nastavení real-time PCR cykléru CFX 96™ Real-Time System (BioRad)
generi biotech
OBSAH 1.
Spuštění již existujícího či nastavení nového teplotního profilu...........................................3 1.1. Spuštění již uloženého teplotního profilu........................................................................3 1.2. Nastavení nového teplotního profilu................................................................................7 2. Odečet hodnot Ct......................................................................................................................13
generi biotech
2/18
1. Spuštění již existujícího či nastavení nového teplotního profilu 1.1.
Spuštění již uloženého teplotního profilu
1.1.1. Před vložením CFX plata se vzorky do real-time PCR cykléru jej stočte na centrifuze. 1.1.2. Vložte plato do cykléru (ujistěte se, že je plato v cykléru umístěno správně – souřadnice A1 v levém horním rohu) 1.1.3. Pomocí ikony „Bio-Rad CFX Manager“ spusťte software cykléru (Verze 2.0) Nastavení teplotního profilu vám umožní „Startup Wizard“
1.1.4. Vyberte možnost nový run (Create a new Run)
generi biotech
3/18
1.1.5. V záložce „Protocol“ zvolte již existující profil „Select Existing“
• •
Po otevření okna vyberte zvolený profil a otevřete jej. Následně se vám název zvoleného profilu zobrazí v rámečku „Selected Protocol“ V rámečku „Preview“ je možno zkontrolovat nastavení teplotního profilu, snímání plata, objem vzorku („Sample Volume“) a počet opakování cyklů
generi biotech
4/18
1.1.6. Po stisknutí tlačítka „Next“ se dostanete do záložky „Plate“, kde je možno zkontrolovat, zda je v profilu nastaveno správné rozvržení plata a snímané fluorescenční kanály („Fluorophores“)
generi biotech
5/18
1.1.7. Po stisknutí tlačítka „Next“ se dostanete do záložky „Start Run“, kde lze spustit run.
•
Po zmáčknutí tlačítka „Start Run“ se objeví vámi přednastavená složka, do které bude soubor uložen. Po stisknutí tlačítka „Uložit“ (Save) se run spustí a po skončení zůstane v této složce uložen.
generi biotech
6/18
1.2.
Nastavení nového teplotního profilu
1.2.1. Před vložením CFX plata se vzorky do real-time PCR cykléru jej stočte na centrifuze. 1.2.2. Vložte plato do cykléru (ujistěte se, že je plato v cykléru umístěno správně – souřadnice A1 v levém horním rohu) 1.2.3. Pomocí ikony „Bio-Rad CFX Manager“ spusťte software cykléru a vyberte nový run (Create a new Run)
1.2.4. V záložce „Protocol“ zvolte „Create New …“
generi biotech
7/18
1.2.5. V nově otevřeném okně lze nastavit parametry teplotního profilu
• •
•
•
Nejprve nastavte objem reakce (obvykle 20 µl) Ve světle modře vybarveném poli je možno měnit nastavení – teplotu a čas (jak dlouho bude zvolená teplota udržována) – změna se provede dvojitým kliknutím na číslo v tmavě modrém políčku Je zde možnost nastavit počet opakování. Pokud si přejete, aby byl úsek označený tmavě červenou šipkou opakován např. 40x, je potřeba zvolit počet opakování 39x (tedy kolikrát se bude opakovat, ne kolikrát celkem proběhne) V levé dolní části okna je možno teplotní profil upravovat pomocí • Vložení kroku • Vložení gradientu teploty (podrobně viz dále) • Vložení opakování určitých kroků • Vložení křivky tání • Přidaného snímání destičky navíc • Nastavení teploty a doby daného kroku • Odstranění kroku
generi biotech
8/18
1.2.5.1.
Nastavení gradientu teploty
Po stisknutí tlačítka „Insert Gradient“ je možné do teplotního profilu zařadit gradient teploty. Změna se provede dvojitým kliknutím na číslo v tmavě modrém políčku, přičemž se nastavuje minimální a maximální hodnota. Teplotní rozmezí gradientu je pak zobrazeno v pravé dolní části okna.
1.2.6. Jakmile je profil nastaven, po stisknutí tlačítka „OK“ budete vyzváni k uložení souboru.
generi biotech
9/18
1.2.7. V záložce „Plate“ zvolte opět tlačítko „Create New …“
• •
V okně „Plate Editor - New“ je možno nastavit vzhled plata, snímání ve fluorescenčních kanálech, skupiny vzorků apod. Tlačítkem „Select Fluorophores …“ je možno zvolit fluorescenční kanály, ve kterých chcete snímat signál
generi biotech
10/18
1.2.8. Po stisknutí tlačítka „OK“ budete vyzváni k uložení nastavení. Název souboru bude zobrazován v nabídce „Express Load“ při každém dalším spuštění runu.
generi biotech
11/18
1.2.9. Po stisknutí tlačítka „Next“ se dostanete do záložky „Start Run“, kde lze spustit run.
•
Po zmáčknutí tlačítka „Start Run“ se objeví vámi přednastavená složka, do které bude soubor uložen. Po stisknutí tlačítka „Uložit“ (Save) se run spustí a po skončení zůstane v této složce uložen
Pro zobrazení odečtu času zbývajícího do konce runu klikněte chvilku po spuštění runu na záložku „Time Status“.
generi biotech
12/18
2. Odečet hodnot Ct 2.1.
Spusťte program „Bio-Rad CFX Manager“ na vašem počítači a pomocí ikony otevřete požadovaný soubor
2.2.
V záložce „Quantification“ zvolte flouorecenční kanály, ve kterých byl run snímám a zašktrněte „Log Scale“ v případě, že chcete hodnoty převést do logaritmické škály (doporučeno)
generi biotech
13/18
2.3.
•
Následně je třeba nastavit hodnotu threshold (linie prahového cyklu by měla být umístěna v polovině lineální části křivky – při zobrazení v logaritmické škále) V záložce „Settings“ – „Baseline Threshold“ je zobrazena hodnota automaticky zvolené hodnoty threshold („Auto Calculated“) nebo si můžete hodnotu zvolit podle svého uvážení („User Defined“)
generi biotech
14/18
•
Pro případ nevhodně vypočítané hodnoty „Baseline Cycles“ pro některou z křivek je možné upravit rozsah manuálně v polích „Begin“ a „End“ (v režimu „User Defined“)
generi biotech
15/18
2.4.
Chcete-li si vzorky barevně rozlišit, stiskněte ikonu „Trace Style“ a po označení zvolených vzorků na platu vyberte v kolonce „Selected Wells“ barvu, kterou chcete vybrané vzorky označit. Postup lze opakovat pro více barev (např. barevné rozlišení NTC, standardu a vzorků)
2.5.
Jamky plata, které neobsahovaly žádné vzorky je možné odoznačit (šedá barva). Nebudou se dále zobrazovat jejich hodnoty Ct
generi biotech
16/18
2.6.
Pro zobrazení hodnot Ct nejdříve nastavte správný mód. V záložce „Settings“ – „Analysis Mode“ zvolte možnost „Baseline Subtracted Curve Fit“
2.7.
V záložce „Quantification Data“ s volbou „Results“ je pak zobrazeno: • označení jamky („Well“) • zvolený fluorofor („Fluor“) • hodnoty prahového cyklu („Threshold Cycle“)
Kliknutím na položku v liště (na obrázku vyznačeno zelenou šipkou) se hodnoty seřadí podle této zvolené položky. Lze také sloupce mezi sebou různě přesouvat
generi biotech
17/18
Poznámka: Funkci zvýraznění křivky, je-li na ní zrovna umístěný kurzor myši lze vypnout v nabídce „Settings“ – „Mouse Highlighting“. 2.8.
Další záložky
• „Run Information“ V této záložce jsou uvedeny parametry proběhlého runu: teplotní profil a jeho název, datum a čas runu nebo např. objem reakce.
• • •
„Gene Expression“ „End Point“ „Allelic Discrimination“
Data pro alelickou diskriminaci musí pocházet z multiplex reakce s obsahem nejméně dvou fluoroforů. Pomocí jednoho fluoroforu je možné identifikovat jeden typ alely ve vzorku.
generi biotech
18/18
