NAGY ÁTERESZTŐKÉPESSÉGŰ MOLEKULÁRIS BIOREMEDIÁCIÓS CENTRUM LÉTREHOZÁSA DR. KOVÁCS TAMÁS VEZÉRIGAZGATÓ-HELYETTES
BUDAPEST, 2015.03.25
A PROJEKT • Az Enviroinvest Zrt és az MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont támogatást nyert a Norvég Alap Zöldipari Innováció programján. • Összes költségvetés: 175 MFt; támogatás: 123 MFt • Befejezési határidő: 2016. február
• A projekt célja egy olyan molekuláris biológiai laboratórium létrehozása, melyekkel megválaszolhatóak az alábbi kérdések:
MEGVÁLASZOLANDÓ KÉRDÉSEK 1.
2.
3.
4.
• Jelen vannak-e az adott szennyezőanyag degradációjáért felelős mikroorganizmusok, ha igen, akkor megközelítőleg milyen arányban?
• Szükség van-e mikroorganizmusok inokulálására és/vagy tápanyagutánpótlásra? • Olyan irányban folyik-e a kármentesítési folyamat, mint amilyenben szükséges? • Milyen mértékben toxikus az adott szennyezőanyag a mikroflórára?
A PROJEKT ELEMEI Beruházás: • Melléképület felújítása • Illumina MiSeq újgenerációs DNS szekvenáló beszerzése • Szuperszámítógép beszerzése • CLC Genomics Workbench szoftver beszerzése
K+F: • Mintavételi protokoll kidolgozása • Metagenom analízis • Etidium-monoazid előkezeléses qPCR • MFCDiagn • Kidolgozott szolgáltatáscsomag validálása
MINTAVÉTELI PROTOKOLL
Kim et al., FEMS Microbiol. Ecol., 2014: 465-475
METAGENOM-ANALÍZIS Mi a metagenomika?
A DNS direkt (klónozás nélküli) izolálása környezeti mintákból. Vizsgálható a nem tenyészhető mikroorganizmusok jelenléte is. Jo Handelsman (2004): Metagenom – a genomok összessége, mintha a közösség egyetlen szervezet lenne, és a genomok alkotnák a kromoszómáit, melyből a metagenom épül fel.
METAGENOM-ANALÍZIS A környezeti mintából izolálható baktériumok csupán 1%-a tenyészthető laboratóriumban
METAGENOM-ANALÍZIS Mi a metagenomika?
A DNS direkt (klónozás nélküli) izolálása környezeti mintákból. Vizsgálható a nem tenyészhető mikroorganizmusok jelenléte is. Jo Handelsman (2004): Metagenom – a genomok összessége, mintha a közösség egyetlen szervezet lenne, és a genomok alkotnák a kromoszómáit, melyből a metagenom épül fel.
METAGENOM-SZEKVENÁLÁS • Célja: egy adott (környezeti) mintában meghatározni a mikroflóra összetételét • Többféle megközelítés (shotgun, rRNS)
lehetséges • Leggyakrabban a 16S rRNS-t kódoló gén szekvenciája alapján történik
PCR ELVE
Hajósné Dr. Novák Márta: Genetikai variabilitás a növénynemesítésben
PCR REAKCIÓ Primertervezés: nagyon lényeges, csak validált primert használjunk (Primerek: rövid DNS szakaszok, melyek komplementerek a felszaporítandó DNS valamely szakaszával. A primerpár 2 tagja közé eső szakaszt amplifikáljuka PCR során). A projekt során standardizálni fogjuk a primertervezés elveit.
DNS TISZTÍTÁS • Nehéz a gátlóanyagoktól megszabadulni KH-1
TR-1
2-metil-naftalin (µg/L)
991,7
165,9
1-metil-naftalin (µg/L)
1292,2
371,0
dha
2,3-dimetilnaftalin (µg/L)
1450,9
592,2
dha
1,3-dimetilnaftalin (µg/L)
774,3
205,8
dha
1,6,7-trimetilnaftalin (µg/L)
768,9
196,1
dha
KH-1
TR-1
TK-1
20,1
5,7
dha
34,8
10,0
dha
2,6,10-trimetilpentadekán (mg/L) 2,6,10,14tetrametil-
TK-1 dha
DNS TISZTÍTÁS • Nehéz a gátlóanyagoktól megszabadulni Negatív TK-1
TR-1
KH-1
Negatív
DNS SZEKVENÁLÁS • Leolvassuk az amplifikált DNS bázissorrendjét • Lényeges a read-hossz Read: az adott szekvenálási technológia által megszakítás nélkül leolvasott, egymást követő nukleotidok száma
READEK A projekt célja egy molekuláris biológiai laboratórium létrehozása, mely alkalmas arra, hogy a szennyezett területek bioremediációja
132 karakter 25 karakterenként olvasva: ológiai laboratórium létr A projekt célja egy molek laboratórium molekuláris biológiailétrehozása, lab
… és így tovább… 132 vagy több karakterenként olvasva: A projekt célja egy molekuláris biológiai laboratórium létrehozása, mely alkalmas arra, hogy a szennyezett területek bioremediációja
READ-HOSSZ Rövid read
Hosszú read
READ-HOSSZ Rövid read-nél illeszteni kell, ekkor fennáll a tévedés lehetősége: nagyon hasonló szekvenciájú DNS molekulák keverékének szekvenálása történik. Hosszú readnél fizikailag kapcsolva van a variábilis régió egésze. Rövid readnél törzs vagy osztály szintű, hosszú readnél genus, de akár faj szintű azonosítás is lehetséges.
PLATFORMOK DNS SZEKVENÁLÁS: READHOSSZ Leghosszabb readdel a Roche 454 technológia rendelkezik. DNS szekvenálás: adatmennyiség Shot gun szekvenálás: A DNS-t random darabokra törjük Funkcionális információt nyerhetünk (pl. metabolizmusban résztvevő enzimeket kódoló génekről). Legtöbb “értelmes” adatot az Illumina technológia szolgáltatja
BIOINFORMATIKAI KIÉRTÉKELÉS Eredmény A minta mikroflóra-összetétele faj vagy genus szinten, %-os összetételben, illetve funkcionális adatok.
Fontos a kiértékelő szoftver és a számítógép gyorsasága és memóriája
QPCR (ETIDIUM-MONOAZID ELŐKEZELÉSSEL) Megválaszolandó kérdés: egy adott baktériumfaj jelen van-e a mintában, ha igen, milyen mennyiségben, illetve milyen az adott szennyezőanyag lebontásáért felelős enzimeket kódoló gének relatív géngyakorisága.
Olyan PCR reakció, melynek során valós időben monitorozzuk az amplifikált DNS mennyiségét (fluorescens festékkel).
QPCR (ETIDIUM-MONOAZID ELŐKEZELÉSSEL)
A módszer előnye: gyors, nyomnyi mennyiségű baktérium kimutatására is alkalmas, kvantitálható. Hátránya: sok esetben nehéz a PCR gátló anyagoktól megszabadulni, validálni kell, a nem élő baktériumokból
QPCR (ETIDIUM-MONOAZID ELŐKEZELÉSSEL) Az etidium-monoazid csak az elpusztult sejtek károsodott membránján keresztül tud penetrálni. Kovalensen köt a DNS-hez, melynek gátolja a PCR reakcióban való amplifikációját. Eredmény: csak az élő sejtekből származó DNS-t fogjuk kimutatni.
e-
metabolizmus
Grafit
Proton szelektív membrán
Grafit
MFCDIAGN
+ Anód cella : mediátor
Katód cella
MFCDIAGN Az áramerősség μA-es (általában 1-4 μA) tartományban mérhető. 0,003
0,004 0,0035
0,0025
0,003 0,002
0,0025 0,0015
0,002 0,0015
0,001
0,001 0,0005
0,0005 0
0 1
1
162 323 484 645 806 967 1128 1289 1450 1611 1772 1933 2094 2255 2416 2577 2738 2899 3060 3221 3382 3543 3704 3865 4026 4187
Acinetobacter baumannii 0,004
154 307 460 613 766 919 1072 1225 1378 1531 1684 1837 1990 2143 2296 2449 2602 2755 2908 3061 3214 3367 3520 3673 3826 3979 4132
Escherichia coli 0,003
0,0035
0,0025 0,003
0,002 0,0025
0,002
0,0015
0,0015
0,001 0,001
0,0005 0,0005
0
0 1
229 457 685 913 1141 1369 1597 1825 2053 2281 2509 2737 2965 3193 3421 3649 3877 4105 4333 4561 4789 5017 5245 5473 5701 5929
1
164
327 490 653 816 979 1142 1305 1468 1631 1794 1957 2120 2283 2446 2609 2772 2935 3098 3261 3424 3587 3750 3913 4076 4239
Salmonella TyphimuriumStreptococcus pneumoniae
MFCDIAGN 0,004
0,0035
0,003
0,0025
0,002
E. coli gyep
Nem toxikus
0,0015
0,001
0,0005
0 1
206 411 616 821 1026 1231 1436 1641 1846 2051 2256 2461 2666 2871 3076 3281 3486 3691 3896 4101 4306 4511 4716 4921 5126 5331 5536 5741 5946 6151 6356
0,004
0,0035
0,003
0,0025
Enyhén toxikus
0,002
0,0015
0,001
0,0005
0 1
212 423 634 845 1056 1267 1478 1689 1900 2111 2322 2533 2744 2955 3166 3377 3588 3799 4010 4221 4432 4643 4854 5065 5276 5487
0,004
0,0035
0,003
0,0025
0,002
Toxikus
0,0015
0,001
0,0005
0 1
219 437 655 873 1091 1309 1527 1745 1963 2181 2399 2617 2835 3053 3271 3489 3707 3925 4143 4361 4579 4797 5015 5233 5451 5669
2 óra 6 óra
24 óra
ÖSSZEFOGLALÁS • A metagenom szekvenálással meghatározhatjuk a minta mikroflóra-összetételét, és a taxonok egymáshoz
viszonyított arányát • A qPCR-el meghatárohatjuk a mintában az általunk kívánt mikroorganizmus mennyiségét, illetve meg tudjuk
határozni a szennyezőanyag lebontásáért felelős enzimeket kódoló gének relatív géngyakoriságát. • Az MFC Diagn alkalmas toxicitás-vizsgálatok gyors
elvégzésére • E molekuláris biológiai módszerekel megválaszolhatóak a
TOVÁBBI INFORMÁCIÓK Projekthonlap
http://molbioremed.wordpress.com
KÖSZÖNJÜK A FIGYELMET!
