Návod k použití CRC RAScan Combination Kit

Návod k použití CRC RAScan™ Combination Kit Souprava SURVEYOR® Scan KRAS a NRAS Exons 2, 3 & 4 CE IVD

se systémy DHPLC

Tento návod k použití si důkladně přečtěte před použitím tohoto produktu. Uschovejte si tento návod k použití, abyste se k němu mohli v případě potřeby vrátit.

Tato stránka je úmyslně ponechána prázdná.

Obsah 1 Výrobce ......................................................................................................................... 3 2 Souprava CRC RAScan™ Combination Kit................................................................ 3 2.1 Použití ................................................................................................................................. 3 2.2 Indikace pro použití ............................................................................................................. 3 3 Principy testu pro detekci mutací CRC RAScan KRAS a NRAS ............................... 4 3.1 Geny KRAS a NRAS .............................................................................................................. 4 3.2 Analýza vzorků pacientů s použitím souprav SURVEYOR Scan ............................................. 4 3.3 Nukleáza SURVEYOR Nuclease ............................................................................................ 5 4 Původ kontrol v soupravě ........................................................................................... 6 5 Součásti ........................................................................................................................ 7 5.1 Krabice SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h 710107) ............................................ 7 5.2 Krabice SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h 710400) .......................................... 8 5.3 Počet vzorků, které lze testovat pomocí jedné soupravy ..................................................... 8 5.4 Sekvenování DNA ................................................................................................................ 9 6 Další požadované vybavení a reagencie .................................................................... 9 7 Příprava reagencií ........................................................................................................ 9 8 Skladování a doba použitelnosti ............................................................................... 10 9 Upozornění a preventivní opatření............................................................................ 10 10 Získání primárního vzorku, manipulace a uchovávání .......................................... 10 11 Postup testu ............................................................................................................. 11 11.1 Detekce somatických mutací s použitím souprav SURVEYOR Scan ‐ přehled ................... 11 12 Pokyny pro jednotlivé kroky .................................................................................... 12 12.1 POČÁTEČNÍ nastavení/kalibrace systému DHPLC ........................................................ 12 12.2 Před analýzou vzorků KRAS a NRAS ................................................................................. 12 12.3 Templát ........................................................................................................................... 12 12.4 Pracovní schéma ............................................................................................................. 12 12.5 Amplifikační protokol ...................................................................................................... 15 12.6 Program termocykleru pro amplifikační protokol ............................................................ 17 12.7 Kontrola kvality produktů PCR ......................................................................................... 18 12.8 Digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease .......................................................................... 18 13 Kontrolní postupy ................................................................................................... 20 13.1 Kontrola kvality soupravy CRC RAScan Combination Kit .................................................. 20 13.2 Použití kontrolních plasmidových DNA ............................................................................ 20 14 Interpretace výsledků............................................................................................... 21 14.1 Analýza KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4 pomocí nukleázy SURVEYOR Nuclease .................... 21 14.2 Kontrola výsledků SURVEYOR Scan .................................................................................. 21 14.3 Příklady výsledků ............................................................................................................. 22 15 Co je třeba dodržovat ............................................................................................... 29 15.1 Detekční hladina mutací získaných soupravou SURVEYOR Scan ...................................... 29 15.2 Potvrzení sekvence .......................................................................................................... 29 15.3 Omezení testu ................................................................................................................. 30 Příloha A ........................................................................................................................ 31 A.1 Návrh uspořádání destičky pro soupravy SURVEYOR Scan ................................................ 31 A.2 Označení na kontrolní DNA ............................................................................................... 31 A.3 Požadavky pro denaturaci v systému HPLC (DHPLC) ......................................................... 32 A.4 Uspořádání laboratoře pro testy PCR ................................................................................ 34 A.5 Odkazy na literaturu ......................................................................................................... 35 Příloha B ........................................................................................................................ 36 Pokyny pro řešení problémů ................................................................................................... 36 Podrobnosti pro objednávku ........................................................................................ 43 Kontaktní údaje ............................................................................................................. 43 Překlad Prohlášení ........................................................................................................ 43 Licence, obchodní známky a autorská práva.............................................................. 44

1 Výrobce

1 Výrobce

M

Výrobce Zástupce pro EU

P

Transgenomic, Inc. 12325 Emmet Street, Omaha, NE 68164, USA Tel: 1-402-452-5400 Transgenomic Limited 40 Watt Road, Hillington Park, Glasgow G52 4RY, UK Tel: +44-141-892-8800

2 Souprava CRC RAScan™ Combination Kit 2.1 Použití Pouze pro profesionální použití. Souprava od společnosti Transgenomic CRC RAScan Combination Kit tvoří diagnostický test in vitro, kterým se zjišťují somatické mutace v úsecích Exons 2, 3 a 4 genů KRAS a NRAS. Tyto mutace jsou indikovány píky, které jsou výsledkem štěpení enzymem SURVEYOR Nuclease a zahrnují mutace známé svým potenciálním klinickým významem. Tato souprava je určena pro použití v klinické diagnostické laboratoři příslušně školenými pracovníky provádějícími testování DNA extrahované z tkání zalitých v parafínu a fixovaných formalinem. Souprava je identifikována katalogovým číslem 710077. Tento návod k použití je k dispozici ke stažení na http://world.transgenomic.com/files/literature/482427-EN.pdf.

2.2 Indikace pro použití Kliničtí pracovníci mohou používat soupravu CRC RAScan Combination Kit se systémem DHPLC jako vodítko k rozhodnutí, zda nádor kolorektálního karcinomu pacienta nebude vykazovat odezvu vůči léčivům na bázi anti-EGFR (receptor pro epidermální růstový faktor), jako je panitumumab. Souprava CRC RAScan Combination Kit nesmí být používána k diagnóze kolorektálního ani jiného druhu karcinomu. Souprava CRC RAScan Combination Kit je testem používaným ke zjišťování možných somatických mutací v úsecích Exons 2, 3 a 4 genů KRAS a NRAS, avšak neumožňuje potvrzení identity sekvence mutace. K identifikaci přesné zjištěné mutace je třeba použít další analytickou metodu, jako je sekvenování DNA. Ačkoli výsledky analýzy získané těmito soupravami ukáží mutační stav pacienta, je třeba zvážit i další klinické faktory. Výsledky získané soupravou CRC RAScan Combination Kit nesmí být jedinou cestou k učinění rozhodnutí o léčbě pacienta s kolorektálním karcinomem. Je důležité mít na mysli, že použití systému DHPLC k identifikaci vzorků pozitivních na mutaci genů KRAS a/nebo NRAS lze brát pouze jako vodítko a všechny mutace musí být potvrzeny další analýzou, jako je např. sekvenování DNA.

Návod k použití soupravy CRC RAScan se systémy DHPLC

strana 3

3 Principy testu pro detekci mutací SURVEYOR Scan KRAS a NRAS

3 Principy testu pro detekci mutací CRC RAScan KRAS a NRAS 3.1 Geny KRAS a NRAS Léčivé přípravky cílící na receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR) prokázaly svoji účinnost vůči kolorektálnímu karcinomu. Výzkum ukázal, že přibližně 40 % kolorektálních nádorů obsahuje somatické mutace genu KRAS a klinické studie ukázaly, že mutace v úseku KRAS exon 2 (kodony 12 a 13) předpovídají nedostatečnou odezvu vůči léčbě cílené na EGFR. Poslední výzkumné studie ukázaly, že populaci pacientů lze dále specifikovat jako pacienty, jejichž metastazovaný nádor mCRC obsahuje další mutaci v úseku KRAS exony 3 a 4 a/nebo v úseku NRAS exony 2, 3 1-7 a 4 rovněž vykazoval tendenci k nedostatečné odezvě vůči léčbě cílené na EGFR . Tato souprava je určena k použití v diagnostické analýze somatických mutací v úseku KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4. Souprava CRC RAScan Combination Kit tvoří test pro zjišťování všech sekvenčních a malých inzerčních/delečních změn v Exons 2, 3 a 4 genů KRAS a NRAS. Mutace v kodonech 12, 13, 59, 61, 117 a 146 genů KRAS a NRAS souvisejí s nedostatečnou účinností přípravku panitumumab. Pro mutace v kodonech 12, 61, 117 a 146 jsou v této soupravě dodány kontroly Positive Control. V této soupravě je použita chráněná technologie společnosti Transgenomic s názvem SURVEYOR Nuclease, která spolu se systémem DHPLC poskytuje jednoduchou a citlivou detekci potenciálních mutací. Tato technologie může zjistit 2-5% směs mutantů na pozadí nezmutované DNA. Validační studie ukázaly extrémně vysokou konkordanci se sekvenováním kvalitně charakterizovaných vzorků kolorektálního karcinomu. Použití soupravy CRC RAScan Combination Kit sníží pro uživatele nároky na sekvenování a umožní zjištění sekvence, když software pro automatické sekvenování nezjistí přítomnost mutace nízké hladiny. Vzhledem vysoké citlivosti tohoto testu vůči Sangerově metodě sekvenování se doporučuje uspořádat laboratoř tak, aby se zabránilo příčné kontaminaci vzorků a kontrol. Ukázku optimálního uspořádání laboratoře naleznete v Příloze A.4 Uspořádání laboratoře pro testy PCR.

3.2 Analýza vzorků pacientů s použitím souprav SURVEYOR Scan Souprava CRC RAScan Combination Kit je určena pouze pro použití v rámci níže znázorněného pracovního schématu.

Pracovní schéma Vzorek pacienta

Test genů KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4

Záznam výsledku Obrázek 1 Pracovní schéma použití soupravy CRC RAScan Combination Kit ke screeningu genů KRAS a NRAS Návrh uspořádání 96jamkových destiček pro analýzu všech úseků KRAS and NRAS Exons 2-4 naleznete v příloze A.1 Uspořádání destiček v soupravě CRC RAScan Combination Kit


strana 4

3 Principy testu pro detekci mutací SURVEYOR Scan KRAS a NRAS

3.3 Nukleáza SURVEYOR Nuclease Nukleáza SURVEYOR Nuclease od společnosti Transgenomic je mismatch - specifická (specifická pro chybné párování) endonukleáza z rostlinné DNA, která skenuje známé i neznámé mutace a polymorfismy v heteroduplexní DNA8. Tento enzym štěpí s vysokou specificitou DNA v místech substituce báze chybným párováním a v místech jiných odchylek. Tato DNA endonukleáza štěpí oba řetězce heteroduplexu DNA na straně 3’ chybně párovaného místa. Rozpoznává se chybné párování vzniklé inzercí/delecí a substitucí bází, avšak účinnost štěpení se mění podle sekvence chybného párování. Obrázek 2. Obrázek 1. Mechanismus účinku nukleázy SURVEYOR Nuclease. Endonukleáza rozpoznává chybné párování a provádí štěpení na straně 3’ každé báze v chybném párování. Tím je štěpena dvoušroubovice DNA s přesahující jednou bází na konci 3’.

Nukleáza SURVEYOR Nuclease byla použita v širokém rozsahu situací pro přesnou detekci mutací a genetického polymorfismu. SURVEYOR Nuclease byla například použita k ověření přítomnosti známých mutací v řadě genů spojených s karcinomem ledvin, plic, hlavy a krku, s leukémií, endometriálním karcinomem a s předpovědí výsledku radioterapie9,10,11. Souprava CRC RAScan Combination Kit je určena pro štěpení chybných párování v genech KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4 před další analýzou v systému DHPLC. Poznámka: Je-li vzorek 100% mutantní DNA, nebudou se tvořit žádné heteroduplexy a vzorek se bude jevit jako Wild-Type. Avšak vzorky z biopsie nádoru budou obsahovat buňky typu WildType v důsledku heterogenity nádoru a/nebo kontaminace normální tkání; 5% a 95% mutantní DNA budou mít identické elektroferogramy. Poznámka: Pro část testu zahrnující PCR lze používat pouze polymerázu DNA Polymerase dodávanou v soupravě. Poznámka: Dodržujte konkrétní pokyny v příručce pro systém DHPLC. V zájmu úspěšného používání této soupravy důrazně doporučujeme, abyste si tuto příručku důkladně přečetli a pozorně postupovali podle pokynů a návodů v ní obsažených. Uživatelé pracující s touto soupravou poprvé by měli provést kontrolní experimenty uvedené v části Použití kontrolních plasmidových DNA. Máte-li další dotazy nebo potřebujete-li asistenci, zatelefonujte na číslo (888) 233-9283 (pouze pro severní Ameriku), +1 (402) 452-5400 nebo +44 (0) 141 892 8800 (Evropa) a požádejte o „KRAS a NRAS support“ (podporu pro KRAS a NRAS). Další možností je poslat nám e-mail na: [email protected]

Návod k použití soupravy CRC RAScan Combination Kit se systémy DHPLC

strana 5

4 Původ kontrol v soupravě

4 Původ kontrol v soupravě Kontroly dodávané s touto soupravou jsou plasmidové klony úseků KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4. Všechny klony byly sekvenovány, aby byla ověřena věrnost jejich sekvence ve srovnání s referenční NCBI Reference Sequence: NG_007524.1 (KRAS) a NG_007572 (NRAS). Kontroly mají genetickou „známku“. Viz Příloha A.2 Označení na kontrolní DNA; tyto varianty sekvencí KRAS nebo NRAS Wild-Type v úseku, kde se mutace nepředpokládají, lze použít k řešení problémů s kontaminací vzorků kontrolami Positive Control. Ukázku takové kontaminace ukazuje křivka SURVEYOR Scan v Příloze B - Pokyny pro řešení problémů, 8. Kontrola KRAS Control Wild-Type je zkonstruována syntézou a klonováním úseku KRAS Exons 2, 3 a 4 s použitím NCBI Reference Sequence NG_007524.1. Kontrola KRAS Positive Control exon 2 byla vytvořena syntézou sekvence KRAS Exon 2 s použitím výše uvedené referenční sekvence, avšak obsahující mutaci G12D. Sekvenováním DNA bylo potvrzeno, že jediná změna v sekvenci je v kodonu 12, a to změna GGT>GAT (mutace G12D). Tento klon je poté zkombinován s DNA KRAS Control Wild-Type za vytvoření heterozygotní kombinace. Kontrola KRAS Positive Control Exon 3 byla vytvořena syntézou sekvence KRAS Exon 3 s použitím výše referenční sekvence obsahující mutaci Q61H. Sekvenováním DNA bylo potvrzeno, že jediná změna v sekvenci je v kodonu 61, a to změna CAA>CAC (mutace Q61H). Tento klon je poté zkombinován s DNA KRAS Control Wild-Type za vytvoření heterozygotní kombinace. Kontrola „KRAS Positive Control Exon 4A“ byla vytvořena syntézou úseku KRAS Exon 4 s použitím výše uvedené reference, avšak obsahující mutaci K117N. Sekvenováním DNA bylo potvrzeno, že jediná změna v sekvenci je v kodonu 117, a to změna AAA>AAT (mutace K117N). Tento klon je poté zkombinován s DNA KRAS Control Wild-Type za vytvoření heterozygotní kombinace. Kontrola KRAS Positive Control Exon 4B byla vytvořena syntézou úseku KRAS Exon 4 s použitím výše uvedené referenční sekvence, avšak obsahující mutaci A146T. Sekvenováním DNA bylo potvrzeno, že jediná změna v sekvenci je v kodonu 146, a to změna GCA>ACA (mutace A146T). Tento klon je poté zkombinován s DNA KRAS Control Wild-Type za vytvoření heterozygotní kombinace. Kontrola NRAS Control Wild-Type je zkonstruována syntézou a klonováním úseku NRAS Exons 2, 3 a 4 s použitím NCBI Reference Sequence NG_007572. Kontrola NRAS Positive Control Exon 2 byla vytvořena syntézou sekvence NRAS Exon 2 s použitím výše referenční sekvence obsahující mutaci G12D. Sekvenováním DNA bylo potvrzeno, že jediná změna v sekvenci je v kodonu 12, a to změna GGT>GAT (mutace G12D). Tento klon je poté zkombinován s DNA NRAS Control Wild-Type za vytvoření heterozygotní směsi. Kontrola NRAS Positive Control Exon 3 byla vytvořena syntézou sekvence NRAS Exon 3 s použitím výše referenční sekvence obsahující mutaci Q61K. Sekvenováním DNA bylo potvrzeno, že jediná změna v sekvenci je v kodonu 61, a to změna CAA>AAA (mutace Q61K). Tento klon je poté zkombinován s DNA NRAS Control Wild-Type za vytvoření heterozygotní směsi. Kontrola NRAS Positive Control Exon 4 byla vytvořena syntézou sekvence NRAS Exon 4 s použitím výše referenční sekvence obsahující mutaci A146T. Sekvenováním DNA bylo potvrzeno, že jediná změna v sekvenci je v kodonu 146, a to změna GCC>ACC (mutace A146T). Tento klon je poté zkombinován s DNA NRAS Control Wild-Type za vytvoření heterozygotní směsi.


strana 6

5 Součásti

5 Součásti Souprava CRC RAScan Combination Kit se dodává ve dvou samostatných krabicích: (a) krabice reagencií pro analýzu úseku KRAS exony 2, 3 a 4 a (b) krabice reagencií pro analýzu úseku NRAS Exons 2, 3 a 4. Krabice společně obsahují dostatečné množství reagencií k provedení počtů analýz uvedených v části 5.3.

5.1 Krabice SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h 710107) Krabice s komponentami pro analýzu úseku KRAS Exons 2, 3 a 4 obsahuje dvě další krabice: (1) krabici s komponentami pro digesci SURVEYOR s 10 reagenčními zkumavkami a (2) složky pro PCR a kontroly s nosičem zkumavek obsahujícím 20 reagenčních zkumavek. Katalogové číslo

Komponenta

Barva víčka zkumavky

Objem pro 130 reakcí

růžová černá růžová hnědá červená

3 x 105 µl 2 x 105 µl 2 x 105 µl 2 x 105 µl 250 µl

čirá čirá čirá modrá modrá modrá modrá modrá modrá modrá modrá žlutá zelená zelená zelená zelená oranžová oranžová

2 x 100 µl 1 ml 2 x 500 µl 125 µl 125 µl 90 µl 90 µl 90 µl 90 µl 90 µl 90 µl 120 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 125 µl 125 µl

Krabice se složkami pro digesci SURVEYOR 710160 710161 708049 708027 708030

SURVEYOR Nuclease W SURVEYOR Enhancer W2 SURVEYOR Enhancer Cofactor 0.15 M MgCl2 Solution Stop Solution

Krabice se složkami pro PCR a s kontrolami 703310 703315 703065 710155F 710155R 710157F 710157R 710154F 710154R 710156F 710156R 710131 710135 710136 710137 710138 710153F 710153R

DNA Polymerase 10x DNA Polymerase Reaction Buffer dNTPs (10 mM) KRAS Primer: Exon 2 Forward (10 µM) KRAS Primer: Exon 2 Reverse (10 µM) KRAS Primer: Exon 3 Forward (10 µM) KRAS Primer: Exon 3 Reverse (10 µM) KRAS Primer: Exon 4A Forward (10 µM) KRAS Primer: Exon 4A Reverse (10 µM) KRAS Primer: Exon 4B Forward (10 µM) KRAS Primer: Exon 4B Reverse (10 µM) KRAS Control Wild-Type KRAS Positive Control Exon 2 KRAS Positive Control Exon 3 KRAS Positive Control Exon 4A KRAS Positive Control Exon 4B Universal Sequencing Primer 1 (10 µM) Universal Sequencing Primer 2 (10 µM)


strana 7

5 Součásti

5.2 Krabice SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h 710400) Krabice s komponentami pro analýzu úseku NRAS Exons 2, 3 a 4 obsahuje dvě další krabice: (1) krabici s komponentami pro digesci SURVEYOR s 10 reagenčními zkumavkami bez prázdných otvorů a (2) složky pro PCR a kontroly s nosičem zkumavek obsahujícím 14 reagenčních zkumavek. Katalogové číslo

Komponenta

Barva víčka zkumavky

Objem pro 100 reakcí

růžová černá růžová hnědá červená oranžová oranžová

2 x 105 µl 105 µl 105 µl 105 µl 250 µl 2 x 125 µl 2 x 125 µl

červená červená čirá čirá modrá modrá modrá modrá modrá modrá žlutá zelená zelená zelená

100 µl 20 µl 1 ml 500 µl 90 µl 90 µl 90 µl 90 µl 90 µl 90 µl 120 µl 40 µl 40 µl 40 µl

Krabice se složkami pro digesci SURVEYOR 710160 710161 708049 708027 708030 710153F 710153R

SURVEYOR Nuclease W SURVEYOR Enhancer W2 SURVEYOR Enhancer Cofactor 0.15 M MgCl2 Solution SURVEYOR Stop Solution Universal Sequencing Primer 1 (10 µM) Universal Sequencing Primer 2 (10 µM)

Krabice se složkami pro PCR a s kontrolami 703310 703312 703315 703065 710452F 710452R 710453F 710453R 710454F 710454R 710441 710442 710443 710444

DNA Polymerase (250 U) DNA Polymerase (50 U) DNA Polymerase 10X PCR Buffer dNTPs (10 mM) NRAS Primer Exon 2 Forward (10 µM) NRAS Primer Exon 2 Reverse (10 µM) NRAS Primer Exon 3 Forward (10 µM) NRAS Primer Exon 3 Reverse (10 µM) NRAS Primer Exon 4 Forward (10 µM) NRAS Primer Exon 4 Reverse (10 µM) NRAS Control Wild-Type Mix NRAS Positive Control Exon 2 NRAS Positive Control Exon 3 NRAS Positive Control Exon 4

5.3 Počet vzorků, které lze testovat pomocí jedné soupravy Souprava CRC RAScan Combination Kit je určena pro testování 230 reakcí. Celkový počet vzorků, které lze testovat pomocí soupravy, závisí na průměrné velikosti testované dávky vzorků, neboť v každé destičce s reakčními směsmi musí být zahrnuta jedna sada kontrolních reakcí (kontroly Wild-Type Control, Positive Control a kontroly bez templátu). Níže uvedená tabulka ukazuje počet vzorků, které lze analyzovat soupravou KRAS a NRAS v závislosti na průměrné velikosti dávky vzorků. To zahrnuje (a) 21 kontrol (7x Wild-Type, 7x Positive Control, 7x kontroly bez templátu) požadovaných pro každý běh a (b) limit 230 reakcí na jednu soupravu. Poznámka: Analyzuje-li se více destiček, musí být na každé destičce zahrnuta každá sestava z 21 výše uvedených kontrol. Proto pro dvě destičky je zapotřebí 42 kontrolních reakcí; pro 3 destičky je zapotřebí 63 kontrolních reakcí, atd.


strana 8

5 Součásti

Zvýší-li se velikost dávky vzorků, zvýší se tím i počet vzorků, které lze testovat pomocí jedné soupravy a tím se sníží průměrné náklady na reagencie vztažené na jeden vzorek. Níže uvedená tabulka slouží jako vodítko pro počet vzorků, které lze testovat pomocí souprav.

Počet kontrolních reakcí + Počet amplikonů vzorků

Počet vyžadovanýc h na jeden běh

Celkový počet běhů dávek vzorků na soupravu

Celkový počet vzorků testovaný ch jednou soupravo u

1

21 + 7

28

8

8

2

21 + 14

35

6

12

3

21 + 21

42

5

15

4

21 + 28

49

4

16

5

21 + 35

56

4

20

Velikost dávky vzorků

5.4 Sekvenování DNA Pro sekvenování DNA všech testovaných vzorků jsou k dispozici primery (PN 710153F a 710153R). Pro sekvenování je třeba používat amplikony PCR vytvořené před digescí nukleázou SURVEYOR Nuclease.

6 Další požadované vybavení a reagencie Další komponenty a vybavení potřebné k použití soupravy CRC RAScan Combination Kit se systémem DHPLC zahrnují následující: Systém DHPLC, kolona, pufry, velikostní standard DNA - viz Příloha A.3.1 Specifikace systému DHPLC pro aplikace SURVEYOR Scan, kde naleznete popis vhodného systému DHPLC pro použití s touto soupravou Voda jakosti pro molekulární biologii 0,2 ml zkumavky pro PCR, pásy nebo 96jamková destička Mikropipety Pipetové špičky Ledová lázeň Míchadlo vortex Mikrocentrifuga Termocykler Agarózové gely a zařízení pro elektroforézu v agarózovém gelu 10% chlornan nebo podobný čisticí přípravek

7 Příprava reagencií Všechny reagencie dodávané v soupravě jsou připravené k použití. Některé komponenty je nutné před použitím rozmrazit, zamíchat na vortexu a/nebo odstředit v mikrocentrifuze; příslušné podrobnosti naleznete v níže uvedeném postupu testování. Sloučením reagencií se získají výchozí směsi a reakční směsi; úplné podrobnosti jsou uvedené v níže popsaném postupu testování.


strana 9

8 Skladování a doba použitelnosti

8 Skladování a doba použitelnosti Souprava se skladuje až do použití při teplotě mezi –18 ºC a -25 °C v mrazáku s konstantní teplotou. Poznamenejte si datum použitelnosti u každé dodané soupravy. Po vypršení data použitelnosti soupravu nepoužívejte. Směs s nukleázou SURVEYOR Nuclease připravená v kroku 7 Digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease se musí použít okamžitě, neboť nukleáza SURVEYOR Nuclease W se v přítomnosti ostatních složek reakční směsi nukleázy SURVEYOR Nuclease během času deaktivuje.

9 Upozornění a preventivní opatření Žádná z reagencií v této soupravě není v dodaném množství nebezpečná pro lidské zdraví. Dokument společnosti Transgenomic pod číslem MSD-710077 lze stáhnout z http://world.transgenomic.com/files/literature/710077-EN.pdf Souprava neobsahuje žádné látky lidského nebo živočišného původu, které by mohly způsobit infekci. Tuto soupravu mohou používat pouze osoby, které jsou vyškolené v příslušných laboratorních metodách. Při práci s komponentami této soupravy vždy používejte laboratorní plášť, jednorázové rukavice a ochranu očí. Po použití soupravy zlikvidujte komponenty, jako je např. nemocniční odpad, v souladu s místními pravidly a předpisy. Alikvotní množství reagencií odpipetovaná ze zkumavek v soupravě jsou určená pouze pro jedno použití. Komponenty soupravy zůstávají stabilní i po 25 cyklech zmrazení-rozmrazení. Po překročení tohoto počtu cyklů zmrazení-rozmrazení soupravu nepoužívejte.

10 Získání primárního vzorku, manipulace a uchovávání Souprava CRC RAScan Combination Kit je validována pro použití s DNA extrahovanou ze vzorků nádorů kolorektálního karcinomu zalitých v parafínu a fixovaných formalinem (FFPE). V zájmu optimální extrakce DNA je třeba tkáň 14-24 hodin před zalitím v parafinu fixovat ve formalinu. Biopsie z nádorů jsou heterogenní směsi nádorových a nenádorových buněk. Nádor samotný je navíc heterogenní směsí národových buněk s mutacemi a nádorových buněk bez mutací. Vzhledem k tomu, že tyto somatické mutace nemusí být rozptýleny v nádoru rovnoměrně, mohou být výsledné analýzy mutací z různých částí stejného nádoru různé. Aby se zvýšila pravděpodobnost detekce mutace, je třeba izolovat DNA z nádorové části tkáně oddělením pouze nádorové části ze sklíčka pomocí čerstvě sterilizovaného skalpelu pro každé nové sklíčko. V zájmu úspěšného použití této soupravy musí extrahovaná DNA splňovat kritéria v části Templát. POZNÁMKA: Extrahované vzorky DNA neurčené k okamžité analýze touto soupravou je třeba uchovávat zmrazené při teplotě od -20 ºC do -80 ºC.


strana 10

11 Postup testu

11 Postup testu 11.1 Detekce somatických mutací s použitím souprav SURVEYOR Scan přehled Detekce mutace a potvrzení nukleázou SURVEYOR Nuclease zahrnuje tři kroky:

. Krok 1 - Připravte amplikony PCR z mutantní (testované) a normální (referenční) DNA, v návaznosti na konečný amplifikační cyklus PCR rozpusťte veškeré dvoušroubovice a poté pomalu ochlazujte, čímž dojde k optimalizované tvorbě heteroduplexů a homoduplexů (heteroduplexy se tvoří, když jeden řetězec se sekvencí Wild-Type se spáruje s jedním řetězcem mutantní sekvence). Krok 2 - Aplikujte na směs spárovaných heteroduplexů/homoduplexů nukleázu SURVEYOR Nuclease. SURVEYOR Nuclease rozštěpí oba dva řetězce heteroduplexní DNA za vzniku fragmentů DNA. DNA Control Wild-Type, vystavená obdobnému postupu, slouží jako kontrola na pozadí. Krok 3 - Proveďte analýzu fragmentů DNA v systému DHPLC. Tvorba nových produktů štěpení je v důsledku jednoho nebo více chybných párování indikována přítomností dodatečných chromatografických píků. Migrační časy produktů štěpení indikují velikost fragmentů a tím i přibližné umístění chybného nebo více chybných párování.


strana 11

12 Pokyny pro jednotlivé kroky

12 Pokyny pro jednotlivé kroky 12.1 POČÁTEČNÍ nastavení/kalibrace systému DHPLC Při přípravě destičky SURVEYOR Nuclease pro analýzu v DHPLC se obraťte na Přílohu A.3 Požadavky pro denaturaci v systému HPLC (DHPLC).

12.2 Před analýzou vzorků KRAS a NRAS Před analýzou vzorků v systému DHPLC se musí provést běh s velikostním standardem DNA, aby se ověřila správná funkce systému. Před analýzou musí laboratorní pracovník používající přístroj zkontrolovat kvalitu rozlišení velikostního standardu DNA.

12.3 Templát 1. U izolované templátové FFPE DNA proveďte pomocí běžných laboratorních postupů kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení extrahované DNA, aby bylo jisté, že je k dispozici dostatečné množství templátu pro PCR. 2. Poměr absorbance 260/280 musí být >1,80. 3. Pro optimální nastavení PCR musí být pracovní koncentrace templátu přibližně 12,5 ng/µl. Je-li třeba, zřeďte templátovou DNA ve vodě o jakosti pro molekulární biologii.

12.4 Pracovní schéma Souprava umožňuje analýzu 130 reakcí. Lze analyzovat i menší dávky vzorků, avšak s každou dávkou vzorků musí být zahrnuty kontroly ze soupravy i kontrola bez templátu. Souprava obsahuje dostatečný materiál pro kontrolu 130 reakcí všech kombinací používaných velikostí dávek vzorků. Zpracování vzorků musí být všeobecně prováděno od zahájení až do konce podle popisu v tomto návodu k použití. Musí-li být před dokončením celého postupu zpracování vzorku zastaveno, je nutné DNA uložit do -20 °C, jak je ukázáno. Avšak zmrazené vzorky nemají být vystavovány opakovanému zmrazování a rozmrazování a zmrazená DNA amplifikovaná pomocí PCR ani produkty digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease nemají být skladovány při teplotě od -18 do 25 °C po delší dobu (>1 týden). Analýza vzorků se provádí podle níže znázorněného pracovního schématu:


strana 12


Oddělení tkáně

1

Izolace DNA a PCR

2

Gelová elektroforéza 3

Vyhodnocení robustní/slabá PCR 4

5

Neúspěšný SURVEYOR Scan

SURVEYOR Nuclease a analýza v DHPLC

SURVEYOR Scan Pozitivní

SURVEYOR Scan Negativní 6

7

NVD (varianta nedetekována)

Potvrzení sekvence

8

Kvalita sekvence neúspěšná

Kvalita sekvence prošla 9

Mutace v kodonech G12, G13, A59, Q61, K117 nebo A146

NVD

Obrázek 3: Pracovní schéma analýzy se soupravou CRC RAScan Combination Kit


strana 13


Poznámky k obr. 3 1. DNA izolujte z FFPE (tkáň zalitá v parafínu a fixovaná formalinem) podle standardních laboratorních postupů. 2. Proveďte PCR a ověřte kvalitu DNA gelovou elektroforézou., 3. Vyhodnoťte a proveďte záznam, zda je proužek PCR Robustní (≥20 ng/µl) nebo Slabý (<20 ng/µl). Dojde-li k vytvoření více proužků PCR, připravte čerstvou genomickou DNA z FFPE. 4. U vzorků vyhodnocených po amplifikaci pomocí PCR buď jako Robustní PCR nebo Slabá PCR proveďte krok s nukleázou SURVEYOR Nuclease a analýzu v systému DHPLC. Se slabou PCR může být množství DNA k získání smysluplných výsledků systémem DHPLC nedostatečné, avšak může být dostatečné pro sekvenování. 5. Viz Příloha B – Pokyny k řešení problémů, kde naleznete příklady neúspěšných výsledků ze SURVEYOR Scan. Všechny vzorky s neúspěšným výsledkem ze SURVEYOR Scan musí být znovu zpracovány jedním z následujících způsobů: a. opakování PCR, zbývá-li dostatečné množství genomické DNA b. nová extrakce DNA z FFPE; to by měla být až sekundární volba, neboť obvykle není žádoucí řezat další blok FFPE. c.

použije-li se další řez nebo blok, musí být celý test znovu opakován, neboť vzhledem k heterogenní povaze nádoru může dojít k odchylkám při digesci.

6. Nejsou-li žádné viditelné píky v důsledku štěpení, zaznamenejte si negativní výsledek ze SURVEYOR Scan, tj. NVD = varianta nedetekována. 7. Ukazuje-li vzorek produkty štěpení enzymem SURVEYOR Nuclease (neshodující se s příslušnou kontrolou Wild-Type Control), je třeba je předat k ověření sekvenováním. 8. Je-li ověřovací analýza sekvence nevyhovující, poté zvolte jeden z následujících kroků: a. opakujte PCR, zbývá-li dostatečné množství genomické DNA b. proveďte novou extrakci DNA z FFPE; to by měla být až sekundární volba, neboť obvykle není žádoucí oddělovat další řezy z bloku FFPE. 9. Je-li ověřovací analýza sekvence vyhovující, potom výsledky znamenají jedno z následujícího: a. Sekvence Wild-Type, tzn. varianta nedetekována (NVD); nebo b. Varianta detekována. Ukazuje-li ověření sekvence jakoukoli změnu báze s výsledkem změny aminokyseliny v: i. kodonech 12 nebo 13 ii. kodonech 59 nebo 61 iii. kodonu 117; nebo iv. kodonu 146 vyhodnoťte jako pozitivní mutaci v KRAS o/nebo NRAS. Poznámka: je možné získat pozitivní výsledek ze SURVEYOR Scan, který bude sekvenováním zároveň potvrzen jako „varianta nedetekována“. Hladina detekce (LOD) pro SURVEYOR Nuclease v systému DHPLC je pro některé mutace 2% mutantů v 98% typu Wild-Type, zatímco hodnota LOD sekvenování je přibližně 10-25% mutantů v 90-75% typu Wild-Type. Pozn: Je-li vzorek 100% mutantní DNA, nebudou se tvořit žádné heteroduplexy a vzorek se bude jevit jako Wild-Type. Avšak vzorky z biopsie nádoru budou obsahovat buňky typu Wild-Type v důsledku heterogenity nádoru a/nebo kontaminace normální tkání. Poznámka: vzorky s 5% a 95% mutantní DNA budou mít identické elektroferogramy.


strana 14


Poznámka: pozitivní výsledky SURVEYOR Scan lze získat i v důsledku jiných změn bází než jsou ty, které aktivují geny KRAS a/nebo NRAS. Tyto mutace jsou sice vzácné, avšak je nutné potvrzení další metodou, jako je např. sekvenování DNA, aby se určilo, zda pozitivní výsledek ze SURVEYOR Scan je či není KRAS a/nebo NRAS aktivující mutací. Pozn: proces fixace ve formalinu, požívaný při přípravě FFPE, může vést k deaminaci cytosinů. Během této deaminace se cytosin převádí na uracil. Polymeráza bude detekovat tento uracil jako thymin a začlení do kopírovaných řetězců adenin. To může být považováno za mutaci, při které se normální G nahrazuje za A s výsledkem mutace GC na AT, což je uměle vytvořená mutace, nikoli skutečná somatická mutace. Jedná se o vzácné případy, avšak dojde-li k brzkému kopírování při cyklování PCR, mohou být považovány za mutace. Při duplikované analýze se neopakují. Příklady potenciálních mutací vyvolaných deaminací cytosinu, které by byly zvažovány při rozhodování o léčbě pacienta, jsou v případě KRAS: -

Kodon 12: AGT (G12S) a GAT (G12D)

-

Kodon 13: AGC (G13S), GAC (G13D) a GGT (G13G, tichá mutace)

-

Kodon 146: GCA>ACA (A146T)

Příklady potenciálních mutací vyvolaných deaminací cytosinu, které by byly zvažovány při rozhodování o léčbě pacienta, jsou v případě NRAS: -

Kodon 12: GGT> AGT (G12S) nebo GAT (G12D)

-

Kodon 13: GGT> AGT (G13S), GAT (G13D) nebo GGC (G13G, tichá mutace)

-

Kodon 146: GCC>ACC (A146T)

Proto se doporučuje ověřit takové mutace duplikovanou analýzou stejné genomické DNA nebo podrobením všech vzorků duplikované analýze od začátku analýzy.

12.5 Amplifikační protokol 1. K dispozici jsou předmíchané roztoky dNTP od Transgenomic (PN 703065 a 705020) s celkovou pracovní koncentrací deoxynukleotidů 10 mM (2,5 mM na každý ze čtyř deoxynukleotidů). 2. Primery KRAS a NRAS Forward a Reverse PCR (KRAS PN 710155F/R, 710157F/R, 710154F/R a 710156F/R; NRAS PN 710452F/R, 710453F/R a 710454F/R) se dodávají o koncentraci 10 µM. 3. Vyjměte 10µM primery, 10mM dNTP a pufr DNA Polymerase 10X PCR Buffer (PN 703315) z mrazáku a nechte rozmrazit na ledu. 4. Po rozmrazení důkladně promíchejte všechny složky soupravy na vortexu (~10 sekund), krátce odstřeďte (~10 sekund), aby na víčkách zkumavek nezůstala žádná kapalina, a umístěte do ledu. 5. Na ledu připravte výchozí směsi. 6. Podle následující tabulky jako vodítka připravte výchozí směs pro každou z reakcí: KRAS Exon 2, KRAS Exon 3, KRAS Exon 4A, KRAS Exon 4B, NRAS Exon 2, NRAS Exon 3 a NRAS Exon 4: Počet reakcí (7 vzorků + 3 kontroly):

10

Výpočet objemu: Objem vody (µl) DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µl) dNTP (µl) Forward Primer (µl) Forward Primer (µl) DNA Polymerase (µl)

330** 50 40 25 25 10

Celkový objem výchozí směsi


48,0

strana 15


**Poznámka: Je třeba dosáhnout minimálního množství 25 ng DNA na 50 µl reakční směsi PCR. Je-li koncentrace extrahované DNA nižší než 12,5 ng/µl, zvyšte úměrně objem extrahované DNA, abyste zajistili množství 25 ng na reakční směs. Rovněž snižte odpovídajícím způsobem objem vody ve výchozích směsích, abyste získali 50 µl na reakční směs. Ve všech vzorcích připravených s použitím těchto výchozích směsí bude muset být extrahovaná DNA naředěna na přibližně stejnou nejnižší hladinu koncentrace. Nedoporučuje se používat extrahovanou DNA o koncentraci <5 ng/µl. 7.

Pro každou výchozí směs vypočítejte požadované objemy s použitím výše uvedené tabulky a dbejte na následující: (a) Pro výchozí směs 1 KRAS Exon 2 se vyžadují tři další reakce na jednu destičku se vzorky: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 2 a kontrola KRAS Exon 2 bez templátu (NTC1). (b) Pro výchozí směs 2, KRAS Exon 3, se vyžadují tři další reakce na jednu destičku se vzorky: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 3 a kontrola KRAS Exon 3 bez templátu (NTC2). (c) Pro výchozí směs 3 KRAS Exon 4Ase vyžadují tři další reakce na jednu destičku se vzorky: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 4A a kontrola KRAS Exon 4A bez templátu (NTC3). (d) Pro výchozí směs 4 KRAS Exon 4B se vyžadují tři další reakce na jednu destičku se vzorky: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 4B a kontrola KRAS Exon 4B bez templátu (NTC4). (e) Pro výchozí směs 5, NRAS Exon 2 budou zapotřebí do destičky se vzorky tři další reakce pro kontroly NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 2 a kontrolu NRAS Exon 2 bez templátu (NTC5). (f) Pro výchozí směs 6, NRAS Exon 3 budou zapotřebí do destičky se vzorky tři další reakce pro kontroly NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 2 a kontrolu NRAS Exon 3 bez templátu (NTC6). (g) Pro výchozí směs 7, NRAS Exon 4 budou zapotřebí do destičky se vzorky tři další reakce pro kontroly NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 2 a kontrolu NRAS Exon 4 bez templátu (NTC7). Poznámka: vezměte na vědomí, že bude zapotřebí poněkud větší objem výchozí směsi, aby se tak kompenzovaly ztráty během pipetování.

8. Označte 0,2ml zkumavky pro PCR a/nebo jamky na 96jamkové destičce údajem příslušného vzorku. 9. Označte 2,0ml centrifugační zkumavky pro přípravu výchozí směsi. 10. Přidejte do 2,0ml centrifugačních zkumavek s označením „Výchozí směs“ požadovaný objem vody o jakosti pro molekulární biologii. 11. Přidejte do zkumavek s výchozí směsí požadované množství pufru DNA Polymerase 10X PCR Buffer . 12. Přidejte do zkumavek s výchozí směsí požadovaný objem 10mM nukleotidů dNTP. 13. Přidejte do příslušných zkumavek s výchozí směsí požadovaný objem primerů KRAS a/nebo NRAS Forward Primer. 14. Přidejte do příslušných zkumavek s výchozí směsí požadovaný objem primerů KRAS a/nebo NRAS Reverse Primer. 15. Vyjměte enzym DNA Polymerase (PN 703310) z mrazáku. 16. Odstřeďte enzym DNA Polymerase přibližně 10 sek. 17. Zamíchejte enzym DNA Polymerase na vortexu přibližně 10 sek. 18. Přidejte požadovaný objem polymerázy DNA Polymerase do zkumavek s výchozí směsí. 19. Zavřete zkumavky s výchozí směsí víčkem.


strana 16


20. Před použitím zkumavky s výchozí směsí zamíchejte na vortexu přibližně 30 sek. a poté krátce odstřeďte přibližně 10 sek. 21. Až do použití uložte do ledu. 22. Odpipetujte 48,0 µl (viz poznámka v kroku 6 výše) výchozí směsi do příslušných jamek; používáte-li jednokanálovou pipetu, vyměňujte špičky pipety mezi jednotlivými jamkami. Používáte-li opakovací pipetu, nesmí mezi jamkami docházet k úniku nebo rozstřiku. Uložte destičku na led. 23. Do příslušných jamek přidejte 2,0 µl (viz poznámka výše v kroku 6) templátové DNA ze všech vzorků nebo vodu (kontrola bez templátu, NTC). Pro každý vzorek použijte novou pipetovou špičku; snažte se zabránit kontaminaci mezi vzorky v důsledku rozstřikování. Zakryjte jamky obsahující DNA ze vzorků a NTC pásem s 8 kryty (používáte-li 96jamkovou destičku) a/nebo uzavřete 0,2ml zkumavky pro PCR. Zkontrolujte, že kryty jsou bezpečně utěsněny. 24. Až poté postupně otevřete kontroly s templátovou DNA ze souprav (PN 710131, 710135, 710136, 710137, 710138, 710441, 710442, 710443 a 710444). Nakonec odpipetujte 2,0 µl z každého kontrolního templátu, aby se zminimalizovala možnost kontaminace vzorků DNA. Znovu zakryjte každou jamku pásem s 8 kryty (používáte-li 96-jamkovou desku) a/nebo uzavřete 0,2ml zkumavky pro PCR. Zkontrolujte, že kryty jsou bezpečně utěsněny. POZNÁMKA: Správnou praxí je umístit kontroly bez templátu (NTC) do jamek, které nesousedí s kontrolou Positive Control ani se vzorky. POZNÁMKA: Návrh uspořádání 96jamkových destiček pro analýzu všech úseků KRAS and NRAS exony 2-4 naleznete v Příloze A.1 Uspořádání destiček v soupravách SURVEYOR Scan. 25. Zamíchejte na vortexu 10 sek. (při přibližně poloviční rychlosti). 26. Odstřeďte 1-2 minuty, aby se všechny roztoky shromáždily na dně jamek a/nebo zkumavek. Přesvědčte se, že roztoky jsou na dně každé jamky a/nebo zkumavky. Pokud tomu tak není, odstřeďte znovu.

12.6 Program termocykleru pro amplifikační protokol 1. Pro amplifikaci PCR a tvorbu heteroduplexů použijte následující protokol pro termocykler:

15 cyklů

30 cyklů

1 cyklus

Počáteční denaturace 95 C „Touchdown“ amplifikace 95 C 62 C, -0,5 ºC/cyklus 72 C Amplifikace 95 C 55 C 72 C Konečné prodloužení 72 C Tvorba heteroduplexů 95 ºC 12 C


5 minut 30 sekund 30 sekund 25 sekund 30 sekund 30 sekund 25 sekund 2 minuty 2 minuty Ponechat

strana 17


12.7 Kontrola kvality produktů PCR 1. Před digescí nukleázou SURVEYOR Nuclease se doporučuje zkontrolovat kvalitu a množství amplikonů gelovou elektroforézou (nebo jí ekvivalentním způsobem). 2. Proveďte analýzu alikvotního podílu produktu PCR s různým množstvím hmotnostního žebříčku 100-bp DNA. 3. S použitím žebříčku proveďte odhad koncentrace amplifikované DNA. 4. Měl by být zřetelný pouze jediný proužek >20 ng/µl odpovídající hlavnímu produktu PCR. 5. Je-li přítomno více proužků, zkontrolujte, že byla dostačující kvalita vstupní templátové DNA (viz Příloha B – Pokyny k řešení problémů). 6. Není-li přítomen žádný produkt, zkontrolujte, že byla dostačující kvalita vstupní templátové DNA (viz Příloha B – Pokyny k řešení problémů). Splňuje-li kvalita požadované specifikace, zvyšte objem templátu na 4,0 µl/ 50µl reakci (snižte množství vody na reakci na 31,0 µl). 7. V kontrolním vzorku bez templátu by neměly být viditelné žádné produkty PCR. Jsou-li v této kontrole produkty DNA zřetelné, je pravděpodobná kontaminace; viz Příloha B – Pokyny k řešení problémů. 8. Vyhodnoťte, zda PCR je robustní nebo slabá. a. Robustní PCR se projevuje jedním proužkem > 20 ng/µl. b. Slabá PCR se projevuje jedním proužkem < 20 ng/µl. c.

Pro obě vyhodnocení, robustní i slabou PCR, přejděte k digesci nukleázou SURVEYOR Nuclease.

RADA: v této fázi mohou být produkty PCR skladovány při teplotě < -20 ºC až 1 týden.

12.8 Digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease 1. Je-li PCR vzorku o dostatečné kvalitě a množství, proveďte digestivní reakci s nukleázou SURVEYOR Nuclease podle níže uvedeného popisu. K optimální digesci enzymem SURVEYOR Nuclease je zapotřebí vzorek o koncentraci >40 ng/µl. 2. Rozmrazte na ledu zkumavky obsahující roztok 0.15 M MgCl2 Solution a SURVEYOR Enhancer Cofactor 3. Do nové 0,2ml zkumavky pro PCR a/nebo do jamky v 96 jamkové destičce přidejte 10,0 µl z každého vzorku amplifikovaného pomocí PCR. 4. Připravte čerstvou směs z následujícího: roztok 0,15 M MgCl2 Solution, SURVEYOR Enhancer Cofactor, SURVEYOR Enhancer W2 a SURVEYOR Nuclease W (směs SURVEYOR Nuclease). Použijte následující tabulku jako vodítko pro přípravu výchozí směsi pro digesci nukleázou SURVEYOR Nuclease k analýze více vzorků. Níže uvedený příklad představuje objem výchozí směsi pro 10 vzorků.


strana 18


Vezměte na vědomí, že bude zapotřebí mírně větší objem výchozí směsi než je tento výpočet, aby se tak kompenzovaly ztráty během pipetování. Počet digestivních reakcí s nukleázou SURVEYOR Nuclease: Výpočet objemu: 0.15 M MgCl2 Solution (µl) SURVEYOR Enhancer Cofactor (µl) SURVEYOR Enhancer W2 (µl) SURVEYOR Nuclease W (µl) Celkový objem výchozí směsi: Přidejte 5 µl výchozí směsi SURVEYOR Nuclease do vzorku amplifikovaného pomocí PCR (µl) Celkový objem digestivní reakce s nukleázou SURVEYOR Nuclease:

10 10,0 10,0 10,0 20,0 50,0 10,0 15,0

a. Před použitím každou reagencii odstřeďte. b. Před pipetováním každou reagencii mírně promíchejte na vortexu; po každém promíchání krátce odstřeďte asi 10 sekund. c.

Pro každou digesci přidejte do 0,2 ml (nebo větší) mikrocentrifugační zkumavky pro PCR následující komponenty. 1,0 µl 0.15 M MgCl2 Solution (PN 708027) 1,0 µl SURVEYOR Enhancer Cofactor (PN 708049) 1,0 µl SURVEYOR Enhancer W2 (PN 710161) 2,.0 µl SURVEYOR Nuclease W (PN 710160) A/nebo přidejte 5 µl výchozí směsi připravené podle výše uvedené tabulky.

5. Mírně zamíchejte výchozí směs pro digesci se SURVEYOR Nuclease na vortexu po dobu 10 sek. při nízké rychlosti. 6. Mírně odstřeďte výchozí směs pro digesci se SURVEYOR Nuclease po dobu 10 sek. při nízké rychlosti. 7. Uložte výchozí směs pro digesci se SURVEYOR Nuclease do ledu, dokud ji nepoužijete. Poznámka: Výchozí směs pro digesci nukleázou SURVEYOR Nuclease připravená v kroku 7 musí být použita okamžitě, neboť u enzymu SURVEYOR Nuclease W dochází za přítomnosti ostatních složek této reakční směsi SURVEYOR Nuclease k jeho deaktivaci. 8. Odpipetujte 5,0µl alikvotní podíl výchozí směsi pro digesci se SURVEYOR Nuclease do každé zkumavky a/nebo jamky obsahující 10,0µl alikvotní podíl amplifikovaného produktu PCR (viz krok 3 výše). 9. Po dokončení pipetování odstřeďte 0,2ml zkumavky PCR nebo 96jamkovou destičku po dobu 10 sek. 10. Mírně zamíchejte na vortexu 0,2ml zkumavky PCR a/nebo 96jamkovou destičku se vzorky po dobu 10 sek. 11. Odstřeďte po dobu 10 sekund při nízké rychlosti (tento krok je velmi důležitý, je-li digesce prováděna v přístroji bez zahřívaného krytu). 12. Inkubujte při teplotě 42 °C po dobu 30 min. 13. Do každé zkumavky nebo jamky přidejte 1,0 µl roztoku SURVEYOR Stop Solution (PN 708030) a mírně zamíchejte na vortexu (celkový reakční objem s nukleázou SURVEYOR Nuclease je 16,0 µl). RADA: Produkty digesce SURVEYOR lze uchovávat po dobu až jednoho týdne při teplotě ≤ -20 ºC. 14. Umístěte digestované vzorky do systému DHPLC.


strana 19


Poznámka: Navrhované nastavení gradientu v systému DHPLC pro analýzu produktů digesce enzymem SURVEYOR Nuclease naleznete na http://world.transgenomic.com/diagnostictools/genetic-analysis-kits/crc-rascan-kits-eu/dhplcsystemsettings.

13 Kontrolní postupy 13.1 Kontrola kvality soupravy CRC RAScan Combination Kit Souprava obsahuje kontrolní plasmidovou DNA pro provádění kontroly kvality během specifických kroků testu. V Amplifikačním protokolu se pomocí těchto kontrol ověřuje, zda jsou výchozí směsi správně připraveny a zda amplifikace probíhá správně. Vyžaduje se používat i kontroly bez templátu (s vodou místo templátové DNA), aby se tak mohla zjistit možná kontaminace složek souprav jakýmkoli cizorodým templátem DNA. Během kroku digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease umožňují amplikony z kontrolní plasmidové DNA účinnou kontrolu, zda podmínky při štěpící reakci (příprava výchozí směsi pro digesci enzymem SURVEYOR Nuclease a podmínky inkubace) byly uspokojivé. Ve fázi analýzy poskytují elektroferogramy digestovaných kontrolních amplikonů nukleázou SURVEYOR Nuclease v systému DHPLC vodítko, zda se píky produktů digesce odpovídající těmto mutacím v úseku KRAS and NRAS Exons 2, 3 a 4 budou eluovat i při nízké hladině (viz obr. 4-10). Píky produktů štěpení odpovídající jiným mutacím v úseku KRAS a/nebo NRAS Exons 2, 3 a 4 se mohou eluovat v mírně odlišných pozicích. Pokud amplikony PCR neodpovídají výsledkům uvedeným v části Kontrola kvality produktů PCR, obraťte se na Přílohu B - Pokyny pro řešení problémů nebo kontaktujte technickou podporu společnosti Transgenomic, než přejdete k dalším krokům analýzy vzorků.

13.2 Použití kontrolních plasmidových DNA Součástí soupravy je devět kontrolních DNA: KRAS Control Wild-Type; PN 710131 KRAS Positive Control Exon 2; PN 710135 KRAS Positive Control Exon 3; PN 710136 KRAS Positive Control Exon 4A; PN 710137 KRAS Positive Control Exon 4B; PN 710138 NRAS Control Wild-Type; PN 710441 NRAS Positive Control Exon 2; PN 710442 NRAS Positive Control Exon 3; PN 710443 NRAS Positive Control Exon 4; PN 710444 Tyto kontrolní DNA jsou plasmidy s inzerty. Každá kontrola Positive Control obsahuje dva plasmidy: směs KRAS a/nebo NRAS Control Wild-Type a mutační klon odlišující se od typu Wild5 Type v jediném páru bází. Kontroly se dodávají v samostatných lahvičkách o koncentraci 10 kopií/µl. KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4 a primery PCR Forward a Reverse pro amplifikaci pomocí PCR se dodávají v soupravách samostatně. Při používání těchto kontrol dodržujte pokyny uvedené v částech Amplifikační protokol, Digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease a Analýza KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4 pomocí nukleázy SURVEYOR Nuclease. PŘI PRVNÍM POUŽITÍ SOUPRAVY DŮRAZNĚ DOPORUČUJEME PROVÉST PŘED TESTOVÁNÍM GENOMICKÝCH VZORKŮ NEJPRVE EXPERIMENTY SE SAMOTNÝMI KONTROLAMI


strana 20

14 Interpretace výsledků

14 Interpretace výsledků 14.1 Analýza KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4 pomocí nukleázy SURVEYOR Nuclease Pro účely porovnání a kontroly VŽDY proveďte digesci enzymem SURVEYOR Nuclease u každé kontroly (Wild-Type a Positive Control) a u kontroly bez templátu (NTC), u DNA vzorků a analyzujte je na stejné destičce pro vzorky v systému DHPLC. Během kroku digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease umožňují amplikony z těchto kontrolních plazmidových DNA účinnou kontrolu, zda podmínky při štěpící reakci (příprava směsi SURVEYOR Nuclease a podmínky inkubace) byly uspokojivé. Ve fázi analýzy umožňují křivky digestovaných kontrolních amplikonů nukleázou SURVEYOR Nuclease v systému DHPLC vodítko, kde dojde k eluci fragmentů DNA vzniklých štěpením v místech specifických mutací v důsledku chybného párování, a to i při jejich nízké koncentraci (viz obr. 4-10). Pokud ani amplikony PCR ani fragmenty štěpení nukleázou SURVEYOR Nuclease odvozené z kontrolní DNA neodpovídají uvedeným výsledkům, obraťte se na Přílohu B - Pokyny pro řešení problémů nebo kontaktujte technickou podporuTransgenomic, než přejdete k dalším krokům analýzy vzorků. Níže uvedené ukázky jsou pouze pro účely ilustrace a NEJSOU určeny pro stanovení identity jakékoli konkrétní mutace. Potvrzení identity mutace je nutné, aby se jednoznačně stanovila přítomnost specifické záměny bází v Exons 2, 3 a 4 genů KRAS a NRAS. Enzym SURVEYOR Nuclease štěpí ve všech místech chybného párování vzniklých v důsledku tvorby heteroduplexů mezi typem Wild-Type a mutovanou DNA, nikoli pouze v mutacích v Exons 2, 3 a 4. Enzym SURVEYOR Nuclease umožňuje potvrzení přítomnosti chybného párování. Identita změny bází specifická pro danou mutaci se požaduje ke stanovení KRAS a NRASaktivujícího stavu a musí být ověřena jiným způsobem, např. sekvenováním.

14.2 Kontrola výsledků SURVEYOR Scan Prohlédněte chromatogramy a porovnejte náležející kontrolám Wild-Type a Positive Control s chromatogramem vzorku. Určete, zda chromatogram vzorku je svým charakterem podobný nebo odlišný od kontroly Wild-Type. Je-li odlišný, potom vzorek je „Pozitivní SURVEYOR Scan“ a bude předán k analýze DNA sekvenováním. Příklady ukazují obr. 4-10 a příklady takových vzorků ukazuje Příloha B – Pokyny pro řešení problémů, 7 a 8. Každý vzorek s charakterem SURVEYOR Nuclease odlišným od Wild-Type by měl být předán k ověření sekvence, i když není identický s kontrolou Positive Control. Viz příklad takového vzorku v Příloze B – Pokyny pro řešení problémů, 7. Je-li třeba, zvětšete zkoumanou oblast a překryjte chromatogram vzorku chromatogramem kontroly Wild-Type Control pro daný amplikon. Pozorujte rozdíly mezi kontrolou Wild-Type Control a analyzovaným vzorkem. Důležité! Po důkladném prozkoumání každého vzorku vyhodnocující ověří, zda sousedící vzorky v analytické destičce mají identické pozitivní výsledky SURVEYOR Scan. Vyskytují-li se identické pozitivní výsledky, mohou být důsledkem příčné kontaminace mezi vzorky nebo kontrolami a analýza se musí zopakovat.


strana 21


14.3 Příklady výsledků Příklady výsledků získaných pomocí soupravy CRC RAScan Combination Kit se systémem DHPLC jsou ukázány na obr. 4-10 níže. Tyto ukázky byly získány systémem WAVE® 4500HT-HS System s použitím UV a fluorescenčních detektorů a s přesným dodržením pokynů v části Pokyny pro jednotlivé kroky. Pokyny pro navrhované nastavení gradientu v systému DHPLC pro analýzu produktů digesce enzymem SURVEYOR Nuclease naleznete na http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysis-kits/crc-rascan-kitseu/dhplcsystemsettings. Obrázek 4A

Průtok systémem DHPLC

KRAS Control Wild-Type KRAS Control Exon 2 Uncleaved Vzorek 1, KRAS Exon 2 200-bp Vzorek 2, KRAS Exon 2 ampliconVzorek 3, KRAS Exon 2 Velikostní standard DNA G12D tvoří fragmenty 74 a 116-bp

Nerozštěpený amplikon 190-bp Promytí systému DHPLC

Obrázek 4B G12D tvoří fragmenty 74 a 116-bp

KRAS Control Wild-Type KRAS Control Exon 2 Uncleaved Vzorek 1, KRAS Exon 2 200-bp Vzorek 2, KRAS Exon 2 ampliconVzorek 3, KRAS Exon 2 Velikostní standard DNA Nerozštěpený amplikon 190-bp

Obrázky 4A a 4B: Analýza v systému WAVE DHPLC s UV (obr. 4A) a fluorescenční (obr. 4B) detekcí produktů digesce enzymem SURVEYOR Nuclease kontroly KRAS Positive Control Exon 2 a kontroly KRAS Control Wild-Type a CRC DNA izolované z řezů FFPE. Při vizuálním prohlížení chromatogramů je třeba porovnávat vzorky po digesci s kontrolou Wild-Type Control (hnědá čára). Kontrola KRAS Positive Control Exon (modrá čára) je směsí typu Wild-Type a mutantních plasmidů G12D dávající digesční píky 74 a 116 bp; tato kontrola ukazuje, že krok digesce enzymem SURVEYOR Nuclease proběhl správně a ukazuje oblast chromatogramu, kterou je třeba vizuálně prozkoumat a určit, zda by měl být vzorek předán k analýze sekvence DNA. Z porovnání charakteru digesce u vzorků 1-3 s elektroferogramem typu Wild-Type bez digesce je zřejmé, že vzorky 1 a 2 (červená a tyrkysová čára) obsahují pravděpodobné mutace a měly by být sekvenovány, aby se potvrdila přítomnost či absence mutace v příslušném kodonu. Vzorek 3 (zelená čára) má podobný chromatogram jako kontrola Wild-Type Control a není třeba


strana 22


jej předávat k sekvenční analýze DNA. Konečným výsledkem je výsledek sekvenování, neboť se mohou vyskytovat i jiné nerelevantní mutace poskytující fragmenty o stejné velikosti. Obrázek 5A

KRAS Control Wild-Type KRAS Control Exon 3 Vzorek 1, KRAS Exon 3 Uncleaved 200-bp Vzorek 2, KRAS Exon 3 ampliconVzorek 3, KRAS Exon 3 Velikostní standard DNA

Průtok systémem DHPLC Q61H tvoří fragmenty 65 a 135-bp

Nerozštěpený amplikon 200-bp Promytí systému DHPLC

Obrázek 5B Q61H tvoří fragmenty 65 a 135-bp

KRAS Control Wild-Type KRAS Control Exon 3 Vzorek 1, KRAS Exon 3 Uncleaved 200-bp Vzorek 2, KRAS Exon 3 ampliconVzorek 3, KRAS Exon 3 Velikostní standard DNA Nerozštěpený amplikon 200-bp

Obrázky 5A a 5B: Analýza v systému WAVE DHPLC s UV (obr. 5A) a fluorescenční (obr. 5B) detekcí produktů digesce enzymem SURVEYOR Nuclease kontroly KRAS Positive Control Exon 3 a kontroly KRAS Control Wild-Type a CRC DNA izolované z řezů FFPE. Při vizuálním prohlížení chromatogramů je třeba porovnávat vzorky po digesci s kontrolou Wild-Type Control (hnědá čára). Kontrola KRAS Positive Control Exon 3 (zelená čára) je směsí typu Wild-Type a mutantních plasmidů Q61H dávající digesční píky 65 a 135 bp; tato kontrola ukazuje, že krok digesce enzymem SURVEYOR Nuclease proběhl správně a ukazuje oblast chromatogramu, kterou je třeba vizuálně prozkoumat a určit, zda by měl být vzorek předán k analýze sekvence DNA. Z porovnání charakteru digesce u vzorků 1-3 s elektroferogramem typu Wild-Type bez digesce je zřejmé, že vzorek 2 (černá čára) obsahuje pravděpodobnou mutaci a měl by být sekvenován, aby se potvrdila přítomnost či absence mutace v příslušném kodonu. Vzorky 1 a 3 (modrá a červená čára) mají podobné chromatogramy jako kontrola Wild-Type Control a není třeba jej předávat k sekvenční analýze DNA. Konečným výsledkem je výsledek sekvenování, neboť se mohou vyskytovat i jiné nerelevantní mutace poskytující fragmenty o stejné velikosti.


strana 23


Obrázek 6A

Průtok systémem DHPLC K117N tvoří fragmenty 80 a 88-bp

DHPLC KRAS Control Wild-Type Wash-off KRAS Control Exon 4A Uncleaved Vzorek 1, KRAS Exon 2 200-bp Vzorek 2, KRAS Exon 2 ampliconVelikostní standard DNA

Nerozštěpený amplikon 168-bp

Promytí systému DHPLC

Obrázek 6B

K117N tvoří fragmenty 80 a 88-bp

DHPLC KRAS Control Wild-Type Wash-off KRAS Control Exon 4A Uncleaved Vzorek 1, KRAS Exon 2 200-bp Vzorek 2, KRAS Exon 2 ampliconVelikostní standard DNA


Obrázky 6A a 6B: Analýza v systému WAVE DHPLC s UV (obr. 6A) a fluorescenční (obr. 6B) detekcí produktů digesce SURVEYOR Nuclease kontroly KRAS Positive Control Exon 4A a KRAS Control Wild-Type a CRC DNA izolované z řezů FFPE. Při vizuálním prohlížení chromatogramů je třeba porovnávat vzorky po digesci s kontrolou Wild-Type Control (zelená čára). Kontrola KRAS Positive Control Exon 4A (modrá čára) je směsí typu Wild-Type a mutantních plasmidů K117N dávající digesční píky 80 a 88 bp; tato kontrola ukazuje, že krok digesce enzymem SURVEYOR Nuclease proběhl správně a ukazuje oblast chromatogramu, kterou je třeba vizuálně prozkoumat a určit, zda by měl být vzorek předán k analýze sekvence DNA. Z porovnání charakteru digesce u vzorků 1a 2 s elektroferogramem typu Wild-Type bez digesce je zřejmé, že vzorek 1 (červená čára) obsahuje pravděpodobnou mutaci a měl by být sekvenován, aby se potvrdila přítomnost či absence mutace v příslušném kodonu. Vzorek 2 (červená čára) má podobný chromatogram jako kontrola Wild-Type Control a není třeba jej předávat k sekvenční analýze DNA. Konečným výsledkem je výsledek sekvenování, neboť se mohou vyskytovat i jiné nerelevantní mutace poskytující fragmenty o stejné velikosti.


strana 24


Obrázek 7A



DHPLC KRAS Control Wild-Type Wash-off KRAS Control Exon 4B Uncleaved Vzorek 1, KRAS Exon 2 200-bp Vzorek 2, KRAS Exon 2 ampliconVzorek 3, KRAS Exon 2 Velikostní standard DNA

Promytí systému DHPLC A146T tvoří fragmenty 78 a 116-bp

Obrázek 7B A146T tvoří fragmenty 78 a 116-bp

DHPLC KRAS Control Wild-Type Wash-off KRAS Control Exon 4B UncleavedVzorek 1, KRAS Exon 2 200-bp Vzorek 2, KRAS Exon 2 ampliconVzorek 3, KRAS Exon 2 Velikostní standard DNA


Obrázky 7A a 7B: Analýza v systému WAVE DHPLC s UV (obr. 7A) a fluorescenční (obr. 7B) detekcí produktů digesce SURVEYOR Nuclease kontroly KRAS Positive Control Exon 4B a KRAS Control Wild-Type a CRC DNA izolované z řezů FFPE. Při vizuálním prohlížení chromatogramů je třeba porovnávat vzorky po digesci s kontrolou Wild-Type Control (hnědá čára). Kontrola KRAS Positive Control Exon 4B (tmavozelená čára) je směsí typu Wild-Type a mutantních plasmidů A146T dávající digesční píky 78 a 116 bp; tato kontrola ukazuje, že krok digesce enzymem SURVEYOR Nuclease proběhl správně a ukazuje oblast chromatogramu, kterou je třeba vizuálně prozkoumat a určit, zda by měl být vzorek předán k analýze sekvence DNA. Z porovnání charakteru digesce u vzorků 1 -3 s elektroferogramem typu Wild-Type bez digesce je zřejmé, že vzorek 3 (červená čára) obsahuje pravděpodobnou mutaci a měl by být sekvenován, aby se potvrdila přítomnost či absence mutace v příslušném kodonu. Vzorky 2 a 3 (černá a světlezelená čára) mají podobné chromatogramy jako kontrola Wild-Type Control a není třeba jej předávat k sekvenční analýze DNA. Konečným výsledkem je výsledek sekvenování, neboť se mohou vyskytovat i jiné nerelevantní mutace poskytující fragmenty o stejné velikosti.


strana 25


Obrázek 8A


G12D tvoří fragmenty 88 a 148-bp

NRAS Control Wild-Type NRAS Control Exon 2 Vzorek 1, NRAS Exon 2 Uncleaved 200-bp Vzorek 2, NRAS Exon 2 ampliconVelikostní standard DNA Nerozštěpený amplikon 236-bp


Obrázek 8B G12D tvoří fragmenty 88 a 148-bp

NRAS Control Wild-Type NRAS Control Exon 2 Vzorek 1, NRAS Exon 2 Uncleaved 200-bp Vzorek 2, NRAS Exon 2 ampliconVelikostní standard DNA


Obrázky 8A a 8B: Analýza v systému WAVE DHPLC s UV (Obrázek 8A) a fluorescenční (Obrázek 8B) detekcí produktů digesce enzymem SURVEYOR Nuclease kontroly NRAS Positive Control Exon 3 a kontroly Wild-Type Control a CRC DNA izolované z řezů FFPE. Při vizuálním prohlížení chromatogramů je třeba porovnávat vzorky po digesci s kontrolou NRAS Control Wild-Type (modrá čára). Kontrola NRAS Positive Control Exon 2 (zelená čára) je směsí typu Wild-Type a mutantních plasmidů G12D dávající digesční píky 88 a 148 bp; tato kontrola ukazuje, že krok digesce enzymem SURVEYOR Nuclease proběhl správně a ukazuje oblast chromatogramu, kterou je třeba vizuálně prozkoumat a určit, zda by měl být vzorek předán k analýze sekvence DNA. Z porovnání charakteru digesce u vzorků 1 a 2 s elektroferogramem typu Wild-Type bez digesce je zřejmé, že vzorek 1 (červená čára) obsahuje pravděpodobnou mutaci a měl by být sekvenován, aby se potvrdila přítomnost či absence mutace v příslušném kodonu. Vzorek 2 (černá čára) má podobný chromatogram jako kontrola NRAS Control Wild-Type a není třeba jej předávat k sekvenční analýze DNA. Konečným výsledkem je výsledek sekvenování, neboť se mohou vyskytovat i jiné nerelevantní mutace poskytující fragmenty o stejné velikosti.


strana 26


Obrázek 9A

Průtok systémem DHPLC Q61K tvoří fragmenty 78 a 125-bp

NRAS Control Wild-Type NRAS Control Exon 3 Vzorek 1, NRAS Exon 3 Uncleaved 200-bp Vzorek 2, NRAS Exon 3 ampliconVelikostní standard DNA Promytí systému DHPLC Nerozštěpený amplikon 203-bp

Obrázek 9B Q61K tvoří fragmenty 78 a 125-bp

NRAS Control Wild-Type NRAS Control Exon 3 Vzorek 1, NRAS Exon 3 Uncleaved 200-bp Vzorek 2, NRAS Exon 3 ampliconVelikostní standard DNA Nerozštěpený amplikon 203-bp

Obrázky 9A a 9B: Analýza v systému WAVE DHPLC s UV (Obrázek 9A) a fluorescenční (Obrázek 9B) detekcí produktů digesce enzymem SURVEYOR Nuclease kontroly NRAS Positive Control Exon 3 a kontroly Wild-Type Control a CRC DNA izolované z řezů FFPE. Při vizuálním prohlížení chromatogramů je třeba porovnávat vzorky po digesci s kontrolou NRAS Control Wild-Type (zelená čára). Kontrola NRAS Positive Control Exon 3 (modrá čára) je směsí typu Wild-Type a mutantních plasmidů Q61K dávající digesční píky 78 a 125 bp; tato kontrola ukazuje, že krok digesce enzymem SURVEYOR Nuclease proběhl správně a ukazuje oblast chromatogramu, kterou je třeba vizuálně prozkoumat a určit, zda by měl být vzorek předán k analýze sekvence DNA. Z porovnání charakteru digesce u vzorků 1 a 2 s elektroferogramem typu Wild-Type bez digesce je zřejmé, že vzorek 1 (červená čára) obsahuje pravděpodobnou mutaci a měl by být sekvenován, aby se potvrdila přítomnost či absence mutace v příslušném kodonu. Vzorek 2 (černá čára) má podobný chromatogram jako kontrola NRAS Control Wild-Type a není třeba jej předávat k sekvenční analýze DNA. Konečným výsledkem je výsledek sekvenování, neboť se mohou vyskytovat i jiné nerelevantní mutace poskytující fragmenty o stejné velikosti.


strana 27


Obrázek 10A



NRAS Control Wild-Type NRAS Control Exon 4 Uncleaved Vzorek 1, NRAS Exon 4 200-bp Vzorek 2, NRAS Exon 4 ampliconVelikostní standard DNA Promytí systému DHPLC

A146T tvoří fragmenty 68 a 165-bp

Obrázek 10B

NRAS Control Wild-Type NRAS Control Exon 4 Uncleaved Vzorek 1, NRAS Exon 4 200-bp Vzorek 2, NRAS Exon 4 ampliconVelikostní standard DNA

A146T tvoří fragmenty 68 a 165-bp


Obrázky 10A a 10B: Analýza v systému WAVE DHPLC s UV (Obrázek 10A) a fluorescenční (Obrázek 10B) detekcí produktů digesce enzymem SURVEYOR Nuclease kontroly NRAS Positive Control Exon 4 a kontroly Wild-Type Control a CRC DNA izolované z řezů FFPE. Při vizuálním prohlížení chromatogramů je třeba porovnávat vzorky po digesci s kontrolou NRAS Control Wild-Type (zelená čára). Kontrola NRAS Positive Control Exon 4 (modrá čára) je směsí typu Wild-Type a mutantních plasmidů A146T dávající digesční píky 68 a 165 bp; tato kontrola ukazuje, že krok digesce enzymem SURVEYOR Nuclease proběhl správně a ukazuje oblast chromatogramu, kterou je třeba vizuálně prozkoumat a určit, zda by měl být vzorek předán k analýze sekvence DNA. Ze srovnání charakteru digesce u vzorků 1 a 2 s elektroferogramem digestovaného typu Wild-Type je zřejmé, že vzorky 1 a 2 (červená a černá čára) mají podobné chromatogramy jako NRAS Control Wild-Type a není třeba je předávat k analýze DNA sekvenováním. U pozitivních výsledků SURVEYOR Scan je konečným výsledkem výsledek sekvenování, neboť se mohou vyskytovat i jiné nerelevantní mutace poskytující fragmenty o stejné velikosti.


strana 28

15 Co je třeba dodržovat

15 Co je třeba dodržovat 15.1 Detekční hladina mutací získaných soupravou SURVEYOR Scan Validace souprav SURVEYOR Scan pro platformy DHPLC pomocí plasmidových klonů všech indikovaných mutací ukázala, že píky pro SURVEYOR Nuclease lze detekovat ve směsi 2-5% mutantu na pozadí Wild-Type. Automatické zjišťování sekvenováním přímého a zpětného řetězce často selhává v detekci mutací o koncentraci ve směsi s DNA typu Wild-Type nižší než 10 %. Společně s výsledky získanými nukleázou SURVEYOR Nuclease lze důvěryhodněji interpretovat elektroferogramy sekvenování obsahující 5-10 % mutantů. Ukáže-li analýza vzorku pro SURVEYOR Scan pozitivní výsledek, avšak sekvenování DNA neukáže žádnou detekovatelnou mutaci v KRAS nebo NRAS, doporučujeme takový výsledek vyhodnotit a zaznamenat jako „Žádná varianta nezjištěna“. Viz více podrobností v části Pracovní schéma.

15.2 Potvrzení sekvence U všech pozitivních výsledků ze SURVEYOR Scan přejděte k ověření sekvence, aby se určila identita sekvence mutací v KRAS a/nebo NRAS Exons 2, 3 a 4. Obrázek 11 ukazuje důležitost ověření sekvence pro stanovení přesné mutace. Nepostupujte ověřování sekvence s negativními výsledky ze SURVEYOR Scan. Takový vzorek lze vyhodnotit jako Wild-Type nebo „varianta nezjištěna“. Primery Universal Sequencing Primer dodávané v soupravě jsou určeny k použití při ověřování sekvence. Přímý primer je PN 710153F (Universal Sequencing Primer 1) a zpětný primer je PN 710153R (Universal Sequencing Primer 2). Vzorek 1: G13C

Vzorek 2: G13D

Obrázek 11 Analýza sekvence vzorků se stejným charakterem digesce v KRAS Exon 2 enzymem SURVEYOR Nuclease. Výše ukázané vzorky 1 a 2 vykázaly v systému DHPLC stejný charakter píků po digesci nukleázou SURVEYOR Nuclease a byly dále analyzovány sekvenováním DNA. Sekvenování potvrzuje dvě odlišné mutace: G13C a G13D. Na těchto vzorcích lze ilustrovat (a) schopnost enzymu SURVEYOR Nuclease detekovat potenciální mutace a (b) neschopnost určit jejich přesné umístění ani konkrétní změnu bází mutace(í) v testovaném vzorku. Poznámka: V každém sekvenačním elektroferogramu je důležité ověřit absenci „značkovací“ sekvence, aby se potvrdilo, že mutace není výsledkem kontaminace vzorku některou z kontrol dodaných v soupravě. Poznámka: Je-li testovaný vzorek v příslušných kodonech typu Wild-Type a je přítomna „značkovací“ sekvence, potom je testovaný vzorek kontaminovaný a musí být znovu analyzován. Přítomnost „značky“ ukazuje, že testovaný vzorek může být kontaminován některou kontrolou Wild-Type Control ze souprav; tato kontaminace může zakrýt mutaci o nízkém výskytu ve vzorku. Bližší informace o značkovacích sekvencích v kontrolách naleznete v příloze A.2 Označení na kontrolní DNA.


strana 29

15 Co je třeba dodržovat

15.3 Omezení testu Kontaminující látky přenesené ze vzorků zalitých v parafínu a fixovaných formalinem mohou narušovat amplifikaci metodou PCR a digesci nukleázou SURVEYOR Nuclease. Postupy kontroly kvality uvedenými v části Kontrola kvality produktů PCR se zajistí, že extrahovaná DNA bude vhodná pro použití s touto soupravou. Tato souprava byla validována pro analýzu vzorků získaných z nádoru kolorektálního karcinomu zalitých v parafínu a fixovaných formalinem. Není validována pro diagnostické použití s jinými druhy karcinomů ani pro čerstvé nebo zmrazené vzorky získané biopsií. Řešení problémů s nestandardními výsledky a podrobnosti k faktorům, které ovlivňují tento test, naleznete v části Příloha B - Pokyny pro řešení problémů v následujícím textu. Během práce se soupravou je nutné věnovat pozornost zabránění přenosu a křížové kontaminaci. Extrémní citlivost metody testování vyžaduje v následujících bodech preventivní opatření: 

Manipulaci se vzorky je nutné provádět tak, aby mezi vzorky nemohlo dojít ke křížové kontaminaci



Pracujte na pracovišti pro PCR nebo na jiném vhodném místě, které lze před přípravou amplifikačních reakcí PCR vystavit UV záření.



K otevření vzorků po amplifikaci pomocí PCR určených ke kontrole kvality gelovou elektroforézou použijte oddělené pracoviště pro PCR.



Příprava k digesci enzymem SURVEYOR Nuclease má být provedena v oddělené místnosti nebo na jiném pracovišti pro PCR, než kde byla provedena původní PCR.



Během všech kroků testu se s plasmidovými kontrolami v soupravě musí manipulovat odděleně od testovaných vzorků.



o

Všechny roztoky a jamky pro kontrolu bez templátu a pro DNA vzorků musí být před otevřením zkumavek s kontrolní plasmidovou DNA uzavřeny.

o

MANIPULACI S KONTROLAMI PROVÁDĚJTE JAKO POSLEDNÍ. Kontrolní plasmidovou DNA přidávejte do příslušných zkumavek pouze AŽ PO uzavření všech jamek s kontrolou bez templátu a se vzorky.

o

Po uzavření zkumavek s kontrolní DNA otřete VŠECHNY zkumavky a víčka před přenesením na jiné pracoviště přípravkem destruujícím DNA (např. 10% chlornanem).

Pipetování vzorků do 96jamkových destiček nesmí umožnit kontaminaci sousedících jamek vzorkem, ke které by mohlo dojít vystříknutím během míchání nebo opomenutím vyměnit špičku pipety.


strana 30

Příloha A

Příloha A A.1 Návrh uspořádání destičky pro soupravy SURVEYOR Scan Níže znázorněný návrh uspořádání destičky je určen pro analýzu SURVEYOR Scan všech sedmi Exons v KRAS a NRAS současně v deseti vzorcích.

Legenda: Ex = Exon; WT = Wild-Type; Mut = Mutace; NTC = kontrola bez templátu.

A.2 Označení na kontrolní DNA Sekvence s „označením“ jsou ukázány níže. Legenda: Úseky s nejčastější mutací jsou zvýrazněny růžově. Sekvenci ve VELKÉM písmu tvoří kódující báze; malým písmem jsou nekódující báze. Kontroly obsahují genetické označení zvýrazněné žlutě; tuto odchylku od sekvence KRAS a/nebo NRAS Wild-Type v úseku, kde se mutace neočekávají, lze využít k řešení problémů s kontaminací vzorků kontrolami Positive Control. Ukázku takové kontaminace ukazuje křivka SURVEYOR Scan v Příloze B - Pokyny pro řešení problémů, 8. Označení v exonu KRAS Exon 2 Velikost amplikonu: 190 bp. V kontrolním plasmidu pro KRAS Exon 2 je genetické označení vytvořeno změnou TAT na ATA. Kodony 12 a 13 jsou zvýrazněny níže. GCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAAATAGAT Označení v exonu KRAS Exon 3 Velikost amplikonu: 200 bp. Při přípravě kontrolního plasmidu KRAS Exon 3 je genetické označení ACC změněno na TGG. Kodony 59 a 61 jsou zvýrazněny níže. GAATGGTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG Označení v exonu KRAS Exon 4A Velikost amplikonu: 168 bp. Při přípravě kontrolního plasmidu KRAS Exon 4A je genetické označení AGA změněno na TCT. Kodon 117 je zvýrazněn níže. AATAAATGTGATTTGCCTTCTAGAACAGTTCTCAC


strana 31

Příloha A

Označení v exonu KRAS Exon 4B Velikost amplikonu: 194 bp. Při přípravě kontrolního plasmidu KRAS Exon 4B je genetické označení agt změněno na tca. Kodon 146 je zvýrazněn níže. TCAGCAAAGACAAGACAGgtatcaaac Označení v exonu NRAS Exon 2 Velikost amplikonu: 236 bp. Při přípravě kontrolního plasmidu NRAS Exon 2 je genetické označení aca změněno na tgt. Kodony 12 a 13 jsou zvýrazněny níže. ccatgtggttcttgctggtgtgaaATGACTGAGTACAAACTGGTGGTGGTTGGAGCAGGTGGTGTT Označení v exonu NRAS Exon 3 Velikost amplikonu: 203 bp. Při přípravě kontrolního plasmidu NRAS Exon 3 je genetické označení GAC změněno na CTG. Kodony 59 a 61 jsou zvýrazněny níže. ACAGCTGGACAAGAAGAGTACAGTGCCATGAGACTGCAA Označení v exonu NRAS Exon 4 Velikost amplikonu: 233 bp. Při přípravě kontrolního plasmidu NRAS Exon 4 je genetické označení CAA změněno na GTT. Kodony 117 a 146 jsou zvýrazněny níže. AACAAGTGTGATTTGCCAACAAGGACAGTTGATACAAAAGTTGCCCACGAACTGGCCAAGAGTTACGGG ATTCCATTCATTGAAACCTCAGCCAAG

A.3 Požadavky pro denaturaci v systému HPLC (DHPLC) A.3.1 Specifikace systému DHPLC pro aplikace v rámci SURVEYOR Scan Následující specifikace představují minimální požadavky pro specifikace systému provádění testů s použitím soupravy SURVEYOR Scan KRAS a NRAS.

DHPLC k

Systém dávkování gradientového rozpouštědla do HPLC  Funkce binárního gradientu; vysoký tlak nebo nízký tlak  Ovládání rychlosti průtoku, minimální rozsah: 0,7 – 1,6 ml/min  Přesnost rychlosti průtoku: ± 2% (H2O při 20 ºC)  Odplyňovač rozpouštědla Automatický vzorkovač  Ovládání teploty k chlazení destiček, nastavitelné: 4 až 14 ºC  Objem vstřiku: 5–50 µl Separační kolona  Určena k separaci fragmentů dsDNA různých velikostí, fragmenty od 50 bp do 250 bp Inkubátor s velmi přesným nastavením teploty  Teplotní rozsah: 40 až 70 ºC  Přesnost teploty: ± 0.2 ºC  Reprodukovatelnost teploty: ± 0.2 ºC  Linearita v celém rozsahu teplot: ± 2.0 ºC Alternativa detekce 1  UV/VIS detektor  Rozsah vlnových délek: 190 – 700 nm  UV zdroj: Deuteriová lampa


strana 32

Příloha A

Alternativa detekce 2  Fluorescenční detektor  Rozsah vlnových délek: buzení: 200 – 850 nm; emise: 250 – 900 nm  Fluorescenční zdroj: 150W xenonová lampa 

Pumpa pro fluorescenční barvivo  Fixní rychlost průtoku 0,.1 ml/min – 20 %/+50 %  Nízkopulzní průtok

A.3.2 Obsluha systému Při nastavení a obsluze systému DHPLC dodržujte doporučení výrobce pro analýzu fragmentů dsDNA o velikosti od 50 bp to 250 bp s dosaženým rozlišením velikosti 10 bp nebo vyšším. Takový je rozsah velikostí fragmentů po digesci enzymem SURVEYOR Nuclease s použitím této soupravy. Pokyny pro navrhované nastavení gradientu v systému DHPLC pro analýzu produktů digesce enzymem SURVEYOR Nuclease naleznete na http://world.transgenomic.com/diagnostictools/genetic-analysis-kits/crc-rascan-kits-eu/dhplcsystemsettings.

A.3.3 Údržba kolon v systému DHPLC Při údržbě kolon v DHPLC dodržujte doporučení výrobce. Poznámka: analýza reakcí se SURVEYOR Nuclease vyžaduje dodržování častějších a přísnějších protokolů ve srovnání s analýzou standardních vzorků PCR. Další podrobnosti naleznete v pokynech pro systém DHPLC


strana 33

Příloha A

A.4 Uspořádání laboratoře pro testy PCR V zájmu získání spolehlivých a nekontaminovaných výsledků PCR dodržujte při přípravě laboratoře pro PCR správnou laboratorní praxi. Při přípravě laboratorního uspořádání dbejte na prostorové oddělení činností během přípravy pro PCR od činností po amplifikaci. Je důležité oddělit (i) izolaci DNA; (ii) amplifikaci PCR; a (iii) činnosti následující po PCR, které zahrnují otevírání zkumavek obsahujících amplifikované vzorky při přípravě analýzy v gelu a při přípravě ostatních testů, jako je analýza produktů digesce enzymem SURVEYOR Nuclease a sekvenování DNA. Je rovněž důležité mít laboratorní potřeby a zařízení určené pro jednotlivé prostory a používat je pouze v těchto prostorech. Utírání ploch 10% (obj/obj) chlornanem, připravovaným jednou týdně, pomůže eliminovat fragmenty DNA ≤ 500 bp jako templáty pro PCR. Dále může být vhodné ošetřit plastové potřeby a roztoky expozicí krátkovlnnému UV záření s použitím UV síťovadla po dobu 710 minut. Poznámka: enzymy a DNA určené k amplifikaci nesmí být vystavovány UV záření. K minimalizaci kontaminace velmi pomůže nošení náležitého ochranného oděvu, častá výměna rukavic a utírání rukavic na rukou 10% (obj/obj) roztokem chlornanu před vstupem na pracoviště. Mělo by být dodrženo uspořádání alespoň o dvou místnostech znázorněné na schématu níže, které je určeno specificky pro PCR a pro analýzu s použitím enzymu SURVEYOR Nuclease.


strana 34

Příloha A

A.5 Odkazy na literaturu 1. Amgen News Release (2013) New analyses identify predictive biomarkers for Vectibix® (panitumumab) in patients with metastatic colorectal cancer. http://wwwext.amgen.com/media/media_pr_detail.jsp?-year=2013&releaseID=1820728 2. Peeters M et al (2013) Massively parallel tumor multigene sequencing to evaluate response to panitumumab in a randomized phase III study of metastatic colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 1902-12. 3. De Roock W et al (2010) Association of KRAS p.G13D mutation with outcome in patients with chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. JAMA 304 1812-20. 4. Peeters M et al (2013) Mutant KRAS codon 12 and 13 alleles in patients with metastatic colorectal cancer: assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to panitumumab. J Clin Oncol. 31 759-65. 5. Andre T et al (2013) Panitumumab combined with irinotecan for patients with KRAS wildtype metastatic colorectal cancer refractory to standard chemotherapy: a GERCOR efficacy, tolerance, and translational molecular study. Ann Oncol. 24 412-9. 6. Loupakis F et al (2009) KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer. Br J Cancer 101 715-21. 7. De Roock W et al (2010) Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol. 11 753-62. 8. Qiu P et al (2004) Mutation detection using Surveyor™ nuclease. Biotechniques 36 702707 9. Kuang Y et al (2009) Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15 2630-6 10. Mitani N et al (2007) Surveyor nuclease-based detection of p53 gene mutations in haematological malignancy. Ann. Clin. Biochem. 44 557-9 11. Engelman JA et al (2006) Allelic dilution obscures detection of a biologically significant resistance mutation in EGFR-amplified lung cancer. J. Clin. Invest. 116 2695-2706 Viz též odkazy na http://world.transgenomic.com/files/literature/482146.pdf o nukleáze SURVEYOR Nuclease a jejím použití.


strana 35

Příloha B

Příloha B Pokyny pro řešení problémů Efektivní použití souprav SURVEYOR Scan pro systém DHPLC závisí na úspěšném provedení celé řady kroků. Jedním z nejdůležitějších kroků je amplifikace metodou PCR, která musí vést k tvorbě specifické DNA o jednotné velikosti a v dostatečném množství, aby byla po hybridizaci a štěpení detekovatelná. To závisí na kvalitě původního vzorku. Provádění testu s DNA, která nesplňuje kritéria kvality a množství, se nedoporučuje. Poznámka: Používáte-li enzym SURVEYOR Nuclease poprvé, prostudujte si Pokyny pro jednotlivé kroky a proveďte experimenty v části Použití kontrolních plasmidových DNA. Před kontaktováním technické podpory společnosti Transgenomic mějte výsledky získané pomocí kontrolní plasmidové DNA připravené u sebe. Tyto pokyny po řešení problémů obsahují seznam problémů, se kterými se můžete setkat při používání souprav SURVEYOR Scan pro DHPLC a také návrhy jejich řešení. Jsou použité příklady z Exons KRAS i NRAS. Podrobné informace k obsluze a údržbě přístroje naleznete v příručce pro systém DHPLC. Příručka obsahuje konkrétní pokyny pro kontrolu a udržování funkčnosti kolony a podrobnosti k řešení problémů.

Problém 1 – nízký výtěžek PCR nebo analýza na agarózovém gelu neukazuje žádný produkt PCR NÍZKÝ VÝTĚŽEK PCR

Správný výtěžek PCR

Nízký výtěžek PCR

MOŽNÁ PŘÍČINA

ŘEŠENÍ

Špatná kvalita templátové DNA

Opakujte purifikaci DNA; ověřte používanou purifikační metodu. Je-li DNA extrahovaná z FFPE příliš fragmentovaná, mohou být zapotřebí další bloky FFPE.

Velké množství RNA ve vzorku zvyšující odhadovanou koncentraci DNA

Opakujte ošetření vzorku DNA RNázou a purifikaci DNA.

Termocykler není zkalibrován

Zkalibrujte termocykler.

Není dostatek templátu

Zvyšte množství templátu.

Proužek RNA

Poznámka: Je třeba používat DNA vysoké kvality z FFPE. Podle měření absorbance při 260 nm musí mít DNA koncentraci 25 ng/µl, absorbanční poměr při 260/280 nm >1,8 a čistotu >90 % DNA (tj. neobsahovat kontaminaci tRNA a rRNA na základě pozorování agarózového gelu). Vzorky s DNA uchovávejte při teplotě od -20 °C do -80 °C. Analýza templátu DNA extrahované z tkání zalitých v parafínu vyžaduje některá preventivní opatření. Extrahovanou DNA lze ošetřit uracil DNA glykosylázou a tím zabránit amplifikaci fragmentů DNA obsahujících deaminovaná C residua. Často dochází k tomu, že vysoký podíl materiálu extrahovaného z tkáně zalité v parafinu a adsorbujícího při A260 není během PCR správně amplifikován. Použití většího množství počáteční DNA často napomůže tvorbě správného produktu amplifikace. Další možností je vybrat nádorovou tkáň z FFPE s vyšším podílem nádorových buněk. Lze též použít mikrořez, avšak to je velmi časově náročný postup a nedoporučuje se pro běžnou laboratorní analýzu.


strana 36

Příloha B

Problém 2 – analýza na agarózovém gelu ukazuje více produktů PCR VÍCE PRODUKTŮ PCR

Správný výtěžek PCR

MOŽNÁ PŘÍČINA

ŘEŠENÍ

Příliš nízká teplota párování

Zkontrolujte kalibraci termocykleru.

Více proužků z PCR

Poznámka: PCR musí poskytnout dostatečně vysoký výtěžek (> 20 ng/µl) JEDINÉHO amplifikovaného druhu správné velikosti. Pro PCR se musí používat enzym DNA Polymerase a pufr DNA Polymerase 10X PCR Buffer , které jsou součástí soupravy. Amplikony z kontrol musí být digestovány enzymem SURVEYOR Nuclease a analyzovány odděleně, aby se zamezilo jejich rušivému pozadí při vizuálním srovnávání profilů na elektroferogramech (viz Příklady výsledků, obr. 4-10). Před digescí zkontrolujte všechny produkty amplifikované DNA gelovou elektroforézou (nebo analýzou v systému DHPLC), abyste si ověřili přítomnost jednoho druhu o předpokládané velikosti.


strana 37

Příloha B

Problém 3 – Po působení nukleázy SURVEYOR Nuclease na heteroduplexy a analýze nejsou pozorovány žádné produkty štěpení ŽÁDNÉ PRODUKTY ŠTĚPENÍ

Pozice chybějících heteroduplexů

MOŽNÁ PŘÍČINA

ŘEŠENÍ

Příliš malý podíl chybně párovaných bází

Ověřte test pomocí kontrol.

Neefektivní tvorba heteroduplexů

Dodržujte správný postup při PCR a hybridizaci. Pro digesci nukleázou SURVEYOR Nuclease používejte čerstvě hybridizovanou DNA. Proveďte novou amplifikaci PCR s použitím (1) templátové DNA stejného množství; (2) zvýšeného množství počáteční DNA; nebo (3) izolujte čerstvou DNA ze stejného nebo jiného řezu FFPE.

Pík nerozštěpeného homoduplexu

Neaktivní nukleáza SURVEYOR Nuclease

Pro ověření funkčnosti enzymu proveďte kontrolní reakci s kontrolou Positive Control. Používejte pouze čerstvě připravené výchozí směsi enzymu SURVEYOR Nuclease.

Poznámka: SURVEYOR Nuclease provádí štěpení především v heteroduplexech v místech s chybným párováním. Podíl heteroduplexu vůči homoduplexu v hybridizovaném vzorku určuje velikost signálu digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease. Je-li ve vzorku genomické DNA přítomna mutace genu KRAS a/nebo NRAS ve velmi nízké koncentraci, signál může být příliš nízký na to, aby vytvořil pozitivní výsledek. Důležité je zajistit zahrnutí kroku hybridizace do programu termocykleru (viz Amplifikační protokol), aby byla maximalizována účinnost tvorby heteroduplexu. Heteroduplexy se během standardních reakcí PCR tvoří velmi neefektivně. Poznámka: poměr signálu vůči šumu je všeobecně dosti vysoký pro detekci mutací přítomných v nízkém procentu celkového templátu DNA; je možné detekovat i 2% mutantní DNA. Obr. 4-10 ukazují produkty štěpení vzniklé s použitím homoduplexní a heteroduplexní kontrolní DNA KRAS a NRAS Positive Control (obsažené v soupravě) a vzorků FFPE v systému WAVE DHPLC 4500 System. Lze zřetelně pozorovat produkty štěpení jako dva nové píky eluující o předpokládaných velikostech, které lze odhadnout v porovnání s velikostním markerem DNA.


strana 38

Příloha B

Pozor: komerčně dostupné pufry pro PCR mají výrazně rozdílný obsah a jejich složení často není dodavatelem definováno. Některé pufry NEJSOU kompatibilní s nukleázou SURVEYOR Nuclease vzhledem k pH nebo přítomnosti přísad, povrchově aktivních činidel a jiných přidaných složek. NEPOUŽÍVEJTE žádnou jinou polymerázu ani 10X polymerázový pufr než ty, které jsou dodávané v soupravě.

Problém 4 – Silné pozadí po působení nukleázy SURVEYOR Nuclease SILNÉ POZADÍ

MOŽNÁ PŘÍČINA

ŘEŠENÍ

Neoptimální hybridizace

Proveďte následující: 1. Zkontrolujte, zda koncentrace DNA je v rozsahu >25 ng/µl. 2. Zopakujte vytvoření heteroduplexu a dbejte na dodržování doporučeného postupu; viz bod 12.7.1.


Vzorek s rušivou základní linií


Příliš nízké množství DNA

Ověřte výtěžek a kvalitu templátové DNA

Nespecifické produkty PCR

Ověřte výtěžek a kvalitu templátové DNA.

SURVEYOR Enhancer W2 a/nebo SURVEYOR Enhancer Cofactor ztratili svojí aktivitu

Zkontrolujte datum vypršení použitelnosti soupravy.

Poznámka: Nukleáza SURVEYOR Nuclease někdy štěpí dvouřetězcovou DNA v náhodně párovaných místech pouze v jednom řetězci. To způsobuje vznik pozadí po digesci. Tato aktivita je potlačována zesilovačem SURVEYOR Enhancer W2 a jeho kofaktorem Cofactor, aniž by došlo k negativnímu ovlivnění reakce štěpení v místě chybného párování. SURVEYOR Enhancer W2 a SURVEYOR Enhancer Cofactor jsou obsaženy v soupravě a tyto je třeba vždy používat. Dochází-li k tomuto štěpení pouze na jednom řetězci, vytváří se tak v systému DHPLC menší píky. Produkty digesce kontroly Wild-Type Control budou vykazovat stejné malé píky. Toto srovnání se používá při hledání rozdílů v elektroferogramech mezi Wild-Type Control a testovaným vzorkem a při srovnávání charakteristiky vzorku s charakteristikou kontroly Wild-Type Control.


strana 39

Příloha B

Problém 5 – píky po digesci nukleázou SURVEYOR Nuclease u negativních kontrol PÍKY DIGESCE U NEGATIVNÍCH KONTROL Píky digesce Wild-Type Control se slabým signálem


Pík neštěpeného homoduplexu

MOŽNÁ PŘÍČINA

ŘEŠENÍ

Kontaminace obsahu soupravy amplikony genu KRAS a/nebo NRAS nebo plasmidovými kontrolami.

Zlikvidujte všechny komponenty soupravy a použijte novou soupravu. Obraťte se na technickou podporu společnosti Transgenomic a poraďte se o možných příčinách a zdrojích kontaminace.


Problém 6 – Neúspěšné výsledky s nukleázou SURVEYOR Nuclease DIGESCE KONTROL POSITIVE CONTROL S NUKLEÁZOU SURVEYOR NUCLEASE SE NEZDAŘILA

Nejasné píky po digesci

Pík nerozštěpeného homoduplexu

MOŽNÁ PŘÍČINA

ŘEŠENÍ

SURVEYOR Nuclease nebyla přidána

Proveďte digesci nového vzorku

Digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease proběhla při nesprávné teplotě

Proveďte digesci nového vzorku


strana 40

Příloha B

Problém 7 – Neočekávané píky na křivce digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease DIGESCE KONTROL POSITIVE CONTROL S NUKLEÁZOU SURVEYOR NUCLEASE SE NEZDAŘILA

Pík neštěpeného homoduplexu

MOŽNÁ PŘÍČINA

ŘEŠENÍ

Mutace v neobvyklém místě

Ověřte mutaci sekvenováním vzorku

Neočekávaný pík po digesci


Očekávané píky po digesci



strana 41

Příloha B

Problém 8 – Kontaminace vzorků kontrolami Positive Control CHARAKTER DIGESCE ODPOVÍDÁ PŘÍTOMNOSTI OZNAČENÉHO ÚSEKU SMÍŠENÝCH KONTROL POSITIVE CONTROL A HETERODUPLEXŮ WILDTYPE

MOŽNÁ PŘÍČINA Nesprávný způsob pipetování

Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3

ŘEŠENÍ Při pipetování vzorků je třeba věnovat pozornost zabránění příčné kontaminaci. Zkontrolujte úseky se sekvencí kontrolního označení, zda nedošlo ke kontaminaci kontrolou Positive Control.

Sekvenování odhaluje úseky s označením v NRAS Exon 2 kontaminující testovaný vzorek. Oblast kodonů 12 a 13 v NRAS Exon 2

Úsek s označením v plasmidové kontrole NRAS Exon 2

Vzorek je typu WildType Je přítomna značkovací sekvence. Kontaminováno Vzorek je mutantní Bez značkovací sekvence Platný vzorek

Nesprávný způsob pipetování

Při pipetování vzorků je třeba věnovat pozornost zabránění příčné kontaminaci. Zkontrolujte úseky se sekvencí kontrolního označení, zda nedošlo ke kontaminaci kontrolou Positive Control.

Vzorek je typu Wild-Type Není přítomna značkovací sekvence. Platný vzorek


strana 42

Podrobnosti pro objednávku

Podrobnosti pro objednávku Číslo produktu

Název produktu

Velikost

710104

SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD

100 reakcí

710106

SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD

100 reakcí

710400

SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD

100 reakcí

710077

CRC RAScan Combination Kit

230 reakcí

Kontaktní údaje Hlavní sídlo Transgenomic, Inc. 12325 Emmet Street Omaha Nebraska 68164 United States of America

Evropa Transgenomic Limited 40 Watt Road Hillington Park, Hillington Glasgow G52 4RY United Kingdom

Tel.: (888) 233-9283* nebo +1 (402) 452-5400 Fax: +1 (402) 452-5401 E-mail: [email protected]

Tel.: +44 141 892 8800 Fax: +44 141 883 5967 E-mail: [email protected]

*Pouze v Severní Americe

www.Transgenomic.com

Překlad Prohlášení Transgenomic, as vynaložila veškeré úsilí, aby zajistila přesnost tohoto překladu. Pokud máte dotazy týkající se jakékoli informace uvedené v této přeložené verze této příručky naleznete na anglické verzi Instructions for Use for the CRC RAScan™ Combination Kit CE IVD with DHPLC Systems – 482296(EN) http://world.Transgenomic.com/files/literature/482427-EN.pdf a / nebo kontaktujte Transgenomic na [email protected].


strana 43

Licence, obchodní známky a autorská práva

Licence, obchodní známky a autorská práva SURVEYOR Nuclease: Tento produkt je vyroben pod exkluzivní licencí podle patentů USA 6,699,980, 6,391,557, 5,869,245, jejich zahraničních protějšků a dalších patentů podaných k přihlášení. K používání nukleázy SURVEYOR Nuclease je vyžadována licence od společnosti Transgenomic. Akademické, neziskové a ziskové organizace mají na základě koupě tohoto produktu omezená práva na používání nukleázy SURVEYOR Nuclease pro výzkumné účely. Další prodej a jiná použití se přísně zakazují. Pro více podrobností se obraťte na společnost Transgenomic. Polymeráza DNA Polymerase: Použití tohoto produktu podléhá jednomu nebo více z následujících patentů USA a příslušným patentovým nárokům mimo USA: 5,789,224, 5,618,711, 6,127,155 a nárokům mimo USA příslušným patentu USA č. 4,889,818. Zakoupení tohoto produktu zahrnuje omezené a nepřenositelné zproštění od soudního postihu podle výše uvedených patentových nároků za použití pouze tohoto množství produktu k vlastnímu internímu výzkumu kupujícího. Neuděluje se žádné právo , ať výslovně či odvozeně nebo jako překážka v uplatnění žalobního nároku podle žádného z patentových nároků (jako jsou např. patentované nároky v patentech USA č. 5,210,015 a 5,487,972 na způsob s 5' nukleázou), žádné právo provádět žádný patentovaný způsob ani žádné právo provádět komerční služby jakéhokoli druhu, včetně, kromě jiného, předávání výsledků činnosti kupujícího za poplatek či jiné komerční ohodnocení. Tento produkt je určen pouze pro výzkumné účely. Pro diagnostické použití podle patentů společnosti Roche se vyžaduje samostatná licence od společnosti Roche . Další informace k nákupu licencí lze obdržet kontaktováním ředitele pro licence: Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA. Transgenomic, SURVEYOR a WAVE jsou registrované obchodní známky a Navigator, CRC RAScan, logo šroubovice a Advancing Personalized Medicine jsou obchodní známky společnosti Transgenomic, Inc. Všechny ostatní známky jsou obchodní známky jejich příslušných držitelů. © 2013 Transgenomic, Inc. Všechna práva vyhrazena. Vytištěno v USA.

Dokument č. 482427(CS) rev-00


strana 44

Návod k použití CRC RAScan Combination Kit

Recommend Documents