Návody Laboratoř sladařství a pivovarství Technologické cvičení
Část A: Rozbor surovin pro pivovarskou a sladařskou výrobu 1. 1.1 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.2 1.2.1
Rozbor ječmene Mechanické a chemické rozbory Stanovení obsahu vody Stanovení hektolitrové hmotnosti ječmene Stanovení absolutní hmotnosti ječmene Fyziologické rozbory Stanovení klíčivé energie a citlivosti na vodu
2. 2.1 2.1.1 2.1.2 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.2.6 2.2.7 2.2.8
Rozbor sladu Smyslové zkoušky Posouzení barvy, vůně, lesku, tvaru, velikosti a vyrovnanosti zrn Stanovení moučnatosti a sklovitosti sladu Fyzikálně-chemické rozbory Obsah vody ve sladu Příprava kongresní sladiny, stanovení relativní hustoty sladiny a stanovení extraktu sladu Stanovení zcukření sladiny Posouzení vůně, čirosti a doby ztékání sladiny Stanovení pH a barvy sladiny Stanovení aminodusíku sladiny Stanovení sacharidických složek sladiny metodou HPLC Stanovení volných aminokyselin sladiny metodou HPLC
3. 3.1 3.1.1 3.2 3.2.1 3.2.2 3.3
Rozbor vody Neutralizační kapacita Stanovení zjevné a celkové alkality Tvrdost vody Stanovení celkové tvrdosti Stanovení obsahu iontů vápníku a hořčíku Výpočet zbytkové alkality vody
4. 4.1 4.2 4.3
Rozbor chmele Stanovení konduktometrické hodnoty chmele a chmelového extraktu Stanovení obsahu α- a β- hořkých kyselin metodou HPLC Stanovení celkových polyfenolů piva podle EBC
5 5.1
Rozbor pivovarských kvasnic Provozní mikrobiologická kontrola
5.2 5.2.1 5.2.2 5.3 5.4 5.5
Stanovení viability kvasnic barvícími technikami Barvení methylenovou modří metodou podle EBC Barvení propidium jodidem s vyhodnocením na průtokovém cytometru Stanovení vitality kvasnic acidifikačním testem Charakterizace bakteriální kontaminace metodou PCR Charakterizace bakteriální kontaminace metodou FISH
Část B: Výroba piva 1. 2.
Příprava mladiny Mikrobiologická kontrola várečných kvasnic
2.1 2.2 3. 3.1 3.2 3.3 4. 4.1 5. 5.1 6. 6.1
Posouzení kvasnic podle makroskopických znaků Stanovení vitality a viability kvasnic Rozbor mladiny Stanovení pH a barvy mladiny Stanovení extraktu mladiny Stanovení celkových hořkých látek podle EBC Zakvašení a hlavní kvašení Stanovení pH, zdánlivého extraktu a počtu buněk ve vznosu Dokvašování piva Stanovení pH, zdánlivého extraktu a obsahu vicinálních diketonů Analytické hodnocení hotového piva Stanovení zdánlivého a skutečného extraktu, obsahu alkohol a původní koncentrace mladiny Stanovení sacharidů metodou HPLC Stanovení celkových hořkých látek podle EBC Stanovení obsahu α- a β- hořkých kyselin metodou HPLC Stanovení volných aminokyselin piva metodou HPLC Senzorické hodnocení hotového piva
6.2 6.3 6.4 6.5 7.
Použité literární zdroje: 1. Basařová G. a kol.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, Praha 1992 (1. díl), 1993 (2. a 3. díl) 2. ANALYTICA EBC, European Brewery Convention, Zoeterwoude 2005. 3. Kosař K. a kol.: Technologie výroby sladu a piva, Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, Praha 2005. 4. Uvedené odborné časopisy a publikace
Část A: Rozbor surovin pro pivovarskou a sladařskou výrobu 1. Rozbor ječmene 1.1 Mechanické a chemické rozbory 1.1.1 Stanovení obsahu vody Princip: Rozemletý zvážený ječmen se suší za stanovených podmínek a stanoví se váhový úbytek Přístroje a zařízení: sušárna, mlýnek EBC, váženky Pracovní postup: Vzorek ječmene se rozemele na moučku. Do navažovačky uzavřené víčkem se s přesností ± 0,001g naváží asi 5g rozemletého ječmene. Je třeba pracovat rychle a rozemletý vzorek uchovávat ve vzduchotěsné prachovnici, aby nenastaly změny v obsahu vody. Suší se tři hodiny při teplotě 105 až 107°C bez víčka v elektrické sušárně. Po této době se navažovačka vyjme, uzavře víčkem a vloží do exsikátoru asi na 20 minut a opět se zváží a přesností ± 0,001 g. V případě, že obsah vody v ječmeni je vyšší než 15%, musí se 100 g ječmene (celá zrna) předsoušet v drátěném košíčku při teplotě 50°C po dobu 3 až 4 hodin. Po předsoušení se opět zváží a vypočte se úbytek vody. Pak se ječmen rozemele a voda se stanoví popsaným způsobem. Výpočet a vyhodnocení:
v
A *100 G
v – obsah vody (%), G – navážka rozemletého ječmene (g), A – úbytek hmotnosti, tj. rozdíl mezi navážkou a usušenou moučkou (g). Běžné hodnoty: Obsah vody ječmene je běžně 12 až 15%, u přímého výkupu nejvýše 17%. kde
Literatura: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta s.r.o., Praha 1993, s. 172 1.1.2 Stanovení hektolitrové hmotnosti ječmene Princip: přesný objem ječmene se zváží a vypočte se hmotnost 100 l ječmene Přístroje a zařízení: objemová váha podle EBC Pracovní postup: Odměrná nádobka se upevní do kovové podložky přístroje, který je ustaven do vodorovné polohy. Zářez v horní části se uzavře srovnávacím nožem s válcovým běhounem a nasadí se plnicí válec. Vrchní násypný válec se uzavře záklopkou, naplní ječmenem, nasadí na plnicí nádobu, záklopka se otevře a zrno samovolně vypadává do plnicího válce. Po naplnění se vysune srovnávací nůž a válcový běhoun s ječmenem spadne do měrného válce. Pak se zvolna vsune nůž zpět do zářezu, přebytečný ječmen se z plnicího válce vysype, válec se sejme a vyjme se srovnávací nůž. Odměrný válec se uchytí za vahadlo váhy a zváží se s přesností na ± 0,5g. Výpočet a vyhodnocení:
Pro výpočet objemové hmotnosti se používají tabulky (tab. 2.3, 2.4, Pivovarskosladařská analytika, s. 157,160), kde podle zjištěné hmotnosti se najde hmotnost hektolitrová, která se udává v kg na jedno desetinné místo. Rozdíl mezi výsledky stanovení dvou laboratoří nemá být větší než 1,0g. Běžné hodnoty: Objemová hmotnost u jarních ječmenů se pohybuje od 68 do 75 kg. Závisí na mnoha faktorech (odrůdě, obsahu vody, ročníku apod.) a dosahuje někdy 65 až 78 kg. Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., Praha 1993, s. 156 1.1.3 Stanovení absolutní hmotnosti ječmene Princip: zváží se 500 zrn a hodnota se přepočte na sušinu Přístroje a zařízení: Petriho miska, analytické váhy, pinzeta Pracovní postup: naváží se 40 g ± 0,1 g ječmene a vysype do počítacího aparátu. Z napočítaných 500 zrn se odstraní půlky a cizí zrna, doplní se zrny ječmene a zváží. Výpočet a vyhodnocení: H
G * 2 * (100 v) 100
H – hmotnost 1000 zrn v sušině (g), G – hmotnost původních 500 zrn (g), v – obsah vody ječmene (%). Výsledky se uvádějí v gramech na jedno desetinné místo. Rozdíl mezi výsledky stanovení dvou laboratoří nemá být vetší než 1,0 g. kde
Běžné hodnoty: (v přepočtu na sušinu ječmene) Lehké ječmeny 37 až 40 g Střední ječmeny 41 až 44 g Těžké ječmeny 45 g a výše. Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., Praha 1993, s. 161 1.2
Fyziologické rozbory
1.2.1 Stanovení klíčivé energie a citlivosti na vodu Princip: stanoví se klíčivá energie zrn se 4 a 8 ml vody při teplotě 15 a 17 °C Přístroje a zařízení: termostat Pracovní postup: Odpočítá se dvakrát 100 zrn. Dvě Petriho misky se vyloží dvěma vrstvami filtračního papíru a na každou se rovnoměrně rozloží 100 zrn. Do jedné misky se pipetou přidají 4 ml vody, do druhé 8 ml vody (v obou případech vodovodní voda). Zrna se přikryjí víčkem a ponechají se pět dnů při teplotě 15 až 17 °C v termostatu. Pak se nevyklíčená zrna spočítají.
Výpočet a vyhodnocení: Počet vyklíčených zrn udává přímo klíčivou energii. Uvádí se klíčivá energie při 4 ml a 8 ml vody. citlivost na vodu = (klíčivá energie při 4 m.) - (klíčivá energie při 8 ml) Hodnoty se udávají v procentech v celých číslech. Ječmen se podle citlivosti na vodu hodnotí jako do 10 % velmi málo citlivý 11 až 25 % málo citlivý 26 až 45 % citlivý nad 45 % velmi citlivý Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 166
2.
Rozbor sladu
2.1 Smyslové zkoušky 2.1.1 Posouzení barvy, vůně, lesku, tvaru, velikosti a vyrovnanosti zrn Princip: zahrnuje smyslové posouzení čistoty vůně a vzhledu zrna a znečištění Literatura: Pivovarsko-sladařská analytika, s. 228 2.1.2 Stanovení moučnatosti a sklovitosti sladu Princip: příčným řezem se zrna rozříznou a vizuálně se stanoví podíl moučnatých, polosklovitých a sklovitých zrn a vyjádří se jejich procentické podíly Přístroje a zařízení: farinatom na příčný řez zrna Výpočet a vyhodnocení: Výsledek se udává v procentech moučnatých, sklovitých a polosklovitých zrn v celých číslech. Světlé slady mají mít moučnatých zrn nejméně 95 %, sklovitých zrn nejvýše 2 %, tmavé slady moučnatých zrn nejméně 93 %, sklovitých nejvýše 4 až 6 %. Někdy se uvádí tzv. „průměrná hodnota sklovitosti“, která se vypočte vynásobením počtu jednotlivých zrn dále uvedeným koeficientem: sklovitá zrna -1, polosklovitá zrna - 0,5, zrna se sklovitými špičkami - 0,25. Součet udává průměrnou sklovitost v procentech. Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 230 2.2
Fyzikálně-chemické rozbory
2.2.1 Obsah vody ve sladu Princip: rozemletý zvážený slad se suší za stanovených podmínek a stanoví se váhový úbytek Přístroje a zařízení: sušárna, mlýnek EBC, váženky
Pracovní postup: Vzorek sladu se rozemele na moučku. Do váženky uzavřené víčkem se s přesností ± 0,001g naváží asi 5g rozemletého ječmene. Je třeba pracovat rychle a rozemletý vzorek uchovávat ve vzduchotěsné prachovnici, aby nenastaly změny v obsahu vody. Suší se tři hodiny při teplotě 105 až 107°C bez víčka v elektrické sušárně. Po této době se navažovačka vyjme, uzavře víčkem a vloží do exsikátoru asi na 20 minut a opět se zváží a přesností ± 0,001 gramu. Výpočet a vyhodnocení:
v
A *100 G
v – obsah vody (%), G – navážka rozemletého sladu (g), A – úbytek hmotnosti, tj. rozdíl mezi navážkou a usušenou moučkou (g). Běžné hodnoty: Obsah vody ve sladu je v rozsahu 3 až 5% podle typu vyráběného sladu kde
Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 226 2.2.2 Příprava kongresní sladiny, stanovení relativní hustoty sladiny a stanovení extraktu sladu Princip: Rmutováním jemně rozemletého sladu standardním rmutovacím, tzv.kongresním postupem se získá sladina, ve které se stanoví relativní hustorta v Reischauerově pyknometru (se stanovenou vodní hodnotou) za předepsaných podmínek. V tabulkách se k hodnotám relativní hustoty najde hodnota extraktu sladiny - hmotnostní zlomek extraktu sladiny (%). Přístroje a zařízení: mlýnek Miag nebo DLFU seřízený na 90% ± 1% moučky rmutovací lázeň (frekvence otáčení míchadel 80 až 100 min -1) kádinky o objemu 500 ml nálevky, průměr 150 mm skládané filtry, průměr 320 mm (Scheicher-Schull č. 597 1/2) pyknometr podle Reischauera nebo denzitometr vodní lázeň na 20 °C ± 0,05 °C pro temperaci pyknometrů sádrová destička pro stanovení zcukření. Chemikálie a roztoky: jodový roztok, c (½I2 ) =0,02 mol.l-1 Pracovní postup: Extrakt sladu se stanoví ve sladině připravené tzv. kongresním postupem, což je standardním způsobem provedený infúzní rmutovací postup s jemné rozemletým sladem (podíl moučky 90 % ± 1 %). Hodnota stanoveného extraktu informuje o obsahu extraktivních látek ve sladu a o předpokladu jejich uvolnění v procesu rmutování. Získaná kongresní sladina se používá pro stanovení řady dalších analytických znaků sladu: zcukření, stékání, barvy, čirosti, viskozity, pH, rozpustných dusíkatých látek apod. Přibližně 60 g sladu se rozemele na předepsaném mlýnku a 50 g ± 0,05 g rozemletého vzorku se naváží do rmutovací kádinky. Za stálého míchání se vzorek přelije 150 ml destilované vody 45 °C teplé a tyčinka se opláchne 50
ml stejně teplé vody. Rmutovací kádinka se ihned vloží do rmutovací lázně na teplotu 45 °C, zapojí se míchadla a při teplotě 45 °C se rmutuje 30 minut. Pak se teplota zvyšuje na 70 °C a to tak, že se každou minutu zvýší teploty rmutu o 1 °C, tzn. za 25 minut se dosáhne 70 °C. Po dosažení této teploty se přidá 100 ml destilované vody 70 °C teplé a od tohoto okamžiku za 10 minut se odebere vzorek na zkoušku zcukření. Teplota 70 °C se udržuje l hodinu. Pak se rmut ochladí během 10 až 15 minut ve rmutovací lázni studenou vodou na teplotu asi 20 °C. Míchadla se opláchnou destilovanou vodou, rmutovací kádinky se vně dokonale osuší a obsah se dováží na 450 g destilovanou vodou. Po dokonalém promíchání se rmut nalije na skládaný filtr. Prvních 100 ml filtrátu se vrací zpět na filtr. Filtrace je ukončena, když obsah filtru (mláto) popraská, jinak se filtrace ukončí po dvou hodinách. Filtrát se promíchá a ihned se stanoví relativní hustota. Zbylý podíl se bere na další stanovení. Relativní hustota se stanoví pyknometricky s přesností ± 0,0005 nebo densitometricky. Výpočet a vyhodnocení: K stanovené relativní hustotě (pyknometricky nebo denzitometrem) se vyhledá v tab. 3.5 (Pivovarsko-sladařská analytika, s. 319) hmotnostní zlomek extraktu v g na 100 g sladiny (%) a vypočte se obsah extraktu v původním sladu a v sušině sladu podle následujících vztahů Ep
Es
P(v 800) 100 P
100 E p 100 v
Ep – je obsah extraktu v původním sladu (%), P – hmotnostní zlomek extraktu sladiny odečtený z tab. 3.5 (%), v – obsah vody ve sladu (%), Es – extrakt v sušině sladu (%). Výsledky se uvádějí v procentech na jedno desetinné místo. Přesnost stanovení: rozdíl mezi dvěma souběžnými stanoveními nemá být větší než 0,3%, rozdíl mezi výsledky stanovení dvou laboratoří nemá být vetší než 0,6%. Kde
Běžné hodnoty: Světlé slady:
79,0 až 82,0% v sušině
Tmavé slady:
76,5 až 78,0% v sušině
Nakuřované slady:
79,0 až 82,0% v sušině
Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 244 2.2.3 Stanovení zcukření sladiny Princip: Vzorek sladiny reaguje s roztokem jodu a posuzuje se míra rozštěpení škrobu Chemikálie a zařízení: Sádrová destička, jodový roztok, c (1/2 I2 = 0, 02 mol.l-1) Pracovní postup: Kontrola 10 minut po dosažení teploty 70° C, při zcukření po přídavku jodového roztoku ke kapce vzorku kanárkově žluté zabarvení. Zcukření 10 až 15 minut – velmi dobré, 10 až 15 minut dobré, 15 až 20 minut - vyhovující, nad 20 minut – nevyhovující. Literatura: Pivovarsko-sladařská analytika, s. 250
2.2.4 Posouzení vůně, čirosti a doby ztékání sladiny Princip: Vůně kongresní sladiny udává, zda slad je připraven ze zdravého ječmene a nezávadným technologickým postupem. Čirost sladiny ukazuje na dobré rozluštění a dostatečné odležení sladu. Rychlé stékání je znakem dobrého rozluštění sladu a dokonalého zcukření sladiny a je důležité především z hlediska scezování sladiny. Pracovní postup: Kontrola vůně v průběhu rmutování, kontrola čirosti při stékání sladiny, doba stékání se posuzuje během filtrace. Stupnice hodnocení čirosti je: čirá, opalizující, kalná. Normální stékání u kongresních sladin je do 1 hodiny, pomalé do 2 hodin, špatné nad 2 hodiny. 2.2.5 Stanovení pH a barvy kongresní sladiny Princip: Měření pH sladiny je důležité pro posouzení rozluštění sladu. Hodnota pH ovlivňuje některé analytické ukazatele - extrakt, Kolbachovo číslo, relativní extrakt při teplotě 45° C, barvu apod. Kyselejší sladiny zvyšují vyloužitelnost látek během rmutování. pH se měří v kongresní sladině po filtraci, nejpozději do 30 minut. Výsledky se udávají na dvě desetinná místa. Běžné hodnoty pH kongresní sladiny světlého sladu jsou 5,6 až 6,0. Barva se stanovuje spektrofotometricky podle EBC ve zfiltrovaném vzorku při 430 nm Chemikálie a zařízení: pH-metr, spektrofotometr, zařízení pro membránovou filtraci, membránové filtry (0,45 µm), křemelina Pracovní postup: Vzorek se zfiltruje přes membránu (při hodnotě zákalu vyšší než 1 jednotka EBC s přídavkem 0,1 % křemeliny) a změří se absorbance při 430 nm. Barva vzorku se vypočte podle vztahu B = 25 . f . A430 Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 252, 257 2.2.6 Stanovení aminodusíku sladiny ninhydrinovou metodou Princip: Metoda ninhydrinová je založena na oxidační dekarboxylaci aminokyselin při pH 6,7 a následné reakci neredukované a redukované formy ninhydrinu Chemikálie a zařízení: ninhydrinové činidlo, ředící roztok, standarní roztok (glycin), reagenční baňky, vodní lázeň, spektrofotometr Pracovní postup: Vzorek sladiny (mladiny) se 100krát ředí, po přídavku ninhydrinového činidla (2 ml vzorku + 1 ml činidla) se ponechá 16 minut ve vroucí vodní lázni, ochladí, přidá zřeďovací roztok (5 ml) a po 10 minutách se proti slepému pokusu změří absorbance při 570 nm. Výpočet obsahu aminodusíku zahrnuje naměřenou hodnotu absorbance zmenšenou o hodnotu slepého pokusu, zřeďovací faktor a hodnotu absorbance standardního roztoku aminokyseliny glycinu. Průměrný obsah volného aminodusíku je 150 až 250 mg/l sladiny. Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s.532
2.2.7 Stanovení sacharidických složek sladiny pomocí HPLC Princip: Stanovení sacharidů metodou HPLC-RIDK. Mono- a oligosacharidy obsažené ve sladině, mladině, případně hotovém pivu se dělí na ionexové koloně v Ag+ cyklu a detekují refraktometricky. Přístroje a zařízení: kapalinový chromatograf Agilent 1100 s refraktometrickým detektorem kolona Phenomenex Rezex RSO Oligosacharides 200x10 mm s předkolonkou mikrofiltr s acetátcelulosovými filtry (0,45m) třepačka Chromatografické podmínky: mobilní fáze: odplyněná demineralizovaná voda teplota kolony: 80C průtok mob. fáze: 0,4 ml/min Chemikálie: glukóza, fruktóza a maltóza (vše p.a.) Software: Agilent Chemstation Pracovní postup: Pro kalibraci je třeba připravit 3 kalibrační roztoky maltózy, glukózy a fruktózy v koncentracích 1, 2 a 5 g/litr. Vzorek se přefiltruje za pomocí mikrofiltru, v případě prokvašené mladiny a hotového piva je třeba vzorek též předem vytřepat po dobu 15 min. Následně se vzorek převede do vialky v autosampleru, další postup je již automatizován a řízen softwarově. Sacharidy se na koloně dělí podle své molekulové hmotnosti a z kolony jsou vymývány sestupně podle počtu glukózových jednotek, manosacharidy pak v pořadí glukóza,fruktóza. Výsledky jsou vyhodnoceny pomocí kalibračních křivek, přičemž v případě maltoriózy a vyšších sacharidů se používá kalibrační křivka maltózy. Výsledky se obvykle vyjadřují v g/l a pohybují se v rozmezí 1-5 g/l u piv a 1-80 g/l u mladin a sladin (záleží na původní koncentraci extraktu a použité technologii). Literatura: Ondroušek, S., Dostálek, P.: Vliv technologie na vznik a využití sacharidů při výrobě mladiny a piva, Kvasny Prum. 33(11), 1987, 322-5. 2.2.8 Stanovení volných aminokyselin sladiny HPLC Přehled metod stanovení aminokyselin obsahuje metody klasické, založené na spektrofotometrickém měření, a moderní, využívající HPLC, GC, GPC a HIC. V dnešní době je většina analýz HPLC uskutečňována v systémech s reverzní fází (RP-HPLC), kde stacionární fáze je nepolární a mobilní fáze polární rozpouštědlo. Princip stanovení: Aminokyseliny jsou před vlastním stanovením formou předkolonové nebo postkolonové derivatizace převedeny na vhodný derivát, dostatečně stabilní a neintegrující s nosičem.
Metoda AccQTag využívá AccQTag fluorescenčního činidla, převádějícího primární a sekundární aminokyseliny na stabilní fluorescenční deriváty. Následuje detekce fluorescenčním nebo PDA detektorem. Chemikálie a zařízení: Waters Alliance HPLC systém, se separačním modulem 2695. Součástí systému jsou dvě nezávisle řízené pumpy v sériovém uspořádání se zpětnými ventily k izokratickým a gradientovým operacím, autosampler, dávkovací injekční stříkačky o objemu 25, 250 a 2 500 l, dávkovací smyčky, disketová jednotka. Režim externího řízení je zajištěn chromatografickým programem Empower. Pracovní režim: Derivatizační činidlo: Standard: Kolona: Rozměr kolony: Temperace kolony: Detektor: Eluenty:
Gradient:
Nástřik na kolonu: Vnitřní standard: Doba analýzy: Stabilizace kolony: Způsob vyhodnocení:
Waters AccQ•Fluor Reagenční činidlo (6-aminoquinolyl-Ahydroxysuccinimidyl karbamát) Waters Amino Acid Hydrolysate Standard Waters AccQ•Tag Amino Acid kolona Nova-Pak C18, 4 μm 150 x 3,9 mm 37 °C Waters Multi 2475 fluorescenční detektor s excitací 250 mm, emisí při 395 nm A – borátový pufr (vodný roztok) B – acetonitril (čistota HPLC grade) C – Milli-Q voda (18 MΩ) Čas (min) počáteční 0,5 18 19 29,5 33 36 51
Průtok (ml.min-1) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
%A 100 99 95 91 83 0 100 0
%B 0 1 5 9 17 60 0 60
%C 0 0 0 0 0 40 0 40
5 μl vzorku (koncentrace aminokyselin 5 – 200 pmolů) kyselina α-aminomáselná 36 min 9 min na začátku, 15 min na nový vzorek program Empower
Spektrum stanovitelných základních aminokyselin: kyselina asparagová, serin, kyselina glutamová, glycin, histidin, arginin, threonin, alanin, prolin, cystein, tyrosin, valin, methionin, lysin, isoleucin, leucin, phenylalanin. Pracovní postup zahrnuje deproteinaci vzorku (metanol, vymražení), odpaření, zpětné naředění roztokem HCl o koncentraci 0,1 mol.l-1, přídavek vnitřního standardu, derivatizaci a převedení
vzorku do vialek autosampleru. Vyhodnocení: Chromatografický program Empower metodou vnitřního standardu umožňuje stanovení aminokyselin v koncentracích pikomoly. Literatura: Instruction Manual Waters AccQ·Tag Chemistry Package, Waters Corporation, USA, 1994, Čížková H., Hofta P., Kolouchová I., Dostálek P.: Kvasny Prum. 51, 2005, s. 47
3.
Rozbor vody
3.1 Neutralizační kapacita 3.1.1 Stanovení zjevné a celkové alkality Princip: Neutralizační kapacita vody udává látkové množství silné kyseliny (cH+) (kyselinová kapacita) nebo silné zásady (COH-) (zásadová kapacita), které po přidání ke zkoumané látce změní její pH na udanou hodnotu. Celková alkalita je zvláštní případ kyselinové neutralizační kapacity vody odpovídající látkovému množství silné kyseliny (H +), kterým po přidání ke vzorku vody je dosaženo pH = 4,5. (KNK4,5, m-hodnota). Zjevná alkalita je zvláštní případ kyselinové neutralizační kapacity vody odpovídající látkovému množství silné kyseliny (H+), kterým po přidání ke vzorku vody je dosaženo pH = 8,3 (KNK4,5, p-hodnota). Alkalita se stanoví titrací vzorku vody roztokem silné kyseliny. Indikace je vizuální nebo elektrometrická Přístroje a zařízení: pH-metr mikrobyrety dělené po 0,05 ml Chemikálie a roztoky: kyselina chlorovodíková, c(HCl) = 0,1 mol/l 0,05% roztok fenolftaleinu v 96% ethanolu 0,05% vodný roztok methyloranže Pracovní postup: Při stanoveni zjevné alkality se přidá ke 100 ml vzorku 0,1 ml fenolftaleinu a titruje se odměrným roztokem HC1 o koncentraci c(HCl) = 0,1 mol/l do odbarvení indikátoru. Při elektrometrické indikaci se titruje do pH = 8,3. Při stanoveni celkové alkality se použije vzorek po stanoveni zjevné alkality. Přidají se 3 kapky roztoku methyloranže a titruje se do cibulového zabarvení. Při elektrometrické indikaci se zvolna dotitrovává do pH = 5,0, až se tato hodnota nemění. Od zjištěné hodnoty se odečte spotřeba na slepý pokus s redestilovanou vodou. Výpočet a vyhodnocení: Zjevná alkalita se vypočte podle vztahu: Ve . c(HCl) .103 KNK = —————————— = c (H+) 8,3 V kde Ve - je spotřeba odměrného roztoku HCl o c(HCl) = 0,1 mol/l, c(HCl) - koncentrace odměrného roztoku HCl při titraci do pH = 8,3 mol/l),
KNK8,3
- zjevná alkalita (mmol/l).
Celková alkalita se vypočte podle vztahu:
KNK4,5 =
Ve . c(HCl) . 103 ——————————— = c (H+) V
kde Ve - je spotřeba odměrného roztoku HCl o c(HCl) =0,1 mol/l, c(HCl) - koncentrace odměrného roztoku HCl při titraci do pH = 4,5 (mol/l), KNK4,5 - celová alkalita V (pro obě alkality) - objem vzorku (ml), Výsledky se udávají v mmol/l s přesností na tři desetinná místa pro rozmezí 0,05 až 1,0 mmol/l, pro hodnoty vyšší s přesností na dvě desetinná místa. Metodu lze použít pro stanovení alkality nad 0,05 mmol/l. Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 41 3.2
Tvrdost vody
Tvrdost vody není v literatuře definována jednotně; vychází se buď z hlediska technologického, nebo analytického. Pojem "tvrdost vody" je vztahován v podstatě na obsah iontů vápníku a hořčíku, i když jejich chemické a technologické vlastnosti nejsou rovnocenné. Zastaralé jsou názvy tvrdost přechodná a stálá a způsob kvantitativního vyjadřování tvrdosti ve stupních německých (°N), anglických či amerických. V příslušných tabulkách lze nalézt přepočet dřívějších jednotek (mval/l, °N) používaných při analýze vody na současné jednotky (mg/l, mmol/l). 3.2.1 Stanovení celkové tvrdosti – obsahu iontů vápníku a hořčíku Vápenaté ionty jsou obsaženy ve všech vodách a společně s ionty hořčíku se podílejí na změnách pH při výrobě mladiny a piva. Z hlediska snížení pH vlivem Ca2+ a Mg2+.má mít varní voda nízkou celkovou alkalitu a současně vyšší obsah Ca 2+. Ionty vápníku ovlivňují také aktivitu α-amylasy (EC 3.2.1.1), podporují sedimentaci kvasinek a pravděpodobně stimulují vznik chladového zákalu. Ionty hořčíku se uplatňují v mnoha případech jako aktivátory enzymových reakcí. Jejich přítomnost může také působit negativně na chuť piva, jestliže koncentrace je vyšší než 65 mg/l. Princip: V prostředí pH = 10 tvoří kyselina ethylendiamintetraoctová nebo její disodná sůl (chelaton 3) nejprve s vápenatými a potom s horečnatými ionty cheláty. Vymizení Mg 2+ je indikováno barevnou změnou eriochromové černi T. Spotřeba odměrného roztoku chelatonu 3 je úměrná koncentraci Ca2+ a Mg2+. Chemikálie a roztoky: kyselina chlorovodíková, c (HCl)) = 0,1 mol/l - 96 % ethanol - 0,5 % vodný roztok methylčerveně odměrný roztok chelatonu 3, c (EDTA) = 0, 05 mol/l - roztok eriochromové černi T - tlumivý roztok pH = 10
Pracovní postup: Ke 100 ml vzorku vody se po zrušení celkové alkality ekvivalentním množstvím zředěné HCl (c = 0,1 mol/l) přidá 5 ml tlumivého roztoku a po promíchání ještě 5 kapek roztoku indikátoru. Potom se titruje roztokem chelatonu 3 do jasně modrého zbarvení. Výpočet a vyhodnocení: Celkový obsah Ca2+ a Mg2+se vypočte podle vztahu: a.c.103 X = -------V kde X a V c
- je celkové množství iontů vápníku a hořčíku (mmol/l) (tzv. tvrdost), - spotřeba odměrného roztoku chelatonu 3 (ml), - objem vzorku odebraného k analýze (ml), - koncentrace chelatonu 3 (mol/l).
Přesnost stanovení je při titraci 0,05 mmol/l, která je zároveň spodní hranicí pro zjištění koncentrace Ca2++ Mg2+. Výsledek se udává v mmol/l s přesností na dvě desetinná místa. Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 43 3.2.2 Stanovení obsahu iontů vápníku a hořčíku Princip: V alkalickém prostředí (pH = 12 až 13) tvoří vápenaté ionty chelát s chelatonem 3 (disodná sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové - EDTA). Konec titrace je indikován barevnou změnou indikátoru. Spotřeba odměrného roztoku chelatomu 3 je úměrná koncentraci vápenatých iontů Chemikálie a roztoky: - hydroxid draselný, roztok přibližně o c(KOH) 5,0 mol/l - kyselina chlorovodíková, c(HCl) =0,1 mol/l - chelaton 3, c(EDTA) =0,05 mol/l - indikátorová směs fluorexonu, thymoftalexonu a murexidu Pracovní postup: Objem odměřeného vzorku s obsahem Ca2+ od 2 do 20 mg se upraví přídavkem destilované vody na objem asi 150 ml. U vzorků s celkovou alkalitou větší než 5 mmol/l se přidá ekvivalentní množství kyseliny chlorovodíkové, c(HCl) = 0,1 mol/l, povaří 3 minuty a po ochlazení se připipetují 2,0 ml roztoku KOH, c(KOH) = 5 mol/l. Po promíchání a přídavku indikátorové směsi do zřetelně zeleného odstínu se titruje chelatonem 3 do fialově růžového zbarvení. Výpočet a vyhodnocení: a.c.103 X = ---------------V Kde X - je koncentrace iontů vápníku (mmol/l), a - spotřeba odměrného roztoku chelatonu 3 (ml),
c - koncentrace odměrného roztoku chelatonu 3 (mmol/l), V - objem vzorku (ml). Výsledek se udává v mg Ca2+ na 1 litr vzorku s přesností na jedno desetinné místo, při vyjádření výsledků v mmol/l s přesností na dvě desetinná místa. Pro přepočet platí: 1 mmol Ca2+ odpovídá 40,08 mg Ca2+nebo 1 mg Ca2+ odpovídá 0,02495 mmol Ca2+. Metodu lze použít pro stanovení Ca2+ v koncentracích 10 až 200 mg/l. Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 49 3.2.3 Stanovení obsahu hořčíku Princip: Koncentrace iontů hořčíku se vypočítá z výsledku stanovení celkového množství Ca 2+ + Mg2+, a výsledku stanovení Ca2+. Výpočet a vyhodnocení: a.c.103 b.c.103 X = ---------------- - ---------------V1 V2 Kde X - je koncentrace iontů hořčíku(mmol/l), a - spotřeba odměrného roztoku chelatonu 3 při stanovení Ca2+ + Mg2+ (ml), b - spotřeba odměrného roztoku chelatonu 3 při stanovení Ca2+ (ml) c - koncentrace odměrného roztoku chelatonu 3 (mmol/l), V1 - objem vzorku při stanovení Ca 2+ + Mg2+(ml) V2 - objem vzorku při stanovení Ca 2+(ml). Výsledek se udává v mmol/l s přesností na dvě desetinná místa, při vyjádření výsledků v mg/l s přesností na jedno desetinné místa. Pro přepočet platí: 1 mmol Mg2+ odpovídá 24,32 mg Mg2+, 1 mg Mg2+ odpovídá 0,0411 mmol Mg2+ Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 50 3.3
Výpočet zbytkové alkality vody
Princip: Sole varní vody ovlivňují významně pH rmutů a sladiny tím, jak reagují s rozpustnými solemi ze sladu. Předpokládaný účinek solí určuje hodnota zbytkové alkality Ra, která je definována jako rozdíl celkové alkality a vyrovnané alkality, přičemž vyrovnaná alkalita se rovná vápníkové tvrdosti lomené 3,5 plus hořečnaté tvrdosti lomené 7. Zbytková alkalita = Celková alkalita – Vyrovnaná alkalita Ra = Tk – (TCa + 0,5 TMg)/ 3,5
Pro 12% světlou čistě sladovou mladinu se předpokládaná hodnota pH vypočte podle vztahu: pH = K + f.Ra kde K je 5,5 (pH sladiny připravené z destilované vody a f je faktor = 0, 17 pro Ra vyjádřenou v mmol/l nebo = 0,03 pro Ra vyjádřenou ve °n Literatura: Basařová G., Čepička J.: Sladařství a pivovarství, skriptum, SNTL Praha 1986, s. 70
4.
Rozbor chmele
4.1
Stanovení konduktometrické hodnoty chmele a chmelového extraktu
Princip: konduktometrická hodnota vyjadřuje obsah α-hořkých kyselin stanovených na základě reakce s kationty Pb2+ Konec titrace je indikován konduktometricky. Zařízení a chemikálie: toluen, methanol, roztok octanu olovnatého c = 4 %, konduktometr Přístroje a zařízení: - konduktometr s příslušenstvím - magnetická míchačka Chemikálie a roztoky: - toluen p.a. - methanol p.a. - 4 % methanolový roztok octanu olovnatého Pracovní postup: 7,5 g chmelové drti nebo 1,5 g extraktu se vpraví do láhve s patentním uzávěrem, přidá se 50 ml toluenu a směs se třepe na třepačce 90 minut. Po vytřepání se obsah láhve přefiltruje přes skládaný papírový filtr do podstavené kuželové baňky obsahu 250 ml. 10 ml eluátu se odpipetuje do 150 ml kádinky a přidá se 75 ml methanolu. Do roztoku se ponoří konduktometrická elektroda a za současného míchání na elektromagnetické míchačce se přidává po 0,2 ml 4% met. roztok octanu olovnatého. Po každém přidání a promíchání se měří vodivost roztoku konduktometrem. Tímto způsobem se pokračuje až do spotřeby 2 až 5 ml titračního roztoku, v závislosti na obsahu -hořkých kyselin v analyzovaném chmelu. Naměřené hodnoty se vynesou do souřadnicového systému na milimetrový papír a sestrojí se křivka charakteru paraboly. Proložením přímek rameny paraboly se získá průsečík, který je bodem ekvivalence. Bod ekvivalence se promítne na souřadnici spotřeby titračního roztoku a získaný údaj se násobí faktorem 2,54. Toto číslo udává % -hořkých kyselin v původním chmelu. Při konduktometrickém stanovení je nutné, aby všechny tři proužky na elektrodě byly ponořeny do roztoku. Rozdíl mezi dvěma souběžnými stanoveními nesmí být větší než 0,3 %. Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 439
4.2
Stanovení obsahu α- a β- hořkých kyselin chmele a chmelových výrobků pomocí HPLC
Upravená metodika podle Analytica-EBC, Method 7.7 Princip: Chmel, chmelové granule jsou extrahovány směsí ether/methanol a kyselinou chlorovodíkovou. a -kyseliny chmele rozpuštěné v etherové fázi jsou rozděleny pomocí chromatografie na reverzní fázi se spektrofotometrickou detekcí při 314 nm. Chemikálie: Diethylether, prostý peroxidů, p.a. Methanol, p.a. Methanol pro HPLC super gradient Kyselina fosforečná, 85%, = 1,71 Kyselina chlorovodíková, c(HCl) = 0,1 mol/l Eluční činidlo A: methanol/millipore voda/fosforečná kyselina v poměru 85 : 17 : 0,25 (v/v/v) cca 250 ml na 1 vzorek chmele (6 nástřiků) a standard (4 nástřiky) Eluční činidlo B: millipore voda (používá se pouze se Shutdown metodou!!!) Standardní chmelový extrakt se známým množstvím a -kyselin (Labor Veritas, Zürich, Switzerland), používá se jako externí standard, skladování při -18 ˚C v mrazáku v pivovarské laboratoři, stabilita 1 rok Přístroje a materiál:
Váhy AND Třepačka (oranžová) Ultrazvuková lázeň (hladina vody po naplnění cca 3 cm pod okraj) Skleněná 250 ml láhev se závitem, gumovým tešněním a hliníkovým víčkem (pozn.: po práci víčko a těsnění ponořte do teplé vody s Jarem) Odměrné baňky 50 ml a 100 ml Pipeta Biohit na 2x 5 ml Pipeta na ether Brand handy step s 50 ml zásobníkem (krok 5) Odměrný válec na těkavé kapaliny 100 ml HPLC Waters W2690 s PDA detektorem W2996 HPLC kolona Waters Nova-Pak 250 x 4.6 mm, C18 s guard kolonkou nebo Phenomenex Gemini 250 x 2.0 mm, C18 s guard kolonkou. Použití této HPLC-MS kolony diskutovat s Ing. Dostálkem (je u ní potřeba dávat větší pozor na čistotu rozpouštědel, nastřikovaná množství a tlaky). Bomba s N2 na převrstvení
Pracovní postup: Příprava externího standardu Navažte 0,5 g standardního extraktu (mcs) do 50 ml kádinky (vraťte standard do mrazáku) a přidejte 30 ml methanolu a rozpusťte pomocí ultrazvuku. Převeďte roztok extraktu do 100 ml odměrné baňky a doplňte po rysku methanolem. Uzavřete baňku a vzniklý roztok opatrně promíchejte. Z tohoto roztoku odpipetujte 10 ml do 50 ml odměrné baňky a doplňte po rysku methanolem a promíchejte. Případný zákal odstraňte filtrací přes membránu 0,45 m (Millipore). Roztok je připraven jako vzorek pro stanovení pomocí HPLC a metody externího
standardu. Skladujte tento roztok v lednici, převrstvěte jej dusíkem a chraňte jej před světlem alobalem. Roztok je stabilní 24 hodin. Odpipetujte cca 1 ml do vialky s víčkem a těsním (Waters) a vložte ji do karuselu HPLC autosampleru a pozici si zazanamenejte, budete ji potřebovat při vyplňování tabulky pro nástřik vzorků . Pozn.: Nastřikujte vzorek standardu nejméně 2krát před a 2krát po reálných vzorcích, stačí opakovaný nástřik z jedné vialky. Příprava vzorků chmele Rozmělněte vzorek chmele či chmelových granulí v laboratorním mlýnku. Doba mletí 2 minuty. Každý vzorek chmele připravte 3krát k nástřiku (3x extra navážka a extrakce). Navažte přesně přibližně 10 g jemně namletého chmele (ms) do 250 ml skleněné láhve se závitem. Přidejte 20 ml methanolu a 100 ml diethyletheru. Zavřete opatrně láhev víčkem s gumovým těsněním a intenzivně třepejte 30 minut na třepačce umístěné v digestoři. Poté opatrně otevřete láhev (pracujte v digestoři), přidejte 40 ml 0,1 mol/l HCl. Opatrně uzavřete láhev a třepejte nejméně 10 minut při optimálně intenzitě (tak aby extrakční činidlo nesmáčelo gumové těsnění). Nechte láhev stát 10 minut aby se oddělili obě fáze. Opatrně odpipetujte 5,0 ml etherové fáze pipetou Brand handy step do 50 ml odměrné baňky a doplňte po rysku methanolem. Opatrně promíchejte. Odpipetujte cca 1 ml do vialkek s víčky a těsněním (Waters) a vložte je do karuselu HPLC autosampleru, pozici si zaznamenejte. Případný zákal zfiltrujte pomocí 0,45 m či 0,22 m mikrofiltru a stříkačky. Chromatografické stanovení V okně nastavte vlevo metodu „EBC_7_7“ a vpravo chromatografický systém „Aliance PDA“ pokud budete analyzovat. Pozn.: Pokud jen vyhodnocujete výledky tak nastavte „No system“. Překontrolujte správnost nastavení metody. Klikněte na záložku „View Method“ a nahoře v lište „File“, pak „Open“ … method set EBC77_1. Pak přepněte v záložce „View Method“ na „Instrument“ a klikněte na tlačítko „W2690/5“ a zkontrolujte průtok mobilní fáze v záložce „Flow“ (Isocratic, Total Flow 0.550, %A 100.0, Low Limit 50.0 a High Limit 3500.0). Zároveň překontrolujte, že eluční roztok je v láhvi A, a že je v něm zcela ponořena hadička s fritou, popsaná jako „Solvent A“!!! Poté klikněte na tlačítko „W2996“ a překontrolujte nastavení PDA detektoru (2D Data Collection, Method channel lambda 314.0, Method channel bandwith 1.2, Sampling Rate 1.0 a zaškrtnout „Digital Filter“) Před vlastní analýzou je potřeba „zavodnit“cestu A pomocí stříkačky a programu. Eluční činidlo přefiltrujte přes 0,45 m acetát-celulosovou membránu Sartorius a nalijte do čistě vymyté 1 l láhve, popište složením mobilky, jménem a datem. Láhev dobře utěsněte parafínovou folií. Po najetí základní obrazovky na Allianci stiskněte „Menu/Status“ poté „Direct Functions“ a dále na „Dry Prime“, otevřete cestu A tlačítkem „Open A“ , povolte zavodňovací šroub (otevřít spodní dvířka a povolit doleva šroub mezi pumpami) a ručně zavodněte cestu stříkačkou (stačí cca 10 ml), poté utáhněte šroub a stiskněte tlačítko „Continue“. Vyčkejte na promytí cest. Následně stiskněte „Direct Functions“, zkontrolujte máte-li v láhvi za přístrojem (vedou k ní dvě hadičky „zelená“ a „Seal wash in“) dostatek oplachové kapaliny (30-50% methanol) a poté stiskněte tlačítko „Wet Prime“. Vyčkejte na promytí součástí přístroje. „Equilibrujte“ kolonu elučním činidlem A nejméně 30 min před nastříknutím vzorků. Přepněte se do záložky „Run Samples“, pokud není oranžové tlačítko „View Acquisition“, tak na něj klikněte. Stiskněte tlačítko „Press to equilibrate system/monitor baseline“, a zadejte Instrument Method „ebc77“ a stiskněte tlačítko „Equilibrate/Monitor“. Přepnutím tlačítka „Control Panel“ v záložce „Run Samples“ můžete sledovat základní linii = baseline. Pokud je rovná baseline, tak můžete
nastřikovat, viz postup níže. Každý vzorek nejméně 2krát. Tj. z jednoho vzorku chmele nejméně 6 nástřiků + 4 nástřiky na kalibraci.
Přepněte se do záložky „Run Samples“ poté máte 2 možnosti: 1. Vypište v záložce „Samples“ tyto parametry „Vial“=číslo vialky, „SampleName“ = popis vzorku, „Inj Vol“ = nastřikovaný objem (Waters Nova-Pak 10 l, Phenomenex Gemini 2,5 l), „# of Injs“ = počet nástřiků, „Function“ = vyberte funkci (nejčastěji se používá Inject Samples, Inject Standard, clear calibration a equlibrate), „Method Set/Report Method“ = vyberte EBC77_1, „Run Time(Minutes)“ = doba analýzy (40 pro kolonu Phenomenex), ostatní parametry nepřenastavujte. Doporučuji mít v prvním řádku jen „Function“ vybrat Clear Calibration a „Method Set/Report Method“ vybrat EBC77_1. 2. Použít některé z předchozích stanovení a přepsat je podle aktuálních pozic v karuselu. Klikněte na „File“ v horní liště, poté „New Sample Set“ a poté „Using Sample Set Method“, vybrat např. ebc77_4 a stisknout tlačítko „Open“.Poté přepište podle aktuálního stavu. Po nastavení tabulky stiskněte tlačítko „Press to run the current sample set method“ (zkumavky s zelenou šipkou) v panelu „View Acquisition“. V následujícím okně vyplňte „Name for this sample set“ = napište název celého setu vzorků, „Run Mode“ = vyplňte Run and Process, „Shutdown Method“ = vyplňte shutdown_ebc, ostatní nevyplňujte a poté stiskněte tlačítko „Run“. Naměřená data jsou v záložce „Browse Project“ a poté v záložce „Results“. Kliknutím na příslušný nástřik se zobrazí jeho chromatogram a po kliknutí na „View Acquisition“ i tabulka s výsledky. Pozn.: Shutdown metoda používá cestu B, tzn. je nutné tuto cestu promýt a připravit stejně jako v případě cesty A. Používejte jen nově připravenou čistou millipore vodu. Průtok mobilní fáze 0,05 ml/min, Low Limit (psi) je tentokrát 0. Vyhřívání kolony není u této metody nutné, pracuje se při laboratorní teplotě. Pro zvýšení přesnosti vyhřejte kolonu na 20 C. Po zapnutí vyberte funkci „MAN.“, vyťukejte 20 a stiskněte „ENTER“. Po práci vyhřívání vypněte (kolíbka vzadu). Výsledky lze získat buď přímo pomocí software Empower nebo jednoduchým výpočtem z vytištěných chromatogramů. Výpočty: Ci
DF ms Cic Ai ms Aic
Ci = koncentrace složky i (např. kohumulonu) ve vzorku vyjádřená jako % hm. DF = ředící faktor, 1 pro extrakty, 2 pro chmel a granule mcs = navážka kalibračního extraktu v g Cic = koncentrace složky i v kalibračním standardu vyjádřená jako % hm. Ai = plocha píku složky i v analyzovaném vzorku (průměr ze tří ploch) ms = navážka vzorku Aic = plocha píku složky i v analyzovaném standardu (průměr ze 4 ploch) Obsah -kyselin je součtem % hm. kohumulonu a a dvojpíku humulonu a adhumulonu. Obsah -kyselin je součtem % hm. kolupulonu a dvojpíku lupulonu a adlupulonu.
C = Ccoh + Cn+adh C = Ccol + Cn+adl Výsledky se vyjadřují jako % hm. na jedno desetinné místo. Literatura: Analytica-EBC, Method 7.7, European Brewery Convention, Zoeterwode 2005. 4.3
Stanovení celkových polyfenolů piva podle EBC
Princip metody: Polyfenoly reagují se železitými ionty v alkalickém roztoku za vzniku červeného barevného komplexu, jehož intenzita se měří spektrofotometricky při vlnové délce 600 nm. Přístroje a zařízení: -
spektrofotometr UNICAM 5625 laboratorní třepačka
Chemikálie a roztoky: -
-
roztok karboxymethylcelulosy (CMC/EDTA): 10 g karboxymethylcelulosy a 2 g EDTA (ethylendiamintetraacetátdisodný – Chelaton III) se rozpustí v destilované vodě v 1000 ml odměrné baňce 3,5 % vodní roztok citrátu železitoamonného: 3,5 g citrátu železitoamonného se rozpustí v 100 ml odměrné baňce (roztok je stálý asi týden) roztok amoniaku: 1 díl koncentrovaného amoniaku a 2 díly destilované vody
Pracovní postup: Do odměrné baňky o objemu 25 ml se k 10 ml chmelového výluhu přidá 8 ml roztoku CMC/EDTA a 0,5 ml roztoku citrátu železitoamonného. Po důkladném promíchání se přidá 0,5 ml amoniaku, promíchá se a doplní destilovanou vodou ke značce. Za deset minut se změří absorbance v 1 cm kyvetách při vlnové délce 600 nm proti slepému pokusu. Ke slepému pokusu se odpipetuje 10 ml chmelového výluhu, 8 ml roztoku CMC/EDTA, 0,5 ml zředěného roztoku amoniaku a po důkladném promíchání se doplní destilovanou vodou ke značce. Výpočet a vyhodnocení: Obsah celkových polyfenolů (CP) v měřeném roztoku se vypočte z rovnice: CP = A600 x 820 (mg/l), kde A600 je rozdíl absorbancí vzorku a slepého pokusu při 600 nm. 5
Rozbor pivovarských kvasnic
5.1
Provozní mikrobiologická kontrola
Termín kvasnice se používá pro větší množství biomasy pivovarských kvasinek, pokud se popisují jednotlivé buňky nebo jejich vlastností používá se termín kvasinky. Prvními ukazateli kvality kvasnic bývá posouzení makroskopických, mikroskopických znaků a celkové vyhodnocení znečištění kvasnic(„várečných“ - použitých na zakvašení). Jako hlavní
kvalitativní vlastnosti kvasnic se pak hodnotí jejich viabilita a vitalita. Termín viabilita nebo počet viabilních buněk (viability count) označuje počet buněk v populaci, které jsou schopné růstu a dalšího rozmnožování. Stanovuje se několika metodami s odlišným principem. Nejpřesnější (ale i časově nejnáročnější) jsou metody založené na buněčné replikaci, nejrozšířenější jsou metody založené na barvení a méně používané jsou metody jejichž principem je měření obsahu některých buněčných složek, adenosin trifosfátu (ATP), či redukované formy nikotinamid dinukleitidu (NADH). Termín vitalita poukazuje na fyziologický stav populace nebo na její metabolickou aktivitu. Vitalita se v laboratorních podmínkách nejčastěji sleduje testy založenými na metabolické aktivitě kvasinek (acidifikační test, intraceluární pH, rychlost spotřeby kyslíku atd.) nebo metodami založenými na měření některých buněčných složek jako jsou zásobní látky (glykogen, trehalosa atd.) nebo ATP či NADH. 5.2 Stanovení viability kvasnic barvícími technikami. Barvení methylenovou modří metodou podle EBC Princip: Živé buňky kvasinek redukují alkalický roztok methylenové modři na bezbarvou formu, mrtvé buňky kvasinek se barví modře. Přesnost stanovení závisí na pH, jehož optimum pro reprodukovatelné stanovení je 9,5-10,5. Materiál: Bürkerova počítací komůrka, methylenová modř, mikroskop Pracovní postup: V kapce roztoku methylenové modře se rozmíchají kvasnice očkovací jehlou nebo tenkou skleněnou tyčinkou tak, aby vznikl preparát s počitatelným množstvím buněk v políčku Bürkerovy komůrky nebo v zorném poli. Po přikrytí krycím sklem se ihned spočítají tmavě modře zbarvené buňky a ostatní kvasinky. Methylenová modř buňky usmrcuje a počet mrtvých buněk s časem roste. Prohlédne se nejméně 20 políček a výsledek se vyjádří v procentech mrtvých buněk z celkového počtu kvasinek. Metoda je spolehlivá, dodrží-li se předepsané podmínky a pracuje-li se rychle. Kvasinky musí být v suspenzi dobře rozptýlené, preparát musí mít předepsanou hustotu (100-200 buněk v zorném poli), jinak se získají chybné výsledky. Násadní kvasnice mají obsahovat méně než 5 % mrtvých buněk Literatura: Šavel J.: Mikrobiologická kontrola v pivovarech, SNTL Praha 1980, s. 88 Smart K., A., Chambers K., M.: J. Am. Soc. Brew. Chem. 57 (1), 1999, s. 18 5.2.2 Barvení propidium jodidem s vyhodnocením na průtokovém cytometru Princip: Při průtokové cytometrii jsou jednotlivé buňky unášeny laminárním proudem kapaliny do měrné cely kde je ozáří světelný zdroj, kterým je obvykle laserový paprsek přesně definovaných parametrů. Světelný zdroj je zaostřen na proud kapaliny, nesoucí analyzovaný vzorek. Světelný paprsek se při průchodu jednotlivými buňkami buť pohltí, rozptýlý nebo u obarveného vzorku emituje fluorescenční záření měří se tedy veličiny: úhel rozptylu, snímaný v přímém směru od světelného zdroje (forward angle – FSC), odpovídající velikosti buněk, úhel rozptylu, snímaný pod úhlem 90° od světelného zdroje (side angle – SSC), popisující granularitu buňky, a fluorescence pro různé vlnové délky (fluorescence je také snímána pod úhlem 90° od světelného zdroje). Z těchto měřených veličin získáme informace o počtu procházejících jedinců, jejich tvaru, velikosti, morfologii a vitalitě. Vzniklé signály jsou jednotlivě zesíleny fotonásobiči, detekovány a registrovány pomocí pulzního analyzátoru napětí. Buňky mohou být analyzovány při velmi vysokých rychlostech průchodu měrnou celou, dosahujících až několik tisíc buněk za sekundu, avšak za optimální je považováno rychlost v řádu stovek.
Výsledkem analýzy je histogram, který ukazuje rozložení jednotlivých měřených parametrů v rámci buněčné populace. Jestliže se současně měří v jediné buňce více než jeden parametr, lze výsledky vyjádřit též dvou nebo třídimenzionálně histogramem nebo bodovým diagramem pro dvě charakteristiky. Každý bod diagramu odpovídá jedné měřené částici. Mezi nejčastěji používaný bodový diagram v průtokové cytometrií patří tzv. dot plot diagram, který udává závislost dvou korelujících parametrů (vlastností buněk), např. popisuje závislost velikosti buněk (FSC) na jejich granularitě (SSC). Propidium jodidem se barví pouze živé buňky, mrtvé ne. Poznámka: propidium jodid je chemikálie se silným karcinogenním účinkem, proto je při manipulaci nezbytné používat chirurgické rukavice či jinou vhodnou ochranu. Chemikálie a zařízení: Zásobní roztok barviva (10 mg propidium jodidu /ml deionizované vody), pracovní roztok barviva (1 mg propidium jodidu /ml deionizované vody), fyziologický fosfátový ústojný roztok PBS, průtokový cytometr (Partec PAS III, výrobce: Partec, GmbH Germany), argoniontový laser, červený filtr FL3 nad 600nm. Pracovní postup: Z hodnocených kvasnic se do odeberou dva vzorky. V jednom se kvasinky po odstředění usmrtí dvouhodinovou fixací v roztoku 70 % ethanolu a poté znovu odstředí a promyjí fosfátovým pufrem. Ze vzorku se přidá několik kapek do měrné kyvety a ta se doplní do dvou třetin fosfátovým pufrem. Do kyvety se nakonec přidá 5 μl barviva a roztok se řádně protřepe. Po vlastní analýze na průtokovém cytometru popsaném výše se vyhodnotí intenzita fluorescence mrtvých buněk. Ta samá procedura, s pochopitelným vynecháním fixačního kroku, je provedena i s druhou částí vzorku. Buňky, které fluoreskují ve stejném rozmezí intenzit jako u fixovaného vzorku jsou poté vyhodnoceny jako mrtvé. Literatura: Hutter K., J., Schaefte J.: Monatsssch. Brauwiss. 50, 1997, s. 444 Howard M.Shapiro: Practical flow citometry. Wiley-Liss publication, 3rd ed., New York, 1995
5.3
Stanovení vitality kvasnic acidifikačním testem
Princip: Acidifikační test je ukazatelem fyziologického stavu kvasnic. Test je založen na schopnosti kvasnic snižovat pH definovaného roztoku, tato schopnost přímo koreluje s fyziologickým stavem populace. Chemikálie: destilovaná voda, 0,05 M roztok hydroxidu draselného a roztok s koncentrací glukosy 20,2 g/l destilované vody. Pracovní postup: Z třikrát odstředěných a promytých kvasnic (3000 ot./min po dobu 10 min) se naváží 9 g do suché 150 ml kádinky. Kvasničná pasta je pak resuspendována ve 100 ml destilované vody vytemperované na 25 OC a s pH upraveným na 6,3 (pH bylo upraveno roztokem hydroxidu draselného). Ihned potom následuje měření pH v minutových intervalech za stálého míchání suspense magnetickým míchadlem. Po uplynutí 10 min, se do proměřovaného roztoku přidá ještě 5 ml glukózového roztoku. Tento roztok je vytemperován na 25 0C. Po dalších 10 min se odečte poslední hodnota pH a tím je měření ukončeno. Výpočty jsou provedeny podle následujících vztahů: Apcelk .= 6,3 - pH20
AP10 = 6,3 - pH10 AP20 = pH10 - pH20 pH20 je hodnota pH po 20 min měření
Kde:
pH10 je hodnota pH po 10 min měření AP20 je glukózou indukovaná acidifikační schopnost AP10 je spontánní acidifikační schopnost Apcelk je celková acidifikační schopnost Literatura: Kara B., Simpson W. J., Hammod J. R. M.: J. Ind. Brew., 94, 1988, s 153 5.4
Charakterizace bakteriální kontaminace metodou PCR
Bakteriální kontaminace piva nepředstavuje v dnešní době pro pivovarství vážné nebezpečí. V pivu je nejčastější kontaminace mléčnými bakteriemi. Protože mléčné bakterie zahrnují mnoho druhů, je dosti často problém s jejich přesnou charakterizací. Na 31. Pivovarsko-sladařském semináři v Plzni bylo referováno o nejčastějších izolátech mléčných bakterií v pivu, a tyto izoláty byly na základě biochemických charakteristik zařazeny jako Lactobacillus plantarum. Rod Lactobacillus je charakterizován jako G+ nesporotvorné tyčinky. Dělí se na homofermentativní podrod Lactobacillus a heterofermentativní podrod Saccharobacillus. Lactobacillus plantarum patří do podrodu Lactobacillus a tvoří opticky inaktivní kyselinu mléčnou. Je velmi rozšířen v přírodě, účastní se mléčného kvašení rostlinného materiálu (zelí, okurky apod.). Některé potravinářské podniky, jako jsou mlékárny, využívají tuto bakterii jako kulturní mikroorganismus. Její přítomnost v pivu je ovšem kontaminací. Abychom potvrdili, že se jedná skutečně o Lactobacillus plantarum, použili jsme přesnější a specifičtější metodu charakterizace izolátů bakterií, které byly izolovány ve Výzkumném ústavu pivovarském a sladařském v Praze. Pracovní postup: Pracovní postup se skládá z několika kroků. Nejdříve se izoluje samotná gDNA z bakterií pomocí kitu a je změřena absorbance pomocí spektrofotometru při vlnové délce λ = 260 nm. Ze zjištěných hodnot je vypočtena koncentrace vyizolované DNA. K určení druhu bakterie je použit speciální kit BrewSave (TAKARA BIO). Pomocí tohoto kitu bylo možné amplifikovat část gDNA a podle velikosti amplifikované části určit druh. Použité půdy a způsoby kultivace bakterií rodu Lactobacillus
Sterilní nízkotučné mléko pro uchování izolátů laktobacilů v zamraženém stavu při teplotě -20 °C.
MRS agar (OXOID) s přídavkem aktidionu (0,025 g/l) a β-fenylethanolu (0,3%) k uchování G+ a katalázu netvořících laktobacilů
MRS bujón (OXOID) k pomnožení izolátů laktobacilů.
MRS agar (OXOID) k namnožení izolátů laktobacilů před izolací DNA.
Izoláty bakterií na MRS médiích je třeba od doby jejich získání do možnosti jejich identifikace velmi často přeočkovávat (1 x za 14 dní). Kultivace probíhá postupně na všech použitých půdách v termostatu při teplotách 28 – 30 °C .
Souprava (NucleoSpin Tissue kit – TAKARA BIO) určená pro izolaci DNA
Kit tvoří sada roztoků a elučních činidel (lyzační pufr T1, promývací pufr BW, promývací pufr B 5, eluční pufr BE), dále mikrozkumavky Eppendorf a kolony s filtrem. Jde o speciálně upravená skleněná vlákna, která tvoří filtr na dně malé zkumavky. Tato zkumavka je svou velikostí určena pro použití v 1,5 a 2,0 ml kyvetách. K aplikaci vzorku, promytí membrány a eluci nukleové kyseliny slouží odstředivá síla. Metoda umožňuje rutinní izolaci a purifikaci nukleových kyselin. Získaný produkt vykazuje absorbanci při 260/280 nm > 1,8. Izolovaná DNA se může použít pro běžné molekulárněbiologické metody, např. PCR, transformace, stanovení sekvence a podobně. Kapacita membrány je limitována na cca 40 g. Vlastní izolace DNA
Odstředit 1 ml dobře narostlé kultury při 7500 min -1. Odstranit supernatant. Peletku resuspendovat v 170 μl pufru T1. Promíchat pomocí nasávání a vypouštění pipety (up and down).
Přidat 25 μl proteinasy K a intenzivně protřepat na statické vibrační třepačce. Inkubovat při 56 °C po dobu minimálně 1 – 3 h nebo přes noc. Občas protřepat. Protřepat na statické vibrační třepačce. Přidat 200 μl pufru B3, intenzivně směs promíchat, inkubovat 10 min při 70 °C. Přidat 210 μl ethanolu a okamžitě protřepat na statické vibrační třepačce.
Vložit NucleoSpin Tissue kolonu do sběrné 2 ml zkumavky. Vzorek odstředit 1 min. při 10 000 min-1. Proteklý objem vylít a kolonu vložit do stejné sběrné zkumavky. Přidat 500 μl pufru BW a odstředit při 10 000 min -1. Proteklý objem odstranit. Přidat 600 μl pufru B5 a odstředit při 10 000 min-1. Proteklý objem odstranit. Naprázdno odstředit po dobu 3 minut. Tímto krokem se odstraní všechna rezidua ethanolu. Kolonu umístit do 1,5 ml eppendorfky, do kolony přidat 200 μl pufru BE předehřátého na 70 °C, inkubovat 1 minutu při pokojové teplotě. Kolonu odstranit, zkumavku uzavřít a pečlivě popsat. Změřit koncentraci na spektrofotometru.
Měření koncentrace izolované DNA Spektrofotometr Beckman DU–600, jednokyvetový, jednopaprskový spektrofotometr, využívající jak UV tak VIS paprsků, je speciálně upravený spektrofotometr pro měření absorbance DNA a RNA v minimálním objemovém množství. Jeho kyveta je vyrobena tak, že na určení absorbance postačí objem měřené kapaliny již 50 μl. Určení koncentrace je velmi důležité, protože z koncentrace určíme množství DNA, které bude dále používáno na PCR.
Gelová elektroforéza
Agaróza Serva pro DNA elektroforézu AGAGE standard electrophoresis (Biometra) Standard Power Pack P25 (Biometra) TBE pufr 10 x : Tris HCl Kyselina boritá EDTA
Ethidium bromid (EtBr) o koncentraci 1μg/ml Srovnávací standard Lambda Hind III 1 Kb DNA Ladder
Velikost a kvalita amplifikované DNA se hodnotí pomocí agarosové elektroforérzy. Elektroforézy se využívá pro rychlost a rozlišovací schopnost. Zjišťuje se čistota preparátu, popřípadě množství a velikost DNA. Separace probíhá na základě elektrického náboje a také na základě molární hmotnosti udávané v bp („base pairs“). Jako detekční barvivo se nejčastěji používá ethidium bromid, který je detekován pomocí UV prosvícení. Lze ovšem použít i další barviva, jako jsou bromfenolová modř, akridinová oranž, xylen cyanol nebo bromkresolová zeleň.
BrewSave kit (amplifikace DNA) http://bio.takara.co.jp/BIO_EN/Catalog_d.asp?C_ID=C0224 BrewSave kit je navržený pro detekce G+ bakterií v kvašených nápojích jako jsou saké nebo pivo. Tyto grampozitivní bakterie z řady laktobacilů jsou tolerantní k alkoholu od 12 až do 16
%, kontaminují a kazí kvašené nápoje. Vyskytují se i ve zvětralém pivu. Kit je založen na metodě polymerázové řetězové reakci (PCR) a obsahuje specifické primery, Tag polymerázu, směs nukleotidů a PCR pufr. Primery (oligonukleotidy) dodané v tomto kitu jsou v zastoupení: jeden univerzální sensový a čtyři anti-sensové primery, které mohou generovat DNA fragmenty ze širokého spektra bakterií současně v jedné zkumavce. Z velikosti amplifikovaných fragmentů lze zjistit, o jaký druh rodu Lactobacillus se jedná. Velikosti fragmentů uvádí tab. 1. Reverzní primer Lactobacillus heterohichii S-14 Lactobacillus heterohichii S-20 Lactobacillus heterohichii H-1 Lactobacillus heterohichii S-24 Lactobacillus heterohichii S-34 Lactobacillus heterohichii H-42 Lactobacillus japonicum H-7 Lactobacillus plantarum Lactobacillus casei subsp. rhamnosus Lactobacillus casei subsp. casei Lactobacillus sp. Lactobacillus brevis Lactobacillus heterohichii S-14 Lactobacillus heterohichii H-1A Lactobacillus heterohichii S-37B Lactobacillus heterohichii S-9A Lactobacillus heterohichii S-24 Lactobacillus heterohichii S-42 S-7A H-34B H-7 A-1
LAM – 3R
Velikost aplifikovaných fragmentů ( párů bází – bp) 200
LA 1198 LAM – 3R
167 20
LA 1198 LAF – 3R
167 163
LAC – 3R
175
LAC – 3R
175
LA 1198
170
LAM – 3R
200
LAF – 3R
175
LAC – 3R
180
Tab.1 - Velikosti amplifikovaných fragmentů
PCR – metoda polymerázové řetězové reakce Principem PCR je mnohonásobné kopírování úseků DNA neboli amplifikace. Úsek genomové DNA, který chceme amplifikovat je označen specifickými oligonukleotidy zvané primery. Jedná se většinou o oligomery s 16 až 30 jednotkami. Ty svým přesně daným pořadím nukleotidů dosedají na gDNA a od tohoto místa začíná amplifikace. Z hlediska postupu amplifikace jsou dva typy primerů - sensový, probíhající od 5´konce, a antisensový, který amplifikuje opačně tj.3´konce. V kitu, použitém k amplifikaci DNA z bakterie rodu Lactobacillus jsou použity následující primery: sensový LAU 1 a čtyři antisensové LAC – 3R, LAF – 3R, LA1198, LAM – 3R. Vlastní amplifikace probíhá ve třech základních krocích v několika cyklech, přičemž v každém cyklu se počet kopií zdvojnásobí. Jednotlivé kroky jsou:
Tepelná denaturace – slouží k rozvinutí dvoušroubovice DNA. Probíhá při teplotě 94 °C po dobu 30 sekund. Připojení primerů (annealing) – neboli navázání specifických primerů na odpovídající místo rozvinuté DNA, přičemž je dodržena zásada o párování bazí. Trvá 1 min při 55 °C. Syntetická fáze (extenze) – za přítomnosti DNA–polymerasy se kopíruje úsek vymezený navázanými primery. Extenze je prováděna při 72 °C po dobu 1 minuty. Tento cyklus je opakován a počet cyklů určuje výslednou koncentraci amplifikovaného úseku DNA. V běžné praxi se používá okolo 35 cyklů. Po skončení cyklů se většinou provedou ještě další dva kroky: annealing po dobu 5 minut, který umožní dokončit syntézu všech vláken DNA, a posledním krokem bývá chlazení na 4 °C. Podmínky pro PCR cycler – Progene (Techne)
Denaturace 94 °C po dobu 30 sekund,
Annealing 55 °C po dobu 1 minuty,
Extenze 72 °C,
35 cyklů
5 minut 72 °C a poté ochlazení na 4 °C.
Po úspěšném vyizolování DNA byl použit BrewSave Kit pro amplifikaci úseku DNA, podle jehož velikosti bychom měli určit přesný druh Lactobacillus. Z katalogu TAKARA kitů bylo zjištěno množství látek přidávané do reakce. Postup je zřejmý z tab. 2. TaKaRa Taq (5 jednotek/l) 10x PCR pufr dNTP směs (2,5 mM každé) Templát DNA Primer 1 Primer 2 voda celkem
0,5 l 10 l 8 l 1 g 0,2 - 1,0 M 0,2 - 1,0 M doplnit do 100 l 100 l
Tab.2 - Směs pro PCR Literatura: Vohánka, J., Dostálek, P., Fiala, J., Hollerová I.: Charakterizace bakteriální kontaminace v pivu metodou PCR, Kvasny Prum. 49, 2003, 340-342. 5.5
Charakterizace bakteriální kontaminace metodou FISH
Technika fluorescenční in situ hybridizace byla poprvé popsána roku 1969 Parduovou a Gallem. Použili radioaktivně značené sondy pro DNA. Neradioaktivní značení sond poprvé publikované roku 1980 Baumannem a 1981 Langerem některé z potíží spojených s autoradiografií odstranilo. V dnešní době se díky neradioaktivnímu značení rozšířilo používání metod in situ hybridizace z výzkumných laboratoří do praxe.
Principem metody FISH je založen na schopnosti vazby jednořetězcové DNA sondy s komplementárními úseky cílové DNA fixované na mikroskopickém preparátu. Hybridizace probíhá v rozmezí 2-24 hodin, záleží na podmínkách a typu použité sondy. Při hybridizaci dojde k navázání komplementárních úseků a zpětné renaturaci. Někdy je pro získání optimálního výsledku vhodné preparát ještě před denaturací ošetřit, abychom omezili nespecifickou flourescenci. Pro tento účel byla vypracována řada postupů, jež souhrnně označujeme jako „pretreatment“ Posledním krokem FISH je detekce navázané sondy. V případě, že fluorescenční signál je příliš slabý, je možné provést jeho amplifikaci. K tomu se používá tzv. sendvičová metoda, kdy střídavě nanášíme další vrstvy protilátek s fluorochromy. Konečné vyhodnocení preparátu provádíme pomocí fluorescenčního mikroskopu vybaveném sadou vhodných optických filtrů. Vhodné sondy pro FISH dělíme do několika skupin. Jsou to jednak sondy pro specifické chromozómové struktury, kam řadíme např. sondy centromerické a telomerické, dále sondy celochromozómové (tzv. malovací) a sondy pro jedinečné genové kopie. Sondy použité v kitu Vermicon jsou celochromozómové. Vícebarevná FISH je metoda založená na současné aplikaci dvou nebo více různě značených sond na jednom mikroskopickém preparátu. Vizualizaci provádíme kombinací optických filtrů o vhodných vlnových délkách. Existuje i technika kombinovaného značení, kdy různé sondy značíme zároveň dvěma či více značícími molekulami v různých poměrech. Takto lze pomocí tří fluorochromů rozlišit až sedm různých sond. Vícebarevná FISH umožňuje sledovat a detekovat několik DNA sekvencí současně. Fluorescenční proby využívá komerčně dostupný kit Vermicon Identification Technology, kde principem této metody je navázání fluorescenční próby na gDNA bakterií. Po ozáření UV světlem emitují záření (Obr. 1).
A, Volné sondy
B, Nenavázané sondy v buňce
C, Navázané sondy
Obr. 1 Princip kitu Vermicon (http://www.vermicon.de)
VIT – Vermicon Identification Technology - VIT-Bier plus L. brevis Byl použit kit firmy Vermicon AG, který má schopnost detekovat rod Lactobacillus a současně specificky Lactobacillus brevis v médiu. Je přímo vhodný pro pivovarskou kontaminaci způsobenou tímto rodem. Před samotným obarvením ovšem musí předcházet
zkoncentrování vzorku. To se provádí buď přes filtry, které nepropustí bakterie, nebo odstředění při vyšších otáčkách a odsátí supernatantu. Další možností je pomnožení bakterií ve vhodném médiu tak, aby koncentrace vzrostla alespoň na 1000 KTJ (kolonií tvořící jednotky) v 1 ml. Rychlost této metody je dána také tím, že se nepracuje s přesně definovaným množstvím jak vzorku, tak ostatních chemikálií, ale jedná se o kapkovou metodu. Všechny chemikálie, mezi které patří fixační roztok, barvící roztok, nebo promývací roztok, jsou uzpůsobeny k použití v lahvičkách s kapátkem. Další nezbytnou součástí kitu je sada podložních skel, boxy k inkubaci – reaktor (Obr.2). Podložní sklo je rozděleno na tři pole ohraničená černou fólií. Každé z těchto polí poskytuje informaci o stejném vzorku jednoho druhu.
Obr. 2 Součásti kitu Vermicon
Příprava vzorků Inkubátor byl předehřán na 46 ± 2 oC a složka Breaker 2 byla rozmražována před samotným pokusem Byl připraven vzorek s kulturou, která obvykle roste při 28°C po dobu nejméně 48 hodin. Část byla převedena do sterilní vialky na 1,5 – 2 ml. Vzorek byl odstředěn (při pokojové teplotě) po dobu 5 minut při 2 700 – 4000 RPM, poté byl odstraněn supernatant tak, aby došlo k úplnému odstranění kapalné části.
Přidaly se čtyři kapky roztoku B2 k peletě, vzorek byl homogenizován. Došlo k usmrcení bakterií.
Nanášení preparovaného vzorku a fixace
Podložní sklíčko bylo vloženo do víčka VIT- reaktoru (Obr. 3)
Obr. 3 Umístění podložního skla do víčka VIT reaktoru
Pomocí pipety byla přidána jedna kapka (5 – 10 l) preparovaného vzorku na sklíčko se třemi otvory. Inkubace proběhla v horizonální poloze při 46°C po dobu 15 až 30 minut, nebo do úplného uschnutí. Dále se přidala kapka Breaker 2 do kažké jamky a takto se inkubovala na podložce v horihontální poloze při pokojové teplotě po dobu 7 minut. (Ihned po použití je nutné Breaker 2 uzavřít a vrátit zpět na mrazák). VIT reaktor byl naplněn destilovanou vodou po značku. Opatrně byl postaven na podložku kolmo a ihned byl rozebrán. Voda byla vylita. Poté byla přídána jedna kapka roztoku B2 do jamky a v horizonální poloze proběhla inkubace při 46 °C po dobu 10-15 minut nebo do kompletního vyschnutí bez VIT reaktoru. Je-li potřeba, může být reaktor s fixovaným vzorkem uchován při 4 °C po dobu až 4 týdnů. Kontakt Byl připraven promývací roztok Spotřeba na každou reakci je 30 ml roztoku D1, naředěného 10x s destilovanou vodou. V průběhu kontaktu byl promývací roztok předehřívaný na 46 °C v uzavřené lahvi v inkubátoru. Z části byla vložena komora do VIT-reaktoru (Obr. 4) Poté se přidalo asi 25 kapek roztoku C1 do komory VIT reaktoru a celá komora byla zasunuta do VIT- reaktoru. Na sklíčko do jamky označené „ – “ . byla přidána 1 kapka negativní kontroly Na sklíčko do jamky označené „VIT“ byla přídána 1 kapka B-Lbr (green). Na sklíčko označené „+“. byla přidána 1 kapka pozitivní kontroly G (red) Pozorně bylo sklíčko vloženo horiontálně do VIT – reaktoru (Obr.5), reaktor byl uzavřen a proběhla inkubace v horizontální poloze při 46°C po dobu 1,5 hodiny. Je nutné zamezit kontaktu jednotlivých vzorků mezi sebou.
Obr. 4 Vložení komory do reaktoru
Obr. 5 Vložení sklíčka do reaktoru
Promývání
Opatrně byl otevřen VIT reaktor a vyndalo se sklíčko. (Pozor na slití různých jamek.) Poté se jamky vyndaly z reaktoru a byly postaveny kolmo a reaktor byl naplněn promývacím roztokem ke značce. Reaktor byl uzavřen v kolmé poloze a otočen do horizontální polohy. Proběhla inkubace VIT reaktoru v této pozici 46 °C po dobu 15 minut. VIT reaktor byl otevřen a vyndalo se sklíčko. Promývací roztok byl odstraněn Podložní sklíčko bylo opláchnuto destilovanou vodou. Podložní sklíčko bylo inkubováno v temnu při 46 °C, 15 minut nebo do kompletního vyschnutí. Poté byly přidány dvě malé kapky Finisher na sklíčko a bylo přiloženo krycí sklíčko.
Mikroskopické hodnocení Jelikož se jedná o bakterie dlouhé 1-6µm, bylo nejvhodnější použít zvětšení 10x100 a imerzní olej.Podložní sklo rozdělené do tří polí dává tyto výsledky: pole pozitivní kontrola - všechny gram-positivní bakterie ze vzorku svítí zeleně pole negativní kontrola - bakterie nesvítí ani červeně ani zeleně Pivo kazící mléčné bakterie svítí červeně, pouze Lactobacillus brevis svítí červeně a zeleně. Mikroskopování bylo provedeno na mikroskopu Olympus BX51. Tento typ disponuje měnitelnými filtry. Také je u tohoto typu možnost snímání zorného pole pomocí kamery a pořídit tak digitální záznam na počítači.L.brevis dává obraz 3 možných zorných polí v jiném světle. Na prvním obrázku (Obr. 6) je Lactobacillus brevis v nativním preparátu. Zvětšení při mikroskopování bylo vždy použito 10 x 100 s použitím imerzního oleje. Dalším obrázkem (Obr.7) je L.brevis pod UV světlem a filtrem na zelenou fluorescenci. Ta je způsobena barvivem fluoresceinem. Posledním ze série snímků je obrázek s nastaveným červeným filtrem (Obr.8). Zde je fluorescence způsobena rhodaminem.
Obr. 6 Nativní preparát vzorku Lactobacillus brevis, zvětšení 10 x 100 imerze
Obr. 7 Preparát vzorku Lactobacillus brevis pod UV světlem se zeleným filtrem
Obr. 8 Preparát Lactobacillus brevis pod UV světlem s červeným filtrem
Literatura: Fiala, J., Vohánka, J., Dostálek, P.: Determination of Lactobacillaceae by PCR methods. Proceedings of the Congress - European Brewery Convention 30, 2005, 131/1-131/7.
Část B: Výroba piva 1.
Příprava mladiny
Výrobní zařízení: 1/4-provozní čtyřnádobová varna, vystírací káď, rmutovací pánev, scezovací káď, mladinová pánev, měděné nádoby, 2-rmutový dekokční postup, ohřev plynem, oddělení chmele na chmelovém cízu. Varna je umístěna v technologické hale ÚKCHB, VŠCHT Praha Suroviny:
voda sladový šrot hlávkový sušený chmel chmelový granulát sacharosa
Pracovní postup: 1/ Vystírání: V boileru se upraví teplota vody na 38 oC a přibližně 35 l se přepustí do vystírací kádě. Za stálého míchání se vystře (při výrobě mladiny o původní koncentraci 11 %hm. se vystírá přibližně 10 kg sladového šrotu při 38 oC) a po řádném rozmíchání se výsledný objem díla upraví na 45 litrů). 2/ Rmutování: 23 l vystírky se spustí jako první rmut na rmutovaní pánev. Rmut se pomalu vyhřívá (l °C za l min) až na „první cukrotvornou“ teplotu 63 °C. Po dosažení této teploty se zařadí prodleva 15 min. V průběhu zahřívání se v boileru přivede zbytek vody do varu a přidá se ke zbytku vystírky v takovém množství, aby teplota vzrostla na 55 °C. Tuto operaci nazýváme „zapářka“. Po prodlevě prvního rmutu opět pozvolna zvyšujeme teplotu na 73 °C („druhá cukrotvorná“ teplota). Zde se rmut „podrží“ až do úplného zcukření. Při použití kvalitních sladů zcukření proběhne do 15 minut. Po kontrole zcukření jodovou zkouškou (viz. jodová zkouška), rmut pozvolna přivedeme do varu a 20 minut vaříme. Povařený rmut se přečerpá zpět do vystírací kádě - teplota ve vystírací kádi pak musí být v v rozsahu hodnot 62 °C až 65 °C. Po důkladném promíchání se spustí zvolené množství díla do rmutovací pánve (v reálném případě 22 l). Druhý rmut se uvedenou rychlostí ohřeje na 75 oC a nechá zcukřit. Dosažení úplného zcukření (doba je přibližně stejná jako u prvního rmutu) ověříme jodovou zkouškou a rmut se pozvolna uvede do varu a 15 minut povaří. Následně se spojí druhý rmut se zbytkem ve vystírací kádi ( teplota musí být v rozsahu 73 oC – 78 oC) a celé dílo se přečerpá na scezovací káď. 3/ Scezování: Po 30 minutové prodlevě, při které se vytvoří sedimentací pluch filtrační koláč, se dílo tzv. „podrazí“ (odpustí se kalný podíl a vrátí nad mláto). Když je stékající sladina čirá, zahájí se scezování. V průběhu stékání předku se naplní boiler vodou, vyhřeje na 75 oC a až se při stahování předku objeví na dně kádě povrch mláta, začne se s „výstřelkováním“. Povrch mláta se skrápí ohřátou vodou. Je-li mláto potopeno, opatrně se prokope jeho vrchní vrstva tak, aby se nenarušila vrstva spodní a pokračuje se ve scezování. V této fázi již lze zatopit pod kotlem a ohřívat sladinku. Výstřelkování se provádí buď na extrakt výstřelku (min 1% ), nebo na objem (v reálném případě). 4/ Chmelovar: Dávka chmele je závislá na obsahu hořkých látek a požadované hořkosti vyráběného piva. Ke chmelení se používá sušený hlávkový chmel nebo chmelový granulát. Nejvhodnější dávkování chmele je na tři dávky a to 40 % - 40 % - 20 %. Po ukončení scezování se sladina přivede do varu. Cca 10 minut před dosažením bodu varu se přidá
první dávka chmele. Druhá dávka se přidává 30 minut po začátku chmelovaru a třetí společně se sacharosou (v případě surogace) 10 minut před jeho skončením. Celý chmelovar se provádí v mladinové pánvi a trvá 90 minut. Následuje kontrola lomu a odměření objemu vystřelované horké mladiny. Odpar bývá 7 až 8 litrů. Objem horké mladiny je cca 50 l. 5/ Chlazení a oddělení kalů: Na další nádobě, která je kombinací cízu a chladiče, se oddělí chmelové mláto a mladina se ochladí na 7 oC. Při chlazení se změří orientačně stupňovitost sacharometrem. Zde je poslední možnost naředit mladinu na požadovanou stupňovitost převařenou vodou (v další fázi výroby již voda do českého piva voda při klasické technologii nepatří). Výpočet sypání: Sypání je množství sladu (a jejich surogátů) použité pro várku. Závisí na extraktivnosti zpracovávaných surovin. S = V20 . E0 Rv kde S je sypání sladu (kg V20 je objem studené mladiny (V100 . 0,96) E0
je koncentrace mladiny před čerpáním (% obj. = % hm. x hustota)
Rv je varní výtěžek (%), tj. extrakt použitého sladu v původní hmotě E zmenšený o rozdíl extraktu mezi laboratoří a varnou Jodová zkouška – kontrola zcukření: Připraví se 0,01 N roztok jodu a několik kapek se přidá k malému množství zkoušeného rmutu. Pokud roztok zůstane žlutý, pokračuje se dále ve výrobním postupu. Pokud jod zmodrá, není ještě všechen škrob obsažený ve sladovém šrotu rozštěpen na jednoduché zkvasitelné sacharidy. V tomto případě se zvýší teplota na 75 °C a pokračuje se v prodlevě až do úplného zcukření. Zakvašení a hlavní kvašení Procesu zakvašení předchází posouzení kvality kvasnic a stanoven zákvasné dávky v závislosti na koncentraci mladiny. Připravená mladina se zchladí na 7 °C a oddělí se jemné kaly (nejlépe po usazení stáhnout hadičkou) a zakvasí se pivovarskými kvasnicemi v množství 250 ml hustých kvasnic na 50 litrů mladiny tak, aby po zakvašení byl počet buněk (15 – 20). 106 buněk/ml (viz. dále Stanovení počtu buněk po zakvašení). Mladina se pak nechá kvasit ve skleněné nádobě při teplotě 7 °C. Teplota je regulována temperací místnosti – „spilky“. Po dvou dnech teplota mladiny vzroste intenzivním kvašením na 8 °C, po třech dnech klesá opět na 7 °C. Obecně platí zásada - kolik % extraktu má mladina, tolik dní se vede hlavní kvašení. Tuto dobu lze však ovlivnit zákvasnou dávkou, teplotou procesu a je závislá na parametrech mladiny a kvalitě kvasnic. Kvasící pivo je třeba kontrolovat. Když kvasnice sedají ke dnu a pivo se začíná čiřit a extrakt odpovídá 75 % dosažitelného prokvašení mladiny, suduje se do čistých sudů případně PET lahví. Sudy s mladým pivem se uloží do ležáckého sklepa, při teplotě 0,5 až 2 °C a nechají se po dobu 5 až 7 týdnů dokvášet - zrát. V průběhu dozrávání se kontroluje tlak v sudu a udržuje se přibližně na 1,5 kPa.
2.
Mikrobiologická kontrola várečných kvasnic
Při odběru vzorků kvasnic je nutné zajistit odebrání průměrného tak, aby nedošlo k sekundární kontaminaci. Vzorky se odebírají sterilně do sterilních nádobek (zkumavek, baněk) uzavřených vhodnou zátkou. Zpracují se v nejkratší době po odebrání. Mikrobiologická kontrola zahrnuje posouzení kvasnic podle makroskopických znaků, mikroskopické posouzení čistoty kvasnic, stanovení počtu mrtvých buněk a stanovení kontaminujících (koliformních a mléčných) bakterií 2.1
Posouzení kvasnic podle makroskopických znaků
Termín kvasnice se používá pro větší množství biomasy pivovarských kvasinek, pokud se popisují jednotlivé buňky nebo jejich vlastností používá se termín kvasinky. Prvními ukazateli kvality kvasnic bývá posouzení makroskopických, mikroskopických znaků a celkové vyhodnocení znečištění kvasnic(„várečných“ - použitých na zakvašení). Jako hlavní kvalitativní vlastnosti kvasnic se pak hodnotí jejich viabilita a vitalita. Termín viabilita nebo počet viabilních buněk (viability count) označuje počet buněk v populaci, které jsou schopné růstu a dalšího rozmnožování. Stanovuje se několika metodami s odlišným principem. Nejpřesnější (ale i časově nejnáročnější) jsou metody založené na buněčné replikaci, nejrozšířenější jsou metody založené na barvení a méně používané jsou metody jejichž principem je měření obsahu některých buněčných složek, adenosin trifosfátu (ATP), či redukované formy nikotinamid dinukleitidu (NADH). Termín vitalita poukazuje na fyziologický stav populace nebo na její metabolickou aktivitu. Vitalita se v laboratorních podmínkách nejčastěji sleduje testy založenými na metabolické aktivitě kvasinek (acidifikační test, intraceluární pH, rychlost spotřeby kyslíku atd.) nebo metodami založenými na měření některých buněčných složek jako jsou zásobní látky (glykogen, trehalosa atd.) nebo ATP či NADH. 2.2
Stanovení vitality a viability kvasnic
Stanovení viability kvasnic barvícími technikami - Barvení methylenovou modří Princip: Živé buňky kvasinek redukují alkalický roztok methylenové modři na bezbarvou formu, mrtvé buňky kvasinek se barví modře. Přesnost stanovení závisí na pH, jehož optimum pro reprodukovatelné stanovení je 9,5-10,5. Materiál: Bürkerova počítací komůrka, methylenová modř, mikroskop Pracovní postup: V kapce roztoku methylenové modře se rozmíchají kvasnice očkovací jehlou nebo tenkou skleněnou tyčinkou tak, aby vznikl preparát s počitatelným množstvím buněk v políčku Bürkerovy komůrky nebo v zorném poli. Po přikrytí krycím sklem se ihned spočítají tmavě modře zbarvené buňky a ostatní kvasinky. Methylenová modř buňky usmrcuje a počet mrtvých buněk s časem roste. Prohlédne se nejméně 20 políček a výsledek se vyjádří v procentech mrtvých buněk z celkového počtu kvasinek. Metoda je spolehlivá, dodrží-li se předepsané podmínky a pracuje-li se rychle. Kvasinky musí být v suspenzi dobře rozptýlené, preparát musí mít předepsanou hustotu (100-200 buněk v zorném poli), jinak se získají chybné výsledky. Násadní kvasnice mají obsahovat méně než 5 % mrtvých buněk
Literatura: Šavel J.: Mikrobiologická kontrola v pivovarech, SNTL Praha 1980, s. 88 Smart K., A., Chambers K., M.: J. Am. Soc. Brew. Chem. 57 (1), 1999, s. 18 Stanovení viability kvasnic barvícími technikami - Barvení propidium jodidem s vyhodnocením na průtokovém cytometru Princip: Při průtokové cytometrii jsou jednotlivé buňky unášeny laminárním proudem kapaliny do měrné cely kde je ozáří světelný zdroj, kterým je obvykle laserový paprsek přesně definovaných parametrů. Světelný zdroj je zaostřen na proud kapaliny, nesoucí analyzovaný vzorek. Světelný paprsek se při průchodu jednotlivými buňkami buť pohltí, rozptýlý nebo u obarveného vzorku emituje fluorescenční záření měří se tedy veličiny: úhel rozptylu, snímaný v přímém směru od světelného zdroje (forward angle – FSC), odpovídající velikosti buněk, úhel rozptylu, snímaný pod úhlem 90° od světelného zdroje (side angle – SSC), popisující granularitu buňky, a fluorescence pro různé vlnové délky (fluorescence je také snímána pod úhlem 90° od světelného zdroje). Z těchto měřených veličin získáme informace o počtu procházejících jedinců, jejich tvaru, velikosti, morfologii a vitalitě. Vzniklé signály jsou jednotlivě zesíleny fotonásobiči, detekovány a registrovány pomocí pulzního analyzátoru napětí. Buňky mohou být analyzovány při velmi vysokých rychlostech průchodu měrnou celou, dosahujících až několik tisíc buněk za sekundu, avšak za optimální je považováno rychlost v řádu stovek. Výsledkem analýzy je histogram, který ukazuje rozložení jednotlivých měřených parametrů v rámci buněčné populace. Jestliže se současně měří v jediné buňce více než jeden parametr, lze výsledky vyjádřit též dvou nebo třídimenzionálně histogramem nebo bodovým diagramem pro dvě charakteristiky. Každý bod diagramu odpovídá jedné měřené částici. Mezi nejčastěji používaný bodový diagram v průtokové cytometrií patří tzv. dot plot diagram, který udává závislost dvou korelujících parametrů (vlastností buněk), např. popisuje závislost velikosti buněk (FSC) na jejich granularitě (SSC). Propidium jodidem se barví pouze živé buňky, mrtvé ne. Poznámka: propidium jodid je chemikálie se silným karcinogenním účinkem, proto je při manipulaci nezbytné používat chirurgické rukavice či jinou vhodnou ochranu. Chemikálie a zařízení: Zásobní roztok barviva (10 mg propidium jodidu /ml deionizované vody), pracovní roztok barviva (1 mg propidium jodidu /ml deionizované vody), fyziologický fosfátový ústojný roztok PBS, průtokový cytometr (Partec PAS III, výrobce: Partec, GmbH Germany), argoniontový laser, červený filtr FL3 nad 600nm. Pracovní postup: Z hodnocených kvasnic se do odeberou dva vzorky. V jednom se kvasinky po odstředění usmrtí dvouhodinovou fixací v roztoku 70 % ethanolu a poté znovu odstředí a promyjí fosfátovým pufrem. Ze vzorku se přidá několik kapek do měrné kyvety a ta se doplní do dvou třetin fosfátovým pufrem. Do kyvety se nakonec přidá 5 μl barviva a roztok se řádně protřepe. Po vlastní analýze na průtokovém cytometru popsaném výše se vyhodnotí intenzita fluorescence mrtvých buněk. Ta samá procedura, s pochopitelným vynecháním fixačního kroku, je provedena i s druhou částí vzorku. Buňky, které fluoreskují ve stejném rozmezí intenzit jako u fixovaného vzorku jsou poté vyhodnoceny jako mrtvé. Literatura: Hutter K., J., Schaefte J.: Monatsssch. Brauwiss. 50, 1997, s. 444 Howard M.Shapiro: Practical flow citometry. Wiley-Liss publication, 3rd ed., New York, 1995
2.3
Kontrola mikrobiální kontaminace
Charakterizace bakteriální kontaminace metodou FISH Fluorescenční proby využívá komerčně dostupný kit Vermicon Identification Technology, kde principem této metody je navázání fluorescenční próby na gDNA bakterií. Po ozáření UV světlem emitují záření (Obr. 1).
A, Volné sondy
B, Nenavázané sondy v buňce
C, Navázané sondy
Obr. 1 Princip kitu Vermicon (http://www.vermicon.de)
VIT – Vermicon Identification Technology - VIT-Bier plus L. brevis Byl použit kit firmy Vermicon AG, který má schopnost detekovat rod Lactobacillus a současně specificky Lactobacillus brevis v médiu. Je přímo vhodný pro pivovarskou kontaminaci způsobenou tímto rodem. Před samotným obarvením ovšem musí předcházet zkoncentrování vzorku. To se provádí buď přes filtry, které nepropustí bakterie, nebo odstředění při vyšších otáčkách a odsátí supernatantu. Další možností je pomnožení bakterií ve vhodném médiu tak, aby koncentrace vzrostla alespoň na 1000 KTJ (kolonií tvořící jednotky) v 1 ml. Rychlost této metody je dána také tím, že se nepracuje s přesně definovaným množstvím jak vzorku, tak ostatních chemikálií, ale jedná se o kapkovou metodu. Všechny chemikálie, mezi které patří fixační roztok, barvící roztok, nebo promývací roztok, jsou uzpůsobeny k použití v lahvičkách s kapátkem. Další nezbytnou součástí kitu je sada podložních skel, boxy k inkubaci – reaktor (Obr.2). Podložní sklo je rozděleno na tři pole ohraničená černou fólií. Každé z těchto polí poskytuje informaci o stejném vzorku jednoho druhu.
Obr. 2 Součásti kitu Vermicon
Příprava vzorků Inkubátor byl předehřán na 46 ± 2 oC a složka Breaker 2 byla rozmražována před samotným pokusem Byl připraven vzorek s kulturou, která obvykle roste při 28°C po dobu nejméně 48 hodin. Část byla převedena do sterilní vialky na 1,5 – 2 ml. Vzorek byl odstředěn (při pokojové teplotě) po dobu 5 minut při 2 700 – 4000 RPM, poté byl odstraněn supernatant tak, aby došlo k úplnému odstranění kapalné části.
Přidaly se čtyři kapky roztoku B2 k peletě, vzorek byl homogenizován. Došlo k usmrcení bakterií.
Nanášení preparovaného vzorku a fixace
Podložní sklíčko bylo vloženo do víčka VIT- reaktoru (Obr. 3)
Obr. 3 Umístění podložního skla do víčka VIT reaktoru
Pomocí pipety byla přidána jedna kapka (5 – 10 l) preparovaného vzorku na sklíčko se třemi otvory. Inkubace proběhla v horizonální poloze při 46°C po dobu 15 až 30 minut, nebo do úplného uschnutí. Dále se přidala kapka Breaker 2 do kažké jamky a takto se inkubovala na podložce v horihontální poloze při pokojové teplotě po dobu 7 minut. (Ihned po použití je nutné Breaker 2 uzavřít a vrátit zpět na mrazák). VIT reaktor byl naplněn destilovanou vodou po značku. Opatrně byl postaven na podložku kolmo a ihned byl rozebrán. Voda byla vylita. Poté byla přídána jedna kapka roztoku B2 do jamky a v horizonální poloze proběhla inkubace při 46 °C po dobu 10-15 minut nebo do kompletního vyschnutí bez VIT reaktoru. Je-li potřeba, může být reaktor s fixovaným vzorkem uchován při 4 °C po dobu až 4 týdnů. Kontakt Byl připraven promývací roztok Spotřeba na každou reakci je 30 ml roztoku D1, naředěného 10x s destilovanou vodou. V průběhu kontaktu byl promývací roztok předehřívaný na 46 °C v uzavřené lahvi v inkubátoru. Z části byla vložena komora do VIT-reaktoru (Obr. 4) Poté se přidalo asi 25 kapek roztoku C1 do komory VIT reaktoru a celá komora byla zasunuta do VIT- reaktoru. Na sklíčko do jamky označené „ – “ . byla přidána 1 kapka negativní kontroly Na sklíčko do jamky označené „VIT“ byla přídána 1 kapka B-Lbr (green). Na sklíčko označené „+“. byla přidána 1 kapka pozitivní kontroly G (red) Pozorně bylo sklíčko vloženo horiontálně do VIT – reaktoru (Obr.5), reaktor byl uzavřen a proběhla inkubace v horizontální poloze při 46°C po dobu 1,5 hodiny. Je nutné zamezit kontaktu jednotlivých vzorků mezi sebou.
Obr. 4 Vložení komory do reaktoru
Obr. 5 Vložení sklíčka do reaktoru
Promývání
Opatrně byl otevřen VIT reaktor a vyndalo se sklíčko. (Pozor na slití různých jamek.) Poté se jamky vyndaly z reaktoru a byly postaveny kolmo a reaktor byl naplněn promývacím roztokem ke značce. Reaktor byl uzavřen v kolmé poloze a otočen do horizontální polohy. Proběhla inkubace VIT reaktoru v této pozici 46 °C po dobu 15 minut. VIT reaktor byl otevřen a vyndalo se sklíčko. Promývací roztok byl odstraněn Podložní sklíčko bylo opláchnuto destilovanou vodou. Podložní sklíčko bylo inkubováno v temnu při 46 °C, 15 minut nebo do kompletního vyschnutí. Poté byly přidány dvě malé kapky Finisher na sklíčko a bylo přiloženo krycí sklíčko.
Mikroskopické hodnocení Jelikož se jedná o bakterie dlouhé 1-6µm, bylo nejvhodnější použít zvětšení 10x100 a imerzní olej.Podložní sklo rozdělené do tří polí dává tyto výsledky: pole pozitivní kontrola - všechny gram-positivní bakterie ze vzorku svítí zeleně pole negativní kontrola - bakterie nesvítí ani červeně ani zeleně Pivo kazící mléčné bakterie svítí červeně, pouze Lactobacillus brevis svítí červeně a zeleně. Mikroskopování bylo provedeno na mikroskopu Olympus BX51. Tento typ disponuje měnitelnými filtry. Také je u tohoto typu možnost snímání zorného pole pomocí kamery a pořídit tak digitální záznam na počítači.L.brevis dává obraz 3 možných zorných polí v jiném světle. Na prvním obrázku (Obr. 6) je Lactobacillus brevis v nativním preparátu. Zvětšení při mikroskopování bylo vždy použito 10 x 100 s použitím imerzního oleje. Dalším obrázkem (Obr.7) je L.brevis pod UV světlem a filtrem na zelenou fluorescenci. Ta je způsobena barvivem fluoresceinem. Posledním ze série snímků je obrázek s nastaveným červeným filtrem (Obr.8). Zde je fluorescence způsobena rhodaminem.
Obr. 6 Nativní preparát vzorku Lactobacillus brevis, zvětšení 10 x 100 imerze
Obr. 7 Preparát vzorku Lactobacillus brevis pod UV světlem se zeleným filtrem
Obr. 8 Preparát Lactobacillus brevis pod UV světlem s červeným filtrem
Literatura: Fiala, J., Vohánka, J., Dostálek, P.: Determination of Lactobacillaceae by PCR methods. Proceedings of the Congress - European Brewery Convention 30, 2005, 131/1-131/7.
3.
Rozbor mladiny
3.1
Stanovení pH a barvy mladiny
Princip: Hodnota pH má vliv při rmutování na enzymové procesy, především na štěpení vysokomolekulárních látek, dále na rozpustnost dusíkatých a hořkých látek při chmelovaru a na intenzitu přibarvené vyrážené mladiny. Mezi hodnotou pH mladiny a příslušného piva jsou určité závislosti. U mladin s vyššími hodnotami pH obtížněji koagulují při varu výšemolekulární dusíkaté látky a piva jsou náchylná k tvorbě koloidních zákalů. Běžné hodnoty pH kongresní sladiny světlého sladu jsou 5,6 až 6,0. Běžné hodnoty předku jsou 5,5 až 5,8. U sufigovaných várek může být 5,6 až 6,1. Vyrážená mladina má pH 5,2 až 5,6. Barva se stanovuje spektrofotometricky podle EBC ve zfiltrovaném vzorku při 430 nm Chemikálie a zařízení: pH-metr, spektrofotometr, zařízení pro membránovou filtraci, membránové filtry (0,45 µm), křemelina Pracovní postup: Vzorek se zfiltruje přes membránu (při hodnotě zákalu vyšší než 1 jednotka EBC s přídavkem 0,1 % křemeliny) a změří se absorbance při 430 nm. Barva vzorku se vypočte podle vztahu B = 25 . f . A430 Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 517 3.2
Stanovení extraktu mladiny
Princip: Extrakt mladiny tvoří rozpuštěné látky, které přešly do roztoku při rmutování a varním procesu ze surovin (sladu, ječmene, škrobnatých a neškrobnatých náhražek, chmele a chmelových preparátů. Ke stanovení extraktu se nějčastěji používají sacharometry, pyknometry nebo denzitometry. Při pyknometrickém stanovení se vyhledá ke zjištěné relativní hustotě příslušná hodnota hmotnostního zlomku extraktu, která se vyjadřuje v procentech na dvě desetinná místa. Relativní hustota vzorku mladiny se stanoví v Reischauerově pyknometru, u něhož byl přesně stanoven objem na destilovanou vodu (vodní hodnota) za předepsaných podmínek. Extrakt předku se pohybuje podle typu vyráběné mladiny v rozmezí 12 až 20 %. Relativní hustota vzorku mladiny se stanoví v Reischauerově pyknometru, u něhož byl přesně stanoven objem na destilovanou vodu (vodní hodnota) za předepsaných podmínek. Přístroje a zařízení: - Pyknometr podle Reischaiera s nálevkou a trubičkou na vyprazdňování - Sušárna - Ultratermostat (hrdlo pyknometru musí být nad značkou ponořeno ve vodě). Pracovní postup: Stanovení hmotnosti prázdného pyknometru: Z vyčištěného pyknometru se odsaje vzduch, pak se propláchne methanolem nebo acetonem a vysuší v sušárně. Po vysušení se dá do exsikátoru asi na 20 minut. Po vychladnutí se temperuje 15 minut ve vážním prostoru analytických vah. Pak se zváží s přesností ± 0,0001 g.
Stanovení vodní hodnoty pyknometru: Pyknometr se naplní destilovanou vodou prostou oxidu uhličitého (provařenou). Temperuje se 20 minut ve vodní lázni při teplotě 20 °C. Případné bublinky uvnitř pyknometru se odstraní poklepem rukou na pyknometr. Kapilární trubičkou se odsaje z hrdla kapalina asi l až 2 mm nad rysku. Zbytek se odsaje smotkem filtračního papíru přesně po rysku (zaostří se) a současně se filtračním smotkem vysuší hrdlo pyknometru. Opět se temperuje 5 minut. V případě změny objemu se pyknometr opět zaostří a to se opakuje tak dlouho, až nenastává změna. Pak se pyknometr dokonale osuší, nechá se stát 15 minut v prostoru analytické váhy a zváží se s přesností ± 0,0001 g. Výpočet vodní hodnoty: Vh = Pv - Pp kde Vh je vodní hodnota pyknometru (g),Pv - hmotnost pyknometru naplněného vodou (g), Pp - hmotnost prázdného pyknometru (g). Stanovení relativní hustoty mladiny: Pyknometr se známou vodní hodnotou se propláchne třikrát mladinou a pak se naplní pomocí nálevky tak, až přetéká (tím se odstraní bublinky tvořící se při plnění). Prudkým pohybem se odstříkne nadbytek tekutiny, ne více než 5 mm od konce hrdla. Pyknometr se vloží do ultratermostatu a temperuje se 20 minut při teplotě 20 °C ±0,1 °C. Zaostření pyknometru je stejné jako při stanovení vodní hodnoty. Po osušení se pyknometr zváží s přesností ± 0,0001 g. Výpočet a vyhodnocení: Hm = Ps-Pp/Vh kde
Hm je relativní hustota mladiny Ps - hmotnost pyknometru naplněného mladinou (g), Pp - hmotnost prázdného pyknometru (g), Vh - vodní hodnota pyknometru (g).
Výsledky relativní hustoty se udávají na pět desetinných míst extraktu při teplotě 20° C. Příslušné hmotnostní zlomky extraktu jsou uvedeny v tabulce v tab. 7.1 (Pivovarskosladařská analytika, s. 850) Zdánlivé relativní hustoty extraktu. Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 513 3.3
Stanovení celkových hořkých látek podle EBC
Princip: Hořké látky, především iso--hořké kyseliny, se extrahují z okyselené mladiny (piva) isooktanem a stanoví se spektrofotometricky Přístroje a zařízení: - Odstředivka, kyvety do odstředivky - Zábrusové 100 ml baňky - Třepačka o amplitudě 2 až 3 cm - Spektrofotometr Chemikálie a roztoky:
- Isooktan (2,2,4-trimethylpentan), spektroskopicky čistý (absorbance změřená v lem kyvetě proti destilované vodě při 275 nm musí být nižší než 0,005) -Roztok kyseliny chlorovodíkové, c'(HCl) = 6 mol.l"1 Pracovní postup: Zakalené vzorky mladiny (piva) se vyčeří odstředěním, k úpravě vzorku nelze použít filtrace. Z piva se před analýzou odstraní bez ztráty pěny oxid uhličitý. 10 ml vzorku se odpipetuje do centrifugační kyvety přidá se 0,5 ml roztoku HC1, c = 6 mol/l, dále 20 ml isooktanu a 2 až 3 skleněné kuličky. Centrifugační kyvety se uzavřou a třepou 15 minut při teplotě 20 °C na třepačce. Potom se obsah kyvet odstřeďuje 3 minuty při frekvenci otáčení 3000 za minutu. Upravený způsob: 100 ml čirého vzorku, 0,5 ml roztoku HC1 (c = 6 mol/l), 20 ml isooktanu se dá do 100 ml baňky a třepe intenzivně na třepačce 5 minut. Změří se absorbance isooktanového extraktu proti čistému isooktanu (téže kvality jako k extrakci vzorku) v 1 cm křemenných kyvetách při 275 nm. Výpočet a vyhodnocení: Jednotky hořkosti (JH) se vypočtou podle vztahu: JH = 50 . A (10 ml vzorku) JH = 25 . A (20 ml vzorku) A - absorbance isooktanového extraktu vzorku při 275 nm. Výsledky se uvádějí v celých číslech bez desetinných míst. Běžné hodnoty: Mladina 20 až 60 JH podle druhu vyráběné mladiny a dávky chmele, pivo 10 až 40 JH (jednotek hořkosti) podle typu piva, dávky chmele apod Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 675 4.
Zakvašení a hlavní kvašení
Procesu zakvašení předchází posouzení kvality kvasnic a stanoven zákvasné dávky v závislosti na koncentraci mladiny. Připravená mladina se zchladí na 7 °C a oddělí se jemné kaly (nejlépe po usazení stáhnout hadičkou) a zakvasí se pivovarskými kvasnicemi v množství 250 ml hustých kvasnic na 50 litrů mladiny tak, aby po zakvašení byl počet buněk (15 – 20). 106 buněk/ml (viz. dále Stanovení počtu buněk po zakvašení). Mladina se pak nechá kvasit ve skleněné nádobě při teplotě 7 °C. Teplota je regulována temperací místnosti – „spilky“. Po dvou dnech teplota mladiny vzroste intenzivním kvašením na 8 °C, po třech dnech klesá opět na 7 °C. Obecně platí zásada - kolik % extraktu má mladina, tolik dní se vede hlavní kvašení. Tuto dobu lze však ovlivnit zákvasnou dávkou, teplotou procesu a je závislá na parametrech mladiny a kvalitě kvasnic. Kvasící pivo je třeba kontrolovat. Když kvasnice sedají ke dnu a pivo se začíná čiřit a extrakt odpovídá 75 % dosažitelného prokvašení mladiny, suduje se do čistých sudů případně PET lahví. Sudy s mladým pivem se uloží do ležáckého sklepa, při teplotě 0,5 až 2 °C a nechají se po dobu 5 až 7 týdnů dokvášet - zrát. V průběhu dozrávání se kontroluje tlak v sudu a udržuje se přibližně na 1,5 kPa. 4.1
Stanovení pH mladiny, zdánlivého extraktu a počtu buněk ve vznosu
Hodnota pH výrazně ovlivňuje nejen chemické a biochemické procesy ve vodách, nýbrž i stabilitu a aktivitu enzymů, zejména při rmutování má vliv na štěpení vysokomolekulárních látek, na rozpustnost dusíkatých a hořkých látek při chmelovaru a na intenzitu přibarvení
vyrážené mladiny. U mladin s vyššími hodnotami pH obtížněji koagulují při varu výšemolekulární dusíkaté látky a piva jsou náchylná k tvorbě koloidních zákalů. Stanovení pH: Měření pH skleněnou elektrodou využívá vlastností skleněné membrány, na které se vytváří potenciál, jehož velikost závisí na koncentraci vodíkových iontů v roztoku. Potenciál skleněné elektrody se měří proti referentní kalomelové elektrodě Přístroje a zařízení: - pH-metr, skleněná a kalomelová elektroda Chemikálie a roztoky: - Tlumivé roztoky o pH 4,00, 7,00 a 9,00 Pracovní postup: V případě potřeby se elektroda i přístroj kalibrují s použitím tlumivého roztoku, jehož hodnota je blízká měřenému pH. Při měření pH vzorku se elektroda opláchne a ponoří do promíchaného vzorku a odečítá po ustálení. pH se má změřit ihned po odběru vzorku, není-li to možné, odebere se plná vzorkovnice a uloží se v chladnu. Výpočet a vyhodnocení: Výsledky se udávají s přesností na 0,1 až 0,05 pH podle typu použitého přístroje. Běžné hodnoty: Předek
5,5 – 5,8
Vyrážená mladina
5,2 – 5,6
Světlé pivo
4,1 – 4,8
Tmavé pivo
4,0 – 4,8
Dia pivo
4,0 – 4,8
PITO
4,4 - 5,4
Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 252, Stanovení zdánlivého extraktu: Princip: Extrakt mladiny tvoří rozpuštěné látky, které přešly do roztoku při rmutování a varním procesu ze surovin (sladu, ječmene, škrobnatých a neškrobnatých náhražek, chmele a chmelových preparátů. Ke stanovení extraktu se nějčastěji používají sacharometry, pyknometry nebo denzitometry. Při pyknometrickém stanovení se vyhledá ke zjištěné relativní hustotě příslušná hodnota hmotnostního zlomku extraktu, která se vyjadřuje v procentech na dvě desetinná místa. Relativní hustota vzorku mladiny se stanoví v Reischauerově pyknometru, u něhož byl přesně stanoven objem na destilovanou vodu (vodní hodnota) za předepsaných podmínek. Extrakt předku se pohybuje podle typu vyráběné mladiny v rozmezí 12 až 20 %.
Relativní hustota vzorku mladiny se stanoví v Reischauerově pyknometru, u něhož byl přesně stanoven objem na destilovanou vodu (vodní hodnota) za předepsaných podmínek. Přístroje a zařízení: - Pyknometr podle Reischaiera s nálevkou a trubičkou na vyprazdňování - Sušárna - Ultratermostat (hrdlo pyknometru musí být nad značkou ponořeno ve vodě). Pracovní postup: Stanovení hmotnosti prázdného pyknometru: Z vyčištěného pyknometru se odsaje vzduch, pak se propláchne methanolem nebo acetonem a vysuší v sušárně. Po vysušení se dá do exsikátoru asi na 20 minut. Po vychladnutí se temperuje 15 minut ve vážním prostoru analytických vah. Pak se zváží s přesností ± 0,0001 g. Stanovení vodní hodnoty pyknometru: Pyknometr se naplní destilovanou vodou prostou oxidu uhličitého (provařenou). Temperuje se 20 minut ve vodní lázni při teplotě 20 °C. Případné bublinky uvnitř pyknometru se odstraní poklepem rukou na pyknometr. Kapilární trubičkou se odsaje z hrdla kapalina asi l až 2 mm nad rysku. Zbytek se odsaje smotkem filtračního papíru přesně po rysku (zaostří se) a současně se filtračním smotkem vysuší hrdlo pyknometru. Opět se temperuje 5 minut. V případě změny objemu se pyknometr opět zaostří a to se opakuje tak dlouho, až nenastává změna. Pak se pyknometr dokonale osuší, nechá se stát 15 minut v prostoru analytické váhy a zváží se s přesností ± 0,0001 g. Výpočet vodní hodnoty: Vh = Pv - Pp kde Vh je vodní hodnota pyknometru (g),Pv - hmotnost pyknometru naplněného vodou (g), Pp - hmotnost prázdného pyknometru (g). Stanovení relativní hustoty mladiny: Pyknometr se známou vodní hodnotou se propláchne třikrát mladinou a pak se naplní pomocí nálevky tak, až přetéká (tím se odstraní bublinky tvořící se při plnění). Prudkým pohybem se odstříkne nadbytek tekutiny, ne více než 5 mm od konce hrdla. Pyknometr se vloží do ultratermostatu a temperuje se 20 minut při teplotě 20 °C ±0,1 °C. Zaostření pyknometru je stejné jako při stanovení vodní hodnoty. Po osušení se pyknometr zváží s přesností ± 0,0001 g. Výpočet a vyhodnocení: Hm = Ps-Pp/Vh kde
Hm je relativní hustota mladiny
Ps - hmotnost pyknometru naplněného mladinou (g), Pp - hmotnost prázdného pyknometru (g), Vh - vodní hodnota pyknometru (g). Výsledky relativní hustoty se udávají na pět desetinných míst extraktu při teplotě 20° C. Příslušné hmotnostní zlomky extraktu jsou uvedeny v tabulce v tab. 7.1 (Pivovarsko-sladařská analytika, s. 850) Zdánlivé relativní hustoty extraktu. Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 513
Stanovení počtu buněk ve vznosu: Běžně používaným postupem je přímé počítání v Bürkerově komůrce, další možnosti jsou nefelometrické měření intenzity zákalu nebo měření počtu buněk na průtokovém citometru Přímé počítání buněk v Bürkerově počítací komůrce. Materiál: Počítací komůrka, mikroskop. Postup práce: Do středu komůrky se pipetou nanese kapka vzorku, ihned přikryje krycím sklíčkem a komůrka se přenese na stolek mikroskopu. Po chvíli, až kvasinky klesnou na dno komůrky, se při vhodném zvětšení (500 až 800 krát) počítají buňky v políčkách komůrky. Buňky se počítají ve větším počtu políček (alespoň 20 polí), buňky ležící na hranách se počítají jen jednou. Mateřské a dceřinné buňky (i neoddělené) kvasinek se počítají jako dvě buňky, pučící buňka jako jedna. Z průměrného počtu buněk v jednom políčku se vypočte jejich koncentrace v l ml suspenze. Průměrný počet buněk v políčku se vydělí jeho objemem a přepočte na l ml. V praxi se přepočet zahrne do tzv. konstanty komůrky, kterou se násobí přímo průměrný obsah mikroorganismů v l políčku. Literatura: Šavel J.: Mikrobiologická kontrola v pivovarech, SNTL Praha 1980, s. 85 5. Dokvašování piva 5.1 Stanovení pH, zdánlivého extraktu a obsahu vicinálních diketonů v mladém pivu Stanovení pH Hodnota pH výrazně ovlivňuje nejen chemické a biochemické procesy ve vodách, nýbrž i stabilitu a aktivitu enzymů, zejména při rmutování má vliv na štěpení vysokomolekulárních látek, na rozpustnost dusíkatých a hořkých látek při chmelovaru a na intenzitu přibarvení vyrážené mladiny. U mladin s vyššími hodnotami pH obtížněji koagulují při varu výšemolekulární dusíkaté látky a piva jsou náchylná k tvorbě koloidních zákalů. Stanovení pH: Měření pH skleněnou elektrodou využívá vlastností skleněné membrány, na které se vytváří potenciál, jehož velikost závisí na koncentraci vodíkových iontů v roztoku. Potenciál skleněné elektrody se měří proti referentní kalomelové elektrodě Přístroje a zařízení: - pH-metr, skleněná a kalomelová elektroda Chemikálie a roztoky: - Tlumivé roztoky o pH 4,00, 7,00 a 9,00 Pracovní postup: V případě potřeby se elektroda i přístroj kalibrují s použitím tlumivého roztoku, jehož hodnota je blízká měřenému pH. Při měření pH vzorku se elektroda opláchne a ponoří do promíchaného vzorku a odečítá po ustálení. pH se má změřit ihned po odběru vzorku, není-li to možné, odebere se plná vzorkovnice a uloží se v chladnu. Výpočet a vyhodnocení: Výsledky se udávají s přesností na 0,1 až 0,05 pH podle typu použitého přístroje. Běžné hodnoty:
Předek
5,5 – 5,8
Vyrážená mladina
5,2 – 5,6
Světlé pivo
4,1 – 4,8
Tmavé pivo
4,0 – 4,8
Dia pivo
4,0 – 4,8
PITO
4,4 - 5,4
Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 252,
Stanovení zdánlivého extraktu: Princip: Extrakt mladiny tvoří rozpuštěné látky, které přešly do roztoku při rmutování a varním procesu ze surovin (sladu, ječmene, škrobnatých a neškrobnatých náhražek, chmele a chmelových preparátů. Ke stanovení extraktu se nějčastěji používají sacharometry, pyknometry nebo denzitometry. Při pyknometrickém stanovení se vyhledá ke zjištěné relativní hustotě příslušná hodnota hmotnostního zlomku extraktu, která se vyjadřuje v procentech na dvě desetinná místa. Relativní hustota vzorku mladiny se stanoví v Reischauerově pyknometru, u něhož byl přesně stanoven objem na destilovanou vodu (vodní hodnota) za předepsaných podmínek. Extrakt předku se pohybuje podle typu vyráběné mladiny v rozmezí 12 až 20 %. Relativní hustota vzorku mladiny se stanoví v Reischauerově pyknometru, u něhož byl přesně stanoven objem na destilovanou vodu (vodní hodnota) za předepsaných podmínek. Přístroje a zařízení: - Pyknometr podle Reischaiera s nálevkou a trubičkou na vyprazdňování - Sušárna - Ultratermostat (hrdlo pyknometru musí být nad značkou ponořeno ve vodě). Pracovní postup: Stanovení hmotnosti prázdného pyknometru: Z vyčištěného pyknometru se odsaje vzduch, pak se propláchne methanolem nebo acetonem a vysuší v sušárně. Po vysušení se dá do exsikátoru asi na 20 minut. Po vychladnutí se temperuje 15 minut ve vážním prostoru analytických vah. Pak se zváží s přesností ± 0,0001 g. Stanovení vodní hodnoty pyknometru: Pyknometr se naplní destilovanou vodou prostou oxidu uhličitého (provařenou). Temperuje se 20 minut ve vodní lázni při teplotě 20 °C. Případné bublinky uvnitř pyknometru se odstraní poklepem rukou na pyknometr. Kapilární trubičkou se odsaje z hrdla kapalina asi l až 2 mm nad rysku. Zbytek se odsaje smotkem filtračního papíru přesně po rysku (zaostří se) a současně se filtračním smotkem vysuší hrdlo pyknometru. Opět se temperuje 5 minut. V případě změny objemu se pyknometr opět zaostří a to se opakuje tak dlouho, až nenastává změna. Pak se pyknometr dokonale osuší, nechá se stát 15 minut v prostoru analytické váhy a zváží se s přesností ± 0,0001 g. Výpočet vodní hodnoty: Vh = Pv - Pp
kde Vh je vodní hodnota pyknometru (g),Pv - hmotnost pyknometru naplněného vodou (g), Pp - hmotnost prázdného pyknometru (g). Stanovení relativní hustoty mladiny: Pyknometr se známou vodní hodnotou se propláchne třikrát mladinou a pak se naplní pomocí nálevky tak, až přetéká (tím se odstraní bublinky tvořící se při plnění). Prudkým pohybem se odstříkne nadbytek tekutiny, ne více než 5 mm od konce hrdla. Pyknometr se vloží do ultratermostatu a temperuje se 20 minut při teplotě 20 °C ±0,1 °C. Zaostření pyknometru je stejné jako při stanovení vodní hodnoty. Po osušení se pyknometr zváží s přesností ± 0,0001 g. Výpočet a vyhodnocení: Hm = Ps-Pp/Vh kde
Hm je relativní hustota mladiny
Ps - hmotnost pyknometru naplněného mladinou (g), Pp - hmotnost prázdného pyknometru (g), Vh - vodní hodnota pyknometru (g). Výsledky relativní hustoty se udávají na pět desetinných míst extraktu při teplotě 20° C. Příslušné hmotnostní zlomky extraktu jsou uvedeny v tabulce v tab. 7.1 (Pivovarsko-sladařská analytika, s. 850) Zdánlivé relativní hustoty extraktu. Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 513
Stanovení obsahu vicinálních diketonů Tvorba vicinálních diketonů při kvašení mladiny souvisí se syntézou valinu a isoleucinu. Důležitými meziprodukty této syntézy jsou 2-acetolaktát a 2-acetohydroxybutyrát, z kterých oxidativní dekarboxylací vznikají diacetyl a 2,3-pentadion. Obě sloučeniny mají velký význam ze senzorického hlediska, protože při překročení prahové koncentrace vnímání vyvolávají nežádoucí změny aromátu piva. Stanovení vicinálních diketonů se provádí metodami spektrofotometrickými (EBC) a metodami plynové chromatografie a kapalinové Princip spektrofotometrické metody podle Esera Vicinální diketony se z analyzovaného piva oddestilují, destilát se smísí s roztokem ofenylendiaminu a množství vzniklých derivátů chinoxalinu se měří spektrofotometricky při vlnové délce 335 nm. Přístroje a zařízení: - Destilační přístroj pro stanovení dusíku podle Parnase - Spektrofotometr - Roztok kyseliny chlorovodíkové, c(HCl) = 4 mol.l-1. - Roztok o-fenylendiaminu v roztoku kyselině chlorovodíkové o koncentraci l % (w/v), který se připravuje každý den čerstvý a uchovává se v temnu. Pracovní postup:
Do kádinky o objemu 100 ml se odváží 100 g vychlazeného piva a kvantitativně se přeleje do destilační baňky Parnasova přístroje. Destilační přístroj je předem vyhřát. Potom se zahájí destilace takovou rychlostí, aby se nadestilovalo 25 ml za 2 minuty. Destilát se jímá do odměrné baňky o objemu 25 ml. Z destilátu se po promíchání odpipetuje 10 ml do dvou Erlenmeyerových baněk o objemu 50 ml, do jedné se přidá 0,5 ml roztoku o-fenylendiaminu a do druhé 2,5 ml roztoku kyseliny HC1. Obě baňky se uzavřou zábrusovou zátkou, promíchají se a uloží se na 30 minut do temna. Baňka bez o-fenylendiaminu se použije jako slepý pokus. Po uplynutí reakční doby se přidají do baňky s o-fenylendiaminem 2 ml roztoku HC1 a ihned se změří absorbance v 2 cm kyvetách při vlnové délce 335 nm proti slepému pokusu. Výpočet a vyhodnocení: Koncentrace vicinálních diketonů se vypočte vynásobením zjištěné absorbance součinitelem 1,2. Výsledky se uvádějí v mg/kg nebo mg/l po přepočtu na dvě desetinná místa. Při koncentracích vyšších než 0,25 mg/kg se již výrazně uplatňuje negativní vliv vicinálních diketonů na aroma a chuť piva. Poznámka: Spektrofotometrickou metodou nelze diferencovat obsah diacetylu od obsahu 2,3pentadionu. Literatura: Basařová G.: -sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 770 6.
Analytické hodnocení hotového piva
6.1
Stanovení zdánlivého a skutečného extraktu, obsahu alkoholu a původní koncentrace mladiny
Stupňovitost piva vyjádřená v procentech je procentický obsah extraktu původní mladiny ze které se pivo vyrobilo před zakvašením. Zdánlivý extrakt Ez piva je extrakt stanovený v tomto nápoji sacharometricky nebo pyknometricky po jeho zbavení oxidu uhličitého. Skutečný extrakt -Es je nezkvašený extrakt piva, který se stanoví sacharometricky nebo pyknometricky po oddestilování alkoholu a doplnění destilovanou vodou na původní hmotnost vzorku. Alkohol A se stanoví v destilátu pyknometricky. Mezi zdánlivým extraktem, skutečným extraktem, obsahem alkoholu v pivu a extraktem původní mladiny jsou určité vztahy, které zpracoval Balling do nauky o attenuaci a vymezil význam termínu prokvašení piva. Velký Ballingův vzorec pro výpočet extraktu původní mladiny (%):
p
(2,0665 * A ES ) *100 100 1,0665 * A
kde
A je alkohol (% hm) Es - skutečný extrakt
K orientačnímu výpočtu extraktu původní mladiny, ze které je pivo vyrobeno, se používá tzv. malý Ballingúv vzorec:
p kde
ES EZ ES q
q je attenuační koeficient uvedený v pivovarských tabulkách Ez - zdánlivý extrakt
ES – skutečný extrakt Ve starší literatuře se používá označení pro zdánlivý extrakt Ez = m, pro skutečný extrakt Es = n. Princip destilační metody: Z naváženého vzorku piva se vydestiluje alkohol, destilační zbytek po oddestilování alkoholu se použije ke stanovení skutečného extraktu a z obou získaných údajů se vypočte hmotnostní zlomek konvenčního extraktu Přístroje a zařízení: - Pyknometry typu Reischauer, 50 ml - Temperovací lázeň - Třepačka - Destilační přístroj - Skládané filtry Pracovní postup: Vzorek piva (300 až 500 ml) se vytemperuje v lázni na teplotu 20 °C a zbaví se oxidu uhličitého. Potom se pivo přefiltruje přes suchý skládaný filtr, aby se zbavilo pěny. Prvních asi 50 ml filtrátu se vyleje. Do vytárované (zvážené) destilační baňky o objemu 300 ml se naváží 100 g piva (nejvýše s chybou 0,1 g) zbaveného oxidu uhličitého a přidá se 50 ml destilované vody. Do zvážené předlohy se dá předem 5 až 10 ml destilované vody. Destiluje se zprvu za slabého zahřívání (aby se pěna nedostala do přestupníku) a po uvedení do rovnoměrného varu se zahřívání zesílí. Teplota vytékající vody z chladiče nesmí být vyšší než 25 °C. Destilace se ukončí po nadestilování 85 až 90 ml (při rovnoměrném varu za 30 až 60 minut). Potom se konec chladiče zasunutého v předloze opláchne malým množstvím destilované vody do předlohy a její obsah se dováží vodou na 100,0 g. Relativní hustota destilátu se stanoví pyknometricky. Zbytek v destilační baňce, který zůstal po oddestilování alkoholu, se ochladí na teplotu 20 °C a dováží se destilovanou vodou na původní hmotnost 100,0 g. Po promíchání se stanoví relativní hustota roztoku pyknometricky. Klky vzniklé při destilaci alkoholu se neodstraňují. Jestliže se překročí původní hmotnost 100,0 g při dovažování destilátu nebo zbytku po destilaci, musí se vypočítat z příslušných hodnot korekční součinitel. Pro zdánlivý extrakt, který představuje extrakt piva po odstranění oxidu uhličitého, nebyla zatím v upravené normě zavedena nová terminologie. U vytřepaného vzorku piva se stanoví pyknometricky jeho relativní hustota a v tabulce se vyhledá odpovídající hodnota hmotnostního zlomku extraktu. Relativní hustota destilátu, zbytku po destilaci a zdánlivého extraktu se vypočte podle vztahu:
d 20/ 20
m3 m1 m2 m1
kde d20/20 je relativní hustota, m1 - hmotnost prázdného pyknometru (g), m2 - hmotnost pyknometru s vodou (g),
m3 - hmotnost pyknometru s destilátem, zbytkem po destilaci nebo s vytřepaným pivem (g). Ke zjištěné hodnotě relativní hustoty destilátu, zbytku po destilaci nebo vytřepaného piva se vyhledá v příslušných tabulkách údaj odpovídající hmotnostnímu zlomku alkoholu (WA) hmotnostnímu zlomku skutečného extraktu (Wn ) nebo zdánlivému extraktu Ez(m). Výsledky obou hmotnostních zlomků (WA,Wn ) a zdánlivého extraktu (Ez) se uvádějí v procentech na dvě desetinná místa. Konečný výsledek je aritmetickým průměrem výsledků dvou paralelních stanovení. Rozdíl mezi dvěma stanoveními nemá být větší než 0,06 % pro WA, pro Wn 0,03 % a pro zdánlivý extrakt 0,02 %. Hmotnostní zlomek konvenčního extraktu (WP), dříve původní koncentrace mladiny, se vypočte podle Ballingova vzorce:
WP
(2,0665 * WA Wn ) *100 100 1,0665 * WA
kde WP je hmotnostní zlomek konvenčního extraktu (%), WA - hmotnostní zlomek alkoholu (%), WN - hmotnostní zlomek skutečného extraktu (%), 2,0665 a 1,0665 - koncenční konstanty podle Ballinga. Výsledky hmotnostního zlomku konvenčního extraktu se uvádějí v procentech na jedno desetinné místo po zaokrouhlení. Rozdíl mezi dvěma stanoveními nemá být větší než 0,03 % (vztahuje se k zaokrouhleným výsledkům). Zdánlivé a skutečné prokvašení se vypočte podle vztahu;
PZ
WP EZ *100 WP
PS
WP Wn *100 WP Wn
kde PZ, je zdánlivé prokvašení (%), PS - skutečné prokvašení (%), WP - hmotnostní zlomek konvenčního extraktu (%), Wn - hmotnostní zlomek skutečného extraktu (%), EZ - zdánlivý extrakt piva (%). Výsledky zdánlivého a skutečného prokvašení se uvádějí v procentech na jedno desetinné místo.
6.2
Stanovení sacharidů metodou HPLC
Princip: Stanovení sacharidů metodou HPLC-RIDK. Mono- a oligosacharidy obsažené ve sladině, mladině, případně hotovém pivu se dělí na ionexové koloně v Ag+ cyklu a detekují
refraktometricky. Přístroje a zařízení: kapalinový chromatograf Agilent 1100 s refraktometrickým detektorem kolona Phenomenex Rezex RSO Oligosacharides 200x10 mm s předkolonkou mikrofiltr s acetátcelulosovými filtry (0,45m) třepačka Chromatografické podmínky: mobilní fáze: odplyněná demineralizovaná voda teplota kolony: 80C průtok mob. fáze: 0,4 ml/min Chemikálie: glukóza, fruktóza a maltóza (vše p.a.) Software: Agilent Chemstation Pracovní postup: Pro kalibraci je třeba připravit 3 kalibrační roztoky maltózy, glukózy a fruktózy v koncentracích 1, 2 a 5 g/litr. Vzorek se přefiltruje za pomocí mikrofiltru, v případě prokvašené mladiny a hotového piva je třeba vzorek též předem vytřepat po dobu 15 min. Následně se vzorek převede do vialky v autosampleru, další postup je již automatizován a řízen softwarově. Sacharidy se na koloně dělí podle své molekulové hmotnosti a z kolony jsou vymývány sestupně podle počtu glukózových jednotek, manosacharidy pak v pořadí glukóza,fruktóza. Výsledky jsou vyhodnoceny pomocí kalibračních křivek, přičemž v případě maltoriózy a vyšších sacharidů se používá kalibrační křivka maltózy. Výsledky se obvykle vyjadřují v g/l a pohybují se v rozmezí 1-5 g/l u piv a 1-80 g/l u mladin a sladin (záleží na původní koncentraci extraktu a použité technologii). Literatura: Ondroušek, S., Dostálek, P.: Vliv technologie na vznik a využití sacharidů při výrobě mladiny a piva, Kvasny Prum. 33(11), 1987, 322-5. 6.3
Stanovení celkových hořkých látek podle EBC
Princip: Hořké látky, především iso--hořké kyseliny, se extrahují z okyselené mladiny (piva) isooktanem a stanoví se spektrofotometricky Přístroje a zařízení: - Odstředivka, kyvety do odstředivky - Zábrusové 100 ml baňky - Třepačka o amplitudě 2 až 3 cm - Spektrofotometr Chemikálie a roztoky: - Isooktan (2,2,4-trimethylpentan), spektroskopicky čistý (absorbance změřená v lem kyvetě proti destilované vodě při 275 nm musí být nižší než 0,005)
-Roztok kyseliny chlorovodíkové, c'(HCl) = 6 mol.l"1 Pracovní postup: Zakalené vzorky mladiny (piva) se vyčeří odstředěním, k úpravě vzorku nelze použít filtrace. Z piva se před analýzou odstraní bez ztráty pěny oxid uhličitý. 10 ml vzorku se odpipetuje do centrifugační kyvety přidá se 0,5 ml roztoku HC1, c = 6 mol/l, dále 20 ml isooktanu a 2 až 3 skleněné kuličky. Centrifugační kyvety se uzavřou a třepou 15 minut při teplotě 20 °C na třepačce. Potom se obsah kyvet odstřeďuje 3 minuty při frekvenci otáčení 3000 za minutu. Upravený způsob: 100 ml čirého vzorku, 0,5 ml roztoku HC1 (c = 6 mol/l), 20 ml isooktanu se dá do 100 ml baňky a třepe intenzivně na třepačce 5 minut. Změří se absorbance isooktanového extraktu proti čistému isooktanu (téže kvality jako k extrakci vzorku) v 1 cm křemenných kyvetách při 275 nm. Výpočet a vyhodnocení: Jednotky hořkosti (JH) se vypočtou podle vztahu: JH = 50 . A (10 ml vzorku) JH = 25 . A (20 ml vzorku) A - absorbance isooktanového extraktu vzorku při 275 nm. Výsledky se uvádějí v celých číslech bez desetinných míst. Běžné hodnoty: Mladina 20 až 60 JH podle druhu vyráběné mladiny a dávky chmele, pivo 10 až 40 JH (jednotek hořkosti) podle typu piva, dávky chmele apod Literatura: Basařová G.: Pivovarsko-sladařská analytika, Merkanta, s.r.o., 1993, s. 675 6.4
Stanovení obsahu α- a β- hořkých kyselin metodou HPLC
Upravená metodika podle Analytica-EBC, Method 7.7 Princip: Chmel, chmelové granule jsou extrahovány směsí ether/methanol a kyselinou chlorovodíkovou. a -kyseliny chmele rozpuštěné v etherové fázi jsou rozděleny pomocí chromatografie na reverzní fázi se spektrofotometrickou detekcí při 314 nm. Chemikálie: Diethylether, prostý peroxidů, p.a. Methanol, p.a. Methanol pro HPLC super gradient Kyselina fosforečná, 85%, = 1,71 Kyselina chlorovodíková, c(HCl) = 0,1 mol/l Eluční činidlo A: methanol/millipore voda/fosforečná kyselina v poměru 85 : 17 : 0,25 (v/v/v) cca 250 ml na 1 vzorek chmele (6 nástřiků) a standard (4 nástřiky) Eluční činidlo B: millipore voda (používá se pouze se Shutdown metodou!!!) Standardní chmelový extrakt se známým množstvím a -kyselin (Labor Veritas, Zürich, Switzerland), používá se jako externí standard, skladování při -18 ˚C v mrazáku v pivovarské laboratoři, stabilita 1 rok Přístroje a materiál:
Váhy AND Třepačka (oranžová) Ultrazvuková lázeň (hladina vody po naplnění cca 3 cm pod okraj) Skleněná 250 ml láhev se závitem, gumovým tešněním a hliníkovým víčkem (pozn.: po práci víčko a těsnění ponořte do teplé vody s Jarem) Odměrné baňky 50 ml a 100 ml Pipeta Biohit na 2x 5 ml Pipeta na ether Brand handy step s 50 ml zásobníkem (krok 5) Odměrný válec na těkavé kapaliny 100 ml HPLC Waters W2690 s PDA detektorem W2996 HPLC kolona Waters Nova-Pak 250 x 4.6 mm, C18 s guard kolonkou nebo Phenomenex Gemini 250 x 2.0 mm, C18 s guard kolonkou. Použití této HPLC-MS kolony diskutovat s Ing. Dostálkem (je u ní potřeba dávat větší pozor na čistotu rozpouštědel, nastřikovaná množství a tlaky). Bomba s N2 na převrstvení
Pracovní postup: Příprava externího standardu Navažte 0,5 g standardního extraktu (mcs) do 50 ml kádinky (vraťte standard do mrazáku) a přidejte 30 ml methanolu a rozpusťte pomocí ultrazvuku. Převeďte roztok extraktu do 100 ml odměrné baňky a doplňte po rysku methanolem. Uzavřete baňku a vzniklý roztok opatrně promíchejte. Z tohoto roztoku odpipetujte 10 ml do 50 ml odměrné baňky a doplňte po rysku methanolem a promíchejte. Případný zákal odstraňte filtrací přes membránu 0,45 m (Millipore). Roztok je připraven jako vzorek pro stanovení pomocí HPLC a metody externího standardu. Skladujte tento roztok v lednici, převrstvěte jej dusíkem a chraňte jej před světlem alobalem. Roztok je stabilní 24 hodin. Odpipetujte cca 1 ml do vialky s víčkem a těsním (Waters) a vložte ji do karuselu HPLC autosampleru a pozici si zazanamenejte, budete ji potřebovat při vyplňování tabulky pro nástřik vzorků . Pozn.: Nastřikujte vzorek standardu nejméně 2krát před a 2krát po reálných vzorcích, stačí opakovaný nástřik z jedné vialky. Příprava vzorků chmele Rozmělněte vzorek chmele či chmelových granulí v laboratorním mlýnku. Doba mletí 2 minuty. Každý vzorek chmele připravte 3krát k nástřiku (3x extra navážka a extrakce). Navažte přesně přibližně 10 g jemně namletého chmele (ms) do 250 ml skleněné láhve se závitem. Přidejte 20 ml methanolu a 100 ml diethyletheru. Zavřete opatrně láhev víčkem s gumovým těsněním a intenzivně třepejte 30 minut na třepačce umístěné v digestoři. Poté opatrně otevřete láhev (pracujte v digestoři), přidejte 40 ml 0,1 mol/l HCl. Opatrně uzavřete láhev a třepejte nejméně 10 minut při optimálně intenzitě (tak aby extrakční činidlo nesmáčelo gumové těsnění). Nechte láhev stát 10 minut aby se oddělili obě fáze. Opatrně odpipetujte 5,0 ml etherové fáze pipetou Brand handy step do 50 ml odměrné baňky a doplňte po rysku methanolem. Opatrně promíchejte. Odpipetujte cca 1 ml do vialkek s víčky a těsněním (Waters) a vložte je do karuselu HPLC autosampleru, pozici si zaznamenejte. Případný zákal zfiltrujte pomocí 0,45 m či 0,22 m mikrofiltru a stříkačky. Chromatografické stanovení
V okně nastavte vlevo metodu „EBC_7_7“ a vpravo chromatografický systém „Aliance PDA“ pokud budete analyzovat. Pozn.: Pokud jen vyhodnocujete výledky tak nastavte „No system“. Překontrolujte správnost nastavení metody. Klikněte na záložku „View Method“ a nahoře v lište „File“, pak „Open“ … method set EBC77_1. Pak přepněte v záložce „View Method“ na „Instrument“ a klikněte na tlačítko „W2690/5“ a zkontrolujte průtok mobilní fáze v záložce „Flow“ (Isocratic, Total Flow 0.550, %A 100.0, Low Limit 50.0 a High Limit 3500.0). Zároveň překontrolujte, že eluční roztok je v láhvi A, a že je v něm zcela ponořena hadička s fritou, popsaná jako „Solvent A“!!! Poté klikněte na tlačítko „W2996“ a překontrolujte nastavení PDA detektoru (2D Data Collection, Method channel lambda 314.0, Method channel bandwith 1.2, Sampling Rate 1.0 a zaškrtnout „Digital Filter“) Před vlastní analýzou je potřeba „zavodnit“cestu A pomocí stříkačky a programu. Eluční činidlo přefiltrujte přes 0,45 m acetát-celulosovou membránu Sartorius a nalijte do čistě vymyté 1 l láhve, popište složením mobilky, jménem a datem. Láhev dobře utěsněte parafínovou folií. Po najetí základní obrazovky na Allianci stiskněte „Menu/Status“ poté „Direct Functions“ a dále na „Dry Prime“, otevřete cestu A tlačítkem „Open A“ , povolte zavodňovací šroub (otevřít spodní dvířka a povolit doleva šroub mezi pumpami) a ručně zavodněte cestu stříkačkou (stačí cca 10 ml), poté utáhněte šroub a stiskněte tlačítko „Continue“. Vyčkejte na promytí cest. Následně stiskněte „Direct Functions“, zkontrolujte máte-li v láhvi za přístrojem (vedou k ní dvě hadičky „zelená“ a „Seal wash in“) dostatek oplachové kapaliny (30-50% methanol) a poté stiskněte tlačítko „Wet Prime“. Vyčkejte na promytí součástí přístroje. „Equilibrujte“ kolonu elučním činidlem A nejméně 30 min před nastříknutím vzorků. Přepněte se do záložky „Run Samples“, pokud není oranžové tlačítko „View Acquisition“, tak na něj klikněte. Stiskněte tlačítko „Press to equilibrate system/monitor baseline“, a zadejte Instrument Method „ebc77“ a stiskněte tlačítko „Equilibrate/Monitor“. Přepnutím tlačítka „Control Panel“ v záložce „Run Samples“ můžete sledovat základní linii = baseline. Pokud je rovná baseline, tak můžete nastřikovat, viz postup níže. Každý vzorek nejméně 2krát. Tj. z jednoho vzorku chmele nejméně 6 nástřiků + 4 nástřiky na kalibraci. Přepněte se do záložky „Run Samples“ poté máte 2 možnosti: 3. Vypište v záložce „Samples“ tyto parametry „Vial“=číslo vialky, „SampleName“ = popis vzorku, „Inj Vol“ = nastřikovaný objem (Waters Nova-Pak 10 l, Phenomenex Gemini 2,5 l), „# of Injs“ = počet nástřiků, „Function“ = vyberte funkci (nejčastěji se používá Inject Samples, Inject Standard, clear calibration a equlibrate), „Method Set/Report Method“ = vyberte EBC77_1, „Run Time(Minutes)“ = doba analýzy (40 pro kolonu Phenomenex), ostatní parametry nepřenastavujte. Doporučuji mít v prvním řádku jen „Function“ vybrat Clear Calibration a „Method Set/Report Method“ vybrat EBC77_1. 4. Použít některé z předchozích stanovení a přepsat je podle aktuálních pozic v karuselu. Klikněte na „File“ v horní liště, poté „New Sample Set“ a poté „Using Sample Set Method“, vybrat např. ebc77_4 a stisknout tlačítko „Open“.Poté přepište podle aktuálního stavu. Po nastavení tabulky stiskněte tlačítko „Press to run the current sample set method“ (zkumavky s zelenou šipkou) v panelu „View Acquisition“. V následujícím okně vyplňte „Name for this sample set“ = napište název celého setu vzorků, „Run Mode“ = vyplňte Run and Process, „Shutdown Method“ = vyplňte shutdown_ebc, ostatní nevyplňujte a poté stiskněte tlačítko „Run“. Naměřená data jsou v záložce „Browse
Project“ a poté v záložce „Results“. Kliknutím na příslušný nástřik se zobrazí jeho chromatogram a po kliknutí na „View Acquisition“ i tabulka s výsledky. Pozn.: Shutdown metoda používá cestu B, tzn. je nutné tuto cestu promýt a připravit stejně jako v případě cesty A. Používejte jen nově připravenou čistou millipore vodu. Průtok mobilní fáze 0,05 ml/min, Low Limit (psi) je tentokrát 0. Vyhřívání kolony není u této metody nutné, pracuje se při laboratorní teplotě. Pro zvýšení přesnosti vyhřejte kolonu na 20 C. Po zapnutí vyberte funkci „MAN.“, vyťukejte 20 a stiskněte „ENTER“. Po práci vyhřívání vypněte (kolíbka vzadu). Výsledky lze získat buď přímo pomocí software Empower nebo jednoduchým výpočtem z vytištěných chromatogramů. Výpočty:
Ci
DF ms Cic Ai ms Aic
Ci = koncentrace složky i (např. kohumulonu) ve vzorku vyjádřená jako % hm. DF = ředící faktor, 1 pro extrakty, 2 pro chmel a granule mcs = navážka kalibračního extraktu v g Cic = koncentrace složky i v kalibračním standardu vyjádřená jako % hm. Ai = plocha píku složky i v analyzovaném vzorku (průměr ze tří ploch) ms = navážka vzorku Aic = plocha píku složky i v analyzovaném standardu (průměr ze 4 ploch) Obsah -kyselin je součtem % hm. kohumulonu a a dvojpíku humulonu a adhumulonu. Obsah -kyselin je součtem % hm. kolupulonu a dvojpíku lupulonu a adlupulonu. C = Ccoh + Cn+adh C = Ccol + Cn+adl Výsledky se vyjadřují jako % hm. na jedno desetinné místo. Literatura: Analytica-EBC, Method 7.7, European Brewery Convention, Zoeterwoude 2005.
6.5
Stanovení volných aminokyselin piva metodou
Princip stanovení: Aminokyseliny jsou před vlastním stanovením formou předkolonové nebo postkolonové derivatizace převedeny na vhodný derivát, dostatečně stabilní a neintegrující s nosičem. Metoda AccQTag využívá AccQTag fluorescenčního činidla, převádějícího primární a sekundární aminokyseliny na stabilní fluorescenční deriváty. Následuje detekce fluorescenčním nebo PDA detektorem. Chemikálie a zařízení: Waters Alliance HPLC systém, se separačním modulem 2695. Součástí systému jsou dvě nezávisle řízené pumpy v sériovém uspořádání se zpětnými ventily k izokratickým a gradientovým operacím, autosampler, dávkovací injekční stříkačky o objemu 25, 250 a 2 500
l, dávkovací smyčky, disketová jednotka. Režim externího řízení chromatografickým programem Empower. Pracovní režim: Derivatizační činidlo: Standard: Kolona: Rozměr kolony: Temperace kolony: Detektor: Eluenty:
Gradient:
Nástřik na kolonu: Vnitřní standard: Doba analýzy: Stabilizace kolony: Způsob vyhodnocení:
je zajištěn
Waters AccQ•Fluor Reagenční činidlo (6-aminoquinolyl-Ahydroxysuccinimidyl karbamát) Waters Amino Acid Hydrolysate Standard Waters AccQ•Tag Amino Acid kolona Nova-Pak C18, 4 μm 150 x 3,9 mm 37 °C Waters Multi 2475 fluorescenční detektor s excitací 250 mm, emisí při 395 nm A – borátový pufr (vodný roztok) B – acetonitril (čistota HPLC grade) C – Milli-Q voda (18 MΩ) Čas (min) počáteční 0,5 18 19 29,5 33 36 51
Průtok (ml.min-1) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
%A 100 99 95 91 83 0 100 0
%B 0 1 5 9 17 60 0 60
%C 0 0 0 0 0 40 0 40
5 μl vzorku (koncentrace aminokyselin 5 – 200 pmolů) kyselina α-aminomáselná 36 min 9 min na začátku, 15 min na nový vzorek program Empower
Spektrum stanovitelných základních aminokyselin: kyselina asparagová, serin, kyselina glutamová, glycin, histidin, arginin, threonin, alanin, prolin, cystein, tyrosin, valin, methionin, lysin, isoleucin, leucin, phenylalanin. Pracovní postup zahrnuje deproteinaci vzorku (metanol, vymražení), odpaření, zpětné naředění roztokem HCl o koncentraci 0,1 mol.l-1, přídavek vnitřního standardu, derivatizaci a převedení vzorku do vialek autosampleru. Vyhodnocení: Chromatografický program Empower metodou vnitřního standardu umožňuje stanovení aminokyselin v koncentracích pikomoly. Literatura:
Instruction Manual Waters AccQ·Tag Chemistry Package, Waters Corporation, USA, 1994 Čížková H., Hofta P., Kolouchová I., Dostálek P.: Kvasny Prum. 51, 2005, s. 47
7.
Senzorické hodnocení hotového piva
Senzorické hodnocení při kontrole jakosti Kvalitu poživatin můžeme definovat jako shodu výrobku se standardy nebo s požadavky spotřebitele. V souladu s touto definicí lze ke kontrole jakosti přistupovat ze dvou hledisek: a) hledisko legislativní, podle kterého je jakost stupeň shody vlastností výrobku s požadavky normy jakosti nebo s vlastnostmi úředně schváleného referenčního vzorku standardu jakosti); b) hledisko spotřebitelské (tržní hodnota), podle kterého je jakost stupeň, v kterém výrobek splňuje požadavky spotřebitele. Obojí přístup je velmi důležitý. Legislativní přístup chrání spotřebitele tím, že zajišťuje prostřednictvím standardu určité minimální požadavky jakosti. Jsou zpravidla formulovány tak, aby zajistily zdravotní nezávadnost, minimální výživovou hodnotu (např. obsah vitaminů) a přijatelnou senzorickou jakost. těžiště kontroly je v činnosti státních a jiných správních kontrolních orgánů. Požadavky spotřebitelů na jakost se uplatňují hlavně tehdy, jestliže je trh nasycen potravinářskými výrobky a existuje výběr daný jistou soutěží mezi výrobci. Poměry u nás se postupně přizpůsobují této situace. Výrobce má pak zájem na získání spotřebitele a těžiště činnosti při kontrole jakosti je potom v laboratořích výrobce. Různé faktory, které určují oblibu a zájem spotřebitele, zahrnují i historické a psychosociální motivy, které ovlivňují jeho preference. Spotřebitelé nepožadují nutně nejvyšší jakost za každou cenu. Většinou jsou jejich nákupní možnosti omezeny cenou výrobku a požadují proto jen jakost přiměřenou ceně a záruku, že výrobek bude stále plnit jejich očekávání (tedy, že jeho vlastnosti nebudou znatelně kolísat). Zájmem výrobce bude, aby se jakost jeho výrobku udržovala za daných podmínek (hlavně cenových) na optimální úrovni. Přístup k otázce kontroly jakosti plyne z přístupu k otázce jakosti, jak bylo definováno výše: Cílem kontroly jakosti z hlediska legislativního je rozhodnutí, zda výrobek odpovídá normě či jakosti referenčního standardu nebo jim neodpovídá. Cílem kontroly z hlediska spotřebitelského je zjištění, v jakém stupni výrobek vyhovuje požadavkům spotřebitele. Pro prvý typ kontroly jakosti má základní důležitost velmi přesně a jednoznačné vymezení hranice, pod kterou nesmí jakost klesnout. Výsledkem kontroly je závěr, že buď výrobek standardu vyhovuje, nebo že výrobek je nestandardní. Při druhém typu kontroly jakosti je úkolem správně a citlivě definovat stupeň jakosti a výsledkem kontroly bude zjištění určité hodnoty - stupně jakosti. Proto každý přístup vyžaduje
jiný typ kontrolních metod, jinak zaškolené odborníky a jiné metody statistického zpracování výsledků. U obou přístupů ke kontrole je velmi důležitou složkou kontrola senzorické jakosti. Při určení nestandardnosti výrobků je pochopitelně nejvýznamnější hygienická jakost a složení výrobků. U senzorické jakosti zde bude důležité, aby výrobek neměl nějakou tak závažnou chybu, že by znemožnila jeho požívání. Musí být také zjištěno, zda má výrobek alespoň v minimální míře vlastnosti charakteristické pro danou poživatinu. Při spotřebitelském přístupu ke kontrole jakosti má senzorická jakost dokonce prvořadý význam. Spotřebitel očekává, že hygienická jakost je splněna a zkontrolována srovnáním s normou, takže klade hlavní důraz na jemné rozdíly v senzorické jakosti a na zjištění malých rozdílů od organoleptických vlastností, které u výrobku očekává. Metody rozlišovací Úkolem metod rozlišovacích (rozdílových, diskriminačních) je zjištění, zda mezi vzorky existuje nebo neexistuje rozdíl v organoleptických vlastnostech nebo senzorické jakosti. Nejčastěji se srovnávají dva vzorky. Pro rozdílové zkoušky potřebujeme podle našich zkušeností nejméně 10, lépe 20 až 30 hodnotitelů. ISO doporučuje mírně odlišné hodnoty; počet bude záležet na zjišťovaných rozdílech a na zkušenostech hodnotitelů. Rozdílové zkoušky jednostimulové a dvoustimulové mají specifický charakter. Rozdílové zkoušky se mohou také použít ke stanovení velikosti rozdílu na základě Thurstoneova zákona srovnávacího posuzování, který praví, že stupeň rozlišení je tím lepší, čím je rozdíl vlastností větší; avšak vztah není jednoduchý a výsledky různých mechanik se nedají srovnávat. Výběr vhodné rozdílové metody záleží na úkolu a kvalitě hodnotitelů. Párová zkouška Nejstarší a stále hojně (pro svou jednoduchost) používanou rozdílovou metodou je zkouška párová. Při této zkoušce hodnotitel obdrží najednou dva vzorky (A a B) v nahodilém pořadí. Vzorky ovšem musejí být předloženy ve stejných nádobách (lišících se jen kódem), ve stejném množství a musejí mít stejnou teplotu. Hodnotitel vzorky v předloženém pořadí ochutná (degustaci obou vzorků smí libovolně opakovat) a rozhodne, zda rozpoznal nějaký rozdíl nebo nerozpoznal. Výsledek se zapíše do protokolového formuláře. Někdy se úkol kombinuje: při zjištění rozdílu se dává hodnotiteli ještě úkol, aby určil směr rozdílu (která chuť je silnější apod.), což nepovažuji za správné (viz dále). Určitou nevýhodou rozdílové párové zkoušky je, že nemůžeme a priori vytvořit nulovou hypotézu. Při preferenční zkoušce se ptáme, který ze dvou vzorků je lepší; vybíráme tedy ze dvou vzorků, takže pravděpodobnost náhodného určení správné odpovědi je P = 50 %, ovšem velmi záleží na tom, jak se položí otázka. Když se za otázkou, zda je rozdíl, položí ještě úkol, aby v případě zjištěného rozdílu se hodnotitel vyjádřil k velikosti tohoto rozdílu, pak ihned pravděpodobnost zjištění rozdílu (byly podány identické vzorky) stoupla na P = 65 %. U párové rozdílové zkoušky je tedy pravděpodobnost 50 %, že se ke správnému výsledku dojde náhodou, protože jsou dvě stejně pravděpodobné možnosti odpovědi (empiricky).
Zkouška je jednosměrná. K dosažení průkazných závěrů je proto obvykle nutný větší počet odpovědí (n = 20 až 60, i více; v praxi se často musíme spokojit i s nižším počtem odpovědí). Průkaznost u rozdílových zkoušek volíme obyčejně na hladině pravděpodobnosti P = 99 %. Protože je často obtížné zajistit dostatečný počet osob k hodnocení, dáváme každému hodnotiteli několik párů vzorků k posouzení (v nahodilém pořadí vzorků). Výsledky se statisticky vyhodnotí nejčastěji podle tabulek; v tab. 1 je uveden minimální počet odpovědí nutný pro zamítnutí nulové hypotézy, která zní, že neexistuje rozdíl mezi vzorky. Jestliže je z daného počtu odpovědí počet kladných odpovědí stejný nebo větší než tabelární hodnota, předpokládáme, že rozdíl byl prokázán. Např. bylo 18 hodnotitelům předloženo po dvou párech piva ze dvou závodů téhož podniku a úkolem bylo zjistit s pravděpodobností P = 99 %, zda jsou nerozeznatelné. Z celkového počtu 36 odpovědí 21 nezjistilo rozdíl, v 15 případech byla odpověď, že rozdíl existuje. Podle tab. 1 je hraniční hodnota n = 27, takže byla potvrzena nulová hypotéza, že vzorky jsou shodné a není mezi nimi znatelný rozdíl. Jak je z popisu patrno, je párová zkouška velice jednoduchá, neklade velké nároky na paměť a je tedy vhodná pro všechny typy hodnotitelů nezávisle na stupni zaškolení; je použitelná i pro spotřebitelské zkoušky. Nevýhodou je nutnost značného množství vzorku i hodnotitelského času. Tabulka 1 Vyhodnocení průkaznosti u párové rozdílové zkoušky a zkoušky duo-trio POČET PODANÝCH PÁRŮ 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
MINIMÁLNÍ POČET SHODNÝCH ODPOVĚDÍ NEZBYTNÝCH PRO PRŮKAZ PLATNOSTI ROZDÍLU NA HLADINĚ PRAVDĚPODOBNOSTI P = 95 % P = 99 % P = 99,9 % 7 8 8 8 9 9 10 10 11 11 10 11 12 11 12 13 12 13 14 12 13 14 13 14 15 13 15 16 14 15 17 15 16 17 15 17 18 16 17 19 17 18 19 17 19 20 18 19 21 18 20 21
26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 60 70 80 90 100
19 20 20 21 21 22 23 23 24 24 25 25 26 27 27 28 28 29 29 30 31 31 32 32 33 39 44 50 55 61
20 21 22 22 23 24 24 25 25 26 27 27 28 28 29 30 30 31 31 32 33 33 34 34 35 41 47 52 58 64
22 23 23 24 25 25 26 27 27 28 29 29 30 31 31 32 32 33 34 34 35 36 36 37 37 44 50 56 61 67
Zkouška duo-trio Výhody a nevýhody párové zkoušky platí snad ještě ve větší míře i pro zkoušku duo-trio. Jak název zkoušky naznačuje, podávají se celkem tři vzorky, z toho dva neznámé. První vzorek je referenční, podávaný neanonymně jako standard. Další dva vzorky jsou zakódované a mají být s referenčním vzorkem srovnány. Z těchto dvou neznámých vzorků je jeden opět stejný jako vzorek referenční, ale tentokrát podávaný anonymně. Druhý neznámý vzorek je vzorek zkoumaný. Jejich pořadí v řadě je nahodilé. Hodnotitel nejprve ohodnotí referenční vzorek (standard) a pak oba neznámé vzorky; posouzení standardu i libovolného neznámého vzorku může podle potřeby opakovat. Potom rozhodne, který ze srovnávaných vzorků je shodný s referenčním a který je odlišný. Podobně jako u párové zkoušky jsou i zde dvě možnosti volby a zkouška je jednosměrná. Výsledky je proto možné vyhodnotit také podle tab. 1 jako výsledky párové zkoušky. Např. bylo 15 hodnotilelům předloženo po 2 sadách ovocných moštů ze dvou odrůd jablek. Sledovali charakter chuti; z 30 odpovědí bylo 19 správných a 11 nesprávných; podle tab.1 je hraniční hodnota (při hladině pravděpodobnosti P = 99 %) 23 správných odpovědí. Protože 19<23,
nulová hypotéza se nezamítá a rozdíl mezi vzorky je neprůkazný. Při jiném pokusu bylo 20 hodnotitelům podáno po 4 sadách vzorků mléka rekonstituovaného ze sušeného mléka ze dvou různých provozních linek, s úkolem sledovat rozdíly v chutnosti. Z 80 odpovědí bylo 61 správných a 19 nesprávných. Podle tab.1 je při hladině pravděpodobnosti P = 99 % hraniční počet 52 správných odpovědí. Protože 61>52, je nutno zamítnout nulovou hypotézu, že mezi vzorky není rozdíl. Sušené mléko vyrobené na jedné lince se tedy liší od sušeného mléka vyrobeného na druhé lince. Na rozdíl od párové zkoušky má u zkoušky duo-trio hodnotitel k dispozici známý referenční vzorek, takže snadněji zjistí existenci rozdílu. metoda je proto vhodná pro určení malých rozdílů mezi zkoumaným a referenčním vzorkem. latí to zvláště tehdy, jestliže hodnotitelé znají referenční vzorek již z dřívějších zkoušek (je to např. běžný produkt podniku). Zkouška je vhodná i pro méně zkušené hodnotitele, takže se hodí např. i pro zaškolování. Další výhodou proti párové zkoušce je, že není třeba přesně definovat při zadání úkolu sledovanou vlastnosti. Počet potřebných odpovědí je asi jako u párové zkoušky, někdy i menší, ale celkový počet potřebných vzorků je větší o podávané standardy. Trojúhelníková zkouška jinou starší,l ale stále hojně používanou metodou, je zkouška trojúhelníková. Podstata této zkoušky spočívá v tom, že hodnotitel obdrží k posouzení řadu tří vzorků. Dříve se vzorky podávaly uspořádané ve formě trojúhelníku, kdežto dnes se obvykle podávají v řadě. Trojúhelníkové uspořádání totiž může podporovat v hodnotiteli domněnku, že základnu tvoří dva identické vzorky a protilehlý vrchol vzorek odlišný. V řadě tří vzorků jsou vždy dva vzorky stejné a jeden vzorek odlišný, takže je možných 6 kombinací: ABB BAB BBA BAA ABA AAB. Tyto kombinace se podávají tak, aby byly v celém souboru zastoupeny stejně často nebo zcela nahodile. Hodnotitel postupně ochutná vzorky v předloženém pořadí a pokud si přeje, může ochutnání libovolně opakovat. je chybou, jestliže se vzorky ochutnávají v rychlém sledu, protože pak jejich vlastnosti splývají. Doporučuje se proto, aby si hodnotitel po každém ochutnání vypláchl ústa a počkal 30 až 60 sekund před ochutnáním dalšího vzorku. Potom rozhodne, které dva vzorky jsou stejné a který je odlišný a výsledek zaznamená do protokolového formuláře. Doporučujeme, aby byl hodnotitel nucen rozhodnout, i když nepozoruje žádné rozdíly (nucená volba). U trojúhelníkové zkoušky může být kterýkoli ze tří vzorků odlišný, takže jsou tři možnosti odpovědi a s pravděpodobností P = 33,3 % lze ke správnému výsledku dojít náhodou. Zkouška je jednostranná. Ve srovnání s předcházejícími zkouškami je tedy menší pravděpodobnost náhodné správné odpovědi a stačí proto menší počet odpovědí (obvykle již 30 nebo méně) k bezpečným závěrům. Pokud předpokládáme stejný počet ode všech kombinací, pak počet odpovědí musí být dělitelný šesti. Výsledky se vyhodnotí pomocí tabulky 2, kde jsou uvedeny hraniční počty správných odpovědí. např. 30 posuzovatelům bylo předloženo po jedné sadě pomerančových džusů A a B, z nichž vzorek A byl skladován 6 měsíců při teplotě 18 až 22 °C a vzorek B při teplotě 15 °C. Z 30 odpovědí bylo 17 správných a 13 nesprávných. Pro hladinu pravděpodobnosti P = 99 % z tab. 2 plyne, že minimální počet správných odpovědí nezbytný pro zamítnutí nulové hypotézy je právě 17. Znamená to, že byl prokázán rozdíl mezi vzorky.
Tabulka 2 Vyhodnocování výsledků trojúhelníkové zkoušky CELKOVÝ POČET ODPOVĚDÍ 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 50 60 70 80
MINIMÁLNÍ POČET ODPOVĚDÍ NUTNÝCH PRO ZAMÍTNUTÍ NULOVÉ HYPOTÉZY P = 95 % P = 99 % P = 99,9 % 4 5 5 5 6 6 5 6 7 6 7 8 6 7 8 7 8 9 7 8 9 8 9 10 8 9 10 9 10 11 9 10 12 10 11 12 10 11 13 10 12 13 11 12 14 11 13 14 12 13 15 12 14 15 13 14 16 13 14 16 13 15 17 14 15 17 14 16 18 15 16 18 15 17 19 16 17 19 16 18 19 16 18 20 17 19 20 17 19 21 18 19 21 18 20 22 18 20 22 19 21 23 19 21 23 20 22 24 24 26 28 28 30 33 32 34 37 35 38 41
Trojúhelníková zkouška je náročnější na paměť a zkušenosti hodnotitele než obě předešlé zkoušky, a to zvláště při hodnocení vzorků s dlouho doznívajícími vlastnostmi (jedlý olej, čokoláda, pivo aj.), ale nezkušení hodnotitelé si ji mohou rozložit na 3 párové zkoušky (každý vzorek s každým). Názory na výhodnost trojúhelníkové zkoušky se různí. Podle našeho názoru je metoda dosti náročná na množství materiálu a na vynaložený čas, takže je nutné zvážit její použití. Pro méně zkušené hodnotitele je výhodnější zkouška párová, pro velmi zkušené naopak zkouška s menší pravděpodobností náhodného správního výsledku. Zkouška tetrádová Kombinací zkoušek duo-trio a trojúhelníkové vznikla zkouška tetrádová. jak již název naznačuje, podávají se celkem 4 vzorky. První je neanonymně podávaný vzorek referenční (standard, např. A) a pak následuje trojice neznámých vzorků. Jsou to různé kombinace referenčního vzorku A i srovnávacího vzorku B, tentokrát podávané anonymně. Tyto kombinace jsou vlastně stejné jako u trojúhelníkové zkoušky, takže je možných 6 kombinací: SXXS SXSX SSXX SXSS SSXS SSSX, kde S = standard a X = srovnávací vzorek. Hodnotitel má za úkol ochutnat nejprve vzorek předložený jako referenční a pak v předloženém pořadí ochutnat tři neznámé vzorky (tento postup se může upravit na 3 párové zkoušky tak, že se každý neznámý vzorek srovná se vzorkem referenčním). Ochutnávání vzorku referenčního a neznámých vzorků smí hodnotitel libovolně opakovat. Pak rozhodne, které neznámé vzorky (jeden nebo dva) jsou shodné se vzorkem referenčním a které (jeden nebo dva) jsou odlišné. Výsledek zapíše do protokolového formuláře. Tetrádová zkouška je pro hodnotitele asi stejně náročná jako trojúhelníková (která se také může rozložit na tři párové zkoušky), ale pravděpodobnost náhodného určení správného výsledku je jen 1 : 6 = 16.7 %; stačí tedy již malý počet odpovědí (obyčejně 10 až 20), abychom získali průkazné závěry. Při vyhodnocování se zjistí celkový počet odpovědí a počet správných odpovědí a v tab. 3 se vyhledá, zda nulovou hypotézu můžeme přijmout nebo musíme zamítnout. Tabulka 3 Vyhodnocování výsledků tetrádové zkoušky
CELKOVÝ POČET ODPOVĚDÍ 5 6 7 8 9 10 11 12 13
MINIMÁLNÍ POČET SPRÁVNÝCH ODPOVĚDÍ NUTNÝCH PRO ZAMÍTNUTÍ NULOVÉ HYPOTÉZY P = 95 % P = 99 % P = 99,9 % 4 4 5 4 5 6 4 5 6 5 5 6 5 6 7 5 6 7 5 6 8 6 7 8 6 7 8
14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
6 7 7 7 7 8 8 8 8 9 9 9
7 8 8 8 9 9 9 9 10 10 10 10
9 9 9 10 10 10 11 11 11 12 12 12
Literatura: Pokorný J.: Metody senzorické analýzy potravin a stanovení senzorické jakosti, Ústav zemědělských a potravinářských informací, Praha 1993.
