Návod k použití pro soupravy Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits CE revize 5, leden 2014

Dot108v08: Návod k použití pro Biofortuna SSPGoTM HLA typizace sady. CE Revize 5

Strana 1 / 12

Návod k použití pro soupravy Biofortuna SSPGoTM HLA Typing Kits CE revize 5, leden 2014. 1. Použití Biofortuna HLA SSPGo Kits jsou kvalitativní soupravy založené na analýze DNA pro stanovení HLA alel buď pomocí soupravy s „nízkým rozlišením“, nebo pomocí soupravy pro skupinově specifickou amplifikaci alel se „středním rozlišením“. Běžná definice střední úrovně rozlišení je taková, že většina výsledků je při něm jasně určena na úrovni dvou číslic; např. DQB1*02, DQB1*05 atd. Vysoké rozlišení je obecně definováno tak, že je většina alel určena na úrovni čtyř číslic, jako např. DQB1*02:01, DQB1*05:01 atd. Tento produkt je určen pro diagnostické účely in vitro a používat ho mohou pouze vyškolení pracovníci. 2. Úvod Molekuly HLA hrají klíčovou roli v imunitní odpovědi a rozpoznávání vlastních a cizích molekul, a v důsledku toho je genotypizace HLA a určení HLA shody povinné před většinou prováděných transplantací. Antigeny HLA omezují specificitu T-buňkami přenášené imunitní odpovědi a genotypizace HLA je přínosným vyhledávacím nástrojem mnoha imunitních poruch nebo imunitních odpovědí na patogeny, vakcinaci nebo medikamentózní léčbu. Genotypizaci HLA lze také použít k potvrzení diagnózy onemocnění, u kterých alely HLA významným způsobem souvisejí se stavem onemocnění. Většina genů HLA je vysoce polymorfních a pro přesné stanovení antigenů HLA se obecně vyžaduje DNA genotypizace. Genotypizace pomocí PCR reakce využívající primery specifické pro sekvenci (SSP - Sequence-Specific Primers)1 je rychlá metoda genotypizace HLA vhodná zejména v situacích, kdy je požadována střední úroveň rozlišení. U souprav Biofortuna SSP jsou všechny reakce prováděny v suchém stavu, včetně polymerázy, takže jediné, co musí uživatel před PCR udělat, je přidat DNA. Věnujeme maximální úsilí tomu, aby byly soupravy aktualizovány v souladu s IMGT HLA. Aktualizace souprav jsou k dispozici na webové stránce www.biofortuna.com. 3. Popis testu PCR SSP je založena na principu, že k amplifikaci dojde pouze u primerů, které se budou zcela shodovat s 3’ koncem cílové sekvence. Neshodné primery neposkytnou pozitivní produkt amplifikace.2 Pár primerů interní kontroly, který amplifikuje konzervovanou oblast housekeeping genu, je obsažen v každé PCR reakční směsi; pár primerů interní kontroly je indikátorem integrity PCR reakce. Genotypizace SSP obecně využívá několikanásobných reakcí, které při společné analýze indikují genotyp. Vizualizace produktů amplifikace lze dosáhnout pomocí elektroforézy na agarózovém gelu, která separuje fragmenty DNA podle velikosti.

C

V

C


Strana 2 / 12

4. Obsah soupravy 

   

Polypropylenové PCR destičky nebo proužky, které obsahují 8 až 96 PCR jamek (podle typu soupravy), každá jamka obsahuje předem nadávkované lyofilizované primery, polymerázu, dNTP* a pufr. Jednotlivé destičky nebo proužky se dodávají vzduchotěsně uzavřené fólií nebo uzávěrem a balené jednotlivě v sáčku s vysoušedlem. Zatavovací fólie nebo uzávěry pro PCR. 1x návod k použití. Certifikát analýzy Interpretační tabulky a MSDS (bezpečnostní listy) si lze stáhnout z webové stránky společnosti Biofortuna www.biofortuna.com. Pokud nemáte možnost tyto dokumenty stáhnout z webové stránky, kontaktujte prosím lokálního distributora.

*CleanAmp™ dNTP podléhají licenci společnosti Trilink Biotechnologies Inc se svolením k použití v produktech Biofortuna SSPGo. 5. Reagencie a vybavení, které nejsou součástí dodávky      

Vhodné kalibrované pipety a sterilní špičky, např. pipeta P10 s 10µl filtračními špičkami. Souprava / vybavení pro izolaci DNA. UV spektrofotometr. Polypropylenové zkumavky. Sterilní voda pro molekulárně-biologické aplikace. Termocykler musí vyhovovat těmto požadavkům:  96 jamkový termocykler s vyhřívaným víkem s teplotou 104 °C pro bezolejový provoz,  rychlost ohřevu 1,0 °C/sec.,  teplotní rozmezí 4,0 – 99,9 °C,  přesnost teploty ±0,25 °C v teplotním rozmezí 35 – 99,9 °C,  teplotní kalibrace s návazností na referenční standard,  programování termocykleru podle cyklovacích parametrů PCR uvedených v oddíle 8. Pozn.: Konkrétní informace o termocykleru najdete v návodu výrobce. Termocykler je třeba zkalibrovat podle akreditačních předpisů ASHI (American Society of Histocompatibility and Immunogenetics) nebo EFI (European Federation of Immunogenetics).



Reagencie pro gelovou elektroforézu [agaróza, 0,5x TBE pufr, 1 000bp DNA molekulární hmotnostní marker, roztok ethidiumbromidu 10 mg/ml]. Vybavení pro gelovou elektroforézu (elektroforetické vany a rámečky s gelem, síťový zdroj, gelový dokumentační systém s UV transluminátorem). Software na pomoc při manuálním analýze SSPGo výsledků zkoušek kit a archivaci dat lze stáhnout z webových stránek Biofortuna www.biofortuna.com.

 

Pozn.: Jakákoli změna uvedených podmínek, například rychlosti ohřevu termocykleru, může ovlivnit interpretaci výsledků testu. 6. Bezpečnost a varování     

Pro diagnostické účely in vitro. Test může provádět pouze náležitě vyškolený pracovník. Všechny výsledky typizace musí ověřit kvalifikovaný pracovník, a pokud jsou výsledky použity pro klinické rozhodování, musí být potvrzeny pomocí jiných metod typizace. Se všemi reagenciemi zacházejte v souladu se zásadami Správné laboratorní praxe. Oblasti k provádění postupu před a po PCR musí být odděleny. Materiál používaný po PCR nevnášejte zpět do oblasti pro postup před PCR.

C

V

C


   

Strana 3 / 12

Varování týkající se biologického rizika: Se všemi produkty krevního původu zacházejte jako s potenciálně infekčními. Varování týkající se biologického rizika: Ethidiumbromid je potenciální karcinogen. Při jeho použití vždy používejte ochranné rukavice, laboratorní plášť a ochranné brýle. Varování týkající se biologického rizika: Při používání zdrojů UV záření postupujte opatrně - vždy používejte ochranné rukavice, laboratorní plášť a ochranné brýle. Nikdy se nedívejte přímo do zdroje UV záření. Bezpečnostní listy jsou k dispozici na webové stránce www.biofortuna.com.

7. Uchovávání a stabilita Soupravy Biofortuna SSPGo uchovávejte při teplotě 2–28 °C. Jakmile jsou PCR jamky vyjmuty z fólie, reagencie rehydratujte pomocí DNA do 3 hodin. Datum expirace je uvedeno na obalu. Po uvedeném datu produkt nepoužívejte. Soupravy, jejichž obal je poškozený nebo jež neobsahují sáček s vysoušedlem, nepoužívejte. Pouze za použití vzduchotěsně uzavíracích fólií nebo uzávěrů zajistěte, aby byly PCR jamky po nadávkování DNA důkladně utěsněny, neboť jinak by během PCR amplifikace mohlo dojít k odpařování. Zvláštní pozornost věnujte okrajům a rohům. Pozn. (1): V případě potřeby lze nehydratované PCR destičky a proužky vyjmuté ze sáčku uchovávat po dobu až 3 hodin před přidáním DNA při teplotě do 21 oC a relativní vlhkosti nepřesahující 60 %. Pozn. (2): Po hydrataci s DNA lze PCR proužky a destičky z čerstvě otevřených sáčků uchovávat při teplotě 2–8 °C po dobu až 24 hodin před krokem PCR, za předpokladu, že jsou jamky dokonale utěsněné tak, aby nemohlo docházet k odpařování. 8. Pokyny k použití Požadavky na vzorky DNA Všechny reakce testu jsou optimalizovány pro provedení s 50–100 ng DNA, ale rehydrataci každé reakce je nezbytné provést přesně s 10 µl kapaliny. Test lze tedy provést pouze tak, že se použije 10 µl DNA o koncentraci 5–10 ng/µl. DNA nařeďte na požadovanou koncentraci výhradně za použití sterilní vody molekulární čistoty. Pozor: Konečný vzorek DNA nesmí obsahovat více než 2,5mM Tris/0,25mM EDTA. Používejte pouze DNA extrahovanou ze vzorků odebraných s citrátem a EDTA. Jelikož heparin může inhibovat PCR reakci, nedoporučuje se provádět extrakci DNA z heparinizovaných vzorků krve. Bylo zjištěno, že hemoglobin při testu s SSPGo HLA soupravou interferuje, pokud je ve vzorku DNA přítomen v koncentraci vyšší než 1 mg/dl. DNA lze extrahovat kteroukoli tradiční extrakční metodou. Dbejte, aby hodnota A260/280 vzorku DNA stanovená UV spektrofotometrií ležela v rozmezí 1,66 –1,94. Pokyny pro postup před PCR i. ii. iii.

Vyjměte destičku nebo proužek SSPGo z uzavřeného obalu. Poznamenejte si číslo šarže výrobku. Předtím, než je těsnicí fólie nebo uzávěr sejmut, mají všechny vymražené pelety (PCR reagencie) ležet na dně jamek destičky či proužku. Pokud tomu tak není, mírně poklepejte, aby se peleta sesunula na dno jamky. První reakce každého testovaného lokusu má vždy bledě růžovou barvu v porovnání se zbytkem soupravy. (Při hydrataci červenou.) Některé PCR destičky obsahují v poslední jamce integrovanou fialově zbarvenou „kontrolu bez templátu“ - negativní kontrolu. iv. Pomocí sterilního vybavení napipetujte 10 µl roztoku DNA do jednotlivých reakcí v destičce nebo proužku. Viz poznámka v oddílu 8 - Požadavky na vzorky DNA. Pokud destička obsahuje integrovanou fialově

C

V

C


v. vi. vii. viii.

Strana 4 / 12

zbarvenou „kontrolu bez templátu“, napipetujte do ní 10 µl roztoku na ředění vzorků (bez DNA). Viz oddíl 8 Poznámka pro kontrolu bez templátu. Zajistěte, aby v každé reakci byla DNA před teplotním cyklem v kontaktu s reagenciemi v suchém stavu. Utěsněte reakce dodanou krycí fólií nebo uzávěry pro PCR zkumavky. Fólie co nejlépe utěsněte, abyste předešli odpařování. Zvláštní pozornost věnujte okrajům a rohům. Vložte panel nebo proužky přímo do termocykleru. Ujistěte se, že jamky jsou zcela vloženy do bloku a víko je zcela stlačeno. V opačném případě může v důsledku odpařování a kondenzace PCR dojít k individuálnímu selhání PCR reakce. Spusťte program pro PCR reakci (viz parametry PCR).

POZNÁMKA TÝKAJÍCÍ SE RESUSPENZE: Po vyjmutí jamek PCR z utěsněného sáčku je třeba reagencie okamžitě s DNA rehydratovat. Bližší informace viz pozn. (1) a pozn. (2). POZNÁMKA PRO KONTROLU BEZ TEMPLÁTU: Některé soupravy obsahují kontrolu bez templátu (NTC - No Template Control) jako poslední reakci destičky. Tato reakce obsahuje fialové barvivo, aby ji bylo možné rozeznat od ostatních reakcí. NTC je navržena pro detekci kontaminace reakce PCR nebo genomové DNA, která může být přítomna ve vodě používané k resuspenzi DNA. V případě kontaminace PCR reakce budou pozorovány amplikony různých velikostí. POZNÁMKA TÝKAJÍCÍ SE VÝŠKY PROFILU DESTIČEK/PROUŽKŮ PCR: Doporučuje se, aby výška profilu destiček a proužků byla shodná, pokud jsou vloženy ve stejném přístroji pro PCR reakci. Rozdíl výšky profilů může mít za následek nedostatečný kontakt s vyhřívaným víkem přístroje pro PCR reakci. Může tak dojít k nedostatečné amplifikaci PCR nebo k jejímu selhání. Parametry PCR reakce Používejte následující parametry PCR reakce. Ujistěte se, že rychlost náběhu je 1 °C za sekundu, a zapněte výhřev víka. Kompletní pokyny k použití jsou uvedeny v uživatelské příručce od výrobce termocykleru. Termocyklery kalibrujte podle akreditačních pravidel vydaných organizací American Society of Histocompatibility and Immunogenetic (ASHI) nebo European Federation of Immunogenetics (EFI). Denaturace

při teplotě 94 °C

po dobu 5 minut

Denaturace Anelace Extenze

při teplotě 96 °C při teplotě 66 °C při teplotě 72 °C

po dobu 15 sekund po dobu 50 sekund po dobu 30 sekund

10 cyklů

Denaturace Anelace Extenze

při teplotě 96 °C při teplotě 64 °C při teplotě 72 °C

po dobu 15 sekund po dobu 50 sekund po dobu 30 sekund

20 cyklů

UDRŽUJTE PŘI TEPLOTĚ 15 °C maximálně po dobu 72 hodin před spuštěním gelové elektroforézy. V případě nutnosti lze před spuštěním gelové elektroforézy PCR destičku uchovávat až po dobu 24 hodin při 2 – 8 °C. Vždy zajistěte správné utěsnění destiček. Gelová elektroforéza Tyto pokyny jsou platné pro horizontální elektroforézu na agarózovém gelu: Připravte 2% agarózový gel v 0,5x TBE pufru. Jakmile je gel zchlazen přibližně na 60 °C, přidejte ethidiumbromid, aby jeho konečná koncentrace byla 0,5 µg/ml. Nalijte gel a vložte hřebeny pro vytvoření mikrotitračních jamek (např. 12 x 8 jamek s 9mm mezerami). Po ztuhnutí vyjměte hřebeny a ponořte gel do roztoku 0,5x TBE pufru. Celý PCR produkt nadávkujte postupně na 2% agarózový gel a poznamenejte si pozici každé reakce. Pro určení velikosti se doporučuje 1000bp ladder (velikostní marker). Gelovou elektroforézu provádějte po dobu 20 minut rychlostí 10 V/cm.

C

V

C


Strana 5 / 12

Podrobnosti týkající se specifického vybavení jsou uvedeny v návodu k použití od výrobce elektroforetického systému. Gel zobrazte pomocí UV dokumentačního systému pro gel s UV transluminátorem. Pozn.: Pokud je elektroforéza nedostatečná, mohou velké amplikony nad 600bp splynout s kontrolním amplikonem. Proto dbejte, aby byla elektroforéza dostatečná na to, by byly tyto amplikony viditelné. Příliš dlouho trvající elektroforéza však může vést ke ztrátě malých amplikonů v předcházejících jamkách na gelu. 9. Interpretace Soupravy SSPGo byly navrženy tak, aby bylo možné stanovit výsledky manuálně pomocí interpretačních tabulek, které jsou k dispozici na webové stránce www.biofortuna.com. Pokud máte potíže s přístupem na webovou stránku, kontaktujte prosím lokálního distributora. Interpretační tabulky mohou obsahovat poznámky týkající se dané konkrétní šarže, které mohou být pro interpretaci důležité. Připojte snímek gelu k odpovídající interpretační tabulce tak, aby souhlasilo číslo a verze soupravy. Vyhodnoťte zobrazení gelu. Každá reakce by měla obsahovat pozitivní kontrolní proužek. Používejte interpretační tabulky, neboť u různých produktů SSPGo může mít různou velikost. Proužky interních kontrol se mohou objevit jako mnohem slabší než přítomné proužky specifické pro alely. Pokud je přítomen proužek specifický pro alelu, nikoli však proužek kontroly, je třeba výsledek také považovat za pozitivní. Proužkům menším než 70 bp nevěnujte pozornost, neboť se jedná o volné primery. Určete pozitivní reakce. Pozitivní reakce jsou indikovány přítomností proužků očekávané velikosti, které jsou uvedeny v interpretačních tabulkách. V dané reakci může být více než jedna velikost produktu - jedná se o multiplexní reakce, které jsou uvedeny v interpretačních tabulkách. Pozitivní reakce porovnejte s interpretačními tabulkami. Pozitivní výsledek v reakci indikuje přítomnost nejméně jedné z alel uvedených u této reakce v interpretační tabulce. Daná alela může být amplifikována v několika zkumavkách - pokud je alela přítomna, měly by být pozitivní všechny relevantní reakce.

Proužek kontroly

Směr elektroforézy

Proužek specifický pro alelu

Obr. 1 Příklady pozitivních reakcí indikovaných přítomností proužků specifických pro alely a proužků kontrol (reakce 1–3); negativních reakcí indikovaných přítomností proužků kontrol, ale nepřítomností proužků specifických pro alely (reakce 4–7) a selhání reakce indikované nepřítomností jakéhokoli proužku (reakce 8). Ujistěte se, že číslo šarže soupravy odpovídá číslu šarže interpretační tabulky. Software na pomoc při manuálním analýze SSPGo výsledků zkoušek kit a archivaci dat lze stáhnout z webových stránek Biofortuna www.biofortuna.com. 10. Zajištění a kontrola kvality Kvalita každé šarže SSPGo je kontrolována před uvolněním produktu společnosti Biofortuna z výroby. Vzorky jednotlivých šarží souprav jsou kontrolovány vzhledem k definovanému panelu se vzorky DNA lidského původu, aby byla zajištěna správná funkčnost. Každá reakce byla validována nejméně se 47 vzorky dobře charakterizovaných buněčných linií DNA. Společnost Biofortuna doporučuje, aby každá laboratoř provedla interní validaci nových produktů používaných k typizaci před jejich použitím pro klinické vzorky. Typizaci pro diagnostické účely může

C

V

C


Strana 6 / 12

provádět pouze plně vyškolený a kvalifikovaný pracovník a výsledky musí být zkontrolovány jiným vyškoleným pracovníkem. 11. Klinické údaje Na pěti zkušebních pracovištích byla provedena studie diagnostického zařízení in vitro porovnávající funkčnost souprav SSPGo HLA Typing Kits se srovnávacím výrobkem, což byl ʽOne Lambdaʼ Labtype SSO. Lokusová typizace provedená pro hodnocení soupravy SSPGo poskytla zkušební výsledky pro HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQA1, HLADQB1, HLA-DRB1/3/4/5, HLA-DPB1, DPA1 a HLA-DQA1*05, DQB1*02, DQ8. Testování klinické funkčnosti souprav SSPGo HLA Typing Kits poskytlo celkovou 98,3% - 100% shodu se srovnávacím výrobkem (metoda SSO)s minimálně 95% spolehlivostí pro genotypizaci HLA alel třídy I a II v DNA získané z plné krve v koncentraci 5-10ng/μl. Při vyloučení tří potvrzených nesouhlasných výsledků genotypizace bylo na testovacích pracovištích ve Velké Británii a USA dosaženo 100% shody u 1 222 vzorků za použití tří šarží každé testovací soupravy. Reprodukovatelnost testů se soupravami SSPGo HLA Typing kits mezi pracovišti byla studována na třech pracovištích za použití reprezentativního panelu 8 SSPGo PCR reakcí vůči dodaným vzorkům DNA o koncentracích 4 a 11 ng/μl, což jsou krajní hodnoty koncentračního rozmezí pro tuto testovací soupravu. Shodu DNA vykázalo celkem 958/960 jednotlivých reakcí rovnoměrně rozdělených mezi ona tři externí pracoviště, což představuje celkovou shodu 99,7 % (0,995 LCL). Reprodukovatelnost mezi šaržemi byla stanovena za použití tří šarží reprezentativní soupravy SSPGo HLA Test kit, se kterými pracoval jeden pracovník na jednom pracovišti za použití DNA o koncentraci v rozmezí 5-10 ng/μl. Tato reprodukovatelnost pro SSPGo HLA Type testování představovala 100% shodu se srovnávacím výrobkem u 130/130 vzorků DNA testovaných třemi šaržemi reprezentativního HLA Type testu při celkovém počtu 390 testů. Shoda při pozitivní verifikaci SSPGo HLA byla získána u alel třídy I a II v rámci srovnávacího testování pomocí LABType SSO testovaných klinických vzorků. Interní testování SSPGo HLA poskytlo výsledky souhlasné s referenčními vzorky DNA s výjimkou nedostupných vzorků, jako byly určité vzácné HLA-DPB1 alely a vzácné HLA-B alely a skupiny alel, např. B*59:01, B*78 a B*83:01. Nebyly potvrzeny tyto skupiny vzácných alel: B*59, B*78, B*83, DPB*21:01, DPB*26:01:02, DPB*27:01, DPB*28:01, DPB*29:01, DPB*31:01, DPB*34:01, DPB*35:01:01, DPB*39:01, DPB*45:1, DPB*46:01, DPB*51:01, DPB*55:01, DPB*59:01, DPB*63:01, DPB*81:01, DPB*85:01 & DPB*105:01 12. Literatura 1) Bunce M et al Tissue Antigens. 1995 Nov;46(5):355-67. 2) Saiki RK et al. Nature. 1986 Nov 13-19;324(6093):163-6.

C

V

C


Strana 7 / 12

13. Řešení problémů při použití produktu SSPGo Problém Při žádné reakci nedošlo k amplifikaci

Pravděpodobná příčina Nesprávná koncentrace použité DNA Ve vzorku DNA jsou přítomny inhibitory PCR reakce

Nízká kvalita použitých vzorků DNA

Nápravné opatření Měřením při OD280 stanovte množství DNA a zajistěte, aby bylo při každé reakci přidáno v objemu 10 µl celkem 50–100 ng DNA. Nepoužívejte heparinizovanou krev. Nepoužívejte vzorky DNA obsahující hemoglobin v koncentraci nad 1 mg/dl. Změřte kvalitu DNA. Hodnota poměru A260/280 při UV spektrofotometrii se musí nacházet v rozmezí 1,66– 1,94. Zajistěte, aby byla DNA před použitím zcela resuspendována. Dbejte, aby se vzorek DNA ředil vodou molekulární čistoty a neobsahoval více než 2,5mM Tris/0,25mM EDTA.

Reagencie nejsou zcela resuspendovány

Zajistěte, aby byly pelety před přidáním DNA zcela rehydratovány.

Termocykler nebyl správně nastaven

Zajistěte, aby bylo pro každou reakci použito 10 µl roztoku DNA. Zajistěte, aby byl program PCR zadán správně podle návodu k použití. Ujistěte se, že vyhřívané víko termocykleru je usazeno a dostatečně utěsněno. Další pokyny jsou uvedeny v návodu k použití termocykleru. Ujistěte se, že je do elektroforetické komory přiváděn elektrický proud - zkontrolujte síťový zdroj a vyčistěte elektrody.

Problémy týkající se elektroforézy

Použijte gel v 0,5x TBE pufru. Zajistěte, aby byl používán čerstvý roztok 0,5 µg/ml ethidiumbromidu. Ověřte, že je při zobrazení gelů UV záření dostatečné. Pro další pokyny nahlédněte do návodů od výrobce elektroforetické vany a rámečků s gelem a síťového zdroje. Při žádné reakci nedošlo k amplifikaci

C

Panely nejsou správně utěsněny

Nedostatečné utěsnění panelů může vést k odpařování během PCR. Společnost Biofortuna dodává v soupravě doporučené krycí fólie. Další dodávky si vyžádejte u svého distributora.

V

C


Problém

Náhodné chyby při záznamu kontrol a/nebo amplikonů specifických pro alely

Pravděpodobná příčina

Strana 8 / 12

Nápravné opatření Ujistěte se, že všechny jamky jsou náležitě utěsněné. Zvláštní pozornost věnujte utěsnění jamek na okrajích PCR destičky nebo proužku. Ujistěte se, že všechny jamky byly do gelu nadávkovány ve správném pořadí a do všech jamek byl nadávkován stejný objem PCR reakcí.

Chyby týkající se gelu

Nakalibrujte pipety podle návodu k použití od výrobce. Zkontrolujte, že se jamky v gelu náležitě utvořily. Hřebeny odstraňujte opatrně, abyste neroztrhli dna jamek. Před nanesením gelu se ujistěte, že agaróza je zcela rozpuštěná. Ujistěte se, že elektroforéza v gelu neprobíhá příliš dlouho, neboť menší amplikony by mohly přetéct přes konec. Zajistěte dostatečně dlouhou elektroforézu v gelu, aby mohlo dojít k separaci proužků. Použijte čerstvý roztok ethidiumbromidu. Selhání metody, zejména podél okrajů, může být způsobeno nedostatečným utěsněním víka. To může vést k odpaření a kondenzaci PCR reakce v horní polovině jamky pro PCR reakci, takže je PCR reakce nedostatečná.

Problémy týkající se termocykleru

Při údržbě a kalibraci termocykleru postupujte přesně podle pokynů od výrobce. Podle návodu k použití zkontrolujte, zda jsou parametry PCR správné. Ujistěte se, že všechny jamky jsou náležitě utěsněné. Zvláštní pozornost věnujte utěsnění jamek na okrajích PCR destičky nebo proužků.

Problémy týkající se odpařování

Ujistěte se, že je zapnut výhřev víka a že je víko dostatečně stlačeno. Dbejte, aby se používaly dodávané krycí fólie firmy Biofortuna. Další dodávky si vyžádejte u svého distributora. Náhodné chyby při záznamu kontrol a/nebo amplikonů specifických pro alely

Sporadická selhání způsobená problémy s DNA

DNA není přítomna: Zajistěte, aby byla DNA přítomna ve všech jamkách. Nesprávný objem: Zajistěte, aby bylo do každé reakce přidáno 10 µl roztoku DNA. Přidáno příliš mnoho DNA: Koncentrace vyšší než 200 ng

C

V

C


Problém

Rozmazané zobrazení gelu

Slabá amplifikace

Pravděpodobná příčina

Strana 9 / 12

Nápravné opatření nebo nižší než 20 ng může způsobit selhání PCR reakce. Kontaminace DNA může způsobit sporadické nebo rozsáhlé selhání amplifikace. Zkontrolujte koncentraci a čistotu DNA. Přídavek velkého množství DNA do PCR reakcí může způsobit rozmazané zobrazení gelu.

DNA

Příčinou může být degradace nebo nedostatečná čistota. Použijte čerstvý vzorek DNA. Zkontrolujte, zda koncentrace DNA není příliš vysoká nebo příliš nízká. Nadávkujte 50 – 100 ng DNA v 10 µl na reakci. Při údržbě a kalibraci termocykleru postupujte přesně podle pokynů od výrobce.

Problémy týkající se koncentrace DNA Problémy týkající se termocykleru

Podle návodu k použití zkontrolujte, zda jsou parametry PCR správné. Zajistěte, aby byl nadávkován stejný objem v rozmezí 5–10 µl pro každou reakci.

Chyby týkající se gelu

Nakalibrujte pipetu podle návodu k použití od výrobce. Nespecifická amplifikace

Použijte čerstvý roztok ethidiumbromidu. Zkontrolujte, zda koncentrace DNA není příliš vysoká nebo příliš nízká. Nadávkujte 50–100 ng DNA v 10 µl na reakci. Zkontrolujte pořadí PCR a pořadí řad v gelu.

Problémy týkající se koncentrace DNA Reakce jsou v nesprávném pořadí

Byla identifikována nová alela

Amplifikační vzor (pattern) nelze interpretovat

Nesprávná interpretace artefaktu jako specifického proužku

V interpretačních tabulkách specifických pro danou verzi zkontrolujte správnou velikost proužku. Zkontrolujte, zda všechny specifické amplifikace mají správnou velikost nebo zda byl jako amplifikace chybně interpretován artefakt (přenos, primer dimer). Zkontrolujte pořadí PCR a pořadí řad v gelu.

Reakce jsou v nesprávném pořadí Individuální selhání reakce PCR

C

Předejděte fyzickému přetečení sousedících jamek při elektroforéze tím, že je nebudete přeplňovat, a před vyjmutím hřebenů se ujistíte, že gel je již pevný. V nových amplifikačních vzorech (pattern) mohou být přítomny alely, které dosud nebyly sekvenovány. Pokud používáte k interpretaci předchozí verze interpretačních tabulek, stáhněte si aktuální verze z webových stránek www.biofortuna.com. Pokud nový vzor neobsahují, použijte jinou soupravu Biofortuna nebo potvrďte identifikaci sekvence pomocí typizace na základě sekvencí.

Zkontrolujte, že jsou přítomny všechny interní pozitivní kontroly. Proveďte interpretaci znovu bez chybějících

V

C


Problém

Pravděpodobná příčina Chybí malé amplikony

Ve vzorku byla identifikována nová alela

C

V

Strana 10 / 12

Nápravné opatření reakcí. Jsou elektroforézou zaneseny příliš daleko, malé amplikony přetekly přes konec gelu nebo mimo dosah ethidiumbromidu nebo jsou rozptýleny vniknutím do předchozího vzorku v gelu. Použijte podmínky pro elektroforézu, které jsou vhodné pro daný gelový systém. Příležitostně se mohou objevit nové alely poskytující amplifikační vzor (pattern), který nesouhlasí s existujícími alelami. Kontaktujte prosím lokálního distributora.

C


Strana 11 / 12

14. Historie revizí Revize:

Z revize 4 na revizi 5

Datum revize: 21. ledna 2014 Oddíl

Popis revize

Oddíl 4: Obsah soupravy

Přidáno utěsnění destiček v soupravách

Oddíl 5: Reagencie a vybavení, které nejsou součástí dodávky

Aktualizovány specifikace 96jamkového termocykleru Teplota uchovávání souprav aktualizována na 2-28 oC Manipulace s nehydratovanými PCR destičkami a proužky Manipulace s hydratovanými PCR destičkami a proužky

Oddíl 8: Pokyny k použití

Ředění DNA sterilní vodou molekulární čistoty Přidána další rušivá látka a aktualizovány pokyny k čistotě DNA Aktualizováno měření OD260/280 Přidána poloha vymražených pelet před přidáním vzorku Přidány podmínky pro uchovávání amplifikovaného produktu Přidána poznámka o délce doby gelové elektroforézy

Oddíl 9: Interpretace

Poznámka o informacích týkajících se dané konkrétní šarže Číslo šarže soupravy musí souhlasit s číslem šarže interpretační tabulky.

Oddíl 11: Klinické údaje

Přidán celý oddíl

Oddíl 14: Historie revizí

Přidán celý oddíl

C

V

C


Strana 12 / 12

15. Vysvětlivky k používaným symbolům

X P i M V H : 4: s28 g

Počet testů Zástupce v zemích Evropského společenství Prostudujte si návod k použití Místo výroby Diagnostický prostředek in vitro Datum expirace Teplota uchovávání Číslo šarže Distributor Počet Global Trade Item

16. Kontaktní údaje výrobce Biofortuna Ltd 1 Hawkshead Road Croft Business Park Bromborough, CH62 3RJ, UK T: +44 (0) 151 334 0182 E: [email protected] W: www.biofortuna.com 17. Překlady FranÇaise: Deutsch: Español: Italiano: Česky: Danske: Έλληνες: Magyar: Norske: Polska: Português: Россию: Slovensky: Türk: Svenska:

Traductions disponibles Übersetzungen verfügbar Traducciones disponibles Traduzioni disponibili Překlady k dispozici Tilgængelige oversættelser διαθέσιμες μεταφράσεις Fordítások Oversettelser tilgjengelig Dostępne tłumaczenia Traduções disponíveis Переводы доступны Preklady k dispozícii Çeviriler mevcut Översättningar tillgängliga

www.biofortuna.com

C

V

C

Návod k použití pro soupravy Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kits CE revize 5, leden 2014

Recommend Documents