IntellMed, s.r.o., Vědeckotechnický park Univerzity Palackého, Šlechtitelů 21 783 71 Olomouc IČ: 27780317 DIČ: CZ27780317
[email protected]
N ÁVOD K POUŽITÍ PRO HER2 DNA QUANTIFICATION KIT
1 Verze 15-05
IntellMed, s.r.o., Vědeckotechnický park Univerzity Palackého, Šlechtitelů 21 783 71 Olomouc IČ: 27780317 DIČ: CZ27780317
[email protected]
O BSAH Návod k použití pro HER2 DNA QUANTIFICATION KIT .............................................................................................................. 1 1. Úvod ............................................................................................................................................................................................... 3 1.1 Označení .............................................................................................................................................................................. 3 1.2 Rozsah použití ..................................................................................................................................................................... 3 1.3 Testovaná položka ............................................................................................................................................................... 3 1.4 Stanovované veličiny .......................................................................................................................................................... 3 1.5 Přístroje a zařízení ............................................................................................................................................................... 3 1.6 Složení kitu .......................................................................................................................................................................... 3 1.7 Podmínky prostředí ............................................................................................................................................................. 5 2. Postup ............................................................................................................................................................................................. 6 2.1 Preanalýza ........................................................................................................................................................................... 6 2.2 Kontrola před analýzou ....................................................................................................................................................... 6 2.3 Vlastní postup ...................................................................................................................................................................... 6 2.5 Kontrola v průběhu analýzy ................................................................................................................................................ 9 2.7 Bezpečnostní opatření ......................................................................................................................................................... 9 3. Hodnocení ..................................................................................................................................................................................... 10 3.1 Algoritmus hodnocení ....................................................................................................................................................... 10 3.2 Kritéria zamítnutí .............................................................................................................................................................. 10
2 Verze 15-05
IntellMed, s.r.o., Vědeckotechnický park Univerzity Palackého, Šlechtitelů 21 783 71 Olomouc IČ: 27780317 DIČ: CZ27780317
[email protected]
1. Ú VOD 1.1 O ZN A Č EN Í Vyšetření molekulárně genetických změn DNA metodou PCR s fluorescenčním měřením nárůstu amplikonu v reálném čase ve dvou fluorescenčních kanálech.
1.2 R O Z S AH
P O U ŽI T Í
DNA izolovaná z tkáně karcinomu prsu o dostatečné kvalitě (nedegradovaná, nemodifikovaná chemicky), u které lze očekávat amplifikaci genu HER2 a jejíž vyšetření má diagnostický, prognostický nebo prediktivní význam. Kit je standardizován pro použití DNA izolované z formalínem fixované a parafinu zalité (FFPE) tkáně karcinomu prsu.
1.3 T EST O V AN Á
P O LO Ž K A
Gen HER2 v lidské DNA, lokalizovaný v oblasti 17q11-12.
1.4 S T AN O V O V AN É
V E L I ČI N Y
HER2 Test je určen k detekci amplifikace genu HER2 u karcinomu prsu pomocí tří duplexních reakcí srovnávajících gen HER2 s referenčními geny (GCS1, DCK a EPN2). Detekční limit metody je 5% obsah vysoce amplifikovaných buněk (≥20 kopií HER2/jádro) ve vzorku.
1.5 P Ř Í S T R O J E
A ZA Ř Í Z EN Í
Pro řezání bloků a přípravu DNA: mikrotom, výhřevný blok, digestoř, vortex, centrifuga, spektrofotometr, nastavitelné pipety, plastový spotřební materiál Pro amplifikaci: termocyklér s měřením fluorescence v reálném čase (doporučeno použití RotorGene 3000), vortex, minicentrifuga, chladící stojánky, nastavitelné pipety, pipetovací box, plastový spotřební materiál
1.6 S LO Ž EN Í
KITU
Kit obsahuje: 10 x PCR pufr 25mM MgCl2 10mM dNTP 25uM FW primery ke genům HER2, GCS1, DCK, EPN2 25uM RW primery ke genům HER2, GCS1, DCK, EPN2 25uM proby ke genům HER2, GCS1, DCK, EPN2 Deionizovaná voda (DW) ThermoStar polymeráza (5U/1µl) Standard o koncentraci 20 ng/µl (třeba naředit dle Tab. č. 2)
3 Verze 15-05
IntellMed, s.r.o., Vědeckotechnický park Univerzity Palackého, Šlechtitelů 21 783 71 Olomouc IČ: 27780317 DIČ: CZ27780317
[email protected] Pozn.: Jako standard slouží vzorek prsní tkáně sfyziologickým počtem kopií genu HER2 a referenčních genů, naředěný do příslušných koncentrací. Do reakce je jako negativní kontrola použita voda.
Pozn. 2: Všechny reagencie s výjimkou standardu jsou dodávány naředěné na požadované koncentrace.
4 Verze 15-05
IntellMed, s.r.o., Vědeckotechnický park Univerzity Palackého, Šlechtitelů 21 783 71 Olomouc IČ: 27780317 DIČ: CZ27780317
[email protected]
1.7 P O D MÍ N K Y
P R O ST Ř E DÍ
Na pracovní prostředí nejsou kladeny žádné zvláštní podmínky odlišující se od běžných molekulárně biologických laboratorních podmínek (zavedení protikontaminačních opatření včetně fyzického oddělení prePCR a PCR/postPCR areálu). Biologický materiál zpracovávejte s použitím ochranných rukavic. Pro cycler musí být splněny podmínky teploty a vlhkosti stanovené výrobcem. Pro skladování parafinových bloků doporučujeme uchování při laboratorní teplotě, popř. v chladu. Parafinové řezy uchovávejte krátkodobě při laboratorní teplotě, dlouhodobě při -10 až -20°C Izolovanou i amplifikovanou DNA uchovávejte při -10 až -20°C.
5 Verze 15-05
IntellMed, s.r.o., Vědeckotechnický park Univerzity Palackého, Šlechtitelů 21 783 71 Olomouc IČ: 27780317 DIČ: CZ27780317
[email protected]
2. P OSTUP 2.1 P R EAN A LÝ Z A Není součástí testu. Doporučujeme provést kontrolu amplifikovatelnosti DNA.
2.2 K O N T R O L A
P Ř E D A N A LÝ ZO U
Kontrola dostatečného množství DNA (na základě spektrofotometrického nebo fluorescenčního odhadu koncentrace a čistoty, na základě výsledků předchozího PCR testování).
2.3 V LA ST N Í
P O ST UP
Používáme DNA s koncentrací 4 – 20 ng/µl (koncentrační řada standardů ředění zásobního roztoku standardu dle Tab. č.2). Vyšetřovaný vzorek je třeba naředit na koncentraci 10 ng/µl. V přípravě mastermixů postupujeme dle Tab. č. 1. Připravíme tři mastermixy pro každou duplexní reakci (kontrolní geny GCS1, DCK a EPN2). Tab.č.1: Složení jednotlivých mastermixů pro 3 heteroduplexní qPCR detekce
REAKCE 1 výsl.konc.
HER2
GCS1
REAKCE 2 HER2
DCK
REAKCE 3 HER2
EPN2
10 x PCR pufr
1x
2,5µl
2,5µl
2,5µl
25mM MgCl 2 10mM dNTP
5mM
5µl
5µl
5µl
200µM
0,5µl
0,5µl
0,5µl
25µM FW primer
0,2µM
0,2µl
0,2µl
0,2µl
0,2µl
0,2µl
0,2µl
25µM RW primer
0,2µM
0,2µl
0,2µl
0,2µl
0,2µl
0,2µl
0,2µl
0,15µM
0,15µl
0,15µl
0,15µl
0,15µl
0,15µl
0,15µl
25µM proba DW ThermoStar pol. (5U/1µl) DNA celkový objem
1U
10,7µl
10,7µl
10,7µl
0,2µl
0,2µl
0,2µl
25,0 µl
25,0 µl
25,0 µl
(5µl)
6 Verze 15-05
IntellMed, s.r.o., Vědeckotechnický park Univerzity Palackého, Šlechtitelů 21 783 71 Olomouc IČ: 27780317 DIČ: CZ27780317
[email protected]
Kit je navržen pro současné vyšetření 10 vzorků. Pro toto uspořádání je v kitu přiložené dostačující množství standardu o koncentraci 20 ng/µl. Tento standard je třeba naředit dle Tab. č. 2: Tab.č. 2: Ředění standardů Koncentrační řada standardů Standard 1
Koncentrace po naředění [ng/µl] 4
Konečná koncentrace v reakci [ng/µl] 20
Počet kopií HER2 a referenčních genů v reakci 3330
Standard 2
6
30
6660
Standard 3
8
40
9990
Standard 4
10
50
16650
Standard 5
12
60
19980
Standard 6
14 20 (neředí se, zásobní roztok standardu)
70
23310
Standard 7
33300 100
Vlastní postup: 1. Do každé PCR zkumavky pipetujeme 20 µl příslušného mastermixu dle rozpisu uvedeného v Tab. č.3 2. Přidáváme 5 µl vzorku DNA (standard či vyšetřovaná DNA) 3. V případě negativní kontroly k mastermixu pipetujeme 5 µl DEPC vody 4. Zamícháme pipetováním špičkou tam a zpět 5. Uzavřeme zkumavky 6. Vložíme do cycleru (pozn.: Reakce byla standardizována pro RotorGene 3000, v následujícím provedení. Pro použití jiného cycleru je nutná standardizace programu). 7. Zapneme „HER2“ program: 95°C 15 minut 40 cyklů (95°C 15 sekund, 60°C 60 sekund). Snímání v kanálu FAM a JOE/HEX při 60°C
Tab č.3: Rozpis vzorků
7 Verze 15-05
IntellMed, s.r.o., Vědeckotechnický park Univerzity Palackého, Šlechtitelů 21 783 71 Olomouc IČ: 27780317 DIČ: CZ27780317
[email protected] Rozpis pro 10 testovaných vzorků v duplikátu, 7 standardů o konečných koncentracích 20, 30, 40, 50, 60, 70 a 100 ng/reakci a 1 negativní kontrolu – NTC. (GCS1mastermix je označen modře, DCK mastermix je označen červeně a EPN2 mastermix je označen zeleně):
1 NTC GCS1 2 Standard 1 3 Standard 2 4 Standard 3
5 Standard 4 6 Standard 5 7 Standard 6 8 Standard 7
9 Vzorek 1 10 Vzorek 1 11 Vzorek 2 12 Vzorek 2
17 Vzorek 5
25 Vzorek 9
18 Vzorek 5
26 Vzorek 9
19 Vzorek 6
27 Vzorek 10
20 Vzorek 6
28 Vzorek 10
13 Vzorek 3 14 Vzorek 3 15 Vzorek 4 16 Vzorek 4
21 Vzorek 7
29 NTC DCK 30 Standard 1 31 Standard 2 32 Standard 3
22 Vzorek 7 23 Vzorek 8 24 Vzorek 8
33 Standard 4 34 Standard 5 35 Standard 6 36 Standard 7
41 Vzorek 3 42 Vzorek 3 43 Vzorek 4 44 Vzorek 4
49 Vzorek 7 50 Vzorek 7 51 Vzorek 8 52 Vzorek 8
57 NTC EPN2 58 Standard 1 59 Standard 2 60 Standard 3
65 Vzorek 1 66 Vzorek 1 67 Vzorek 2 68 Vzorek 2
73 Vzorek 5
37 Vzorek 1
45 Vzorek 5 46 Vzorek 5 47 Vzorek 6 48 Vzorek 6
53 Vzorek 9 54 Vzorek 9 55 Vzorek 10 56 Vzorek 10
61 Standard 4 62 Standard 5 63 Standard 6 64 Standard 7
69 Vzorek 3 70 Vzorek 3 71 Vzorek 4 72 Vzorek 4
77 Vzorek 7
38 Vzorek 1 39 Vzorek 2 40 Vzorek 2
74 Vzorek 5 75 Vzorek 6 76 Vzorek 6
81 Vzorek 9 82 Vzorek 9 83 Vzorek 10 84 Vzorek 10
78 Vzorek 7 79 Vzorek 8 80 Vzorek 8
Vysvětlivky k Tab. č. 3: NTC…negativní kontrola (20 µl mastermixu + 5 µl DEPC vody) Standard 1… referenční DNA; konečná koncentrace 20 ng/reakci Standard 2… referenční DNA; konečná koncentrace 30 ng/reakci Standard 3… referenční DNA; konečná koncentrace 40 ng/reakci Standard 4… referenční DNA; konečná koncentrace 50 ng/reakci Standard 5… referenční DNA; konečná koncentrace 60 ng/reakci Standard 6… referenční DNA; konečná koncentrace 70 ng/reakci Standard 7… referenční DNA; konečná koncentrace 100 ng/reakci Vzorek č.1-10…vyšetřovaná DNA v konečné koncentraci 50 ng/reakci, pipetujeme v duplikátu
8 Verze 15-05
IntellMed, s.r.o., Vědeckotechnický park Univerzity Palackého, Šlechtitelů 21 783 71 Olomouc IČ: 27780317 DIČ: CZ27780317
[email protected]
2.5 K O N T R O L A
V P R ŮB Ě HU AN AL Ý ZY
Průběžně kontrolujeme průběh vyšetření v těchto krocích: Kontrola amplifikovatelnosti DNA Je-li stanovena nízká koncentrace DNA anebo testovací PCR neprokázala amplifikovatelnost DNA, doporučujeme vyšetření neprovádět, vzorek nelze vyhodnotit. Negativní kontrola PCR reakce Do každé reakce je přidávána negativní kontrola (DEPC voda). Pokud je tato kontrola pozitivní, došlo ke kontaminaci v průběhu přípravy PCR reakce, případně jsou kontaminované PCR reagencie a je nutno analýzu provést znovu. Pozitivní kontrola DNA s fyziologickým počtem kopií genu HER2 (standard 1-7).
Problémy při PCR Problém
Pravděpodobně způsobeno
Možné řešení
Žádný amplikon po PCR, pozdní zdvih amplifikační křivky
Špatná kvalita DNA, chyba při izolaci, chyba při PCR set up
Opakujeme izolaci ze stejného vzorku nebo provedeme izolaci z nového vzorku.
Amplifikace v negativní kontrole (voda místo DNA)
Kontaminace během přípravy PCR
Hledání zdroje kontaminace: výměna levných reakčních komponent, vyčištění pracovní plochy přípravkem ničícím DNA, případné vyčištění pipet a opakování celého postupu PCR s přidáním no template control (voda místo DNA).
2.7 B E Z P E Č N O ST N Í
O P AT Ř E N Í
Rizikové látky: biologický materiál Každý biologický materiál je brán jako potenciálně infekční. Při práci je nutno používat vhodnou ochranu (jednorázové rukavice). Dále platí všeobecné zásady bezpečnosti práce v molekulárně biologické laboratoři. Reagencie chráníme před světlem, vystavujeme světlu jen na nejnutnější dobu
9 Verze 15-05
IntellMed, s.r.o., Vědeckotechnický park Univerzity Palackého, Šlechtitelů 21 783 71 Olomouc IČ: 27780317 DIČ: CZ27780317
[email protected]
3. H ODNOCENÍ 3.1 A L GO R I T M US
HO D N O C EN Í
Po skončení PCR provedeme vyhodnocení pomocí softwaru příslušného real-time cycléru. Sledujeme počet kopií HER2 (FAM filter comb 465-510) a jednotlivých referenčních genů (HEX/JOE filter comb 533 – 580). Ze standardů 1-7 o známém počtu kopií genu HER2 a referenčních genů (viz Tab. č.2) vytvoříme kalibrační (standardizační) křivku, do níž vyneseme Ct hodnoty vyšetřovaných vzorků. Pomocí kalibrační křivky tak určíme počet kopií jednotlivých genů u vyšetřovaných vzorků. Hodnotíme míru shody u jednotlivých duplikátů. Pokud není odchylka větší než 10%, provedeme průměr výsledků duplikátů. V případě neshody duplikátů opakujeme vyšetření. Pro každý vyšetřovaný vzorek vypočítáme podíl počtu kopií HER2 a jednotlivých referenčních genů. Získáme tak 3 podíly pro každý vyšetřovaný vzorek Vzorek vyhodnotíme jako HER2 amplifikovaný v případě, že je podíl HER2/referenční gen ≥ 2,2 alespoň u 2 referenčních genů Vzorek vyhodnotíme jako HER2 neamplifikovaný (fyziologický) v případě, že je podíl HER2/referenční gen < 2,2 alespoň u 2 referenčních genů Pokud byl hodnotitelná pouze jedna nebo žádná z duplexních PCR reakcí, není vzorek hodnotitelný a je nutné jej opakovat. Pokud je v negativní kontrole NTC Ct signál HEX/JOE nižší než 35, je běh kontaminován a neplatný. Pokud je hodnota Ct v kanálu HEX/JOE a/nebo FAM vyšší než 35 nebo je nulová nebo pokud je počet kopií HER2 nebo referenčního genu menší než 200 kopií/reakci není vzorek analyzovatelný.
3.2 K R I T ÉR I A
ZA MÍ T N U T Í
Pozitivní výsledky zamítáme pro celý běh, pokud se objeví pozitivní signál i u „no template“ kontroly (voda místo DNA). Výsledek uzavíráme jako „nelze“, pokud u konkrétního vzorku chybí signál ve FAM nebo JOE/HEX kanálu.
10 Verze 15-05