Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Combination Kit

1 Fabrikant

Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan™ Combination Kit Een SURVEYOR® Scan KRAS en NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD

met DHPLC-systemen

Lees deze instructies voor gebruik zorgvuldig voordat u dit product gaat gebruiken. Bewaar deze instructies voor gebruik voor toekomstige referentie.

Deze pagina is met opzet leeg gelaten.

Inhoudsopgave 1 Fabrikant ....................................................................................................................... 3 2 CRC RAScan™ Combination Kit ................................................................................. 3 2.1 Beoogd gebruik ................................................................................................................... 3 2.2 Indicaties voor gebruik ........................................................................................................ 3 3 Principes van de CRC RAScan KRAS en NRAS Mutatie detectie-assay ................. 4 3.1 KRAS en NRAS ...................................................................................................................... 4 3.2 Analyse van patiëntenmonsters met behulp van SURVEYOR Scan Kits ................................ 4 3.3 SURVEYOR Nuclease ............................................................................................................ 5 4 Traceerbaarheid van kitcontroles ............................................................................... 6 5 Componenten ............................................................................................................... 7 5.1 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2, 3 & 4 Box (h 710107) .................................................. 7 5.2 SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 Box (h 710400) ................................................. 8 5.3 Aantal monsters dat met één kit kan worden getest ........................................................... 8 5.4 DNA‐sequencing .................................................................................................................. 9 6 Extra benodigde apparatuur en reagentia .................................................................. 9 7 Reagensbereiding ........................................................................................................ 9 8 Opslag en houdbaarheid ........................................................................................... 10 9 Waarschuwingen en voorzorgen .............................................................................. 10 10 Primaire monsterafname, hantering en opslag ...................................................... 10 11 Assayprocedure ....................................................................................................... 11 11.1 Somatische mutatiedetectie met SURVEYOR Scan Kits ‐ Een overzicht ............................ 11 12 Stap-voor-stap instructies ....................................................................................... 12 12.1 DHPLC EERSTE opstelling/kalibratie ................................................................................. 12 12.2 Overwegingen voorafgaand aan KRAS en NRAS Monsteranalyse .................................... 12 12.3 Template‐overwegingen .................................................................................................. 12 12.4 Workflow‐overwegingen ................................................................................................. 12 12.5 Amplificatieprotocol ........................................................................................................ 15 12.6 Thermisch cyclerprogramma voor amplificatieprotocol .................................................. 18 12.7 Kwaliteitscontrole van PCR‐producten ............................................................................ 18 12.8 SURVEYOR Nuclease Digestie .......................................................................................... 19 13 Controleprocedures ................................................................................................. 21 13.1 Kwaliteitscontrole van de CRC RAScan Combination Kit .................................................. 21 13.2 Gebruik van controleplasmide‐DNA's .............................................................................. 22 14 Interpretatie van de resultaten ................................................................................ 22 14.1 Analysis van KRAS en NRAS Exons 2, 3 en 4 met behulp van SURVEYOR Nuclease ........... 22 14.2 Gegevensbeoordeling van SURVEYOR Scan‐resultaten .................................................... 23 14.3 Voorbeelden van resultaten ............................................................................................ 24 15 Prestatiekenmerken ................................................................................................. 31 15.1 Niveau van detectie van mutaties door middel van SURVEYOR Scan Kits ........................ 31 15.2 Sequentiebevestiging ...................................................................................................... 31 15.3 Beperkingen van de assayprocedure ............................................................................... 32 Bijlage A ......................................................................................................................... 33 A.1 Plaat‐lay‐outplan voor SURVEYOR Scan Kits ...................................................................... 33 A.2 Controle DNA‐stempels ..................................................................................................... 33 A.3 Denaturering HPLC (DHPLC) Systeemvereisten ................................................................. 34 A.4 Laboratoriumopstelling voor PCR‐assays ........................................................................... 36 A.5 Literatuurreferenties ......................................................................................................... 37 Bijlage B ......................................................................................................................... 38 Gids voor het opsporen en oplossen van problemen .............................................................. 38 Bestelinformatie ............................................................................................................ 45 Contactgegevens .......................................................................................................... 45 Vertaling Disclaimer ...................................................................................................... 45 Licenties, Handelsmerken & Copyright ....................................................................... 45

1 Fabrikant

1 Fabrikant

M

Fabrikant EC Vertegenwoordiger

P

Transgenomic, Inc. 12325 Emmet Street, Omaha, NE 68164, USA Tel 1-402-452-5400 Transgenomic Limited 40 Watt Road, Hillington Park, Glasgow G52 4RY, UK Tel +44-141-892-8800

2 CRC RAScan™ Combination Kit 2.1 Beoogd gebruik Uitsluitend voor professioneel gebruik. Transgenomic’s CRC RAScan Combination Kit is een in vitro diagnostische assay die somatische mutaties in Exons 2, 3 & 4 van de KRAS en NRAS genen detecteert. Deze mutaties worden aangegeven door SURVEYOR Nuclease knippieken en omvatten die mutaties waarvan bekend is dat ze mogelijk klinisch significant zijn. Deze kit is ontwikkeld voor gebruik in laboratoria voor klinische diagnostiek door personeel dat goed opgeleid is in het testen van DNA dat verkregen is uit formaline-gefixeerd en paraffine-ingebed weefsel. Deze kit is te vinden onder catalogusnummer 710077. Deze instructies voor gebruik zijn als download verkrijgbaar op http://world.transgenomic.com/files/literature/482427-NL.pdf.

2.2 Indicaties voor gebruik Clinici kunnen de CRC RAScan Combination Kit met DHPLC-systemen gebruiken als hulpmiddel bij het beslissen of colorectale kankertumoren van patiënten mogelijk niet reageren op anti-EGFR (epidermale groeifactorreceptor) therapeutica zoals panitumumab. De CRC RAScan Combination Kit dient niet te worden gebruikt voor diagnose van colorectale of enige andere vorm van kanker. De CRC RAScan Combination Kit is een assay die de aanwezigheid van mogelijke somatische mutaties in Exons 2, 3 & 4 van de KRAS en NRAS genen detecteert maar de de sequentieidentiteit van de mutatie niet bevestigt. Om de exacte gedetecteerde mutatie te identificeren, is verdere analyse, zoals DNA-sequencing, noodzakelijk. Hoewel de resultaten van de analyse met deze kits de mutatiestatus van de patiënt zullen aangeven, dient rekening te worden gehouden met andere klinische factoren. Resultaten die zijn verkregen met behulp van de CRC RAScan Combination Kit dienen niet de enige methode te zijn die wordt gebruikt bij het nemen van beslissingen met betrekking tot een behandeling van patiënten met colorectale kanker. Het is belangrijk op te merken dat het gebruik van DHPLC voor het identificeren van monsters die positief testen voor een KRAS of NRAS mutatie met deze set alleen gebruikt dient te worden als richtlijn en alle mutaties moeten worden bevestigd door middel van aanvullende analyses, zoals DNA sequencing.

Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Kit met DHPLC-systemen

Pagina 3

3 Principes van de CRC RAScan KRAS en NRAS Mutatie detectie-assay

3 Principes van de CRC RAScan KRAS en NRAS Mutatie detectie-assay 3.1 KRAS en NRAS Therapeutica die zich richten op de epidermale groeifactorreceptor (EGFR) zijn effectief gebleken tegen colorectale kanker. Research heeft aangegeven dat ongeveer 40% van colorectale tumoren somatische KRAS genmutaties dragen en klinische onderzoeken hebben aangetoond dat mutaties in KRAS exon 2 (codonen 12 en 13) een gebrek aan respons op anti-EGFR therapieën voorspellen. Recente oriënterende onderzoeken hebben aangetoond dat de patiëntenpopulatie verder verfijnd kan worden doordat patiënten bij wie de mCRC-tumoren een bijkomende mutatie in KRAS exons 3 en 4 of NRAS exons 2, 3 en 4 herbergen ook niet de neiging vertoonden te reageren op anti-EGFR-bevattende behandeling1-7. Deze kit is ontworpen voor gebruik bij diagnostische analyse van somatische KRAS en NRAS Exons 2, 3 & 4 mutaties. De CRC RAScan Combination Kit is een assay voor het detecteren van alle sequentie en kleine insertie-/verwijderingsveranderingen in Exons 2, 3 & 4 van de KRAS en NRAS genen. Mutaties in KRAS en NRAS codonen 12, 13, 59, 61, 117 en 146 zijn in verband gebracht met het ontbreken van werkzaamheid van panitumumab. In deze kit worden Positive Controls geleverd voor mutaties in codonen 12, 61, 117 en 146. In deze kit wordt Transgenomic's eigen SURVEYOR Nucleasetechnologie gebruikt en geeft, indien gekoppeld aan de DHPLC Systeemtechnologie, simpele en gevoelige detectie van mogelijke mutaties. Het is in staat een mengsel van 2-5% mutant te detecteren in een achtergrond van niet-mutant DNA. Validatie-onderzoeken hebben extreem hoge concordantie aangetoond met sequencing in goed-gekarakteriseerde colorectale kankermonsters. Het gebruik van de CRC RAScan Combination Kit zal zowel de sequencingsbelasting verlagen als de sequence-calling helpen waar automatische sequencing software de aanwezigheid van een laag-niveaumutatie niet verklaart. In verband met de hoge gevoeligheid van deze assay in relatie tot Sanger-sequencing wordt aanbevolen de laboratoriumopstelling te optimaliseren voor vermijden van kruisbesmetting van monsters of controles. Zie voor een voorbeeld van een ideale laboratoriumopstelling Bijlage A.4 Laboratoriumopstelling voor PCR-assays.

3.2 Analyse van patiëntenmonsters met behulp van SURVEYOR Scan Kits De CRC RAScan Combination Kit dient alleen in de context van de hieronder aangegeven workflow te worden gebruikt.

Workflow Patiëntenmonster

Test KRAS en NRAS Exons 2, 3 & 4

Rapporteer resultaat Figuur 1 CRC RAScan Combination Kit workflow voor screening van KRAS en NRAS Voor een suggestie over hoe 96-wells platen opgezet moeten worden voor analyse van alle KRAS en NRAS Exons 2-4 zie Bijlage A.1 Plaatlay-outplan voor de CRC RAScan Combination Kit.


Pagina 4

3 Principes van de CRC RAScan Scan KRAS en NRAS Mutatiedetectie-assay

3.3 SURVEYOR Nuclease Transgenomic's SURVEYOR Nuclease is een mismatch-specifiek plant-DNA-endonuclease dat kan scannen voor bekende en onbekende mutaties en polymorfismen in heteroduplex DNA8. Het enzym knipt DNA met hoge specificiteit op locaties van base-substitutiemismatch en andere distorsies. Dit DNA-endonuclease knipt beide strengen van een DNA-heteroduplex aan de 3'-zijde van de mismatchlocatie. Insertie/deletiemismatches en alle base-substitutiemismatches worden herkend, maar de efficiëntie van het knippen varieert met de sequentie van de mismatch.

Figuur 2. Werkwijze van SURVEYOR Nuclease. Het endonuclease herkent een mismatch en knipt aan de 3'-zijde van elke base in de mismatch. Hierdoor wordt de dubbele DNA-streng geknipt, waarna een enkele base 3'-overhang overblijft.

SURVEYOR Nuclease is gebruikt in een groot scala aan contexten om nauwkeurig een verscheidenheid aan mutaties en polymorfismen in genen te detecteren. SURVEYOR Nuclease is met name gebruikt om de aanwezigheid van bekende mutaties in een aantal genen geassocieerd met nierkanker, longkanker, hoofd- & halskanker, leukemie, endometriale kanker te verifiëren en bij voorspelling van het resultaat van radiotherapie9,10,11. De CRC RAScan Combination Kit is ontworpen voor het knippen van mismatches in KRAS en NRAS Exons 2, 3 & 4 voor daarop volgende analyse door DHPLC. N.B.: indien een monster 100% mutant DNA is, kunnen er geen heteroduplexen worden gevormd en zal het monster verschijnen als "Wild-Type". Tumorbiopsiemonsters zullen echter Wild-Type cellen bevatten als gevolg van tumorheterogeniteit en/of verontreinigend normaal weefsel; N.B. monsters met 5% en 95% mutant DNA zullen identieke chromatogram hebben. N.B.: Voor het PCR-deel van de assay dient alleen het met deze kit meegeleverde DNA Polymerase te worden gebruikt. N.B.: Volg de specifieke instructies in de handleiding van uw DHPLC-systeem. Om deze kit met succes te gebruiken adviseren wij met klem deze handleiding grondig te lezen en de gegeven instructies en richtlijnen zorgvuldig te volgen. Eerste gebruikers dienen de in het hoofdstuk Gebruik van controleplasmide-DNA'sbeschreven controleexperimenten uit te voeren. Als u nog vragen hebt of hulp nodig hebt kunt u bellen naar (888) 233-9283 (alleen NoordAmerika), +1 (402) 452-5400 of +44 (0) 141 892 8800 (Europa) en vragen naar "KRAS en NRAS support". Als alternatief kunt u ons e-mailen op: [email protected]

Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Combination Kit met DHPLC-systemen

Pag. 5

4 Traceerbaarheid van kitcontroles

4 Traceerbaarheid van kitcontroles De met deze kit geleverde controles zijn plasmideklonen van KRAS en NRAS Exons 2, 3 & 4 sequenties. Alle klonen zijn gesequentieerd om de getrouwheid van de sequentie te controleren door middel van vergelijking met NCBI Reference Sequences: NG_007524.1 (KRAS) en NG_007572 (NRAS). De controles hebben een genetische "stempel" Zie Bijlage A.2 Controle DNA-stempels; deze zijn variaties van de KRAS of NRAS Wild-Type sequenties in een regio waarvan niet wordt verwacht dat deze mutaties heeft en kan worden gebruikt voor het opsporen en oplossen van problemen met verontreiniging van monsters door middel van Positive Controls. Zie Bijlage B Gids voor het opsporen en oplossen van problemen, Probleem 8, voor een voorbeeld van een SURVEYOR Scan spoor van een dergelijke verontreiniging. De "KRAS Control Wild-Type"werd geconstrueerd door middel van synthese en klonen van KRAS Exons 2, 3 en 4 met behulp van de NCBI Reference Sequence NG_007524.1. De "KRAS Positive Control Exon 2" werd geconstrueerd door middel van synthese van KRAS Exon 2 met behulp van de bovengenoemde referentiesequentie maar die de G12D-mutatie bevat. DNA-sequentiëring bevestigde dat de enige verandering in de sequentie op codon 12 is met een G12D, GGT>GAT, alteratie. Deze kloon wordt vervolgens vermengd met KRAS Control Wild-Type DNA voor het creëren van een heterozygoot mengsel. De "KRAS Positive Control Exon 3" werd geconstrueerd door middel van synthese van KRAS Exon 3 met behulp van de bovengenoemde referentiesequentie maar die de Q61H-mutatie bevat. DNA-sequentiëring bevestigde dat de enige verandering in de sequentie op codon 61 is met een Q61H, CAA>CAC, alteratie. Deze kloon wordt vervolgens vermengd met KRAS Control Wild-Type DNA voor het creëren van een heterozygoot mengsel. De "KRAS Positive Control Exon 4A" werd geconstrueerd door middel van synthese van KRAS Exon 4 met behulp van de bovengenoemde referentiesequentie maar die de K117N-mutatie bevat. DNA-sequentiëring bevestigde dat de enige verandering in de sequentie op codon 117 is met een K117N, AAA>AAT, alteratie. Deze kloon wordt vervolgens vermengd met KRAS Control Wild-Type DNA voor het creëren van een heterozygoot mengsel. De "KRAS Positive Control Exon 4B" werd geconstrueerd door middel van synthese van KRAS Exon 4 met behulp van de bovengenoemde referentiesequentie maar die de A146T-mutatie bevat. DNA-sequentiëring bevestigde dat de enige verandering in de sequentie op codon 146 is met een A146T, GCA>ACA, alteratie. Deze kloon wordt vervolgens vermengd met KRAS Control WildType DNA voor het creëren van een heterozygoot mengsel. De "NRAS Control Wild-Type"werd geconstrueerd door middel van synthese en klonen van NRAS Exons 2, 3 en 4 met behulp van de NCBI Reference Sequence NG_007572. De "NRAS Positive Control Exon 2" werd geconstrueerd door middel van synthese van NRAS Exon 2 met behulp van de bovengenoemde referentie maar die de G12D-mutatie bevat. DNAsequentiëring bevestigde dat de enige verandering in de sequentie op codon 12 is met een G12D, GGT>GAT, alteratie. Deze kloon wordt vervolgens vermengd met NRAS Control Wild-Type DNA voor het creëren van een heterozygoot mengsel. De "NRAS Positive Control Exon 3" werd geconstrueerd door middel van synthese van NRAS Exon 3 met behulp van de bovengenoemde referentiesequentie maar die de Q61K-mutatie bevat. DNA-sequentiëring bevestigde dat de enige verandering in de sequentie op codon 61 is met een Q61K, CAA>AAA, alteratie. Deze kloon wordt vervolgens vermengd met NRAS Control Wild-Type DNA voor het creëren van een heterozygoot mengsel. De "NRAS Positive Control Exon 4" werd geconstrueerd door middel van synthese van NRAS Exon 4 met behulp van de bovengenoemde referentiesequentie maar die de A146T-mutatie bevat. DNA-sequentiëring bevestigde dat de enige verandering in de sequentie op codon 146 is met een A146T, GCC>ACC, alteratie. Deze kloon wordt vervolgens vermengd met NRAS Control WildType DNA voor het creëren van een heterozygoot mengsel.


Pagina 6

5 Componenten

5 Componenten De CRC RAScan Combination Kit wordt geleverd in een enkele koker als twee afzonderlijke dozen: (a) één doos reagentia voor analyse van KRAS Exons 2, 3 & 4 en (b) één doos reagentia voor analyse van NRAS Exons 2, 3 & 4. Samen bevatten de dozen voldoende reagentia voor de uitvoering van het in Paragraaf 5.3 vermelde aantal analyses.

5.1 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2, 3 & 4 Box (h 710107) De doos met componenten voor analyse van KRAS Exons 2, 3 & 4 heeft twee binnenboxen: (1) een SURVEYOR Digestiecomponentendoos met 10 reagensbuisjes en (2) een buiten PCRcomponenten en controlebuishouder met 20 reageerbuisjes. Catalogus -nummer

Onderdeel

Buisdop Kleur

130-Reactiekit Volume verstrekt

Paars Zwart Roze Bruin Rood

3 x 105 µL 2 x 105 µL 2 x 105 µL 2 x 105 µL 250 µL

Helder Helder Helder Blauw Blauw Blauw Blauw Blauw Blauw Blauw Blauw Geel Groen Groen Groen Groen Oranje Oranje

2 x 100 µL 1 mL 2 x 500 µL 125 µL 125 µL 90 µL 90 µL 90 µL 90 µL 90 µL 90 µL 120 µL 40 µL 40 µL 40 µL 40 µL 125 µL 125 µL

SURVEYOR Digestiecomponentendoos 710160 710161 708049 708027 708030

SURVEYOR Nuclease W SURVEYOR Enhancer W2 SURVEYOR Enhancer Cofactor 0.15 M MgCl2 Solution Stop Solution

PCR componenten- en controledoos 703310 703315 703065 710155F 710155R 710157F 710157R 710154F 710154R 710156F 710156R 710131 710135 710136 710137 710138 710153F 710153R

DNA Polymerase 10x DNA Polymerase Reaction Buffer dNTPs (10 mM) KRAS Primer: Exon 2 Forward (10 µM) KRAS Primer: Exon 2 Reverse (10 µM) KRAS Primer: Exon 3 Forward (10 µM) KRAS Primer: Exon 3 Reverse (10 µM) KRAS Primer: Exon 4A Forward (10 µM) KRAS Primer: Exon 4A Reverse (10 µM) KRAS Primer: Exon 4B Forward (10 µM) KRAS Primer: Exon 4B Reverse (10 µM) KRAS Control Wild-Type KRAS Positive Control Exon 2 KRAS Positive Control Exon 3 KRAS Positive Control Exon 4A KRAS Positive Control Exon 4B Universal Sequencing Primer 1 (10 µM) Universal Sequencing Primer 2 (10 µM)


Pag. 7

5 Componenten

5.2 SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 Box (h 710400) De doos met componenten voor analyse van NRAS Exons 2, 3 & 4 heeft twee binnendozen: (1) een SURVEYOR Digestiecomponentendoos met 10 reagensbuisjes zonder lege openingen en (2) een buiten PCR-componenten en controlebuishouder met 14 reageerbuisjes. Catalogus -nummer

Onderdeel

Buisdop Kleur

100-Reactiekit Volume verstrekt

Paars Zwart Roze Bruin Rood Oranje Oranje

2 x 105 µL 105 µL 105 µL 105 µL 250 µL 2 x 125 µL 2 x 125 µL

Rood Rood Helder Helder Blauw Blauw Blauw Blauw Blauw Blauw Geel Groen Groen Groen

100 µL 20 µL 1 mL 500 µL 90 µL 90 µL 90 µL 90 µL 90 µL 90 µL 120 µL 40 µL 40 µL 40 µL

SURVEYOR Digestiecomponentendoos 710160 710161 708049 708027 708030 710153F 710153R

SURVEYOR Nuclease W SURVEYOR Enhancer W2 SURVEYOR Enhancer Cofactor 0.15 M MgCl2 Solution SURVEYOR Stop Solution Universal Sequencing Primer 1 (10 µM) Universal Sequencing Primer 2 (10 µM)

PCR componenten- en controledoos 703310 703312 703315 703065 710452F 710452R 710453F 710453R 710454F 710454R 710441 710442 710443 710444

DNA Polymerase (250 U) DNA Polymerase (50 U) DNA Polymerase 10X PCR Buffer dNTPs (10 mM) NRAS Primer Exon 2 Forward (10 µM) NRAS Primer Exon 2 Reverse (10 µM) NRAS Primer Exon 3 Forward (10 µM) NRAS Primer Exon 3 Reverse (10 µM) NRAS Primer Exon 4 Forward (10 µM) NRAS Primer Exon 4 Reverse (10 µM) NRAS Control Wild-Type Mix NRAS Positive Control Exon 2 NRAS Positive Control Exon 3 NRAS Positive Control Exon 4

5.3 Aantal monsters dat met één kit kan worden getest De CRC RAScan Combination Kit is ontworpen voor het testen van 230 reacties. Het totale aantal monsters dat met de kit kan worden getest is afhankelijk van de gemiddelde batchgrootte die op enig moment wordt getest omdat in elke reactieplaat één set controlereacties (Wild-Type Controls, Positive Controls en Geen-templatecontroles) moet worden opgenomen. De onderstaande tabel toont het aantal monsters dat kan worden geanalyseerd met de KRAS en NRAS kit, afhankelijk van de gemiddelde monsterbatch-grootte. Hierbij wordt rekening gehouden met (a) de 21 controles (7x Wild-Type, 7x Positive Controls, 7x Geen-templatecontroles) die voor elke run nodig zijn en (b) de limiet van 230 reacties per kit. N.B.: Bij het draaien van meerdere platen, moet elke set van de 21 hierboven vermelde controles op elke plaat zijn. Daarom zullen twee platen in totaal 42 controlereacties nodig hebben; 3 platen zullen 63 controlereacties nodig hebben; enz.


Pag. 8

5 Componenten

Wanneer de monsterbatchgrootte wordt verhoogd, wordt het aantal monsters dat met één kit kan worden getest verhoogd, waardoor de gemiddelde reagenskosten per monster worden verlaagd. De onderstaande tabel is een richtlijn voor het aantal monsters dat met de kits kan worden getest. Monster -batch -grootte

Aant. Controlereacties + aant. monsteramplicons

Aant. reacties nodig per run

Totaal aant. monsterbatchruns per Kit

Totaal monsters getest per kit

1

21 + 7

28

8

8

2

21 + 14

35

6

12

3

21 + 21

42

5

15

4

21 + 28

49

4

16

5

21 + 35

56

4

20

5.4 DNA-sequencing sequencing primers (PN's 710153F en 710153R) worden geleverd voor gebruik voor DNAsequencing van alle geteste monsters. De PCR-amplicons die voorafgaand aan SURVEYOR Nuclease-digestie werden gecreëerd dienen voor sequencing te worden gebruikt.

6 Extra benodigde apparatuur en reagentia Extra componenten en apparatuur nodig voor gebruik van de CRC RAScan Combination Kit met DHPLC omvat het volgende: DHPLC-systeem, kolom, buffers, DNA-grootte standaard - zie Bijlage A.3.1 DHPLC-specificaties voor SURVEYOR Scan-toepassingen voor kenmerken van een geschikt DHPLC-systeem voor gebruik met deze kit Moleculaire biologieklasse water 0,2 mL-PCR-buisjes, strips of 96-wellsplaat Micropipetten Pipettips IJsbad Vortexmixer Microcentrifuge Thermische cycler Agarosegels en agarosegelelektroforese-apparatuur 10% bleekmiddel of soortgelijk reinigingsmiddel

7 Reagensbereiding Alle met deze kit geleverde reagentia zijn klaar voor gebruik. Sommige componenten zullen vóór gebruik moeten worden ontdooid, gevortexed of worden gecentrifugeerd in een microcentrifuge; controleer bijzonderheden in de hieronder vermelde Assayprocedure. Reagentia dienen te worden gecombineerd voor het produceren van mastermixen en reactiemengsels; volledige bijzonderheden worden gegeven in de onderstaande Assayprocedure.


Pag. 9

8 Opslag en houdbaarheid

8 Opslag en houdbaarheid De kit dient tot gebruik te worden bewaard bij temperaturen tussen de -18 ºC en -25 °C in een vriezer met constante temperatuur. Let op de uiterste gebruiksdatum van elke ontvangen kit. Gebruik de kit niet nadat de uiterste gebruiksdatum is verstreken. Het SURVEYOR Nuclease mengsel dat in Stap 7 van SURVEYOR Nuclease digestie werd bereid dient onmiddellijk te worden gebruikt daar SURVEYOR Nuclease W na verloop van tijd inactief wordt bij aanwezigheid van de andere SURVEYOR Nucleasereactiemengselcomponenten.

9 Waarschuwingen en voorzorgen In de geleverde hoeveelheden vormen geen van de in deze kit aanwezige reagentia een gevaar voor de gezondheid. Transgenomic's documentnummer MSD-710077 kan worden gedownload van http://world.transgenomic.com/files/literature/710077-NL.pdf Deze kit bevat geen stoffen van dierlijke of menselijke oorsprong die een infectierisico vormen. Deze kit dient alleen te worden gebruikt door die personen die zijn getraind in de betreffende laboratoriumtechnieken. Tijdens het werken met de componenten van deze kit dient men altijd een geschikte labjas, wegwerphandschoenen en oogbescherming te dragen. Na gebruik dienen de kitcomponenten te worden weggegooid als klinisch afval en in overeenstemming met uw plaatselijke voorschriften. Delen van reagentia die uit buizen in deze kit zijn gepipetteerd, zijn uitsluitend bedoeld voor eenmalig gebruik. Van de componenten van deze kit is aangetoond dat zij na 25 cycli van invriezen en ontdooien nog steeds stabiel zijn. Gebruik deze kit niet wanneer dit aantal cycli van invriezen en ontdooien is overschreden.

10 Primaire monsterafname, hantering en opslag De CRC RAScan Combination Kit is gevalideerd voor gebruik met DNA geëxtraheerd uit formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde (FFPE) colorectale kankertumormonsters. Voor optimale DNA-extractie dient het weefsel gedurende 14-24 uur voorafgaand aan het inbedden in paraffine te worden gefixeerd in formaline. Tumorenbiopten zijn een heterogeen mengsel van tumorcellen en niet-tumorcellen. Bovendien is de tumor zelf een heterogeen mengsel van tumorcellen met mutaties en tumorcellen zonder mutaties. Daar deze somatische mutaties mogelijk niet gelijkmatig door de tumor zijn verspreid, kan de resulterende mutationele analyse van verschillende delen van dezelfde tumor verschillend zijn. Om de waarschijnlijkheid van het detecteren van een mutatie te verhogen, dient DNA van de tumorregio van het weefsel te worden geïsoleerd door alleen het tumorgebied van het glaasje te schrapen met behulp van een vers, steriel scalpel voor elk nieuw glaasje. Voor succesvol gebruik van deze kit dient het geëxtraheerde DNA te voldoen aan de criteria die worden vermeld in Template-overwegingen. N.B.: Geëxtraheerde DNA-monsters die niet voor onmiddellijke analyse met deze kit zijn bedoeld dienen bevroren te worden opgeslagen bij -20 ºC tot -80 ºC.


Pag. 10

11 Assayprocedure

11 Assayprocedure 11.1 Somatische mutatiedetectie met SURVEYOR Scan Kits - Een overzicht Mutatiedetectie en bevestiging met SURVEYOR Nuclease houdt drie stappen in:

Stap 1 - Bereid PCR-amplicons uit mutant (test) en normaal (referentie) DNA, ga door vanaf de laatste PCR-amplificatiecyclus om alle dubbele strengen te smelten en laat ze vervolgens langzaam afkoelen voor optimale vorming van hetero- en homoduplexen (heteroduplexen treden op wanneer één streng van een Wild-Type sequentie uitgloeit met één streng van een mutantsequentie). Stap 2 - Behandel een deel van het uitgegloeide heteroduplex-/homoduplexmengsel met SURVEYOR Nuclease. SURVEYOR Nuclease zal beide strengen heteroduplex DNA knippen waardoor DNA-fragmenten ontstaan. Het Control Wild-Type DNA, dat op dezelfde manier wordt behandeld, doet dienst als achtergrondcontrole. Stap 3 - Analyseer de DNA-fragmenten op een DHPLC-systeem. De vorming van nieuwe knipproducten, als gevolg van de aanwezigheid van één of meer mismatches, wordt aangegeven door de aanwezigheid van extra chromatografische pieken. De migratietijden van de knipproducten geven de grootte van de fragmenten aan en daarom ongeveer de locatie van de mismatch of mismatches.


Pag. 11

12 Stap-voor-stap instructies

12 Stap-voor-stap instructies 12.1 DHPLC EERSTE opstelling/kalibratie Raadpleeg bij het opstellen van de SURVEYOR Nuclease-plaat voor analyse door DHPLC de Bijlage A.3 Denaturing HPLC (DHPLC) Systeemvereisten.

12.2 Overwegingen voorafgaand aan KRAS en NRAS Monsteranalyse Voorafgaand aan het laten lopen van monsters op een DHPLC-systeem, moet een passende DNA-groottestandaard worden verwerkt om zeker te stellen dat het systeem goed werkt. Laboratoriumpersoneel dat het instrument gebruikt dient de kwaliteit van de DNAgroottestandaardresolutie te controleren alvorens aan de analyse te beginnen.

12.3 Template-overwegingen 1. Gebruik voor FFPE-geïsoleerd template-DNA normale laboratoriumprocedures om de kwaliteit en kwantiteit van geëxtraheerd DNA te bepalen om zeker te stellen dat er voldoende template is voor PCR. 2. De 260/280 absorptieratio dient hoger te zijn dan 1,80. 3. Voor het bespoedigen van de PCR-opstelling de werktemplateconcentratie instellen op ongeveer 12,5 ng/µL. Verdun het template-DNA indien nodig in moleculaire biologieklasse water.

12.4 Workflow-overwegingen De kit is ontworpen om analyse van 230 reacties mogelijk te maken. Kleinere monsterbatches kunnen wel worden gedraaid, maar de kitcontroles en een "geen templatecontrole" moeten bij elke batch monsters worden opgenomen. Er zitten voldoende controlematerialen in de kit voor 230? reacties van alle te gebruiken combinaties van monsterbatchgrootten. Over het algemeen dient het verwerken van monsters van begin tot einde te worden uitgevoerd volgens de beschrijving in deze instructies voor gebruik. Wanneer het verwerken van een monster vóór voltooiing van alle stappen moet worden gestopt, dient het DNA bij -20 °C op de aangegeven punten te worden bewaard. Blootstelling van elk bevroren monster aan herhaalde ontdooieninvriezen cycli dient echter te worden vermeden en bevroren opslag bij (-18 tot -25 °C) van PCRgeamplificeerde DNA of SURVEYOR Nuclease-digestieproducten gedurende langere perioden (>1 week) dient te worden vermeden.


Pag. 12


Analyse van monsters dient de hieronder getoonde workflow te volgen: Schraap weefsel

1

DNAisolatie & PCR

2

Gelelektroforese 3

Score Robuust/Zwak PCR 4

5

SURVEYOR Scan Mislukt

SURVEYOR Nuclease & DHPLC-analyse

SURVEYOR Scan Positief

SURVEYOR Scan Negatief 6

7

NVD Sequentiebevestiging

8

Sequentiekwaliteit Mislukt

Sequentiekwaliteit Goed 9

Mutaties in KRAS of NRAS codonen G12, G13, A59, Q61, K117 of A146

NVD

Figuur 3 Workflow van CRC RAScan Combination Kit analyse


Pag. 13


Opmerkingen bij Figuur 3 1. Isoleer het DNA uit FFPE met behulp van standaard laboratoriumprocedures. 2. Voer PCR uit en controleer de kwaliteit van DNA door middel van gelelektroforese. 3. Registreer of de PCR-band Robuust (≥20 ng) of Zwak (<20 ng) is. Bereid, wanneer er meerdere PCR-banden zijn, vers genomisch DNA uit FFPE. 4. Met monsters die zijn geklasseerd als hetzij Robuust PCR of Zwak PCR na PCRamplificatie, gaat u door naar SURVEYOR Nuclease-behandeling en DHPLCsysteemanalyse. N.B. met een zwakke PCR-call is er mogelijk niet voldoende DNA voor het genereren van duidelijke resultaten door middel van DHPLC, maar er is mogelijk wel voldoende DNA voor sequentiëring. 5. Zie Bijlage B – Gids voor het opsporen en oplossen van problemenvoor voorbeelden van mislukte SURVEYOR Scan resultaten. Alle monsters met een mislukt SURVEYOR Scan resultaat dienen opnieuw te worden bewerkt hetzij door middel van: a. het herhalen van PCR wanneer er voldoende genomisch DNA over is. b. het opnieuw extraheren van DNA uit FFPE; dit dient de tweede keuze te zijn daar het gewoonlijk ongewenst is om nog een FFPE-blok te snijden. c.

bij gebruik van een andere sectie of een ander blok dient de gehele assay te worden herhaald daar verschillen in digesties het gevolg kunnen zijn van tumorheterogeniteit.

6. Als er geen zichtbare knippieken zijn, noteert u een negatief SURVEYOR Scan-resultaat, d.w.z. NVD = Geen variant gedetecteerd. 7. Wanneer een monster SURVEYOR Nuclease-knipproducten vertoont (komt niet overeen met de relevante Wild-Type Control) dienen zij te worden opgestuurd voor sequentiëringsbevestiging. 8. Wanneer sequentiebevestigingsanalyse onacceptabel is, dan: a. herhaalt u PCR wanneer er voldoende genomisch DNA over is, of b. extraheert u opnieuw DNA uit FFPE; dit dient de tweede keuze te zijn daar het gewoonlijk ongewenst is om extra glaasjes uit een FFPE-blok te snijden. 9. Wanneer sequentiebevestigingsanalyse acceptabel is, dienen de resultaten aan te geven: a. Wild-Type sequentie, dat wil wil zeggen, Geen variant gedetecteerd (NVD); of b. Variant gedetecteerd. Wanneer sequentiebevestiging een baseverandering aangeeft die resulteert in een aminozuurverandering op: i. codon 12 of 13 ii. codon 59 of 61 iii. codon 117; of iv. codon 146 beoordelen als KRAS of NRAS mutatie positief. N.B.: het is mogelijk een positieve SURVEYOR Scan-call te hebben die ook resulteert in "geen variant gedetecteerd" uit een sequentiebevestigingstest. Het detectieniveau (LOD) van SURVEYOR Nuclease op een DHPLC-systeem is slechts 2% mutant in 98% Wild-Type DNA voor sommige mutaties, terwijl de sequentiërings-LOD ongeveer 10-25% mutant is in 90-75% WildType DNA. N.B.: indien een monster 100% mutant DNA is, kunnen er geen heteroduplexen worden gevormd en zal het monster verschijnen als "Wild-Type? Tumorbiopsiemonsters zullen echter Wild-Type cellen bevatten als gevolg van tumorheterogeniteit en/of verontreinigend normaal weefsel.


Pag. 14


N.B.: monsters met 5% en 95% mutant DNA zullen identieke chromatogram hebben. N.B.: positieve SURVEYOR Scan-resultaten kunnen het gevolg zijn van andere baseveranderingen dan die, die KRAS- of NRAS-activerend bleken te zijn. Hoewel deze mutaties zeldzaam zijn, zal bevestiging via een andere methode, zoals DNA-sequentiëring, nodig zijn om te bepalen of een positief SURVEYOR Scan-resultaat een KRAS- of NRAS-activerende mutatie is of niet. N.B.: het formaline-fixatieproces dat wordt gebruikt bij het bereiden van FFPEtumorbiopsiemonsters kan resulteren in deaminering van cytosinen. Deze deaminering zet cytosine om in uracil. Het polymerase zal dit uracil "lezen" als een thymine en een adenine opnemen in de gekopieerde strengen. Dit zal vervolgens lijken op een mutatie waarin de normale G nu wordt vervangen door een A die ervoor zorgt dat een GC in A/T-mutatie verandert die een artefactmutatie is die resulteert uit het fixatieproces en geen werkelijke somatische mutatie is. Dit zijn zeldzame voorvallen, maar wanneer zij vroeg in de PCR-cyclus worden gekopieerd, zullen zij "lijken" op mutaties. Zij herhalen niet bij heranalyse. Voorbeelden van mogelijke cytosinedeamineringsmutaties die overwogen zouden worden voor het bepalen van de behandeling van een patiënt zijn voor KRAS: -

Codon 12: AGT (G12S) en GAT (G12D)

-

Codon 13: AGC (G13S), GAC (G13D) en GGT (G13G, een stille mutatie)

-

Codon 146: GCA>ACA (A146T)

Voorbeelden van mogelijke cytosinedeamineringsmutaties die overwogen zouden worden voor het bepalen van de behandeling van een patiënt zijn voor NRAS: -

Codon 12: GGT> AGT (G12S) of GAT (G12D)

-

Codon 13: GGT> AGT (G13S), GAT (G13D) of GGC (G13G, een stille mutatie)

-

Codon 146: GCC>ACC (A146T)

Daarom is het raadzaam elke dergelijke mutatie te bevestigen door middel van duplicaatanalyse van hetzelfde genomische DNA of alle monsters vanaf de start van de analyse te onderwerpen aan duplicaatanalyse.

12.5 Amplificatieprotocol 1. De Transgenomic voorgemengde dNTP-oplossingen (PN's 703065 en 705020) worden geleverd in een werkconcentratie van 10 mM totale deoxynucleotide (2,5 mM van elk van de vier deoxynucleotiden). 2. De KRAS en NRAS Forward en Reverse PCR primers (KRAS PN's 710155F/R, 710157F/R, 710154F/R en 710156F/R; NRAS PN's 710452F/R, 710453F/R en 710454F/R) worden geleverd op 10 µM. 3. Neem de 10 µM primers, 10 mM dNTP's en DNA Polymerase 10X PCR Buffer (PN 703315) uit de vriezer en laat ze op ijs ontdooien. 4. Na het ontdooien alle kitcomponenten ~10 seconden vortexen om ze grondig te mengen, kort centrifugeren ~10 seconden om zeker te stellen dat er geen vloeistof achterblijft op de doppen van de buisjes en op ijs plaatsen. 5. Bereid de mastermixen op ijs.


Pag. 15


6. Gebruik de volgende tabel als richtlijn voor het bereiden van een mastermix voor elk van KRAS Exon 2, KRAS Exon 3, KRAS Exon 4A, KRAS Exon 4B reacties, NRAS Exon 2, NRAS Exon 3 en NRAS Exon 4 reacties: Aantal reacties (7 Monsters + 3 controles): Volumeberekening: Watervolume (µL) DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µL) dNTP's (µL) Forward Primer (µL) Reverse Primer (µL) DNA Polymerase (µL) Totaal volume mastermix

10 330** 50 40 25 25 10 48.0

**N.B.: De gebruiker dient ernaar te streven minimaal 25 ng DNA per 50 µL PCRreactie te hebben. Wanneer geëxtraheerde DNA-concentraties minder zijn dan 12,5 ng/µL, het volume van geëxtraheerd DNA proportioneel verhogen om 25 ng per reactie zeker te stellen. Verlaag ook het watervolume in de mastermixen met dezelfde hoeveelheid om te resulteren in 50 µL per reactie. Alle met deze mastermixen bereide monsters dienen geëxtraheerd DNA verdund te hebben tot ongeveer hetzelfde laagste concentratieniveau. Het gebruik van geëxtraheerde DNA-concentraties van minder dan 5 ng/µL wordt afgeraden. 7.

Bereken de benodigde volumes voor elke gegeven mastermix door middel van referentie met de bovenstaande tabel; N.B.: (a) Voor mastermix 1, KRAS Exon 2, zullen drie extra reacties per monsterplaat nodig zijn: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 2 en de KRAS Exon 2 geen-templatecontrole (NTC1). (b) Voor mastermix 2, KRAS Exon 3, zullen drie extra reacties per monsterplaat nodig zijn: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 3 en de KRAS Exon 3 geen-templatecontrole (NTC2). (c) Voor mastermix 3, KRAS Exon 4A zullen drie extra reacties per monsterplaat nodig zijn: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 4A en de KRAS Exon 4A Geen-templatecontrole (NTC1). (d) Voor mastermix 4, KRAS Exon 4B zullen drie extra reacties per monsterplaat nodig zijn: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 4B en de KRAS Exon 4B Geen-templatecontrole (NTC4). (e) Voor mastermix 5, NRAS Exon 2 zullen drie extra reacties per monsterplaat nodig zijn voor de NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 2 en de NRAS Exon 2 Geen-templatecontrole (NTC5). (f)

Voor mastermix 6, NRAS Exon 3 zullen drie extra reacties per monsterplaat nodig zijn voor de NRAS Control Wild-Type, de NRAS Positive Control Exon 3 en de NRAS Exon 3 Geen-templatecontrole (NTC6).

(g) Voor mastermix 7, NRAS Exon 4 zullen drie extra reacties per monsterplaat nodig zijn voor de NRAS Control Wild-Type, de NRAS Positive Control Exon 4 en de NRAS Exon 4 Geen-templatecontrole (NTC7). N.B.: houd er rekening mee dat een iets groter mastermixvolume dan deze berekening nodig zal zijn om verliezen tijdens het pipetteren op te vangen. 8. Voorzie 0,2 mL PCR-buisjes of wells van een 96-wellsplaat van een etiket met de juiste monsterinformatie. 9. Voorzie 2,0 mL centrifugebuisjes voor het bereiden van mastermix van een etiket. 10. Voeg de gewenste hoeveelheid moleculaire-biologieklasse water toe aan de 2,0 mL centrifugebuisjes met het etiket "Mastermix".


Pag. 16


11. Voeg de gewenste mastermixbuisjes toe.

hoeveelheid

DNA

Polymerase

10X

PCR

Buffer

aan

de

12. Voeg de gewenste hoeveelheid van de 10 mM dNTP's toe aan de mastermixbuisjes. 13. Voeg de gewenste hoeveelheid van de KRAS of NRAS Forward Primers toe aan hun respectievelijke mastermixbuisjes. 14. Voeg de gewenste hoeveelheid van de KRAS of NRAS Reverse Primers toe aan hun respectievelijke mastermixbuisjes. 15. Neem de DNA Polymerase (PN 703310) uit de vriezer. 16. Centrifugeer de DNA Polymerase gedurende ~10 seconden. 17. Vortex de DNA Polymerase gedurende ~10 seconden. 18. Voeg de gewenste hoeveelheid van de DNA Polymerase toe aan de mastermixbuisjes. 19. Doe de dop op de mastermixbuisjes. 20. Vortex de mastermixbuisjes vóór gebruik gedurende ~30 seconden en centrifugeer vervolgens kort gedurende ~10 seconden. 21. Bewaar op ijs tot gebruik. 22. Pipetteer 48,0 µL (zie bovenstaande opmerking in stap 6) van de mastermix in de juiste wells, vervang pipettips tussendoor bij gebruik van een enkelkanaalspipet. Zorg er bij gebruik van een herhalingspipet voor dat er van de ene well naar de andere niet wordt gemorst of gespetterd. Houd de plaat op ijs. 23. Doe 2,0 µL (zie bovenstaande opmerking in stap 6) van elke monstertemplate DNA of water (geen templatecontrole, NTC) in de juiste wells. Gebruik afzonderlijke pipettips voor elk monster en vermijd kruisverontreiniging van de monsters door spetteren. Doe, zodra u klaar bent met pipetteren, een dop op de wells met de monster-DNA's en de NTC met de 8-dopsstrips (wanneer u een 96-wellsplaat gebruikt) of doe een dop op de 0,2 mL PCRbuisjes. Controleer of de doppen goed zijn gesloten. 24. Open pas daarna één voor één de controle template DNA's (PN's 710131, 710135, 710136, 710137, 710138, 710441, 710442, 710443 & 710444) van de kits. Pipetteer 2,0 µL van elk van de controletemplates het laatst om de kans op verontreiniging van een DNA-monster te verminderen. Doe opnieuw op elke well een dop met de 8-dopsstrips (wanneer u een 96-wellsplaat gebruikt) of doe een dop op de 0,2 mL-PCR-buizen. Controleer of de doppen goed zijn gesloten. N.B.: Goede praktijk is het plaatsen van de geen-templatecontroles (NTC) in wells die zich niet naast Positive Controls of monsters bevinden. N.B.: Voor een suggestie over hoe 96-wellplaten opgezet moeten worden voor analyse van alle KRAS en NRAS exons 2-4 zie Bijlage A.1 Plaat-lay-outplan voor SURVEYOR Scan Kits. 25. Vortex (~1/2 toerental) gedurende 10 seconden. 26. Centrifugeer gedurende 1-2 minuten om zeker te stellen dat alle oplossingen op de bodem van de wells of buisjes worden verzameld. Verifieer of de oplossingen zich onderin elke well of elk buisje bevinden. Indien dit niet het geval is, het centrifugeren herhalen.


Pag. 17


12.6 Thermisch cyclerprogramma voor amplificatieprotocol 1. Gebruik het volgende heteroduplexvorming:

thermische

cyclerprotocol

voor

PCR-amplificatie

en

Eerste denaturatie 95 C Touchdownamplificatie 15 cycli

30 cycli

1 cyclus

95 C 62 C, -0,5 ºC/cyclus 72 C Amplificatie

5 minuten 30 seconden 30 seconden 25 seconden

95 C 55 C 72 C Eindextensie

30 seconden 30 seconden 25 seconden

72 C Heteroduplex-vorming 95 ºC

2 minuten

≤12 C

2 minuten Stoppen

12.7 Kwaliteitscontrole van PCR-producten 1. Het is raadzaam dat amplicon-kwaliteit en kwantiteit worden gecontroleerd door middel van gelelektroforese (of gelijksoortige middelen) alvorens door te gaan naar SURVEYOR Nuclease-digestie. 2. Analyseer een deel van het PCR-product samen met een aantal verschillende hoeveelheden van een 100-bp DNA-massaladder. 3. Gebruik de ladder om de concentratie van het geamplificeerde DNA te bepalen. 4. Er mag slechts een enkele band van meer dan 20 ng/µL, die overeenkomt met het hoofd PCR-product, te zien zijn. 5. Wanneer er meerdere banden aanwezig zijn, controleer dan of de kwaliteit van het inputtemplate-DNA voldoende was (zie Bijlage B – Opsporen en oplossen van problemen). 6. Wanneer geen product wordt opgemerkt, controleer dan of de kwaliteit van het inputtemplate-DNA voldoende was (zie Bijlage B – Gids voor het opsporen en oplossen van problemen). Wanneer de kwaliteit voldoet aan de specificaties, verhoog dan het templatevolume tot 4,0 µL per 50 µL reactie (verminder het water per reactie tot 31,0 µL). 7. Er mogen geen PCR-producten zichtbaar zijn in het geen-template-controlemonster. Wanneer er DNA-producten zichtbaar zijn, is bij deze controle verontreiniging waarschijnlijk; zie Bijlage B - Gids voor het opsporen en oplossen van problemen. 8. Beoordeel de PCR als Robuuste PCR of Zwakke PCR. a. Robuuste PCR dient een enkele band van meer dan of gelijk aan 20 ng/µL te hebben. b. De zwakke PCR dient een enkele band van minder dan 20 ng/µL te hebben. c.

Ga door naar SURVEYOR Nuclease digestie met zowel Robuuste als Zwakke PCR-beoordelingen.

TIP: in dit stadium kunnen PCR-producten bij minder dan of gelijk aan -20 ºC gedurende maximaal één week worden opgeslagen.


Pag. 18


12.8 SURVEYOR Nuclease Digestie 1. Nadat het monster-PCR van voldoende kwaliteit en kwantiteit wordt geacht, voert u de SURVEYOR Nuclease digestiereactie op de hieronder beschreven wijze uit. Een monsterconcentratie van meer dan of gelijk aan 20 ng/µL is noodzakelijk voor optimale digestie door middel van SURVEYOR Nuclease. 2. Ontdooi de buisjes met 0,15 M MgCl2 Solution en SURVEYOR Enhancer Cofactor op ijs. 3. Voeg 10,0 µL van elk hierboven vermeld PCR-geamplificeerd monster toe aan een nieuwe 0,2 mL-PCR-buis of well van een 96-wellsplaat. 4. Bereid een vers mengsel van 0.15 M MgCl2 Solution, SURVEYOR Enhancer Cofactor, SURVEYOR Enhancer W2 en SURVEYOR Nuclease W (SURVEYOR Nuclease mengsel). Gebruik de volgende tabel als richtlijn voor het bereiden van een SURVEYOR Nuclease Digest mastermix voor analyse van meerdere monsters. Het onderstaande voorbeeld heeft de volumes voor een mastermix voor 10 monsters. Houd er rekening mee dat een iets groter mastermixvolume dan deze berekening nodig zal zijn om verliezen tijdens het pipetteren op te vangen. Aantal SURVEYOR Nuclease Digestreacties:

10

Volumeberekening: 0.15 M MgCl2 Solution (µL) SURVEYOR Enhancer Cofactor (µL) SURVEYOR Enhancer W2 (µL) SURVEYOR Nuclease W (µL) Totaal mastermixvolume:

10.0 10.0 10.0 20.0 50.0

Voeg aan elke 5 µL SURVEYOR Nuclease mastermix PCR-geamplificeerd monster (µL)

10.0

Totaal volume SURVEYOR Nuclease Digestreactie:

15.0

a. Centrifugeer elk reagens vóór gebruik. b. Vortex elk reagens voorzichtig voorafgaand aan pipettering; centrifugeer kort gedurende ~10 seconden na elke vortexstap. c.

Voeg voor elke digestie de volgende componenten toe aan een 0,2 mL-PCR (of groter) microcentrifugebuis. 1.0 µL 0.15 M MgCl2 Solution (PN 708027) 1.0 µL SURVEYOR Enhancer Cofactor (PN 708049) 1.0 µL SURVEYOR Enhancer W2 (PN 710161) 2.0 µL SURVEYOR Nuclease W (PN 710160) Of voeg 5 µL mastermix zoals bereid in de bovenstaande tabel toe.

5. Vortex voorzichtig de SURVEYOR Nuclease-digest mastermix gedurende 10 seconden op lage snelheid 6. Centrifugeer de SURVEYOR Nuclease-digest mastermix gedurende 10 seconden op lage snelheid. 7. Zet de SURVEYOR Nuclease-digest Master Mix tot gebruik op ijs. N.B.: De in Stap 7 bereide SURVEYOR Nuclease Digest mastermix dient onmiddellijk te worden gebruikt daar SURVEYOR Nuclease W na verloop van tijd inactief wordt in aanwezigheid van andere SURVEYOR Nuclease Digest mastermixcomponenten. 8. Pipetteer een 5,0 µL-deel van de SURVEYOR Nuclease Digest mastermix in elke buis of well die een 10,0 µL deel van PCR-geamplificeerd product bevat (zie bovenstaande Stap 3).


Pag. 19


9. Na het pipetteren de 0,2 mL-PCR-buizen of 96-wellsplaat gedurende 10 seconden centrifugeren. 10. De 0,2 mL-PCR reageerbuizen of 96-wellsplaat gedurende 10 seconden voorzichtig vortexen. 11. Gedurende 10 seconden bij lage snelheid centrifugeren (deze stap is met name belangrijk wanneer de digestie wordt uitgevoerd in een instrument zonder verwarmde deksel). 12. Gedurende 30 minuten bij 42 °C incuberen. 13. Voeg 1,0 µL SURVEYOR Stop Solution (PN 708030) toe aan elke buis of well en vortex voorzichtig (totaal SURVEYOR Nucleasereactievolume is 16,0 µL). TIP: SURVEYOR digestieproducten kunnen maximaal één week worden opgeslagen bij ≤ -20 ºC. 14. Laad de monsterdigests op een DHPLC-systeem. N.B.: Voor voorgestelde DHPLC-systeemgradiëntinstellingen voor het analyseren van SURVEYOR Nuclease digests, kunt u http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/geneticanalysis-kits/crc-rascan-kits-eu/dhplcsystemsettings bezoeken.


Pag. 20

13 Controleprocedures

13 Controleprocedures 13.1 Kwaliteitscontrole van de CRC RAScan Combination Kit In de kit bevinden zich controleplasmide-DNA's om kwaliteitscontroles op specifieke stappen in de assayprocedure te bieden. Voor het Amplificatieprotocol, bieden deze controles een middel om zeker te stellen dat de mastermixen correct worden bereid en amplificatie correct functioneert. Controles zonder template (waar water wordt toegevoegd in plaats van template-DNA) zijn ook nodig om te controleren op mogelijke verontreiniging van kitcomponenten met ongeacht welke DNA-template van buitenaf. In de SURVEYOR Nuclease digestiefase geven de amplicons van deze controleplasmide-DNA's na een effectieve controle aan dat de knipreactiecondities (SURVEYOR Nuclease Digest mastermixbereidings- en incubatiecondities) bevredigend waren. In de analysefase bieden de DHPLC systeemchromatogram van de SURVEYOR Nuclease gedigesteerde controle-amplicons richtlijnen met betrekking tot waar het knipproduct een piek bereikt in overeenstemming met die mutaties in KRAS en NRAS Exons 2, 3 and 4, zelfs op lage niveaus, zullen eluteren (zie Figuren 4-10). Knipproductpieken die overeenkomen met andere mutaties in KRAS of NRAS Exons 2, 3 en 4 kunnen in iets andere posities eluteren. Wanneer de PCR-amplicons niet overeenkomen met de resultaten die worden omschreven in Kwaliteitscontrole van PCR-producten, raadpleeg de Bijlage B - Gids voor het opsporen en oplossen van problemen of neem contact op met de Technische ondersteuning van Transgenomic alvorens door te gaan met volgende stappen bij de analyse van monsters.


Pag. 21

13 Controleprocedures

13.2 Gebruik van controleplasmide-DNA's De kits worden geleverd met negen controle-DNA's: KRAS Control Wild-Type; PN 710131 KRAS Positive Control Exon 2; PN 710135 KRAS Positive Control Exon 3; PN 710136 KRAS Positive Control Exon 4A; PN 710137 KRAS Positive Control Exon 4B; PN 710138 NRAS Control Wild-Type; PN 710441 NRAS Positive Control Exon 2; PN 710442 NRAS Positive Control Exon 3; PN 710443 NRAS Positive Control Exon 4; PN 710444 Deze controle-DNA's zijn plasmiden met inserties. De Positive Controls bevatten elk twee plasmiden: een mengsel van de KRAS of NRAS Control Wild-Type en een mutatiekloon die verschilt van het Wild-Type bij een enkel basepaar. De controles worden in afzonderlijke flacons geleverd, elk in een concentratie van 105 kopieën/µL. KRAS en NRAS Exons 2, 3 en 4 Forward en Reverse PCR-primers die nodig zijn voor PCRamplificatie worden afzonderlijk geleverd in de kits. Volg de instructies die u kunt vinden in Amplification Protocol, SURVEYOR Nuclease digestie en analyse van KRAS en NRAS Exons 2, 3 & 4 met behulp van SURVEYOR Nuclease voor het gebruik van deze controles. WIJ ADVISEREN PERSONEN DIE DIT VOOR HET EERST GEBRUIKEN MET KLEM ALLEEN TE EXPERIMENTEREN MET DE CONTROLES ALVORENS GENOMISCHE MONSTERS TE TESTEN

14 Interpretatie van de resultaten 14.1 Analysis van KRAS en NRAS Exons 2, 3 en 4 met behulp van SURVEYOR Nuclease Voor vergelijkings- en controle doeleinden, ALTIJD SURVEYOR Nuclease digestie uitvoeren op elk van de controles (Wild-Type en Positive Controls), een geen-template controle, evenals de monster-DNA's en laat in hetzelfde DHPLC-systeem monsterplaat draaien. In de SURVEYOR Nucleasedigestiefase, geven de amplicons van deze 3 Controle PlasmideDNA’s na een effectieve controle aan dat de knipreactiecondities (SURVEYOR Nucleasemengselbereidings- en incubatiecondities) bevredigend waren. In de analysefase bieden de DHPLC-systeemsporen van deze SURVEYOR Nuclease gedigereerde controle-amplicons richtlijnen vanwaar de DNA-fragmenten resulterend uit knippen op deze specifieke mutatiesmismatchlocaties, zelfs op lage niveaus, zullen eluteren (zie Figuren 4-10). Wanneer hetzij de PCR-amplicons of de SURVEYOR Nuclease knipfragmenten die zijn ontleend aan de controle-DNA's niet overeenkomen met de omschreven resultaten, raadpleeg dan de Bijlage B - Gids voor het opsporen en oplossen van problemen of neem contact op met Technische ondersteuning van Transgenomic alvorens door te gaan met andere stappen in de analyse van monsters. De hieronder gegeven voorbeelden zijn uitsluitend voor illustratiedoeleinden en dienen NIET te worden gebruikt om de identiteit van een gegeven mutatie te bepalen. Bevestiging van de identiteit van een mutatie is nodig voor het ondubbelzinnig bepalen van de aanwezigheid van een specifieke base-verandering in Exons 2, 3 of 4 van de KRAS en NRAS genen. SURVEYOR Nuclease knipt in alle mismatches die het resultaat zijn van heteroduplexvorming tussen Wild-Type en mutante DNA's, niet alleen mutaties in Exons 2, 3 of 4.SURVEYOR Nuclease bevestigt de aanwezigheid van een mismatch. De specifieke identiteit van de base-verandering is nodig voor het bepalen van KRAS- en NRAS-


Pag. 22

14 Interpretatie van de resultaten

activeringsstatus en hij moet worden bevestigd door middel van een andere methode, zoals sequentiëring.

14.2 Gegevensbeoordeling van SURVEYOR Scan-resultaten Inspecteer de chromatogrammen en vergelijk die van de Wild-Type en Positive Controls met die van het monster. Bepaal of het chromatogram van het monster overeenkomt met of verschilt van het Wild-Type patroon. Wanneer het anders is, dan dient het monster te worden overwogen "SURVEYOR Scan Positief" en te worden opgestuurd voor DNA-sequentie-analyse. Zie Figuren 4-10 voor voorbeelden en Bijlage B – Gids voor het opsporen en oplossen van problemen 7 & 8 voor voorbeelden van dergelijke monsters. Elk monster met een SURVEYOR Nuclease-patroon dat verschilt van het Wild-Type dient te worden opgestuurd voor sequentiebevestiging, zelfs wanneer het niet identiek is aan de Positive Control. Zie Bijlage B – Gids voor het opsporen en oplossen van problemen, Probleem 7 voor een voorbeeld van een dergelijk monster. Zoom, indien nodig, in de regio van interesse en overleg het monsterchromatogram met de WildType Control voor dat amplicon. Noteer alle verschillen tussen de Wild-Type Control en het geanalyseerde monster. Belangrijk! Na een grondige beoordeling van elk monster dient de beoordelaar van de gegevens te onderzoeken of naastgelegen monsters in de analyseplaat identieke positieve SURVEYOR Scan resultaten hebben. Bij het optreden van identieke positieve resultaten, kunnen zij het resultaat zijn van monster- of controlekruisverontreiniging en moet de analyse worden herhaald.


Pag. 23


14.3 Voorbeelden van resultaten Voorbeelden van resultaten die zijn verkregen met behulp van de CRC RAScan Combination Kit met een DHPLC system worden getoond in onderstaande Figuur 4-10. In deze voorbeelden werd met behulp van WAVE® 4500HT System met zowel UV als fluorescentiedetectors het in het deel Stap-voor-Stap Instructies omschreven proces gevolgd. Voor richtlijnen met betrekking tot gesuggereerde DHPLC-systeemgradiëntinstellingen voor het analyseren van SURVEYOR Nuclease-digests, bezoekt u http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysiskits/crc-rascan-kits-eu/dhplcsystemsettings. Fig. 4A

KRAS Control Wild-Type KRAS Control Exon 2 Ongeknipt Monster 1, KRAS Exon 2 200-bp Monster 2, KRAS Exon 2 ampliconMonster 3, KRAS Exon 2 DNA-kalibreringsstandaard

DHPLC injectiepiek

G12D brengt 74 en 116-bp fragmenten op

Ongeknipt 190-bp amplicon DHPLC waspiek

Fig. 4B G12D brengt 74 en 116-bp fragmenten op

KRAS Control Wild-Type KRAS Control Exon 2 Ongeknipt Monster 1, KRAS Exon 2 200-bp Monster 2, KRAS Exon 2 ampliconMonster 3, KRAS Exon 2 DNA-kalibreringsstandaard

Ongeknipt 190-bp amplicon

Figuren 4A en 4B: WAVE DHPLC analyses met UV (Figuur 4A) en fluorescentie (Figuur 4B) detectie van SURVEYOR Nuclease-digests van KRAS Positive Control Exon 2 en KRAS Control Wild-Type en CRC DNA geïsoleerd uit FFPE-secties. Bij het visueel beoordelen van de chromatogrammen, dienen de gedigereerde monsters te worden vergeleken met de Wild-Type Control (bruine lijn). De KRAS Positive Control Exon 2 (blauwe lijn) is een mengsel van Wild-Type en mutante G12D plasmiden die resulteren in digestiepieken van 74 en 116 bp; deze controle geeft aan dat de SURVEYOR Nuclease digestiestap werkt en toont de regio van het chromatogram dat visueel geïnspecteerd dient te worden om te bepalen of een monster moet worden opgestuurd voor DNA-sequentie-analyse. Bij het vergelijken van digestiepatronen voor de monsters 1-3 met het Wild-Type niet-gedigesteerd elektroferogram, is het duidelijk dan de monsters 1 & 2 (rode & turquoise lijnen) waarschijnlijk mutaties hebben en dienen te worden gesequentieerd om de aanwezigheid of het ontbreken van een mutatie op de relevante codon te bevestigen. Monster 3 (groene lijn) heeft soortgelijke chromatogrammen als die, die zijn


Pag. 24


opgemerkt voor de Wild-Type Control en hoeft niet opgestuurd te worden voor DNA-sequentieanalyse. N.B. het sequentieresultaat is het definitieve resultaat daar er andere niet-relevante mutaties kunnen zijn die kunnen resulteren in dezelfde fragmentgrootten. Fig. 5A DHPLC injectiepiek

Q61H brengt 65 and 135-bp fragmenten op

KRAS Control Wild-Type KRAS Control Exon 3 Monster 1, KRAS Exon 3 Ongeknipt 200-bpMonster 2, KRAS Exon 3 Monster 3, KRAS Exon 3 amplicon DNA-kalibreringsstandaard


Fig. 5B Q61H brengt 65 en 135-bp fragmenten op

KRAS Control Wild-Type KRAS Control Exon 3 Monster 1, KRAS Exon 3 Ongeknipt 200-bpMonster 2, KRAS Exon 3 Monster 3, KRAS Exon 3 amplicon DNA-kalibreringsstandaard Ongeknipt 200-bp amplicon

Figuren 5A en 5B: WAVE DHPLC analyses met UV (Figuur 5A) en fluorescentie (Figuur 5B) detectie van SURVEYOR Nuclease-digests van KRAS Positive Control Exon 3 en KRAS Control Wild-Type en CRC DNA geïsoleerd uit FFPE-secties. Bij het visueel beoordelen van de chromatogrammen, dienen de gedigereerde monsters te worden vergeleken met de Wild-Type Control (bruine lijn). De KRAS Positive Control Exon 3 (groene lijn) is een mengsel van Wild-Type en mutante Q61H plasmiden die resulteren in digestiepieken van 65 en 135 bp; deze controle geeft aan dat de SURVEYOR Nuclease digestiestap werkt en toont de regio van het chromatogram dat visueel geïnspecteerd dient te worden om te bepalen of een monster moet worden opgestuurd voor DNA-sequentie-analyse. Bij het vergelijken van digestiepatronen voor de monsters 1-3 met het Wild-Type niet-gedigesteerde elektroferogram, is het duidelijk dan monster 2 (zwarte lijn) waarschijnlijk een mutatie heeft en dient te worden gesequenced om de aanwezigheid of het ontbreken van een mutatie op de relevante codon te bevestigen. Monster 1 en 3 (blauwe en rode lijnen) hebben soortgelijke chromatogrammen als die, die zijn opgemerkt voor de Wild-Type Control en hoeven niet opgestuurd te worden voor DNA-sequentie-analyse. N.B. het sequentieresultaat is het definitieve resultaat daar er andere niet-relevante mutaties kunnen zijn die kunnen resulteren in dezelfde fragmentgrootten.


Pag. 25


Fig. 6A

DHPLC injectiepiek

K117N brengt 80 en 88-bp fragmenten op

DHPLC KRAS Control Wild-Type Uitwassen KRAS Control Exon 4A Ongeknipt Monster 1, KRAS Exon 4A 200-bpMonster 2, KRAS Exon 4A amplicon DNA-kalibreringsstandaard


DHPLC waspiek

Fig. 6B

K117N brengt 80 en 88-bp fragmenten op

DHPLC KRAS Control Wild-Type Uitwassen KRAS Control Exon 4A Ongeknipt Monster 1, KRAS Exon 4A 200-bpMonster 2, KRAS Exon 4A amplicon DNA-kalibreringsstandaard


Figuren 6A en 6B: WAVE DHPLC analyses met UV (Figuur 6A) en fluorescentie (Figuur 6B) detectie van SURVEYOR Nuclease-digests van KRAS Positive Control Exon 4A en KRAS Control Wild-Type en CRC DNA geïsoleerd uit FFPE-secties. Bij het visueel beoordelen van de chromatogrammen, dienen de verwerkte monsters te worden vergeleken met de Wild-Type Control (groene lijn). De KRAS Positive Control Exon 4A (blauwe lijn) is een mengsel van WildType en mutante K117N plasmiden die resulteren in digestiepieken van 80 en 88 bp; deze controle geeft aan dat de SURVEYOR Nuclease digestiestap werkt en toont de regio van het chromatogram dat visueel geïnspecteerd dient te worden om te bepalen of een monster moet worden opgestuurd voor DNA-sequentie-analyse. Bij het vergelijken van digestiepatronen voor de monsters 1 & 2 met het Wild-Type niet-gedigesteerde elektroferogram, is het duidelijk dan monster 1 (rode lijn) waarschijnlijk een mutatie heeft en dient te worden gesequenced om de aanwezigheid of het ontbreken van een mutatie op de relevante codon te bevestigen. Monster 2 (zwarte lijn) heeft een soortgelijk chromatogram als die, die zijn opgemerkt voor Wild-Type Control en hoeft niet opgestuurd te worden voor DNA-sequentie-analyse. N.B. het sequentieresultaat is het definitieve resultaat daar er andere niet-relevante mutaties kunnen zijn die kunnen resulteren in dezelfde fragmentgrootten.


Pag. 26


Fig. 7A

DHPLC injectiepiek


DHPLC KRAS Control Wild-Type Uitwassen KRAS Control Exon 4B Ongeknipt Monster 1, KRAS Exon 4B 200-bp Monster 2, KRAS Exon 4B ampliconMonster 3, KRAS Exon 4B DNA-kalibreringsstandaard

DHPLC waspiek A146T brengt 78 en 116-bp fragmenten

Fig. 7B A146T brengt 78 and 116-bp fragmenten op

DHPLC KRAS Control Wild-Type Uitwassen KRAS Control Exon 4B Ongeknipt Monster 1, KRAS Exon 4B 200-bp Monster 2, KRAS Exon 4B ampliconMonster 3, KRAS Exon 4B DNA-kalibreringsstandaard


Figuren 7A en 7B: WAVE DHPLC analyse met UV (Figuur 7A) en fluorescentie (Figuur 7B) detectie van SURVEYOR Nuclease-digests van KRAS Positive Control Exon 4B en KRAS Control Wild-Type en CRC DNA geïsoleerd uit FFPE secties. Bij het visueel beoordelen van de chromatogrammen, dienen de gedigereerde monsters te worden vergeleken met de Wild-Type Control (bruine lijn). De KRAS Positive Control Exon 4B (donkergroene lijn) is een mengsel van Wild-Type en mutante A146T plasmiden die resulteren in digestiepieken van 78 en 116 bp; deze controle geeft aan dat de SURVEYOR Nuclease digestiestap werkt en toont de regio van het chromatogram dat visueel geïnspecteerd dient te worden om te bepalen of een monster moet worden opgestuurd voor DNA-sequentie-analyse. Bij het vergelijken van digestiepatronen voor de monsters 1-3 met het Wild-Type niet-gedigesteerde elektroferogram, is het duidelijk dan monster 3 (rode lijn) waarschijnlijk een mutatie heeft en dient te worden gesequenced om de aanwezigheid of het ontbreken van een mutatie op de relevante codon te bevestigen. Monsters 2 & 3 (zwarte en lichtgroene lijnen) hebben soortgelijke chromatogrammen als die, die zijn opgemerkt voor de WildType Control en hoeven niet te worden opgestuurd voor DNA-sequentie-analyse. N.B. het sequentieresultaat is het definitieve resultaat daar er andere niet-relevante mutaties kunnen zijn die kunnen resulteren in dezelfde fragmentgrootten.


Pag. 27


Fig. 8A

NRAS Control Wild-Type NRAS Control Exon 2 Monster 1, NRAS Exon 2 Ongeknipt 200-bp Monster 2, NRAS Exon 2 ampliconDNA-kalibreringsstandaard

DHPLC injectiepiek



DHPLC waspiek

Fig. 8B




Figuren 8A en 8B: WAVE DHPLC analyses met UV (Figuur 8A) en fluorescentie (Figuur 8B) detectie van SURVEYOR Nuclease-digests van NRAS Positive Control Exon 3 en Wild-Type Controls en CRC DNA geïsoleerd uit FFPE-secties. Bij het visueel beoordelen van de chromatogrammen, dienen de verwerkte monsters te worden vergeleken met de NRAS Control Wild-Type (blauwe lijn). De NRAS Positive Control Exon 2 (groene lijn) is een mengsel van WildType en mutante G12D plasmiden die resulteren in digestiepieken van 88 en 148 bp; deze controle geeft aan dat de SURVEYOR Nuclease digestiestap werkt en toont de regio van het chromatogram dat visueel geïnspecteerd dient te worden om te bepalen of een monster moet worden opgestuurd voor DNA-sequentie-analyse. Bij het vergelijken van digestiepatronen voor de monsters 1 en 2 met het Wild-Type niet-gedigesteerde elektroferogram, is het duidelijk dan monster 1 (rode lijn) waarschijnlijk een mutatie heeft en dient te worden gesequenced om de aanwezigheid of het ontbreken van een mutatie op de relevante codon te bevestigen. Monster 2 (zwarte lijn) heeft een soortgelijk chromatogram als die, die zijn opgemerkt voor het NRAS Control Wild-Type en hoeft niet opgestuurd te worden voor DNA-sequentie-analyse. N.B. het sequentiesresultaat is het definitieve resultaat daar er andere niet-relevante mutaties kunnen zijn die kunnen resulteren in dezelfde fragmentgrootten.

Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Kit met DHPLC-systemen Pagina 28


Fig. 9A


DHPLC injectiepiek

Q61K brengt 78 en 125-bp fragmenten op

DHPLC waspiek


Fig. 9B Q61K brengt 78 en 125-bp fragmenten op

NRAS Control Wild-Type NRAS Control Exon 3 Monster 1, NRAS Exon 3 Ongeknipt 200-bp Monster 2, NRAS Exon 3 ampliconDNA-kalibreringsstandaard Ongeknipt 203-bp amplicon

Figuren 9A en 9B: WAVE DHPLC analyses met UV (Figuur 9A) en fluorescentie (Figuur 9B) detectie van SURVEYOR Nuclease-digests van NRAS Positive Control Exon 3 en Wild-Type Controls en CRC DNA geïsoleerd uit FFPE-secties. Bij het visueel beoordelen van de chromatogrammen, dienen de verwerkte monsters te worden vergeleken met de NRAS Control Wild-Type (groene lijn). De NRAS Positive Control Exon 3 (blauwe lijn) is een mengsel van WildType en mutante Q61K plasmiden die resulteren in digestiepieken van 78 en 125 bp; deze controle geeft aan dat de SURVEYOR Nuclease digestiestap werkt en toont de regio van het chromatogram dat visueel geïnspecteerd dient te worden om te bepalen of een monster moet worden opgestuurd voor DNA-sequentie-analyse. Bij het vergelijken van digestiepatronen voor de monsters 1 & 2 met het Wild-Type niet-gedigesteerde elektroferogram, is het duidelijk dan monster 1 (rode lijn) waarschijnlijk een mutatie heeft en dient te worden gesequenced om de aanwezigheid of het ontbreken van een mutatie op de relevante codon te bevestigen. Monster 2 (zwarte lijn) heeft een soortgelijk chromatogram als die, die zijn opgemerkt voor het NRAS Control Wild-Type en hoeft niet opgestuurd te worden voor DNA-sequentie-analyse. N.B. het sequentieresultaat is het definitieve resultaat daar er andere niet-relevante mutaties kunnen zijn die kunnen resulteren in dezelfde fragmentgrootten.


Pag. 29


Fig. 10A

DHPLC injectiepiek

NRAS Control Wild-Type NRAS Control Exon 4 Ongeknipt Monster 1, NRAS Exon 4 200-bp Monster 2, NRAS Exon 4 ampliconDNA-kalibreringsstandaard


A146T brengt 68 en 165-bp fragmenten op

Fig. 10B A146T brengt 68 en 165-bp fragmenten op

NRAS Control Wild-Type NRAS Control Exon 4 Ongeknipt Monster 1, NRAS Exon 4 200-bp Monster 2, NRAS Exon 4 ampliconDNA-kalibreringsstandaard


Figuren 10A en 10: WAVE DHPLC analyses met UV (Figuur 10A) en fluorescentie (Figuur 10B) detectie van SURVEYOR Nuclease-digests van NRAS Positive Control Exon 4 en Wild-Type Controls en CRC DNA geïsoleerd uit FFPE-secties. Bij het visueel beoordelen van de chromatogrammen, dienen de verwerkte monsters te worden vergeleken met de NRAS Control Wild-Type NRAS Control Wild-Type (groene lijn). De NRAS Positive Control Exon 4 (blauwe lijn) is een mengsel van Wild-Type en mutante A146T plasmiden die resulteren in digestiepieken van 68 en 165 bp; deze controle geeft aan dat de SURVEYOR Nuclease digestiestap werkt en toont de regio van het chromatogram dat visueel geïnspecteerd dient te worden om te bepalen of een monster moet worden opgestuurd voor DNA-sequentie-analyse. Bij het vergelijken van digestiepatronen voor de monsters 1 & 2 met het Wild-Type niet-gedigesteerde elektroferogram, is het duidelijk dat de monsters 1 & 2 (rode en zwarte lijnen) soortgelijke chromatogrammen hebben ten opzichte van het NRAS Control Wild-Type en hoeven niet opgestuurd te worden voor DNA-sequentie-analyse. N.B. voor SURVEYOR Scan is het sequentieresultaat het definitieve resultaat daar er andere niet-relevante mutaties die kan resulteren in dezelfde fragmentgrootten.


Pag. 30

15 Prestatiekenmerken

15 Prestatiekenmerken 15.1 Niveau van detectie van mutaties door middel van SURVEYOR Scan Kits Validatie van de SURVEYOR Scan Kits voor DHPLC platforms met behulp van plasmideklonen van alle geïndiceerde mutaties heeft aangetoond dat SURVEYOR Nuclease pieken kunnen worden gedetecteerd in een mengsel van 2-5% mutant in een Wild-Type achtergrond. Geautomatiseerde sequence calling van zowel forward- als reverse-strengen mist vaak de detectie van mutaties op niveaus van minder dan 10% met Wild-Type DNA. Samen met de SURVEYOR Nuclease resultaten is het mogelijk de 5-10% mutante sequence-chromatogram met meer vertrouwen te interpreteren. Wanneer een monsteranalyse een SURVEYOR Scan positief resultaat toont, maar er geen detecteerbare KRAS of NRAS mutatie is met behulp van DNA-sequencing, adviseren wij dat er een "Geen variant opgemerkt" resultaat wordt genoteerd. Zie Workflowoverwegingen voor meer bijzonderheden.

15.2 Sequentiebevestiging Ga door naar sequentiebevestiging voor alle SURVEYOR Scan positieve resultaten voor het bepalen van de sequentie-identiteit van de KRAS of NRAS Exons 2, 3 of 4 mutaties. Figuur 11 is een voorbeeld van het belang van sequentie-bevestiging voor het bepalen van de exacte mutatie. Ga niet door naar sequentiebevestiging wanneer de SURVEYOR Scan een negatief resultaat had. Het monster kan worden gerapporteerd als Wild-Type of geen-variant gedetecteerd. De Universal Sequencing Primers in deze kit zijn bedoeld voor gebruik voor sequentiebevestiging. De forward-primer is PN 710153F (Universal Sequencing Primer 1) en de reverse-primer is PN 710153R (Universal Sequencing Primer 2). Monster 1: G13C

Monster 2: G13D

Figuur 11 Sequentie-analyse van monsters met hetzelfde KRAS Exon 2 SURVEYOR Nuclease-digestiepatroon. De bovengenoemde monsters 1 en 2 vertoonden hetzelfde DHPLCpiekpatroon na SURVEYOR Nuclease-digestie en werden vervolgens geanalyseerd door middel van DNA-sequencing. De sequencing toont aan dat zij 2 verschillende mutaties zijn; G13C en G13D. Deze monsters illustreren (a) het vermogen van SURVEYOR Nuclease van het detecteren van mogelijke mutaties en (b) het onvermogen de exacte locatie of specifieke basisverandering van (een) mutatie(s) te bepalen die aanwezig zijn in een testmonster. N.B.: Het is belangrijk te controleren op de afwezigheid van de "stempel"-sequentie in elk sequentie-elektroferogram om te bevestigen dat de mutatie niet het resultaat is van verontreiniging van het monster met één van de controles van de kit. N.B.: Wanneer het testmonster Wild-Type is op de relevante belangrijke codon(en) en de "gestempelde" sequentie aanwezig is, is het testmonster "verontreinigd" en moet het opnieuw worden geanalyseerd. De aanwezigheid van de "stempel" geeft aan dat het testmonster zou kunnen worden verontreinigd door de een van de Wild-Type Controls van de kit; deze verontreiniging zou elke in het testmonster aanwezige mutatie op laag niveau kunnen maskeren. Zie A.2 Controle DNA-stempels voor bijzonderheden over de Controls-stempelsequentie.

Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Kit met DHPLC-systemen Pagina 31

15 Prestatiekenmerken

15.3 Beperkingen van de assayprocedure Verontreinigende stoffen die worden overgedragen van extractie van formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde monsters kunnen interfereren met de PCR-amplificatie en SURVEYOR Nuclease digestieprocedures. De kwaliteitscontroleprocedures die worden beschreven in Kwaliteitscontrole van PCR-producten zullen garanderen dat het geëxtraheerde DNA geschikt is voor gebruik in deze kit. Deze kit is gevalideerd voor analyse van formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde colorectale kankertumormonsters. Hij is niet gevalideerd voor diagnostisch gebruik van andere kankertypes of met verse of bevroren biopsiemonsters. Voor het opsporen en oplossen van niet-standaardresultaten en bijzonderheden van factoren die van invloed kunnen zijn op deze assay, zie de onderstaande Bijlage B - Gids voor het opsporen en oplossen van problemen. Wees voorzichtig, vermijd overdracht en kruisverontreiniging met deze set. De extreme gevoeligheid van de assaymethode vereist het nemen van voorzorgen op de volgende punten: 

Zorg ervoor dat alle monsters zodanig worden gehanteerd dat geen kruisverontreiniging tussen monsters kan ontstaan.



Werk in een PCR-werkstation of andere geschikte ruimte waar de werkplek kan worden blootgesteld aan UV-licht alvorens de PCR-amplificatiereacties op te zetten.



Gebruik een afzonderlijk PCR-werkstation of ruimte voor het openen van de monsters na PCR-amplificatie voor kwaliteitscontrole door middel van gelelektroforese.



SURVEYOR Nuclease digestie-opstelling dient in een afzonderlijke ruimte of een ander PCR-werkstation vanwaar de eerste PCR werd opgezet te worden gedaan.



Zorg ervoor dat de plasmidecontroles van de kit in alle fasen van de assay afzonderlijk van testmonsters worden gehanteerd



o

Zorg ervoor dat alle oplossingen, geen–template-controle en monster-DNA-wells zijn voorzien van een dop alvorens de buizen met de controleplasmide-DNA te openen.

o

BEHANDEL DE CONTROLES HET LAATST. Voeg de controleplasmide-DNA pas toe aan de juiste tubes NADAT ALLE geen-template-controle en monsterwells van een dop zijn voorzien.

o

Nadat de controle-DNA-tubes zijn voorzien van een dop, veegt u ALLE buizen en doppen af met een DNA-vernietigend middel (zoals 10% bleekmiddel) alvorens ze over te brengen naar een ander gebied.

Zorg ervoor dat bij het pipetteren van monsters in 96-wellsplaten geen monsterverontreiniging van aangrenzende wells wordt toegelaten, hetzij als gevolg van spetteren tijdens het mengen of door de pipettips niet te vervangen.


Pag. 32

Bijlage A

Bijlage A A.1 Plaat-lay-outplan voor SURVEYOR Scan Kits Het hieronder voorgestelde plaatlayoutplan is voor de gelijktijdige uitvoering van SURVEYOR Scan analyse van alle zeven KRAS en NRAS Exons op 10 monsters.

Sleutel: Ex = Exon; WT = Wild-Type; Mut = Mutatie; NTC = Geen templatecontrole.

A.2 Controle DNA-stempels De sequenties met een "Stempel" worden hieronder gegeven. Verklaring: De meest voorkomende mutatieregio's zijn gemarkeerd in Paars. Sequentie in HOOFD-letters is coderingsbasen; sequentie in kleine letters is niet-coderingsbasen De controles hebben genetische "Stempel" gemarkeerd in Geel; deze variatie van de KRAS of NRAS Wild-Type sequentie in een regio waarvan niet wordt verwacht dat deze mutaties heeft en kan worden gebruikt voor het opsporen en oplossen van problemen met verontreiniging van monsters door middel van Positive Controls. Zie Bijlage B Gids voor het opsporen en oplossen van problemen, Probleem 8, voor een voorbeeld van een SURVEYOR Scan spoor van een dergelijke verontreiniging.. KRAS Exon 2 “Stempel” Amplicongrootte: 190 bp. Voor het creëren van de genetische stempel van KRAS Exon 2 controleplasmide wordt TAT veranderd in ATA. Codon 12 en 13 zijn hieronder ook gemarkeerd. GCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAAATAGAT KRAS Exon 3 "Stempel" Amplicongrootte: 200 bp. Voor het creëren van de KRAS Exon 3 genetische controleplasmidenstempel wordt ACC veranderd in TGG. Codon 59 en 61 zijn hieronder ook gemarkeerd. GAATGGTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG KRAS Exon 4A "Stempel” Amplicongrootte: 168 bp. Voor het creëren van het genetische stempel van KRAS Exon 4A controleplasmiden wordt AGA veranderd in TCT. Codon 117 is hieronder ook gemarkeerd. AATAAATGTGATTTGCCTTCTAGAACAGTTCTCAC


Pag. 33

Bijlage A

KRAS Exon 4B “Stempel” Amplicongrootte: 194 bp. Voor het creëren van het genetische stempel van KRAS Exon 4B controle plasmides wordt agt veranderd in tca. Codon 146 is hieronder ook gemarkeerd. TCAGCAAAGACAAGACAGgtatcaaac NRAS Exon 2 "Stempel" Amplicongrootte: 236 bp. Voor het creëren van de NRAS Exon 2 genetische controleplasmidenstempels wordt aca veranderd in tgt. Codon 12 en 13 zijn hieronder ook gemarkeerd. ccatgtggttcttgctggtgtgaaATGACTGAGTACAAACTGGTGGTGGTTGGAGCAGGTGGTGTT NRAS Exon 3 "Stempel" Amplicongrootte: 203 bp. Voor het creëren van de NRAS Exon 3 genetische controleplasmidenstempel wordt GAC veranderd in CTG. Codon 59 en 61 zijn hieronder ook gemarkeerd. ACAGCTGGACAAGAAGAGTACAGTGCCATGAGACTGCAA NRAS Exon 4 "Stempel" Amplicongrootte: 233 bp. Voor het creëren van de NRAS Exon 4 genetische controleplasmidenstempel wordt CAA veranderd in GTT. Codon 117 en 146 zijn hieronder ook gemarkeerd. AACAAGTGTGATTTGCCAACAAGGACAGTTGATACAAAAGTTGCCCACGAACTGGCCAAGAGTTACGGG ATTCCATTCATTGAAACCTCAGCCAAG

A.3 Denaturering HPLC (DHPLC) Systeemvereisten A.3.1 DHPLC Specificaties voor SURVEYOR SCAN-toepassingen De volgende specificaties zijn de minimumvereisten voor DHPLC-systeemspecificaties voor de uitvoering van de SURVEYOR Scan KRAS & NRAS Kit-assays. High Performance Liquid Chromatography systeem  Binaire gradiëntcapaciteit; hoge druk of lage druk  Stroomsnelheidscontrole, minimumbereik: 0.7 – 1.6 mL/min  Stroomsnelheidsnauwkeurigheid: ± 2% (H2O op 20 ºC)  Oplosmiddelontgasser Autosampler  Temperatuurregeling voor het koelen van platen, instelbaar: 4 tot 14 ºC  Injectievolume: 5–50 µL Scheidingskolom  Ontworpen voor dsDNA-fragmentgroottescheiding, fragmentgrootten 50 bp tot 250 bp Hoge-precisie temperatuurregeloven  Temperatuurbereik: 40 tot 70 ºC  Temperatuurprecisie: ± 0,2 ºC  Temperatuurreproduceerbaarheid: ± 0,2 ºC  Lineariteit over volledig temperatuurbereik: ± 2,0 ºC Detectie-alternatief 1  UV/VIS-detector  Bereik golflengte: 190 – 700 nm  UV-bron: Deuteriumlamp


Pag. 34

Bijlage A

Detectie-alternatief 2  Fluorescentiedetector  Bereik golflengte: excitatie: 200 – 850 nm; emissie: 250 – 900 nm  Fluorescentiebron: 150 W Xenonlamp 

Fluorescentiekleurstofpomp  Vaste stroomsnelheid op 0,1 mL/min – 20%/+50%  Lage pulsatiestroming

A.3.2 Systeemoperatie Raadpleeg voor DHPLC-systeeminstelling en bediening de aanbevelingen van de fabrikant voor analyse van dsDNA-fragmenten die in het groottebereik liggen van 50 bp tot 250 bp en volg ze, richtend op groottediscriminatie van 10 bp of beter. Dit is het groottebereik voor fragmenten na SURVEYOR Nuclease-digestie met behulp van deze kit. Voor richtlijnen met betrekking tot voorgestelde DHPLC-systeemgradiëntinstellingen voor het analyseren van SURVEYOR Nuclease-digests, kunt u http://world.transgenomic.com/diagnostictools/genetic-analysis-kits/crc-rascan-kits-eu/dhplcsystemsettings bezoeken.

A.3.3 Onderhoud van DHPLC-kolommen Volg voor onderhoud van DHPLC-kolommen de aanbevelingen van de fabrikant. N.B.: voor analyse van SURVEYOR Nuclease reacties zullen meer frequente en stringente reinigingsprotocollen nodig zijn dan die voor standaard PCR-monsteranalyse. Raadpleeg uw DHPLC-systeemrichtlijnen voor aanvullende bijzonderheden.


Pag. 35

Bijlage A

A.4 Laboratoriumopstelling voor PCR-assays Volg voor het produceren van betrouwbare en besmettingsvrije PCR-resultaten, goede laboratoriumpraktijk bij het ontwerpen van de PCR-laboratoriumlay-out. Overweeg bij het plannen van de laboratoriumopstelling de noodzaak voor ruimtelijke scheiding van PCR-amplificatie-opstelling en post-amplificatie-activiteiten. Het is belangrijk (i) DNA-isolatie te scheiden: (ii) PCR-amplificatie; en (iii) Post-PCR-activiteiten zoals het openen van buizen met geamplificeerde monsters in preparatie voor het draaien van gels en opzetten van andere assays zoals SURVEYOR Nuclease digests en DNA-sequencing te scheiden. Het is ook belangrijk laboratoriumvoorraden en apparatuur specifiek voor elk gebied te hebben die alleen in dat gebied worden gebruikt. Het afvegen van oppervlakken met 10% (v/v) bleekmiddel, wekelijks vers bereid, zal helpen bij de eliminatie van DNA-fragmenten ≤ 500 bp als templates voor PCR. Bovendien kan het nuttig zijn kunststofartikelen en oplossingen te behandelen met een blootstelling van 7–10 minuten aan kortegolf UV-licht met behulp van een UV-brugvorming. N.B.: enzymen en te amplificeren DNA dienen niet te worden behandeld met UV-licht. Het dragen van goede beschermende kleding, het regelmatig vervangen van handschoenen en uw handen in de handschoenen regelmatig afvegen met de 10% (v/v) bleekmiddeloplossing alvorens naar een werkstation te gaan, zal zeer goed helpen bij het verminderen van verontreiniging. Er dient minimaal een opstelling te zijn die overeenkomt met de twee-ruimtenopstelling in het onderstaande diagram dat speciaal is ontworpen voor PCR en analyse met behulp van SURVEYOR Nuclease.


Pag. 36

Bijlage A

A.5 Literatuurreferenties 1. Amgen News Release (2013) New analyses identify predictive biomarkers for Vectibix® (panitumumab) in patients with metastatic colorectal cancer. http://wwwext.amgen.com/media/media_pr_detail.jsp?-year=2013&releaseID=1820728 2. Peeters M et al (2013) Massively parallel tumor multigene sequencing to evaluate response to panitumumab in a randomized phase III study of metastatic colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 1902-12 3. De Roock W et al (2010) Association of KRAS p.G13D mutation with outcome in patients with chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. JAMA 304 1812-20 4. Peeters M et al (2013) Mutant KRAS codon 12 and 13 alleles in patients with metastatic colorectal cancer: assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to panitumumab. J Clin Oncol. 31 759-65 5. Andre T et al (2013) Panitumumab combined with irinotecan for patients with KRAS wildtype metastatic colorectal cancer refractory to standard chemotherapy: a GERCOR efficacy, tolerance, and translational molecular study. Ann Oncol. 24 412-9 6. Loupakis F et al (2009) KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer. Br J Cancer 101 715-21 7. De Roock W et al (2010) Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol. 11 753-62 8. Qiu P et al (2004) Mutation detection using Surveyor™ nuclease. Biotechniques 36 702707 9. Kuang Y et al (2009) Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15 2630-6 10. Mitani N et al (2007) Surveyor nuclease-based detection of p53 gene mutations in haematological malignancy. Ann. Clin. Biochem. 44 557-9 11. Engelman JA et al (2006) Allelic dilution obscures detection of a biologically significant resistance mutation in EGFR-amplified lung cancer. J. Clin. Invest. 116 2695-2706 Zie ook http://world.transgenomic.com/files/literature/482146.pdf SURVEYOR Nuclease en de toepassingen ervan.

voor

referenties


over

Pag. 37

Bijlage B

Bijlage B Gids voor het opsporen en oplossen van problemen Effectief gebruik van de SURVEYOR Scan Kits voor DHPLC is afhankelijk van de geslaagde voltooiing van een aantal stappen. Een van meest kritieke is PCR-amplificatie die moet resulteren in de productie van specifieke DNA's van uniforme grootte in voldoende hoeveelheid die kunnen worden gedetecteerd na hybridisatie en knippen. Dit is op zijn beurt afhankelijk van de kwaliteit van het eerste monster. Uitvoering van de analyse met DNA dat niet voldoet aan de kwaliteits- en kwantiteitscriteria wordt afgeraden. N.B.: Als u de SURVEYOR Nuclease voor het eerst gebruikt, voer dan de experimenten in het deel Gebruik van controleplasmiden-DNA's uit nadat u het deel Stap-voor-Stap Instructies hebt gelezen. Zorg dat u de resultaten van de controleplasmide-DNA's hebt alvorens contact op te nemen met Transgenomic Technische ondersteuning. Deze Gids voor het opsporen en oplossen van problemen dekt een lijst met kwesties die u zou kunnen tegenkomen bij het gebruik van de SURVEYOR Scan Kits voor DHPLC en suggesties voor hoe ze kunnen worden opgelost. De getoonde voorbeelden zijn zowel uit KRAS en NRAS Exons. Raadpleeg de handleiding voor het DHPLC systeeminstrument voor gedetailleerde informatie met betrekking tot bediening en onderhoud van het instrument. De handleiding bevat specifieke procedures voor het controleren en onderhouden van de kolomprestatie en omvat bijzonderheden met betrekking tot opsporen en oplossen van problemen.

Probleem 1 – Lage PCR-opbrengst of geen PCR-product bij analyse op agarosegel LAGE PCROPBRENGST

MOGELIJKE OORZAAK

Goede Slechte PCR PCR opbrengst opbrengst

RNA band

OPLOSSING

Slechte kwaliteit van DNA-template

Herhaal zuivering van DNA; beoordeel de toegepaste zuiveringsmethode. Wanneer uit FFPE geëxtraheerd DNA te gefragmenteerd is, kunnen alternatieve FFPE-blokken nodig zijn.

Teveel RNA in het monster, dit zal overschatting van de DNA-concentratie veroorzaken

Herhaal RNase-behandeling van het DNAmonster en zuiver het DNA opnieuw.

Thermische cycler niet gekalibreerd

Voer kalibratie van thermische cycler uit.

Niet voldoende template

Verhoog de hoeveelheid template.

N.B.: Men dient kwaliteits-DNA van FFPE te gebruiken. Het DNA dient een concentratie te hebben van 25 ng/µL als bepaald door middel van absorptie op 260 nm, een absorptieratio op 260/280 nm of hoger dan 1,8 te hebben en meer dan 90% DNA te zijn (d.w.z. vrij van de meeste tRNA- en rRNA-verontreiniging als beoordeeld door middel van verschijning op een agarosegel). Bewaar DNA-monsters tussen de-20 °C en -80 °C. Voor analyse van DNA-template geëxtraheerd uit paraffine-ingebed weefsel dient een aantal voorzorgsmaatregelen te worden getroffen. Het geëxtraheerde DNA kan worden behandeld met uracil-DNA-glycosylase om amplificatie van DNA-fragmenten die gedeamineerde C-residuen bevatten te voorkomen. Vaak wordt een hoog percentage van het A260 adsorberende materiaal dat wordt geëxtraheerd uit in paraffine ingebed weefsel niet goed geamplificeerd tijdens PCR. Het gebruik van een grotere hoeveelheid start-DNA zal vaak helpen bij het produceren van een geschikt


Pag. 38

Bijlage B

amplificatieproduct. Een andere overweging zou de keuze van FFPE-tumorsecties met een hoog percentage aan tumorcellen zijn. Micro-dissectie kan ook worden gebruikt, maar dit is een tijdrovende optie en zou niet worden aanbevolen bij algemene laboratoriumtests.

Probleem 2 – Meerdere PCR-producten bij analysering op agarosegel MEERDERE PCRPRODUCTEN Goede PCR opbrengst

Meerdere banden PCR

MOGELIJKE OORZAAK

OPLOSSING

Uitgloeitemperatuur te laag

Voer controle van kalibratie van thermische cycler uit.

N.B.: PCR dient een voldoende hoge opbrengst (MEER DAN 20 ng/µL) van een ENKELE geamplificeerde species van het juiste formaat te produceren. De met deze set geleverde DNA Polymerase en de DNA Polymerase 10X PCR Buffer moet worden gebruikt voor PCR. Amplicons from Controls dienen te worden gedigereerd met SURVEYOR Nuclease en in parallel te lopen om valse achtergrondruis uit te sluiten door middel van visuele vergelijking van elektroferogramprofielen (zie Voorbeelden van resultaten, Figuren 4-10). Onderzoek elk geamplificeerd DNA-product voorafgaand aan digestie door middel van gelelektroforese (of door middel van DHPLC Systeemanalyse) om zeker te zijn dat het een enkele species van de verwachte grootte is.


Pag. 39

Bijlage B

Probleem 3 – Geen knipproducten opgemerkt bij analyse na SURVEYOR Nuclease-behandeling van heteroduplexen GEEN KNIPPRODUCTEN

Positie van ontbrekende heteroduplexen

MOGELIJKE OORZAAK

OPLOSSING

Proportie van mismatchtarget te laag

Controleer assay met behulp van Controls.

Inefficiënte vorming van heteroduplexen

Volg correcte PCRen hybridisatieprocedure. Gebruik vers gehybridiseerd DNA in SURVEYOR Nuclease-digesten. Voer nieuwe PCRamplificatie uit met behulp van (1) dezelfde DNAtemplatekwantiteit; (2) waarbij de hoeveelheid startDNA wordt verhoogd; of (3) isoleer vers DNA uit dezelfde of een andere FFPEsectie.

Ongeknipte Homoduplexpiek

Inactieve SURVEYOR Nuclease

Voer de Positive Control reactie uit om de enzymprestatie te verifiëren. Gebruik alleen vers bereide SURVEYOR Nuclease mastermixen.

N.B.: SURVEYOR Nuclease knipt voornamelijk bij mismatches in heteroduplexen. De proportie van heteroduplex tot homoduplex in het gehybridiseerde monster zal de grootte van het SURVEYOR Nuclease digestiesignaal bepalen. Wanneer de KRAS of NRAS-mutatie in een zeer lage concentratie aanwezig is in het genomische DNA-monster kan het signaal te laag zijn om een positief resultaat te geven. Het is belangrijk zeker te stellen dat de hybridisatiestap wordt opgenomen in het thermische cyclerprogramma (zie Amplificatieprotocol) om de efficiëntie van de vorming van heteroduplexen te maximaliseren. Heteroduplexen worden zeer inefficiënt gevormd tijdens standaard PCRreacties. N.B.: de signaal-tot-ruisverhouding is over het algemeen hoog genoeg om mutaties te detecteren die in een laag percentage van de totale DNA-template aanwezig zijn; het is zelfs mogelijk slechts 2% mutant DNA te detecteren. Figuren 4-10 tonen de digestieproducten die worden gegenereerd met homoduplex en heteroduplex KRAS en NRAS Positive Control DNA's (inclusief in deze kit) en FFPE-monsters op een WAVE DHPLC 4500 System. De knipproducten worden duidelijk gezien als twee nieuwe pieken die eluteren met de verwachte grootten die kunnen worden geraamd in relatie tot de DNA-groottemarker. Let op: commercieel beschikbare PCR-buffers variëren dramatisch in inhoud en de formuleringen worden vaak niet gedefinieerd door leveranciers. Een aantal buffers zijn NIET compatibel met


Pag. 40

Bijlage B

SURVEYOR Nuclease als gevolg van pH of de aanwezigheid van additieven, surfactanten of andere eigen ingrediënten. Gebruik GEEN andere polymerase of 10X polymerasebuffers dan de in de kit meegeleverde.

Probleem 4 – Hoge achtergrond na SURVEYOR Nucleasebehandeling MOGELIJKE OORZAAK

HOGE ACHTERGROND

Suboptimale hybridisatiestap

OPLOSSING Doe het volgende: 1. Controleer of de DNAconcentratie in het bereik van >25 ng/µL ligt. 2. Herhaal de heteroduplexvormingsst ap, zorg ervoor dat u de aanbevolen procedure volgt; zie 12.7.1.

DHPLC injectiepiek

Monster met ruis in basislijn

DHPLC waspiek

Hoeveelheid DNA te laag

Controleer opbrengst en kwaliteit van template-DNA

Niet-specifieke PCRproducten

Controleer opbrengst en kwaliteit template-DNA.

SURVEYOR Enhancer W2 en/of SURVEYOR Enhancer-cofactor hebben activiteit verloren

Controleer de uiterste gebruiksdatum van de kit.

N.B.: SURVEYOR Nuclease knipt soms dubbelstrengs-DNA op willekeurige overeenkomende locaties . Dit produceert achtergrond na digestie. Deze activiteit wordt onderdrukt door SURVEYOR Enhancer W2 en zijn Cofactor zonder anders de mismatchknipreactie negatief te beïnvloeden. SURVEYOR Enhancer W2 en SURVEYOR Enhancer Cofactor zijn bijgesloten in deze kit en dienen altijd te worden gebruikt. Wanneer dit knippen aanhoudt, veroorzaakt het kleine pieken op het DHPLC systeem. De WildType Control digest zal deze zelfde kleine pieken vertonen. Deze vergelijking wordt gebruikt om te kijken naar verschillen in de elektroferogrampatronen tussen de Wild-Type Control en het testmonster en wordt gebruikt bij de vergelijking van het testmonsterpatroon met dat van de WildType Control.


Pag. 41

Bijlage B

Probleem 5 – SURVEYOR Nuclease digestiepieken in negatieve controles DIGESTIEPIEKEN IN NEGATIEVE CONTROLES Zwak signaal Digestiepieken in Wild-Type Controle

DHPLC injectiepiek

MOGELIJKE OORZAAK Verontreiniging van inhoud van de kit met KRAS of NRAS amplicons of plasmidecontrole.


DHPLC waspiek

OPLOSSING Gooi alle kitcomponenten weg en gebruik een verse kit. Neem contact op met Transgenomic Technical Support om mogelijke oorzaken en bronnen van verontreiniging te bespreken.

Probleem 6 – Mislukte SURVEYOR Nuclease resultaten DE SURVEYOR NUCLEASEDIGESTIE VAN POSITIEVE CONTROLS IS MISLUKT

Ongesneden Homoduplexpiek Geen duidelijke digestiepieken

MOGELIJKE OORZAAK

OPLOSSING

SURVEYOR Nuclease werd niet toegevoegd

Digesteer een nieuw monster

SURVEYOR Nuclease digestie werd op de verkeerde temperatuur uitgevoerd

Digesteer een nieuw monster


Pag. 42

Bijlage B

Probleem 7 – Onverwachte pieken in SURVEYOR Nuclease digestiepatroon DE SURVEYOR NUCLEASE DIGESTIE VAN POSITIVE CONTROLS IS MISLUKT


MOGELIJKE OORZAAK

OPLOSSING

Mutatie aanwezig op ongewone locatie

Sequence monster voor het verifiëren van mutatie

Onverwachte digestiepiek

DHPLC injectiepiek

Verwachte digestiepieken

DHPLC waspiek


Pag. 43

Bijlage B

Probleem 8 – Verontreiniging van monsters met Positive Controls DIGESTIESSPATRONEN CONSISTENT MET AANWEZIGHEID VAN GEMENGDE POSITIVE CONTROLS' GESTEMPELDE REGIO EN WILD-TYPE HETERODUPLEXEN

MOGELIJKE OORZAAK Slechte pipetteringstechniek

Monster 1 Monster 2 Monster 3

OPLOSSING Men dient voorzichtig te zijn bij het pipetteren van de monsters om kruisverontreiniging te vermijden. Controleer de controlestempelsequentieregio's op Positive Control verontreiniging.

Sequentiëring die NRAS Exon 2 Stempelregio's onthult die een testmonster verontreinigen. Codon 12 en 13 regio van NRAS Exon 2

Plasmid Control "Stempel" regio van NRAS Exon 2 Monster is WildType Stempelsequentie is aanwezig Verontreinigd

Slechte pipetteringstechniek

Men dient voorzichtig te zijn bij het pipetteren van de monsters om kruisverontreiniging te vermijden. Controleer de controlestempelsequentieregio's op Positive Control verontreiniging.

Monster is mutant Geen stempelsequentie Geldig monster Monster is WildType Er is geen stempelsequentie aanwezig Geldig monster


Pag. 44

Bestelinformatie

Bestelinformatie Productnummer

Productnaam

Aantal

710104

SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD

100 reacties

710106

SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD

100 reacties

710400

SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD

100 reacties

710077

CRC RAScan Combination Kit

230 reacties

Contactgegevens Corporate Headquarters Transgenomic, Inc. 12325 Emmet Street Omaha Nebraska 68164 United States of America

Europe Transgenomic Limited 40 Watt Road Hillington Park, Hillington Glasgow G52 4RY United Kingdom

Phone: (888) 233-9283* of +1 (402) 452-5400 Fax: +1 (402) 452-5401 E-mail: [email protected]

Phone: +44 141 892 8800 Fax: +44 141 883 5967 E-mail: [email protected]

*In North America only

www.Transgenomic.com

Vertaling Disclaimer Transgenomic, Inc heeft alles in het werk gesteld om de juistheid van deze vertaling te garanderen . Als u vragen heeft over alle informatie in deze vertaalde versie van de handleiding , verwijzen wij naar de Engels versie Instructions for Use for the CRC RAScan™ Combination Kit CE IVD for DHPLC Systems – 482427(EN) http://world.Transgenomic.com/files/literature/482427-EN.pdf en/of contact op te nemen metTransgenomic via [email protected].

Licenties, Handelsmerken & Copyright SURVEYOR Nuclease: Dit product wordt gefabriceerd onder exclusieve licentie volgens Amerikaanse octrooien 6,699,980, 6,391,557, 5,869,245, hun buitenlandse equivalenten; en andere octrooien in behandeling. Voor het gebruik van SURVEYOR Nuclease heeft men een licentie nodig van Transgenomic. Academische organisaties zonder winstoogmerk of met winstoogmerk hebben bij aankoop van dit product beperkte rechten op het gebruik van SURVEYOR Nuclease voor researchdoeleinden. Doorverkoop of andere toepassingen zijn streng verboden. Neem contact op met Transgenomic voor verdere informatie. DNA Polymerase: Het gebruik van dit product valt onder één of meer van de volgende Amerikaanse octrooien en overeenkomende octrooiconclusies buiten de VS:, 5,789,224, 5,618,711, 6,127,155 en conclusies buiten de VS die overeenkomen met het Amerikaanse octrooi nr. 4,889,818. De aankoop van dit product omvat een beperkte, niet overdraagbare immuniteit tegen vervolging onder de bovengenoemde octrooiconclusies voor het gebruik van alleen deze hoeveelheid product voor de eigen interne research van de koper. Geen recht onder enige andere octrooiconclusie (zoals de gepatenteerde 5' Nucleaseprocesconclusies in de Amerikaanse octrooien nr. 5,210,015 en 5,487,972), geen recht op het uitvoeren van enige gepatenteerde methode en geen recht op het uitvoeren van commerciële diensten van ongeacht welk soort, inclusief zonder beperking het rapporteren van de resultaten van de activiteiten van de koper voor een vergoeding of andere commerciële overweging, wordt uitdrukkelijk, door implicatie of door niet-ontvankelijk-verklaring tot uitdrukking gebracht. Dit product is uitsluitend bedoeld voor research. Voor diagnostische toepassingen onder octrooien van Roche is een afzonderlijke licentie van Roche nodig. Verdere informatie over de aankoop van licenties is verkrijgbaar door contact op te nemen met de Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA. Transgenomic, SURVEYOR en WAVE zijn gedeponeerde handelsmerken en Navigator, CRC RAScan zijn handelsmerken van Transgenomic, Inc. Alle andere handelsmerken zijn handelsmerken van hun respectievelijke houders. © 2013 Transgenomic, Inc. Alle rechten voorbehouden. Gedrukt in de VS.

Document Nr. 482427(NL) rev-00


Pag. 45

Instructies voor gebruik voor de CRC RAScan Combination Kit

Recommend Documents