Verze: 1.2 Datum poslední revize: 24.9.2014
Nastavení real-time PCR cykleru Light Cycler® 480 Instrument (Roche)
generi biotech
OBSAH Nastavení teplotního profilu ........................................................................................................................ 3 1.1. Nastavení nového teplotního profilu................................................................................3 2. Alelická diskriminace ...................................................................................................................................... 3 2.1. Nastavení pro alelickou diskriminaci ................................................................................3 3. Kvantifikace genové exprese ....................................................................................................................... 5 3.1. Nastavení pro genovou expresi.........................................................................................5 4. Detekční formáty............................................................................................................................................... 7 1.
generi biotech
2/10
1. Nastavení teplotního profilu 1.1.
Nastavení nového teplotního profilu
1.1.1. Při volbě „Program an experiment“ vyberte možnost „Experiment Creation“ a dále „New Experiment“ 1.1.2. Zvolte typ destičky (průhledná nebo bílá) 1.1.3. V tabulce „Run Protocol“ v části „Setup“ vyberte z rozbalovací nabídky „Detection Format“
2. Alelická diskriminace 2.1.
Nastavení pro alelickou diskriminaci
Pro alelickou diskriminaci vyberte jeden následujících detekčních formátů (viz Kap. 4): • V módu „Quantification“ zvolte možnost „3 Colors Hydrolysis Probes“ a při spouštění runu pak vyberte fluorescenční kanály FAM (465-510) a VIC/HEX (533-580) • V módu „Endpoint Genotyping (SNP Analysis)“ zvolte možnost „Dual Color Hydrolysis Probes“ s kanály FAM (465-510) a VIC (533-580) Nezadávat volbu Color Compensation (ta je pro HRM a melting), zde se zadává Continuous Acquision mode (fluorescenci snímá kontinuálně) Acquision Mode (snímání fluorescence) • Single (data snímá pouze 1x během každého cyklu, na konci zvoleného kroku 2.1.1. Nastavte kroky teplotního profilu uvedeného v manuálu ke kitu a zvolte objem reakce 20 µl
generi biotech
3/10
Ukázka správného nastavení: FAM: (465-510), VIC/Hex (533-580): Oblasti excitace:
Oblasti emise:
generi biotech
4/10
Verze: 1.2 Datum poslední revize: 24.9.2014
3. Kvantifikace genové exprese 3.1.
Nastavení pro genovou expresi
Pro kvantifikaci vyberte následující detekční formát (viz Kap.4): • V módu „Quantification“ zvolte možnost „Monocolor Hydrolysis Probe“ a při spouštění runu pak vyberte fluorescenční kanál FAM (465-510) Nezadávat volbu Color Compensation (ta je pro HRM a melting), zde se zadává Continuous Acquision mode (fluorescenci snímá kontinuálně) Acquision Mode (snímání fluorescence) • Single (data snímá pouze 1x během každého cyklu, na konci zvoleného kroku 3.1.1. Nastavte kroky teplotního profilu uvedeného v manuálu ke kitu a zvolte objem reakce 20 µl 3.1.2. Pro vyhodnocení zvolte možnost „Absolute Quantifiction“ • Data lze vyhodnotit dvěma způsoby: a) Second Derivative Maximum Method – určí hodnotu Ct jako bod, kde se křivka pro daný vzorek prudce zvedá
Převzato z manuálu výrobce cykleru: LightCycler480 II_Manual_V1.5
generi biotech
b) Fit Points Method – v oblasti exponenciální log fáze amplifikační křivky jsou zvoleny body, které protne přímka. Hodnota Ct je dána místem, kde tato přímka protne linii thresholdu.
Převzato z manuálu výrobce cykleru: LightCycler480 II_Manual_V1.5
generi biotech
6/10
Verze: 1.2 Datum poslední revize: 24.9.2014
4. Detekční formáty Detekční formáty vhodné pro alelickou diskriminaci Detekční formáty vhodné pro genovou expresi Applications
Assay Detection Format
Dyes
Excitation (nm) Detection (nm)
Product Characterization
SYBR Green l
SYBR Green I
465
510
465
510
Monocolor Hydrolysis Probe / UPL FAM Probe Dual Color* Hydrolysis Probes / UPL Probes
FAM VIC/Hex/Yellow 555
465 533
510 580
3 Colors Hydrolysis Probes
FAM VIC/Hex Cy 5/Cy 5.5
465 533 618
510 580 660
4 Colors Hydrolysis Probes
LightCycler® Cyan 500
440 FAM 498 LightCycler® Red 610 533 Cy 5/Cy 5.5 618
488 580 610 660
Monocolor HybProbe Probes
Fluorescein (Donor) 498 LightCycler® Red 640
640
Monocolor HybProbe Probes
Fluorescein (Donor) 498 LightCycler® Red 640
640
Multicolor HybProbe Probes
Fluorescein (Donor) LightCycler® Red 610 LightCycler® Red 640 Cy 5/Cy 5.5
465 498 498 498
510 610 640 660
Endpoint Genotyping Dual Color* (SNP Analysis) Hydrolysis Probes
FAM VIC
465 533
510 580
Melting Curve Genotyping (SNP Analysis)
SimpleProbe Probes
Fluorescein
465
510
Gene Scanning, Mutation Discovery, and Methylation Analysis
High Resolution Melting
HRM Dye
465
510
Quantification
Melting Curve Genotyping (SNP Analysis)
*Universal color compensation objects for dual color FAM/VIC and UPL assays
generi biotech
Seznam detekčních formátů cykelru LightCycler® 480 Real-Time PCR System:
Dostupné na: http://lifescience.roche.com
generi biotech
8/10
