Verze: 1.4 Datum poslední revize: 25. 3. 2015
nastavení real-time PCR cykleru Rotor Gene™ 3000 (Corbett Research)
generi biotech
OBSAH:
1. Nastavení teplotního profilu a spuštění cykleru .................................... 3 2. Zadání vzorků .......................................................................................... 10 Způsoby vyhodnocení dat ............................................................................ 11 3. Vyhodnocení alelické diskriminace – mód Quantification .................. 12 4. Vyhodnocení alelické diskriminace - Scatter Graph Analysis ............ 16 5. Vyhodnocení alelické diskriminace - mód Allelic Discrimination ...... 21
generi biotech
2/25
1. Nastavení teplotního profilu a spuštění cykleru 1.1. Vložte vzorky do cykleru 1.2. Spusťte software cykleru a v záložce „Advanced“ vyberte nový run („New“)
generi biotech
3/25
1.3. Vyberte typ rotoru a zkumavek. Následně stiskněte „Next“
1.4. Zvolte objem reakce „Reaction Volume“ (obvykle 20 nebo 25 µl).
generi biotech
4/25
1.5. Nastavte teplotní profil analýzy v okně „Edit profile“
V záložce „Hold“ nastavte délku a teplotu úvodní denaturace.
generi biotech
5/25
V záložce „Cycling“ nastavte délku a teplotu denaturace a následného annealingu. Lze nastavit také počet cyklů.
generi biotech
6/25
1.6. Nastavte snímání fluorescence v příslušných kanálech. Po označení oblasti s annealingem (na obrázku znázorněno šedou barvou) stiskněte tlačítko „Acquiring to Cycling A“. V tabulce, která se objeví označte zvolený kanál v oblasti „Available Channels“ a pomocí šipky mezi okny jej přesuňte do oblasti „Acquiring Channels“
generi biotech
7/25
1.7. V případě potřeby proveďte kalibraci podle návodu výrobce cykleru (nastavený „gain“ by se mezi kanály neměl příliš lišit)
generi biotech
8/25
1.8. Uložte run do zvoleného adresáře a spusťte analýzu
generi biotech
9/25
2. Zadání vzorků 2.1. Jméno a typ vzorků zadejte v okně „Edit samples“, které se automaticky otevře po spuštění runu (popis vzorků lze upravovat také dodatečně, otevřením okna „Edit samples“ z hlavního
menu)
generi biotech
10/25
Způsoby vyhodnocení dat Na základě kvantifikace genové exprese – mód Quantification Vyhodnocení probíhá podle hodnot Ct, které se získají manuálním nastavením hodnoty Threshold. Data pro každý fluorescenční kanál je třeba vyhodnotit zvlášť.
Scatter Graph Analýza Tento způsob umožňuje rychlé a jednoduché vyhodnocení získaných dat prostřednictvím grafu. Software dokáže ke vzorkům přiřadit příslušný genotyp. Nelze manuálně nastavit hodnotu Threshold.
Na základě konečné fluorescence – mód Allelic Discrimination Tento způsob umožňuje data vyhodnotit na základě konečné fluorescence (fluorescence v posledním cyklu qPCR). Lze zde manuálně přizpůsobit hodnotu Threshold.
generi biotech
11/25
3. Vyhodnocení alelické diskriminace – mód Quantification 3.1. V hlavním menu v modulu „Analysis“ vyberte možnost „Quantitation“, označte požadovaný fluorescenční kanál a stiskněte příkaz „Show“
generi biotech
12/25
3.2. V okně „Quantitation Analysis“ nastavte při použití módů Dynamic Tube a Slope Correct zobrazení „Log. Scale“
3.3. V pravé dolní části okna lze manuálně nastavit hodnotu Threshold (zvolená hodnota bývá obvykle 0,05 ± 0,03). Pokud se tabulka nezobrazí automaticky, stačí kliknout myší na graf.
generi biotech
13/25
3.4. Práh (threshold) pro Ct Calculation umístěte do poloviny exponenciální části nárůstu fluorescenčního signálu) a v modulu „More Settings“ zvolte NTC threshold v rozmezí 1-20 % (pro odstranění nespecifického signálu). Doporučujeme nechat si viditelné pouze křivky pro příslušnou pozitivní kontrolu (WT/MUT) a zvolit takovou hodnotu NTC, při které zmizí křivka v kanále, kde nemá být daná pozitivní kontrola detekována. Toto nastavení následně použijte při vyhodnocování vzorků 3.5. Při odečtu hodnot pro genotypovou analýzu by měly být prahové fluorescence stejné pro oba kanály a měly by být lokalizovány do exponenciální fáze nárůstu fluorescence tj. v té oblasti, která je v logaritmickém zobrazení lineární
generi biotech
14/25
3.6. V tabulce „Quant. Results“ odečtěte hodnoty Ct
Pro odečet hodnot Ct v dalším fluorescenčním kanálu (například u multiplexní PCR, genotypová analýza, interní pozitivní kontroly) opět označte v modulu „Analysis / Quantitation“ požadovaný kanál a postupujte způsobem popsaným výše (od kapitoly 3.1.)
generi biotech
15/25
4. Vyhodnocení alelické diskriminace - Scatter Graph Analysis 4.1. Po spuštění programu stiskněte tlačítko „Analysis“. V nově otevřeném okně v záložce „Other“ zvolte možnost „Scatter Graph Analysis“.
generi biotech
16/25
4.2. Následně označte oba fluorescenční kanály a stiskněte tlačítko „Show“
generi biotech
17/25
4.3. Zobrazí se analýza alelické diskriminace. V horním okně jsou data znázorněna v grafu, kde na ose x je počet proběhlých cyklů PCR a na ose y je hladina fluorescence. Fluorescenční kanál FAM/Sybr je zobrazen hladkou křivkou, JOE/HEX křivkou s puntíky. V levém dolním okně je grafické znázornění jednotlivých skupin vzorků (WT, MUT a HET).
generi biotech
18/25
4.4. Při vyhodnocování alelické diskriminace doporučujeme nechat si viditelné pouze křivky pro příslušnou pozitivní kontrolu (WT/MUT) a podle toho si přiřadit daný genotyp k označení alely (např. WT je detekován v kanále FAM/Sybr a objeví se v levém horním rohu grafu („Scatter Analysis Graph“) . Nechte si viditelné pouze křivky standardů pro zvolený genotyp (např. HET). Myší ohraničte skupinu standardů a pravým myšítkem zvolte možnost „Define Genotype“. Vyberte genotyp. Takto pokračujte i s ostatními genotypy (WT a MUT).
generi biotech
19/25
4.5. Po definování oblastí se ve vedlejším okně („Scatter Analysis Results“) ve sloupci „Genotype“ zobrazí výsledek analýzy. 4.6. Toto nastavení následně použijte při vyhodnocování vzorků. Oblasti pro definování genotypu přizpůsobte rozptylu vzorků v grafu.
generi biotech
20/25
5. Vyhodnocení alelické diskriminace - mód Allelic Discrimination 5.1. Po spuštění programu stiskněte tlačítko „Analysis“. V nově otevřeném okně v záložce „Other“ zvolte možnost „Allelic Discrimination“.
5.2. Následně označte oba fluorescenční kanály (s pomocí klávesy Shift) a stiskněte tlačítko „Show“.
generi biotech
21/25
5.3. Zobrazí se analýza alelické diskriminace. V horním okně jsou data znázorněna v grafu, kde na ose x je počet proběhlých cyklů PCR a na ose y je hladina fluorescence. Fluorescenční kanál FAM/Sybr je zobrazen hladkou křivkou, JOE/HEX křivkou s puntíky.
generi biotech
22/25
5.4. Software dokáže na základě hodnoty konečné fluorescence daného vzorku (či standardu) vyhodnotit jeho genotyp. Nejdříve je ale třeba definovat fluorescenční kanály pro jednotlivé genotypy. V liště vyberte nabídku „Genotypes“ a v nově otevřeném okně „Genotyping“ vyberte fluorescenční kanály pro všechny genotypy. Poznámka:
Wild-type je detekován v kanále FAM/Sybr Mutant v kanále JOE/HEX Heterozygot v kanálech FAM/Sybr a zároveň JOE/HEX (zvolte tedy oba)
Genotypy se po vyhodnocení analýzy zobrazí v přehledné tabulce (viz bod 5.8.)
generi biotech
23/25
5.5. V pravé dolní části okna lze manuálně nastavit hodnotu Threshold (zvolená hodnota bývá obvykle 0,05 ± 0,03). Pokud se tabulka nezobrazí automaticky, stačí kliknout myší na graf.
generi biotech
24/25
5.6. Doporučujeme ponechat si viditelné pouze křivky pozitivních kontrol WT, MUT a HET (po kliknutí na vzorek v pravé části monitoru křivka zmizí, nebo se naopak objeví). Dále je třeba linii Thresholdu nastavit tak, aby ležela těsně nad nespecifickými křivkami – je to křivka pro standard WT v kanále JOE/HEX a křivka pro standard MUT v kanále FAM/Sybr. 5.7. Při hodnocení více mutací v rámci jednoho runu je nezbytné nastavit hodnotu threshold pro každou mutaci zvlášť podle příslušných standardů. Toto nastavení pak použijte pouze pro hodnocení vzorků testovaných na danou mutaci.
5.8. V levé dolní části je zobrazena tabulka (viz obrázek výše) s genotypy pro jednotlivé standardy. Takto se genotypy přiřadí i ke vzorkům DNA.
generi biotech
25/25
