NOVÁ VERZE Systém pro kvantitativní multiplex amplifikaci DNA
PLEXAMP® KIT PXT3 Detekce genomové přestavby genů MSH2 a MSH6
NÁVOD K POUŽITÍ
REFERENCE: PXT3-02.01.25: 25 testů PXT3-02.01.50: 50 testů PXT3-02.01.100: 100 testů
SKLADOVÁNÍ: - 20°C
POUZE PRO VÝZKUMNÉ ÚČELY NEPOUŽÍVEJTE PRO DIAGNOSTICKÉ PROCEDURY
N_PXT3 V3
OBSAH
1)
Multiplex PCR.......................................................................................................... 3
2)
Princip..................................................................................................................... 3 a)
PLEXAMP®: Kvantitativní multiplex amplifikace fragmentů genomu pomocí PCR .............. 3
b)
Amplikony ..................................................................................................................... 4
3)
Komponenty PLEXAMP® Kit...................................................................................... 4
4)
Umístění PCR cílových sekvencí ................................................................................ 4
5)
Vlastnosti PCR cílových sekvencí .............................................................................. 5
6)
Varování a doporučení ............................................................................................ 7
7)
Skladování .............................................................................................................. 7
8)
Nedodávané vybavení, mikrozkumavky a reagencia, potřebné pro testování ........... 7 a)
Základní vybavení .......................................................................................................... 7
b)
Mikrozkumavky ............................................................................................................. 7
c)
Reagencia ...................................................................................................................... 8
9)
Příprava genomové DNA ......................................................................................... 8 a)
Kvalita genomové DNA .................................................................................................. 8
b)
Kvantita genomové DNA ................................................................................................ 8
Procedura PLEXAMP® ........................................................................................... 9
10)
PLEXAMP® amplifikační reakce ....................................................................................... 9
a) i) ii) iii)
b)
Vyberte genomovou referenční DNA ................................................................................................ 9 Připravte reakční směs ...................................................................................................................... 9 Spusťte PCR ....................................................................................................................................... 9
Elektroforéza ................................................................................................................. 9 i) ii)
Parametry elektroforézy .................................................................................................................... 9 Kapilární elektroforéza: ABI 310, 31xx, 37xx skupinový instrument ................................................. 9
PLEXAMP® Analýza ....................................................................................................... 10
c) i) ii) iii)
Quantipeak ...................................................................................................................................... 10 ® GeneMapper .................................................................................................................................. 10 Nejčastější problémy ....................................................................................................................... 11
2
N_PXT3 V3
1) Multiplex PCR Simultánní amplifikace několika amplikonů v jedné PCR byla poprvé použita pro detekci delecí a duplikací genu pro dystrophin (Abbs and Bobrow, 1992)1. Simultánní amplifikace dvou nebo více úseků dovoluje přímé srovnání relativního množství PCR produktů získaných z dvou genomových DNA za předpokladu, že 1/ u každého amplikonu je amplifikace ve své exponenciální fázi a 2/ amplifikační produkty mohou být zobrazeny. K zlepšení sensitivity detekce amplifikačních produktů bylo použito fluorescenční značení (Mansfield et al, 1993)2. Nová multiplex PCR metoda, nazvaná fluorescenční multiplex PCR krátkých genomových sekvencí, byla vynalezena Charbonnierem a kol. v roce 2000 ve snaze učinit nová vylepšení3. Tato metoda je založena na simultánní amplifikaci krátkých úseků DNA pro lepší homogenizaci amplifikace různých amplikonů. Amplifikační produkty jsou analyzovány kapilární elektroforézou, která umožňuje překrytí PCR profilů a srovnání fluorescence získané pro každý amplikon ze dvou vzorků DNA. Tato metoda umožňuje detekci genomových heterozygotních alterací, ale množství simultánně amplifikovaných amplikonů je limitováno. Nyní PrestaGen® představuje originální multiplex PCR metodu nazvanou PLEXAMP® (MultiPLEX AMPlification PCR System). Tato vlastní metoda je založena na speciálním a optimalizovaném návrhu PCR primerů, reakčním pufru a podmínkách PCR umožňujících vysoký počet simultánních amplifikací a kvantitativní analýzu každého amplikonu. Oproti jiným podobným metodám, PLEXAMP® je jednokroková metoda, která může být použita jako jednorázový test nebo high-throughput metoda.
2) Princip a) PLEXAMP®: Kvantitativní multiplex amplifikace fragmentů genomu pomocí PCR Tato technologie je založena na: 1. Multiplex amplifikaci jednotlivých genomových sekvencí (amplikonů) především z exonových oblastí cílových sekvencí. 2. Kontrole kinetiky procesu PCR amplifikace umožňující kvantitativní analýzu. 3. Použití fluorescenčních primerů umožňujících analýzu fragmentů pomocí většiny genetických analytických systémů. 4. Jednokrokové proceduře. 5. Kvantitativní analýze srovnáním profilu pacientovy genomové DNA s profilem referenční genomové DNA po normalizaci pomocí kontrolních amplikonů. 1
Abbs, S. and Bobrow, M. Analysis of quantitative PCR for the diagnosis of deletion and duplication carriers in the dystrophin gene. J Med Genet. 1992; 29(3):191-6. 2 Mansfield, E. S.; Robertson, J. M.; Lebo, R. V.; Lucero, M. Y.; Mayrand, P. E.; Rappaport, E.; Parrella, T.; Sartore, M.; Surrey, S., and Fortina, P. Duchenne/Becker muscular dystrophy carrier detection using quantitative PCR and fluorescence-based strategies. Am J Med Genet. 1993; 48(4):200-8. 3 Charbonnier F, Raux G, Wang Q, Drouot N, Cordier F, Limacher JM, et al. Detection of exon deletions and duplications of the mismatch repair genes in hereditary nonpolyposis colorectal cancer families using multiplex polymerase chain reaction of short fluorescent fragments. Cancer Res 2000; 60: 2760-3.
3
N_PXT3 V3
b) Amplikony Každý jednotlivý genomový segment může být použit jako amplikon pro technologii PLEXAMP®. Výběr amplikonů se řidí podle následujících pravidel: 1. Cílové úseky amplikonů by měly být genomově jedinečné. 2. Primerové sekvence by neměly obsahovat známé Polymorphism). 3. Amplikony jsou přednostně vybírány z exonových oblastí.
SNP
(Single
Nucleotide
Každý kit obsahuje nejméně dva kontrolní amplikony lokalizované v genomových oblastech, které neobsahují žádné repetitivní sekvence. Tyto amplikony slouží jako kontrola a ke kalibraci, což umožní normalizaci pacientovy a referenční DNA.
3) Komponenty PLEXAMP® Soupravy Každá PLEXAMP® Souprava obsahuje dostatek reagencií pro provedení 25, 50 nebo 100 testů. Zkumavka
Reagens
A
4X PLEXAMP® PCR MASTERMIX obsahující PCR reakční pufr a Taq-polymerasu
Červený uzávěr B Žlutý uzávěr C Modrý uzávěr
Objem 135 µl
Množství 1 (25 testů) 2 (50 testů)
(ref# PXT-01.01.25-A)
4 (100 testů)
4X PLEXAMP® PCR PRIMERMIX*
135 µl
(ref# PXT3-01.01.25-B)
1 (25 testů) 2 (50 testů) 4 (100 testů)
PCR grade H2O
500 µl
(ref# PXT-01.01.50-C)
1 (25 or 50 testů) 2 (100 testů)
* PCR primery jsou značené fluorescenčním barvivem 6-FAMTM.
4) Umístění PCR cílových sekvencí
4
N_PXT3 V3
MHS2 gen Od exonu 1 do 16 jsou k amplikaci každého exonu použity specifické primery. Dvě další cílové sekvence se nacházejí v oblasti promotoru genu MHS2, aby byla možná i detekce alterace promotoru: o Jedna cílová sekvence v proximální oblasti promotoru PROM -125 bp (od ATG), o Jedna cílová sekvence v distální oblasti promotoru PROM -13 kb (od ATG). Specifické primery jsou použity k amplifikaci exonu 9 genu EPCAM (TACSTD1), který je umístěný 16 kb v protisměru od ATG genu MSH2. MSH6 gen Od exonu 2 do 10 jsou k amplifikaci každého exonu použity specifické primery. CTRL geny : CTRL A,B,C a D jsou umístěny v různých genomových oblastech, ve kterých dosud nebyly detekovány žádné repetitivní sekvence.
5) Vlastnosti PCR cílových sekvencí
PCR TARGET
Profile Genomic Size order Order (bp)
PCR TARGET
Genomic Profile Size Order order (bp)
CTRL_A
1
1
92
CTRL_A
1
1
92
CTRL_B
2
2
100
CTRL_B
2
2
100
MSH6_EXON_7
3
28
103
EPCAM (TACSTD1) EXON_9
3
20
243
MSH2_EXON_2
4
7
107
MSH2_PROM -13000 bp
4
27
309
MSH2_EXON_3
5
8
115
MSH2_PROM -125 bp
5
28
316
MSH2_EXON_7
6
12
124
MSH2_EXON_1
6
8
142
MSH2_EXON_4
7
9
133
MSH2_EXON_2
7
4
107
MSH2_EXON_1
8
6
142
MSH2_EXON_3
8
5
115
MSH6_EXON_8
9
29
152
MSH2_EXON_4
9
7
133
MSH6_EXON_9
10
30
158
MSH2_EXON_5
10
25
294
MSH2_EXON_14
11
19
166
MSH2_EXON_6
11
14
190
MSH2_EXON_9
12
14
174
MSH2_EXON_7
12
6
124
MSH2_EXON_12
13
17
183
MSH2_EXON_8
13
15
198
MSH2_EXON_6
14
11
190
MSH2_EXON_9
14
12
174
MSH2_EXON_8
15
13
198
MSH2_EXON_10
15
18
223
PCR TARGET
Profile Genomic Size
PCR TARGET
5
Genomic Profile Size N_PXT3 V3
order
Order
(bp)
Order
order
(bp)
MSH2_EXON_11
16
16
207
MSH2_EXON_11
16
16
207
MSH6_EXON_6
17
27
215
MSH2_EXON_12
17
13
183
MSH2_EXON_10
18
15
223
MSH2_EXON_13
18
26
301
MSH2_EXON_15
19
20
233
MSH2_EXON_14
19
11
166
EPCAM (TACSTD1) EXON_9
20
3
243
MSH2_EXON_15
20
19
233
MSH6_EXON_4 P1
21
24
250
MSH2_EXON_16
21
24
280
MSH6_EXON_10
22
31
257
MSH6_EXON_2
22
23
273
MSH6_EXON_2
23
22
273
MSH6_EXON_3
23
30
336
MSH2_EXON_16
24
21
280
MSH6_EXON_4 P1
24
21
250
MSH2_EXON_5
25
10
294
MSH6_EXON_4 P2
25
31
343
MSH2_EXON_13
26
18
301
MSH6_EXON_5
26
29
324
MSH2_PROM -13000 bp
27
4
309
MSH6_EXON_6
27
17
215
MSH2_PROM -125 bp
28
5
316
MSH6_EXON_7
28
3
103
MSH6_EXON_5
29
26
324
MSH6_EXON_8
29
9
152
MSH6_EXON_3
30
23
336
MSH6_EXON_9
30
10
158
MSH6_EXON_4 P2
31
25
343
MSH6_EXON_10
31
22
257
CTRL_C
32
32
386
CTRL_C
32
32
386
CTRL_D
33
33
395
CTRL_D
33
33
395
6
N_PXT3 V3
PLEXAMP® MSH2/MSH6 PCR profil referenční DNA
Každý peak odpovídá jednomu amplikonu. Peaky se objevují podle zvyšující se velikosti od 92 bp (první vlevo) do 395 bp (poslední vpravo): viz tabulka nahoře.
6) Varování a doporučení
Tento kit je určen pouze pro výzkumné účely a nikoli pro diagnostické nebo terapeutické účely. Nepoužívejte kit po uplynutí data expirace. Nemíchejte dohromady reagencie z různých šarží nebo různých typů kitů. Používejte stejnou šarži u pacientovy i referenční DNA. Se vzorky a reagenciemi byste měli zacházet v rukavicích. Používejte pouze špičky s filtry. Rozmrazujte pouze nezbytná reagencie. Vyvarujte se opakovanému rozmrazování a zmrazování. Vždy dodržujte podmínky k skladování a níže uvedenou testovací proceduru.
7) Skladování Kit by měl být skladován při –20°C.
8) Nedodávané vybavení, mikrozkumavky a reagencia, potřebné pro testování a) Základní vybavení
PCR thermocycler s 0.2 ml destičkou (rychlost vyhřívání ≥ 2°C/sec)
Vyhřívané víko by mělo vyvíjet dostatečný tlak na vršek PCR zkumavek, aby umožnil dokonalý kontakt mezi zkumavkami a topným tělesem. Systém kapilární elektroforézy 7
N_PXT3 V3
Tento systém byl validován na ABI3130 – 36 cm délka kapiláry, POP7 polymer – se softwarem Genemapper4.0 Čisté a spolehlivě přesné mikropipety
b) Mikrozkumavky
0.2 ml PCR zkumavky prosté nukleových kyselin a nukleáz
c) Reagencia
Deionizovaný formamid (doporučen ABI 4311320) Fluorescenční standard velikosti DNA kompatibilní s PCR produkty značenými 6-FAM™. Doporučujeme použití : Size standard dye ROX
Filter set ABI product D GeneScan™ 400 HD ROX™*
ABI product Nr 402985
9) Příprava genomové DNA
Kvalita genomové DNA je nezbytná pro získávání homogenní amplifikační kinetiky u všech amplikonů. Pro získání spolehlivých kvantitativních výsledků by měla být pro extrakci pacientovy DNA a referenční DNA použita stejná metoda.
a) Kvalita genomové DNA
DNA extrakce metodou VYSOLOVÁNÍ interferuje s podmínkami PCR a proto byste se jí měli VYHNOUT. Genomová DNA extrahovaná s použitím magnetických kuliček by se měla používat s opatrností: přítomnost magnetických kuliček v eluované genomové DNA může interferovat s chemií multiplex PCR. Nejlepší výsledky jsou získány použitím genomové DNA extrahované pomocí kitů založených na DNA resin afinitě nebo DNA filtrech (Protokol optimální extrakce DNA je k dispozici na vyžádání, kontaktujte prosím
[email protected]). OD 260/280 se optimálně pohybuje od 1,8 do 2,0.
b) Kvantita genomové DNA
Koncentrace genomové DNA musí být stanovena přesně: optimálně se pohybuje mezi 20 a 50 ng/µl. Doporučuje se použití kalibrovaného UV spektrofotometru.
8
N_PXT3 V3
10)
Procedura PLEXAMP®
a) PLEXAMP® amplifikační reakce i) Vyberte genomovou referenční DNA Genomová referenční DNA by měla být extrahována stejným postupem jako genomová DNA pacienta. Referenční genomová DNA by měla být prostá jakýchkoli známých alterací úseků cílových sekvencí. ii)
Připravte reakční směs Rozmrazte nezbytné reagencie. Krátce odstřeďte každou zkumavku, aby se celý obsah usadil na dně. Před použitím dobře promíchejte každou reagencii na vortexu (5 vteřin při nejvyšší rychlosti). Připravte nezbytné množství PCR zkumavek pro testované i pro referenční DNA. Do každé 0,2ml PCR zkumavky přidejte: - 4X PLEXAMP® PCR MASTERMIX (Zkumavka A – Červený uzávěr): 5 µL - 4X PLEXAMP® PRIMERMIX (Zkumavka B – Žlutý uzávěr): 5 µL - pacientova DNA nebo referenční DNA: 25 ng - H2O pro PCR (Zkumavka C – Modrý uzávěr): až 20 µL Krátce odstřeďte a promíchejte na vortexu PCR zkumavky.
iii) Spusťte PCR Nastavte thermocycler na stupeň změny teploty ≥ 2°C/sec mezi každým krokem:
26 CYKLŮ
Krok
Čas
Teplota
Počáteční denaturace
10 min
96°C
Denaturace
20 sec
96°C
Nasednutí primeru
60 sec
61°C*
Extenze
120 sec
72°C
Konečná extenze
5 min
72°C
Inkubace 4°C * Teplota pro nasednutí primeru se může u každého kitu lišit Podmínky PCR jsou kritické a měly by být přesně dodržovány. b) Elektroforéza i) Parametry elektroforézy Nastavení elektroforetických parametrů viz doporučení dodavatele. ii) Kapilární elektroforéza: ABI 310, 31xx, 37xx skupinový instrument Připravte plnicí roztok do injekčního platu. Do každé jamky: -
PLEXAMP® PCR produkt značený fluoresc. barvivem 6-FAMTM Fluorescenční standard velikosti DNA Deionizovaný formamid 9
2.0 µL 0.3 µL 15.0 µL N_PXT3 V3
CELKEM (na jamku): 17.3 µL
Inkubujte 3 min při 95°C a 1 min při 4°C.
Nastavte Applied následně:
parametry Biosystems
Systém byl vytvořen na ABI3130 (Délka kapiláry 36 cm; Typ polymeru POP7).
c) PLEXAMP® Analýza i) Quantipeak Nástroj pro online software analýzu je k dispozici na http://www.prestagen.com/ (Tab « QuantiPeak »). Tento nástroj umožňuje rychlou a jednoduchou analýzu dat ze souborů vytvořených sekvencerem (.fsa). Specializovaný návod k použití je k dispozici na webových stránkách. ii) GeneMapper® Analýza dat může být provedena pomocí softwaru GeneMapper® v4.0 podle uživatelské poznámky Applied Biosystems: “Detekce významných delecí nebo duplikací genomové DNA pomocí kvantitativní multiplex PCR a Applied Biosystems systému kapilární elektroforézy”. Uživatelská poznámka může být stažena zde: http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/00115216.pdf.
Plot analýza PCR multiplex profilů: odkaz na sekci “Reviewing plots in GeneMapper® Software” (viz plot uvedený níže). Početní analýza PCR multiplex: odkaz na sekci “Automated analysis”. Prosím kontaktujte
[email protected] pro soubory Bin Set, Analysis Methods a Report Settings vhodné pro automatickou analýzu PLEXAMP® profilů softwarem GeneMapper®.
10
N_PXT3 V3
Peak Ratio Výška = 100±20% 0.8-1.2 30-70% snížení výšky několika 0.3-0.7 amplikonů 30-70% zvýšení výšky několika 1.3-1.7 amplikonů
Interpretace Normal Heterozygotní delece Duplikace
Poměr mezi 0.3 a 0.7 pouze u jednoho amplikonu : viz Nejčastější problémy. Poměr < 0.3, obě alely mohou být variantní. Poměr mezi 0.7 a 0.8 nebo mezi 1.2 a 1.3: - Možná vysvětlení: Různá množství pacientovy DNA a referenční DNA. Různá kvalita pacientovy DNA a referenční DNA. Pacientova DNA a referenční DNA byly extrahovány různými metodami. - Zkontrolujte: Množství DNA pacientovy DNA a referenční DNA. Kvalitu DNA (OD 260/280 mezi 1.8 a 2.0). Metody extrakce DNA. - Pro více informací prosím kontaktujte
[email protected].
iii) Nejčastější problémy Žádné nebo příliš nízké peaky (Průměrná intenzita < 200) Možné příčiny: Chyba thermocycleru. Špatné nastavení elektroforézy. Špatná elektroforetická migrace. Malé množství a/nebo špatná kvalita vzorku DNA. Řešení: Zkontrolujte thermocycler. Nastavit parametry elektroforézy podle návodu uvedeného výše. Zkontrolujte migraci fluorescenčního DNA standardu a pokud je to nezbytné, pokračujte novou migrací. Zkontrolujte množství genomové DNA fluorescenční metodou (např. picogreen™) a pokud je to nezbytné, množství upravte. Zkontrolujte kvalitu vzorku DNA (např. solí, vysokým obsahem RNA). Dva příliš vysoké peaky (Průměrná intenzita > 4500) Možné příčiny: Špatné nastavení elektroforézy. Vysoce citlivý sekvenční přístroj (např. ABI3730). Vysoké množství vzorku DNA. Řešení: Nastavte parametry elektroforézy podle výše uvedených požadavků. Zkraťte injekční čas, pokud je to nezbytné. Zkontrolujte množství genomové DNA fluorescenční metodou (např. picogreen™) a pokud je to nezbytné, množství upravte. 11
N_PXT3 V3
Některé peaky pacientovy DNA a referenční DNA nemohou být překryty Možné příčiny: Kvalita pacientovy DNA a referenční DNA je různá. Množství pacientovy DNA a referenční DNA je různé. Špatná elektroforetická migrace. Řešení: Použijte stejné extrakční metody pro všechny vzorky. Proveďte další měření množství DNA pomocí referenční metody (picogreen™). (Optimální množství 25 ng). Zkontrolujte migraci fluorescenčního DNA standardu a pokud je to nezbytné, pokračujte novou migrací. Pouze jeden peak vykazuje 50% snížení výšky Možné příčiny: Přítomnost Single Nucleotide Polymorphism (SNP) v sekvenci PCR primeru. Proto může být amplifikována pouze jedna alela. Přítomnost mutace v sekvenci PCR primeru. Pouze jedna alela může být amplifikována. Delece nebo inserce jednoho nebo více nukleotidů v amplikonu spojeného s výskytem peaku navíc Řešení: Hledejte možnou variaci cílové sekvence lokalizovanou na primeru nebo na amplikonu. Kvůli technické podpoře prosím kontaktujte
[email protected].
12
N_PXT3 V3
609 Chemin de la Bretèque, BP41 76232 BOIS-GUILLAUME CEDEX FRANCE
Hlavní informace : info(a)prestagen.com Objednávka : order(a)prestagen.com Technická podpora : techserv(a)prestagen.com Kvalita : quality(a)prestagen.com
Website : www.prestagen.com 13
N_PXT3 V3
14
N_PXT3 V3
