NOVA Lite® ANCA
Reagencie ke stanovení autoprotilátek proti cytoplazmě neutrofilů
Pro diagnostické použití In Vitro Kódy výrobků: 708290, 708296, 708298, 708299 508290.10, 508296.20, 508298.20, 508299.10 Obtížnost CLIA: Vysoká
Účel použití
NOVA Lite® ANCA je test nepřímé imunofluorescence určený ke skríningu a semikvantitativní analýze protilátek proti cytoplazmě neutrofilů (ANCA) v lidském séru. Přítomnost ANCA může být použita společně s dalšími sérologickými testy a klinickým nálezem k diagnostice různých systémových vaskulitid.
Stručná charakteristika a vysvětlení testu
Testování na protilátky proti cytoplazmě neutrofilů (ANCA) bylo převratem v diagnostice a léčbě různých autoimunitních vaskulitid.1-4 Perinukleární neboli pANCA a cytoplazmatické neboli cANCA autoprotilátky se ukázaly užitečnými pro detekci chorob jako je Wegenerova granulomatóza a srpkovitá glomerulonefritis. Bylo identifikováno minimálně šest ANCA antigenů a mnoho dalších je zatím neidentifikováno.1,5 Většina těchto antigenů jsou zřejmě enzymy nacházející se v primárních granulech neutrofilů. Tyto enzymy zahrnují myeloperoxidázu (MPO), serinovou proteázu 3 (PR3), elastázu, lactoferrin, cathepsin G a kationický protein 57 (CAP-57). Byly vyvinuty ELISA testy k detekci mnoha z nejvýznamnějších protilátek proti neutrofilům, přesto ale většina expertů na autoimunitní vaskulitidy stále doporučuje jako primární skríningový test provést imunoflurescenční metodu (IFA). Při použití standardní ANCA IFA procedury jsou detektovatelné dva ANCA ornamenty. Klasický ANCA ornament se zobrazuje jak granulární cytoplazmatická fluorescence. Tento ornament vede k podezření na Wegenerovu granulomatózu a mírnou formu mikroskopické polyarteritis, tento typ byl označen cANCA.6 Druhý popsaný ANCA ornament se zobrazuje7,8 v perinukleární oblasti ethanolem fixovaných neutrofilů. Tento typ byl označen jako pANCA. pANCA ornament provází vaskulitidy s víceorgánovým postižením, jako je srpkovitá nebo rychle progredující glomerulonefritida.9 Korelace cANCA a Wegenerovy granulomatózy je dobře popsána.3,10 Wegenerova granulomatóza je charakterizována nekrotizujícím zánětem se vznikem granulomů a vaskulitidou, která primárně postihuje horní a dolní dýchací trakt a ledviny. Tato triáda klinického postižení se považuje za charakteristický znak Wegenerovy granulomatózy. cANCA jsou přítomny až u 96 % nemocných s Wegenerovou granulomatózou s aktivním a generalizovaným onemocněním. U nemocných s aktivní limitovanou formou onemocnění se vyskytují u 65 % nemocných a jen u 30-40 % pacientů v remisi. Titr cANCA sleduje průběh nemoci, přičemž v remisi se snižuje a během relapsu se zvyšuje.4,12 Narozdíl od cANCA (které jsou převážně asociovány se systémovou formou Wegenerovy granulomatózy), se pANCA se častěji vyskytují u nekrotizující glomerulonefritidy a u systémových variant se typicky nenacházejí. Nejčastějším cílovým antigen asociovaným s pANCA je myeloperoxidáza, ale bývá také zachycena reaktivita vůči elastáze a laktoferinu. Téměř 90 % pANCA pozitivních sér od pacientů s glomerulonefritidou reaguje s myeloperoxidázou, zatímco pANCA pozitivní pacienti s jiným typem onemocnění než je glomerulonefritida, reagují s myeloperoxidázou mnohem méně často.11,13 Toto dává tušit, že mnoho antigenů je detekovatelných jako perinukleární zbarvení ethanol-fixovaných neutrofilů, a to včetně sér pozitivních na antinukleární protilátky. Nález perinukleárních obrazců (detekovaných na ethanol-fixovaných glomerulech) je možné potvrdit nález pomocí IFA na formalínem fixovaných neutrofilech. Meloperoxidáza, primární antigenní cíl pANCA protilátek je v cytoplazmě formalinem fixovaných buněk, zatímco v buňkách fixovaných ethanolem tento antigen migruje k jádru a tvoří perinukleární obrazec.
Princip procedury
Při metodě nepřímé imunofluorescence jsou vzorky inkubovány s antigenním substrátem a nenavázané protilátky jsou opláchnuty. Substrát je posléze inkubován se specifickým, fluoresceinem značeným konjugátem a nenavázaná reagencie je opět opláchnuta. Při prohlédnutí vzorku pod fluorescenčním mikroskopem se přítomnost autoprotilátek projeví jablkově zelenou fluorescencí v oblastech buňky nebo buněčného jádra, kde je protilátka navázána.
1
Reagencie 1.
ANCA sklíčka, ethanolem fixovaná lidská sklíčka s neutrofilním substrátem, sklíčka o 6 nebo 12 jamkách, s vysoušedlem
Pouze sady 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Konjugát s protilátkami proti lidskému IgG (Kozí), fluoresceinem značený, v pufru, obsahující Evansovu modř a 0,09 % azid sodný Pozitivní cANCA, 1 ampule pufru, s obsahem 0,09 % azidu sodného a lidské sérové autoprotilátky proti cANCA antigenu, naředěné Pozitivní pANCA, 1 ampule pufru, s obsahem 0,09 % azidu sodného a lidské sérové autoprotilátky proti pANCA antigenu, naředěné Negativní kontrola testu IFA, 1 ampule pufru, s obsahem 0,09 % azidu sodného, bez lidských sérových ANCA protilátek, naředěno Koncentrát PBS II II (40x) Montovací médium, 0,09 % azid sodný Krycí sklíčka
Varování 1.
2.
3. 4.
Všechen v testu použitý lidský materiál pro přípravu kontrolních vzorků byl testován a shledán negativní na protilátky proti HIV, HBsAg, a HCV, pomocí FDA povolených metod. Žádná testovací metoda však není schopna dát kompletní jistotu, že HIV, HBV, HCV nebo jiné infekční agens je nepřítomno. Proto by se s kontrolami pANCA pozitivní, cANCA pozitivní i IFA negativní mělo zacházet jako s potenciálně infekčním materiálem.14 Azid sodný je zde používán jako konzervační látka. Azid sodný je jed, a pokud je požit nebo se dostane do kontaktu s kůží nebo očima, může být toxický. Azid sodný může reagovat s olovem nebo mědí a vytvářet potenciálně výbušné metalické azidy. Proto splachujte výlevky, ve kterých jste reagencie používali, velkým objemem vody, tak aby se předešlo tvorbě azidů. Při práci s dodanými reagencii používejte příslušné osobní ochranné pomůcky. Vylité reagencie by měly být ihned uklizeny. Dodržujte všechny federální, státní i lokální předpisy o životním prostředí, týkající se likvidování odpadu.
Bezpečnostní opatření 1. 2. 3. 4.
5.
6. 7.
Tento výrobek je určen k diagnostickému použití In Vitro. Substituce komponent za jiné, než byly dodány v této sadě, může vést k nepřesným výsledkům. Nedostatečné nebo neúplné promytí IFA může vyvolat silné pozadí. Adaptace tohoto testu na různé automatické pomůcky, může způsobit rozdíly ve výsledcích testu, oproti výsledkům dosaženým při použití manuální procedury. Toto je na zodpovědnosti každé laboratoře, aby zajistila, že automatické postupy přinesou výsledky v přijatelném rozmezí. Různé další faktory mohou ovlivnit sílu testu. Jde například o úvodní teplotu reagencií, sílu žárovky použitého mikroskopu, reproducibilitu techniky pipetování, pečlivost promytí a délka inkubace během testu. V testu je třeba dbát na důslednost, tak aby bylo dosaženo reprodukovatelných a přesných výsledků. Konjugát s protilátkami proti lidskému IgG může časem díky expozici světlu změnit barvu. Tato změna barvy však nemá vliv na sílu testu. Doporučuje se přísné dodržování protokolu.
Podmínky skladování 1. 2.
Reagencie sady skladujte při 2-8 °C. Nezmrazujite. Reagencie jsou stabilní až do data uplynutí doby použitelnosti pouze skladovány a je s nimi zacházeno dle instrukcí. Naředěný PBS II pufr je stabilní až 4 týdny při 2-8 °C.
2
Sběr vzorků
Test by měl být prováděn se vzorkem séra. Přidání azidu nebo jiných konzervačních látek k testovaným vzorkům by mohl negativně ovlivnit výsledky. Mikrobiálně kontaminované, teplem prošlé sérum nebo vzorky s obsahem viditelných částic by neměly být používány. Je třeba se také vyhnout lipemickým vzorkům séra a také těm s výraznější hemolýzou. Po odběru vzorku by sérum mělo být odděleno od sraženiny. CLSI (dříve NCCLS) Dokument H18-A3 doporučuje pro vzorky následující skladovací podmínky. 1) Vzorky skladujte při pokojové teplotě nejdéle 8 hodin. 2) Pokud nebude test proveden do 8 hodin, umístěte vzorky do chladu 2-8 °C. 3) Pokud nebude test proveden do 48 hodin nebo pokud se vzorek bude přepravovat, zmrazte minimálně na -20 °C. Zmrazené vzorky musí být po rozmrazení a před zahájením testu dobře promíchány.
Proces Dodaný materiál (sady)
708290 10 6jamková sklíčka s ANCA pozitivním ethanol-fixovaným lidským neutrofilním substrátem 1 4 ml konjugát s protilátkami proti lidskému IgG FITC 1 0,5 ml pozitivní cANCA 1 0,5 ml pozitivní pANCA 1 0,5 ml negativní kontrola testu IFA 1 25 ml PBS II pufr koncentrát (40x) 1 7 ml montovací médium 1 10x Krycí sklíčka 708296 20 12jamková sklíčka s ANCA pozitivním ethanol-fixovaným lidským neutrofilním substrátem 1 15 ml konjugát s protilátkami proti lidskému IgG FITC 1 0,5 ml pozitivní cANCA 1 0,5 ml pozitivní pANCA 1 0,5 ml negativní kontrola testu IFA 2 25 ml PBS II pufr koncentrát (40x) 1 7 ml montovací médium 1 20x Krycí sklíčka 708298 20 12jamková sklíčka s ANCA pozitivním ethanol-fixovaným lidským neutrofilním substrátem 1 15 ml konjugát s protilátkami proti lidskému IgG FITC 1 0,5 ml pozitivní cANCA 1 0,5 ml pozitivní pANCA 1 0,5 ml negativní kontrola testu IFA 2 25 ml PBS II pufr koncentrát (40x) 1 7 ml montovací médium 1 20x Krycí sklíčka 708299 10 6jamková sklíčka s ANCA pozitivním ethanol-fixovaným lidským neutrofilním substrátem 1 4 ml konjugát s protilátkami proti lidskému IgG FITC 1 0,5 ml pozitivní cANCA 1 0,5 ml pozitivní pANCA 1 0,5 ml negativní kontrola testu IFA 1 25 ml PBS II pufr koncentrát (40x) 1 7 ml montovací médium 1 10x Krycí sklíčka
3
Dodaný materiál (sklíčka) 508290.10 508296.20 508298.20 508299.10
10x ANCA pozitivní sklíčka s ethanolem fixovaným lidským neutrofilním substrátem (6 jamek) 20x ANCA pozitivní sklíčka s ethanolem fixovaným lidským neutrofilním substrátem (12 jamek) 20x ANCA pozitivní sklíčka s ethanolem fixovaným lidským neutrofilním substrátem (12 jamek) 10x ANCA pozitivní sklíčka s ethanolem fixovaným lidským neutrofilním substrátem (6 jamek)
Dodatečně požadované materiály nedodané se soupravou
Mikropipety o objemu 15-1000µl Destilovaná nebo deionizovaná voda Stlačitelné lahvičky nebo Pasteurovy pipety Vlhká komůrka 1 l zásobník (k naředění PBS II pufru) Coplin nádobka Fluorescenční mikroskop s 495 nm prosvětlovacím filtrem a 515 nm bariérovým filtrem.
Další samostatně dostupné materiály
ANCA (Formalinem fixovaný lidský neutrofilní substrát) 6jamková sklíčka, INOVA katalogové č. 508295 ANCA (Formalinem fixovaný lidský neutrofilní substrát) 12jamková sklíčka, INOVA katalogové č. 508297
Metoda
Před tím než začnete 1. 2.
3.
Nechte všechny reagencie a vzorky dosáhnout pokojové teploty (20-26 oC) a dobře promíchejte. Nařeďte koncentrát PBS II: DŮLEŽITÉ: Nařeďte koncentrát PBS II 1:40 tak, že přidáte obsah lahvičky s koncentrátem PBS II k 975 ml destilované nebo deionizované vody a pečlivě promíchejte. PBS II pufr je určen k ředění pacientských vzorků a jako promývací pufr. Naředěný pufr může být skladován až 4 týdny při 2-8 °C.. Nařeďte vzorky pacientů: a. Vstupní skríning: Nařeďte vzorky pacientů 1:20 s ředěným PBS II pufrem (např.: přidejte 50 µl séra k 950 µl PBS II pufru). b. Titrace: Proveďte sériové 2 násobné ředění pomocí ředěného PBS II pufru, počínaje vstupním skríningovým ředěním, a to pro všechny pozitivní vzorky (např. 1:1280).
Proces testování 1.
2. 3.
4. 5.
Připravte substrátová sklíčka: Před vyjmutím z váčku nechte substrát dosáhnout pokojové teploty. Tužkou označte a umístěte do příslušné vlhké komůrky. Postupně přidejte 1 kapku (20-25 µl) neředěné pozitivní a negativní kontroly do jamek 1 a 2. Přidejte 1 kapku (20-25 µl) ředěného séra pacientů. Inkubace sklíček: Inkubujte sklíčka 30 ±5 minut ve vlhké komůrce (vlhká papírová utěrka na dně plastové nebo skleněné nádobky) udrží přiměřeně vlhké prostředí. Zabraňte vysušení substrátu během testovací procedury. Promytí sklíček: Po inkubaci použijte plastovou stlačitelnou lahvičku nebo pipetu a opatrně omyjte sérum ředěným PBS II pufrem. Nakloňte sklíčka a proud PBS II pufru, tak abyste minimalizovali přelití vzorků mezi jamkami. Nemiřte proudem přímo na sklíčka, aby nedošlo k poškození substrátu. Volitelně můžete umístit sklíčka do Coplin nádobky s PBS II pufrem maximálně na 5 minut. Přidání fluoresceinového konjugátu: Setřeste přebytek PBS II pufru. Umístěte sklíčka zpět do vlhké komůrky a okamžitě překryjte každou jamku kapkou fluoresceinového konjugátu. Inkubujte sklíčka dalších 30 + minut. Promytí sklíček: Opakujte krok 3. Krycí sklíčka: Aplikace krycích sklíček se liší laboratoř od laboratoře; přesto doporučujeme následující postup: a. Položte krycí sklíčko na čistou utěrku. b. Aplikujte montovací médium v souvislé lince po dolním okraji krycího sklíčka. c. Setřeste přebytek PBS II pufru a spojte dolní okraj sklíčka s hranou krycího sklíčka. Opatrně položte sklíčko na krycí sklíčko tak, aby montovací médium steklo z horního okraje sklíčka bez vzniku bublin.
4
Kontrola kvality
Pozitivní kontrola cANCA a negativní kontrola IFA by měly být použity pokaždé, aby všechny reagencie a procedury správně proběhly. Další vhodná kontrolní séra mohou být připravena tak, že vzorky lidského séra budou rozpipetovány a skladovány při < -70 oC. Výsledky testu mohou být považovány za validní, pouze budou-li splněna všechna následující kritéria. Pokud některé není splněno, test je neplatný a měl by být zopakován. 1. Neředěná pozitivní kontrola cANCA musí být > 3+. 2. Negativní kontrola IFA musí být negativní.
Interpretace výsledků
Negativní reakce. Vzorek je považován za negativní, pokud je specifické nukleární a cytoplazmatické zbarvení rovné nebo méně výrazné než negativní kontrola IFA. Vzorky mohou vykazovat různé stupně zbarvení pozadí, díky heterofilním protilátkám nebo díky nízkému titru autoprotilátek proti cytoplazmatickým organelám, jako jsou napři. kontraktilní proteiny. Pozitivní reakce. Vzorek je považován za pozitivní, pokud je specifické nukleární a / nebo cytoplatmatické zbarvení (jak níže popsáno) výraznější než negativní kontrola a pokud je intenzita zbarvení větší než 1+. Určete stupeň nebo intenzitu fluorescence podle následujících kriterií: 4+ Oslnivá jablečně zelená fluorescence 3+ Jasně jablečně zelená fluorescence 2+ Výrazná pozitivní fluorescence 1+ Nejnižší specifická fluorescence, která umožňuje jasně rozlišit nukleární a/nebo cytoplazmatické zbarvení od fluorescence pozadí. Interpretace obrazců. V závislosti na typu a relativním množství autoprotilátek ve vzorku je možné pozorovat různé varianty obrazců. Lze pozorovat následující typy obrazců: cANCA aneb cytoplazmatické zbarvení: Tento obrazec většinou vypadá jako hrubě skvrnitá cytoplazmatická fluorescence, často se zvýrazněnou fluorescencí uvnitř a okolo jaderných laloků. Tento typ obrazce je většinou produkován protilátkami reagujícími s granulárním enzymem serinové proteázy 2 (PR3). pANCA aneb perinukleární zbarvení: Tento obrazec většinou vypadá jako homogenní zbarvení jaderných laloků, často s perinukleárním zvýrazněním. Protože některé antinukleární protilátky (ANA) také mohou reagovat s jádrem ethanolem fixovaných lidských neutrofilů, doporučuje se, aby byly tyto vzorky zároveň testovány na ANA. Navíc by tyto vzorky měly být testovány spíše na lidských neutrofilech fixovaných ve formalinu spíše než v ethanolu. Formalin, který je zesíťovaným fixačním činidlem, ničí většinu jaderných antigenů a pokud vzorek obsahuje pANCA, zbarvení se stěhuje z oblasti perinukleární do cytoplazmatické. Sklíčka fixovaná formalínem k tomuto účelu jsou dostupná zvlášť.
Omezení procesu 1.
2. 3.
4.
5.
Teplem inaktivované, hemolytické, mikrobiálně kontaminované nebo nekompletně defibrinované vzorky mohou způsobit vysoký stupeň zbarvení pozadí a interpretace výsledků tak může být obtížná. V tom případě získejte čerstvý vzorek a znovu otestujte. Zbarvení pozadí u problematických vzorků může omezit přidání 2 % albuminu nebo kravského séra k PBS II pufru. ANA pozitivní vzorky mohou reagovat s ethanolem fixovanými neutrofily. Vzorky s pozitivními jádry by měly být otestovány na ANA a / nebo pomocí formalinem fixovaných neutrofilních sklíček. Ethanolem fixované neutrofily obsahují řadu primárně granulárních antigenů, jako je elastáza, laktoferrin, kathepsin G, kationický protein 57 a možná další, zatím neidentifikované antigeny neutrofilů. Z toho důvodu se nemusí p nebo cANCA pozitivní vzorky jevit jako pozitivní na protilátky proti specifické myeloperoxidáze (MPO) nebo proti serinové proteáze 3 (PR3). Také další autoprotilátky, mimo ANA, mohou reagovat s ethanolem fixovanými lidskými neutrofily. Tyto protilátky zahrnují protilátky proti hladké svalovině (actin) a některé alloprotilátky, jako je Mart nebo NB1.15 Protilátky proti aktinu nebo hladké svalovině reagují s cytoplazmou neutrofilů, spíše ale homogenním než hrubě zrnitým obrazcem, jako to platí pro typickou cANCA. Alloprotilátky se také zobrazují jako cytoplazmatický ornament, ale mnohem jemnějším zrněním ve srovnání s cANCA. Pouze malé množství buněk (typicky 40 % nebo méně) se zobrazí s fluorescencí. Někdy se vzorek může manifestovat více než jednou protilátkou, například kombinací cANCA a pANCA nebo ANCA plus ANA.
5
6.
7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.
Někteří nemocní se zánětlivým onemocněním střeva nebo ulcerózní kolitidou mají v séru reaktivní neutrofilní protilátky.16 Tyto vzorky se jeví jako pANCA pozitivní u ethanolem fixovaných neutrofilů, přičemž barvení je akcentováno perinukleárně. Na sklíčkách fixovaných formalinem se tyto vzorky typicky jeví jako negativní se slabou homogenní cytoplazmatickou fluorescencí. Nesprávné zacházení se sklíčky během barvící procedury, zejména pokud sklíčka mezi jednotlivými kroky vyschnou, může vést k vymytí fluorescenčního obrazce a vysoké úrovni barvení pozadí. Použití reagencií z jiných typů flurescenčních protilátkových sad (zejména konjugátu) může nepříznivě ovlivnit senzitivitu a specificitu ethanolem fixovaných sklíček s neutrofilním substrátem. Řada různých externích faktorů může také ovlivnit senzitivitu testu, včetně toho jaký typ fluorescenčního mikroskopu je použit, jaká je síla a stáří žárovky, jaké je užito zvětšení, jaký je systém filtrů a pozorovatel. Pokud je použit propustný filtr namísto barérového 515 filtru, bývá výsledkem zvýšené arteficiální zbarvení. K označení sklíček má být použita pouze tužka. Použití jiných psacích materiálů může vést k artefaktům. Všechny coplin nádobky, které se používají k promytí sklíček, musí být očištěny od všech barevných reziduí. Barevná rezidua v coplin nádobkách by mohla způsobit artefakty. Výsledky tohoto testu by měly být interpretovány v souvislosti s klinickým vyšetřením a dalšími sérologickými nálezy. Charakteristiky testu nebyly s výjimkou séra stanoveny pro žádné jiné formy. Separátně lze objednat sklíčka klasifikovaná jako „Reagencie Specifické pro Analyt“. Výkonnostní analytické charakteristiky testu jsou stanoveny pouze jako součást sady NOVA Lite® ANCA.
Očekávané hodnoty Stopatnáct náhodně vybraných normálních vzorků bylo testováno pomocí ethanolem fixovaných NOVA Lite® ANCA sklíček. Tyto vzorky byly odebrány během lékařských prohlídek u zaměstnavatele, takže nezahrnují starší osoby ani děti. Vzorky jsou náhodnou směsí mužů a žen. Všech 115 sklíček bylo negativních při skríningové diluci 1:20. Dále bylo testováno 45 nemocných s Wegenerovou granulomatózou, 39 s mikroskopickou polyarteritidou a 20 se srpkovitou glomerulonephritidou a dále pacienti s různými typy onemocnění pojivové tkáně. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce: Skupina pacientů
Náhodné normální kontroly Wegenerova granulomatóza Mikroskopická polyarteritida Srpkovitá glomerulonephritida SLE Sjogrenův syndrom Sklerodermie Polymyositidy
Počet pacientů
115 45 39 20 27 21 15 6
% pozitivních
0 89 100 100 7 0 0 0
(všechny cANCA) (všechny pANCA) (všechny pANCA) (obě pANCA a cANCA)
Sklíčka NOVA Lite® ANCA byla jedno po druhém porovnávána cytocentrifugovanými preparáty neutrofilů, které se rutinně používají v ANCA referenčním univerzitním centru. Bylo testováno padesátpět pozitivních sér (23 cANCA, 28 pANCA, 4 atypické) a 14 ANCA negativních vzorků. 54 z těchto 55 pozitivních vzorků vytvořilo barvení identické jako barvení sklíčky NOVA Lite® ANCA. Jeden vzorek s nízkým titrem cANCA se manifestoval na sklíčku INOVA jako negativní. Všech 14 ANCA negativních vzorků bylo rovněž negativní na NOVA Lite® ANCA sklíčkách. Titrace 55 pozitivních vzorků na obou substrátech přinesla stejné výsledky, a to rozdíl v jednom dvojitém ředění u 53 testovaných vzorků. Zbývající 2 vzorky se lišily ve 2 dvojnásobných ředěních. Čtyřicetosm náhodných vzorků séra bylo testováno ve významné USA referenční laboratoři pro ANCA testy. Vzorky byly simultánně testovány na ANCA, pomocí sklíček NOVA Lite® ANCA a dále na specifické MPO a PR-3 protilátky pomocí sady INOVA QUANTA Lite® ELISA. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.
6
Č. vzorku
% ELISA pozitivních MPO PR3 negativní 8 0 0 pANCA 13 84 0 cANCA 21 0 95 c + pANCA 5 80 0 Atypické 1 0 0 Osm vzorků bylo imunofluorescenčně ANCA negativních. Všech osm vzorků bylo zároveň ELISA negativních na MPO a PR-3. Hladiny MPO a PR-3 byly 1-5 jednotek, tedy dostatečně pod hranicí pozitivity (20 jednotek). Třináct vzorků bylo pomocí IFA hodnoceno jako pANCA pozitivní. Jedenáct z těchto bylo zároveň MPO pozitivní a žádný nebyl PR-3 pozitivní. Dvacetjedna vzorků bylo cANCA pozitivních imunofluorescenčně. Žádný ze vzorků nebyl MPO pozitivní, zatímco 20 z 21 vzorků bylo PR-3 pozitivních. Pět vzorků bylo IFA pozitivní zároveň na pANCA i cANCA. Čtyři z těchto byly MPO pozitivní a žádný nebyl PR3 pozitivní. Jeden vzorek byl hodnocen jako atypické pANCA. Tento atypický pANCA vzorek byl negativní v MPO a PR3 sadách. Výsledek testu IFA
Shoda ANCA výsledků - ELISA vs. IFA Zatímco MPO a PR3 jsou hlavními antigeny, odpovídajícími pANCA a cANCA, uživatel by si měl být vědom, že protilátky proti některým jiným primárním granulárním enzymům neutrofilů se také může manifestovat jako cANCA a pANCA pozitivní, a to imunofluorescenčně, na neutrofilech fixovaných ethanolem. To zvláště platí pro případ pANCA protilátek, kde se minimálně 3 další autoprotilátky k jiným antigenům než je MPO mohou manifestovat jako imunofluorescenčně pANCA pozitivní. K ilustraci této situace byla zhodnocena skupina vzorků Wegenerovy mikroskopické polyarteritidy a srpkovité glomerulonefritidy a dále 48 vzorků předložených k rutinnímu sérologickému testování na vaskulitidu. Výsledky imunofluorescence a metody ELISA u neutrofilů fixovaných ethanolem jsou popsány níže.
cANCA IFA
pANCA IFA
+
QUANTA Lite® PR-3 IgG + 60 6
-
1
85
+
QUANTA Lite® MPO IgG + 47 30
-
0
75
Relativní citlivost Relativní specificita Shoda
Relativní citlivost Relativní specificita Shoda
90,9 % 98,8 % 95,4 %
61,0 % 100 % 80,3 %
Ze 66 cANCA IFA pozitivních vzorků bylo 6 negativních na PR3 a 1 vzorek pozitivní metodou ELISA, ale negativní metodou IFA. Ze 77 pANCA IFA pozitivních vzorků bylo 30 negativních na specifickou MPO pomocí ELISA. Žádné pANCA u IFA negativních vzorků nebylo pozitivní na MPO pomocí ELISA.
7
Reference 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.
Goeken JA, Antineutrophil cytoplasmic antibody - a useful serological marker for vasculitis. J Clin Immunol 11:161-174, 1991. Specks U, et. al., Anticytoplasmic autoantibodies in the diagnosis and follow-up of Wegener’s granulomatosis. May Clin Proc 64:28-36, 1989. van der Woude FJ, et. al., Autoantibodies against neutrophils and monocytes: tools for diagnosis and marker of disease activity in Wegener’s granulomatosis. Lancet 423-429, 1985. Cohen-Tervaert JW, et. al., Association between active Wegener’s granulomatosis and anticytoplasmic antibodies. Arch Intern Med 149:2461-2465, 1989. Cambridge, et. al., Antineutrophil antibodies in inflammatory bowel disease: prevalence and diagnostic role. Gut 33:668-679, 1992. Nolle B, et. al., Anticytoplasmic autoantibodies: their immunodiagnostic value in Wegener’s granulomatosis. Ann Int Med 111:28-40, 1988. Charles LA, Falk RJ, Jennette JC, Clin Immunol Immunopathol 53:243-253, 1989. Falk RJ, Jennette JC, Anti neutrophil cytoplasmic autoantibodies with specificity for myeloperoxidase in patients with systemic vasculitis and idiopathic necrotizing and crescentic glomerulonephritis. N Engl J Med 318:1651-1657, 1988. Jennette JC, Wilkman AS, Falk RJ, Am J Path 135:921-930, 1989. Gross WL, Ludemann G, et. al., Lancet 1:806, 1986. Cohen-Tervaert JW, et. al., Association of autoantibodies to myeloperoxidase with different forms of vasculitis. Arth and Rheum 33(8):1264-1272, 1990. Cohen-Tervaert JW, et. al., Autoantibodies against myeloid lysosomal enzymes in crescentic glomerulonephritis. Kidney Int 37:799-806, 1990. Cohen-Tervaert JW, et. al., Detection of autoantibodies against myeloid lysosomal enzymes: a useful adjunct to classification of patients with biopsy proven necrotizing arteritis. Am J Med 91:59-66, 1991. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2009 Stroncek DF, et. al., Neutrophil alloantibodies react with cytoplasmic antigens: a possible cause of false-positive indirect immunofluorescence assays for antibodies to neutrophil cytoplasmic antigens. Am J Kidney Dis 21:368-373, 1993. Hardarson S, et. al., Antineutrophil cytoplasmic antibody in inflammatory bowel and hepatobiliary diseases. Clinical Microbiology and Immunology 99: No. 3, 1992.
NOVA Lite, QUANTA Lite a INOVA Diagnostics, Inc, jsou registrované ochranné známky Copyright 2012 Všechna práva vyhrazena Vyrobila společnost: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 Spojené státy americké Technický servis (pouze USA a Kanada): 877-829-4745 Technický Servis (mmo území USA): 1 858-805-7950
[email protected]
Autorizovaný zástupce v EU: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Německo Tel.: +49-6894-581020 Fax: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 628290CZH
Prosinec 2011 Revize 1
8
