NITROGÉN-MONOXID SZEREPE T LIMFOCITA AKTIVÁCIÓBAN. Dr. Koncz Ágnes

Doktori értekezés

NITROGÉN-MONOXID SZEREPE T LIMFOCITA AKTIVÁCIÓBAN

Dr. Koncz Ágnes

Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Buzás Edit egyetemi docens, orvostudományok doktora Hivatalos bírálók: Dr. Bajtay Zsuzsanna Ph.D., tudományos munkatárs Dr. Igaz Péter Ph.D., egyetemi tanársegéd Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Füst György egyetemi tanár, orvostudományok doktora Szigorlati bizottság tagjai: Prof. Dr. Sipka Sándor egyetemi tanár, orvostudományok doktora Dr. Pállinger Éva Ph.D., tudományos munkatárs Budapest 2008.

TARTALOMJEGYZÉK I.RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉK ……………………………………………………….4 II.BEVEZETÉS …………………………………………………………………5 A. T limfociták jellemzői ……………………………………………………....5 B. T limfocita aktiváció és nitrogén-monoxid ………………………………….6 C. Nitrogén-monoxid …………………………………………………………8 D. Nitrogén-monoxid szerepe a mitokondrium bioszintézisben……………..11 E. Nitrogén-monoxid szerepe az immunregulációban ………………………13 F. Reaktív oxigén intermedierek és szerepük T limfociták aktivációjában…...15 G. Hisztamin ………………………………………………………………….19 H. Hisztamin hatása a T limfociták citokintermelésére és érésére…………….22 III. CÉLKITŰZÉSEK ……………………………………………………………….26 IV. MÓDSZEREK

…………………………………………………………………27

A. T limfocita aktiváció mérése ……………………………………………..27 B. Hisztidin dekarboxiláz génkiütött (HDC-KO) állat………………………27 C. Áramlás citometriás mérések …………………………………………...28 D. Western-blot módszer ……………………………………………………..30 E. ELISPOT módszer

………………………………………………………31

F. Nitrit/nitrát mérés

……………………….......................................32

G. PCR alapú technikák ……………………………………………………...32 H. Statisztikai elemzések ……………………………………………………33 V. EREDMÉNYEK ……………………………………….........................................34 A. Nitrogén-monoxid szerepének vizsgálata T limfociták aktivációjában …….34 B. HDC-KO egér eltérő citokintermelése………………………………………42 C. Hisztamin hatása a limfociták nitrogén-monoxid termelésére ..…………….44 D. Eltérő T limfocita aktiváció a HDC-KO egerekben ………………………..46

2

E. Nitrogén-monoxid hatása az IFN-γ termelésre .…………………………….48 VI. MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK ……………………………50 VII. ÖSSZEFOGLALÁS

…………………………………………………………56

VIII. SUMMARY …………………………………………………………………...58 IX. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK LISTÁJA …………………………………………….59 X. KÖSZÖNTENYILVÁNÍTÁS …………………………………………………. 61 X. IRODALMI JEGYZÉK ……………………………………………………….62

3

I. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

TCR: T sejt receptor Th: T helper sejtek NO: nitrogén-monoxid ZAP-70: ζ-associated protein-70 LAT: linker for activation of T cells IP3: inozitol-1,4,5-trifoszfát ROI: reaktív oxigén intermedierek NOS: nitrogén-monoxid szintetáz; nNOS, neuronális NOS; eNOS, endotheliális NOS; iNOS, indukálható NOS 2-APB: 2-aminoetoxidifenil borát MnTBAP: mangán (III) tetrakis (4-benzoesav)porfirin klorid C-PTIO: carboxi-2-fenil-4,4,5,5-tetrametil-imidazolin-1-oxil-3-oxid HE: hidroetidin TMRM: tetrametilrhodamin metil észter DAF-FM: 4-amino-5-metilamino-2’,7’-difluorofloureszcein diacetát Fluo-3: fluoro-3 acetoximetil-észter NOC-18:

(Z)-1-[2-(2-aminoetil)-N-(2-ammonioetil)amino]diazen-1-ium-1,2-diolát

dietilenetriamin ConA: Concavalin A CFA: komplett Freund’s adjuváns HDC: hisztidin dekarboxiláz IL: interleukin IFN: interferon

4

II. BEVEZETÉS A. T limfociták jellemzői T limfociták központi szerepet játszanak az adaptív immunválaszban. A sejtfelszínükön expresszálódó T sejt receptor (TCR) az antigén prezentáló sejt (APC) felszínén exresszálódó fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) által bemutatott antigénepitóp specifikus felismerésére képes. T limfociták érése a thymusban történik, melynek során az autoreaktív T limfociták kiszelektálódnak. A thymusból perifériára kerülő T sejtek jellegzetes sejtfelszíni receporaik alapján több típusba sorolhatók. A CD8 sejtfelszíni receptorral rendelkezőket citotoxikus T sejteknek (Tc) nevezzük. Mint nevük is mutatja sejtkárosító hatással rendelkeznek, fontos szerepük van az intracelluláris parazitával, vírussal fertőzött sejtek és a tumor sejtek elpusztításában, illetve fő mediátorai a traszplantáció után fellépő kilökődési mechanizmusnak. A CD4 sejtfelszíni receptort viselő sejteket T helper (Th) sejteknek nevezzük. Jellemzőjük, hogy aktiváció során immunválaszt befolyásoló citokineket termelnek. Ezeket a sejtek citokintermelése alapján több alcsoportba sorolhatjuk: Th1, Th2, Th17. Th1 sejtek elsősorban IL-2, IFN-γ, és IL-12 citokineket termelnek, jellemző transzkripciós faktoruk a T-bet. A Th2 sejtek által termelt citokinek az IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13; jellegzetes transzkripciós faktoruk a GATA-3. Az újabban leírt Th alcsoport a Th17, melynek jellemző citokinje az IL-17, transzkripciós faktora pedig a ROR-γ, irodalmi adatok szerint fontos szerepe van egyes autoimmun betegségek patomechanizmusában. A CD4 sejtfelszíni receptorral rendelkező T limfociták egy további csoportját alkotják az un. regulatorikus T sejtek (Treg). Ezeket a sejteket szupresszor T sejteknek is nevezik mert legfontosabb feladatuk a T sejt által közvetített immunválasz gátlása illetve a thymusból a perifériára kerülő autoreaktív T sejtek gátlása. Az irodalom a Treg limfociták két csoportját különbözteti meg; a természetes Treg és az adaptív Treg populációt. A természetes Treg sejtek jellemzője a sejtfelszínen expresszálódó CD4 mellett magas CD25 (IL2Rα) receptor expresszió illetve a foxp3 transzkripciós faktor kifejeződése. Ezen sejtek érése a thymusban történik, míg az adaptív Treg sejtek a periférián alakulnak ki az immunválasz során [1.]

5

A

T

limfociták

felszínén

expresszálódó

molekulák

valamint

a

sejtek

mikrokörnyezetében jelenlévő citokinek és szolubilis molekulák fontos részét képezik a T sejt aktivációnak és érésnek. Munkánk során vizsgáltuk hogy két bioaktív molekula, a nitrogén monoxid (NO) és a hisztamin milyen szerepet játszik a T sejtek aktivációjában, jelátviteli folyamataiban és citokin termelésében.

B. T limfocita aktiváció és nitrogén monoxid Az antigén kötődése a T sejt receptorhoz (TCR) Lck és Fyn tirozin kinázok aktiválódásához vezet. Ezen tirozin kinázok felelősek a TCR ζ lánc és a CD3 alegység foszforilációjáért, melyek ilyen formában a ζ- associated protein-70 (ZAP-70) molekulát képesek lehorgonyozni és ezáltal aktiválni. A ZAP-70 protein foszforilálja a ’linker for activation of T cells’ (LAT) proteint, mely direkt módon kötődik többek között a foszfolipáz C-γ1-hez. A foszfolipáz C-γ1 katalizálja a foszfatidol-inozitol-4,5bifoszfát hidrolízisét inozitol-1,4,5-triszfoszfáttá (IP3) és diacilglicerollá (DAG). Az IP3 kötődése belső Ca2+ raktárakon lévő receptorához Ca2+-ot mobilizál, létrehozva ezzel a citoplazmatikus Ca2+-szignált. A DAG protein kináz-C aktivációt okoz. Ezek a útvonalak

továbbiakban

traszkripciós

faktorok

aktiválásáért,

citokintermelés

beindításáért, T sejt proliferációért felelősek [2;3]. (1. ábra) A T sejt aktivációhoz azonban a T sejt receptor (TCR) által közvetített folyamat mellett kostimulációs szignálokra (CD28, CD40 ligand, LFA-1, CD2) is szükség van. A T sejt aktiválással párhuzamosan jelentős strukturális változások is bekövetkeznek, ami szintén nélkülözhetetlen részjelensége a hatékony T sejt aktivációnak. A T limfocita antigénprezentáló sejt felé eső részén kialakuló szupramolekuláris aktivációs komplex (SMAC) aktivált enzimeket, adaptor proteineket, szignáltranszdukcióban részvevő proteineket tartalmaz és szabályozza ezek konformációváltozását. Ezen kívül a T sejt membránja ezen a részen koleszterolban és szfinglipidben gazdaggá válik, un. lipidtutajok (raftok) alakulnak ki. A T sejt aktiváció során tehát létrejön az immunológiai szinapszis, melyben a sejt polarizálttá válik [4;5;6].

6

ANTIGÉN

α β kostimulációs szignálok

CD3 ε γ ζ ζ

P

Lck/Fyn P

P

LAT

P

P

P

P

P

PLCγ1 P

PIP2

ZAP-70 P

IP3 + DAG Ca2+ szignál

PKC aktiváció

NO T sejt aktiváció, proliferáció 1. Ábra: T sejt receptor aktivációt követő jelátviteli folyamatok sematikus rajza. A T sejt immunszinapszisban történő polarizációjának részjelensége az az újabban leírt szubcelluláris megfigyelés, miszerint a T sejt antigénprezentáló sejttel kapcsolódó részében kétszer nagyobb mennyiségű NO termelődik mint a citoplazma többi részében. Ennek hátterében az eNOS megváltozott lokalizációja áll. Az immunológiai szinapszisban fokozott NO termelés új megvilágításba helyezi a T sejt aktiváció folyamatát, a helyileg nagyobb mennyiségben termelődő NO ugyanis befolyásolja a CD3 ζ lánc és a ZAP-70 foszforilációt [7]. Ezen eredmények is alátámasztják a NO T sejt aktivációban betöltött szerepét [8].

7

C. Nitrogén-monoxid

A nitrogén-monoxid (NO) a sejtfunkciók fontos és sokrétű fiziológiás szabályozója. NO-t emittáló gyógyszereket használunk egyes betegségek gyógyítására, továbbá az NO a környezetünkben is jelentős mennyiségben megtalálható. Molekuláris oxigénből és nitrogénből igen magas hőmérsékleten, például a légkörben villámlás során keletkezhet. NO termelődik továbbá a belső égésű motorok, erőművek működése során is. NO és ózon kemiluminescens reakciója során oxigén és nitrogén dioxid keletkezik, a folyamatot kísérő fény fotodetektorral laboratóriumi körülmények között mérhető, ez képezi a NO mérésére használható egyik módszer alapját is. Az ózonnal történő reakciója miatt a NO az ózonréteg elvékonyodásában, továbbá a savas esők kialakulásában is szerepet játszik. A NO fontos intra-, trasz- és intercelluláris hírvivő molekula mely számos fiziológiás és patológiás folyamatban szerepet játszik. A NO egyik legjobban ismert funkciója az értónus szabályozása, vazodilatációt okoz, növeli az oxigén szükségletet [9;10]. A NO élettani hatásainak kutatásában elért eredményeiért Robert F Furchgott, Louis J Ignarro és Ferid Murad 1998-ban Nobel díjat kapott, fő kutatási területük a NO szív és érrendszeri szerepének vizsgálata volt. Megfigyeléseik szerint a NO számos jelátviteli útvonalat szabályozó gáz, mely a legtöbb jelátvitelt szabályozó anyaggal szemben, szabadon átjut a biológiai membránokon. A NO egyik fontos intracelluláris hatása tiol és cisztein csoportok S-nitrozilációja. Ez a poszttranszlációs módosulás reverzibilis módon befolyásolja a proteinek funkcióját. A másik ismert hatásmechanizmusa a guanil cikláz aktivitásának befolyásolása révén a cGMP szint emelkedése [11]. Szervezetünkben NO L-argininből képződik, nitrogén monoxid szintetáz (NOS) enzimek által katalizált folyamatban, melyhez NAPH és tetrabiopterin kofaktor jelenléte szükséges [12]. Három NOS izoformát ismerünk: a neuronális NOS-t (nNOS, NOS1), az indukálható NOS-t (iNOS, NOS2) és az endoteliális NOS-t (eNOS, NOS3). A három izoforma génjei különböző kromoszómán helyezkednek el, nNOS a 12. kromoszóma

8

24.1-31 régiójában; az iNOS a 17. kromoszóm 11.2-12 régiójában; az eNOS pedig a 7. kromoszóma 35-36 régiójában. Ghafourifar és Cadenas 2005-ben leírt a mitokondrum belső membránjában elhelyezkedő, Ca2+ függő módon működő NOS izoformát, melyről még kevés, ellentmondásos irodalmi adattal rendelkezünk [13]. Az eNOS és nNOS folyamatosan expresszálódik, aktivációja Ca-calmodulin függő. Ezek az izoformák felelősek a sejtek kis mennyiségű, alap szintű NO termelésért. Ezzel ellentétben az iNOS működése transzkripciós szinten szabályozott és ez az izoforma nagy mennyiségű NO termelésért felelős. eNOS érendothel sejtekben történő expressziója szerepet játszik az értónus fenntartásában és a trombocita aggregáció gátlásban illetve endothel sejtekhez történő adhéziójának megakadályozásában. Az idegsejtekben folyamatosan expresszálódó nNOS által termelt NO a ’non-adrenerg non-cholinerg’ (NANC) idegvégződések fontos neuromodulátora. Makrofágokban az iNOS elsősorban a mikrobiális endotoxinok és proinflammatórikus citokinek hatására indukálódik [14]. A NO élettani és patológiás folyamatokban betöltött szerepének tanulmányozásához a különböző genetikailag módosított állatmodellek jelentős segítséget nyújtanak. Az nNOS génkiütött állat jellemző betegsége a pylorus sphincter hipertrófia, az agresszív magatartásforma és fokozott védelem az agyi ischemiával szemben. Az eNOS knockout állat jellemzői közé tartoznak a vasculáris léziók, hipertenzió és a fogékonyság az agyi ischemiára. Az iNOS génkiütött állat legjellemzőbb fenotípusos elváltozása pedig a fertőzésekkel szembeni fokozott érzékenység és a bakteriális lipopoliszacharidokra adott csökkent hipotenzív válasz [15]. A NO rövid féléletidejű, (3-15 másodperc) szuperoxiddal (O2-) reagálva spontán peroxinitritté (ONOO-) alakul. A peroxinitrit maga is oxidálószer, vagy átalakul nitráttá, mely stabil, jól mérhető, a NO termeléssel arányos mennyiségben termelődő vegyület [16] (2. ábra).

9

Citrullin

NO

+szuperoxid

NOS

Nitrit/Nitrat

L-Arginin

2. Ábra: Nitrogén monoxid képződés és bomlás vázlata

10

Peroxinitrit

D. Nitrogén-monoxid szerepe a mitokondrium működésben és bioszintézisében

A mitokondriumok képezik az oxidatív foszforiláció és a terminális oxidáció színhelyét ahol a szervezetünk működéséhez energiát szolgáltató ATP több mint 90 százaléka termelődik. Az oxidatív foszforiláció tulajdonképpen elektrontranszfer az elektron donor (pl. NADH) és az elektron akceptor (oxigén) között. Az elektron transzfer redox reakciók során valósul meg, amit a mitokondrium belső membránjában elhelyezkedő protein-komplexek biztosítanak. Alapvetően öt protein komplex vesz részt a folyamatban, melyek a következők: NADH-koenzim Q oxidoreduktáz (komplex I), szukcinát-Q

oxidoreduktáz

(komplex

II),

elektron

transzfer

flavoprotein-Q

oxidoreduktáz, Q-citokróm-c oxidoreduktáz (komplex III), citokróm-c oxidáz (komplex IV). Az elektron transzportláncon történő végighaladása során felszabaduló energia a mitokondrium belső membránján keresztüli protontranszportra használódik. Ezt a folyamatot kemiozmózisnak nevezzük, melynek során a membrán két oldala között elektrokémiai gradiens alakul ki. Ez a grádiens két részből áll, pH grádiensből és elektromos potenciál különbségből [17]. A mitokondrium belső membránján át mérhető elektromos potenciálkülönbség mértéke 180-200 mV, negatív belül és potenciálszenzitív fluoreszcens festékekkel jól detektálható. A kemiozmózis formájában tárolt energia végül ATP szintézist eredményez, a mitokondrium belső membránjában elhelyezkedő ATP szintáz enzim segítségével. Ez az enzim a fennálló proton gradiens rovására felszabaduló energiát ATP szintézisre használja:

11

ADP + Pi + 4H+→ ATP 4H+mitok.matrix

Az utóbbi években derült fény arra hogy a NO a mitokondriális légzés fiziológiás szabályozója. Szabályozza a mitokondriumok ATP szintézisét és oxigén felhasználását azáltal hogy alacsony koncentrációban reverzibilisen gátolja a citokróm-c oxidázt. A citokróm-c oxidáz az elektron transzportlánc utolsó enzimje, mely a sejt csaknem teljes oxigén fogyasztásáért felelős. Alacsony koncentrációban a NO az oxigénnel versenyezve reverzibilisen gátolja az enzimet, ATP depléciót okozva [18]. Ezenkívül a NO a mitokondrium bioszintézis fő regulátora is, hatását a cGMP- függő peroxiszóma proliferator-activating receptor γ coactivator-1 molekulán (PPAR-γ coactivator-1) keresztül fejti ki. Jelenlegi ismereteink szerint a barna zsírsejtek, U937 sejtek, HeLa sejtek és humán limfociták mitokondrium bioszintézise befolyásolható NO-val[19]. A sejt pillanatnyi állapotától függően a NO egyaránt gátolhatja, vagy stimulálhatja a programozott sejthalál folyamatát. A NO szuperoxiddal (O2-) reagálva spontán peroxinitritté (ONOO-) alakul. A peroxinitrit erélyes oxidálószer, igen toxikus, nagyobb mennyiségben apoptózist vagy nekrózist okoz, kisebb mennyiségben jelátviteli útvonalak szabályozásában vesz részt. Ezenkívül a NO mitokondriális hiperpolarizációt és ATP depléciót okoz astrocitákon, Jurkat sejteken. NO-t emittáló vegyületekkel (NO donor) mitokondriális és citoplazmatikus Ca2+ szignál váltható ki. Jurkat sejteken a FAS indukálta apoptózis során NO termelés mérhető [20;21].

12

E. Nitrogén-monoxid szerepe az immunregulációban A NO sokrétű szabályozója az immunfolyamatoknak is. Az irodalomból jól ismert, hogy az iNOS nagy mennyiségű NO termelése révén citotoxikus hatással rendelkezik. Számos tanulmány foglalkozik a makrofágokban az iNOS által termelt NO antimikrobiális és tumor sejt károsító hatásával. A sejtkárosító hatást különböző enzimek gátlása révén fejti ki. A NO gátolja például a célsejtek mitokondriális légzési láncának I, IV komplexét, a ribonukleotid reduktázt, gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenázt ezen kívül DNS-t módosító hatása is van. A makrofágok iNOS termelését elsősorban a Th1 immunválasz citokinjei (INF-γ, TNF-α, IL-1β) valamint bakteriális termékek (LPS, Staphylococcus enterooxin B) indítják be [22]. Mivel az iNOS transzkripció órákon át tartó nagy mennyiségű NO termelést eredményez, transzkripciója pontosan szabályozott. Az iNOS expresszió NF-κB útvonalon keresztül szabályozott [23;24]. Az NF-κB transzkripciós faktor, homo- és heterodimer formában fordul elő a citoplazmában, gátló proteinekhez, az IκB-hez kötődve. Megfelelő stimulus hatására (citokinek, mikrobiális termékek, UV sugárzás) IκB kináz aktiválódik és az IκB-k foszforilálódnak. Foszforilált IκB gyors proteolízisen megy keresztül aminek eredményeként NF-κB felszabadul a komplexből és specifikus szekvenciájának köszönhetően (5’-GGGRNNYYCC-3’) kötődni tud megfelelő DNS szekvenciához. Az NF-κB kötő DNS szekvencia az indukálható gének promóter régiójában található mint pl. citokinek, adhéziós molekulák, antioxidáns enzimek és iNOS. Érdekes módon az NF-κB útvonalat maga a NO is befolyásolja. Citokin aktivált asztroglia és mikroglia sejteken NO donorral gátolható az iNOS expresszió. Ennek hátterében több mechanizmust írtak le, egyik szerint NO hatására nitrozilálódik az NF-κB DNS kapcsolódásban szerepet játszó p50-es alegység 62 ciszteinje, így nem tud léterjönni a DNS - NF-κB komplex [25]. Ezenkívül ismert az is hogy NO hatására fokozódik az IκBα inhibitor protein stabilitása, szintén gátolva ezzel a NF-κB útvonalat. Ezek a hatások azonban függnek a sejt pillanatnyi redox állapotától, nagy koncentrációjú glutation és redox aktivitással rendelkező proteinek (thioredoxin) kivédik a NO ezen hatásait [26]. Ugyanakkor bizonyos körülmények között NO fokozza a NF-κB által szabályozott gének expresszióját, mint a COX-2, TNF-α, gluthation szintetáz [27;28]. Az NF-κB útvonalra kifejtett serkentő hatás molekuláris mechanizmusa kevésbé ismert.

13

Feltehetően az oxidatív stresszre aktiválódó p21ras nitrozilációja játszik szerepet ebben a folyamatban [29;30]. Ezek az eredmények arra engednek következtetni hogy a NO génexpresszió szabályozásban gátló és serkentő módon egyaránt részt vesz. Egér makrofágokon végzett kísérlet szerint a NO koncentráció függő módon gátolni és serkenteni is tudja az NF-κB útvonalat, ezáltal számos proinflammatorikus gén (pl. citokinek, COX-2, iNOS) expresszióját ki- illetve bekapcsolja. Kis koncentrációjú NO (30 nM – 3 μM) NF-κB-t aktiváló hatása érvényesül, míg nagy koncentrációban (30 – 300 μM) NF-κB útvonalat gátolja. A kis koncentrációjú NO termelésért eNOS és nNOS izoformák felelősek, míg a nagy koncentrációjú NO termelés az iNOS izoformára jellemző. A NO NF-κB útvonalra kifejtett kettős hatása magyarázatot ad az irodalomban ellentmondásosnak ismert olyan eredményekre mint a Th1 sejtekre, osteoclastokra, apoptózisra kifejtett serkentő és gátló hatás [31].

14

F. Reaktív oxigén intermedierek és szerepük a T limfociták aktivációjában Reaktív oxigén intermedierek (ROI) közé tartoznak: a szuperoxid anion, a hidrogénperoxid, a hidroxil gyökök és a szabad gyökök (3. ábra). Jellemezőjük az extrém mértékű instabilitás, mely a külső elektronpályán elhelyezkedő páratlan elektronnak köszönhető. Instabil konfigurációjuk következtében gyorsan reagálnak más molekulákkal vagy gyökökkel, miközben stabil molekulák képződnek. A szervezetben többféle módon keletkezhetnek ROI-k. Képződhetnek külső ionizáló sugárzás hatására, vagy a sejtlégzés melléktermékeként, mikor ez elektronok az elektron transzportláncon történő áthaladásuk során direkt módon reakcióba lépnek az oxigénnel [32]. Ezeken kívül, bizonyos sejtek ROI szintézisre is képesek NADPH oxidáz (makrofágok) vagy mieloperoxidáz (neutrofil granulociták) enzimjeik révén.

o

o

Szuperoxid anion

o

H

Hidroxil gyök

H

o

o

H

Hidroxil ion (OH-)

o H

Hidrogén peroxid 3. Ábra: Legfontosabb reaktív oxigén

intermedierek sematikus rajza, a külső

elekronhéjon lévő elektronok ábrázolásával.

15

A ROI-k erőteljes oxidáló hatásuknál fogva jól ismert sejtkárosítók, oxidálják a proteineket, lipideket és a DNS-t. Sejtkárosító hatásaik közül legismertebb a lipid peroxidációt okozó hatásuk. Lipidperoxidációs folyamatban a többszörösen telítetlen zsírsavak kettős kötés mellet elhelyezkedő metilén csoporton (-CH2) lévő reaktív hidrogén vesz részt [33] (4. ábra).

iniciáció

Molekuláris áterndeződés Lipid gyök prolongáció

termináció

4. Ábra: Lipidperoxidáció folyamata.

A sejtek képesek védekezni a ROI károsító hatásaival szemben illetve képesek a ROI által okozott károsodások helyreállítására. Egyik védekezési mechanizmus antioxidáns enzimek segítségével történik. Ilyen enzimek a szuperoxid dizmutáz és a kataláz. A szuperoxid dizmutáz (SOD) a következő reakciót katalizálja: 2 O2- + 2 H+ → O2 + H2 O 2

16

A SOD a sejtekben kétféle lokalizációban található, a mitokondrium mátrixban, és citoplazmában. A mitokondriális forma mangánt, a citoplazmatikus forma cinket és rezet tartalmaz. A kataláz enzim a hidrogén peroxidot oxigénné és vízzé bontja: 2 H2O2 → 2 H2O + O2 A szervezetben ezenkívül számos antioxidáns hatással rendelkező molekula megtalálható, mint például az E vitamin (alfa-tokoferol), C-vitamin, glutation, melanin. Az antioxidánsok gyökfogó molekulák, melyek redukáló tulajdonságuknál fogva a ROI oxidatív hatását kivédik. Abban az esetben, ha a sejtekben az oxidatív és antioxidatív egyensúlya felborul oxidatív stressz állapota alakul ki. 1950-es években Dehman Harman írta le először az ún. „free radical theories” (FRTA) elméletet [34]. Lényege, hogy a normál sejtlégzés során termelődő szabad gyökök által létrehozott károsodások a szervezetben évek során felhalmozónak és az öregedés folyamatát eredményezik. Ez az elmélet később tovább bővült, ma már jól ismert a ROI szomatikus mutációt, protein károsodást és lipidperoxidációt okozó hatása, melyek mind részét képezik az öregedés folyamatának. Elsősorban a lassan bomló proteinek (mint a kollagén, elasztin) reaktív aminosavainak oxidációja illetve glikozilációja tehető felelőssé ezért a folyamatért. Ma már ismert az is, hogy a ROI által okozott oxidatív károsodás

nemcsak

az

öregedésben,

hanem

a

neurodegeneratív

betegségek

kialakulásában is szerepet játszik, mint például Alzheimer-kór, Parkinson kór, de szerepe van más betegségek patomechanizmusában is (pl. atherosclerosis, diabetes szövődményei, arthritis, tumoros betegségek) [35;36]. A ROI előbb ismertetett sejtkárosító hatásán túl nélkülözhetetlen szabályozója számos fiziológiás folyamatnak. Hidrogén peroxid keletkezése szükséges a pajzsmirigy által termelt tiroxin hormon szintéziséhez. Szintén ROI termelődik a makrofágokban és a neutrofil granulocitákban a baktériumok fagocitózisa során, mely a sejtek antibakteriális hatásához szükségesek. A makrofágok baktériumölő hatásában a NADPH oxidáz enzim működése biztosítja ROI termelődését. NADPH oxidáz a következő reakciót katalizálja: NADPH – 2e- + 2 O2 → NADP+ + H+ + 2 •O2-

17

Ha az enzim genetikai károsodás miatt nem működik az X kromoszómához kötött chronicus granulomatosus betegség alakul ki. A betegség jellemzője a bakteriális infekció, melyet elsősorban azok a baktériumok okoznak, melyek katalázt termelnek, például E. coli, Salmonella, Staphylococcus törzsek. A ROI ezenkívül a sejtek szignálfolyamataiban is részt vesz. Fontos szabályozója például a programozott sejthalál, az apoptózis beindításának és folyamatának. A T limfociták TCR-nek megfelelő specifikus antigénnel történő találkozásuk során aktiválódnak, differenciálódnak és osztódnak. Ezen hatások eredménye az lesz, hogy kialakul egy aktivált effektor T sejt populáció. Az aktivált T sejtek egy része memória T sejtté alakul és a limfoid szövetet elhagyva a keringés segítségével nem limfoid szövetekbe vándorol. Másik részük apoptózissal elpusztul, ezt a folyamatot aktiváció indukálta sejthalálnak (AICD) nevezzük. Az AICD molekuláris mechanizmusának hátterében a TCR aktivációt követő Fas és Fas ligand (FasL) expresszió áll. Számos irodalmi adat támasztja alá a ROI központi szerepét a T limfocita aktiváció során bekövetkező fokozott Fas és FasL expresszióban [37; 38; 39]. A TCR aktivációt követrő 15 percen belül fokozott ROI termelés detektálható [ 40 ]. Bár a TCR aktivációra bekövetkező ROI szignálhoz vezető útvonal kevésbé ismert, a legújabb eredmények azt mutatják hogy a ZAP-70, LAT, PLCγ1 deficiens sejtvonalon a TCR aktiváció indukálta ROI szignál nem váltható ki. Kiváltható ugyanakkor a DAG mimetikus hatással rendelkező phorbol 12-miristát 13-acetáttal (PMA), továbbá a PKC siRNS-el történő blokkolása gátolta a TCR aktivációt követő ROI szignált és a Fas, FasL expresszió fokozódását [41]. Ezek az eredmények arra utalnak hogy a T sejt aktiváció következtében kialakuló ROI szignál fontos részét képezi a normál T limfocita funkciónak.

18

G. Hisztamin

A hisztamin (β-imidazolylethylamin) különböző fiziológás folyamatok és patológiás állapotok fontos mediátora. Szerepet játszik az idegrendszer ingerület átviteli folyamataiban, hipofizis hormonok szekréciójában, a gyomor-bélrendszer és a kardiovaszkuláris rendszer működésében. Irodalmi adatok szerint a melanóma sejtek proliferációját közvetlenül befolyásolja, ezáltal hatása van a melanóma progressziójára [42;43]. Ezenkívül jól ismert immunregulátor, fő mediátora az allergiás reakciónak, részt vesz a fertőzésekben, gyulladásos reakciókban. Hisztamin L-hisztidinből keletkezik hisztidin dekarboxiláz enzim (HDC) által katalizált folyamatban (5. ábra).

Hisztidin dekarboxiláz (HDC)

Hisztamin

L-Hisztidin

5. Ábra: Hisztamin képződés

19

A hisztidin dekarboxiláz enzim (HDC) csaknem minden szöveti sejtben expresszálódik [ 44 ], legnagyobb mértékben a hízósejtekben és bazofil granulocitákban, melyek a hisztamint nagy mennyiségben tárolni is képesek granulumaikban. Lebontásáért a diamin oxidáz és a hisztamin N-methyltraszferáz enzimek felelősek. A hisztamin metabolizmusban illetve a hisztamin által kiváltott jelátviteli folyamatokban szerepet játszó gének polimorfizmusa összefügg különböző patológiás folyamatok kialakulásával, lezajlásával és a terápiára adott válasszal [45]. Számos irodalmi adat utal a hisztamin immunregulációban betöltött szerepére. Különböző kísérletek eredményei a hisztamin mind gyulladást serkentő, mind gyulladást gátló hatását leírják. A hisztamin farmakológiai hatását négy különböző receptoron (HR) keresztül fejti ki: 1-es típusú hisztamin receptor (H1R), 2-es típusú hisztamin receptor (H2R), 3-as típusú hisztamin receptor (H3R) és a legújabban felfedezett 4-es típusú hisztamin receptor (H4R) (1. táblázat).

20

Hisztamin

Sejttípus

receptor

Intracelluláris szignál

simaizomsejtek, májsejtek, porcsejtek, H1R

endotélsejtek, idegsejtek, granulociták, monociták, dendritikus sejtek, T és B

intracelluláris Ca2+ ↑

sejtek idegsejtek, simaizomsejtek, májsejtek, H2R

porcsejtek, endotélsejtek, granulociták, monociták, dendritikus sejtek, T és B

cAMP ↑

sejtek, Hisztaminerg neuronok, eozinofil H3R

granulociták, dendritikus sejtek,

cAMP ↓

monociták Eozinofil, neutrofil, bazofil granulociták, H4R

dendritikus sejtek, T sejtek (helper),

cAMP

hízósejt 1. táblázat: Összefoglaló táblázat a hisztamin receptorok sejt-specificitásáről illetve fő jelátviteli mechanizmusairól

A hisztamin receptorok G-protein kapcsolt receptorok, H1R és H2R stimulácója elsősorban a Gq és Gs proteinek aktivációját, míg a H3R és H4R stimuláció Gi/0 protein aktivációt okoz. A hisztamin egyaránt kialakíthat gátló és serkentő hatást attól függően hogy milyen típusú hisztamin receptor, milyen mértékben expresszálódik az adott sejten. A T limfocitákban a H1R által közvetített jelátviteli folyamat a Gq/11 G protein család tagjain keresztül kommunikál a T sejt receptor (TCR) által közvetített jelátviteli folyamatokkal [46].

H. Hisztamin hatása a T limfociták citokin termelésre és érésére A hisztamin immunfolyamatok szabályozásában betöltött szerepét bizonyítják azok az eredmények is, melyek a citokin termelést befolyásoló hatásáról szólnak. Perifériás humán mononukleáris sejteken és a CD19 depletált alpopulációban a hisztamin gátolja a lipopoliszacharid (LPS) által okozott interferon-γ (IFN- γ) szintézist mRNS és protein szinten egyaránt [ 47 ]. Ugyanakkor a hisztamin H2R-on keresztül fokozza az interleukin-6 (IL-6) [48], interleukin-1 (IL-1) termelést [49],dózis függő módon pedig gátolja a humán monociták interleukin-12 (IL-12) termelést [50]. A H2R-on keresztül kifejtett hatása szelektív H2R antagonistával gátolható, míg szelektív H1R illetve H3R antagonistával ez a hatás nem befolyásolható. A hisztamin T sejtek IL-2 termelésére gyakorolt hatása kettős, gátló vagy serkentő hatás egyaránt lehetséges. Ez a kettős hatás függ egyrészt a hisztaminnal történő kezelés módjától, a kezelt sejtek típusától, másrészt a T sejt aktiváció időbeli lefutásától. Abban az esetben például, ha perifériás mononukleáris sejtek vagy T sejtvonalak hisztaminnal történő kezelése az aktiváció kezdeti szakaszában történik, erőteljes IL-2 és IFN-γ expresszió fokozódás jön létre, az aktiváció későbbi szakaszában viszont ezen citokinek termelésére a hisztamin gátló hatást fejt ki. [51]. A perifériás szövetekben elhelyezkedő éretlen dendritikus sejtek antigénnel történő találkozásuk után érési folyamaton mennek keresztül, ezalatt történik az antigén feldolgozása, miközben megváltozik a sejtfelszíni molekulák expressziós mintázata és a sejtek citokineket kezdenek termelni. Ezután az érett dendritikus sejtek a nyirokszövetekbe vándorolnak, ahol naiv T sejteknek bemutatják a feldolgozott antigént. A dendritikus sejtek érésében szerepe van a sejtek mikrokörnyezetének is. Abban az esetben, ha a dendritikus sejtek érése az elsősorban hízósejtek és bazofilek degranulációjából származó hisztamin jelenlétében történik, csökken a dendritikus sejtek IL-12 termelése, ugyanakkor fokozódik az IL-10 termelésük. Abban az esetben viszont, ha az érés során hisztamin nincs jelen, a dendritikus sejtek IL-12 termelése fokozódik. Antigén prezentáció során a dendritikus sejtek által termelt IL-12 fontos szerepet tölt be a naív T sejtek T helper sejtekké érésében. Az elsősorban dendritikus sejtekből származó IL-12 jelenlétében ugyanis a naív T sejtek T helper 1 típusú sejtekké

22

(Th1) érnek, melyek jellemző citokinjei az IFN-γ, TNF-β, IL-2; jellemző transzkripciós faktoruk a T-bet. Ha az antigén prezentáció során gátolt a dendritikus sejtek IL-12 termelése, a T sejtek T helper 2 típusú sejtekké (Th2) érnek, melyek jellemző citokinjei az IL-4, IL-5, IL-10, IL-13; jellemző transzkripciós faktoruk pedig a GATA-3 [52] (6. ábra).

23

IL-12 MHC Antigen TCR

IL-12 IL-12R

H2R

PKC

Ca2+ signal STAT4

IL-4

cAMP

PKA

p38 MAPK

STAT1

STAT6 IFN-γ

T-bet

IL-5

IL-4R

GATA3 IL-2

IL-4 IL-13

6. Ábra: T helper sejtek érését befolyásoló tényezők és jelátviteli útvonalak egyszerűsített rajza. (Szaggatott nyíl: gátlást jelöl)

24

A hízósejtek degranulációja során felszabaduló hisztamin tehát fontos szabályozója a naiv T sejtek T helper 2 sejtekké történő differenciálódásának. Az allergén által keresztkötött IgE molekula kapcsolódva a hízósejt felszínén expresszálódó FcεRI receptorhoz a hízósejt granulumainak plazmamembránnal való összeolvadását idézi elő, azaz létrejön a degranuláció folyamata [53]. Jól ismert hogy az allergiás, atópias betgségek Th2 túlsúllyal járnak. Allergiás egyénekben a fokozott Th2 típusú immunválasz beindítójának az allergén által keresztkötött IgE sejtfelszíni receptorhoz való kapcsolódását teszik felelőssé. Összehasonlítva az egészséges egyének és allergiás egyének allergének által kiváltott T sejt mintázatát, Akdis és munkatársai azt találták, hogy az egészséges egyénekben az allergén- specifikus regulatorikus T (Treg) sejtek szubpopulációja dominál, míg allergiásokban az allergén-specifikus IL-4 termelő Th2 sejtek jelenléte a meghatározó. Ezek az eredmények azt mutatják hogy az allergén-specifikus Treg és Th2 sejtek megváltozott egyensúlya fontos szerepet játszik az allergiás betegségek kialakulásában [54]. Az újabban alkalmazott allergén-specifikus immunterápia (SIT) éppen a fokozott Th2 immunválasz megfékezését célozza meg azáltal, hogy serkenti az allergénspecifikus Treg sejtek által közvetített immunválaszt. Az allergén-specifikus immunterápia hatására megjelenő Treg sejtek többféle szupresszor mechanizmus (IL-10, TGF-β citokin termelés illetve a sejtfelszínükön megjelenő citotoxikus T-limfocita antigen 4 és programmed death-1) révén csökkentik az IL-4, IL-5, IL-13-at termelő CD4+ T sejtek (Th2) számát, létrehozva ezzel a perifériás T sejt toleranciát. Ezenkívül a megnövekedett IL-10 és TGF-β termelés hatására megváltoztatják a ’pro-allergén’-IgE és a ’protektív’-IgG4 arányt is [ 55 ; 56 ; 57 ]. Az allergén-specifikus immunterápia legújabb eredményei szerint a hisztamin által közvetített jelátviteli folyamat interferál a perifériás T sejt toleranciával. A terápia során adott H1R antagonista fokozza a specifikus tolerancia mechanizmust és a vakcináció gyulladást gátló hatását [58].

25

II. CÉLKITŰZÉSEK ¾ Célunk volt humán T limfociták CD3/CD28 aktivációra kialakuló intracelluláris Ca2+ szignállal párhuzamosan végbemenő NO és ROI termelés mérése illetve a mitokondriális membránpotenciál detektálása és vizsgálata. ¾ Vizsgáltuk hogy az IP3 receptor antagonista 2-ABP és a NO kelátor C-PTIO és a szuperoxid dizmutáz gátló MnTBAP önmagában alkalmazva hogyan befolyásolja a CD3/CD28 stimuláció során létrejövő szignálfolyamatokat. ¾ Választ kerestünk arra a kérdésre is, hogy a NO donor NOC-18 hogyan befolyásolja az intracelluláris és mitokondriális Ca2+ szignált, ROI termelést és a mitokondriális hiperpolarizációt. ¾ Vizsgáltuk melyik NOS izoforma expresszálódik T limfocitákban nyugalmi állapotban illetve CD3/CD28 stimulációra. ¾ Vizsgáltuk továbbá a NO T sejt aktivációban és citokin termelésben betöltött szerepét olyan genetikailag módosított állatmodellben, melyben hiányzik a T sejt érésben és aktivációban szintén fontos szerepet játszó molekula, a hisztamin. ¾ Összehasonlítottuk a HDC-KO egér és a vad típusú egerek limfocitáinak citokin- és NO termelését, a Con-A stimulációra fellépő intracelluláris Ca2+ szignált, a ROI termelést és mitokondriális membránpotenciál változást. ¾ Mivel szignifikáns eltérést találtunk a HDC-KO és vad típusú egér limfocitáinak IFN-γ és NO termelésében, megvizsgáltuk hogy a NO és a hisztamin hogyan befolyásolja a sejtek IFN-γ termelését.

26

III. MÓDSZEREK A. Humán T limfocita aktiváció mérés Humán perifériás mononukleáris sejteket (PBMC) alvadásgátolt vénás vérből FicollHypaque grádiensen centrifugálva nyertünk, majd a perifériás limfociták (PBL) izolálása céljából autológ szérummal fedett Petri csészében tenyésztettük. Ezután a perifériás limfocitákat 106/ml sejtkoncentrációban RPMI 1600-as médiumban vettük fel, ami 10% fetal bovin szérumot (FBS), 2 mM L-glutamint, 100 IU/ml penicillint, 100 μg/ml gentamicint tartalmazott. A sejteket 37˚C-os 5% CO2-t tartalmazó termosztátban tartottuk. T sejt aktivációhoz a sejtek tenyésztése olyan plate-en történt, melyet először CD3 ellenes OKT3 monoklonális antitesttel (CRL 8001; American Type Culture Collection, Manassas, VA) 1 órán keresztül inkubáltuk, majd PBS-el mostuk.. Az így előkezelt lemezekre 106/ml koncentrációban limfocitákat helyeztünk. A CD28 kostimulációhoz 500 ng/ml monoklonális CD28 antitestet használtunk (BD PharMingen, San Diego, CA). A sejteket a kísérlettől függően 4, 12, 24 vagy 48 órán keresztül stimuláltuk.

B. Hisztidin dekarboxkáz génkiütött (HDC-KO) állat A genetikailag módosított HDC-KO egértörzset intézetünkkel együttműködésben Ohtsu és társai homológ rekombinációval hozták létre. A HDC-KO CD1 egereket kilenc generáción keresztül kereszteztük BALB/C egértörzsbe [59]. Az állatokat intézetünk állatházában SPF körülmények között tarottuk. Kísérletekeinkhez 8-10 hetes hím egereket használtunk, melyek legalabb két héttel a kísérletek megkezdése előtt hisztamin mentes tápot (Altromin Gmbh., Németország) kaptak. Mivel a hisztamin termelésért felelős egyetlen enzim, a hisztidin dekarboxiláz nem működik az állatokban, illetve a hisztamin-mentes diéta az exogén hisztamin bevitel lehetőségét is megakadályozza,

az állatok immunfolyamatai hisztamin mentesen zajlanak.

Kísérleteinkhez HDC-KO és vad típusú egerek lépéből izolált sejteket használtuk. Bizonyos kísérletekhez az állatokat CFA-val oltottuk, majd kilenc nap elteltével

27

izoláltuk a lépsejteket. A sejteket RPMI 1640 komplett médiumban vettük fel 106 sejt/ml koncentrációban. A sejtek stimulálásához 2 μg/ml ConA-t használtunk.

C. Áramlási citometriás mérések Az intracelluláris és mitokondrális Ca2+ koncentráció, NO termelés, ROI termelés, mitokondriális membránpotenciál, intracelluláris IFN-γ, sejtfelszíni CD markerek mérését áramlási citometriával végeztük, BD FACS Calibour készülékeken. A műszer 20mV argon lézerrel (emisszió maximum: 488 nm) és 16 mV hélium-neon lézerrel (emisszió max.: 634 nm) van felszerelve. Az elpusztult sejteket és sejttörmelékeket a vizsgálatból forward- és side scatter mintázatuk alapján kizártuk. Mérésenként 10.000 sejtet számoltunk meg, kivétel a gyors Ca2+ szignál mérés, ebben az esetben a mérési idő a stimulációt követő 10 percig tartott. Intracelluláris Ca2+ koncentráció mérés A citoplazmatikus Ca2+ koncentráció méréshez 1 μM Fluo-3-acetoxymthyl észter (Molecular Probes) fluoreszcens festéket használtunk. A festék lipidoldékony, így a sejtek könnyen felveszik. Miután a sejtekbe került, a citoplazmában lévő észterázok hatására az észter csoport lehasad, miáltal vízoldékonnyá válik, így a sejtben marad. A festékhez ilyen formában kötődik a Ca2+. A Ca2+-ot kötött festék fluoreszencia intezitása sokszorosára fokozódik (excitációs hullámhossz maximuma: 506 nm, emissziós hullámhossz maximuma: 526 nm) amit az áramlási citométer FL-1 csatornáján detektálunk. T sejt aktiváció hatására kialakuló gyors Ca2+ szignál mérésénél a sejteket 25 percig inkubáltuk 37˚C-on 1 μM Fluo-3 festéket tartalmazó komplett RPMI 1600 médiumban, majd 3 percen keresztül mértük az alap fluoreszcencia intenzitást áramlási citométeren. Ezután ConA-val, vagy CD3/28-al stimuláltuk a sejteket és további 10 percen át rögzítettük a fluoreszcencia intenzitást. Fenntartott Ca2+ szignált 4 órás, 24 órás és 48 órás stimuláció után mértünk. A Ca2+ szignál gátlását a membrán permeábilis 2-ABP-t 10 μM és 1 mM koncentrációkban

teszteltük.

Eredményes

Ca2+

szignál

gátlást

100

μM

végkoncentrációban kaptunk, így a kísérletek során ebben a koncentrációban használtuk.

28

Az egér limfocitákon végzett kísérletekben Ca2+ kelátor BAPTA-AM-el (Molecular Probes) gátoltuk a Ca2+ szignált, 10 μM koncentrációban. Mitokondriális membránpotenciál és tömeg mérés A

mitokondriális

membránpotenciál

mérésére

tetramethylrhodamine-methylester-perchlorate

a

(TMRM)

kationos

lipidoldékony

fluoreszcens

festéket

(excitációs hullámhossz 543 nm, emissziós hullámhossz 567 nm) használtunk 1 μM-os koncentrációban (Molecular Probes). TMRM anélkül kötődik szelektíven az aktívan működő mitokondrium membránhoz, hogy bármilyen citotoxikus hatást kifejtene. A membránkötött forma fluoreszcencia intenzitása a mitokondriális membránpotenciállal korrelál. Mérés megkezdése előtt a sejteket 15 percig inkubáltuk a festékkel 37˚C- os CO2 termosztátban. Az áramlási citométer FL-2 csatornáján mért fluoreszcencia intenzitás a mitokondriális membránpotenciállal korrelál. A

mitokondrium mennyiség

fluoreszcens

festéket,

nonyl

meghatározásához

membránpotenciáltól

független

acridine

(NAO)

50

orange

használtunk

nM

végkoncentrációban. NAO a mitokondriumok kardiolipinjéhez kötődik függetlenül a sejt energiaállapotától. Sejteket 15 percig inkubáltuk a festékkel 37˚C- os CO2 termosztátban, sötétben. A NAO excitációs hullámhossza 490 nm, emissziós hullámhossza 540 nm, mely az áramlási citométer FL-1 csatornáján detektálható. ROI termelés mérése A reaktív oxigén intermedierek (ROI) termelésének mérésére hidroetidin (HE) (Molecular Probes) oxidációra érzékeny fluoreszcens festéket használtunk. A sejtek 1 μM HE-el inkubáltuk 37˚C-os termosztátban 15 percig, majd áramlási citométerrel megmértük a sejtek fluoreszcencia intenzitását (az oxidált HE emmissziós hullámhossza: 605 nm; FL-2). A fluoreszcencia intenzitás a termelődött ROI mennyiségével arányos. A ROI termelés gátlására illetve a T sejt aktivációra bekövetkező ROI szignál gátlására szuperoxid-dizmutáz gátlót (superoxide dismutase mimic manganese (III) tetrakis (4-benzoic acid) porphyrin chloride) (MnTBAP) 300 μM-os koncentrációban használtunk.

29

NO termelés mérése Limfociták

NO

termelésének

méréséhez

4-amino-5-methylamino-2',7'-difluoro-

fluorescein diacetát (DAF-FM) festéket használtunk (Molecular Probes). DAF-FM passzív diffúzióval átjut a sejtmembránon, majd az intracelluláris észterázok deacetilálják, így lipidoldékonyságát elveszti, a sejtből nem tud kijutni. A festék fluoreszcens tulajdonságai megváltoznak mikor NO-hoz kötődik. NO kötődés hatására benzotriazollá

alakul,

melynek

excitációs

hullámhossza

495

nm,

emiszziós

hullámhossza 515 nm. A festék fluoreszcencia intenzitása arányos a sejt által termelt NO koncentrációjával. A sejteket 2 órán keresztül inkubáltuk 1 μM DAF-FM festéket tartalmazó komplett RPMI 1640 médiumban, 37˚C- on CO2 termosztátban. Intracelluláris IFN-γ mérés és T sejt szubpopuláció meghatározás A HDC-KO és a vad típusú egerek lépéből izolált sejteket 48 órán át 2 μg/ml ConA-val stimuláltunk, majd GolgiPlug Protein Transpot inhibitorral (BD Biosciences) kezeltük 5 órán át 37˚C -os CO2 termosztátban. Ezután 0,5 μg/ml fluoreszcens festékkel konjugált monoklonális antitesttel megfestettük a vizsgálni kívánt sejtfelszíni CD markerekkel, 30 percig 4˚C-on. Az antitestek a következők voltak: CD3-PE, CD8-PerCP, CD45-Per-CP vagy CD25-PerCP-Cy5 (BD Biosciences). Mosási lépés után a sejteket fixáltuk és permeabilizáltuk Fixation/permeabilization (BD Boisciences) oldattal 20 percig 4˚C-on. Az újabb mosási lépés után (Perm/Wash Buffer BD Biosciences) 0,5 μg/ml FITC-el konjugált monoklonális IFN-γ antitesttel (BD Biosciences) inkubáltuk 30 percig 4˚C-on, sötétben. Végül a sejteket PBS-ben mostuk és analizáltuk három vagy négy csatornán az előzőekben említett áramlási citométeren.

D. Western-blot módszer NOS izoformák expresszióját humán perifériás limfocitákban Western-blot módszerrel vizsgáltuk. A sejteket NOS szolubilizáló oldatban vettük fel, mely 10 mM HEPES-t (pH 7.4), 320 mM szacharózt, 100 μM EDTA-t, 1.5 mM DTT-t, 10 μg/ml leupeptint, 10

30

μg/ml aprotinint, 1 mg/ml PMSF-t, és 10 μM tetrahydrobiopterint tartalmazott. Ebben az oldatban háromszori fagyasztás-olvasztás során lizáltuk a sejteket, majd 15000xg sebességgel centrifugáltuk. A centrifugálás után a felülúszó proteinkoncentrációját Bradford- módszerrel (Bio-Rad) határoztuk meg, majd 20 μg protein-lizátumot 7,5% SDS- polyacrylamid gélen szétválasztottunk. A szétválasztás után a proteineket nitrocellulóz membránra blottoltuk. A nitrocellulóz membránokat a három NOS izoformának megfelelő monoklonális antitesttel detektáltuk, kontollként β-aktin ellenes monoklonális antitestet használtunk. NOS izoformák detektálása ECL (Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus; PerkinElmer) reagenssel, β-aktin detektálása 4-chloronaphthol szubszráttal történt. Az egyes izoformák relatív mennyiségét Kodak Image Station 440CF készüléken, Kodak 1D Image Analysis software (Eastman Kodak) automatikus denzitometrás programjával határoztuk meg.

E. ELISPOT módszer T sejteket egér lépszuszpenzióból negatív szelekcióval mágneses gyöngyökkel (Miltenyi Biotech) szeparáltunk. 96 lyukú ELISPOT lemezt (MultiScreen; Millipore) anti-IFN-γ, vagy anti-IL-10 vagy anti-IL-4 capture monoklonális antitestekkel (Duoset; R&D Systems) inkubáltuk egy éjszakán át, majd 1% FCS-t tartalmazó PBS-el blokkoltuk 1 órán át 37°C-on, CO2 termosztátban. Ezután helyeztük rá a szeparált sejteket 105 sejt/lyuk koncentrációban, duplikátumban. A sejtek 2 μg/ml ConA- val stimuláltuk, egyes kísérletekben a ConA- val történő stimulálással együtt NO donorral 60 μM [(Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolatediethylenetriamine] (NOC-18) vagy NOS gátlószerekkel (600 μM 7-nitronidazolide vagy 100 μM NG-mono-methyl – L-arginine) (Moleculáar Probes) is kezeltük a sejteket. A stimuláció minden esetben 24 órán át tartott, 37°C-on, 5% CO2 termosztátban. Utána a lemezeket PBS Tween-20-al 10-szer mostuk, majd streptavidin-HRP-vel konjgált detektáló antitesttel inkubáltuk 1 órán át. Újabb 10 mosási lépés után hozzáadtuk a kromogén szubsztrátot (aminoethyl carbazole és H2O2,Sigma-Aldrich), mellyel 20 percen át inkubáltuk, majd desztillált vízzel mostuk. A kiszáradt membránokon a spotszámot ELISPOT reader (CTL) segítségével határoztuk meg.

31

F. Nitrit/nitrát mérés A HDC-KO és vad típusú egerektől nyert szérumból nitrát/nitrit meghatározára HighSensity Nitrit Assay Kitet (Molecular probes) használtunk.

G. PCR alapú technikák Reverz transzkritpáz PCR (RT-PCR) Az RT-PCR vizsgálatokat CFA-val oltott HDC-KO és vad típusú egerek lépsejtjein végeztük. A lépből teljes RNS-t preparáltuk TRI reagenssel (Sigma- Aldrich), majd random hexamerekkel (Promega) cDNS-be írtuk át. Az RT-PCR reakció során a következő primereket használtuk: egér IFN-γ szenz: CCT CAG ACT CTT TGA CT, antiszenz primer: CAG CGA CTC CTT TTC CTC TT, (54°C, 35 ciklus); egér GADPH szenz primer: CTG GTG CTG AGT ATG TCG TG, antiszenz primer: CAG TCT TCT GAG TGG CAG TG (57°C, 30 ciklus). A PCR Perkin-Elmer thermal cycler készüléken végeztük, a PCR terméket 3%-os agaróz gélen futtattuk. Kvantitatív RT-PCR T sejteket az egér lépszuszpenzióból negatív szelekcióval mágneses gyöngyök segítségével (Miltenyi Biotech) szeparáltunk. Az így szeparált sejtekből RNS-t prepaláltunk Rneasy Mini Kit (Qiagen) felhasználásával. A preparált RNS-t random primerekkel (Promega) cDNS-be írtuk át. A NOS enzim mindhárom izoforma relatív mennyiségének meghatározásához standard TaqMan real-time RT-PCR technikát alkalmaztunk. A kvantitatív mérést ABI Prism 7000 Sequence Detector (Applied Biosystems)

készüléken

mértük.

A

mennyiségi

analízist

a

küszöbciklusok

összehasonlításával végeztük. A NOS enzimek mRNS-ének mennyiségét a mintákkal párhuzamosan

megmért

hypxanthine

phosphoribosyl

mennyiségének arányában adtuk meg.

32

transferase

(HGPRT)

H. Statisztikai elemzések Az eredmények értékeléséhez Student t tesztet hasznaltunk, nem parametrikus eloszlást mutató

adatok

esetén

Mann-Whitney

tesztet

szignifikánsnak tekintettük, ha p<0,05.

33

alkalmaztuk.

Az

eredményeket

V. EREDMÉNYEK A. Nitrogén-monoxid szerepének vizsgálata T limfociták aktivációjában Humán T limfociták CD3/CD28 antitesttel történő 4 órás és 24 órás stimuláció hatására: • Ca2+ szignál (4 óránál 3,9 ± 0,75-szeres Ca2+cc. emelkedés p=0,001; 24 óránál 2.77+/-0.75-szeres Ca2+cc. emelkedés p= 0.0043 a nyugalmi szinthez képest) • mitokondriális membránpotenciál szignál (4 óránál 1,73±0.44-szeres membránpotenciál emelkedés

p=0,001; 24 óránál 1,53± 0.17-szeres membránpotenciál

emelkedés p=0,001 a nyugalmi szinthez képest) • fokozott ROI termelés (4 óránál 1,53±0.36-szoros emelkedés p= 0.002; 24 óránál 4.57±1.75-szeres emelkedés p= 0.001 a nyugalmi szinthez képest) • illetve ezekkel a folyamtokkal párhuzamosan NO szignál (4 óránál 6.09±2.98-szeres p= 0.001; 24 óránál 4.9±1.8-szeres emelkedés) mérhető (7. ábra).

34

Kontroll

CD3/CD28 4 óra

965

358

788

115 Fluo3

NITROGÉN MONOXID

CD3/CD28 24óra

952

497

Fluo3

Fluo3

NITROGÉN MONOXID

NITROGÉN MONOXID

50 283

DAF-FM

DAF-FM

266

DAF-FM

7. Ábra: A humán perifériás limfociták CD3/CD28 antitesttel történő stimuláció hatására bekövetkező citoplazmatikus Ca2+ koncentráció, mitokondriális membránpotenciál és nitrogén monoxid termelés változásának mérése áramlási citometriás módszerrel (n=6) .

IP3 receptor antagonista hatása T limfocita aktivációra Jól ismert hogy TCR aktiváció során keletkező inozitol-1,4,5-tiszfoszfát (IP3) intracelluláris receptorhoz (IP3R) történő kapcsolódása az endoplazmatikus retikulum raktáraiból Ca2+ felszabadulást eredményez, ami fontos része a T sejt aktiváció hatására bekövetkező Ca2+ szignálnak. Ezért megvizsgáltuk, hogy a membrán permeábilis IP3 receptor antagonista 2-aminoetoxidifenil borát (2-APB) hogyan befolyásolja a fent leírt szignálfolyamatokat. Azt találtuk, hogy a 2-APB csökkenti a CD3/CD28 kostimulációra fellépő Ca2+ szignált, NO szignált, továbbá csökkenti a mitokondriális hiperpolarizáció mértékét, illetve csökkent ROI termelést is eredményez.

35

Szuperoxid dizmutáz hatása a T limfocita aktivációra A szuperoxid dizmutáz (MnTBAP) jelentősen csökkentette a CD3/CD28 stimulációra fellépő ROI szignált, hatására kis mértékben csökken a Ca2+- és NO jel.

NO kelátor hatása a T limfocita aktivációra A specifikus NO kelátor carboxi-2-fenil-4,4,5,5-tetrametil-imidazolin-1-oxil-3-oxid (CPTIO) viszont gátolja a CD3/CD28 kostimulációra fellépő intracelluláris Ca2+ szignált, mitokondriális hiperpolarizációt, a ROI szignált és természetesen a NO szignált is. (8. ábra)

Kontroll

CD3/CD28 20 perc C-PTIO

NITROGÉN MONOXID

CD3/CD28 4 óra C-PTIO

NITROGÉN MONOXID

8. Ábra: A humán perifériás limfocitákban CD3/CD28 + NO kelátor C-PTIO kezelés hatására bekövetkező citoplazmatikus Ca2+ koncentráció, mitkondriális membránpotenciál és a nitrogén monoxid termelés mérése áramlási citometriás módszerrel. (n=9)

36

Thapsigargin, ionomycin hatása a T limfocita aktivációra Mivel a CD3/CD28 kostimuláció hatására létrejövő mitokondriális hiperpolarizáció gátolható 2-ABP-vel és C-PTIO-val, ezért megvizsgáltuk hogy az intracelluláris Ca2+ emelkedés önmagában hogyan hat a mitokondriális folyamatokra. Humán perifériás limfocitákat Ca2+ ATPáz gátló thapsigarginnal illetve kalcium ionofor ionomycinnel kezelve TCR aktivációtól független intracellulális Ca2+ koncentráció emelkedés jön létre. Eredményeink szerint sem a thapsigargin sem az ionomycin hatására létrejövő Ca2+ koncentráció emelkedés nem okoz mitokondriális memránpotenciál változást és NO szignált, önmagában tehát nem elégséges a hatásos T sejt aktivációhoz (9.A, B. ábra).

9A. Ábra: Ionomycin hatása a humán perifériás limfociták citoplazmatikus Ca2+ koncentráció, a mitokondriális membránpotenciál és a nitrogén monoxid termelés változására. A dot plot ábrák X tengelyén a citoplazmatikus Ca2+ koncentráció (Fluo-3), Y tengelyen a mitokondriális membránpotenciál (TMRM) látható. A hisztogrammok a NO (DAF-FM) termelést mutatják. (n=9)

37

9B. Ábra: Thapsigargin hatása a humán perifériás limfociták citoplazmatikus Ca2+ koncentráció, mitokondriális membránpotenciál és nitrogén monoxid termelésre. . A dot plot ábrák X tengelyén a citoplazmatikus Ca2+ koncentráció (Fluo-3), Y tengelyen a mitokondriális membránpotenciál (TMRM) látható. A hisztogrammok a NO (DAF-FM) termelést mutatják (n=9).

NO-donor hatása a T limfociták aktivációjára A NO mitokondriális membránpotenciálra kifejtett hatásának vizsgálatához humán perifériás limfocitákat NO donor - NOC-18 – molekulával kezeltünk. 60 μM NOC-18 hatására intracelluláris NO termelés figyelhető meg, mely a kezelést követő 4 óra múlva 3,13±0,8-szoros (p=0,04), 24 óra múlva pedig 3,7±0,6-szeres (p=0,003) emelkedést mutat, a sejtek életképességét nem befolyásolva. Kísérleteink során azt találtuk, hogy 24 órán át 60 μM NOC-18-al történő kezelés hatására a limfociták mitokondriális membránpotenciálja 3,5± 0,79-szörösére emelkedik (p=0,002). Ezzel párhuzamosan, emelkedett intracelluláris, Ca2+ koncentrációt és ROI szintet mértünk (10. ábra).

38

10. Ábra: A NO donor (NOC-18) hatása a humán perifériás limfociták a citoplazmatikus Ca2+ koncentráció, a mitkondriális membránpotenciál és a nitrogén monoxid termelésre. A dot plot ábrák X tengelyén a citoplazmatikus Ca2+ koncentráció (Fluo-3), Y tengelyen a mitokondriális membránpotenciál (TMRM) látható. A hisztogrammok a NO (DAF-FM) termelést mutatják. (n=9)

NOS izoformák detektálása Eredményeink szerint tehát NO szükséges a fiziológiás T sejt aktivációhoz, megvizsgáltuk tehát milyen NOS izoforma felelős a megnövekedett NO termelésért. Western-blot analízissel azt találtuk hogy humán perifériás limfocitákban eNOS és nNOS izoforma expresszálódik. Ezen izoformák szintje 15-szörösére növekszik 24 órás CD3/CD28 antitestekkel történő aktiváció során. Az iNOS izoforma nem detektálható limfocitákban, még CD3/CD28 stimuláció hatására sem. (11.A és 11.B ábra) Az eNOS és nNOS expresszió mértéke ugyanakkor fokozható 4 órán át 100 μM H2O2 –dal történő kezeléssel.

39

11.A. Ábra: Humán perifériás T sejtek eNOS és nNOS proteinszintek változása 4 órás és 24 órás CD3/CD28 kostimulációra illetve 100 μM H2O2 hatására, Wsterd-blot mószerrel. Konrollként aktint használtunk. A számok az aktinra normalizált denzitometriás értékek.

40

11.B. Ábra: Humán perifériás T sejtek iNOS protein expressziója. CC: porcsejt mint pozitív kontroll, C: stimulálatlan sejtek, S: 24 órás CD3/CD28 kostimuláció.

41

B. HDC-KO egér eltérő citokintermelése Munkánk során összehasonlítottuk a HDC-KO és vad típusú egerek lépsejtjeinek ConA stimulációra bekövetkező citokintermelését. Megmértük az IFN-γ, IL-4, IL-10 proteinek szintjét. Eredményeink szerint a HDC-KO állat lépsejtjei több IFN-γ-t termelnek mind mRNS mind protein szinten a vad típusú állatokéhoz képest. Az IL-4, IL-10 proteinek szintjében nem találtunk szignifikáns különbséget (12.A. és B. ábra).

interferon-γ

GADPH

VAD TÍPUS

HDC-KO

12.A. Ábra: HDC-KO és vad típusú állat lépsejtjeiből készült reprezentatív interferon-γ RT-PCR. (n=3)

42

Rel. spot szám 3

p=0.001

2

1

0 VAD TÍPUS

HCD-KO

12.B. Ábra: HDC-KO és vad típusú állat lépsejtjeiből készült interferon-γ ELISPOT. (n=6) Intracelluláris áramlási citometriás módszerrel megnéztük hogy az IFN-γ melyik T sejt szubpopulációban mutat eltérést. Azt találtuk hogy a CD4 pozitív, CD8 pozitív, CD45 pozitív és CD4/CD25 kettős pozitív alpopulációkban nincs különbség a HDC-KO és vad egerek limfocitáinak intracelluláris IFN-γ mennyiségében, valószínűleg a megváltozott IFN-γ termelésért a teljes T sejt populáció eltolódása felelős (nem ábrázoltuk).

43

C.

Hisztamin

hatása

a

limfociták

nitrogén-monoxid

termlésére Előző eredményeinkből ismert hogy a NO fontos szerepet játszik a T sejt aktivációban és érésben, megmértük tehát a limfociták NO termelését. A T limfociták NO termelése szignifikánsan különbözött a HDC-KO és a vad típusú egerek limfocitáiban. A HDCKO egér sejtjei 2,5-ször több NO termelnek (p=0,0009) mint a vad típusú egerek limfocitái. A ConA stimuláció hatására bekövetkező NO szignál is nagyobb mértékű a HDC-KO egerek limfocitáiban.(13.A. és B. ábra)

p=0.0009 Rel. DAF-FM fluoresc. int. 3 (NO)

2

1

0 HDC-KO

VAD típus

13.A. Ábra: HDC-KO és vad típusú állat limfocitáinak NO termelése. (n= 9)

44

Rel. DAF-FM fluoresc. int. 4 3,5

p=0.00024

p=0.00086

3 p=0.093

2,5

HDC KO VAD típus

2 1,5 1 0,5 0 óra

4 óra

24 óra

idő

13.B. Ábra: HDC-KO és vad típusú állat limfocitáinak ConA stimulációra bekövetkező NO szignálja.(n=6)

A következőkben vizsgáltuk melyik NOS izoforma expresszálódik a CD3 pozitív limfocitákban. Azt találtuk hogy mindhárom NOS izoforma (eNOS, nNOS, és iNOS) mRNS-e megtalálható a limfocitákban, legnagyobb mértékű expressziót azonban a nNOS mutat. Mindhárom izoforma nagyobb mennyiségben expresszálódik a HDC-KO egerekből származó limfocitában, bár külön-külön vizsgálva az izoformákat nem kaptunk szignifikáns különbséget. Mivel a hisztamin hiányos állat limfocitái több NO-t termelnek és a ConA stimunációra adott NO szignál is eltér a vad típusú állatokéhoz képest, megvizsgáltuk hogy a hisztamin hogyan befolyásolja a limfociták NO termelését. Azt az eredményt kaptuk, hogy mind a vad mind a HDC-KO limfociták NO termelése szignifikánsan csökkent, ha a 24 órás ConA stimuláció 10-6 M hisztamin jelenlétében történt (p=0,004 HDC-KO egérben, p=0,001 vad típus esetén). A NO féléletideje nagyon rövid, stabil végtermékei a nitrit és nitrát. Az egerek szérumának nitrit és nitrát szintjét megmértük, eredményünk szerint nincs szignifikáns különbség a HDC-KO és vad típusú egerek szérum nitrit és nitrát szinjében.

45

D. Eltérő T limfocita aktiváció a HDC-KO egerekben Előző munkánk eredményeiből ismert hogy T sejt aktiváció hatására Ca2+ szignál, mitokondriális membránpotenciál szignál és ROI szignál mérhető, melyeket a NO befolyásol. A HDC-KO egerek limfocitáiban a T sejt aktivációra bekövetkező gyors Ca2+ szignál eltér a vad típusétól. Eredményeink szerint mind a nyugalmi, mind a ConA stimuláció hatására bekövetkező gyors Ca2+ szignál szignifikánsan magasabb volt a génkiütött állat limfocitáiban (p=0,02; p=0,04), bár a ConA hatására létrejövő gyors Ca2+ szignál változásban (ΔCa2+) és a fenntartott Ca2+ szignálban nem találtunk különbséget (14. Ábra).

Rel. Fluo-3 fluoresc. int. 4,5 4 3,5

ConA stimuláció

3

HDC KO

2,5 Vad típus 2

1 0,5

p=0.04

p=0.02

1,5

p=0.04

p=0.02

p=0.03 1

p=0.05

2

3

4

5

6

7

8

9

10

perc

14. Ábra: HDC-KO és vad típusú állat limfocitáinak ConA stimulációjára bekövetkező gyors Ca2+ szignál.(n=3)

46

Mivel a HDC-KO egerek limfocitái szignifikánsan több NO-t termelnek, megvizsgáltuk hogy a fokozott NO termelés hogyan befolyásolja a mitokondrium biogenezist. Azt találtuk hogy a mitokondriális membránpotenciál nem különbözik a két állat limfocitáiban. A ConA hatására létrejövő ROI szignál viszont 24 órás stimuláció után szignifikánsan kisebb volt a HDC-KO egerek limfocitáiban.

47

E. Nitrogén-monoxid hatása az IFN-γ termelésre Az eddig bemutatott eredmények szerint a HDC-KO egér limfocitái több IFN-γ –t termelnek, ami együtt jár fokozott NO termeléssel is. Ismert, hogy a NO transzkripciós szinten befolyásolja a citokinek termelését, ezért megvizsgáltuk hogyan hat a limfociták IFN-γ termelésére. Vad típusú egerek limfocitáit ConA-val stimuláltuk NO donor (60 μM NOC-18) jelenlétében és jelenléte nélkül. ELISPOT módszerrel összehasonlítottuk a NO donorral és az NO donor nélkül 24 órán át stimulált IFN-γ-t termelő sejetek számát. Azt találtuk hogy 60 μM NOC-18 hatására az IFN-γ-t termelő sejtek száma szignifikánsan megnő (p=0,0002) (15. ábra).

p=0.0002

Rel. spot szám 1,6

1,2

0,8

0,4 ConA 24 óra

ConA + 60μM NOC-18 24h

15. Ábra: Vad típusú állat limfocitáinak ConA stimulációra illetve ConA + 60 μM NOC-18 (NO donor) hatására bekövetkező INF-γ termelő sejtek relatív mennyisége, ELISPOT módszerrel mérve.(n=6)

48

Megmértük a sejtek IFN-γ termlését NOS inhibitorokkal történő kezelés után is. Kétféle NOS gátlót alkalmaztunk (600 μM 7-nitronidazolide és 100 μM NG-mono-methyl – Larginine), mindkettőt olyan koncentrációban hogy mindhárom NOS izoformát gátolja. Eredményeink szerint a NOS gátlóval történt kezelés szignifikánsan csökkentette a sejtek IFN-γ termelését (p=0,01 és p=0,002) (16. ábra).

p=0,002 p=0,01

Nem stimulált

ConA stimuláció

ConA + 600 μM 7nitronidazole stimuláció

ConA + 100 μM NGMonomethyl-L-arginine stimuláció

16. Ábra: Reprezentatív ELISPOT ábra a vad típusú állat limfocitáinak ConA stimulációra illetve ConA + nitronidazole vagy ConA + monomethyl- L-arginine (NOS gátlók) hatására bekövetkező INF-γ termeléséről. (n=6) 10-6 M hisztaminnal történt kezelés a limfociták IFN-γ termelését nem befolyásolta, szignifikánsan csökkentette viszont a NO termelésüket. A HDC-KO egér limfocitái hisztamin hiányában több NO-t termelnek, a fokozott NO termelés pedig befolyásolja a sejtek IFN-γ termelését. Így eredényeink szerint elmondható hogy a hisztamin a NO termelés befolyásolásával is szerepet játszik a T sejt citokintermelés szabályozásában.

49

V I. MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK A T sejt receptor (TCR) aktiváció ZAP-70 protein aktiválódásához vezet, mely felelős a LAT foszforilációért aminek hatására a kialakuló aktivált PLCγ1 katalizálja az inozitol 1,4,5-trifoszfát (IP3) és diacilglicerol (DAG) keletkezését. Az IP3 továbbiakban a citoplasmatikus Ca2+ szignálért, a DAG a protein kináz-C (PKC) aktivációért felelős [ 60 ](1. ábra). A citoplazmatikus Ca2+ szignál korai jele a T sejt aktivációnak és nélkülözhetetlen a transzkripciós faktorok (NF-AT) aktiválódásában. A TCR stimuláció után perceken belül regisztrálható a gyors citoplazmatikus Ca2+ szignál, mely 5-10 percen át tart, illetve TCR aktiváció után 24-48 óra múlva a nyugalmi állapothoz képest emelkedett Ca2+ koncentráció mérhető [61]. A tartósan emelkedett Ca2+ szignál a T sejt proliferáció és differenciálódás jele. Megfelelő antigénepitóppal történő találkozás során a T limfocita tehát nyugvó állapotából egy nagyobb energiaigényű, aktivált állapotba kerül. A megnövekedett energiaszükségletet a sejt fokozott ATP termeléssel biztosítja, aminek egyrészt fokozott glukóz felhasználás, másrészt fokozott mitokondriális működés a következménye [62;63]. Mitokondriális hiperpolarizáció ismert korai jele a T sejt aktivációnak [64]. Oxidatív foszforiláció során az elektronok egy része az oxigénnel direkt módon reakcióba lép, ROI képződik. Több tanulmány is foglalkozik a T limfociták aktivációja során keletkező ROI szignál jelentőségével [39; 40], ugyanakkor a fokozott ROI termeléshez vezető útvonal kevésbé tisztázott. Egyik elmélet szerint a T sejt aktivációra bekövetkező ROI szignálért a mitokondriumok fokozott oxidatív foszforilációs tevékenysége tehető felelőssé. Ezt támasztja alá az az eredmény, miszerint a mitokondrium elektrontranszportlánc I. komplexét gátolva – mely a ROI termelésben részt vesz - TCR stimuláció indukálta ROI szignál nem jön létre [41]. Saját eredményeink szerint a CD3/CD28 aktivációra fellépő ROI szignál kismértékben csökkenthető ha a stimulációval párhuzamosan IP3 receptor antagonista 2aminoetoxidifenil boráttal (2-APB) is kezeltük a sejteket. Tehát a TCR felől érkező szignálfolyamatok befolyással vannak a ROI szignál mértékére. Újabb irodalmi adatok szerint ZAP-70, LAT, PLCγ1 deficiens sejtvonalon TCR aktiváció indukálta ROI szignál nem váltható ki. Abban az esetben, ha limfociták intracelluláris Ca2+

50

koncentráció emelkedését tapsigarginnal vagy ionomycinnel idéztük elő, nem jött létre ROI szignál. Ez az eredmény azt mutatja, hogy Ca2+ szignál önmagában nem elégséges a ROI termelés kiváltásához. Mások eredményei szerint a TCR stimuláció során aktiválódó PKC útvonal viszont jelentős szerepet tölt be a ROI szignál kialakulásában, a PKC Ca2+ szignáltól független aktivációja során ugyanis kiváltható ROI szignál a T limfocitákban [41]. Saját és irodalmi adatok alapján elmondhatjuk, hogy TCR stimuláció hatására kialakuló ROI szignál és a fokozott mitokondrium működés szoros kapcsolatban áll. Az utóbbi években a NO mitokondrium működés szabályozásában betöltött fiziológiás szerepének egyre bővülő irodalma van [19]. Saját eredményeink szerint humán limfociták eNOS-t és nNOS-t expresszálnak, iNOS izoformát nem. Az irodalomból ismert, hogy ezen konstitutív NOS izoformák szabályozása Ca2+-calmodulin szignálon keresztül történik. Érdekes módon eredményeink szerint az eNOS, nNOS proteinek szintje a humán T sejtek 24 órás CD3/CD28 stimulálása során többszörösére fokozódott, ami ezeknek az izoformáknak transzkripciós szinten történő szabályozását mutatja. Az iNOS izoformát viszont a T limfociták aktivációja során sem tudtuk detektálni Western-bolt módszerrel. Ugyancsak többszörösére fokozza az eNOS és nNOS expressziót, ha a sejteket 100 μM H2O 2-vel kezeltük. Megmérve a limfociták NO termelését, azt találtuk hogy TCR stimuláció hatására NO szignál detektálható, mely a csúcsát 24 órás stimulációnál éri el és párhuzamos a mitokokndriális hiperpolarizációval és a ROI szignállal. Részletesebben megvizsgálva a NO mitokondriális és oxidatív folyamatokra kifejtett hatását T limfociták aktivációja során, NO kelátor C-PTIO-t adtunk a sejtekhez. A NO gátlása során nem jön létre a T sejt aktivációra jellemző Ca2+ szignál, ROI szignál és a mitokondriális változások. Abban az esetben viszont, ha NO donorral kezeljük a sejteket, kialakul egy sejtpopuláció melyben Ca2+ szignál, NO szignál és mitokondriális hiperoplarizáció illetve ROI szignál mérhető.

51

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a TCR stimuláció hatására fellépő NO szignál nélkülözhetetlen része a hatékony T sejt aktivációnak és szoros összefüggésben áll a mitokondriális és oxidatív szignáltranszdukciós folyamatokkal (17 ábra).

Monocita / Dendritikus sejt

CD 80

NO AG

NO

NO

CD 28

NO

T sejt T sejt aktiváció

eNOS mitokondriumból T sejt szinapsziba történő transzlokációja

Ca2+ szignál transzkripció és protein szintézis (IL-2)

Mitokondriális hiperpolarizáció és bioszintézis Emelkedett O2Szuperoxid dizmutáz

H2O2

OONO

NO

NO szintézis

Alacsony cc.NO

iNOS

Magas cc.NO

Mitokondriális hiperpolarizáció és bioszintézis

Emelkedett O2-

Sejthalál

Sejt túlélés

17. Ábra. Sematikus ábra a NO T sejt aktivációban betöltött szerepéről.

52

Az irodalomban szintén jól ismert, hogy a hisztaminnak fontos szerepe van T limfociták aktivációjában és érésében. A hisztamin immunfolyamatok szabályozásában betöltött szerepének vizsgálatához jó modell a hisztidin dekarboxiláz génkiütött (HDC-KO) egérmodell, mivel hisztamin termelésért csak a HDC enzim felelős. Abban az esetben ha az állatokat hisztamin mentes diétán tartjuk, az immunfolyamatok in vivo hiszatamin mentesen zajlanak. Laboratóriumunk előző eredményeiből ismert hogy a HDC-KO egerek lépéből szeparált dendritikus sejtek fokozott antigénprezentáló képességgel rendelkeznek illetve LPS stimulációt követően szignifikánsan több IFNγ-t és IL-12-t termelnek [65]. Ezek az eredmények alátámasztják azt az irodalmi adatot miszerint a hisztamin a naiv Th sejtek Th2 sejtekké történő differenciálódásában játszik szerepet. Ugyanakkor az is ismert, hogy alacsony koncentrációjú NO a naiv Th sejtek Th1 irányban történő érését segíti elő. A NO cGMP útvonalat befolyásoló hatása révén fokozza a naiv Th sejtek IL-12 receptor β2 (IL-12Rβ2) sejtfelszíni expresszióját, de nincs hatással az IL-4 receptor expresszió mértékére [66]. Saját eredményeink szerint a HDC-KO egerek limfocitái szignifikánsan több INF-γ-t termelnek mind mRNS, mind protein szinten. Az IL-10 és IL-4 citokinek termelésében nem találtunk különbséget. A fokozott IFN-γ termelésért a T sejt szubpopulációk eltolódása tehető felelőssé, mivel az intracelluláris IFN-γ mennyiség nem különbözik a CD4, CD8, CD45 és CD4/CD25 pozitív szubpopulációkban. Ezek az eredmények is azt mutatják, hogy a HDC-KO egér immunválasza hiszamin hiány következtében Th1 irányba tolódik el. Kíváncsiak voltunk arra, hogy a HDC-KO állat Th1 irányban eltolt immunválaszában szerepet játszik-e a NO, ezért megmértük a limfociták NO termelését. HDC-KO egér lépéből szeparált T sejtek 2,5-ször több NO-t termelnek a vad típusú egér limfocitáihoz képest. Ezenkívül a HDC-KO egerek limfocitái ConA stimuláció hatására fokozott NO szignállal válaszolnak. Tovább vizsgálva a hisztamin NO termelésre kifejtett hatását, azt találtuk, hogy mind a vad, mind a HDC-KO limfociták NO termelése csökkenthető hisztaminnal történő kezeléssel. Mivel a hisztaminkezelés nem befolyásolta a sejtek IFN-γ termelését, megvizsgáltuk a NO termelés hogyan hat a limfociták citokintermelésére. Azt az eredményt kaptuk, hogy NO donor hatására a sejtek IFN-γ termelése szignifikánsan nagyobb a kontroll,

53

csak ConA-val stimulált sejtekhez képest. Abban az estben viszont, ha a sejteket ConA stimulációval

párhuzamosan

NOS

inhibitorral

kezeltük,

az

IFN-γ

termelés

szignifikánsan csökkenthető volt. Ezen eredményeink szerint elmondhatjuk, hogy a hisztamin irodalomból ismert citokintermelésre gyakorolt direkt hatásán túl, a NO termelés befolyásolása révén is részt vesz a T sejt citokintermelés szabályozásában (18. ábra).

54

-

IL-12 MHC

-

Antigén

IL-12

TCR

IL-12R H2R

PKC 2+ NOS Ca szignál PKA

ROI

cAMP

p38 MAPK

STAT1

STAT6 IFN-γ

T-bet

IL-4 IL-4R

IL-5

IL-2 IL-4 IL-13

GATA3

18. Ábra. Sematikus ábra a hisztamin és a NO szerepéről a T helper sejtek érésében.

55

VII. ÖSSZEFOGLALÁS T

limfociták

aktivációjában,

proliferációjában

illetve

a

programozott

sejthalálban a mitokondriális membránpotenciál illetve reaktív oxigén intermedierek (ROI) termelődése fontos szerepet játszik. A mitokondriális hiperpolarizáció egyik korai, reverzibilis jele a T sejt aktivációnak. Munkánk során vizsgáltuk a humán T limfociták CD3/CD28 kostimulációra bekövetkező citoplazmatikus és mitokondriális Ca2+ szignált, a ROI és nitrogén-monoxid (NO) termelést illetve a mitokondriális membránpotenciál változás mértékét. Abban az esetben, ha inozitol 1,4,5-trifoszfát receptor (IP3R) antagonistával vagy a szuperoxid dizmutáz hatását utánzó szerrel kezeltük a sejteket a citoplazmatikus Ca2+ szignál, a ROI szignál és a NO szignál mértéke csökkent. Specifikus NO kelátorral történő kezelés hatására viszont a stimulált sejtekben nemcsak az előbb említett szignálok mértéke csökkent, hanem a mitokondriális hiperpolarizáció is gátolható volt. Ugyanakkor NO donor hatására ROI szignál, Ca2+ szignál, átmeneti ATP depléció és markáns mitokondriális hiperpolarizáció detektálható. Az önmagában adott ionomycinnel vagy thapsigarginnal létrehozott Ca2+ koncentráció emelkedés azonban nem járt együtt sem a NO termelés fokozódásával, mitokondriális membránpotenciál változással, sem a ROI szignállal. Western-blot analízissel humán perifériás limfocitákban a NO szintetáz enzim (NOS) izoformái közül az endotheliális és a neuronális izoformákat lehetett detektálni, ezekből a sejtekből hiányzik a Ca2+független indukálható NOS izoforma. CD3/CD28 kostimuláció hatására az eNOS és nNOS izoformák expressziója többszörösére fokozódik. Eredményeink azt mutatják, hogy a T limfociták aktivációja során bekövetkező mitokondriális hiperpolarizációban és az oxidatív szignálfolyamatokban a Ca2+ -függő NO termelésnek fontos szerepe van. Munkánk során szintén vizsgáltuk a hisztamin T sejt aktivációban és citokintermelés befolyásolásában betöltött szerepét hisztidin dekarboxiláz génkiütött (HDC-KO) és vad típusú állatmodellen. Eredményeink szerint hisztamin hiányában a HDC-KO egerek lépsejtjeinek interferon-γ (IFN-γ) termelése mind protein, mind mRNS szinten szignifikánsan nagyobb mértékű. A sejtek fokozott IFN-γ termelése ugyanakkor fokozott NO termeléssel társul. Eredményeink szerint hisztaminnal történő kezelés a limfociták NO termelését csökkenti mind a HDC-KO mind a vad típusú egérben. NO donor hatására viszont a limfociták fokozott IFN-γ termeléssel válaszoknak, míg NOS

56

gátlószerek,

(NG-monomethyl-L-arginine

és

nitronidazole)

hatására

a

sejtek

szignifikánsan kevesebb IFN-γ-t termelnek, mely a NO IFN-γ termelés szabályozásában betöltött szerepére utal. Eredményeink szerint tehát a hisztamin T limfocitákra gyakorolt direkt hatásán túl, az NO termelés befolyásolása révén is szabályozza a T sejtek citokintermelését és jelátviteli folyamatait.

57

VIII. SUMMARY Activation, proliferation, or programmed cell death of T lymphocytes is regulated by the mitochondrial transmembrane potential through controlling ATP synthesis, production of reactive oxygen intermediates (ROI). Mitochondrial hyperpolarization is an early and reversible event associated with T cell activation. CD3/CD28 costimulation of human PBL elevated cytoplasmic and mitochondrial Ca2+ levels,

ROI

production,

and

NO

production,

and

elicited

mitochondrial

hyperpolarization. Although T cell activation-induced Ca2+ release, ROI levels, and NO production were diminished by inositol 1,4,5-triphosphate receptor antagonist, superoxide dismutase mimic and NO chelator, mitochondrial hyperpolarization was selectively inhibited by NO chelator. Moreover, NO precursor NOC-18 elicited NO and ROI production, Ca2+ release, transient ATP depletion, and robust mitochondrial hyperpolarization. Ca2+ influx by ionomycin or Ca2+ release from intracellular stores by thapsigargin alone failed to induce NO synthase expression, NO production, or mitochondrial membrane potential elevation. Western blot analysis revealed expression of Ca-dependent endothelial NO synthase and neuronal NO synthase isoforms and absence of Ca-independent inducible NO synthase in PBL. CD3/CD28 costimulation elicited severalfold elevations of endothelial NO synthase and neuronal NO synthase expression.. The results suggest that T cell activation-induced mitochondrial hyperpolarization is mediated by ROI- and Ca2+ dependent NO production. In order to study the role of histamine in T cell activation, we investigated cytokine production and T cell signal transduction in HDC-KO and wild type mice. In the absence of histamine, an elevated INF-γ mRNA and protein levels of splenocytes were associated with a markedly increased NO production, compared to wild type animals. Furthermore, histamine treatment decreased the NO production of splenocytes from both wild type and HDC-KO mice. NO precursor NOC-18 elicited IFN-γ production, while NO synthase inhibitors, NG-monomethyl-L-arginine and nitronidazole both inhibited

IFN-γ production, suggesting the role of NO in regulating IFN-γ

synthesis. Our present data indicate that in addition to its direct effects on T lymphocyte function, histamine regulates cytokine production and T cell signal transduction through regulating NO production.

58

IX. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK LISTÁJA Ph.D. értekezés témájában megjelent publikációk Koncz A, Pasztoi M, Mazan M, Fazakas F, Buzas E, Falus A, Nagy G. Nitric oxide mediates T cell cytokine production and signal transduction in histidine dexarboxylase knockout mice. J Immunol 2007 Nov. 15;179(10):6613-9. IF: 6,3 Nagy G, Koncz A, Fernandez D, Perl A.Nitric oxide, mitochondrial hyperpolarization, and T cell activation. Free Radic Biol Med. 2007 Jun 1; 42(11): 1625-31. IF:5,4 Nagy G, Koncz A, Perl A Mitochondrial T cell signal transduction abnormalities in systemic lupus erythematosus Curr Immunol Rev 2005, 1, 62-68. Perl A, Gergely P Jr, Nagy G, Koncz A, Banki K. Mitochondrial hypepolarization: a checkpoint of T-cell life, death and autoimmunoty. Trends Immunol 2004, 25, 360-7. IF:13,1 Nagy G, Koncz A, Perl A. T cell activation induced mitochondrial hyperpolarization is mediated by Ca2+ and redox dependent production of nitric oxide. J Immunol 2003, 171, 5188-97. IF: 6,7 A Ph.D. értekezés témájában megjelent közlemények összesített impakt faktora: 31,5

Ph.D. értekezés témájához nem kapcsolódó publikációk Nagy G, Ward J, Mosser DD, Koncz A, Gergely P Jr, Stancato C, Qian Y, Fernandez D, Niland B, Grossman CE, Telarico T, Banki K, Perl A.Regulation of CD4 expression via recycling by HRES-1/RAB4 controls susceptibility to HIV infection. J Biol Chem. 2006 Nov 10; 281(45):34574-91 IF: 5,8

59

Nagy G, Koncz A, Perl A.

T- and B-cell abnormalities in systemic lupus

erythematosus. Crit Rev Immunol. 2005, 25(2),123-40. IF: 3,2 Gergely P Jr, Pullmann R, Stancato C, Otvos L Jr, Koncz A, Blazsek A, Poor G, Brown KE, Phillips PE, Perl A. Increased prevalence of transfusion-transmitted virus and cross-reactivity with immunodominant epitopes of the HRES-1/p28 endogenous retroviral autoantigen in patients with systemic lupus erythematosus.Clin Immunol. 2005 Aug;116(2):124-34. IF: 3,2 Nagy G, Clark J M, Buzas E, Gorman C, Pasztoi M, Koncz A, Falus A and Cope A P. Nirtic oxide production of T lymphocytes is increased in rheumatoid arthritis. Immunology Letters 2008 in press. IF: 2,3 Koncz A, Nagy G, Perl A. Nitrogén monoxid függő mitokondrium bioszintézis systemas lupus erythematosusban Klinikai és kísérletes laboratóriumi medicina 2005. szeptember Nagy

G, Géher P, Koncz A, Perl As. Jelátviteli defektusok systemás lupus

erythematosusban. Orvosi Hetilap. 2005 Jul 31.

Kumulatív impakt faktor: 46

60

X. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönettel és hálával tartozom Falus András Professzor Úrnak és Dr. Buzás Editnek, amiért lehetőséget adtak munkatervem és kísérleteim megvalósítására és mindenben támogatták munkámat. Kutatómunkával a syracues-i egyetemen a Perl András Professzor Úr által vezetett laboratóriumban ismerkedtem meg, köszönettel tartozom azért, hogy számos laboratóriumi módszer elsajátításában segítséget és lehetőséget kaptam tőle. Szintén ezúton szeretném megköszönni a Heim Pál Gyermekkórházban dolgozó munkatársaimnak hogy türelmükkel és megértésükkel támogatták Ph.D. munkám befejezését, Simonné Sebestyén Piroskának pedig külön köszönetet szeretnék mondani bíztatásáért és lelkesítéséért. Szerencsésnek érzem magam, hogy férjemmel, Nagy Györggyel együtt dolgozhattam. A közösen végzett munka általa történő szakmai, szellemi irányítása nagymértékben elősegítette fejlődésemet és fontos részét képezi Ph.D. munkámnak. Köszönet illeti azért is, mert családfőként lehetőséget biztosított munkám végzéséhez és a legnehezebb pillanatokban is mellettem állt, támogatására folyamatosan számíthattam. Szeretnék köszönetet mondani Édesanyámnak is, aki gondoskodásával, szeretetével és állandó segítőkészségével járult hozzá munkám eredményességéhez.

61

XI. IRODALOMI JEGYZÉK

1. Falus A, Buzás E, Rajnavölgyi É. Az immunológia alapjai. Semmelweis Kiadó 2007 2. Wange, R. L., and L. E. Samelson. Complex complexes: signaling at the TCR. Immunity 1996. 5:197-205 3. Weiss, A., and D. R. Littman. Signal transduction by lymphocyte antigen receptors. Cell 1994. 76:263-274. 4. Dustin, M. L., and J. A. Cooper. The immunological synapse and the actin cytoskeleton: molecular hardware for T cell signaling. Nat. Immunol. 2000. 11:23 5. Bromley, S. K., W. R. Burack, K. G. Johnson, K. Somersalo, T. N. Sims, C. Sumen, M. M. Davis, A. S. Shaw, P. M. Allen, and M. L. Dustin. The immunological synapse. Annu. Rev. Immunol. 2001. 19:375 6. Grakoui A, Bromley SK, Sumen C, Davis MM, Shaw AS, Allen PM, Dustin ML. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science 1999;285:221–227. 7. Ibiza S, Victor VM, Bosca I, Ortega A, Urzainqui A, O'Connor JE, SanchezMadrid F, Esplugues JV, Serrador JM. Endothelial nitric oxide synthase regulates T cell receptor signaling at the immunological synapse. Immunity 2006;24:753–765 8. Vincenzo Di Bartolo1 Benjamin Montagne, Mogjiborahman Salek, Britta Jungwirth1 Florent Carrette, Julien Fourtane, Nathalie Sol-Foulon, Frédérique Michel1 Olivier Schwartz2 Wolf D. Lehmann, and Oreste Acuto. A novel pathway downmodulating T cell activation involves HPK-1–dependent recruitment of 14-3-3 proteins on SLP- J Exp Med. 2007. March 19; 204(3): 681–691)

62

9. Brown-CG: Nitric oxide and mitochondrial respiration. Biochem Biophys Acta.1999. 1411:351-369 10. Beltran-B, Mathur-A, Duchen-MR, Erusalimsky-JD and Moncada-S: The effect of nitric oxide on cell respiration: a key to undertanding its role in cell survival, or death. PNAS 2000. 26:14602-14607 11. Ignarro LJ. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview J Physiol Pharmacol. 2002. Dec. 53(4 Pt 1):503-14. 12 . Bredt-DS: Endogenous nitrice oxide synthesis: biological functions and pathophysiology. Free Radic Res 1999. 31:577-596 13 . Ghafourifar P, Cadenas E Mitochondrial nitric oxide synthase. Trends Pharmacol Sci. 2005. Apr;26(4):190-5. 14. T.J. Guzik, R. Korbut, T. Adamek-Guzik. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. Journal of Phisiology AND Pharmacology 2003. 54, 4,469-487 15 Masato Tsutsui, Hiroaki Shimokawa, Tsuyoshi Morishita, Yasuhide Nakashima, and Nobuyuki Yanagihara. Development of Genetically Engineered Mice Lacking All Three Nitric Oxide Synthases. J Pharmacol Sci 102, 147 – 154 16 . Chung-HT, Pae-HO, Choi-BM, Billiar-TR, Kim-YM: Nitric oxide as a bioregulator of apoptosis. Biochem Biophys Res Commun 2001. 282:1075-1079 17.Mitchell P, Moyle J "Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation". Nature 1967. 213 (5072): 137–9.)

63

18 . Félix Rodríguez-Juárez, Enara Aguirre, and Susana Cadenas. Relative sensitivity of soluble guanylate cyclase and mitochondrial respiration to endogenous nitric oxide at physiological oxygen concentration. Biochem J. 2007 July 15; 405(Pt 2): 223–231. 19 . Nisoli E, Carruba MO. Nitric oxide and mitochondrial biogenesis. J. Cell Sci. 2006. 119:2855–2862 20. Beltran-B, Quintero-M, Gracia-Zaragoza-E, O'Connor-E, Esplugues-JV and Moncada-S: Inhibition of mitochondrial respiration by endogenous nitric oxide: a critical step in Fas signalling. PNAS 2002. 13:8892-8897 21 .

Kim-YM, B Ombeck-CA, Billiar-TR: Nitric oxide as a bifunctional

regulator of apoptosis. Circ Res 1999. 19: 253-256 22. MacMicking, J., Q. W. Xie, and C. Nathan. Nitric oxide and macrophage function. Annu. Rev. Immunol. 1997. 15:323–350. 23 . Kleinert, H., C. Euchenhofer, I. Ihrig-Biedert, and U. Forstermann. Glucocorticoids inhibit the induction of nitric oxide synthase II by down-regulating cytokine-induced activity of transcription factor nuclear factor-kB. Mol. Pharmacol. 1996. 49:15 24. Liu, S. F., X. Ye, and A. B. Malik. In vivo inhibition of nuclear factor-kB activation prevents inducible nitric oxide synthase expression and systemic hypotensionin a rat model of septic shock. J. Immunol. 1997. 159:3976. 25. Song Kyu PARK, Hsin Lee LIN and Sean MURPHY. Nitric oxide regulates nitric oxide synthase-2 gene expression by inhibiting NF-κB binding to DNA Biochem. J. 1997. 322,

64

26. Peng, H. B., P. Libby, and J. K. Liao. Induction and stabilization of IκBα by nitric oxide mediates inhibition of NF-kB. J. Biol. Chem. 1995. 270:14214 27. Habib, A., C. Bernard, M. Lebret, C. Creminon, B. Esposito, A. Tedgui, and J. Maclouf. Regulation of the expression of cyclooxygenase-2 by nitric oxide in rat peritoneal macrophages. J. Immunol. 1997. 158:3845; 28. Moellering, D., A. J. Mc, R. P. Patel, H. J. Forman, R. T. Mulcahy, H. Jo, and V. M. Darley-Usmar. The induction of GSH synthesis by nanomolar concentrations of NO in endothelial cells: a role for g-glutamylcysteine synthetase and g-glutamyl transpeptidase. FEBS Lett. 1999. 448:292. 29. Lander, H. M., D. P. Hajjar, B. L. Hempstead, U. A. Mirza, B. T. Chait, S. Campbell, and L. A. Quilliam. A molecular redox switch on p21ras: structural basis for the nitric oxide-p21ras interaction. J. Biol. Chem.1997. 272:4323. 30. Sheffler, L. A., D. A. Wink, G. Melillo, and G. W. Cox. Exogenous nitric oxide regulates IFN-g plus lipopolysaccharide- induced nitric oxide synthase expression in mouse macrophages. J. Immunol. 1995. 155:886. 31. L. Connelly, M. Palacios-Callender, C. Ameixa, S. Moncada, and A. J. Hobbs. Biphasic Regulation of NF-kB Activity Underlies the Pro- and AntiInflammatory Actions of Nitric Oxide. The Journal of Immunology, 2001, 166: 3873– 3881 32. Han, D., Williams, E. and Cadenas, E. Mitochondrial respiratory chaindependent generation of superoxide anion and its release into the intermembrane space. Biochem. J. 2001. 353, 411-416.

65

33 . Kappus, H. and Sies, H., Toxic drug effects associated with oxygen metabolism: redox cycling and lipid peroxidation, Experientia, 37, 1233, 1981 34. Harman, D. "Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry". J Gerontology 1956. 11 (3): 298-300 35 . Tuppo EE, Forman LJ. Free radical oxidative damage and Alzheimer's disease. J Am Osteopath Assoc. 2001 Dec;101(12 Suppl Pt 1):S11-5 36 . Kowluru RA, Chan PS. Oxidative stress and diabetic retinopathy. Exp Diabetes Res. 2007: 43603 37 . Bauer, M. K., M. Vogt, M. Los, J. Siegel, S. Wesselborg, and K. SchulzeOsthoff. Role of reactive oxygen intermediates in activation-induced CD95 (APO1/Fas) ligand expression. J. Biol. Chem. 1998. 273:8048–8055. 38 . Gulow, K., M. Kaminski, K. Darvas, D. Suss, M. Li-Weber, and P. H. Krammer. HIV-1 trans-activator of transcription substitutes for oxidative signaling in activation-induced T cell death. J. Immunol. 2005. 174:5249–5260. 39 . Peter, M.E, and Krammer, P.H. Mechanisms of CD95 (APO-1/Fas)mediated apoptosis. Curr. Opin. Immunol. 1998. 10:545–551. 40. Devadas S, Zaritskaya L, Rhee S. G, Oberley L and Williams M.S. Doscrete genetation of superoxide and hydrogen peroxide by T cell receptor stimulation: selective regulation of mitogen-activated protein kinase activation and fas ligand expression. J. Exp. Med. 2002. 195:59-70 41 . Marcin Kaminski, Michael Kießling, Dorothee Su¨ss, Peter H. Krammer, and Karsten Gulow. Novel Role for Mitochondria: Protein Kinase C -Dependent Oxidative Signaling Organelles in Activation-Induced T-Cell Death. Molecular And Cellular Biology, 2007 May, p. 3625–3639

66

42. Falus A, Hegyesi H, Lazar-Molnar E, Pos Z, Laszlo V, Darvas Z. Paracrine and autocrine interactions in melanoma: histamine is a relevant player in local regulation. Trends Immunol. 2001. 22(12):648-52. 43. Pos Z, Safrany G, Muller K, Toth S, Falus A, Hegyesi H. Phenotypic profiling of engineered mouse melanomas with manipulated histamine production identifies histamine H2 receptor and rho-C as histamine-regulated melanoma progression markers. Cancer Res.2005. 65(10):4458-66. 44. Laszlo V, Falus A. Yet unrevealed aspects of histamine: questions from outside--answers at inside? Semin Cancer Biol. 2000. 10(1):1-2. 45. Igaz P, Fitzimons CP, Szalai C, Falus A. Histamine genomics in silico: polymorphisms of the human genes involved in the synthesis, action and degradation of histamine.Am J Pharmacogenomics. 2002. 2(1):67-72 46. Kehrl JH: Heterotrimeric G protein signaling: roles in immune function and fine-tuning by RGS proteins.Immunity. 1998. Jan;8(1):1-10 47. Horvath B, Szalai Cs, Mandi Y, Laszlo v, Radvanyi Zs, Darvas Zs, Falus A: Histamine and histamine-receptor antagonists modify gene expression and biosynthesis of interferon γ in priferial human blood mononuclear cells and in CD19-depleted cell subsets. Immunol Let. 1999. 70: 95-9.. 48. Mor S, Nagler A, Barak V, Handzel ZT, Geller-Bernstein C, Fabian I. Histamine enhances granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin6 production by human peripheral blood mononuclear cells. J Leukoc Biol. 1995 Oct;58(4):445-50

67

49. E Vannier and C A Dinarello Histamine enhances interleukin (IL)-1-induced IL-1 gene expression and protein synthesis via H2 receptors in peripheral blood mononuclear cells. Comparison with IL-1 receptor antagonist.J Clin Invest. 1993 July; 92(1): 281–287. 50. van der Pouw Kraan TC, Snijders A, Boeije LC, de Groot ER, Alewijnse AE, Leurs R, Aarden LA. Histamine inhibits the production of interleukin-12 through interaction with H2 receptors. J Clin Invest. 1998 Nov 15;102(10):1866-73 51. Igaz P, Novák I, Lázaár E, Horváth B, Héninger E, Falus A. Bidirectional communication between histamine and cytokines. Inflamm Res. 2001 Mar;50(3):123-8. 52 . Mazzoni A, Young HA, Spitzer JH, Visintin A, Segal DM. Histamine regulates cytokine production in maturing dendritic cells, resulting in altered T cell polarization. J Clin Invest. 2001. 108(12):1865-73. 53. Mazzoni A, Siraganian RP, Leifer CA, Segal DM. Dendritic cell modulation by mast cells controls the Th1/Th2 balance in responding T cells.J Immunol. 2006 Sep 15;177(6):3577-81. 54. Mübeccel Akdis, Johan Verhagen,Alison Taylor, Fariba Karamloo, Christian Karagiannidis, Reto Crameri, Sarah Thunberg, Günnur Deniz, Rudolf Valenta,Helmut Fiebig, Christian Kegel, Rainer Disch, Carsten B. Schmidt-Weber, Kurt Blaser, and Cezmi A. Akdis. Immune Responses in Healthy and Allergic Individuals Are Characterized by a Fine Balance between Allergen-specific T Regulatory 1 and T Helper 2 Cells J. Exp. Med. June 7, 2004 Volume 199, Number 11, 55. Jayasekera NP, Toma TP, Williams A, Rajakulasingam K. Mechanisms of immunotherapy in allergic rhinitis. Biomed Pharmacother. 2007 Jan;61(1):29-33

68

56. Jutel M, Akdis M, Blaser K, Akdis CA. Mechanisms of allergen specific immunotherapy--T-cell tolerance and more Allergy. 2006 Jul;61(7):796-807 57. Alison Taylor, Johan Verhagen, Kurt Blaser, Mu¨beccel Akdis and Cezmi A. Akdis Mechanisms of immune suppression by interleukin-10 andtransforming growth factor-b: the role of T regulatory cells. Immunology, 2005 117, 433–442 58. Jutel M, Blaser K, Akdis CA Histamine receptors in immune regulation and allergen-specific

immunotherapy

Immunol

Allergy

Clin

North

Am.

2006

May;26(2):245-59 59 . Ohtsu H, Tanaka S, Terui T, Hori Y, Makabe-Kobayashi Y, Pejler G, Tchougounova E, Hellman L, Gertsenstein M, Hirasawa N, Sakurai E, Buzas E, Kovacs P, Csaba G, Kittel A, Okada M, Hara M, Mar L, Numayama-Tsuruta K, Ishigaki-Suzuki S, Ohuchi K, Ichikawa A, Falus A, Watanabe T, Nagy A. Mice lacking histidine decarboxylase exhibit abnormal mast cells. FEBS Lett. 2001;502:53-56 60. Williamson, J. R. 1986. Role of inositol lipid breakdown in the generation of intracellular signals. State of the art lecture. Hypertension 8(Part II):140–156. 61. Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev.2002. 82:47–95. 62. Aulwurm, U.R., and Brand, K.A. 2000. Increased formation of reactive oxygen species due to glucose depletion in primary cultures of rat thymocytes inhibits proliferation. Eur. J. Biochem. 2000. 267:5693–5698. 63. Hildeman, D.A., et al. Reactive oxygen species regulate activation induced T cell apoptosis. Immunity. 1999. 10:735–744.

69

64 . Banki K, Hutter E, Gonchoroff N, Perl A. Elevation of mitochondrial transmembrane potential and reactive oxygen intermediate levels are early events and occur independently from activation of caspases in Fas signaling. J.Immunol. 1999;162:1466–1479 65. Jelinek I, Laszlo V, Buzas E, Pallinger E, Hangya B, Horvath Z, Falus A. Increased antigen presentation and T(h)1 polarization in genetically histamine-free mice. Int Immunol. 2007;19:51-58. 66. Wanda Niedbala, Xiao-qing Wei, Carol Campbell, Duncan Thomson, Mousa Komai-Koma, and Foo Y. Liew. Nitric oxide preferentially induces type 1 T cell differentiation by selectively up-regulating IL-12 receptor β2 expression via cGMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Dec 10;99(25):16186-91.

70