Dr Nagy Zsolt György

Új mechanizmusok a csontanyagcsere szabályzásában Doktori értekezés Dr Nagy Zsolt György Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető:

Dr. Speer Gábor egyetemi adjunktus, Ph.D.

Hivatalos bírálók:

Dr. Mocsai Attila, egyetemi docens, Ph.D. Dr. Balogh Ádám, MTA Doktora,egyetemi docens,

Bíráló bizottság elnöke: Bíráló bizottság tagjai:

Dr. Spät András, akadémikus, SE Élettani Intézet Dr. Szendrői Miklós, MTA Doktora, SE Ortopédiai Klinika Dr. Bálint Géza, MTA Doktora,ORFI Budapest 2009.

TARTALOMJEGYZÉK

2

Röviditések jegyzéke

7

1. ÁLTALÁNOS BEVEZETÉS

9

1.1. Csontremodeling

9

1.1.1. Genetikai faktorok.

11

1.1.2. Szisztémásan ható faktorok.

11

1.1.2.a. Parathormon

12

1.1.2.b. Pajzsmirigyhormonok

13

1.1.2.c. Szexhormonok

14

1.1.3. Lokális faktorok.

15

1.1.3.a. Citokinek

16

1.1.3.b. Interleukinok

16

1.1.3.c. Növekedési faktorok

17

1.2. A csontanyagcsere hormonális szabályozása.

18

1.3. A csontanyagcsere kóros folyamatai, a csontvesztés kialakulásának okai.

20

2. CÉLKITŰZÉSEK

21

I.. A parathormon csonthatásainak hatásmechanizmusa

21

A. A PTH, TNF-α és az IL-I hatása az IL-6 promoterrel transzfektált osteoblastokon, PKC gátlók jelenlétében. B. A PKC izoenzimek szerepe a PTH, TNF-α és az IL-1β IL-6 szekréciót fokozó hatásában, szelektív PKC-béta antagonista (LY379196) jelenlétében osteoblastokban. C. Rho fehérjék szerepe a PKC transzlokációban és a PTH stimulálta IL-6 promoter aktivításban UMR-106 osteoblastokban. II. A calcium homeosztázisra ható genetikai faktorok polimorfizmusainak vizsgálata posztmenopauzális egészséges és oszteoporotikus nőkben. A.

Az A986S CaSR-t érintő polimorfizmus szerepe a csontanyagcserében

B.

Az IL-1RA gén polimorfizmusának összefüggése a csontok ásványianyag tartamával.

C.

A VDR gén BsmI polimorfizmus megoszlása a hazai populációban, valamint a VDR genotípusok és a csontok ásványianyag tartalmának összefüggése.

2

23

D.

Az ER gén PvuII és XbaI polimorfizmusának megoszlását a hazai populációban és ezek hatását a csontok ásványianyag tartamának alakulására.

III. Az ösztrogén csonthatásainak hatásmechanizmusa.

24

A. Az ösztrogén receptorok szerepe a PTH indukálta IL-6 szekréció gátlásában ERα és Erβ receptorokkal, IL-6 promoterrel mint negatív és ERE promoterrel mint pozitív kontroll, transzfektált osteoblastokon. B. Az ösztrogén hatása a génexpresszióra egér model felhasználásával, microarray technika segítségével. C. Az ösztrogén hiányában szignifikánsan változó csontszöveti expressziót mutató gének, illetve a vizsgált gének közötti kapcsolatok humán csontban. IV. A pajzsmirigyhormonok csonthatásának hatásmechanizmusa.

25

A. A trijodtironinnak, a parathormonnak és az ösztrogénnek az IGF-I promoterére gyakorolt hatása. B. A trijodtironinnak, a parathormonnak az ösztrogénnek és azz IL-1β-nak az IL-6 gén promoterére gyakorolt hatása. C. A szérum és a mononukleáris sejtkúltúrák felülúszójának TNF-α tartalma csontvesztést okozó hyperthyreosisban, valamint ennek összefüggése a csontdenzitással. D. Hyperthyreosisos betegek szérumának az IGF-I és IGFBP-3, -4, és -5 koncentrációja, ezek összefüggése a csontok ásványianyag tartalmával, valamint ezek változása a terápia során. 3. MÓDSZEREK

26

3.1.Sejtbiológiai módszerek

26

3.1.1. Humán mononukleáris sejtkúltúra. 3.1.2. Csontsejtkúltúra. 3.1.3. Bioaktív TNFα koncentráció mérése. 3.2. Humán és állatkisérletek.

27

3.2.1. A vizsgálatainkbanban résztvevő betegek 3.2.2. Humán csontszövetminták 3.2.3. Egér csontszövet. 3.3. Molekuláris biológiai módszerek

28

3.3.1. Plasmid konstrukciók és receptorok.

3

3.3.2. Tranziens transzfekció, luciferase assay 3.3.3. PKC assay 3.3.4. Subcellularis frakcinálás 3.3.5. Western blott 3.3.6. Rhotekin assay 3.3.7. Immunofluorescencia 3.3.8. RNS preparálás 3.3.9. Microarray és próbák 3.3.10. A vizsgált gének kiválasztása, kvantitatív valós idejű RT-PCR. 3.3.11. génpolimorfizmus PCR 3.4. Biokémiai módszerek

36

3.4.1. Szérum IGF-I és IGF-kötőfehérjék (IGFBP-k) mérése. 3.4.2. Immunoreaktív TNF-α koncentráció mérése. 3.4.3. Szérum pajzsmirigyhormon koncentrációk mérése. 3.5.In vivo vizsgáló módszerek

37

3.5.1. Osteodensitometria. 3.6. Statisztikai módszerek

37

4. EREDMÉNYEK

38

I.. Parathormon hatása a csontanyagcserében

38

A. A PTH, TNF-α és az IL-I hatása az IL-6 promoterrel transzfektált osteoblastokon, PKC gátlók jelenlétében.

38

B. A PKC izoenzimek szerepe a PTH, TNF-α és az IL-1β IL-6 szekréciót fokozó hatásában, szelektív PKC-béta antagonista (LY379196) jelenlétében osteoblastokban.

44

C. Rho fehérjék szerepe a PKC transzlokációban és a PTH stimulálta IL-6 promoter aktivításban UMR-106 osteoblastokban.

51

II.. A calcium homeosztázisra ható genetikai faktorok polimorfizmusainak vizsgálata posztmenopauzális egészséges és oszteoporotikus nőkben. A.

Az A986S CaSR-t érintő polimorfizmus szerepe a csontanyagcserében

B.

Az IL-1RA gén polimorfizmusának összefüggése a csontok ásványianyag tartamával.

4

60

C.

A VDR gén BsmI polimorfizmus megoszlása a hazai populációban, valamint a VDR genotípusok és a csontok ásványianyag tartalmának összefüggése.

D.

Az ER gén PvuII és XbaI polimorfizmusának megoszlását a hazai populációban és ezek hatását a csontok ásványianyag tartamának alakulására.

III. Az ösztrogén csonthatásainak hatásmechanizmusa.

61

A. Az ösztrogén receptorok szerepe a PTH indukálta IL-6 szekréció gátlásában ERα és Erβ receptorokkal, IL-6 promoterrel mint negatív és ERE promoterrel mint pozitív kontroll, transzfektált osteoblastokon.

61

B. Az ösztrogén hatása a génexpresszióra egér model felhasználásával, microarray technika segítségével.

68

C. Az ösztrogén hiányában szignifikánsan változó csontszöveti expressziót mutató gének, illetve a vizsgált gének közötti kapcsolatok humán csontban. IV. A pajzsmirigyhormonok szerepe a csontanyagcserében

72 76

A. A trijodtironinnak, a parathormonnak és az ösztrogénnek az IGF-I promoterére gyakorolt hatása.

76

B. A trijodtironinnak, a parathormonnak az ösztrogénnek és azz IL-1β-nak az IL-6 gén promoterére gyakorolt hatása.

78

C. A szérum és a mononukleáris sejtkúltúrák felülúszójának TNF-α tartalma csontvesztést okozó hyperthyreosisban, valamint ennek összefüggése a csontdenzitással.

80

D. Hyperthyreosisos betegek szérumának az IGF-I és IGFBP-3, -4, és -5 koncentrációja, ezek összefüggése a csontok ásványianyag tartalmával, valamint ezek változása a terápia során.

82

5.MEGBESZÉLÉS

83

I. A parathormon szerepe a csontanyagcserében

83

II..A calcium homeosztázisra ható genetikai faktorok polimorfizmusainak vizsgálata posztmenopauzális egészséges és oszteoporotikus nőkben.

87

III. Az ösztrogén szerepe a csontanyagcserében.

88

IV. A pajzsmirigyhormonok szerepe a csontanyagcserében.

95

6.KÖVETKEZTETÉSEK

97

7.ÖSSZEFOGLALÁS

100

5

8.SUMMARY

101

9.IRODALOMJEGYZÉK

103

10.SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE

115

10.1.Az értekezés témájával összefüggő saját közlemények jegyzéke

115

10.2.További saját közlemények jegyzéke

117

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

123

6

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE -MEM

-minimum essential medium

Akt/PKB

Akt/protein kinase B

ALPL

alkalikus foszfatáz

AP-1

activating protein-1

BGLAP

bone gamma-carboxyglutamate protein, osteocalcin

BMD

bone mineral density, csontsűrűség

BMI

body mass index

BMP

bone morphogenetic protein, csont morfogenetikus fehérje

BMPR

bone morphogenetic protein receptor

BMU

basic multicell unit, csont remodeling egység

CaSR

kálciumszenzor-receptor

COL

kollagén

DAG

diacylglycerol

DFA

discriminant function analysis, diszkriminancia analízis

DMSO

dimetil-szulfoxid

ECM

extracelluláris mátrix

ER

ösztrogén receptor

ERE

ösztrogén response element

ERK

extracellular signal-regulated kinase

FGF

fibroblast növekedési faktor

FGFR1

fibroblast növekedési faktor receptor 1

FITC

fluorescein isothiocyanate

GAPDH

glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

G-CSF

granulocita kolónia stimuláló faktor

GH

növekedési hormon

IGF

inzulin-szerű növekedési faktor

IGFBP

IGF-kötő fehérjék

IGSF4

immunoglobulin superfamily member 4

IL

interleukin

IRAP

IL-1-receptor-antagonista protein

7

MAPK

mitogen-activated protein kinase

MGP

matrix gamma-carboxyglutamate protein

MMP2

mátrix metalloproteináz 2

NF-κB

nuclear factor kappa B

OPG

osteoprotegerin

PBS

phosphate buffered saline

PCA

principal components analysis, főkomponens analízis

PDGF

trombocitákból származó növekedési faktor

PLD

phospholipase D

PKC

protein kinase C

PKA

protein kinase A

PTH

parathormon

PTHR

parathormon receptor

PTHRP

parathormone-related protein

RANK

receptor activator of nuclear factor kappa B

RANKL

receptor activator of nuclear factor kappa B ligand

RUNX2

runt-related transcription factor

SNP

egypontos nukleotid polimorfizmus

SPARC

osteonectin

TGFβ

transzformáló növekedési faktor béta

TNFα

tumor necrosis faktor alfa

TNFR

tumor necrosis faktor receptor

VDR

D-vitamin receptor

VEGF

vaszkuláris endotheliális növekedési faktor

WNT

wingless jelátviteli út

8

1. ÁLTALÁNOS BEVEZETÉS A csontszövetet hosszú ideig statikus rendszernek tartottuk, melynek alapvető szerepe a test mozgatása, védelme. Napjainkban, főleg az osteoimmunológia kutatási eredmények megismerése után a csontszövetet olyan dinamikus rendszernek tartjuk, amely szorosan együttműködik az őt körülvevő struktúrákkal, csontvelővel, erekkel, idegekkel, zsír és izomszövettel.[1] Ez a csontvelői mikrokörnyezet, amelynek alkotóelemei egymással szoros kölcsönhatásban állnak, egymás differenciálódását, működését szabályozzák. Természetesen a rendszer bármely elemének károsodása, vagy működésbeli rendellenessége az adott szövet károsodásán kívül a rendszer többi tagjának a működésére is kihat. Az osteoblastok mesenchymális sejtelőalakokból származnak, melyek összetett extracelluláris mátrixot termelnek, melybe később ásványi anyagok rakódnak le. Az osteoblastokból származó osteocyták a mineralizált alapállományba ágyazódnak be. A csontképzést az úgynevezett mestergének irányítják, melyek a génátírást szabályozzák. Ilyenek a runx 2 (más néven cbfa1) és növekedési faktorok, valamint a TGFβ szupercsaládba tartozó csont morfogenetikai proteinek (BMP). Az osteoclastok a vér hemopoetikus őssejt-prekurzorokból fejlődnek ki, esszenciális gének, szignalizációs fehérjék pl. nukleáris faktor-kappa B és több más, sejthez kötött vagy szolúbilis citokin és növekedési faktor irányítása mellett.[2] A RANK/RANK ligandrendszer az osteoclast-fejlődést dominánsan meghatározó szabályozó rendszer. A RANK ligand az osteoblastok és prekurzorainak a felszínén expresszálódik, az osteoclastok differenciálódását kiváltó faktorok hatására. [3] 1.1. Csontremodeling. Az osteoblastok és osteoclastok aktivitásának szoros koordinációja mellett zajló csontremodeling összességében a szabályzó faktorok kölcsönhatásainak eredménye. A csontszövet az élet során azonban nemcsak épül, növekszik, hanem a csúcscsonttömeg elérése után is szakaszosan átépül (remodeling). A remodeling arra szolgál, hogy a csont öregedéssel bekövetkező fáradásos töréseit kivédje, és biztosítsa a csont rugalmas válaszát a külső hatásokra. Kiegyensúlyozott körülmények között egy év alatt az összcsonttömeg mintegy 5 – 10 %.a újul meg. Mikroszkópikus szinten a remodeling soksejtű, elemi egységekben zajlik (BMU), ahol az osteoclastok a nyugalomban lévő csontállomány felszínén lévő lapos osteoblastok helyére kúsznak, és egy adott

9

mennyiségét lebontják. A kialakult üregekbe aktív köb alakú oszteoblasztok érkeznek és először szerves alapállománnyal töltik ki, melybe később ásványi anyagokat építenek be. A BMU részei az osteoclastok, macrophágok, preosteoblastok, osteoblastok, melyek szisztémás és helyi faktorok szabályzása alatt állnak. A szabályozó mechanizmusoknak köszönhetően a csontreszorpció és -formáció folyamatai egymással szorosan összekapcsolódnak (coupling), fenntartva ezzel a csont anatómiai és strukturális integritását. [4] Felnőttkorban egy év alatt a trabecularis csontok mintegy 25%-a rezorbeálódik, majd újraépül, míg a csöves csontokban ez az arány csak 3%. A különbség jelzi, hogy a remodeling elsősorban helyi faktorok által szabályozott folyamat, amelyben a csontvelői eredetű citokinek is jelentős szerepet játszanak, ezért erősen függ az adott csont felszín-tömeg arányától. A trabecularis csontoknál ez az arány magas, és a felszín 70-85%-a érintkezik a csontvelővel. Emberben az átépülés átlagos ideje 2-8 hónap között van, melynek nagy részét a formáció teszi ki. Vázrendszerünkben megközelítőleg 35 millió BMU van, melyből évente 3-4 millió aktiválódik, míg minden pillanatban kb 1 millió működik, így tehát a teljes vázrendszer 10 évente megújul. A BMU-on belül a képződő és pusztuló sejtek közötti egyensúly a csont homeosztázis szempontjából kritikus. Ennek a bonyolult egymásra hatásnak az eredményeképpen fiziológiás körülmények között a csontbontás és -építés egyensúlyban van.[2] A csontrezorpció és formáció közti egyensúly kialakításában, a csontszövet sejtes elemei, genetikai, mechanikai, vasculáris, táplálkozási, hormonok és citokinek, növekedési faktorok összehangolt működése vesz részt. (1.ábra)

osteoclastogenesis

integrinek kollagenázok fedősejt Prostaglandin IGF-I, NO BMP, TGF-β, PDGF, IGF

osteocyta INGER

Ca10(PO4)6(OH)2

1. ábra. A remodeling folyamata.

10

BMP, kollagén

1.1.1. Genetikai faktorok. A csúcscsonttömeg kialakulása 60-80 %-ban genetikusan determinált. Másrészt számos gén és genetikusan meghatározott szabályzó út került felismerésre, melyek alapvetően befolyásolják a szabályos remodelinget. A kalcium metabolizmus és a csontsejtek szabályozásában részt vevő gének tanulmányozása során több mint kétszáz olyan gént azonosítottak már, amelyeknek az osteoporosis kialakulásában illetve a csonttömeg csökkenésében szerepe van. A betegség genetikai hátterében fontos tényezők a kandidáns gének egypontos nukleotid polimorfizmusai (SNP). Számos ilyen genetikai variáns összefüggését írták le a csontdenzitással és a törési rizikóval.[5] Az elmúlt

évek

vizsgálataiban

számos

munkacsoport

talált

olyan

kandidáns

génpolimorfizmusokat melyek a csontömeggel, vagy az osteoporotikus töréssel voltak kapcsolatba hozhatók, ilyenek a VDR, ER, COLIA1, IRAP és a CaSR.[6] 1.1.2. Szisztémásan ható faktorok. A normális csontfejlődés és remodeling intakt endokrin rendszert feltételez. A csontanyagcserét csaknem valamennyi szisztémás hormon befolyásolja: a nemi, mellékvese, pajzsmirigy, mellékpajzsmirigy, növekedési hormonok egyéb hormonok (glükokortikoidok, leptin, inzulin) mellett. (1.táblázat) A kalcium-anyagcserét három, úgynevezett calcitrop hormon (parathormon, calcitriol, calcitonin) összehangolt működése szabályozza. [7,8] Fokozó hatások

Gátló hatások

PTH

leptin

PTHrP

ösztrogének

thyroxin

tesztoszteron

inzulin

glükokortikoidok

1.táblázat. A remodeling szisztémás mediátorai.

11

1.1.2.a. Parathormon. A PTH a mellékpajzsmirigy fősejtjeinek peptidhormonja. A PTH génjében kódolt ún, preproPTH 115 aminosavból áll, amelyből az endoplazmatikus reticulum 23 tagú preszekvenciát hasít le, majd a Golgi-apparátusban a 6 tagú proszekvencia is leválik. A teljes molekula 84 aminosavból épül fel, és a képződő hormon 80 %-a így kerül a keringésbe, míg 20 %-a a fősejtekben különböző fragmentumokra bomolva szekretálódik. A PTH klasszikus hatása a célsejtekre specifikus receptoron valósul meg, majd a szignált másodlagos jelátvivő rendszerek, egyrészt a cAMP- protein-kináz A (PKA), másrészt a foszfatidil-inozitol – protein kináz C (PKC) rendszer közvetíti a sejtbe. [9] A mellékpajzsmirigy parathormon termelésének ingere a szérum kalcium szint csökkenése. A mellékpajzsmirigy fősejtjeinek falában, de a vese, csont, bél, agy és a pajzsmirigy egyes sejtjeiben is ún. kalciumérzékelő receptor ( CaSR) található, amely a G proteinnel kapcsolt receptor családba tartozik. A parathormon a kalcium homeosztázist egyrészt közvetlen hatással a csontra és a vesére, másrészt indirekt módon a bélrendszere hatva szabályozza. [10] Csont-szempontból a PTH a csontreszopció fő aktivátora. Hatására nő az osteoclastok száma és aktivitása, így a csontokból kalcium és foszfát szabadul fel. PTH receptorok csak az osteoblastokon találhatók, a jel innen tevődik át az osteoclastokra illetve prekurzoraikra. PTH hatására az osteocyták csonttápláló sejtből csontbontókká, osteoclastokká alakulhatnak. A PTH receptora G fehérjéhez kapcsolt plazmamembrán receptor. Nyugalmi állapotban a receptorhoz kapcsolódó G-fehérje α-alegysége GDP-t köt meg. A PTH kötés hatására a receptor aktiválódik, és ennek következtében a Gfehérje konformációváltozása a GDP disszociációját eredményezi. A GDP helyére GTP kötődik, és az így aktivált G fehérje két részre α, és βγ-alegységekre disszociál. A jelátviteli folyamatban mind az α, mind a βγ alegységek egyaránt fontos szerepet játszanak, specifikus effektorokat aktiválnak, amelyek a hormonhatást közvetítik az intracelluláris tér felé. A keletkezett cAMP biológiai hatásait PKA aktiválásán keresztül fejti ki, és a célsejtben szigorúan meghatározott fehérjék foszforilációját eredményezi, amelyek a hatásos hormonválaszért felelősek. A PTH csont sejtjeire gyakorolt fiziológiás hatása összetett. A PTH csont rezorpciót fokozó hatásának végrehajtói az osteoclastok. A PTH közvetlenül csak a fiatal, még éretlen osteoclast sejteken hat, mert az érett osteoclastok elvesztik PTH receptorukat. A PTH segíti az osteoclastok

12

differenciálódását. A már érett osteoclastok aktiválódása az osteoblastok által érvényesül, hiszen ekkor már csak az osteoblastnak vannak PTH receptorai. Az osteoblastokban a PTH a receptorára kötődve az OPG szekréciót csökkenti, az aktiválódott RANK-OPG-RANK-L rendszeren keresztül a RANK-L túlsúlyba kerül, és kötődik a RANK-hoz, mely az osteoclast felszínén van jelen, és fokozódik az osteoclast differenciálódás, nő az osteoclastok aktivitása, és megindul a csont rezorpció. A BMU-k száma nő, gyorsul a remodeling, gyorsul a csont turnover. A csontépítés mértéke nem tud lépést tartani a csontbontással, így a csonttömeg megkisebbedik. A rezorpció során a csontokból kalcium szabadul fel. Újabb kutatások szerint közvetlenül az ostoblastokon és osteoclastokon is van CaSR, így a PTH hatásaként emelkedő szérumkalciumszint is befolyásolja ezen sejtek működését.[11] 1.1.2.b. Pajzsmirigyhormonok. A pajzsmirigyhormonok a csontszövet homeostasisa szempontjából alapvető fontosságúak. E hormonok nélkül nincs normális növekedés. A pajzsmirigyhormonok hatása a csontanyagcserére bifázikus. Fiziológiás koncentrációban serkentik, míg nagyobb koncentrációban gátolják azt. Hasonló hatás figyelhető meg az osteoblastok inzulinszerű növekedési faktor (IGF-I) termelésében, amely anyag nagymértékben hozzájárul a porc-és csontszövet növekedéséhez. A hormontöbblet azonban felgyorsult csontanyagcserével jár együtt, végeredményben fokozott csontvesztést és csökkent csontásványianyag-tartalmat okoz. A csontvesztés mind a trabekuláris, mind a kortikális csontokat érinti, és a hormontöbblet ez utóbbiakat károsítja először. Hatásukat főként az osteoblastokban található magreceptorokon keresztül fejtik ki, de bizonyos esetekben non-genomiális jelátviteli rendszert – membránreceptorokatis aktiválhatnak a csontban. Valószínűleg e rendszerben a magreceptorokon kívül ez a másodlagos jelvivő rendszer is hozzájárul a fokozott kálcium felszabaduláshoz, a megnövekedett osteoclast számhoz és aktivitáshoz pajzsmirigyhormon hatására. In vivo, a pajzsmirigyhormonok serkentik az osteoblastok aktivítását is. Pajzsmirigyhormon receptorokat (α 1 ;α 2 ;β 1 ) kimutattak osteoblastokon. A receptorok expressziója függ az osteoblast differentáció fokától, és így a hormonhatások erőssége is. Trijódtironin hatására osteoblastokban növekszik az alkalikus foszfatáz, osteocalcin, IGF-I szintézise, és megváltozik az insulinszerű növekedési faktor – kötő fehérjék (IGF-BP) kifejeződése.

13

Ugyanakkor osteoclastokon pajzsmirigyhormon receptorok nem mutathatók ki, azt sugalva, hogy a hormonhatásra bekövetkező fokozott osteoclast, és következményes rezorpciós aktivitás másodlagos, és az osteoblast aktiválódást követi. Annak ellenére, hogy fokozott a mineralizáció és az osteoblast aktivitás, a felgyorsult csontépítés mégsem képes kompenzálni a hormontöbblet indukálta rezorpció fokozódást, melynek eredményeképp jön létre a progresszív demineralizáció és csonttömeg-csökkenés, végül is osteoporosis. Hisztológiai vizsgálatok támasztják alá, hogy pajzsmirigyhormonok hatására növekszik a remodeling aktivációs frekvenciája, csökken a mineralizáció ideje, mely hatások végül is a rezorpció fokozódásához vezetnek. A felgyorsult csontanyagcserét az osteoclastok és a reszorpciós helyek számának, illetve a reszorpciós és formációs felszín arányának a növekedése jellemzi. E hatások létrejöttében több a pajzsmirigyhormonok hatására az osteoblastban fokozottan szekretálódó citokinek, IL-6, IL-1, TNFα is részt vesznek. Az IL-6 serkenti az osteoclastok érését, ezáltal fokozódik a csontrezorpció. Annak ellenére, hogy hyperthyreosisban fokozott IL-6 termelést észleltek, a pajzsmirigyhormonok közvetlenül nem befolyásolják az osteoblastok IL-6 képzését. [2,12] 1.1.2.c. Szexhormonok. A szexhormonok (androgének, ösztrogének, progeszteron) alapvető szerepet játszanak a csontrendszer normális, nemfüggő kialakulásában, a csúcscsonttömeg kifejlődésében és az epiphysisfugák záródásában. A női nemi hormonok: Az ösztrogének - nagyobb mértékben, mint az androgének - gátolják a csontreszorpciót, növelik a csontképzést. E hormonok növelik a calcitonin aktivitását, a parathormon aktivitását viszont csökkentik, ez is magyarázza csontvédő hatásukat.[13] Az ösztrogének receptoraikon keresztül fejtik ki hatásaikat. A kér receptor, ösztrogén recepror alfa és béta ( ERα és ERβ), megtalálható az osteoblastokon, osteoclastokon és az osteocytákon is. Emellet számos gén tartalmaz un. ösztrogén- responsive elementet (ERE), melyen keresztül transzkripciójukat befolyásolja, működésüket serkenti, vagy gátolja. Így csökkenti pl. a rezorptiv hatású IL-6, IL-1, TNF- termelést, és fokozza a TGF, IGF-I és az I. típusú kollagén expressziót. E hatások eredményeképp e hormonok csontprotektív hatással bírnak.[14] A csontritkulás 60-70%-ban a postmenopausaban lévő nőkben alakul ki. A primer postmenopausas formában elsődlegesen a csontbontást

14

serkentő citokinek felszaporodása figyelhető meg. Ma már közismert, hogy a gyulladásos citokinek a postemenopausalis csontvesztés pathogenesisében nagyon fontos szerepet játszanak. A keringő macrophagok megnövekedett IL-1 termelését és a plazma megnövekedett IL-1 koncentrációját írták le ösztrogén hiányos nőkben. Az IL-1 receptor

antagonista

fehérje

képes

lassítani

a

csontvesztést

ovariectomizált

patkányokban. A csont és a csontvelő sejtjeinek IL-6 termelése ösztrogén adagolásával gátolható. Azok az egerek, amelyeknek az IL-6 génjét hatástalanították, ovariectomia után nem veszítenek csontot. A prostaglandin E 2 a csont képzésének és lebontásának hatásos serkentője és termelődését az ösztrogén hiánya is serkenti. Az IGF-I és -II valamint kötőfehérjéik keringő mennyisége és termelődése egyaránt csökken ösztrogén hiányos állapotokban. [15,16,17 ] 1.1.3. Lokális faktorok. A csont remodeling szabályzásában helyi faktorok (2. táblázat) is résztvesznek, alapvetően növekedési faktorok és citokinek, míg a BMP a helyi faktorok szabályozói. A csontsejtek ezen kívül prosztaglandinokat és nitrogénoxidot-t termelnek, és e faktorokkal befolyásolják saját működésüket. Az osteoblastok érésére, mőködésérek a következő faktorok hatnak: IGF-1, TNF-α, TGF-β, IL-1, IL-6, IL-11, az osteoclastokra pedig IL-6, IL-1, IL-11, G-CSF, TNF-α, IL-17 faktorok, valamint az osteoblast, mely sejt-sejt kontaktus kialakítása után fokozza az osteoclast érését. Ennek a sejt-sejt kontaktusnak a megvalósulását az osteoblast membránfehérje biztosítja, a RANK-L, mely az osteoclast felszíni receptorára, a RANK kötődik, és serkenti az osteoclast érését. Ugyanakkor az osteoblast termel egy osteoclastogenesist gátló fehérjét is, az OPG-t, mely egy solubilis RANK-receptor, és a RANK-L –hoz kötődve megakadályozza a RANK-L kapcsolódását a RANK-hoz, azaz gátolja az osteoclast fejlődését, érési folyamatát. A RANKL/OPG rendszer mellett az építő és lebontó folyamatok közötti összehangolt működést a részt vevő sejteknek a szabályozóhormonok és -citokinek iránti, időben változó érzékenysége is biztosítja. A differenciálódást mindkét sejtvonal esetében ugyanazok a citokinek és hormonok idézik elő, az érett osteoclastok azonban elveszítik érzékenységüket a serkentőhormonok iránt, így működésüket csak az osteoblastok aktiválódásán keresztül fejthetik ki. [18]

15

Fokozó hatások

Gátló hatások

IL-1

TGFβ

IL-6

OPG

TNFα

IFNγ

IL-11

IL-4

leptin

IL-10

FGF

IL-13

Prosztaglandinok

IL-18

SCF

IGF

RANK-L

BMP

GM-CSF

PDGF

2.táblázat. A remodeling lokális faktorai. 1.1.3.1. Citokinek. Lymphocyták és monocyták által szekretált polipeptidek, amelyek számos sejtműködést befolyásolnak, úgy mint immunválasz, hematopoesis, és mind autokrin, mind parakrin szabályozásban vesznek részt. A csontanyagcserében döntően a citokinek irányítják a csont sejtes elemeinek érését, működését. A lokális citokin környezetért nagyrészt a csontvelő különböző sejtvonalaihoz tartozó prekurzor sejtek, mononukleáris sejtek, és maguk az osteoblastok, sőt újabb kutatások szerint az osteocyták is felelősek. [17] 1.1.3.2. Interleukinok. A csontrendszer szempontjából legfontosabb interleukinok az IL-1.-4,-6,-11, és 17. Fontos szerepet játszanak a csontremodelingben, azonban többnyire a csonrezorpciót serkentik. IL-1 : A remodelinben legkomplexebb hatása az IL-1-nek van. Két fő formáját ismerjük, IL-1α és IL-1β, melyek részleges aminosavhomológiát és hasonló biológiai hatást mutatnak. Fiziológiás koncentrációban a csontrezorpciót, a csontsejt replikációt és kis mennyiségben a kollagén szintézist serkenti. Ezzel ellentétben nagy koncentrációban

16

és az érett osteoblastokon ellentétes hatásúvá válik, gátolja fehérjeszintézisüket (az előalakok esetében azonban nem). Minthogy, mind a rezorpció, mind a formáció folyamatainak szabályozásában részt vesz, így feltételezhető, hogy a két folyamat összehangolásában is van szerepe. [18] IL-6 : Hasonlóan fontos a stromasejtek, mononucleáris sejtek és osteoblastok termelte IL-6 is a csontanyagcsere szempontjából. Fő hatása a rezorpció serkentése, kiváltképp ösztrogénhiány esetén. Hatására több osteoclast irányul a remodeling helyére és serkenti a preosteoclastok differenciálódását, azonban az érett osteoclastokra nem hat. Az is ismert, hogy hatását az IL-1, főleg pajzsmirigyhormonok jelenlétében, jelentősen fokozza. Az IL-1-receptor-antagonista protein (IRAP) fő biológiai funkciója az IL-1 receptorhoz kötődés útján az IL-1 (és más citokin, pl. TNF) hatás gátlása. [19] TNF-α: Az egyik legváltozatosabb hatásokat közvetítő citokin. Csonthatásai meglehetősen hasonlóak az IL-1-hez. Stimulálja a csontlebontást, a csontsejtek differenciálódását, replikációját, és a differenciálódott sejtek kollagén szintézisét is fokozza. [20] 1.1.3.3. Növekedési faktorok. A csontsejtek, vagy csonton kívüli sejtek termelik és olyan alapvető sejtfunkciókat szabályoznak, mint a növekedés, differenciáció és proliferáció. IGF-I és II : Az inzulinhoz hasonló polypeptid, mely a májban és az osteoblastokban termelődik. A csontszövetben magas koncentrációban található, ahol az osteoblastok számát és működését fokozza, stimulálja kollagén szintézisüket. A keringésben IGFBP-hez kapcsolódik, melyek serkentő vagy gátló hatásuak lehetnek a csontban. Az IGF termelését számos hormon és helyi növekedési faktor szabályozza, úgy mint a GH, ösztrogén, progeszteron, melyek fokozzák, míg a glükokortikoidok gátolják termelését. Az osteoclast-osteoblast interakciót is szabályozzák, így aktívan részt vesznek a remodeling szabályozásában. Az IGF-II az embriogenesis folyamatában az egyik legfontosabb faktor, azonban a kifejlődött vázrendszerben szerepe még nem tisztázott. [21] OPG-RANK-RANKL

rendszer :

Az

osteoclastok

a

csontvelő

myeloid

precursoraiból keletkeznek az osteoclastogenesisnek nevezett bonyolult érési folyamat

17

során. Szignálmolekulák egész sora vesz részt e folyamat szabályzásában: PU-1 transcriptiós faktor, cbfa-1, c-fos, NF-kB, M-CSF. Ezek közé tartozik a RANK és ennek ligandja, a RANKL, amelyet osteoblastok, osteoblast-progenitor csontvelõi sejtek és lymphocyták termelnek, de solubilis formában is megtalálható. A RANKL az osteoclastogenesis egyik legerőteljesebb serkentője. Megismerésével érthetővé vált, hogy miként szabályozzák az osteoblastok a remodeling megindulását, aktiválva a csontbontó sejteket. A RANKL hibás génjét hordozó egerekben alig van mûködõképes osteoclast, ami az emberi osteopetrosisra emlékeztetõ következményekkel jár. Az egerekben az immunrendszer is károsodott, a T és B lymphocyták érése sérült. Ez – számításba véve azt is, hogy a RANKL-ot a T lymphocyták is termelik – először létesíthető kapcsolat az immunrendszer és a csontanyagcsere között. Egy ellentétes hatású molekula, amely a csontrezorptio erőteljes gátlója, az OPG. Ez egy solubilis fehérje, amelyet számos szövet termel, és a csontbontás fiziológiás regulátoraként tartjuk számon. Az OPG funkciónövelő génhibája osteopetrosist, funkcióvesztõ hibája pedig súlyos osteoporosist eredményezett egerekben. Legújabban az derült ki, hogy a RANKL nem csupán a RANK-nak, hanem egyúttal az OPG-nek is ligandja. A kép tehát teljesebb lett: az osteoclastogenesist szabályozó RANKL stimulátorként hat, amennyiben a csontbontó sejtek felszíni receptorához RANK kötődhet. E stimuláció azonban elmarad, ha a solubilis OPG van nagyobb mennyiségben jelen, mert ez megköti a RANKL-t, mielőtt az találkozhatna receptorával. [22,23] 1.2. A csontanyagcsere hormonális szabályozása. A csontrezorpció a remodeling első lépése, amelyben bár az osteoclastok játsszák a főszerepet, az irányító szerep mégis az osteoblastoké. Élettani körülmények között a szisztémás kalciumszintet szabályozó hormonok, a PTH, az 1,25-dihidroxi-D-vitamin és a

kalcitonin

a

lokális

szabályozó

mediátorokkal

együtt

vesznek

részt

a

kalciumanyagcsere és a csontrendszeri remodeling szabályozásában. (2. ábra) A PTH és a D-vitamin a legfontosabb hormonális serkentői a rezorpciós folyamatnak, receptoraik azonban csak az osteoblastok felszínén/magjában vannak, így e hormonok csak közvetve, az osteoblastok citokin-termelésének serkentésével IL-1, IL-6,IL-11, illetve a RANKL fokozott és az OPG csökkent expressziójával hatnak az osteoclastokra. A PTH

18

termelődését, hatását a calcitrop hormonokon kívül más hormonok is befolyásolják, közülük a jelentősebbek: a szexual szteroidok, a glükokortikoidok és növekedési hormonok. Az ösztrogen modulálja a PTH okozta IL-6, interleukin-6 szolubilis receptor (IL-6sR) növekedést a szérumban, így a csont rezorptiót csökkenti. Az utóbbi évek kutatásai kimutatták, hogy a PTH közvetlenül is hat a haemopoeticus blast sejtekre, amelyek a praecursorai az osteoclast sejteknek. A PTH-nak ezt az osteoclast érését serkentő hatását az ösztrogén szintén gátolja. Postmenopausában az évek előrehaladtával nő a szérum PTH szint, valamint a csont érzékenyebb lesz a PTH okozta rezorptiós hatásra. Az ösztrogén - bár receptorait a korai preosteoclastok magjában is kimutatták csontrezorpciót gátló hatását szintén az osteoblastokon keresztül fejti ki, mégpedig elsősorban az IL-6 és IL-6-receptor termelésének gátlásával, valamint az OPG- és TGFβ kiválasztás fokozásával. [24,25]

Csontbontás (2-4 hét) Csontépítés (6-8 hónap)

1. Helyi :RANKL,OPG, IGF-I 2. Szisztémás :PTH,E2,idegi, Leptin

2. ábra. A fiziológiás csont remodeling és szabályzása.

1.3. A csontanyagcsere kóros folyamatai, a csontvesztés kialakulásának okai.

19

Az osteoblastok és osteoclastok aktivitásának szoros koordinációja mellett zajló csontremodeling összességében a szabályzó faktorok kölcsönhatásainak eredménye. Csontritkulás esetén a rezorpciós és az ezt követő csontépítő szakasz közötti egyensúly felborul, és ez vezet az osteoporosisra jellemző csontvesztéshez és mikrostruktúra elvesztéséhez. A csontritkulás a leggyakoribb csontbetegség. Az epidemiológiai vizsgálatok alapján a nők felénél, a férfiak egyötödénél 50 éves kor felett csonttörés következik be. Nőknél a menopausa időszakában az ösztrogénszint csökkenése a csontvesztéshez vezető fő ok. Férfiaknál is csökken a nemi hormonok biológiai hozzáférhetősége. Mindkét nemnél azonban számos egyéb tényező is szerepet játszik az osteoporosis kialakulásában; genetikai és környezeti tényezők. A kalcium anyagcserét szabályozó hormonok, a D- hormon rendszer, a GH és az IGF szerepét is bizonyították a csökkent csonttömeg kialakulásában. A pajzsmirigyhormonok és a parathormon fiziológiásnál nagyobb koncentrációja növeli a csontok rezorpcióját és súlyosbítja a csontvesztést. [25,26,27] A csontanyagcserét, a fiziológiás remodelinget szabályozó tényezők jószerivel ismertek, ezek a szisztémásan ható hormonok, és a helyi szinten ható növekedési faktorok és citokinek, melyek működését számos gén, géncsoport szabályoz. Azonban e résztvevők hatásainak pontos mechanizmusát és egymásra hatását nem ismerjük kellő mélységében. Ezért célkitűzésünk volt a szisztémásan ható hormonok közül a parathormon, az ösztrogén, a pajzsmirigyhormonok, az ezek által szabályozott citokinek és növekedési faktorok kálcium- és csont- anyagcserében játszott szerepének és a hatás mechanizmusának vizsgálata.

2. CÉLKITŰZÉSEK

20

Az

utóbbi

évtizedekben

örvendetesen

növekedett

ismeretanyagunk

a

csontanyagcsere fiziológiáját és patofiziológiáját illetően. Mégis távol vagyunk attól, hogy igazán értsük azokat a folyamatokat, amelyek normális és kóros viszonyok között a csontszövet működését, illetve anyagcsere csontbetegségek kialakulását meghatározzák. A csontanyagcsere vizsgálatát az elmúlt évtized korszerű elveinek megfelelően, genetikai, sejtbiológiai és klinikai szinten közelítettem meg. Igyekeztem az egyik szinten nyert információkat egy másik megközelítésben is próbára tenni, végül klinikailag is használható adatokat nyerni. Így próbáltam az alapkutatási eredményeket a gyakorlathoz közelíteni.

I. A PTH csonthatásainak a hatásmechanizmusának vizsgálata. A. A PTH, TNF-α és az IL-1 hatását kívántuk tesztelni IL-6 promoterrel transzfektált osteoblastokon, PKC gátlók jelenlétében. B. Továbbá vizsgáltuk, hogy a PKC milyen izoenzimei vesznek részt a PTH, TNF-α és az IL-1β IL-6 szekréciót fokozó hatásában, szelektív PKC-béta antagonista (LY379196) felhasználásával osteoblastokban. C. Megkívántuk vizsgálni, hogy a Rho fehérjék hogyan modulálják a PKC transzlokációt és a PTH stimulálta IL-6 promoter aktivítást UMR-106 osteoblastokban. Előzmények: A szisztémás kalciumszintet szabályzó parathormon a kalciumanyagcsere és a csontrendszer homeosztázisának fenntartásában szignifikáns szerepet játszik. A naponta alkalmazott humán rekombináns PTH analóg PTH(1-34) oligopeptid injekció növeli a csontképzést és a csonttömeget. Ugyanakkor a PTH a korral járó csontvesztés fő mediátora is, és PTH túltermeléssel járó állapotokban a fokozott csontvesztés oka. A PTH szabályozta csontrezorpció sejtszintű szabályzása nem teljesen ismert. Annak ellenére, hogy a PTH a legfontosabb hormonális serkentője a rezorpciós folyamatnak,

21

csak közvetve, hat az osteoclastokra. Számos adat szól az IL-6 szerepe mellett a PTH stimulálta osteoclastogenesisben. A PTH fokozza mind az IL-6 messenger RNS (mRNS) expressziót mind számos osteoblast sejtvonal IL-6 szekrécióját. Az IL-6 expresszió minden nagy szignáltranszdukciós útvonal mediálja, különböző protein kinázok, és másodlagos hírvivő utak, köztük az intracelluláris kalcium, PKC, kettős-láncú RNSfüggő kináz és cAMP a legfontosabbak. A PTH a cAMP és PKC másodlagos jelátviteli rendszereken keresztül szabályozza az IL-6 szekréciót. [28,29] Mivel a rezorpciós folyamotokban a PKC jelzőrendszer szerepe elsődleges, így munkánkban főleg a PKC jelzőrendszerrel és izoenzimeivel foglalkoztunk (3. ábra) PKC izoenzimek Konvencionális , I, II, 

Regulatory Domain

DAG/Phorbol Ester NH2

Catalytic Domain

Ca2+ Binding

ATP

C2

C3

C1

Szubsztrát C4

COOH

hinge

novel , , , 

atipusos , 

DAG/Phorbol Ester NH2

C2-like

C1

C1

NH2

ATP

Substrate

C3

C4

ATP

Substrate

C3

C4

COOH

COOH

3. ábra. A PKC izoenzimei. Munkacsoportunk korábbi adatai szerint a nem szelektív PKC inhibítor forbolészter vagy calphostin C - előkezelés kivédte az osteoblastok PTH és TNF-α stimulálta IL-6 termelését, míg IL-I tekintetében az adatok ellentmondásosak voltak. [30] Kimutattuk, hogy PTH kezelés hatására a PKC izoenzimek transzlokálódnak az osteoblastban, azonban az ehhez vezető szignálút ismeretlen volt. [31] aktivációban Diacylglycerol generációja

A PKC

phospholipase D-ből, az egyik ismert

szignálút. A PTH szabályozta PLD aktivitás a kis G-fehérjék Rho családján keresztül történik. [32] II. A kalcium homeosztázisra ható genetikai faktorok polimorfizmusainak vizsgálata postmenopausális egészséges és osteoporotikus nőkben.

22

A. Elemezni kívántuk a leggyakoribb A986S CaSR-t érintő polimorfizmus szerepét a csontanyagcserében osteoporotikus nők vizsgálatával. B. Vizsgálni kívántuk az IL-1 csontreszorpciót stimuláló és a szintén csontbontó IL-6 termelődést serkentő hatását gátló IL-1ra gén polimorfizmusát, illetve ennek összefüggését a csontok ásványianyag tartamával. C. Vizsgálni kívántuk a VDR gén BsmI polimorfizmus megoszlását a hazai populációban, valamint a VDR genotípusok és a csontok ásványianyag tartalmának összefüggését. D. Vizsgálni kívántuk az ER gén PvuII és XbaI polimorfizmusának megoszlását a hazai populációban és ezek hatását a csontok ásványianyag tartamának alakulására.

Előzmények. Ismert, hogy mind a kálcium egyensúly, mind a PTH elválasztás alapvető a csontanyagcserében. A mellékpajzsmirigy CaSR szabályozza a kalcium homeosztázist, érzékelve az extracelluláris

kálcium koncentráció csökkenését, fokozza a PTH

szekrécióját Az is ismert, hogy a csúcscsonttömeg kialakulásában nagyrészt genetikai tényezők

játszanak

szerepet.

A

genetikai

kontroll

hasonló

arányát

találták

postmenopausális csontvesztésben is. de a vizsgálatok általában nem tudtak szignifikáns kapcsolatot

kimutatni.

Munkánkban

csontrezorpcióban résztvevő gének

a

kálciumanyagcserében,

illetve

a

polimorfizmusait kívántuk vizsgálni magyar

populáción, melyekről biológia szerepük, illetve előzetes adatok alapján felmerül részvétele a csontritkulás kialakulásában.

III. Az ösztrogén csonthatásainak a hatásmechanizmusa.

23

A. Az ösztrogén és ösztrogén receptorok szerepe a PTH indukálta IL-6 expresszió modulálásában.. B. Az

ösztrogén

hatását

vizsgáltuk

a

génexpresszióra

egér

model

felhasználásával, olyan géneket keresve, melyek részt vesznek az ösztrogén pozitív csonthatásaiban microarray technika segítségével. . C. A további munkánk célja az ösztrogén hiányában szignifikánsan változó csontszöveti expressziót mutató gének meghatározása, illetve a vizsgált gének közötti kapcsolatok definiálása volt humán csontszövetben. Előzmények. Az ösztrogének a legfontosabb sexhormonok a csontanyagcsere egyensúlyának fenn tartásában.- nagyobb mértékben, mint az androgének - gátolják a csontrezorpciót, növelik a csontképzést. E hormonok a parathormon aktivitását

csökkentik, ez is

magyarázza csontvédő hatásukat. Az ösztrogének receptoraikon keresztül fejtik ki hatásaikat. A két receptor, megtalálható az osteoblastokon, osteoclastokon és az osteocytákon is.[33]

Emellet számos gén tartalmaz ERE-t, melyen keresztül

transzkripciójukat befolyásolja, működésüket serkenti, vagy gátolja. Így csökkenti pl. a rezorptív hatású IL-6, IL-1, TNF-α termelést, és fokozza a TGF, IGF-I és az I. típusú kollagén expressziót. E hatások eredményeképp e hormonok csontprotektív hatással bírnak. Ismert, hogy az ösztogénhatásokat a csontban elsődlegesen az ERα közvetíti, azonban az ERβ szerepével keveset tudunk. Vizsgálatainkban ezért e receptor szerepére fókuszáltunk. A csontritkulás 60-70%-ban a postmenopausaban lévő nőkben alakul ki. Ma már közismert, hogy a gyulladásos citokinek a postemenopausalis csontvesztés pathogenesisében nagyon fontos szerepet játszanak. [34] Ugyanakkor, az ERα gén polimorfizmusa és a csontok ásványianyagtartamának alakulása között nem tudtunk kimutatni

öszefüggést.

Mivel

az

ösztrogén

hatásmechanizmusának

génszintű

szabályzása nem minden részletében feltárt. Az ösztrogén központi szerepet játszik a vázrendszer növekedésében, differenciálódásában és anyagcseréjében. A menopauzát

24

követő ösztrogénhiányos állapotban gyorsul a remodeling, fokozódik a csontvesztés. Egér modell felhasználásával génexpressziós különbséget, illetve a csontanyagcserében fontos szerepet játszó gének ösztrogén általi szabályzását mutattuk ki. Mivel az állat modellben talált eredmények nem minden esetben korrelálnak a humán vizsgálatok eredményeivel, illetve az ott talált összefüggések nem inden esetben magyarázzák a human élettani folyamatokat, ezért ilyen irányba kívántuk vizsgálatainkat kiterjeszteni.

IV.

A pajzsmirigyhormonok csonthatásainak a hatásmechanizmusa.

A. Vizsgálni kívántuk a trijodtironin, a PTH és az ösztrogén IGF-I- és az IL-6 gén promoterre gyakorolt hatását. B. Vizsgálni kívántuk hyperthyreosisos betegek szérumában az IGF-I és IGFBP-3, -4, és -5 koncentrációkat, ezek összefüggését a csontok ásványianyag tartalmával, valamint ezek változását terápia során. C. Vizsgálni kívántuk a szérum és mononucleáris sejtkúltúrák felülúszójának TNF-α

tartalmát

csontvesztést

okozó

hyperthyreosisban,

valamint

ennek

összefüggését a csontdenzitással. Előzmények: A pajzsmirigyhormonok nélkülözhetetlenek a csontok normális éréséhez, növekedéséhez. A pajzsmirigyhormonoknak két ellentétes hatása van a csontra. Egyrészt, az IGF-I termelés serkentése révén, serkenti az osteoblastok csontmatrix képzését és annak mineralizációját, másrészt növeli az osteoclastok számát és aktivitásukat. E hatása az IL-1 stimulálta IL-6 és a TNF-α termelés fokozásával valósul meg. Ismert, hogy a pajzsmirigyhormonok befolyásolják mind az ösztrogén, mind a PTH hatásait. Munkacsoportunk korábbi vizsgálataiban kimutatta, hogy az IGF-I és az IL-6 fontos szerepet játszik a hyperthyreosist kísérő csontvesztés szabályozásában.

3. MÓDSZEREK 3.1.Sejtbiológiai módszerek

25

3.1.1. Humán mononucleáris sejtkultúra. A mononucleáris sejteket Ficoll/Hypaque gradiens centrifugálással szeparáltuk teljes vérből. Ezt követően a sejteket RPMI médiumban szuszpendáltuk 106 sejt/ml koncentrációban, majd 24 lyukú tenyésztőedénybe tettük 2 órára 37°C-on 5% CO 2 /95% levegőt tartalmazó atmoszférában. A kitapadt sejteket 48 órán át inkubáltuk 1 ml DME médiumban, amely 5% hőinaktivált FCS-t tartalmazott ± 1 ug fitohemagglutininnal kiegészítve. A sejtkultúra felülúszóit -20°C-on tároltuk a további vizsgálatokig. 3.1.2. Csontsejtkultúra. 3.1.2.a. Osteoblast jellegű UMR-106 patkány osteosarcoma sejtvonalat használtunk a kísérleteinkhez. A sejteket 5% FBS-t tartalmazó DME oldatban, 75-cm2 – es tenyésztő edényben, 37°C-on, 98% páratartalmú, 5% CO 2 –t 95% levegőt tartalmazó inkubátorban tenyésztettük. A sejteket minden 5-7 napokon átültettük, a médiumot 3 naponta cseréltük.. 3.1.2.b. Egyéb sejtvonalak : MC3T3, ROS, MG123, L929. 3.1.2.c.Egér csontvelőtenyészet: 5-7 napos újszülött egerek lábszárcsonjait eltávolítottuk, majd fújásos technikával kimostok belőlük a csontvelőt, Tisztítás és centrifugálás után tenyésztőedényben MEM+15 hőinaktivált FCS tápoldatban, 10-8M D vitaminnal, 106sejt/lyuk mennyiségben 6,8 napig tenyésztettük. 3.1.3. Bioaktív TNFα koncentráció mérése. A bioaktív TNFα mennyiségének mérésére L929 (ATCC) egér fibrosarcoma sejtvonalát használtunk citotoxikus assay-ben. Standardként humán rekombináns TNFα (Sigma, St. Luis, MS, USA) szerepelt 0,625-1,562 pg/ml közötti koncentrációkban. A TNFα bioaktivitást egységekben fejeztük ki, ahol

egy egységnek felelt meg az a

bioaktivítás, ahol a standard TNFα 50%-os citotoxicitást okozott (25 pg/ml standard TNFα /tenyésztőedény). A mintákban a TNFα jelenlétének igazolására monoklonális neutralizáló anti- TNFα egér antitestet (1 egység/tenyésztőedény, Boehringer Mannheim,

Mannheim,

Németország)

használtunk.

A

mononukleáris

sejtek

felülúszójának bioaktivitását 24 órás 1 ug/mL-es végkoncentrációjú fitohemagglutinin (Sigma) stimulus után is mértük. Egy mintát négy párhuzamos tenyészetben határoztunk meg. A detektálhatóság alsó határa 1 pg alatt volt. 3.2. Humán és állatkisérletek. 3.2.1. A vizsgálatainkban résztvevő betegek

26

Vizsgálatainkhoz Klinikánk Endokrinológiai szakrendelésén megjelent betegek közül véletlenszerűen, 40-90 év közötti, rokonságban nem álló, postmenopausas magyar nőket vontunk be, előzetes felvilágosítás és az Etikai Bizottság által jóváhagyott beleegyező nyilatkozat aláíratását követően. Postmenopausasnak tekintettük azokat, akik esetén a menses több,

mint 12 hónapja nem jelentkezett. Azok az egyének, akik

kórtörténetében olyan betegség vagy gyógyszer szerepelt, amely befolyásolja a csontanyagcserét valamint azok, akiknél 40 éves kor előtt jelentkezett a menopausa, nem kerültek be vizsgálatainkba.

A dohányzási, alkohol, koffein és Ca fogyasztási

szokásokban nem volt különbség az egyes csoportok között. A betegekkel minden esetben beleegyező nyilatkozatot írattunk alá. 3.2.2. Humán csontszövetminták A génexpressziós vizsgálatokat post-, illetve premenopausás korban lévő, nem osteoporoticus, független mintaválasztásból származó magyar nők csontmintáin végeztük. A vizsgálatba bevont postmenopausas korú nők nem részesültek semmilyenfajta hormonpótló terápiában. A postmenopausás nem osteoporoticus csoportban (POST -NO P csoport) 10 csontszövetmintát értékeltünk, míg a kontroll premenopausás csoport (PRE -NO P csoport) 7 nő csontmintájából állt. A postmenopausás állapot definiálása a jelenleg érvényes WHO-kritériumok szerint történt: legalább 1 éve elmaradt menstruáció, illetve a szérum ösztradiol koncentrációja kisebb, mint 30 pg/ml. Csontsűrűségmérés a combfejen és a lumbális csigolyákon (L2L4) DEXA segítségével történt, néhány nappal az operációt megelőzően. A csontminták a diagnosztizált II . stádiumú primer osteoarthritist gyógyító műtétet szolgáló csípőizületi teljes endoprotézis beépítésekor leforgácsolódott csontszövetdarabok összegyűjtéséből származtak. A primer osteoarthritis minősítése az Amerikai Ortopédsebészeti Társaság (AAOS ) ajánlásával a Kellgren–Lawrence-féle rendszer alapján történt. A betegség a combfejben a mintavételi helyként is szolgáló spongiosus csontállományt nem érintette. A gyűjtést követően a mintákat alaposan megtisztítottuk a csontvelőtől, illetve vérszennyeződésektől PBS felhasználásával, majd folyékony nitrogénben tároltuk. A vizsgálatot a Semmelweis Egyetem Tudományos és Kutatásetikai Bizottsága jóváhagyta (SOTE -TU KEB 6392-1/2004-1018EKU). Minden betegtől – részletes felvilágosítás után – írásos beleegyező nyilatkozatot kértünk. 3.2.3. Egér csontszövet.

27

18 darab 5 hetes CD-1 nőegeret 3 csoportra osztottunk. 2 csoportot ovarectomizáltunk (OVX), míg a harmadik csoport áloperációban részesült és normál kontrolként (CTR) szolgált. A műtét után az OVX egerek egy csoportját 250 ul, 30ug/ttkg szezám olajban oldott 17-estradiol-3-benzoate-val injektáltuk subcutan háromszor egy héten. A CTR egereket ugyanilyen mennyiségű hatóanyag nélküli oldattal injektáltuk. A plazma ösztradiol szinteket az injektálás után számos időpontban megmértük, és azok közel voltak a CTR egerek plazmaszintjeihez. 2 hét után az állatokat leöltük, és végtagcsontjaikat (femur és tibia) preparáltuk. Az eltávolítás után a csontokat azonnal folyékony nitrogénba helyeztük. 3.3. Molekuláris biológiai módszerek 3.3.1. Plasmid konstrukciók és receptorok. 3.3.1.a. A human IL-6 promoter konstruktot Dr. Bernd Stein (Signal Pharmaceuticals, San Diego, CA, USA) ajándékozta. A konstrukt a következő bázispárokból állt (bp): 2779/111, 2224/111, 2158/111, 2109/111, and 249/ 111 promoter régiója az Il-6 génnek. A vektor módosított thymidine kinase-chloramphenicol acetyltransferase (TK-CAT) volt, melyben a TK-t IL-6 promoterrel helyettesíteték. Vizsgálatainkban a promoter konstukció luciferase reporterrel volt összekötve. A Luc gén GL2-Basic-ból származott. Az XhoI/HpaI Luc fragmentum a GL2-Basic-ból volt klónozva az XhoI/HpaI-emésztett IL-6- CAT génbe. 3.3.1.b. Az ERE 2tk109 luc riporter konstrukció 2 vitellogenin ERE bazális thymidin kináz promoteréből és luciferáz génből állt. 3.3.1.c. A humán ERα receptor cDNS (HEGO) konstrukciót pcDNS 3.1(-)-be klónoztuk EcoRI helyet használva. A humán ER receptort normál humán here cDNS könyvtár felhasználásával publikált patkány ER szekvencia és degenerált primerekkel klónoztuk. A cDNS klónt szekvenáltuk és az Enmark és mtsai. által publikált ER szekvenciával egyeztettük. A cDNS konstrukciót pcDNS3.1(-)-be klónoztuk az AvrII és NotI helyeket használva. A patkány Erα receptoe cDNS konstrukciót pcDNS3.1(-)-be klónoztuk az EcoRI helyet használva. A patkány ER

receptor cDNS plazmidot

patkány prosztata cDNS könyvtár felhasználásával a publikált szekvencia alapján klónoztuk, és pvDNS3.1(-)-be klónoztuk az ApaI és NotI helyeket használva.

28

3.3.1.d. Human IGF-I-promoter-luciferase konstrukció: a humán IgF-I promoter régiók:-4770, -1208. -1033, -834, -506, .450, -184, és -126 és a patkány IGF-I promóter -450 bázispár régiója ( T. Owen, Pfizer Central Research, Groton, CT, USA ajándéka) 3.3.1.e TRE-Luc promoter: humán thyroid response element luciferase-hoz kapcsolva 3.3.2. Tranziens transzfekció, luciferase assay 3.3.2.a. A UMR-106 sejteket 24 lyukú tenyésztőedényekbe tettük 75,000 sejt/lyuk mennyiségben 5% hőinaktivált FBS-t tartalmazó DME oldatban. A sejtek egy éjszakás inkubációt követően 50–70% konfluenciát értek el. Ezek után transzfektáltuk őket 3 órás inkubációval DNA, 400 ng/lyuk DNS-el, és 2 ml Plus Reagenssel melyet 15 perces inkubáció követett 1 ml Lipofectamine-val. A 3 óra végén a sejtekhez 1 ml 5% hőinaktivált FBS-t tartalmazó Opti-ME médiumot adtunk. Az ösztrogén kisérletekben ösztrogén-mentes körülmények között, 5% háromszorosan szénen szűrt, hőinaktivált FBS-t tartalmazó phenol-red mentes DME médiumot használtunk. A kezeléseket (stimulátorok és inhibítorok) általában az utolsó 5 órában adtuk az assay-hez, néhány kivételtől eltekintve. A luciferase assay a 24 óra végén történt. Az assay-hez a sejteket aspiráltuk, majd extrakciós puffert (25 mM glycylglycine, pH 7.8, 15 mM MgSO4, 4 mM ethylene glycol-bis(b-amino ethyl ether)- N,N,N9,N9-tetracetic sav [EGTA], 1% vol/vol Triton X-100, and 2 mM dithiothreitol [DTT]) adtunk. 15 perc múlva hozzáadtuk az assay mixet (25 mM glycylglycine, pH 7.8, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 2 mM DTT, 15 mM K2HPO4, pH 7.8, and 20 mM adenosine triphosphate [ATP]). A felülúszókat csövekbe transzferáltuk és a luminescenciát

luciferin koktél (25 mM

glycylglycine buffer, pH 7.8, 0.2 mM luciferin, and 10 mM DTT) hozzáadása után határoztuk meg. Luciferase activitást Monolight 2010 luminometer segítségével mértünk luciferin-ATP oldat hozzáadása után. 3.3.2.b. UMR-106 sejteket 22-mm2 üveg fedőlemezekre helyeztük 75,000 sejt/ fedőlemez. Egy éjszakás inkubációt követően a sejteket üres (pcDNA3), konstitutívan aktív

RhoA (RhoA63L), vagy dominans negativ RhoA (RhoA19N) vektorral

transzfektáltuk. A transzfekciót Lipofectamine Plus felhasználásával végeztük. Minden transzfekcióhoz 1 ug DNS -t, 2 ul Plus Reagenst és 97 ul OPTI-MEM-t használtunk, melyet 15 perces inkubáció követett 1 ul Lipofectamine-t tartalmazó 99 ul OPTI-MEMben. Transzfektált sejtek életképességét MTT assay-vel határoztuk meg. 24 órával

29

később a transzfektált sejteket kezeltük, fixáltuk, permeabilizáltuk, és PKC izoenzimekkel festettük. 3.3.3. PKC assay UMR-106 sejteket 100-mm petri csészékbe tettük 5% hőinaktivált FBS-t tartalmazó DME oldatban. Egy éjszakás inkubáció után a sejtek

80–90%-os

konfluenciát értek el. A kezeléseket az assay utolsó 5 órájában adtuk a rendszerhez. A kezelés után a médiumot eltávolítottuk, majd a csészéket kétszer átmostuk PBS-el szoba hőmérsékleten.

Ezután

a

sejteket

radioimmunoprecipitation

assay

(RIPA)

felhasználásával pufferrel (13 PBS, 1% NP-40. 0.5% sodium deoxycholate, and 0.1% sodium dodecyl sulfate [SDS]) mely tartalmazott 10 mg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 30 mg/ml aprotinin, aés 100 mM sodium orthovanodate lizáltuk. A sejtlizátum fehérjetartalmát Lowry metodikája szerint határoztuk meg. PKC szintet nonradioactiv PepTag assay kit felhasználásával mértük. Quantitatív meghatározásra Molecular Dynamics STORM 860 imager-t használtuk. 3.3.4. Subcellularis frakcionálás UMR-106 sejteket 1:10 arányban 100 darab 20 mm2-szövettenyésztó csészékbe tettük, majd 48 órán át subconfluens állapotig növesztettük. A sejteket PTH(1-34)-val vagy PTH(3-34)-val kezeltük.A sejteket egyszer 5 ml HBSS-el és 500 ul homogenizáló pufferrel (12.5 mM Tris HCl, 2.5 mM EGTA, 1 mM EDTA, 100 mM NaF, 5 mM DTT, pH 7.4) mostuk, melyhez

0.05% digitonint és and proteaz gátlót (0.26 mg/ml

phenylmethylsulfonyl fluoride [PMSF], 0.15– 0.3 TIU/ml aprotinint, 5 mM sodium orthovanadatet, és 0.1 mg/ml leupeptint) adtunk. A sejteket felkapartuk és a homogenizátumot 21-es tűn keresztül préseltük. A homogenizátumot 14,000 rpm-en (18,000g), 4°C-on 15 percig centrifugáltuk, majd a cytoszol frakciót összegyűjtöttük. A frakciót

500 ul homogenizáló pufferban, mely 0.1%Triton X-100-at tartalmazott

oldottuk és 14,000 rpm-en (18,000g), 4°C-on 15 percig centrifugáltuk. A felülúszót összegyűjtöttük, majd a meghatározott membránfrakcióhoz adtuk. A minta puffer (17% glycerol, 8.7 [vol/vol] u-mercaptoethanol, 5% SDS, 0.2 M Tris-HCl [pH 6.7], és 0.1 mg/ml bromphenol kék) hozzáadása után 5 percig főztük. A sejtlizátum fehérjetartalmát Lowry metodikája szerint határoztuk meg. 3.3.5. Western blott

30

A membrán frakciókat, vagy a teljes sejtlizátumot helyeztük

(50 ug) SDS-PAGE-re

12.5% acrylamid gélre. Electroforesis után a fehérjéket

membránra helyeztük. A fehérjemennyiséget és a transzfert

nitrocellulóz

Ponceau S festéssel

ellenőriztük. A membránokat gátló pufferba ( 2% BSA és 2% tej Tris pufferolt sóoldat és 0.05% Tween ) helyeztük 1 órára. Az elsődleges antitesteket a blokkoló oldatban oldottuk, majd éjszakára a membránokhoz adtuk. Anti-RhoA-t1:1000 higításban használtuk. 2 mosás után a membránokat másodlagos nyúl- vagy egérellenes IgG-HRPvel inkubáltuk 1:2000 higításban 30 percig. Az immunkomplexeket felerősített chemiluminescenciával vizualizáltuk. 3.3.6. Rhotekin assay UMR-106 sejteket 100-mm petri csészékbe tettük 5% hőinaktivált FBS-t tartalmazó DME oldatban. Egy éjszakás szérummentes inkubáció után a sejtek 80–90%os konfluenciát értek el. A sejteket vivőanyaggal, 10 nM PTH(1-34)-al, vagy 10 nM PTH(3-34)-al 3.5 percig 37°C-on kezeltük majd pufferrel (50 mM Tris HCl, pH 7.4, 10% glycerol, 0.1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10 mg/ml aprotinin, és 10 mg/ml leupeptin) lizáltuk. A sejteket felkapartuk és mikrocentifuga csövekbe helyeztük és centrifugálással tisztítottunk. A lizátumot sepharos-kötött GST-Rhotekin Rho kötő domén ágyba helyeztük 45 percre 4°C-on. A lizátumot centrifugáltuk és az ágyakat 4x lizáló pufferrel mostuk. A fehérjéket Laemmli puffer hozzáadásával tisztítottuk és 5 percig főztük.

A lizátumot

SDS-PAGE-re

helyeztük 12.5% acrylamid gélen, ahol GTP-kötött RhoA-val csaptuk ki. 3.3.7. Immunofluorescencia UMR-106 sejteket

22-mm2 üveg fedőlemezekre helyeztük 375,000 sejt/

fedőlemez. 50% konfluenciánál a sejteket PTH(1-34)-el, PTH(3-34)-el, C. difficile toxin B-vel, Y27632-vel, phorbol 12,13 dibutyrattal, vagy kombinációikkal kezeltük adott ideig és koncentrációkban. A sejteket jéghideg methanol:acetone 1:1 arányú oldatával fixáltuk és permeabilizáltuk, majd 3x mostuk PBS-el. A fixált sejteket PKCβ (1:100) isozym–specifikus anti- PKC antitesttel és FITC-konjugáltmásodik antitesttel (1:50) festettük.

A sejteket Zeiss LSM 510 lézerscan/konfokális mikroszkóp 63-as

olajimmerziós objektívével vagy

Olympus Fluoview konfokális mikroszkóp 60-as

olajimmerziós objektívével vizualizáltuk. 3.3.8. RNS preparálás

31

3.3.8.a. Egér RNS izolálás. Minden csoportból (100-125 mg szövet álatonként) a módosított TRIzol metodikával totál RNS-t izoláltunk. Öszefoglava: a csontmintákat a lágyrészektől megtisztítottuk és 1 ml TRIzol reagensbe (Invitrogen, Carlsbad, CA) 50-100 mg szövetet helyeztünk üveg-Teflon és folyékony nitrogént használva. 5 perc szobahő inkubáció után a homogenizált mintákhoz 0,2 ml fenol/kloroformot tartalmazó 1 ml TRIzol Reagenst adtunk, majd 4 C-ont 10 000 RPM –en 15 percig centrifugáltuk. Az RNS precipitációhoz 0,5 ml izopropíl alkoholt tartalmazó 1 ml TRIzol Reagenst használtunk. After centrifugation at at 4 C at 10 000 RPM for 15 sec., RNA csomót 75%-os etanollal mostuk. A mintákat tovább az SV Total RNA Isolation kit (Promega, Madison,WI, USA) felhasználásával tisztítottuk. Az RNS minták mennyiségét és minőségét gélelektroforézissel és spectrophotometriával mértük. A csoportokon belül az RNS mintákat púloztuk. 3.3.8.b. Direkt humán messengerRNS-izolálás. A humán csontmintákat folyékony nitrogén alatt elporítottuk freezer-mill 6750 készülék segítségével (SPEX Certiprep Inc., NJ, USA ). Az RNS -izolálást Dynabeads Oligo (dt)25 kit (Dynal Biotech ASA , Oslo, Norvégia) felhasználásával végeztük. Az elporított mintákhoz 5 ml lysis / binding puffert adtunk és centrifugáltuk 9000 rpm-el, 15 percig szobahőmérsékleten. A nukleinsavakat tartalmazó középső réteget 1 ml oligo-dtvel borított paramagnetikus partikulumokat tartalmazó oldathoz adtuk. Az mRNS tisztítását a Dynabeads Oligo (dt)25 kit-ben található puffer szett segítségével a gyártó előírása szerint végeztük. A tisztított mRNS eluálásához 40 μl RN -áz-mentes vizet használtunk. Ezt követően az mRNS -t 2 μl DN-áz I. enzimmel (Promega, Madison, WI, USA ) kezeltük 20 percig, 37 °C-on 80 U RN -asin RN -áz-inhibitor (Promega) jelenlétében. Az mRNS minőségét és mennyiségét NanoDrop spektrofotométerrel (Nanodrop Technologies, Montchanin, DE, USA ) ellenőriztük 260/280 nm hullámhossztartományon. 15 μl humán mRNS -ből reverz transzkripcióval cDNS -t állítottunk elő, melyhez 200 U SuperScriptII RN -áz H reverz transzkriptázt (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California, USA ), 125 ng random primert (Promega), és 40 U RNaseOUT ribonukleáz-inhibitort (Invitrogen Life Technologies) használtunk 30 μl végtérfogatban. 3.3.9. Microarray és próbák

32

3200 amplifikált cDNS betétek, melyek különböző egér cDNS könyvtárakból voltak amplifikálva vektorspecifikus primerekkel és gél-elektroforézissel analizáltunk, majd Millipore PCR tisztitó lemezeken tisztítottunk (Millipore, Billerica, MA, USA) és 50% -os DMSO/víz-ben oldottuk 0.8 mg/ml végkoncentrációban. A tisztított PCR termékeket duplán csoportosítottuk amino-silanizált lemezekre (FMB cDNA slides, Full Moon Biosystems, Sunnyvale, CA)

MicroGrid Total Array System spotter

(BioRobotics, Cambridge, UK) felhasználásával 16 pins 4x4 grid formátumban. A DNS mintákat UV

fénnyel kötöttük a lemezekhez

700 mJ energiával (Stratalinker,

Stratagene). Hibridizáció előtt a lemezeket blokkoltuk 1 x SSC, 0.2% SDS, 1% BSA oldatával 30 percig 42oC-on, vízzel mostuk, majd szárítottuk. Microarray próbákat a módosított verziójú lineáris amplifikációs technikával generáltuk. Összefoglalva : 2 g tRNA-t minden összesített csoportból amplifikáltunk. Az amplifikált RNS 2 g-ját Cy5 vagy Cy3 fluorescen festékkel jelöltünk reverz transkripcióval (RT) RNAse H (-) pont mutált M-MLV reverz transkriptáz (Fermentas, Vilnius, Lithuania) és random nanomerek felhasználásával. Az RT után a jelölt cDNSeket NucleoSpin PCR purification kit (Macherey-Nagel,düren,Germany) segítségével tisztítottuk. A próbákat ezután 12 l hibridizációs pufferbe (50 % formamide, 5x SSC, 0.1 % SDS, 100 mg/ml salmon sperm DNA) oldottuk. Majd denaturáltuk 1 percig 90ºCon. A lemezeket 22 mm x 22 mm fedővel borítottuk, majd beleptük DPX Mountant (Fluka, Buchs, Switzerland) filmmel, hogy meggátoljuk a párolgást. A lemezeket 42ºCon 20 órát nedves hibridizáló kamrába tartottuk. Hibridizáció után a lemezeket mostuk és szárítottuk 10 perc 1 x SSC 0.1% SDS-el, 10 perc 0.1% x SSC 0.1% SDS-el és 10 perc 0.1 x SSC szobahőmérsékleten. 3.3.10. A vizsgált gének kiválasztása, kvantitatív valós idejű RT-PCR. 3.3.10.a. Kvantitatív valós idejű RT -PCR módszer alkalmazásával olyan kandidáns géneket vizsgáltunk, melyek eltérő génexpressziós aktivitása szerepet játszhat a menopauzát követő csontszöveti anyagcsere-változás kialakulásában. Előzetes genetikai útvonal analízis és irodalmi adatok alapján kiválasztottunk 120 gént a transzkripciós vizsgálatokhoz. Ebből 21 gén a TGF-β/BMP jelátviteli útvonalat alkotja, 6 gén pedig a WNT útvonalhoz tartozik. További 23 gén extracelluláris mátrix molekulákat, 8 gén extracelluláris mátrix bontó enzimeket, 10 gén növekedési faktorokat, 4 gén sejtadhéziós molekulákat, 13 gén transzkripciós faktorokat kódol. 12

33

gén kifejeződése az ösztrogén szabályozása alatt áll, 7 gén polimorfizmusai és a csont ásványianyag-tartalma között összefüggés található, a fennmaradt 8 gént előzetes genetikai analízisek alapján válogattuk ki. A PCR -mérésekhez 2 kontrollgént használtunk. Előre megtervezett és validált génspecifikus TaqMan Gene Expression Assayt használtunk az Applied Biosystemstől (Applied Biosystems, Foster City, CA , USA ). Minden génspecifikus TaqMan szett tartalmazott egy 5’ irányú és egy 3’ irányú primert, valamint egy fluoreszcens jelölőmolekulával ellátott próbát. A PCR –reakció 20 μl végtérfogatban zajlott, amely a következőket tartalmazta: 1 μl cDNS , 10 μl TaqMan 2× Universal PCR Master Mix NoAmpErase UN G (Applied Biosystems), 1 μl validált génspecifikus TaqMan próba 20× (Applied Biosystems) és 18 μl víz. A kiválasztott 120 gén amplifikálásához ABI Prism 7500 valós idejű PCR (Applied Biosystems) rendszert használtunk. Minden gént 3-3 párhuzamos méréssel vizsgáltunk a 96 lyukú lemezeken a következő protokoll szerint: első lépésként 10 perc denaturálás 95 °C-on, majd 70 cikluson keresztül 15 másodperc denaturálás 95 °C-on, 1 perc szintézis 60 °C-on. Általános „house-keeping” géneket (GAPDH, ACTB ) alkalmaztunk belső kontrollként. A statisztikai analízis során a GAPDH-szinteket használtuk a normalizált értékek számításához, ugyanis irodalmi adatok szerint az ACTB gén kifejeződését osteoblastsejtekben az ösztrogén befolyásolja. Az összegyűjtött adatokat (küszöbciklusszámok, Ct) a 7500 System SDS software 1.3 (Applied Biosystems) segítségével értékeltük. A génspecifikus mRNS relatív mennyiségét (RQ) az átlag ΔCt értékekből (célgén Ct-értéke – belső kontroll gén Ct-értéke) számítottuk ki mind a 120 gén esetében mindkét vizsgált mintacsoportban a gyártók előírása szerint (Applied Biosystems). A génexpressziós arányokat (RQ POST -NO P / RQ PRE -NO P) a postmenopausális és premenopausás nem osteoporósisos személyek RQ-értékeiből számítottuk ki. 3.3.10.b. Kvantitatív valós idejű fluorescens RT-PCR (QRT-PCR) QRT-PCR a RotorGene 2000 készülék felhasználásával (Corbett Research, Sydney, Australia), gén-specifikus primerekkel és a SybrGreen protokoll szerint végeztük a microarray-ben talált expressziós különbségek ellenőrzésére

3.3.11. Genotipizálás.

34

A DNS-t perifériás vér mononuclearis sejtfrakciójából izoláltuk. Az ER gén XbaI, a VDR gén BsmI és a CaSR gén A986S polimorf régiót tartalmazó szekvenciáját PCR-technikával amplifikáltuk. 3.3.11.a. Az ER gén PCR-hez felhasznált primerek: primer 1:5’ CTG CCA CCC TAT CTG TAT CTT TTC CTA TTC TCC 3’ 34-mer, primer 2:5’ TCT TTC TCT GCC ACC CTG GCG TCG ATT ATC TGA 3’ 33-mer (10 μM végső koncentráció). 3.3.11.b. A VDR gén PCR-hez felhasznált primerek: primer 1:5’ AAC CAG CGG GAA GAG GTC AAG GG 3’ 23-mer, primer 2:5’ CAA CCA AGA CTA CAA GTA CCG CGT CAG TGA 3’ 30-mer (2,5 μM végkoncentráció). A PCR reakció mindkét gén esetében 50 μL térfogatban zajlott, a következő összetételben: 5 μl 10 × PCR reakció puffer, 1 μl dNTP (10 mM végkoncentráció), 5 μl 25 mM MgCl2, 10 μl DNS (1 μg), 1– 1 μl primer 1 és 2, 0,4 μl (2 U/μl) Taq (Promega, Madison, USA) és 26,6 μl desztillált víz. A PCR program a következő volt: 95 °C 2 min, 85 °C 3 min, 5 × ( 70 °C 210 sec, 95 °C 30 sec), 30 × (70 °C 105 sec, 90 °C 30 sec), 10 × (70 °C 210 sec, 95 °C 30 sec) és 70 °C 15 min. Az amplifikált PCR terméket az ER polimorfizmusnál XbaI enzimmel (Promega, Madison, USA) emésztettük 37 °C-on éjszakán át, míg a VDR polimorfizmusok meghatározásához BsmI restrikciós enzimet használtunk (BioLabs, Beverly, USA) (65 °C, 90 min). Emésztés után a reakcióelegyet 10 μg/ml etidiumbromidot tartalmazó 2%-os agarózgélen futtattuk. Értékelés: X, B jellel jelöljük az allélt, ha az nem tartalmazza a XbaI, BsmI restrikciós enzim helyet – x, b, ha tartalmazza azt, és az enzim emészt. Így a genotípusok a következők: XX, Xx, xx, illetőleg BB, Bb, bb. 3.3.11.c. A CaSR gén A986S polimorfizmus meghatározásához felhasznált primerek: primer 1:5’ ACG GTC ACC TTC TCA CTG ACG TTT GAT GAG CCT CAG AAG TAC T 3’ 43-mer, primer 2:5’ GCT TTG ATG AGC CTC AGA AGA TCG 3’ 24-mer, primer 3:5’ CTC TTCAGGGTC CTC CAC CTC T 3’ 22-mer (10μMvégső koncentráció). A PCR reakció 20 μl térfogatban, a következő kondiciók mellett zajlott: 2 μl 10 × PCR reakció puffer, 4 μl dNTP (1mM), 1,2 μl 25 mM MgCl2, 1 μl DNS (25 ng/ml), 3–2–1 μl (primer -3, -2, -1), 0,1 μl (0,5 U/μl) Taq (Promega, Madison, USA) és 5,7 μl desztillált víz. A PCR program a következő volt: 94 °C 12 min, 35 × (94 °C 20

35

sec, 55 °C 20 sec, 72 °C 30 sec) és 72 °C 5 min. A CaSR génnek a 986-os helyen való eltérése alapján (attól függően, hogy alanint vagy szerint tartalmaz) két típusa van: az A allél és az S allél, ezért a genotípusok a következők: AA, AS, SS. Az electroforetikus szeparáció 7%-os Spreadex/ acrilamide-bis (29:1) gélen történt (Elchrom, Cham, Svájc). A PCR reakciókhoz Hybaid Express (Teddington, Middlesex, Anglia) készüléket használtunk. 3.3.11.d. Az IL-1ra gén polimorfizmusának meghatározása. A DNS-t perifériás vér mononuclearis sejtfrakciójából QIAmp KIT (Quiagen,USA), iletve fenol-kloroformos extrakció segítségével izoláltuk. A polimorfizmust tartalmazó DNS szakaszt PCR technika segítségével amplifikáltuk. A PCR reakcióhoz Hybaid Touch Down (Hybaid,UK) thermocyclert és a következő primereket használtuk: 5’-CTC-AGC-AACACT-CCT--AT-3’ (sense) és 5’-TCC-TGG-TCT-GCA-GGT--AA-3’ (antisense). A DNS amplifikálás körülményei 20 ul végtérfogatban a következők voltak: 1 U Taq DNS polimeráz enzim (DyNAzyme, Finnland), 1x reakció puffer ( az enzimhez csatolt), egyenként 200 uM dATP. dCTP. dGTP, dTTP, 50 pM mindkét primerből. Inkubálási körülmények: 5 perc 95oC, majd 5 ciklus: 30 sec 95oC, 2 perc 60oC, 1 perc 72oC, majd 25 ciklus: 30 sec 95oC, 1 perc 60oC, 1 perc 72oC, amelyet 5 perces 72oC-os inkubálás zárt. Az amplifikálódott DNS 86 kb tandem repeat szakaszt tartalmaz, amelyben három fehérje kötőhely található. Az Il-1ra gén alléltípusát az amplifikátum 2%-os agaróz gélen futtatás és etidium-bromiddal történő jelölés után olvastuk le. A különböző alléltípusok jelölésében az irodalomban elterjedt elnevezéseket alkalmaztuk: allél 1 (A1) 410 bp-4 repeat; allél 2 (A2) 240 bp-2 repeat; allél 3 (A3) 500 bp-5 repeat; allél 4 (A4) 325 bp-3 repeat; allél 5 (A5) 595 bp-6 repeat. 3.4. Biokémiai módszerek 3.4.1. Szérum IGF-I és IGFBP mérése. A szérum IGF-I koncentrációját a Nichols Institute ( San Juan Capistrano, CA, USA) radioimmunoassay-jével mértük. Az immunoassay-t megelőzően HCL-etanol precipitációval szeparáltuk a szolubilis IGF-I-et a kötőfehérjéktől. A szérum IGFBP-3, 4 és -5 mennyiségének vizsgálatát szintén radioimmunoassay-vel (Nichols Institute, illetve Loma Linda University, CA, USA) végeztük. 3.4.2. Immunoreaktív TNF-α koncentráció mérése.

36

Az immunoreaktív TNFα mérése radioimmunoassay-vel (OSSKI, Budapest) történt. A detektálhatóság alsó határa 10 pg/ml volt. 3.4.3. Szérum pajzsmirigyhormon koncentrációk mérése. A szérum TSH, fT 3 és fT 4 mérését radioimmunoassay-vel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), valamint Abbott IMx rendszerrel ( Abbott, North Chicago, IL, USA) végeztük. 3.5.In vivo vizsgáló módszerek 3.5.1. Osteodensitometria. A csontok ásványianyag tartalmát (BMD) a gerinc lumbális szakaszán (L 2-4 ), a combnyak és a radius harmadolópontban mértük DEXA (Norland XR-26, Norland Corporation, Fort Atkinson, WI, USA és Lunar DPX-L, Lunar Corporation, Madison, WI, USA) ill. SPA ( NK-367, Gamma Kft., Budapest) módszerrel. A mért értékekből z és t score-okat számoltunk. 3.6. Statisztikai módszerek Minden egércsont- array-t ScanArray Lite lézerscan (GSI Lumonics, Billerica, MA) felhasználásával olvastunk le konfokális fluorescens scannerrel, 10 m feloldással. A képanalízist GenePix Pro3.0 szoftver (Axon Instruments Inc., Foster City, CA) segítségével végeztük. A humán csont adatok analíziséhez Windows SPSS 13.0.1 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA ) programot használtunk. A statisztikai analízist egyparaméteres Mann–Whitney U teszt segítségével végeztük. A genotípusok és a BMD, illetve a szérumban mért paraméterek kapcsolatait ANOVA (Tukey HSD mint post-hoc test) és Student’s t-teszt felhasználásával végeztük. A genotípusok és vizsgált varibilis régiók közötti kapcsolatot chi-square analízissel (vagy Fisher-exact) tesztekkel végeztük. A transzfekciós kisérletek értékeléséhez Graph.Prism szoftvert használtunk. Statisztikailag szignifikánsnak tekintettük, ha a valószínűségi adatok p≤0,05 voltak.

37

4. EREDMÉNYEK Vizsgálataink során kapott eredményeket a következőkben foglalhatjuk össze.

I. PTH hatása a csontanyagcserében A. A PTH, TNF-α és az IL-I hatása az IL-6 promoterrel transzfektált osteoblastokon, PKC gátlók jelenlétében. PTH szignifikánsan fokozta a -109/+11-, -158/+11-, -224/+11-, és a teljes hosszúságú -779/+11-bp IL-6 promoter konstrukció aktivitását, de a -49/+11-bázispárú konstukciójét nem (4A.ábra). A PTH stimuláló hatását részlegesen a PKC gátló GF109203X antagonizálta, a maximális gátló hatást 100 nM koncentrációban a – 224/+11-bp és a teljes hosszúságú promoteren láttunk. A PTH 10-14 M – 10-8 M koncentráció között dózis-függően növelte a -224/+11-bp konstrukció aktivitását (4B és 4C ábrák). A legmagasabb PTH koncentráció 30-szoros aktivitás fokozódást okozott. A GF109203X, 30 nM és 1 mM koncentrációkban gátolta 10-13–10-11 M PTH hatását. Azonban magasabb PTH koncentrációkét nem (4B, 4C ábrák).

38

a)

D M SO

60000 ***

50000

P T H [1 0

-1 2

M ]

P T H [1 0

-1 2

M ]/G F 1 0 9 2 0 3 X ,1 0 0 n M

***

RLU

40000 ***

30000

##

***

###

###

20000

#

10000

0

- 7 7 9 /+ 1 1

- 2 2 4 /+ 1 1

- 1 0 9 /+ 1 1

- 1 5 8 /+ 1 1

- 4 9 /+ 1 1

H u m a n IL -6 p r o m o te r b) 10000000

G F -1 0 9 2 0 3 X , 1  M

***

***

1000000 RLU

*** *** 100000

***

**

*

10000

D M SO

c) 130000

10

-1 5

10

-1 4

10

###

###

##

-1 3

1 0 -1 2 1 0 -1 1 P T H [M ]

10

-1 0

10

-9

10

-8

*** G F -1 0 9 2 0 3 X , 3 0 n M

120000 110000 100000 90000

***

RLU

80000 ***

70000 60000

###

50000 40000

***

30000 *

10000 0

### ##

20000

# D M SO

10

-1 4

10

-1 3

10

-1 2

10

-1 1

10

-1 0

P T H [M ]

4.ábra. (A) PTH és PKC antagonista GF109203X (100 nM) hatása a -109/+11-, -158/+11-, -224/+11-, -779/+11-bp, -49/+11-bázispárú IL-6 promoter konstrukció expresszióra tranziensen transzfektált UMR106 sejteken (n = 3). (B) PKC antagonista GF 109203X (30 nM) gátló hatása a dózis-függően (10-14 M – 10-10 M) PTH stimulált -224/+11 bp IL-6 promoter konstukción (n = 3). (C) ) PKC antagonista GF 109203X (1 mM) gátló hatása a dózis-függően (10-15 M – 10-8 M) PTH stimulált -224/+11 bp IL-6 promoter konstukción (n = 5).; RLU, relative luciferase units). Az értékeket átlag ± SEM-ben fejeztük ki *p , 0.05 versus kontroll; **p , 0.01 versus kontroll; ***p , 0.001 versus kontroll; # p < 0.05 versus PTH; ##p < 0.01 versus PTH; ###p < 0.001 versus PTH.

39

250 nM Calphostin C, részlegesen, de szignifikánsan gátolta 10-15 M – 10-8 M PTH hatását (5.ábra); alacsonyabb (10-11 M – 10-10 M) PTH koncentrációk esetén jelentősebb gátlóhatást láttunk. Ugyanakkor 10-13 M – 10-12 M PTH koncentrációk nem gátoltak szignifikánsan, mint ahogy ezt GF109203X esetén láttuk, illetve PTH és calphostin C együtt nem okozott olyan szignifikáns stimulációt, melyet ebben a koncentrációban a PTH önmagában okozott.

5.ábra. Calphostin-C (250 nm) hatása a -224/+11-bázispárú IL-6 promoter konstrukció expresszióra tranziensen transzfektált UMR-106 sejteken (n =5).; RLU, relative luciferase units). Az értékeket átlag ± SEM-ben fejeztük ki *p < 0.05 versus kontroll; **p < 0.01 versus kontroll; ***p < 0.001 versus kontroll; # p < 0.05 versus PTH; ##p < 0.01 versus PTH; ###p < 0.001 versus PTH.

Előkezelve a sejteket 48 óráig 100 nM PDBU-val amely a konvencionális és az új PKC izoenzimek alulműködéséhez vezetett, részlegesen és szignifikánsan gátolta 1019

M – 10-8 M PTH stimuláló hatását (6.A ábra. A PDBU előkezelés 1 és 10 nM TNF-α

(6.B ábra) és 1–10 ng/ml IL-1 (6.C ábra) stimuláló hatását is gátolta a -224/+11bázispárú IL-6 promoter konstrukción.

40

6.ábra. (A) PDBU (100 nM/48 h) hatása a PTH stimulálta -224/+11-bázispárú IL-6 promoter konstrukció expresszióra tranziensen transzfektált UMR-106 sejteken (n =6).; RLU, relative luciferase units). Az értékeket átlag ± SEM-ben fejeztük ki; ***p < 0.001 versus kontroll; ##p < 0.01 versus PTH; ###p < 0.001 versus PTH. (B) PDBU (100 nM/48 h) hatása a TNF-α stimulálta -224/+11-bázispárú IL-6 promoter konstrukció expresszióra tranziensen transzfektált UMR-106 sejteken (n =6).; RLU, relative luciferase units). Az értékeket átlag ± SEM-ben fejeztük ki; *p < 0.05 versus control; **p < 0.01 versuskontroll; ***p < 0.001 versus kontroll; #p < 0.05 versus TNF; ##p < 0.01 versus TNF (C) PDBU (100 nM/48 h) hatása az IL-1 stimulálta -224/+11-bázispárú IL-6 promoter konstrukció expresszióra tranziensen transzfektált UMR-106 sejteken (n =3).; RLU, relative luciferase units). Az értékeket átlag ± SEM-ben fejeztük ki; *p < 0.05 versus kontroll; ***p < 0.001 versus kontroll###p , 0.001 versus IL-1 .

41

A többi PKC gátló hatásától eltérően, 100 nM staurosporine szignifikánsan fokozta a PTH, TNF, IL-1 stimuláló hatását a -224/+11-bázispárú IL-6 promoter konstrukció expresszióra (7.A–C ábrák).

7.ábra. (A) Staurosporine hatása a PTH stimulálta -224/+11-bázispárú IL-6 promoter konstrukció expresszióra tranziensen transzfektált UMR-106 sejteken (n =6).; RLU, relative luciferase units). Az értékeket átlag ± SEM-ben fejeztük ki; *p < 0.05 versus kontroll; **p < 0.01 versus kontroll; ***p < 0.001 versus kontroll; # p < 0.05 versus PTH; ###p < 0.001 versus PTH. (B) Staurosporine hatása a TNF-α stimulálta -224/+11-bázispárú IL-6 promoter konstrukció expresszióra tranziensen transzfektált UMR-106 sejteken (n =3).; RLU, relative luciferase units). Az értékeket átlag ± SEM-ben fejeztük ki; **p < 0.01 versus kontroll; ***p < 0.001 versus kontroll; ###p < 0.001 versus TNF (C) Staurosporine hatása az IL-1 stimulálta -224/+11-bázispárú IL-6 promoter konstrukció expresszióra tranziensen transzfektált UMR-106 sejteken (n =3).; RLU, relative luciferase units). Az értékeket átlag ± SEM-ben fejeztük ki; *p < 0.05 versus kontroll; ***p < 0.001 versus kontroll, # p < 0.05 versus IL-1, ###p< 0.001 versus IL-1.

Staurosporine önmagában is stimuláló hatással bírt, mely hatást GF109203X gátolt. (8.A ábra). PDBU előkezelés után a staurosporine hatása elveszett (8.B ábra).

42

8.ábra. (A) GF 109203X (100 nM) hatása a staurosporine stimulálta -224/+11-bázispárú IL-6 promoter konstrukció expresszióra tranziensen transzfektált UMR-106 sejteken (n =3).; RLU, relative luciferase units). Az értékeket átlag ± SEM-ben fejeztük ki; *p < 0.05 versus kontroll; **p < 0.01 versus kontroll; ***p < 0.001 versus kontroll; # p < 0.05 versus PTH; ###p < 0.001 versus PTH. (B) PDBU hatása a staurosporine stimulálta -224/+11-bázispárú IL-6 promoter konstrukció expresszióra tranziensen transzfektált UMR-106 sejteken (n =3) Átlag ± SEM. **p < 0.01 versus control; ***p <0.001 versus control. ###p ,< 0.001 versus PTH

43

A staurosporine PKC aktiváló hatását direkt PKC assay-vel is bizonyítottuk (9. ábra).

9.ábra. PTH és staurosporine hatása a PKC aktivításra UMR106 patkány osteosarcoma sejtekben. A sejteket 5 h át PTH (10 nM), staurosporine (50 nM), vagy kombinációjukkal kezeltük. PKC aktivítást Pep Tag assay kit segítségével mértük.

Standartként tisztított patkány PKC-t használtunk. A foszforilált

terméket densitometriás analízissel határoztuk meg.

B. A PKC izoenzimei részt vesznek a PTH, TNF-α és az IL-1β IL-6 szekréciót fokozó hatásában. LY379196 a PKC- transzlokáció szelektív gátlója UMR-106 osteoblast sejtekben Mivel a PKC transzlokációt az aktiváció markereként is használjuk, immunofluorescens vizsgálattal határoztuk meg nyugvó és PTH stimulált UMR-106 sejtekben a

PKC-α és PKC-I

subcelluláris elhelyezkedését. Nyugvó sejtekben

mindkéz enzim diffúzan helyezkedik el a citoplazmában (10. ábra). 5 perces 10 nM PTH kezelés mind a PKC-α, mind a PKC-I

transzlokációjához vezetett a plazma

membránba (10. ábra). A PKC-II a PKC-I -hez hasonló eloszlást mutatott a nyugvó sejtekben, azonban PTH kezelés a lokalizációját nem befolyásolja. Egyidejű 10 nM PTH és LY379196 (30 vagy 100 nM) kezelés nem volt hatással a PKC-α transzlokációra (10. ábra, felső sor), ugyanakkor a PTH-stimulálta PKC-I transzlokáció gátolt volt mindkét koncentrációjú LY379196 jelenlétében (10. ábra, alsó sor).

44

10-ábra. LY379196 gátolja az endogén PKC-I membrán transzlokációt, de a PKC-α-ét nem, PTHstimulált UMR-106 osteoblast sejtekben. A sejteket vivőanyaggal, 10 nM PTH-val, 30 vagy 100 nM LY379196-tal, vagy kombinációikkal 5 percig kezeltük. Felső sor: PKC-α; alsó sor PKC-I.

Ezzel szemben, az összes konvencionális és új típusú PKC izoenzim gátló GF109203X, kivédte mind a PKC-I, mind a a PKC-α membrán transzlokációt a PTHstimulált UMR-106 sejtekben (11.ábra).

11.ábra. GF109203X gátolja mind az endogén PKC-I mind a PKC-α membrán transzlokációt, PTHstimulált UMR-106 osteoblast sejtekben. A sejteket vivőanyaggal, 10 nM PTH-val, 30 vagy 1 mM GF109203X-el, vagy kombinációikkal 5 percig kezeltük. Felső sor: PKC-α; alsó sor PKC-I.

45

Szintén vizsgáltuk a TNF-α és az IL-1 hatását a PKC izoenzim transzlokációra. 5 perces 10 nM TNF-α kezelés mind a PKC-I mind a PKC-α membrán transzlokációját indukálta (12a.ábra). Minden vizsgált koncentrációban (10, 5, 1 nM), a TNF-α PKC-I és PKC-α transzlokációt fokozó képessége messze elmaradt a PTH-tól. A sejteket egyszerre kezelve 10 nM TNF-α-val és 30 nM LY379196-.val 5 percig megelőzte a PKC-I, de nem a PKC-α membrán transzlokációt (12a.ábra). LY379196 szintén gátolta a PKC PKC-I membrán transzlokációját, melyet 5 vagy 1 nM TNF-α okozott, míg a PKC-α membrán transzlokációra hatástalan volt. Hasonlóan, az IL-1 (0.6 nM) kezelés mind a PKC-I mind a PKC-α membrán transzlokációját indukálta, ugyanakkor e hatás is elmaradt a PTH-tól (12b.ábra). LY379196 szintén gátolta a PKC PKC-I membrán transzlokációját, melyet 0.6, 0.3 és 0.06 nM IL-1 okozott, míg a PKC-α membrán transzlokációra hatástalan volt. Ezek az adatok az LY379196 PKC-I szelektivitását mutatják UMR-106 sejtekben. Eredményünk elsőként demonstrálta a TNF-α és az IL-1 hatását a PKC izoenzim transzlokációra osteoblastban.

46

12.ábra LY379196 kivédi a PKC PKC-I, de nem a PKC-α membrán transzlokációját, melyet (a) TNFα és (b) IL-1 okozott UMR-106 osteoblast sejtekben. A sejteket vivőanyaggal, 10 nM TNF-α -val, 30 nM LY379196-al, vagy kombinációikkal 5 percig kezeltük. Felső sor: PKC-α; alsó sor PKC-I.

LY379196 gátolja a PTH, TNF-α és az IL-1 hatását az IL-6 promoter expresszióra UMR-106 osteoblast sejtekben. PTH növelte az IL-6 promoter aktivitását, szignifikánsan fokozva annak működését 0.01 pM PTH koncentrációig (13.ábra). Dózis-függő növekedést látunk a luciferase expresszióban 10nM-ig, mely a maximális vizsgált koncentráció volt. 30 nM LY379196 szignifikánsan gátolta 0.01–10 pM PTH hatását, azonban magasabb PTH koncentrációk esetén hatástalan volt (13. ábra fent). Hasonló eredményt kaptunk 100 nM LY379196 esetén is (13.ábra lent). 10nM LY379196 kevésbé volt hatékony, mint a 30 vagy 100 nM, de még képes volt részlegesen gátolni a PTH hatását

47

. 13.ábra. LY379196 gátolja a PTH-stimulálta -224/+11 bp IL-6 promoter konstrukt expressziót tranziensen transzfektált UMR-106 osteoblast sejtekben. Transzfektált sejteket a jelzett koncentrációjú PTH-val kezeltük 30 nM LY379196 (fent) vagy 100 nM LY379196 (alul) jelenlétében vagy hiányában 5 órán át. RLU.: relative luciferase units.. Az értékeket átlag ± SEM-ben fejeztük ki *p < 0.05 versus kontroll; **p < 0.01 versus kontroll; ***p < 0.001 versus kontroll; # p < 0.05 versus PTH; ##p < 0.01 versus PTH; ###p < 0.001 versus PTH.

48

TNF-α (1, 5, és 10 nM) (14.ábra) és IL-1 (0.06, 0.3,and 0.6 nM) (15.ábra) szintén fokozta az IL-6 promoter expressziót, ugyanakkor a válasz kisebb volt mint a PTH esetén. LY379196 szintén gátolta mind a TNF-α (15.ábra) mind az IL-1 (15. ábra) hatását az IL-6 promoteren.

14.ábra. LY379196 gátolja a TNF-stimulálta -224/+11 bp IL-6 promoter konstrukt expressziót tranziensen transzfektált UMR-106 osteoblast sejtekben. Transzfektált sejteket a jelzett koncentrációjú TNF-al kezeltük 30 nM LY379196 vagy 100 nM LY379196 jelenlétében vagy hiányában 5 órán át. (n=3) RLU.: relative luciferase units.. Az értékeket átlag ± SEM-ben fejeztük ki *p < 0.; **p < 0.; ***p < 0.001 versus kezeletlen kontroll; #P< 0.05, ##P <0 .01, ###P<0.001 vs TNF.

. 15.ábra. LY379196 gátolja az IL-1-stimulálta -224/+11 bp IL-6 promoter konstrukt expressziót tranziensen transzfektált UMR-106 osteoblast sejtekben. Transzfektált sejteket a jelzett koncentrációjú IL1-el kezeltük 30 nM LY379196 vagy 100 nM LY379196 jelenlétében vagy hiányában 5 órán át. (n=3) RLU.: relative luciferase units. Az értékeket átlag ± SEM-ben fejeztük ki *p < 0.; **p < 0.; ***p < 0.001 versus kezeletlen kontroll; #P< 0.05, ##P <0 .01, ###P<0.001 vs IL-1.

49

LY379196

és

GF109203X

csontvelőkúltúrában

gátolta

a

PTH

stimulálta

osteoclastogenesist . Egér csontvelő kulturához D vitamint önállóan adva nem lehetett szignifikáns osteoclastgenerációt detektálnim míg PTH-val együtt szignifikáns osteoclastogenesist tudtunk kimutatni. A PTH ezirányú hatását a PKC gátlók gyengítették. (16.ábra)

Osteoclast 120

TRAP+

100 80 60 40 20 0

16.ábra. LY379196 és GF109203X gátolja a

-Vit +Vit PTH +LY +GF D D

csontvelőkúltúrában gátolta a PTH stimulálta

osteoclastogenesist. Egércsontvelőtenyészetet D vitaminnal, PTH-val illetve vagy 100 nM LY379196-al, vagy 10 nM GF109203X-ál kezeltünk. A TRAP pozitív sejteket mikroszkóp alatt számoltuk.

LY379196 szervkultúrában gátolja a PTH hatását a csontbontásra. Annak a meghatározásához, hogy vajon a PKC-I gátlása hatással van e a PTH stimulálta csont rezorpcióra, újszülött patkány csontkultúrában teszteltük az LY379196 hatását. 100 nM LY379196 gátolta 0.5 nM PTH stimuláló hatását (17.ábra). Az LY379196 kevésbé volt hatékony magasabb PTH koncentrációk esetén.

50

17.ábra. LY379196 gátolja a PTH-stimulálta rezorpciót magzat patkány végtag csontban. Előzetesen jelölt radiust és ulnát kezeltünk vivőanyaggal vagy 100 nM LY379196-al (a) 1.5 nM, (b) 1.0 nM, vagy (c) 0.5 nM PTH jelenlétében, vagy hiányában 72 órán át. (d) 3 különböző PTH koncentrációt alkalmaztunk. Az értékeket átlag ± SEM-ben fejeztük ki **P< 0.01, ***P <0.001 vs kezeletlen kontroll; +P < 0.05, +++P < 0.001 vs PTH.

C. A Rho fehérjék modulálják a PKC transzlokációt és a PTH stimulálta IL-6 promoter aktivítást UMR-106 osteoblastokban. C. difficile toxin B gátolja, míg a Rho preniláció gátlása gyengíti a PTH(1-34)– és PTH(3-34)–stimulált PKC-α transzlokációt UMR-106 osteoblast sejtekben A kezeletlen UMR-106 sejtekben a PKC-α elsősorban a sejtplazmában lokalizált. (18.ábra). A PTH(1-34), amely képes mind a PKA és PKC útvonalak aktiválására, mind a PTH(3-34), amely csak a PKC útvonaléra, stimulálja az endogén PKC-α transzlokációját a membránba (18.ábra). A Rho fehérje gátló C. difficile toxin B-t, mely úgy gátolja a Rho működését, hogy glikolizálja a Rho fehérjék ( beleértve RhoA, RhoB, Rac1, and Cdc ) nukleotid kötőhelyét, használtuk hogy megállapítsuk mely Rho fehérjék vesznek részt a PTH(1-34) and PTH(3-34) stimulálta PKC-α transzlokációban. 4 ng/ml C. difficile toxin B előkezelés gátolta a PTH(1-34)– és PTH(3-34)–stimulálta PKC-α transzlokációt (18.ábra). A fehérje preniláció gátlót (geranylgeranyl transferase I inhibitor GGTI-2166), használtuk a Rho gátlására. A sejteket 10 M GGTI-2166-al 30

51

percig előkezelve gyengítette a PTH(1-34), vagy PTH(3-34) stimulálta PKC transzlokációt.

18.ábra. C. difficile toxin B és a geranylgeranyl transzferáz gátló gyengíti a PTH(1-34)– és PTH(334)–stimulált PKC-α transzlokációt UMR-106 osteoblast sejtekben. UMR-106 sejteket előkezeltük 4 ng/ml C. difficile toxin B-vel 20 percig vagy 10 M GGTI-2166-al 30 percig, majd 5 percig kezeltük, 10 nM PTH(1-34), vagy 10 nM PTH(3-34). (A) Reprezentatív kép egy kísérletből (n=3).(B) A válasz mennyisége számos kísérlet alapján. Az adatokat a membránfestett sejtek/ a látótér összes sejtje alapján fejeztük ki. Kísérletenként és kezelésenként legalább 3 látóteret számoltunk. Az értékeket átlag ±SEM-ben fejeztük ki; ap <0.001 vs. control; bp<0.001 vs. PTH(1-34); cp< 0.001 vs. PTH(3-34).

52

A mutáns RhoA hatása a PKC-α transzlokációra UMR-106 osteoblast sejtekben Mivel a C difficele toxin B számos Rho családba tartozó fehérjét gátol, genetikai megközelítést használtunk a RhoA szerepének tisztázására a transzlokációban. UMR-106 sejteket tranziensen transzfektáltunk üres, konstitutívan aktív RhoA (Rho63L), vagy dominans negatív RhoA (Rho19N) vektorokkal. Az üres, vagy dominánsan negatív RhoA vektorokkal transzfektált sejtekben a PKC-α a citoszolban helyezkedett el, míg a konstitutívan aktív RhoA-val transzfektált sejtekben a PKC-α a membránban (19A,.C ábrák). Az üres vektorral transzfektált, majd PTH(1-34)-el (19B ábra) vagy PTH(3-34)-el (19C.ábra) kezelt sejtekben a PKC-α a membránba transzlokálódott, de a PTH hatás jóval gyengébb volt, mint a nem transzfektált sejtekben. A dominans negatív RhoA gátolta a PTH(1-34)– (20B.ábra) és a PTH(3-34)– (19C.ábra) stimulálta PKC-α transzlokációt.

53

19.ábra. Rho63L és Rho19N hatása a PKC-α transzlokációra UMR-106 osteoblast sejtekben. UMR106 sejteket tranziensen tarnszfektáltunk pcDNA3, Rho63L, vagy Rho19N vektorokkal, 5 percig vivőanyaggal, 10 nM PTH(1-34)-el vagy PTH(3-34)-el kezeltük. (A) Reprezentatív kép a különböző vektorokkal transzfektált sejtekről.(n=3). (B) PTH(1-34)-el végzett kísérleteink mennyiségi válasza. (C) PTH(3-34)-el végzett kísérleteink mennyiségi válasza. Az adatokat a membránfestett sejtek/ a látótér összes sejtje alapján fejeztük ki. kísérletenként és kezelésenként legalább 3 látóteret számoltunk. Az értékeket átlag ±SEM-ben fejeztük ki; ap <0.001 vs. control; bp<0.001 vs. PTH(1-34); cp< 0.001 vs. PTH(3-34).

Rho kináz gátló Y27632 gátolja a PTH(1-34)– és a PTH(3-34)–stimulálta PKC-α transzlokációt UMR-106 osteoblast sejtekben Ahhoz, hogy meghatározzuk mely Rho kinázok vesznek részt a PTH mediálta PKC-α transzlokációban, a Rho kináz specifikus Y27632-t használtuk. A

54

sejteket 10 M Y27632-al 30 percig előkezelve gyengítette a PTH(1-34), vagy PTH(334) stimulálta PKC-α transzlokációt a membránba (20.ábra).

20.ábra. Rho kináz szükséges PTH(1-34)– és a PTH(3-34)– stimulálta PKC-α transzlokációhoz UMR106 osteoblast sejtekben. UMR-106 sejteket előkezeltünk 10 M Y27632-al 30 percig, majd 5 percig vivőanyaggal, 10 nM PTH(1-34)-el vagy PTH(3-34)-el kezeltük. A válasz mennyisége eredménye kísérleteinkben. Az adatokat a membránfestett sejtek/ a látótér összes sejtje alapján fejeztük ki. kísérletenként és kezelésenként legalább 3 látóteret számoltunk. Az értékeket átlag ±SEM-ben fejeztük ki; ap <0.001 vs. control; bp<0.001 vs. PTH(1-34); cp< 0.001 vs. PTH(3-34).

PTH(1-34) és PTH(3-34) fokozza a RhoA aktivációt és a membrán lokalizációt UMR106 sejtekben Ahhoz, hogy bizonyítsuk a RhoA PTH általi aktivációját osteoblastokban két független metodikát alkalmaztunk. GTP-kötött Rho A mérésére egy specifikus kötőassay-t, a Rhotekin assay-t használtuk, és meghatároztuk a UMR-106 sejtek membrán frakciójában a RhoA fehérje transzlokációját. Mindkét paraméter növekedett PTH(1-34) vagy PTH(3-34) kezelésre PTH(1-34) for 1 vagy 5 perces kezelés PTH(1-34)-el 50 %os növekedést okozott a RhoA membrán frakcióban (21A,B.ábrák). PTH(3-34) ugyancsak fokozta a RhoA membrán kapcsolatot, de kisebb mértékben (21C,D ábrák). A Rho család egyéb kis G-fehérjéi, RhoB, Rac1, és Cdc 42, ugyancsak expresszálódtak az UMR-106 sejtek sejtlizátumában, azonban egyikőjük sem transzlokálódott a membrán

55

frakcióba. PTH(1-34) és PTH(3-34) 3.5 perc kezelés után 1.5-től 2 szeresig növelte a RhoA aktivációt, Rhotekin assay-vel mérve (21E,F ábrák).

21.ábra. PTH(1-34) rapidan stimulálja a RhoA membrán lokalizációját és aktivációját UMR-106 osteoblast sejteken. UMR-106 sejtek vagy vivőanyaggal, vagy 10 nM PTH(1-34)-el, vagy PTH(3-34)-el voltak kezelve (A–D) 1 vagy 5 percig, vagy (E) 3.5 percig. (A) Reprezentatív Western blotja a PTH(1-34)– kezelt membrán frakciónak SDS-PAGE-n és RhoA specifikus poliklonális antitest használatával. (B) A RhoA szintet a blottok densitometriás mérésével határoztuk meg, és a kontroll százalékában fejeztük ki. (C) Reprezentatív Western blotja a PTH(3-34)–kezelt membrán frakciónak. (D) A RhoA szintet a blottok densitometriás mérésével határoztuk meg, és a kontroll százalékában fejeztük ki. (E) Az aktívált GTPRhoA, és az össz RhoA GST-Rhotekin assay. (F) A GTP-RhoA/total RhoA aránya; 2 független, denzitometriával elemzett assay átlagértékei±SEM.

C. difficile toxin B és Y27632 nem védi ki a PDBU stimulálta PKC-α transzlokációt UMR-106 sejtekben Mivel az eddigi eredményeink nem határozták meg, hogy a Rho hatása a PKC transzlokáció közvetlen PKC hatáson át, vagy egy korábbi foszfolipáz aktiváción

56

keresztül történik, mely végül DAG keletkezéséhez vezet, ezért hogy ezt meghatározhassuk, a DAG-mimetikus phorbol-12,13-dibutyrat-ot használtuk. 5 percig 500 nM PDBu-val kezelve a sejteket PKC-α membrán transzlokációhoz vezetett (22. ábra). Ugyanakkor, a Rho fehérje gátlása C. difficile toxin B-vel (22. ábra) vagy GGTI2216-al nem volt hatással a PDBU stimulálta PKC-α transzlokációra. Ugyanígy, a Rho fehérje gátlása Y27632-vel (22.ábra) sem volt hatással a PDBU stimulálta PKC-α transzlokációra..

. 22.ábra. A PDBu-stimulálta PKC-α transzlokációra a Rho vagy Rho kináz gátlása UMR-106 sejtekben nincs hatással. UMR-106 sejteket előkezeltünk 4 ng/ml C. difficile toxin B-vel 20 percig vagy 10 M Y27632-vel 30 percig, majd vivőanyaggal vagy 500 nM PDBu-val kezeltünk 5 percig. (A) Reprezentatív kép egy kisérletből (n=3).(B) A válasz mennyisége számos kisérlet alapján. Az adatokat a membránfestett sejtek/ a látótér összes sejtje alapján fejeztük ki. Kisérletenként és kezelésenként legalább 3 látóteret számoltunk. Az értékeket átlag ±SEM-ben fejeztük ki; ap <0.001 vs. Control.

Rho és a

Rho kinázok modulálják a PTH(1-34) vagy PTH(3-34) stimulálta IL-6

promoter aktivítását A C. difficile toxin B kezelés részlegesen, de szignifikánsan gyengíti a PTH(134)–stimulálta IL-6 promoter aktivítást (23A ábra). Mivel az IL-6 válasz mind PKC és

57

PKA utakon végbemehet, a C. difficile toxin B hatása az IL-6 promoter activotásra a PKA aktátor forskolin stimuláció mellett is meghatároztuk. A forskolin kisebb mértékű stimulációt okozott az IL-6 ptomoteren, melyet C. difficile kezelés felerősített. Ahhoz, hogy

meghatározhassuk,

hogy

mely

Rho

transzlokáció

és

Rho

kinázok

elengedhetetlenek az IL-6 promoter aktivitáshoz, a GGTI-2166 és az Y27632 hatását teszteltük a PTH(1-34) és a PTH(3-34) válaszban. Mindkét gátló részlegesen, de szignifikánsan gátolta a PTH(1-34) és a PTH(3-34) hatását (23B,C.ábrák).

23.ábra. Rho és a Rho kinázok részt vesznek a PTH(1-34)– és a PTH(3-34)–stimulálta IL-6 promoter aktivitásban, de nem gyengítik a forskolin stimulálta IL-6 promoter aktivitást UMR-106 osteoblast sejtekben. UMR-106 sejteket transzfektáltunk az -224/+11-bp IL-6 promoter konstrukttal. A transzfektált sejteket 10 nM PTH(1-34), PTH(3-34), vagy inhibirotokkal kezeltünk 5 órán át. Luciferase assay-t végeztünk, az értékeket átlag ±SEM-ben fejeztük ki, (n=3). (A) 4 ng/ml C. difficile toxin B hatása a PTH(134)– és forskolin-stimulálta IL-6 promoter expresszióra. (B) 10 M GGTI hatása a PTH(1-34)– és a PTH(3-34)–stimulálta IL-6 promoter expresszióra. (C) 10 M Y27632 hatása a PTH(1-34)– és a PTH(334)–stimulálta IL-6 promoter expresszióra. Az értékeket átlag ±SEM-ben fejeztük ki, ap < 0.001 vs. control; bp <0.001 vs. PTH(1-34); cp < 0.01 vs. PTH(1-34); dp < 0.05 vs. PTH(1- 34).

58

PTH analógok hatása PLD/phosphatidsav phosphohydrolas szignálútra az IL-6 promoter activitásban Korábban kimutattuk, hogy a PKC kritikus aktivátora a PTH-stimulálta IL-6 promoter activitásnak és szintézisnek UMR-106 sejtekben. 5 árán át PTH 1–34, PTH 3– 34, PTH 1–31 vagy PTHrP kezelés egyaránt szignifikánsan stimulálta az IL-6 promoter aktivítását (24A.ábra). Annak a meghatározására, hogy vajon a PLD aktiváció befolyásolja-e az IL-6 választ, PTH 1–34 and PTH 3–34 hatását teszteltük az IL-6 promoter activitásra propranolol jelenlétében és hiányában. 100 AM propranolol szignifikánsan gyengítette a PTH 1–34- és PTH 3–34-stimulálta IL-6 promoter activitást (24B.ábra).

24.ábra. PTH szignálutak szerepe az IL-6 promoter aktivációjában.

A sejteket tranziensen

transzfektáltuk a -224/+11 bp IL-6 promoter kostrukcióval. (A) A transzfektált sejteket médiummal (control), PTH 1 – 34, PTH 3 – 34, PTH 1 – 31 vagy PTHrP-vel kezeltük 5 órán át (a: 10 nM). (B) A transzfektált sejteket 100 AM propranolol jelenlétében vagy hiányában kezeltük 10 nM PTH 1 –34 vagy 10 nM PTH 3 – 34 –el 5 órán át. Luciferase assay-t végeztünk. Az értékeket átlag ± SEM-ben fejeztük ki (n=3); xp < 0.05, ***p < 0.001 vs. control; + + +p < 0.001 vs. PTH 1 – 34; xxp < 0.01 vs. PTH 3 –34.

59

II.

A

kalcium

polimorfizmusainak

homeosztázisra vizsgálata

ható

genetikai

postmenopausális

faktorok

egészséges

és

osteoporotikus nőkben. A. A986S CaSR-t érintő polimorfizmus szerepe a csontanyagcserében 230 magyar osteoporotikus nő vizsgálatával. A

leggyakoribb

A986S

CaSR-t

érintő

polimorfizmus

szerepét

a

csontanyagcserében 230 magyar osteoporotikus nőt vizsgálva, azt találtuk, hogy a CaSR gén A986S polimorfizmusa nincs hatással a BMD-re. B. Az IRAP gén polimorfizmusa, illetve ennek összefüggése a csontok ásványianyag tartamával. Az IL-1ra gén polimorfizmusát az addig ismert legnagyobb beteganyagon vizsgálva azt találtuk, hogy egyik allélpár esetében sem található alacsonyabb BMD. C. A VDR gén BsmI polimorfizmus megoszlása a hazai populációban, valamint a VDR genotípusok és a csontok ásványianyag tartalmának összefüggése. Meghatároztuk a magyar populáció VDR gén BsmI polimorfizmus eloszlását, amely hasonló az európai és az észak-amerikai adatokhoz, de jelentősen eltér az ázsiai és dél-amerikai értékektől. A csonttömeg szempontjából kedvezőtlen BB genotípus 24.6%os hazai előfordulása az egyik legmagasabb a világon. A VDR gén BB allélpárjával rendelkező

személyek

lumbális

gerinc

ásványianyag

tartalma

szignifikánsan

alacsonyabb a többi genotípusban észlelhető értékekhez képest. Ugyanez nem volt kimutatható a combnyak és a radius vonatkozásában. . D. Az ER gén XP és PuvaI polimorfizmus és a csontok ásványianyag tartalmának összefüggése. Magyar osteoporosisos beteganyagunk vizsgálatával nem tudtunk összefüggést kimutatni a vizsgált polimorfizmusok és a BMD között.

60

III. Az ösztrogén csonthatásainak hatásmechanizmusa. A. Az ösztrogén és az ösztrogén receptorok szerepe a PTH indukálta IL-6 expresszió szabályzásában. PTH szignifikánsan fokozta a -109/+11-, -158/+11-, -224/+11-, és a teljes hosszúságú -779/+11-bp IL-6 promoter konstrukció aktivitását, de a -49/+11-bázispárú és a pGL konstukciójét nem (25.ábra). A 10000000

v e h i c le P TH ,1 0

-8

M

1000000 R LU

100000

10000 -779

-224

-15 8

-109

-49

P G L -L U C co n tro l

H U M A N IL - 6 - L U C

25.ábra. PTH hatása a -109/+11-, -158/+11-, -224/+11-, -779/+11-bp, -49/+11-bázispárú IL-6 promoter vagy a pGL-kontroll promoter konstrukció expresszióra tranziensen transzfektált UMR-106 sejteken (n =3 ).; RLU: relative luciferase units. Az értékeket átlag ± SEM-ben fejeztük ki ***p < 0.001 vs. kontroll.

A –244/+11 bp konstrukció esetén a PTH (10-13M-10-7M) fokozta a reporter aktivitását liganddózis-függő módon, a maximális aktivációs plateau kb 30 szoros (26. ábra).

61

B 10000000 v e h i c le P TH

***

1000000

**

R LU

100000

10000 10

-1 4

10

-1 3

10

-1 2

10

-1 1

10

-1 0

10

-9

10

-8

10

-7

P T H ,[M ]

26.ábra.

PTH (1-34) (10-14 - 10-7 M) hatása az

interleukin-6 expresszióra UMR-106 sejteken,

tranziensen transzfektálva a -224/+11 bp IL-6 promoter konstrukcióval. A sejteket PTH (1-34)-el (10-1510-7 M) 5 óráig kezeltük. RLU-relative luciferase units. N=6; Átlag  SEM *=p<0.05 vs. kontroll, **=p<0.01 vs. kontroll, ***=p<0.001 vs. kontroll.

Amennyiben a UMR-106 sejteket ERE-reporter és humán ER vagy ER expressziós konstrukciókkal tanszfektáltuk, az E2 (10-8M) ugyanolyan stimuláló hatást mutatott függetlenül az ER konstrukciótól (28.ábra). Az E2 nem okozott ERE-reporter konstrukció stimulációt azokon a UMR-106 osteoblast sejteken, melyekbe nem transzfektáltunk ösztrogén receptort (27.ábra), jelezve, hogy a sejtek nem rendelkeznek endogén ER aktivitással. A 6 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0

E TO H E

2 ,

1 0

-8

***

M

***

*** 4 0 0 0 0 0 0 R L U 3 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

n o re c e p to r

E R  

E R 

E R 

E R E -T K L U C

27.ábra. 17-estradiol (10-8 M) (E2) hatása az ERE-luc promoter konstrukció expressziójára UMR106 osteoblast sejteken, melyeket

humán ER, ER vagy mind kettővel, vagy egyikkel sem

transzfektáltunk. RLU-relative luciferase units. N=4; Átlag + SEM ***=p<0.001vs. kontroll.

62

Az ER expressziós plazmiddal transzfektált sejteken, az E2 (10-8M) és az ER szelektív ligand, 16-bromoestradiol (10-10M) stimulálta az ERE-reporter konstrukciót míg a szelectív estrogen receptor modulator (SERM), 4-OH tamoxifen (10-6M) és az ER-szelektív ligand genistein (10-10M) nem tudta stimulálni az ERE-reporter konstrukció aktivítását (28.ábra, bal oldal). Az ER expressziós plasmiddal transzfektált sejteken, az E2 és a genistein egyaránt stimulálta, míg a 16-bromoestradiol és a 4-OH tamoxifen nem stimulálta az ERE-reporter aktivítást (28.ábra, jobb oldal). E TO H E 2 ,1 0 -8 M

B 900000

***

800000 700000

***

4 - O H - T a m o x if e n , 1 0 -6 M 1 6  - B r o m o e s t r a d i o l, 1 0 G e n i s te i n , 1 0 -1 0 M

600000

-1 0

M

***

R L U 500000

***

400000 300000 200000 100000 0 H u m an E R 

H u m an E R 

28.ábra. 17-estradiol (10-8 M) (E2), a SERM 4-OH-tamoxifen (10-6M), az ER-specifikus ligand 16-bromoestradiol (10-10M), és az ER-specifikus ligand genistein (10-10M) hatása az ERE Luc promoter konstrukció expresszióra human ER vagy ER receptorokkal transzfektált. UMR-106 sejtekben. RLUrelative luciferase units. N=6; Átlag + SEM. ***p<0.001 vs. kontroll.

A –224/+11 bp IL-6 promoter konstrukcióval és ER receptorral transzfektált sejtekben a PTH (10-8M)-indukálta IL-6 promoter aktivitást szignifikáns módon (6090%) az E2

(10-10M-10-7M) gátolta (29.ábra középen). Ugyanakkor, az ER

receptorral transzfektált sejtekben, és 10-7M E2 volt szükséges a PTH-indukálta IL-6 promoter aktivitás szignifikáns (maximálás gátlás 50 %) gátlásának eléréséhez (30.ábra jobb oldalt).

Hasonló eredményt kaptunk alacsonyabb, PTH (10-12M) koncentráció

esetén is. Az E2 nem gátolta szignifikánsan a PTH-indukálta IL-6 promoter működését az ER-ral nem transzfektált sejtekben ( 29.ábra, bal oldalt).

63

1000000 900000 800000 700000 600000 R LU 500000

*

***

400000 300000 200000 100000 0 N O E TO H

E E E

2 2 2 2

H U M AN E R 

R E C E P TO R -

-

-

-

-

+

-

-

-

-8

M )

-

(1 0

-1 0

M )

-

(10

-9

-

(1 0

-8

M )

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

(1 0

-7

M )

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

P TH (1 0 E

+

M )

29.ábra

+

+

+

+

+

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

+

H U M AN E R 

-

-

+

-

-

-

-

-

+

+

+

-

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

+

-

-

+

-

-

-

-

-

+

-

-

+

-

+

+

-

-

-

-

17-estradiol (10-10-10-7 M) (E2) hatása a PTH (1-34) (10-8 M)-stimulálta -224/+11 bp IL-6

promoter konstrukció expresszióra humán ER vagy ER receptorokkal transzfektált UMR-106 osteoblast sejteken. RLU-relative luciferase units. N=6; Átlag + SEM, ***=p<0.001 vs. PTH egyedül. *=p<0.05 vs. PTH egyedül.

Az E2 gátló hatása a PTH-stimulálta IL-6 promoter konstrukció expresszióra 0.01ng-től 1ng-ig humán ER receptorokkal transzfektált UMR-106 osteoblast sejteken korrelált a transzfektált receptor pcDNS mennyiségével,annál nagyobb gátlóhatással, minél nagyobb volt az ER expressziós plasmid mennyisége (30.ábra). Hozzáadott E2 hiányában is, a legnagyobb mennyiségű ER receptorral transzfektált sejtekben kissé csökkent a PTH-stimulált IL-6 promoter activitás (30.ábra). Ezt a médiumban az ösztrégenmentesített közeg ellenére is fellelhető maradék E2 hatásának tulajdonítjuk.

64

E TO H E 2 , 1 0 -8 M P T H , 1 0 -8 M E 2/P TH , 1 0

A 1100000

-8

M

1000000 900000 800000 700000 R LU 600000 500000

*** ***

***

400000 *** 300000 200000 100000 0

n o r e c e p to r

100% pcD NA

90% pcD NA 10% hE R

60% pcD NA 30% pcD NA 40% hE R 70% hE R

100% hE R

30.ábra. 17-estradiol (10-8 M) (E2) hatása a PTH (1-34)-stimulálta –224/+11 bp IL-6 promoter konstrukció expresszióra különböző mennyiségű humán ER receptorral tarnszfektált UMR-106 sejteken. RLU-relative luciferase units. N=4; Átlag + SEM, ***=p<0.001 vs. PTH egyedül.

A 10ng ER plazmiddal transzfektált sejtek alacsonyabb bazális PTH választ és nagyobb E2 mediálta gátlóhatást mutattak, mint a 10 ng ER plazmiddal transzfektált sejtek (31.ábra). Együttes transzfekció 1ng ER és 9 ng ER expressziós plazmiddal E2 jelenlétében nagyobb gátlóhatást okozott, mint 10 ng ER expressziós plazmid egyedül (31.ábra). Együttes transzfekció 9ng ER és 1 ng ER expressziós plazmiddal nem befolyásolta az E2 gátló hatását a PTH-stimulálta IL-6 promoteren, összehasonlítva a 10 ng ER expressziós plazmiddal transzfektált sejtekkel (31.ábra).

65

B

150000

E TO H E 2,1 0

-8

M

P T H , 1 0 -8 M E 2/P T H ,1 0

125000

-8

M

*

100000 R L U 75000

***

50000

***

***

25000 0

10ng hE R 

1ng hE R  9ng hE R 

9ng hE R  1ng hE R 

10ng hE R 

31.ábra. 17-estradiol (10-8 M) (E2) hatása a PTH (1-34)-stimulálta –224/+11 bp IL-6 promoter konstrukt expresszióra különböző arányú humán ER és ER receptorokkal transzfektált UMR-106 sejtekben. N=4; Átlag + SEM, ***=p<0.001 vs. PTH egyedül *=p<0.05 vs. PTH egyedül.

Az ER-val transzfektált sejtekben, a PTH-stimulálta IL-6 promoter aktivitást 16-bromoestradiol gátolta, ugyanekkor az ER-val transzfektált sejteken hatástalan volt (32.ábra). Az ER-val transzfektált sejtekben, a genistein nem szignifikánsan csökkentette a

PTH-stimulálta IL-6 promoter aktivitást, ugyanekkor az

ER-vel

transzfektált sejteken tompította a PTH-stimulálta IL-6 promoter aktivitást (32 ábra). 3 0 0 0 0 0

E TO H E 2 ,1 0

2 7 5 0 0 0

-8

M

1 6  - B r o m o e s t r a d i o l, 1 0

2 5 0 0 0 0

G e n i s te i n , 1 0

-1 0

-1 0

M

M

2 2 5 0 0 0 2 0 0 0 0 0 **

1 7 5 0 0 0 R L U

**

1 5 0 0 0 0

***

1 2 5 0 0 0 1 0 0 0 0 0 7 5 0 0 0 5 0 0 0 0 2 5 0 0 0

P T H ,1 0

-8

0

M

-

-

-

-

+

+

+

N o re c e p to r

+

-

-

-

-

+

+

+

H u m a n E R 

+

-

-

-

-

+

+

+

+

H u m a n E R 

32.ábra 17-estradiol (10-8 M) (E2), az ER specifikus ligand 16--bromoestradiol (10-10 M), és az ER specifikus ligand genistein (10-10 M) hatása aPTH (1-34) stimulálta -224/+11 bp IL-6 promoter konstrukt expresszióra construct expression humán ER vagy ER receptorokkal tarnszfektált UMR-106 sejtekben. RLU-relative luciferase units. N=6; Átlag + SEM, ***=p<0.001 vs. PTH egyedül, **=p<0.01 vs. PTH egyedül.

66

Mivel ezeket az eredményeket heterogén rendszerben találtuk, u.i. humán receptorok, patkány sejtek, ezért a kísérleteket homolog rendszerben is megismételtük, patkány ER-t használva. A patkány ER és ER hasonló specificitású indukciót okozott az ERE-reporter konstrukción mint a humán receptorok (33.ábra); E2 és a 16bromoestradiol stimulálta a patkány ER-val transzfektált sejteket, míg az E2 és a genistein a patkány ER-val transzfektált sejteken okozott szignifikáns stimulációt. E TO H E 2 , 1 0 -8 M 4 - O H - T a m o x if e n , 1 0 -6 M 1 6  - B r o m o e s t r a d i o l, 1 0 G e n i s te i n , 1 0 -1 0 M

A 1250000

-1 0

M

*** ***

1000000

***

***

750000 R L U 500000

250000

0 R at E R 

R at E R 

33.ábra. 17-estradiol (10-8 M) (E2), a SERM 4-OH-tamoxifen (10-6M), és az ER-specifikusligand 16--bromoestradiol (10-10M), és az ER-specifikusligand genistein (10-10M) hatása az promoter konstrukció expressziójára

ERE Luc

patkány ER vagy ER receptorokkal transzfektált UMR-106

sejtekben. RLU-relative luciferase units. N=6; Átlag + SEM. ***p<0.001 vs. kontroll.

A patkány ER expressziós plazmiddal transzfektált sejtekben, az E2 és a 16bromoestradiol gátolta a PTH-stimulálta IL-6 promoter aktivítást (34.ábra), hasonlóan a humán ER-hoz. Ugyancsak a humán ER-hoz hasonlóan, a patkány ER expressziós plazmiddal transzfektált sejtekban, az E2 és a genistein csökkentette a PTH-stimulálta IL-6 promoter aktivítást (34.ábra).

67

B

E TO H E 2 , 1 0 -8 M

1 6  - B r o m o e s tr a d i o l, 1 0 - 1 0 M G e n i s te i n , 1 0 - 1 0 M

300000 275000 250000 225000 200000

RLU

*

175000 150000

***

**

125000 100000 75000 50000 25000 0 P T H , 1 0 -8 M

-

-

- + + R at ER 

+

+

-

-

-

-

+

+

+

+

R at ER 

34.ábra. 17-estradiol (10-8 M) (E2),a SERM 4-OH-tamoxifen (10-6M), az ER-specifikus ligand 16-bromoestradiol (10-10M), és az ER-specifikus ligand genistein (10-10M) hatása a PTH (1-34)-stimulálta -224/+11 bp IL-6 promoter konstrukció expresszióra patkány ER vagy ER receptorokkal transzfektált UMR-106 sejtekben. RLU-relative luciferase units. N=6; Átlag + SEM. ***p<0.001 vs. PTH ehyedül, **=p<0.01 vs. PTH egyedül, *=p<0.05 vs. PTH egyedül.

B. Az ösztrogén hatása a génexpresszióra egér modell felhasználásával. A petefészek eltávolítás hatására a vizsgált 3200 gén közül 1038 esetében találtunk szignifikáns intenzitásbeli eltérést, melyből 6.7 % mutatott expressziós különbséget: 30 gén szignifikáns túlműködést, míg 28 gén szignifikáns alulműködést. A változó expressziójú gének közül azokra fókuszáltunk, melyek szignifikánsan változtak az ovariectomizált, és az ösztrogén pótlásban részesült ovariectomizált egerek csontjaiban: 17 szignifikánsan csökkenten (3A táblázat) és 18 szignifikánsan fokozottan kifejeződő gént találtunk ( 3B táblázat) az EST-ket figyelmen kívül hagyva. Munkánk során kimutattunk 6 új, a csontanyagcsere vonatkozásában eddig nem ismert ösztrögén szabályzás alatt álló gént: L1cam, és non-muscle tropomyosin-5, cathelin-like protein, heparin cofactor II, protein synthesis elongation factor Tu, small GTP-binding protein Rab1a.

68

Kifejezett eltérést találtunk a sejt adhéziót és a sejt szerkezetet meghatározó fehérjéket kódoló génekben. Ezek között a cathelin-like protein, L1cam és a non-muscle tropomyosin-5 kifejeződése mutatott ellentétes irányú változást az ERT hatására. Valósidejű RT-PCR technikával ezt változást szintén megerősítettük. Az ösztrogén szabályzást mutató gének egy másik csoportjának a jeltovábbító és a transzkripciós szabályzásban lehet szerepe. A kis GTP-kötő fehérje Rab1a fokozott, míg a Rab3b gén csökkent kifejeződést mutatott OVX hatására. Ezek a változások csökkentek ösztrogén kezelésre. A Rab1a gén esetén ez az első alkalom, hogy expresszióját a csontban is kimutattuk. A két zinc-finger fehérje (288 és a Kruppel-type zinc finger, C2H2) és a CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) expressziója csökkent míg egy másik zincfinger fehérje 148 kifejeződése fokozódott OVX hatására, azonban ERT hatására csak zinc-finger protein 288 gén expressziója normalizálódott. Négy, az ioncsatornákat vagy receptoraikat kódoló gén kifejeződése csökkent OVX hatására, azonban ezek közül csak a band 3 anion cseréló fehérje és a TSH receptor gének kifejeződése nem változott ERT hatására. Elsőként mutattuk ki, hogy az N-methyl-D-aspartate-(NMDA)-típusú glutamate receptorok expresszálódnak az egér csontban. OVX hatására csökkent és fokozott kifejeződésü

széleskörű funkciót betöltő gén kifejeződését is kitudtunk

mutatni. Ezek között a basigin, phospholipáz D, vascular non-inflammatory molecule 3, mitochondrial creatine kinase, mafG kifejeződése csökkent, míg a COL1A1, profilin 1, cystatin 3, heparin cofactor II, heat shock protein 86 kDa, fibroblast growth factor intracellular binding protein (FGF-IBP), Dlk1-like homolog, protein synthesis elongation factor Tu, hnrp A2/B1 gének kifejeződése nőtt. Az FGF-IBP gén esetén az ösztrogén pozitív hatását QRT-PCR technikával nem tudtuk igazolni. Az A/B csoportú hnRNP fehérjék

jelenlétét az egér csontba elsőként mutattuk ki.

A mikroarray

kisérletünkben eltérő expressziót mutató gének közül hatot QRT-PCR technikával is megvizsgáltunk (4.táblázat). Ezen gének nagy része esetén az expressziós különbséget igazolni tudtuk, kivéve a COL1A1 és a basigin génét. Hat további, ismerten ösztrogén szabályozott, csontspecifikus transzkripciójú gént is vizsgáltunk. A TNFR p55, TGF-1 és az IL-1 exon 4 gének expressziója OVX hatására kifejezetten csökkent, míg ERT hatására normalizálódott. A matrix Gla expresszió OVX, vagy ERT hatására sem változott. Két további gén a RANKL és az OPG esetében szignifikáns expresszió

69

fokozódást detektáltunk OVX után, míg EST hatására ez csökkent, vagy normalizálódott. 3A.táblázat. OVX és ERT hatására csökkent expressziót mutató gének az egér csontban Funkció

Gén termék

Acc. No.

OVX/CTR

SD

EST/CTR

SD

Sejtadhézió,

L1cam L1 cell adhesion molecule

AA220484

-1.96

0.03

-1.55

0.01

Fibroblast tropomyosin 4

AW544913

-2.25

0.21

-1.28

0.11

Ioncsatorna,

Sim. retinoid X receptor interact.

AA242625

-2.98

0.05

-1.89

0.01

receptorok

prot. 15 band 3 anion exchange protein

AA271588

-2.78

0.05

-1.25

0.18

NMDA receptor Glutamate-binding

AA273669

-2.45

0.07

-3.01

0.06

hormone

AW545419

-2.47

0.16

-1.27

0.11

Transzkripciós

CCAAT/enhancer binding protein

AA271223

-2.63

0.11

-2.44

0.16

faktorok

(C/EBPα) zinc finger protein 288

AK038731

-2.70

0.08

-1.54

0.05

Kruppel-type zinc finger (C2H2)

AW540949

-2.45

0.12

-3.18

0.12

Prot. phosphatase 1, reg. Subunit 7

AA289517

-2.52

0.21

-1.92

0.17

small GTP binding protein Rab3B

AA270037

-2.20

0.15

-1.23

0.11

Basigin

AW544934

-2.19

0.22

-2.14

0.15

Phospholipase D

W18362

-2.36

0.26

-1.83

0.07

Vascular non-inflam. Mol. 3

AA250662

-2,47

0.07

-1.28

0.23

Mit. kreatine kinase

W18057

-2.69

0.22

-1.35

0.32

thyroid hormone responsive protein

AW536209

-2.47

0.11

-1.28

0.16

mafG

AW540966

-2.11

0.15

-2.09

0.05

-2.50

0.07

0.04

-1.08

0.19

sejtstruktúra

subunit Thyroid

stimulating

receptor

Szignál transzdukció Egyéb

Hipotetikus, EST

Hypothetical protein

AA276251

-2.56

EST

AA240739

-2.94

EST

AA237331

-2.51

0.07

-1.91

EST

W14184

-2.19

0.09

-2.07

0.08

EST

AA065706

-2.08

0.17

-1.54

0.23

EST

AA073606

-2.04

0.08

1.20

0.12

Az adatokat az átlag-szeres ± SD eltérésként adtuk meg a CTR-hez képesti növekedés ( pozitív értékek), vagy csökkenés ( negatív érték)

70

3B.táblázat.

OVX és ERT hatására fokozott expressziót mutató gének az egér csontban

Funkció

Gén termék

Acc. No.

OVX/CTR

SD

ERT/CTR

SD

Sejtadhézió,

Nonmuscle tropomyosin 5

AW545241

2.33

0.21

1.38

0.14

sejtsrtuktúra

Tubulin beta-5 chain

W16254

2.53

0.42

1.31

0.13

Cathelin-like protein

W17771

3.61

1.21

1.22

0.55

Cell division cycle 42

AA266975

5.42

2.11

1.75

0.74

Small GTP-binding protein RAB1A

AA410005

2.65

0.29

1.70

0.18

Transzkripciós

zinc finger prot. 148

AW536295

2.35

0.31

1.95

0.81

faktorok, DNS kötő

histone H3.3A

AA275906

4.51

1.13

2.54

0.41

fehérjék

histone H2A.Z

AA466087

2.12

0.16

1.56

0.19

replication protein A

AA266114

2.48

0.38

1.21

0.20

Szignál transzdukció

Egyéb

Hipotetikus, EST

COL1A1

AA073604

2.04

0.27

1.44

0.16

profilin 1

AA409654

2.07

0.11

-1.23

0.09

Cystatin 3

W78651

2.51

0.41

1.81

0.24

Heparin cofactor II

AA253700

4.05

1.80

1.24

0.23

Heat shock pr. 86 kDa

AW536206

2.05

0.22

-1.36

0.19

FGF-IBP

W18449

3.41

1.41

2.71

1.31

Dlk1-like homolog

AA245029

3.95

1.08

1.91

0.46

Protein synthesis elongation factor Tu

AA259551

3.78

0.88

2.10

0.25

hnrp A2/B1

W12375

3.19

1.01

1.89

0.19

Hypotethical protein

AA238618

2.13

0.31

1.35

0.07

EST

AA275141

2.51

0.58

1.83

0.26

EST

AW542394

2.15

0.45

1.36

0.02

EST

AW541480

2.18

0.30

-1.06

0.02

EST

AW539670

2.44

0.32

1.32

0.23

Az adatokat az átlag-szeres ± SD eltérésként adtuk meg a CTR-hez képesti növekedés ( pozitív értékek), vagy csökkenés ( negatív érték).

71

4.táblázat. Ösztrogén szabályzás alatt álló gének konfirmálása QRT-PCR technikával egér csontban

OVX/CTR

ERT/CTR

Ösztrogén

SD

P

-3.43

1.51

0.049

Nem

0.009

-1.23

0.24

0.232

Igen

0.40

0.010

-1.07

0.33

0.423

Igen

3.60

1.09

0.019

1.41

0.49

0.238

Igen

AW544934

3.78

1.14

0.105

2.24

0.56

0.029

Nem

FGF-IBP

W18449

4.14

1.32

0.018

2.36

0.71

0.033

Nem

Matrix Gla

D00613

1.80

0.43

0.043

-1.52

0.39

0.132

Nem

SD

p

-4.72

1.82

0.029

W17771

2.17

0.28

L1cam

AA220484

-2.58

Non-muscle

AW545241

Basigin

Géntermék

Acc. No.

COL1A1

W89883

Cathelin-like

QRT-PCR

QRT-PCR

hatás

protein

tropomyosin 5

TNFR p55

X57796

-3.48

1.03

0.017

-1.62

0.42

0.081

Igen

TGF-β1

AJ009862

-27.1

4.39

0.023

-7.14

1.67

0.005

Igen

IL-1 exon 4

L32838

-3.73

0.63

0.006

-2.24

0.26

0.067

Nem

RANKL

AF019048

2.46

0.35

0.008

1.04

0.39

0.500

Igen

OPG

U94331

9.78

2.76

0.006

1.51

0.42

0.144

Igen

Az adatokat az átlag-szeres ± SD eltérésként adtuk meg a CTR-hez képesti növekedés ( pozitív értékek), vagy csökkenés ( negatív érték).

C. Az

ösztrogén

hiányában

szignifikánsan

változó

csontszöveti

expressziót mutató gének meghatározása, illetve a vizsgált gének közötti kapcsolatok definiálása humán csontban. Munkánkban 29 gén esetén találtunk szignifikánsan változó expressziós mintázatot postmenopausás nem osteoporoticus nők csontszövetében a premenopausás kontrollmintákéhoz képest. 28 gén kifejeződése növekedett a menopauzát követően, köztük az extracelluláris mátrix fehérjéket és emésztőenzimeket kódoló gének, TGFB/BMP jelátviteli útvonalon szabályozódó gének, transzkripciós faktorok, növekedési faktorok és egyéb, a csontanyagcserével kapcsolatos kandidáns gének, míg egyetlen gén átíródása csökkent ösztrogén hiányában. A 5. táblázatban foglaltuk össze a szignifikánsan eltérő kifejeződést mutató gének expressziós változására vonatkozó adatait (RQ POST / RQ PRE) 17 nem osteoporoticus nő csontszövetében. A táblázatban szereplő géneket funkcionális osztályozást követően tüntettük fel. Hét kollagén molekula, három nem-kollagén típusú

72

extracelluláris mátrix (ECM) molekula (MGP, BGLAP, FN1) és két szerves mátrix bontó enzim (MMP13, BMP1) génkifejeződési mintázata szignifikánsan nagyobb volt a postmenopausalis stádiumú nem osteoporoticus csontban. Postmenopausas nőkben a közös TGFB/BMP jelátviteli hálózatba tarozó öt gén (BMPR1A, TGFB2, TGFB3, TGFBR2, SMAD4) nagyobb transzkripciós aktivitását észleltük. Ugyanebben a csoportban két nélkülözhetetlen osteoblast specifikus transzkripciós faktor (RUNX2, SP7) és újabb kettő, amely a Wingless útvonalban (TCF7L2) illetve a porcsejtek érésében (SOX9) játszik szerepet, megnövekedett génexpressziós szintet mutatott. Két MAPK (mitogénaktivált protein kináz) kaszkád által szabályozott növekedési faktor génje (PDGFA, FGFR1), valamint két osteoclast stimuláló faktor (TNFSF11/RANKL, IL6) és egy, a differenciálódott osteoblastokat jelző molekula (ALPL) génátíródása is felerősödött a postmenopausas csoportban. Az expressziós különbséget mutató gének közül szinifikáns ösztrogén szabályzást az IL-6, TNFα, IL-1β, IL-1RAP, RANKL és az OPG mutatott, a két ER mellett. Az IGSF4 és a TRIB2 gének kifejeződését elsőként detektáltuk nem osteoporoticus humán csontszövetben. Azt találtuk, hogy ezek a gének nagymértékben expresszálódnak a postmenopausas csoportban. Az ENO1/MBP1 esetén szignifikánsan csökkent géntranszkripciós szintet figyeltünk meg.

5. táblázat: Szignifikánsan megváltozott expressziót mutató 29 gén kvantitatív valósidejű RTRCR adatainak összefoglalása.

73

Expressziós

ECM komponensek és bontó enzimek

ABI Assay ID

a

b

b

arányokc

p értékekd

8,07

0,02

Gén szimbólumok

Gén nevek

Hs00156568_m1

COL2A1

Collagen type II alpha 1

Hs00164103_m1

COL3A1

Collagen type III alpha 1

5,62

0,02

Hs00609088_m1

COL5A1

Collagen type V alpha 1

9,60

0,03

Hs00169768_m1

COL5A2

Collagen type V alpha 2

4,82

0,02

Hs00156680_m1

COL9A1

Collagen type IX alpha 1

5,63

0,04

Hs00189184_m1

COL12A1

Collagen type XII alpha 1

5,30

0,02

Hs00266332_m1

COL15A1

Collagen type XV alpha 1

6,59

0,01

3,28

0,02

Matrix gamma-carboxyglutamate (gla) Hs00179899_m1

MGP

protein Bone gamma-carboxyglutamate (gla)

Hs01587813_g1

BGLAP

protein, osteocalcin

5,52

0,01

Hs00277509_m1

FN1

Fibronectin 1

4,02

0,01

Hs00233992_m1

MMP13

Matrix metalloproteinase 13

3,70

0,02

Hs00196183_m1

BMP1

Bone morphogenetic protein 1

3,12

0,04

Hs00831730_s1

BMPR1A

6,16

0,01

TGFB/BMP útvonal

Bone morphogenetic protein receptor type IA

Hs00234244_m1

TGFB2

Transforming growth factor beta 2

3,42

0,04

Hs00234245_m1

TGFB3

Transforming growth factor beta 3

3,70

0,002

Hs00234253_m1

TGFBR2

3,26

0,03

2,59

0,002

Transforming

growth

factor

beta

receptor II SMAD, mothers against DPP homolog

Hs00232068_m1

SMAD4

4 (Drosophila)

Hs00361415_m1

ENO1 / MBP1

protein

0,53

0,005

Hs00231692_m1

RUNX2

Runt-related transcription factor 2

2,76

0,01

Hs00165814_m1

SOX9

SRY (sex determining region Y)-box 9

9,35

0,04

Hs00541729_m1

SP7

Sp7 transcription factor (osterix)

5,65

0,04

3,02

0,01

Transzkripciós faktorok

Enolase 1 / C-myc promoter-binding

Transcription factor 7-like 2 (T-cell Hs00181036_m1

TCF7L2

Hs00234994_m1

PDGFA

polypeptide

2,81

0,04

Hs00241111_m1

FGFR1

Fibroblast growth factor receptor 1

3,85

0,005

Hs00243519_m1

TNFSF11

superfamily member 11 (RANKL)

21,57

0,01

Hs00758162_m1

ALPL

Alkaline phosphatase,liver/bone/kidney

2,48

0,02

Platelet-derived growth factor alpha

Növek edési

specific)

faktor ok

Egyéb

Tumor

necrosis

factor

(ligand)

Hs00174131_m1

IL6

Interleukin 6

7,28

0,02

Hs00204937_m1

IGSF4

Immunoglobulin superfamily member 4 3,94

0,02

Hs00222224_m1

TRIB2

Tribbles homolog 2 (Drosophila)

0,02

2,10

Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assay azonosítási számok. A humán gének általánosan elfogadott illetve használt nevei és szimbólumai a “Gene Cards” alapján (www.genecards.org). Expressziós arányok (RQ POST / RQ PRE)., Mann-Whitney U teszt valószínűségi értékei. A géneket funkcióik és a csontanyagcserében betöltött fiziológiás szerepük szerint csoportosítva tüntettük fel.

74

Diszkriminancia premenopausas

adatelemzést

csoportot

alkalmaztunk,

multidimenzionális

térben

hogy

a

postmenopausas

elkülönítsük

a

és

csontszöveti

génexpressziós adataik alapján, illetve meghatározzuk azokat a géncsoportokat, amelyek a legnagyobb diszkriminációs képességgel rendelkeznek. Kilenc génhalmazt válogattunk a többváltozós statisztikai analízishez (6. táblázat). Az organikus ECM molekulákat (12 gén) és a közös TGFB/BMP útvonal elemeit (5 gén) tartalmazó két csoport szignifikánsan eltérően kifejeződő géneket tartalmazott (p ≤ 0,05); ezeket a Mann-Whitney teszt eredményei alapján válogattuk. Számos csoportot a különböző jelátviteli útvonalak kategorizálásával alakítottunk ki, mint a kanonikus TGFB/activin/nodal útvonal (12 gén), BMP kaszkád (9 gén), WNT jelátviteli hálózat (6 gén), növekedési faktorok, melyek MAPK típusú jeltovábbítás során szabályozódnak (9 gén), illetve olyan gének csoportjait, melyek az ösztrogén-receptor alfa (ER-alfa) (13 gén) vagy az ösztrogén-receptor béta (ER-béta) (16 gén) ellenőrzése alatt állnak.

ER-alfa jelátvitel Gének neve MMP9 IGF1

Korr. KV

ER-béta jelátvitel Gének neve

Korr. KV

0.250

COL7A1

0.041

0.079

VEGF

-0.040

VEGF

-0.042

BMP4

-0.154

BMP4

-0.162

TNF

-0.175

TGFB1

-0.188

TGFB1

-0.179

CTNNB1

-0.192

COL11A1

-0.309

BMP2

-0.384

TWIST1

-0.371

OPG

-0.385

SPP1

-0.412

MMP13

-0.459

BMP3

-0.426

PDGFA

-0.461

PDGFA

-0.439

TGFB2

-0.545

SOX9

-0.448

RUNX2

-0.631

FGF1

-0.480

TGFB3

-0.740

TGFBR2

-0.504

ALPL

-0.513

TGFB2

-0.525

RUNX2

-0.601

6.táblázat: ER-béta és alfa által szabályozott gének csoportja. A megmaradt csoport hét, a zsíranyagcserében érintett gént tartalmazott. Az ER-béta által szabályozott gének csoportja rendelkezett a legnagyobb megkülönböztető erővel, amely egyértelműen szétválasztotta a post- és premenopausas csoportokat. Az ECM fehérjéket kódoló gének csoportja és a TGFB/activin/nodal szabályozási útvonalhoz kapcsolódó gének szintén erős korrelációt mutattak a kanonikus változóval és a vizsgált nem osteoporotikus nők 75

két csoportjának határozott szétválasztását tették lehetővé. A növekedési faktorok és a BMP kaszkád génjei gyengébb elkülönítő erővel bírtak (35.ábra).

POST PRE

BMP útvonal

WNT útvonal

TGFB/activin/nodal útvonal

Növekedési faktorok/MAPK útvonal

Lipid anyagcsere

ER-béta jelátvitel

ER-alfa jelátvitel

TGFB/BMP útvonal (p ≤ 0.05)

ECM (p ≤ 0.05) -12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

14

16

35.ábra: Tíz postmenopausas nem osteoporotikus (POST, fekete rombusz) és hét premenopausalis nem osteoporotikus (PRE, üres rombusz) nő csontszöveti génexpressziós mintázatának diszkriminancia analízise.

A legtökéletesebb szétválás az ER-béta által szabályozott gének esetén állapítható meg. Szintén nagyon éles különbség tapasztalható három géncsoport, az ECM (p ≤ 0,05), TGFB/activin/nodal útvonal és növekedési faktorok/MAPK útvonal esetén is.

IV. A pajzsmirigyhormonok szerepe a csontanyagcserében. A. A trijodtironinnak, a parathormonnak és az ösztrogénnek az IGF-I promoterére gyakorolt hatása.

76

A T3 sem a humán, sem a patkány IGF-I promoteren nem mutatott szignifikáns hatást (36.ábra).

A parathormon szignifikánsan stimulálta a promotert, míg az ösztrogén mindkét

hormon hatását modifikálta, míg önmagában stimulálta a promotert (37.ábra).

325000

IG F -I p ro m o ter

300000

T 3 [1 0 -8 M ]

275000 250000 225000

RLU

200000 175000 150000 125000 100000 75000 50000 25000 0

-4 4 7 0

-1 2 0 8

-1 0 3 3

-8 3 4

-5 0 6

-4 5 0

-1 8 4

-1 2 6

-4 5 0 RAT

H U M AN

36.ábra. A T3 egyik IGF-I promoter konstrukció aktivitását sem fokozza. v. E TO H

**

90000

E 2 [1 0 -8 M ]/ 5 h P T H (1 -3 4 ) [1 0 -8 M ]/ 5 h

80000

P T H (3 -3 4 ) [1 0 -8 M ]/ 5 h

70000

RLU

60000 50000 40000 30000 20000 10000 0

4470

1208 1033

834

506

450

184

126

37.ábra. A PTH és az E2 stimuláló hatása a humán 1208 bp IGF-I promoteren.

77

450 RAT

h IG F -I(1 2 0 3 b p ) P T H (1 -3 4 ) [1 0 -1 1 M ]

225000

P T H (1 -3 4 ) [1 0 -8 M ]

200000

P T H(3 -3 4 ) [1 0 -1 0 M ]

175000

RLU

150000

# ##

125000 100000 75000 50000 25000 0

co n tro l

5 h ou r

24 h our

38.ábra. A PTH időföggő, bifázisos hatása az 1208 bp IGF-I promoteren.

B. A trijodtironin, a PTH, az ösztrogén és az IL-1β IL-6 gén promoterre gyakorolt hatása. Kimutatuk, hogy a T3 önmagában nem, azonban IL-1β-val együtt szignifikánsan jobban fokozza az IL-6 promotert, mint az IL-1β magában. A stimuláló hatás azon konstrukción érvényesül, amely tartalmaz NFKB elemet (-158 bp-tól nagyobb promoter szakasz), amely nélkülözhetetlen az IL- 1β stimulációhoz.(39.ábra)

T3 (10-8 M) és IL-1(10 ng/ml) az IL-6 promoter konstrukciókra

39.ábra: T3 és IL-1β hatása az IL-6 promoterre.

78

A fenti vizsgálati eredményünket MC3T3 sejteken is teszteltük, ahol kimutattuk, hogy az IL-1β/T3 kezelés szignifikánsan emeli az IL-6 cDNS és mRNS szinteket is.(40.ábra)

PCR MC3T3 cDNS felhasználásával, a sejteket 24 órán át stimuláltuk T3 (10-8 M) és IL-1b (10 ng/ml) IL-6: 638 bp, 18S: 488bp

RT-PCR MC3T3 mRNS felhasználásával, a sejteket 24 órán át stimuláltuk T3 (10-8 M) és IL-1b (10 ng/ml) IL-6: 638 bp, 18S: 488bp

40.ábra a: PCR MC3T3 cDNS felhasználásával, a sejteket 24 órán át stimuláltuk T3 (10-8 M) és IL-1b (10 ng/ml) IL-6: 638 bp, 18S: 488bp, b: RT-PCR MC3T3 mRNS felhasználásával, a sejteket 24 órán át stimuláltuk T3 (10-8 M) és IL-1b (10 ng/ml) IL-6: 638 bp, 18S: 488bp

Amennyiben az IL-6 promotert T3 és PTH együttes jelenlétében situmáltuk, a promoter

aktivitása szignifikánsan nagyobb volt, mint PTH jelenlétében. Amennyiben

ösztrogén is tartalmazott a kezelés a T3/PTH stimuláló hatását azt kevésbé volt képes csökkenteni, mint a PTH önmagában okozta stimulációt. (41.ábra)

79

41. ábra. PTH, E2 és T3 (10-8M) hatása az IL-6 promoterre ER jelenlétében. C. A szérum és a mononukleáris sejtkúltúrák felülúszójának TNF-α tartalma csontvesztést okozó hyperthyreosisban, valamint ennek összefüggése a csontdenzitással. Kimutattuk, hogy a csökkent BMD-vel járó hyperthyreosisban a betegek szérumában, illetve a vérükből szeparált mononucleáris sejtek felülúszójában mind az immunoreaktív, mind a bioaktív TNF-α mennyisége szignifikánsan nagyobb függetlenül a hyperthyreosis szindróma patogenezisétől . A szérum TNF-α -szintje szignifikánsan emelkedett volt a hyperthyreosisos csoportban a kontrollhoz képest. A szérumban az iTNF-α - (72,2±9,1 pg/ml) és a bTNF-α - (133±27,3 pg/ml) szinteket is emelkedettnek találtuk a kontrollokhoz képest (13,2±2,8 pg/ml és 21,5±5,3 pg/ml) (p<0,01) (42,43.ábra). A toxikus adenomás és a Basedow-kóros betegek TNF-α -szintjében nem mutatkozott szignifikáns különbség. Egyik csoportban sem észleltünk korrelációt a TNF-α -koncentrációk és a pajzsmirigyhormonszintek között. A mononukleáris sejtek bazális iTNF-α - és bTNF-α-termelése hyperthyreosisban nagyobb volt a kontrollokénál (iTNF-α: 562±17,3 versus 98,6±7,6 pg/106 sejt, p<0,01; bTNF-α: 345±43,5 versus 87,4±6,2 pg/106 sejt, p<0,05) (44,45.ábra). A két hyperthyreosisos csoport között nem találtunk szignifikáns különbséget. A PHA-stimulus mind a kontroll-, mind a hyperthyreosisos betegeknél szignifikánsan emelte a bTNF-α termelést (301±51,3 versus 652±62,2 pg/106 sejt; p<0,05).

42.ábra.

Immunoreaktív

TNF-alfa-szint 43.ábra. Bioaktív TNF-alfa-szint hyperthyreosisos

hyperthyreosisos betegek szérumában. Az értékeket betegek szérumában. Az értékeket átlag ± SE-ben átlag ± SE-ben fejeztük ki; * p<0,01

fejeztük ki; * p<0,01

80

44.ábra. A perifériás vér mononukleárissejt- 45.ábra. A perifériás vér mononukleárissejtfelülúszójának immunoreaktív TNF-alfa-termelése felülúszójának bazális és PHA-stimulált bioaktív hyperthyreosisos betegeknél. Az értékeket átlag ± TNF-alfa-termelése hyperthyreosisos betegeknél. Az SE-ben fejeztük ki; * p<0,01

értékeket átlag ± SE-ben fejeztük ki; * p<0,05

A BMD az összes mérési ponton szignifikánsan alacsonyabbnak bizonyult a hyperthyreosisos betegeknél, a két hyperthyreosisos csoport között nem volt szignifikáns különbség. A szérum TNF-α-szint és a BMD között egyik csoportban sem találtunk korrelációt.(7.táblázat) 7. táblázat. A csont ásványianyag-tartalma hyperthyreosisos betegeknél

Az adatok átlagértékek ± SEM, *: p<0,01 versus kontroll

D. Hyperthyreosisos betegek szérumában az IGF-I és IGFBP-3, -4, és -5 koncentrációk, és ezek összefüggése a BMD-vel, valamint ezek változása a terápia során. Kimutattuk, hogy a hyperthyreosisos betegek szérum IGF-I szintje magasabb a kontrollokéhoz viszonyítva. Pozitív lineáris korrelációt találtunk a szérum IGF-I koncentrációk és a radius BMD között. Ugyanakkor emelkedett szérum IGFBP-3 és -4 mellett normális IGFBP-5 értéket találtunk hyperthyreosisban. Ezek az eltérések normalizálódtak 1

81

éves thyreostatikus kezelés után. Az eredetileg csökkent BMD a kezelés során- a fenti paraméterek normalizálódásával párhuzamosan- emelkedést mutatott).

5. MEGBESZÉLÉS I. A parathormon szerepe a csontanyagcserében A szisztémás kalciumszintet szabályzó parathormon a kalciumanyagcsere és a csontrendszer homeosztázisának fenntartásában szignifikáns szerepet játszik. A PTH klasszikus hatásait a PTH/PTHrelated-peptid receptor, a G-proteinhez kapcsolt receptorok B alcsaládjának tagjai közvetítik.(46.ábra) [35]

82

46. ábra Az NHERF szabályozta szignálutak. A felsőpanel a legtöbb sejtben domináns cAMP szignálutat mutatja. Az alsó panel azt mutatja, hogyan kapcsolja át a NHERF a cAMP dominanciát a PLC dominanciára.

Állatkísérletek és human vizsgálatok bizonyították, hogy az intermittáló, naponta kis dózisban adott parathormon hatékonyan serkenti a szivacsos csontállomány képződését. [36,37] A folyamatos, intenzív hormonhatás (például súlyos hyperparathyreosisban) ellenben a csontanyagcsere és a csontreszorpció fokozásával csökkenti a csonttömeget. [35,36]

)

Kimutatták, hogy a PTH aminoterminális, 34 aminosav alkotta szekvenciájának működése azonos a teljes hormonéval, azaz teljes mértékben aktiválja a PTH1R jelzõfunkcióit. [38] A PTH1R aktiválása többféle jeltovábbító rendszert is bekapcsol, többek között a Gsα-protein függõ cAMP/proteinkinase-A, illetve PLC-függõ és PLC független proteinkinase-C rendszereket, továbbá az intracelluláris kalcium szintet is emeli. [37,40,41]

E

jelzőrendszerek és a PTH anabolikus/katabolikus hatásainak kapcsolata élénk érdeklõdés tárgya, mert a specifikus PTH-szignálok és a csontsejtek mûködéseinek változásai közötti összefüggések

teljes

megismerése

után

tökéletesebb

gyógyszerek

fejleszthetõk

csontbetegségek (például az osteoporosis) kezelésére. A PTH(1-34) aminosav-szekvencián belül, több kulcsfontosságú ligand-tartományról derítették ki, hogy a PTH1R mely jelzőműködéseit aktiválja. Hosszú ideig azt gondoltuk, hogy a PTH anabolikus hatását a cAMP közvetíti. [36,37]

)

Azonban az IGF növekedési faktor, - amely a PTH anabolikus 83

hatásánák közvetítésében szerepet játszik - promoterének szabályzását vizsgálva kimutattuk, hogy a PTH bifázikus, időfüggő módon szabályozza azt. [42] Rövid ideig tartó stimulus a promoter aktivitását fokozza, míg elhúzódó hatás a promotert gátolja, és e hatás kialakulásában a PKC rendszernek is van szerepe. Mások a PTH1R-ek közvetítésével zajló PKC jeltovábbításnak – mindenekelõtt a ligand PTH(29-34) szakasz által stimulált PKC-nek – szerepet tulajdonítottak az osteoblastikus csontképzés elindításában is. [38,43]

Ugyanakkor

a PTH a korral járó csontvesztés fő mediátora , és PTH túltermeléssel járó állapotokban a fokozott csontvesztés oka. [39,44] A PTH szabályozta csontreszorpció sejtszintű szabályzása nem teljesen ismert. Annak ellenére, hogy a PTH a legfontosabb hormonális serkentője a reszorpciós folyamatnak, receptora azonban csak az osteoblastok felszínén/magjában van, így csak közvetve, az osteoblastok citokin-termelésének serkentésével IL-1, IL-6, IL-11, illetve a RANKL fokozott és az OPG csökkent expressziójával hat az osteoclastokra. Számos adat szól az IL-6 szerepe mellett a PTH stimulálta osteoclastogenesisben. [45,46]

)

A PTH fokozza

mind az IL-6 messenger RNS (mRNS) expressziót mind számos osteoblast sejtvonal IL-6 szekrécióját. [47]

Az IL-6 expresszió minden nagy szignáltranszdukciós útvonal mediálja,

különböző protein kinázok, és másodlagos hírvivő utak, köztük az intracelluláris kalcium, protein kináz C (PKC), kettős-láncú RNS-függő kináz és a ciklikus adenozin monofoszfát (cAMP) a legfontosabbak. [48] A PTH a cAMP és PKC másodlagos jelátviteli rendszereken keresztül szabályozza az IL-6 szekréciót. Munkacsoportunk korábbi adatai szerint PKC gátló forbolészter vagy kalfosztin C előkezelés kivédte az osteoblastok PTH és tumor necrosis factor alfa (TNF-α) stimulálta IL-6 termelését, míg IL-I tekintetében az adatok ellentmondásosak voltak. [49] Munkánkban a PTH függő jelzőrendszerek szerepét vizsgáltuk oszteoblasztban. Egyrészt a PKC jelzőrendszer, másrészt a PTH és egyébb citokinek ( TNF,IL-1) IL-6 szekréciót fokozó hatásaiban résztvevő jelzőrendszer szerepét vizsgáltuk. Kimutattuk, hogy a PKC gátlása mind a PTH, mind a TNF és IL-1 stimulálta IL-6 expresszió gyengüléséhez vezet. Korábban munkacsoportunk és mások is kimutatták, hogy a PKC izoenzimek ,  I ,  II , ,  expresszálódnak oszteoblaszt sejtekben. [30,40,50,51]) Megmutattuk, hogy a PTH stimulus a PKC α és  I transzlokációjához vezet a citoplazmából a sejtmembránba, mely aktiválódásának kulcslépése, míg a PKC  II ,  és  esetében ez nem történik meg. Tovább vizsgálva a specifikus PKC specifikus izoenzimek szerepét nemszelektív és szelektív PKC- gátló felhasználásával először mutattuk ki a csontban a PKC izoenzimek fiziológiás szerepét. A korábban ismert PKC  mellett bebizonyítottuk, hogy a

84

PTH

és

a

gyulladásos

citokinek

közvetítette

IL-6

szekréció

fokozódásban

és

csontrezorpcióban a PKC  izoenzimje is szerepet játszik, bár az enzim gátlása csak alacsony PTH koncentrációk esetén érvényesült, jelezve, hogy egyéb jelzőrendszerek is résztvesznek a hormonhatás közvetítésében, főleg nem fiziológiás körülmények között. Azt is kimutattuk, hogy az így emelkedett IL-6, D vitaminnal együtt fokozott osteoclast képződéshez vezet. A PTH fragmentjei közül mind a PTH(1-34) mind a

PTH(3-34) képes stimulálni a PKC

aktivitást az oszteoblasztban és az intakt csontban. [52,53] Korábban munkacsoportunk azt is kimutatta, hogy e PTH fragmentekkel történő kezelés a UMR-106 osteoblast sejtekben aktiválja a konvencionális diacylglycerol-függő PKCα és PKC I isoenzimeket. [54,55]

A

receptor aktiválódása során, stimulálódik a plazmamembránban található phosphoinositidekre specifikus phopholipase C enzim. Így a hydrolysis során képződött IP3 (inositol 1,4,5triphosphate) mennyisége nő, mely az endoplasmaticus reticulumra hatva, emeli az intracelluláris Ca-szintet. [56]

A hydrolysis során még DAG is képződik, mely tovább

fokozza az enzim aktivitását. termelődhet,

amikor

a

A DAG phospholipase D aktiválódáson keresztül is

phosphatidsav

phosphatidsav-phosphohydroláz

hatására

dephosphorilálódik phosphatidylcholinná. [56,57,58] A PTH markáns és tartós phospholipáz D aktivációt okoz osteoblastokban. [59] Laboratóriumunkban kimutattuk, hogy a PLD egy járulékos jelzőrendszer az osteoblastban. [60] Bebizonyítottuk, hogy a PTH okozta phospholipase D aktiváció protein kinase C-α és IL-6 stimulációhoz vezet osteoblastokban. A PLD aktivációja számos mediátor közvetítésével végbemehet, úgymint a kalcium, MAP kinase, PKC, és kis G-fehérjék. [61] Mi azt találtuk, hogy a PTH stimulálta PLD aktivítás független mechanizmus, azonban kalciumot, MAP kinase-t, Rho és ARF (ADP ribosylation factor) családba tartozó kis G-fehérjéket igényel. [62] A Rho fehérjék, melyek ciklusa az inaktív GDP-kötött és az aktív GTP-kötött állapot, fontos szerepet játszik a citoszkeletonban zajló folyamatok szabályzásában, mind a géntranszkripciós, mind a sejtnövekedés folyamataira hatva. [63,64] Aktív formában a Rho a sejtmenbránhoz kapcsolódik és számos effektor molekulával kapcsolatba lép, mint a Rho-kinase, citron-kinase, protein-kinase N és protein-related kinase 2, a jelzőrendszer és a sejtválasz modulációját okozva. [65,66] Az is megerősítést nyert, hogy a Rho és a PKC jelzőrendszerek konvergálnak. Miután kimutattuk, hogy a PTH stimulálja az IL-6 termelést és a promoterének aktivációját PKC szenzitív mértékben, illetve azt, hogy ez a stimulációs útvonalban a PLD is részt vesz, azt vizsgáltuk, hogy milyen szerepe van a Rho fehérjéknek a PTH-stimulálta PKCα transzlokáció és az IL-6 promoter aktivítás szabályzásában UMR-106 sejtekben. Kimutattuk, hogy a kis G fehérjék RhoA és az ARF expresszálódnak UMR-106 sejtekben, és hogy PTH stimulusra a 85

membránba transzlokálódnak. Azt is találtuk, hogy a Rho aktivítás gátlása kivédi a PTHstimulálta PKCα transzlokációt, tehát a RhoA és a Rho-kinase

szükséges a PKCα

transzlokációhoz. Kimutattuk továbbá, hogy a Rho és a Rho-kinase részt vesz a PTHstimulálta IL-6 promoter aktivításban, és ez a hatás a PKC aktiválódása előtt végbemegy, a PTH-stimulálta PLD aktiváció szintjén. Munkánk során először mi mutattuk ki, hogy a Rho mediálja a PKC izoenzim transzlokációt az osteoblast sejtekben. Adataink szerint a PLD aktiválása PTH-val a kis G fehérje Rho A illetve a Gγ12 és Gγ13 család heterotrimerikus fehérjéin keresztül megy végbe. Mindezek alapján azt feltételezhetjük, hogy a Rho és a Rhokinázok nem közvetlenül, hanem a DAG képződésen keresztül szabályozzák a PKC-α transzlokációt, feltehetően a PLD-re hatva. Így összességében adataink szerint a PTH hatás jelzőútvonalában a Rho és a Rho-kinase transzlokációja stimulálja a PLD aktivítását, és az ezuton képződő DAG serkenti a PKCα tanszlokációját, mely a további, részben már említett hatásokhoz vezet. Az eredményeinket a 47. ábrán összegezzük, mely a PTH IL-6 expresszió serkentéséhez vezető jelzőrendszer részletesebb megismeréséhez is vezetett.

RhoA



csontrezorpció

47.ábra.

PTH aktiváció okozta PKCα

transzlokáció és az IL-6 termelés modelje oszteoblasztban. A

receptorhoz kötődés után a PTH számos G fehérjéhez kapcsolódhat, és különböző jelzőrendszer kaszkádot indíthat el. Egyrészt a PLD-t aktiválhatja a Rhoa A és heterotrimerikus G fehérjéken keresztül, mely PA termelődéshez és következményes DAG képződéshez vezet phosphatid sav phosphorilázon (PA-P’tase) keresztül. A DAG termelődés elnyújtott PKCα transzlokációhoz vezet a membránban, amely fokozott IL-6 termelődéshez vezet. A képződött IL-6 a továbbiakban képes fokozni az oszteoklasztok működését, fokozva a csontbontást.

86

II. A calcium homeosztázisra ható genetikai faktorok polimorfizmusainak vizsgálata posztmenopauzális egészséges és oszteoporotikus nőkben. A VDR gén BsmI polimorfizmusának elemzése alapján elmondható, hogy a BMD szempontjából kedvezőtlennek tekintett BB allélpár gyakorisága a hazai populációban rendkívül magas a nemzetközi adatokkal összevetve. [67] A BB genotípusú személyek BMDje is alacsonyabb, a többi genotípusúéhoz képest. Ez lehet az egyik oka annak a ténynek, hogy a magyar lakosság csigolyatörési incidenciája a legmagasabbak közé tartozik Európában. Az ER, IL-1ra és a CaSR gén A986S polimorfizmusainak önmagában nem volt hatása a BMD-re a mi anyagunkban. Ez részben ellentétes, részben hasonló a mi munkánkkal egyidőben közölt adatokal. [68,69] Ennek oka valószínüleg a vizsgálati csoportok nagyságában és homogenitásában keresendő.Eredményeink alapján úgy tűnik, hogy a különböző gének egyes allélkombinációi potencírozhatják egymás BMD-re kifejtett hatását. Az ER gén PPXX alléltípusa önmagában nem befolyásolja a csontdenzitást, azonban a BBPPXX genotípusú személyekben a VDR gén BB allélpárjának a BMD-re kifejtett negatív hatását fokozza. Ezen megfigyelésünket velünk egyidőben olasz szerzők is leírták. [70] Ezek alapján felmerül annak a lehetősége, hogy a BMD-re negatív hatású genotípus kombinációk keresésével hatékonyabban megjósolható az involúciós osteoporosis rizikója, egyuttal lényegesebb hatékonyabb prevencióra is mód nyíhatlna.

III. Az ösztrogén szerepe a csontanyagcserében. A. Az ösztrogén receptorok szerepe a PTH indukálta IL-6 szekréció gátlásában. Az ösztrogén a legfontosabb szexhormon a vázrendszer homeosztázisának megőrzésében. Ebben a hatásban a fő komponens az IL-6 termelés gátlása az osteoblastban és a csontvelő sztrómasejtjeiben.[71] A hatás mechanizmusa az ER leírásáig a csontban nem volt világos. ER-kat expresszálnak az osteoblastok, és az ösztrogén csonthatásainak jó része rajtuk keresztül közvetítődik a csontra. [72] Az a mechanizmus, ahogyan az ER-ok pozitívan szabályozzák a génexpressziót meglehetősen jól ismert. A ligand kötődése után, az ER leválik 87

a hősokk fehérjéről a citoplazmában és ilyen mód aktiválódva a sejtmagban a célgén promoterrégiójához kapcsolódik. [73,74] Az ER DNS-kötő doménje az ERE. Ugyanakkor jóval kevesebbet tudunk arról, hogyan szabályozza negatívan a génexpressziót az ER. Ma már az ismert, hogy az ER-nak két szubtípusa van, az ERα és az ER, melyek DNS kötő doménjeik meglehetősen homológok, azonban egyéb domenjeik, beleértve a ligandkötőt is eltérőek. [75,76,77] Az ERα és az ER mind az ösztrogént, mind az antiösztrogéneket egyformán köti és az ERE-n keresztülszabályozza a géntranszkripciót. [78,79] Az is ismert, hogy míg az ER az AP1 szabályzó régiót antiösztrögén jelenlétében aktiválja, addig az ERα gátolja azt. [80,81,82,83]

Munkánkban össze kívántuk hasonlítani a két ER szubtípus

szerepét osteoblastokban abból a szempontból, hogy hogyan csökkentik a PTH stimulálta IL6 promoter aktivitást (negatív szabályzási modell), illetve hogyan fokozzák az ERE promoter aktivitását (pozitív szabályzási modell). Eredményeink szerint, mely más munkacsoportok vizsgálataival megegyeznek, mindkét receptoron az ösztrogén egyforma hatékonysággal képes stimulálni, az antiösztrogén pedig gátolni az ERE-luc promoter aktivitását. [84] Ezzel szemben a -224/11 bp. hosszúságú IL-6 promoter aktivitását az ösztrogén az ERα receptoron gátolta, míg az ER receptoron nem tudta gátolni. Ezen eredményünket receptor specifikus ligandok, antiösztogének használatával is megerősítettük. Az ER gátlóhatása akkor sem érvényesült, amikor 10x-es koncentrációban adtuk a sejtekhez az ERα-hoz képest. Eredményünk megerősíti azokat az irodalmi adatokat, melyek szerint a csontban az ösztrogénhatás fő közvetítője az ER, illetve felveti annak a lehetőségét, hogy az ER az ösztrogénhatás modulálásában vesz részt. Az ösztrogén csontanyagcserében betöltött szerepét, - miután korábbi vizsgálatainkban kimutattuk, hogy a főhatást közvetítő ERα gén polimorfizmusa nincs összefüggésben a BM D-vel -, tovább vizsgálva, olyan géneket kerestünk, melyek ösztrogén szabályzás alatt állnak a csontban. B. Az ösztrogén hatása a génexpresszióra egér modell felhasználásával, microarray technika segítségével. Ösztrogen-szabályzás alatt álló géneket vizsgáltunk normál, gonádeltávolított és ösztrogén-kezelt egerekben. Munkánk során 6 új, a csontanyagcsere vonatkozásában eddig nem ismert gént írtunk le: L1cam, és non-muscle tropomyosin-5, cathelin-like protein, heparin cofactor II, protein synthesis elongation factor Tu, small GTP-binding protein Rab1a. Kimutattunk, olyan a csontban ismertten expresszálódó géneket, melyekről nem volt tudott, hogy résztvesznek az ösztrogén hatásának közvetítésében a csontban. Munkánkkal egyidőben

88

megjelent munkában 125 csonttal kapcsolatos gén expressziós analizísét közölték ovarictomizált és ösztrogén kezelt egerekben májában és csontjában. [85] szerint

)

Eredményük

az ovarectomia utáni ösztrogén kezelésre megváltozott kifejezedésű gének a

trabekuláris BMD szabályzásában játszanak szerepet. Mi a munkánkban magasdenzitású génspecifikus mintákat tartalmazó cDNS microarray-t használtunk, kevert cDNS könyvtár felhasználásával, és valósidejű RT-PCR-t egyéb csonttal kapcsolatos markergének ösztrogén szabályzásának kimutatásához. Kifejezett eltérést találtunk a sejt adhéziót és a sejt szerkezetet meghatározó fehérjéket kódoló génekben. Ezek között a cathelin-like protein, L1cam és a non-muscle tropomyosin-5 kifejeződése mutatott ellentétes irányú változást az ERT hatására, sugalva, hogy szabályzásukban az ösztrogénnek szerepe van. Valósidejű RT-PCR technikával ezt a változást szintén megerősítettük. Mivel ezek a gének számos különböző sejttípus sejtvázának remodelingjében vesznek részt [86,87] ), így eredményünk felveti a lehetőségét, hogy e gének az osteoblastok, osteoklastok és egyéb csonthoz köthető sejtek strukturájának szabályzásában vesznek részt. Az általunk talált ösztrogén szabályzást mutató gének egy másik csoportjának a jeltovábbító és a transzkripciós szabályzásban lehet szerepük. A kis GTP-kötő fehérje Rab1a fokozott, míg a Rab3b gén csökkent kifejeződést mutatott OVX hatására. Ezek a változások csökkentek ösztrogén kezelésre. Rab1a gént eddig az izom [88] és a szív [89] szövetben írtak le, ez az első alkalom, hogy expresszióját a csontban is kimutattuk. Ismert, hogy a ras-like Rab GTP-ázok a endocytosis és exocytozis anyagtranszportját szabályozzák. [90] A Rab1a gén túlműködésének szerepét felvetik a cardiomyopathia kialakulásában is. [91] A Rab3 gént pedig kimutatták osteoclastokban, illetve azt is, hogy expresszióját számos citokin szabályozza az osteoclastogenesis folyamatában. [92] Ezek alapján felmerül annak a lehetősége, hogy e gének a csontsejtek anyagszállításában, illetve az ösztrogén hatására expresszálódó

specifikus

Rab3

fehérjék

az

osteoclast-membrán

kialakulásának

szabályzásában vehetnek részt. A transzkripció szabályzásában résztvevő gének közül a számos csont szempontból fontos szabályzófaktor promoter régiójában is jelenlévő C/EBP

mutatott szignifikáns

expresszió eltérést. Keveset tudunk az C/EBPα transzkripciós factor szerepéről az osteogenesisben. [93,94]

A jelenlegi adatok szerint a

C/EBP fehérjék számos csont

szempontból fontos gének, mint az IGF-I, osteocalcin, IL-1, IL-6 szabályzásában fontos szerepet játszik az osteoblastban, illetve maga a fehérje is

hormonok, mint a calcitriol

szabályzása alatt áll. [95-98] Ismert, hogy az IL-6 szerepet játszik az osteoclast előalakok 89

proliferációjában és érésében [99] ugyanakkor az ösztrogén gátolja az IL-6 termelődését oszteoblaszt sejtekben

in vitro. [100] Ebből következően ösztrogén hiányában az IL-6

termelés fokozódik. [101] Tehát az IL-6 a menopausa után kialakult fokozott csontvesztés fontos mediátora. Az IL-6 promoter tartalmaz C/EBP helyet, és ez szükséges az IL-6 gén optimális aktiválódásához. [102] Számos magreceptor, beleértve az ER- , képes a C/EBP transzkripciós helyhez kapcsolódni. [103] Így ezen adatok, felvetik a lehetőségét, hogy a C/EBP szerepe kritikus az ösztrogén hatásában az IL-6-ra csontban, ugyanakkor a mi eredményünk ezt a hypotézist nem támasztja alá, mivel a C/EBP expresszió ERT hatására nem normalizálódott. Ezzel megegyezően néhány más munkacsoport [104] sem tudott IL-6 expresszió változást kimutatni öszrogén hatására a csontban. Ez azt sugalja, hogy a fokozott IL-6 termelés menopausa után nem a csontból, hanem más forrásbó pl-mononucleáris sejtekből ered. Négy, az ioncsatornákat vagy receptoraikat kódoló gén kifejeződése csökkent OVX hatására, azonban ezek közül csak a band 3 anion cseréló fehérje és a TSH receptor gének kifejeződése nem változott ERT hatására. A plazmamembrán Na+-Ca2+-cserélő ioncsatorna számos szövetben szabályozza a calcium homeosztázist, úgy mint a szív [105], agy [106] és a vese [107], mindegyikük magas koncentrációban tartalmaz kalciumot. Újabb közlések kimutatták, hogy a Na+-Ca2+ cserélő mehanizmus elsődleges egér osteoblast tenyészetekben és osteoblast-szerű sejtvonalakban is kimutatható. [108,109,110]

Egér csontsejtekben e

receptorokat elsőként mutattuk ki, és feltehetően a szerepe a Ca2+ biztosítása az újonnan képződő csonthoz. Néhány munkacsoport felvetette a glutamát receptorok szerepét a csontban, mint egy lehetséges csontmemória-eendszer alkotóeleme. [111] Munkánkban elsőként mutattuk ki, hogy az N-methyl-D-aspartate-(NMDA)-típusú glutamate receptorok expresszálódnak az egér csontban. Korábban, mások kimutatták, hogy az NMDA-típusú glutamát receptorok human és patkány osteoblastban és osteoclastban is expresszálódnak. [112] Néhány széleskörű funkciót betöltő gén kifejeződését is kitudtuk mutatni. Ezek közül a heparin cofactor II a plazma proteáz gátló család új tagja. Az antikoncipiens tabletták szedése szintjének fokozódásával jár, míg hiánya fokozott tromboembolia rizikóval [113] alátámasztva az ösztrögén hatását e génre. Csontban elsőként mutattuk ki, illetve azt, hogy expresszióját az ösztrogén fokozza. Ugyanakkor, szerepe a csontanyagcserében további vizsgálatokat igényel. A másik széleskörű szerepet játszó gén a fibroblaszt növekedési faktor (FGF), amelyről ismert, hogy alapvető a vázrendszer normális fejlődéséhez. [114] Ennek ellenére az FGF jelközvetítő rendszerének pontos mechanismusa osteoblastban nem tisztázott részleteiben. 90

Ismert, hogy egymást követő bázikus FGF és PTH kezelés sokkal hatásosabb a gerinc csonttömegének növelésében OVX patkányokban, mint a PTH önmagában. [115] Mi ugyanakkor, emelkedett FGF-IBP expressziót találtunk OVX egérben. A fokozott mennyiségű kötőfehérjék elképzelhető, hogy csökkentik az FGF biológiai elérhetőségét, így az FGF csontanabolikus hatása ösztrogén hiányában nem tud érvényesülni. Ugyanakkor az ösztrogén ezen hatását QRT-PCR technikával nem tudtuk igazolni. Számos elongációs factor vesz részt a fehérjeszintézisben, melyek GTP-ázok, strukturális és mechanikai hasonlóságokat mutatnak a ras és a heterotrimerikus receptorhoz kapcsolódó G fehérjék nagy családjával. A kis nukleáris ribonucleáris (hnRNP) A2/B1 fehérjék az egyik legfontosabb pre-mRNS-kötő fehérjék a gerincesekben és szerkezetükben megegyeznek a hnRNP A1-el. Az A/B csoportú hnRNP fehérjék különböző tagjai a sejtspecifikus gének expressziójának poszttranszkripciós szabályzásában vehetnek részt. [116] Jelenlétüket az egér csontba elsőként mutattuk ki, azonban szerepül, további tisztázásra szorul. A mikroarray kisérletünkben eltérő expressziót mutató gének közül hatot QRT-PCR technikával is megvizsgáltunk. Ezen gének nagyrésze esetén az expressziós különbséget igazolni tudtuk, kivéve a COL1A1 és a basigin gén esetét. Hat további, ismerten ösztrogén szabályzott, csontspecifikus transzkripciójú gént is vizsgáltunk. A TNFR p55, TGF-1 és az IL-1 exon 4 gének a már korábban is leírt, ismert módon reagáltak az ösztrogénre. [85] Ezen gének expressziója OVX hatására kifejezetten csökkent, míg ERT hatására normalizálódott. Vizsgálatunk megerősítete Lindberg és mtsai. azon eredményét is, hogy a matrix Gla expresszió OVX, vagy ERT hatására se változik. [85] Két további, mai ismereteink szerint a normál remodeling szabályzásában központi szerepet játszó géneket, a RANKL és az OPG expressziós változásait is vizsgáltuk. Mindkét esetben szignifikáns expresszió fokozódást detektáltunk OVX után, míg EST hatására ez csökkent, vagy normalizálódott. Ismert, hogy mindkét protein termelődik az osteoblastban, és hogy termelődésüket az ösztrogén serkenti. A RANKL/OPG aránya jelen ismereteink szerint a csontremodeling fő meghatározója. [117121] Az általunk kimutatott RANKL/OPG expressziós változás megerősíti Bord és mtsai. eredményeit. [122]

Meg kell jegyeznünk, hogy az általunk végzett elemzések 2 héttel az

ovariectomia után történtek, vagyis a csontvesztéshez vezető kezdeti változások után. Így számos, a csont és csontvelő sejtek számában, aktivitásában, a

csontremodeling

felgyorsulásában kimutatható eltérést nem detektálhattuk. Továbbá az általunk használt modell arra sem volt alkalmas, hogy az ösztrogén direkt ( ER receptorokon), illetve indirekt ( kinázokon és egyéb transzkripciós faktorokon ) közvetített hatásait tanulmányozzuk. Ezért az általunk talált gének precíz szerepének tisztázására további vizsgálatok szükségesek. 91

C.

Menopausa

hatása

a

csontszövet

komplex

génexpressziós

mintázatára

postmenopausalis vs. premenopausalis nőkben. Elsőként vizsgáltuk munkánk során a humán post- illetve premenopausas nőkből származó csontszövetek multigénes transzkripciós profilját és mutattunk ki szignifikáns expressziós különbségeket a két állapot között. A megismert génexpressziós adatok lehetővé tették a postmenopausalis és premenopausalis csontszöveti fenotípus elkülönítését. Korábbi egérkisérletünkból származó génadataink jelentőségét e tanulmányunkban humán csontszövet mintákon validáltuk és meghatároztunk olyan markánsan megváltozott génexpressziós mintázatokat, amelyek a menopausat követően végbemenő és a csontanyagcserét nagyban befolyásoló változásokkal kapcsolatban eddig ismeretlenek voltak . Két új, a csontanyagcsere folyamatok vonatkozásában eddig nem ismert gén (TRIB2, IGSF4) túlzott kifejeződését mutattuk ki postmenopausas nem osteoporotikus nőkben. A humán TRIB molekulák szelektíven szabályozzák a gyulladásos jelátviteli mechanizmusokat a MAPKK (mitogénaktivált protein kináz kináz) interakciókon keresztül. [123] A TRIB2 gén átíródását a hierarchikus MAPK kaszkád tagjai (ERK1,2) és a pro-inflammatórikus mediátorok (IL-1B) egyaránt modulálják. [124,125] Az általunk észlelt túlzott TRIB2 kifejeződés okozhatja feltételezésünk szerint a MAPK rendszeren keresztül megvalósuló fokozott csontszöveti gyulladásos reakciókat a postmenopausalis korban. A Ca2+-tól független sejt-sejt kölcsönhatásokat közvetítő IGSF4 egy immunglobulinszerű intracelluláris adhéziós molekula, amely az aktin filamentumokhoz kötődése révén a citoszkeletális jeltovábbításban és a sejtinvázió szabályozásban vesz részt. [126] Az IGSF4 gént az ER célpontjaként írták le emlőtumor sejtekben. [127] Túlzott termelése erősödő csontsejt adhéziót és migrációt eredményezhet postmenopausas nőkben. Az egyik legfontosabb osteoblast-specifikus transzkripciós faktor, a RUNX2 (Cbfa1) expressziójának mértéke szignifikánsan nagyobb volt a nem osteoporosisos csontszövetben a menopausat követően. A csont homeosztázisában a RUNX2 központi szerepet tölt be [128] szükséges a közös mesenchymális őssejtek osteoblast irányba történő differenciójához. [129] Emellett számos, a csontsejtekre jellemző gén (BGLAP, ALPL, RANKL, MMP13) működését irányítja [130,131], amelyek szintén szignifikánsan megnövekedett expressziós szintet mutattak az általunk vizsgált postmenopausalis csontszövetben. A RUNX2 transzkripciós aktivitásának szabályozását összetett jelpályák segítik elő [132], amelyek tartalmazzák a növekedési faktorok (mint pl. munkánkban a szignifikáns változást mutató PDGFA és FGFR1) jelátvitelét biztosító MAPK hálózatot, extracelluláris mátrix fehérjéket és 92

a TGFB/BMP család komponenseit (48.ábra). Ezekben a jeltovábbító rendszerekben a RUNX2 komplex fokozza a célgének átíródását, ami a menopausaban gyors turnoverrel járó csontátépüléshez vezet.

RUNX2 COL1A1 ALPL MMP13 OPG BGLAP

BMP2 RANKL

TGFb1

SPP1

48.ábra: A RUNX2 jelátviteli mechanizmusainak összefoglalása. A csontszövet postmenopausas és premenopausas állapotainak megkülönböztetésének irányában végzett analízisünkben nagy számban azonosítottunk

olyan géneket, amelyek

ebben szerepe lehet. A transzkripciós mintázat alapján ezek a gének elsősorban növekedési faktorok (TGFB/BMP jelátviteli útvonal, PDGFA, FGFR1, EGFR) és az extracelluláris mátrixot alkotó kollagén molekulák génjei. Ez a megfigyelés alátámasztja azon szignifikancia vizsgálatunk eredményeit, amely segítségével kimutattuk, hogy a COL2A1 és számos keresztkötő kollagén gén aktivitása szignifikánsan növekszik postmenopausas humán csontszövetben. A minor kollagének, mint a COL3A1, COL5A1 vagy a COL5A2 képezik a csont szerves mátrixának szerkezetét, illetve ezek alkotják azt a központi molekuláris struktúrát, amelyre az I. típusú kollagén polimerizálódik. [133] Elmondhatjuk, hogy a menopausaval összefüggően megváltozott hormonális állapot fokozza a horizontális összeköttetéseket biztosító minor kollagének átíródását, aminek szerepe lehet a módosult csontszöveti metabolizmusban. Ugyanakkor eredményünk a korábbi vizsgálatunkban talált elletmondást is tisztázza, melyben a COL1A1 gén egér microarray-ben látott OVX és ERT hatására bekövetkező expresszió feokozódást QRT-PCR metodikával nem tudtuk megerősíteni. Jelen adataink sem támasztják alá a direkt ösztrogén szabályozást, azonban

93

szerepe a menopauza utáni megváltozott csontanyagcserében igazolható, valószínüleg indirekt szabályozó utakon keresztül. Ugyanakkor a FGF esetén a korábbi munkánkban kimutatott ösztrogén szabályozás hiányát megerősítettük, míg korábbi eredményünkkel ellentétben a TGF esetén e szabályzást humán csontban nem tudtuk kimutatni. Ezen eredmények további megerősítése szükséges. Megerősítettük viszont humán csontban is az ösztrogén szabályzást a TNF, RANKL, OPG és az IL-1RAP gének esetén. Az egérkisérletben felvetett IL-6 szabályzással kapcsolatban e vizsgálatban kimutattuk, hogy az ösztrogén hiánya a csonteredetű IL-6 termelését is fokozza, azonban a C/EBP expressziót nem tudtuk igazolni. Ugyanakkor kimutattuk az IL-6 prromoter régiójában szintén fontos szerepet játszó NFKB expreszióját, amely a C/EBP-hez hasonlóan alul expresszált, így továbbra is azt valószínűsítjük, hogy a jelen munkában kimutatott ösztrogén szabályozást mutató IL-6 expresszióban egyéb tényezők is szerepet játszhatnak, A diszkriminancia analízis felfedett olyan, az ösztrogén-receptorok kétféle típusa (ERβ, ERα) által szabályozott eltérően expresszálódó géneket, melyek segítségével egyértelműen megállapítható a nem osteoporotikus humán csontszövet menopausas állapota . Az ösztrogén-receptorok (elsősorban ER) jelátviteli útjának sérülése és emiatt a nem megfelelő géntranszkripció a csontátépülés megbillent egyensúlyához vezethet. Ezen eredményünk megerősíti az ösztrogén receptorok szerepét osteoblastokban tanulmányozó vizsgálatunk eredményeit, miszerint a fő ösztrogénhatást közvetítő receptor az Erα, azonban hatását az ER modulálja.

IV. A pajzsmirigyhormonok szerepe a csontanyagcserében. Vizsgálataink során nyert adatok alapján új elképzelést alakítottunk ki a thyrogén csontvesztés patomechanizmusáról. A pajzs-mirigytúlműködés kapcsán észlelhető fokozott csontvesztésben az IL-6 játszik központi szerepet, melyet in vitro kísérletekben igazoltunk. [134] Kimutattuk, hogy e citokin termelődését a pajzsmirigyhormon fokozza, és e hatását az IL-1β és a parathormon potencírozza, míg az ösztrogén gyengíti. Munkacsoportunk korábban publikált eredménye in vivo is megerősíti eredményeinket, miszerint az IL-6 túlprodukcióját hyperthyreotikus betegekben is sikerült igazolni, ahol az IL-6 túlnyomó része a mononukleáris sejtekből származott. Az IL-6 esetében közvetlen kapcsolatot sikerült

94

kimutatni a BMD-vel [135] Az IL-6-hoz hasonlóan, hyperthyreotikus betegek mononucleáris sejtjeinek vizsgálatával a TNFα fokozott termelődését, mutattuk ki. Hasonlóan fokozott ET-1 és OPG szinteket mértünk e betegcsoportban. Ez utóbbi citokinek esetén a BMD-vel nem tudtunk kimutatni összefüggést. A pajzsmirigyhormonok hatására kialakuló fokozott anabolikus aktivitás hátterében az IGF-I szerepét tételeztük fel. IGF-I promoter transzfekciójával osteoblastban nem tudunk kimutatni e növekedési faktor thyreogén szabályzását, azonban megerősítettük, az ösztrogén és PTH expressziót fokozó hatását. Munkacsoportunk korábbi adatai szerint a T3 érzékenyíti a PTH receptorokat, illetve anti-sense IGF-I felhasználásával sikerült igazolni e faktor szerepét a pajzsmirigyhormon anabolikus hatásaiban. Mi magunk a korábban in vitro észlelt fokozott IGF-I termelést in vivo is bizonyítottuk. Az IGF-I hyperthyreosisban megfigyelhető anabolikus hatását jelentősen rontja a megemelkedett szérum IGFBP-4 szint, amely gátolja az IGF-I biológiai aktivitását. Vizsgálataink szerint tehát hyperthyreosisban az IL-1β, parathormon

által

felerősített

és

ösztrogén

által

gyengített

pajzsmirigyhormonok

csonthatásaikat e fent említett citokinek és növekedési faktorok közvetítésével fejtik ki (49. ábra).

IL-1

PTH T3

PTH receptor

IL-1receptor

PKC

PKA T3

E2

T3

PC-PLC PKC

IGF-I

IL-6 szintézis

TNF szintézis

49. ábra. A pajzsmirigyhormonok csonthatásait szabályzó szisztémás és lokáli s faktorok.

95

6. KÖVETKEZTETÉSEK A csont élő szövet, melyben az élet során mindvégig zajlik csontanyagcsere. A modelling alatt a csontméret növekedését és a csont alakjának változását értik, elsősorban az érett csont kialakulása előtt. A modelling során bekövetkező csontképzés és –rezorpció térben és időben egymástól elkülönült – szemben a remodeling folyamatával, melynek kapcsán a rezorpció és a csontképzés egymással összefügg, és azonos anatómiai helyen, az úgynevezett BMU-n belül zajlik. A növekedés során kialakult csont a folyamatosan zajló csontképződési és – felszívódási ciklusok révén épül át. A remodeling feltététele a csontot eltávolító osteoclastok és az eltávolított csontot pótló osteoblastok összehangolt működése. Az osteoblastok és osteoclastok aktivitásának szoros koordinációja mellett zajló csontremodeling összességében a szabályozó faktorok kölcsönhatásainak eredménye. Az utóbbi évtizedekben örvendetesen növekedett ismeretanyagunk a csontanyagcsere fiziológiáját és patofiziológiáját illetően. Mégis távol vagyunk attól, hogy igazán értsük azokat a folyamatokat, amelyek normális és kóros viszonyok között a csontszövet működését, illetve anyagcsere csontbetegségek kialakulását meghatározzák. Az fiziológiás csontanyagcserét és a csontvesztést befolyásoló genetikai faktorok és a genetikai tényezők egymással való kapcsolata sem teljes egészében ismert. Az egyes gének, génváltozatok egyedi hatása csekélynek bizonyult a korábbi vizsgálatokban. A csontanyagcsere szabályzásában bekövetkező multifaktoriális változások hátterében poligénes hatás és az egyes gének egymással való interakciója valószínűsíthető. A kutatásokban a közelmúltban bekövetkezett gyors ütemű fejlődés különböző irányokba vezet, de a csontsejtek differenciálódását és működését meghatározó szabályozó tényezők és szignalizációs mechanizmusok továbbra is a kutatás középpontjában állnak. Ezen tendenciáknak megfelelően a csontanyagcsere vizsgálatát az elmúlt évtized korszerű elveinek megfelelően, genetikai, sejtbiológiai és klinikai szinten közelítettem meg. Munkánkból a következő megállapításokat tettük: 1. Kidolgoztuk a PTH csontvesztést okozó hatásának új szignalizációs modelljét. 2. Kimutattuk, hogy a PTH hatása az IGF-I prometérének szabályzásában bifázisos, időfüggő módon szabályozza azt. 3. Kimutattuk a PKC szerepét a PTH, a TNF-α és az IL-1 csontszövetre kifejtett katabolikus hatásában.

96

4. Megmutattuk, hogy a PTH stimulus a PKC α és  I transzlokációjához vezet a citoszolból a sejtmembránba osteoblastban, mely aktiválódásának kulcslépése, míg a PKC  II ,  és  esetében ez nem történik meg. 5. Először mi mutattuk ki a csontban a PKC  izoenzimek fiziológiás szerepét. 6. A korábban ismert PKC  mellett bebizonyítottuk, hogy a PTH , a TNF-α és az IL-1 közvetítette IL-6 szekréciófokozódásban és csontrezorpcióban a PKC  szerepet játszik. 7. Megerősítettük, hogy a PTH hatására fokozódó PKC fokozott IL-6 expresszióhoz, s az így megemelkedett emelkedett IL-6 szint D vitaminnal együtt fokozott osteoclast képződéshez vezet. 8. Bebizonyítottuk, hogy a PTH okozta PLD aktiváció PKC-α és IL-6 stimulációhoz vezet osteoblastokban. 9. Megmutattuk, hogy a PTH stimulálta PLD aktivitás független mechanizmus, azonban kalciumot MAP kinase-t, Rho és ARF családba tartozó kis G-fehérjét igényel. 10. Kimutattuk, hogy a kis G fehérjék RhoA és ARF expresszálódnak UMR-106 sejtekben, és hogy PTH stimulusra a membránba transzlokálódnak. 11. Munkánk során először mi mutattuk ki, hogy a Rho-mediálta PKC izoenzim transzlokációt az osteoblastokban. 12. Kimutattuk továbbá, hogy a Rho és a Rho kinase részt vesz a PTH-stimulálta IL-6 promoter aktivitásban, és ez a hatás a PKC aktiválása előtt megtörténik, a PTH-stimulálta PLD aktiváció idején. 13. Adataink szerint a phospholipase D aktiválása PTH-val a kis G fehérje Rho A illetve a Gγ12 és Gγ13 család heterotrimerikus fehérjéken keresztül megy végbe. 14. Kutatómunkánk során néhány a csontanyagcserében kandidáns gén polimorfizmusainak összefüggését nem tudtuk igazolni a postmenopausalis csontvesztéssel, azonban eredményeink alapján úgy tűnik, hogy a különböző gének egyes allélkombinációi potencírozhatják egymás BMD-re kifejtett hatását. 15. Megerősítettük, hogy osteoblastban az ösztrogénhatás fő közvetítője az ER, és felvetettük annak a lehetőségét, hogy az ER az ösztrogénhatás modulálásában vesz részt. 16. Kimutattunk 6 új, a csontanyagcsere vonatkozásában eddig nem ismert gént egércsontban: L1cam, non-muscle tropomyosin-5, cathelin-like protein, heparin cofactor II, protein synthesis elongation factor Tu, small GTP-binding protein Rab1a. Kimutattunk, olyan a csontban ismerten expresszálódó géneket, melyekről nem volt ismert, hogy résztvesznek az ösztrogén hatásának közvetítésében a csontban.

97

17. Rámutattunk az ösztrogén-receptorok kétféle típusa (ER-, ER-) által szabályozott géncsoportra, melyek erőteljesen elválasztják a humán postmenopausas és premenopausas fázisban lévő csontszövetet. 18. Vizsgálataink során nyert adatok alapján új elképzelést alakítottunk ki a thyrogén csontvesztés patomechanizmusáról.

98

7. ÖSSZEFOGLALÁS Munkám eredményeinek a sematikus ábrázolása az 50. ábrán látható. Ezek hozzájárultak a kalcium-és csontanyagcsere genetikai, sejtbiológiai és klinikai hátterének jobb megértéséhez. Kutatásainkkal új, számos esetben elsőként észlelt alapkutatási adatokból kiindulva klinikai szinten is hasznosítható következtetést vontunk le. Eredményeink alapján lehetséges terápiás célpontokat és diagnosztikus lehetőségeket vetettünk fel, melyek a közeljövő feladatait is meghatározzák.

IL-1

E2

1a,25(OH)2D3

T3

Osteoblast

PTH

+

Gq

Gs VDR receptor

+ -

Er

+

Er

AC

+ -

ATP

PIP

Ca

3

2+

-

2

PLC

cAMP IP

PTH

+

RhoA PLC

PC

DAG + p- choline

DAG

TR PLD

ILR

+ -

PA + choline

PA phosphohydrolase

PKC

Target gének

RANKL,OPG, IL-6, TNF-, IL-1,IGF-I fúzió

differenciáció

1. Radeff JM, Nagy Z, Stern PH: Involvement of pkc-beta in pth, tnf-alpha, and il-1beta effects on IL6 promoterin osteoblastic cells and on pth-stimulated bone resorption. Exp Cell Res. 2001 Aug 15;268(2):179-88 2. Nagy Z, Radeff J, Stern PH: Stimulation of interleukin-6 promoter by parathyroid hormone, tumor necrosisfactor alpha, and interleukin-1beta in UMR-106 osteoblastic cells is inhibited by protein kinase C antagonists. J Bone Miner Res. 2001;16(7):12207. 3. Radeff JM, Nagy Z, Stern PH.Rho and Rho kinase are involved in parathyroid hormone-stimulated protein kinase C alpha translocation and IL-6 promoter activity in osteoblastic cells. J Bone Miner Res. 2004 ;19(11):1882-91.

99

8.SUMMARY The maintenance of bone involves a delicate balance between the actions of systemic hormones, local cytokines and growth factors, and physical forces. Disorders that interfere with, amplify, or mimic the effects of these factors can result in abnormal bone remodeling and elicit pathological conditions that result in increased susceptibility to fracture. My research to define the pathways that lead to the responses to these factors, in order to identify new potential targets for therapy. 

Our studies on osteoblasts have focused on parathyroid hormone signaling. PTH can promote both the formation and resorption of bone. Intermittent stimulation by PTH promotes bone formation, likely through the local production of growth factors. Continuous stimulation by PTH promotes resorption through the local production of the osteoclast-stimulatory cytokines RANKL and interleukin-6 (IL-6). PTH acts through specific receptors to activate signaling pathways. Adenylyl cyclase and phospholipase C were previously recognized as signaling molecules activated by PTH-receptor interactions. We have found that the activation of phospholipase D by PTH occurs through the heterotrimeric proteins of the Galpha12 and Galpha13 family and the small G protein RhoA. We have shown that stimulation of the pathway by PTH in osteoblastic cells leads to activation of protein kinase C-alpha and increased IL-6.



We have found significant differences in the gene expression profiles of the bone tissue of postmenopausal and premenopausal non-osteoporotic women including genes that have not yet been associated with menopausal changes. The separation of the two groups by the multiparametric statistical methods applied suggests the involvement of new candidate gene subsets as well as genetic pathways (canonical TGFB cascade, MAPK and ER signaling) that might be useful for the development of future diagnostic tools. Our findings may provide further insight into the process of postmenopausal changes of bone metabolism as well as it can contribute to the development of new statistical methods for the evaluation of batched genetic data.



Nuclear triiodothyronine (T3) receptors can be found in osteoblastic cell lines as well as in osteoclastomaderived osteoclasts . Thyroid hormones appear to affect bone either by a direct action on osteoclasts or by acting via osteoblasts . T3 directly stimulates bone resorption in organ cultures

that can be inhibited by immunosuppressive

compounds , indicating the involvement of immunologically active cytokines.

100

Increased interleukin-6 (IL-6) production, a potent stimulator of osteoclast progenitors, has been reported in these cultures Elevated serum IL-6 and Il-1/ TNF concentrations were seen in hyperthyroid patients as well. A biphasic response in insulin-like growth factor I (IGF-I) production was observed in UMR-106 osteoblastic cells exposed to increasing doses of thyroid hormones: lower concentrations stimulated IGF-I secretion into the medium while higher concentrations inhibited it . Higher than normal serum IGF-I levels have been reported in hyperthyroid patients who exhibited a positive correlation with radius BMD. The anabolic effect of thyroid hormones during growth may be mediated, at least partly, via IGF-I.

1. Radeff JM, Nagy Z, Stern PH: Involvement of pkc-beta in pth, tnf-alpha, and il-1beta effects on IL6 promoterin osteoblastic cells and on pth-stimulated bone resorption. Exp Cell Res. 2001 Aug 15;268(2):179-88 2. Nagy Z, Radeff J, Stern PH: Stimulation of interleukin-6 promoter by parathyroid hormone, tumor necrosisfactor alpha, and interleukin-1beta in UMR-106 osteoblastic cells is inhibited by protein kinase C antagonists. J Bone Miner Res. 2001;16(7):1220-7. 3. Radeff JM, Nagy Z, Stern PH.Rho and Rho kinase are involved in parathyroid hormone-stimulated protein kinase C alpha translocation and IL-6 promoter activity in osteoblastic cells. J Bone Miner Res. 2004 ;19(11):1882-91.

101

9.IRODALOMJEGYZÉK [1]

Lorenzo J, Horowitz M, Choi Y: Osteoimmunology: interactions of the bone and immune system. Endocrine reviews 2008;29:403-440.

[2]

Lakatos P, Takács I: Metabolikus csontbetegségek. Medintel: Budapest, 2006.

[3]

Khosla

S:

Minireview:

the

OPG/RANKL/RANK

system.

Endocrinology

2001;142:5050-5055. [4]

Martin, T.J. and Rodan, G.A.: Coupling of bone resorption and formation during bone remodeling. In Osteoporosis (Marcus, R. et al., eds), 2001; pp. 361–372, Academic Press

[5]

Rizzoli R, Bonjour JP, Ferrari SL: Osteoporosis, genetics and hormones. J Mol Endocrinol 2001;26:79-94

[6]

Borsy A, Podani J, Steger V, Balla B, Horvath A, Kosa JP, Gyurjan I, Jr., Molnar A, Szabolcsi Z, Szabo L, Jako E, Zomborszky Z, Nagy J, Semsey S, Vellai T, Lakatos P, Orosz L: Identifying novel genes involved in both deer physiological and human pathological osteoporosis. Mol Genet Genomics 2009;281:301-313.

[7]

Mundy, G.R: Hormonal factors which regulate bone resorption. In Handbook of Experimental Pharmacology: Physiology and Pharmacology of Bone (Vol. 107) (Mundy, G.R. and Martin, T.J., eds), 2003; pp. 215–238, Springer-Verlag

[8]

Manolagas, S.C. and Jilka, R.L: Bone marrow, cytokines, and bone remodeling. Emerging insights into the pathophysiology of osteoporosis. N. Engl. J. Med.1995; 332:305–311

[9]

Potts TJ: Parathyroid hormone: past and present. Endocrinology, 2005; 187:311-325

[10]

J. VanHouten et al.: The calcium-sensing receptor regulates mammary gland parathyroid hormone-related protein production and calcium transport, J. Clin. Invest. 2004;113:598–608.

[11]

Arnaud CD, Kolb FO: The calciotropic hormones and metabolic bone disease. In:Greenspan F:Basic and clinical endocrinology. Appleton & Lange, Norwalk, California 1991, pp.247-323.

[12]

Britto JM, Fenton AJ, Holloway WR, Nicholson GC: Osteoblast mediate thyroid hormone stimulation of osteoclastic bone resorption. Endocrinology 1994; 134:169-176.

[13]

Bland R: Steroid hormone receptor expression and action in bone. Clinical Science (Lond) 2000;98:217-40

102

[14]

Turner RT, Riggs BL, Spelsberg TC: Skeletal effects of estrogen. Endocrine reviews 1994;15:275-300.

[15]

Goldring SR, Goldring MB. Cytokines and skeletal physiology. Clin.Orthop. 1996; 324: 34-46

[16]

Canalis E, McCarthy TL, Centrella M: Growth factors and cytokines in bone metabolism Annu Rev. Med. 1992; 42: 17-24

[17]

Zheng SX, Vrindts Y, Lopez M, De-Groote D, Zangerle PF, Collette J, Franchimont N, Geenen V, Albert A, Reginster JY: Increase in cytokine production (IL-1 beta, IL-6, TNF-alpha but not IFN-gamma, GM-CSF or LIF) by stimulated whole blood cells in postmenopausal osteoporosis. Maturitas 1997; 26: 63-71

[18]

Chaudhary LR, Spelsberg TC ,Riggs BL: Production of various cytokines by normal human osteoblast-like cells in response to interleukin-1 and tumor necrosis factor-: lack of regulation by 17-estradiol Endocrinology 1992; 130: 2528-34

[19]

Miyaura C, Kusano K, Masuzawa T, Chaki O, Onoe Y, Aoyagi M, Sasaki T, Tamura T, Koishihara Y, Ohsugi Y: Endogenous bone-resorbing factors in estrogen deficiency: cooperative effects of IL-1 and IL-6. Journal of Bone

and Mineral

Research 1995; 10:1365-73. [20]

Gowen M, Chapman K, Littlewood A, Hughes D, Evans D, Russel G: Production of tumor necrosis factor by human osteoblasts is modulated by other cytokines, but not by osteotropic hormones. 1990; Endocrinology 1990; 126: 1250-1255

[21]

Kasukawa Y, Miyakoshi N, Mohan S: The anabolic effects of GH/IGF system on bone. Curr Pharm Des. 2004;10:2577-92.

[22]

Clowes JA, Riggs BL, Khosla S: The role of the immune system in the pathophysiology of osteoporosis. Immunol Rev 2005;208:207-227

[23]

Atkins GJ, Kostakis P, Pan B, Farrugia A, Gronthos S, Evdokiou A, Harrison K, Findlay DM, Zannettino AC: RANKL expression is related to the differentiation state of human osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research 2003; 18:10881098

[24]

Spelsberg TC, Subramaniam M, Riggs BL, Khosla S: The Actions and Interactions of Sex Steroids and Growth Factors/Cytokines on the Skeleton. Molecular Endocrinology 1999;13:819-828

103

[25]

Manolagas SC: Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocrine Reviews 2000;21:115-37

[26]

Riggs BL, Khosla S, Melton LJ 3rd: A unitary model for involutional osteoporosis: estrogen deficiency causes both type I and type II osteoporosis in postmenopausal women and contributes to bone loss in aging men. Journal of Bone and Mineral Research 1988; 13 763-73.

[27]

Riggs BL: The mechanisms of estrogen regulation of bone resorption. J Clin Invest 2000;106:1203-1204

[28]

Kim, G., Kim, C., Choi, C., Park, J., and Lee, K.-U: Involvement of different second messengers in parathyroid hormone-and interleukin-1-induced interleukin-6 and interleukin-11 production in human bone marrow stromal cells. J. Bone Miner. Res. 1999; 12, 896–902.

[29]

Huang, Y., Harrison, J., Lorenzo, J., and Kream, B: Parathyroid hormone induces interleukin-6 heterogeneous nuclear and messenger RNA expression in murine calvarial organ cultures. Bone 1998; 23, 327–332.

[30]

Sanders, J., and Stern, P: Expression and phorbol esterinduced down-regulation of protein kinase C isozymes in osteoblasts. J. Bone Miner. Res.1996; 11, 1862–1867.

[31]

Dossing, D. A., Radeff, J. M., Sanders, J., Lee, S.-K., Hsieh, M.-R., and Stern, P. H: Parathyroid hormone stimulates translocation of protein kinase C isozymes in UMR-106 osteoblastic osteosarcoma cells. Bone 2001;29, 223-230

[32]

Singh, A. T. K., Radeff, J. M., Kunnel, J. G., and Stern, P. H.: Phosphatidylcholine-specific

phospholipase

C

inhibitor,

tricyclodecan-9-yl

xanthogenate (D609), increases phospholipase D-mediated phosphatidylcholine hydrolysis in UMR-106 osteoblastic osteosarcoma cells. Biochim. Biophys. Acta 2000; 1487,201–208. [33]

Kian Tee M, Rogatsky I, Tzagarakis-Foster C, Cvoro A, An J, Christy RJ, Yamamoto KR, Leitman DC: Estradiol and selective estrogen receptor modulators differentially regulate target genes with estrogen receptors alpha and beta. Mol Biol Cell 2004;15:1262-1272.

[34]

Carlsten H: Immune responses and bone loss: the estrogen connection. Immunol Rev 2005;208:194-206.

104

[35]

Offermanns, S., Iida-Klein, A., Segre, G. V., and Simon, M. I.: Galpha q family members couple PTH/PTHrP and calcitonin receptors to phospholipase C in COS-7 cells. Mol. Endocrinol. 1996; 10, 566–574.

[36]

Lane, N. E., Kimmel, D. B., Nilsson, M. H., Cohen, F. E.,Newton, S., Nissenson, R. A., and Strewler, G. J.: Boneselective analogs of human PTH(1-34) increase bone formation in an ovariectomized rat model. J. Bone Miner. Res.1996;11:614–625.

[37]

Zhigang Chen, Ping Xu, Jean-René Barbier, Gordon Willick, and Feng Ni: Solution Structure of the Osteogenic 1−31 Fragment of the Human Parathyroid Hormone Biochemistry, 2000;39:12766–12777

[38]

Ute Charlotte Marx, Knut Adermann, Peter Bayerc, Wolf-Georg Forssmann and Paul Rösch:Solution Structures of Human Parathyroid Hormone Fragments hPTH(1– 34) and hPTH(1–39) and Bovine Parathyroid Hormone Fragment bPTH(1–37) Biochemical and Biophysical Research Communications 2000; 267 :213-220

[39]

Jilka, R.L. : Increased bone formation by prevention of osteoblast apoptosis with parathyroid hormone. J. Clin. Invest. 1999; 104: 439–446

[40]

Fujimori, A., Cheng, S.-L., Avioli, L., and Civitelli, R:Dissociation of second messenger activation by parathyroid hormone fragments in osteosarcoma cells. Endocrinology 2000; 128:3032–3039.

[41]

Howard, G.A.: Parathyroid hormone stimulates bone formation and resorption in organ culture: evidence for a coupling mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 78: 3204–3208

[42]

Wang Y, Nishida S, Boudignon BM, Burghardt A, Elalieh HZ, Hamilton MM, Majumdar S, Halloran BP, Clemens TL, Bikle DD: IGF-I receptor is required for the anabolic actions of parathyroid hormone on bone. J Bone Miner Res. 2007 ;22:1329-37

[43]

Chan, S. D., Strewler, G. J., and Nissenson, R. A.:Transcriptional activation of Gsa expression by retinoic acid and parathyroid hormone related protein. J. Biol. Chem.1990;265:20081–20084.

[44]

Flicker L, Lichtenstein M, Colman P, Buirski G, Kaymakci B, Hopper JL, Wark JD: The effect of aging on intact PTH and bone density in women. J Am Geriatr Soc. 1992 ;40:1135-8.

[45]

Kurihara, N., Bertolini, D., Suda, T., Akiyama, Y., and Roodman, G: IL-6 stimulates osteoclast-like multinucleated cell formation in long term human marrow cultures by inducing IL-1 release. J. Immunol.1996; 144, 4226–4230 105

[46]

Ishimi, Y., Miyaura, C., Jin, C., Akatsu, T., Abe, E., and Nakamura, Y:IL-6 is produced by osteoblasts and induces bone resorption. J. Immunol. 1990;145:3297– 3303

[47]

Lowik, C., Pluijm, G. v. d., Bloys, H., Hoekman, K., Bijvoet, O., Aarden, L., and Papapoulos, S:Parathyroid hormone (PTH) and PTH-like protein (PLP) stimulate interleukin-6 production by osteogenic cells: A possible role of interleukin-6 in osteoclastogenesis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989; 162:1546–1552.

[48]

Kondo A, Koshihara Y, Togari A.: Signal transduction system for interleukin-6 synthesis stimulated by lipopolysaccharide in human osteoblasts. J Interferon Cytokine Res. 2001;21:943-50.

[49]

Sanders, J., and Stern, P.:Protein kinase C involvement in interleukin-6 production by parathyroid hormone and tumor necrosis factor- in UMR-106 osteoblastic cells. J. Bone Miner. Res. 2000;15:885–893.

[50]

Lorenzo, J. A., Sousa, S., and Quinton, J.: Forskolin has both stimulatory and inhibitory effects on bone resorption in fetal long bone cultures. J. Bone Miner. Res. 1986; 1: 313–317.6

[51]

Abou-Samra, A., Jueppner, H., Westberg, D., Potts, J., and Segre, G: Parathyroid hormone causes translocation of protein kinase-C from cytosol to membranes in rat osteosarcoma cells. Endocrinology1989;124: 1107–1113.

[52]

Greenfield, E., Horowitz, M., and Lavish, S.: Stimulation by parathyroid hormone of interleukin-6 and leukemia inhibitory factor expression in osteoblasts is an immediate-early gene response induced by cAMP signal transduction. J. Biol. Chem. 1996;271: 10984–10989.

[53]

Onyia, J., Liberman, T., Bidwell, J., Arnold, D., Tu, Y., McClelland, P., and Hock, J.:. Parathyroid hormone (1–34)-mediated interleukin-6 induction. J. Cell. Biochem. 1997; 67: 265–274..

[54]

Singh AT, Kunnel JG, Strieleman PJ, Stern PH: Parathyroid hormone (PTH)-(1– 34), [Nle(8,18),Tyr34]PTH-(3–34) amide, PTH-(1–31) amide, and PTH-related peptide-(1–34) stimulate phosphatidylcholine hydrolysis in UMR-106 osteoblastic cells:

Comparison

with

effects

of

phorbol

12,13-dibutyrate.

Endocrinology1999;140:131–137. [55]

Stewart,

P.,

and

Stern,

P.:

Calcium/phosphatidylserinestimulated

protein

phosphorylation in bone: Effect of parathyroid hormone. J. Bone Miner. Res.1987; 2: 281–287. 106

[56]

Billah, M. M., and Anthes, J. C: The regulation and cellular functions of phosphatidylcholine hydrolysis. Biochem. J1990. 269: 281–291.

[57]

Exton, J. H.: Signaling through phosphatidylcholine breakdown. J. Biol. Chem. 1990; 265: 1–4.

[58]

Nishizuka, Y: Protein kinase C and lipid signaling for sustained cellular responses. FASEB J. 1995; 9: 484–496.

[59]

Exton JH : Phospholipase D. Ann NY Acad Sci 2000;905:61–68...

[60]

Radeff JM, Singh ATK, Stern PH: Role of protein kinase A, phospholipase C and phospholipase D in parathyroid hormone receptor regulation of protein kinase C alpha and interleukin-6 in UMR-106 osteoblastic cells. Cell Signal 2004;16:105–114

[61]

Singh ATK, Bhattacharyya RS, Radeff JM, Stern PH: Regulation of parathyroid hormone-stimulated phospholipase D in UMR-106 cells by calcium, MAP kinase and small G proteins. J Bone Miner Res 2003;18:1453–1460.

[62]

Sah VP, Seasholtz TM, Sagi SA, Brown JH: The role of Rho in G protein-coupled receptor signal transduction. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2000;40:459–489.

[63]

Zhang F, Casey P: Protein prenylation: Molecular mechanisms and functional consequences. Annu Rev Biochem 1996 ;65:241–269.

[64]

Laufs U, Liao J: Post-transcriptional regulation of endothelial nitric oxide synthase mRNA stability by Rho GTPase. J Biol Chem 1998;273:24266–24271.

[65]

Cai S, Exton JH: Determination of interaction sites of phospholipase D1 for RhoA. Biochem J 2001; 355:779–785.

[66]

Bae CD, Min DS, Fleming IN, Exton JH: Determination of interaction sites on the small G protein RhoA for phospholipase D. J Biol Chem 1998;273:11596–11604.

[67]

Hustmyer FG, DeLuca HF, Peacock M: Apa1, Bsm1, EcoR and Taq1 polymorphism at the human vitamin D receptor gene locus in Caucasians, Blacks and Asians. Hum Mol Genet 1993;2:487–487

[68]

Chang HY, Jong TC, Hyun AC, Young SK, In GM, Hyun KY, In KH, Dae HK and Ki OH: Association of estrogen receptor alpha gene microsatellite polymorphism with annual changes in bone mineral density in Korean women with hormone replacement therapy. J Bone Miner Metab. 2005; 23:395-400

[69]

K O Han, J T Choi, I G Moon, M S Jeong, C H Yim, H Y Chung, H C Jang, H K Yoon and I K Han: Nonassociation of interleukin-1 receptor antagonist genotypes with bone mineral density, bone turnover status, and estrogen responsiveness in Korean postmenopausal women. Bone 2002;31:612-5 107

[70]

L Gennari, L Becherini, L Masi, R Mansani, S Gonnelli, C Cepollaro, S Martini, A Montagnani, G Lentini, AM Becorpi and ML Brandi: Vitamin D and Estrogen Receptor Allelic Variants in Italian Postmenopausal Women: Evidence of Multiple Gene Contribution to Bone Mineral Density . JCEM 1998;83:3 939-944.

[71]

Manolagas, S. C., Bellido, T., and Jilka, R. L: New insights into the cellular, biochemical, and molecular basis of postmenopausal and senile osteoporosis: roles of IL-6 and gp130. Int J Immunopharmacol 1995;17:109-116.

[72]

Arts, J., Kuiper, G. G., Janssen, J. M., Gustafsson, J. A., Lowik, C. W., Pols, H. A., and van Leeuwen, J. P:. Differential expression of estrogen receptors alpha and beta mRNA during differentiation of human osteoblast SV-HFO cells. Endocrinology 1997;138:5067-5070

[73]

Benz, D. J., Haussler, M. R., and Komm, B. S: Estrogen binding and estrogenic responses in normal human osteoblast- like cells. J Bone Miner Res 1991; 6:531-541.

[74]

Bord, S., Horner, A., Beavan, S., and Compston, J: Estrogen receptors alpha and beta are differentially expressed in developing human bone. J Clin Endocrinol Metab2001; 86:2309-2314.

[75]

Braidman, I. P., Hainey, L., Batra, G., Selby, P. L., Saunders, P. T., and Hoyland, J. A: Localization of estrogen receptor beta protein expression in adult human bone. J Bone Miner Res 2001;16:214-220.

[76]

Enmark, E., Pelto-Huikko, M., Grandien, K., Lagercrantz, S., Lagercrantz, J., Fried, G., Nordenskjold, M., and Gustafsson, J. A: Human estrogen receptor betagene structure, chromosomal localization, and expression pattern. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82:4258-4265.

[77]

Kuiper, G. G., Enmark, E., Pelto-Huikko, M., Nilsson, S., and Gustafsson, J. A: Cloning of a novel receptor expressed in rat prostate and ovary. Proc Natl Acad Sci U S A 1996;93:5925-5930.

[78]

Kuiper, G. G., Carlsson, B., Grandien, K., Enmark, E., Haggblad, J., Nilsson, S., and Gustafsson, J. A.: Comparison of the ligand binding specificity and transcript tissue distribution of estrogen receptors alpha and beta. Endocrinology 1997;138:863870.

[79]

Kuiper, G. G., Lemmen, J. G., Carlsson, B., Corton, J. C., Safe, S. H., van der Saag, P. T., van der Burg, B., and Gustafsson, J. A.: Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor beta. Endocrinology 1998;139:4252-4263. 108

[80]

Kumar, V., Green, S., Stack, G., Berry, M., Jin, J. R., and Chambon, P: Functional domains of the human estrogen receptor. Cell 1987; 51:941-951.

[81]

Paech, K., Webb, P., Kuiper, G. G., Nilsson, S., Gustafsson, J., Kushner, P. J., and Scanlan, T. S: Differential ligand activation of estrogen receptors ERalpha and ERbeta at AP1 sites. Science 1997;277:1508-1510.

[82]

Stein, B., and Yang, M. X.: Repression of the interleukin-6 promoter by estrogen receptor is mediated by NF-kappa B and C/EBP beta. Mol Cell Biol 1995;15:49714979.

[83]

Waters, K. M., Rickard, D. J., Riggs, B. L., Khosla, S., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S., Moore, J., and Spelsberg, T. C: Estrogen regulation of human osteoblast function is determined by the stage of differentiation and the estrogen receptor isoform. J Cell Biochem 2001;83:448-462.

[84]

Windahl, S. H., Vidal, O., Andersson, G., Gustafsson, J. A., and Ohlsson, C: Increased cortical bone mineral content but unchanged trabecular bone mineral density in female ERbeta(-/-) mice. J Clin Invest 1999;104:895-901.

[85]

Lindberg MK, Weihua Z, Andersson N, Moverare S, Gao H, Vidal O, Erlandsson M, Windahl S, Andersson G, Lubahn DB, Carlsten H, Dahlman-Wright K, Gustafsson JA, Ohlsson C: Estrogen receptor specificity for the effects of estrogen in ovariectomized mice. J Endocrinol 2002; 174:167-78.

[86]

Gutwein P, Mechtersheimer S, Riedle S, Stoeck A, Gast D, Joumaa S,

Zentgraf

H, Fogel M, Altevogt DP:ADAM10-mediated cleavage of L1 adhesion molecule at the cell surface and in released membrane vesicles. FASEB J 2003;17:292-4. [87]

Hayes AJ, Benjamin M, Ralphs JR: Role of actin stress fibres in the development of the intervertebral disc: cytoskeletal control of extracellular matrix assembly. Dev Dyn 1999;215:179-89.

[88]

Zhu AX, Zhao Y, Flier JS: Molecular cloning of two small GTP-binding proteins from human skeletal muscle. Biochem Biophys Res Commun 1994; 205:1875-82

[89]

Uphues I, Kolter T, Goud B, Eckel J: Insulin-induced translocation of the glucose transporter GLUT4 in cardiac muscle: studies on the role of small-molecular-mass GTP-binding proteins. Biochem J 1994; 301:177-82

[90]

Smythe E: Direct interactions between rab GTPases and cargo. Mol Cell 2002; 9:2056.

[91]

Wu G, Yussman MG, Barrett TJ, Hahn HS, Osinska H, Hilliard GM, Wang X, Toyokawa T, Yatani A, Lynch RA, Robbins J, Dorn GW: Increased myocardial 109

Rab GTPase expression: a consequence and cause of cardiomyopathy. Circ Res 2001; 89:130-7. [92]

Abu-Amer Y, Teitelbaum SL, Chappel JC, Schlesinger P, Ross FP: Expression and regulation of RAB3 proteins in osteoclasts and their precursors. J Bone Min Res 1999;14:1855-60.

[93]

Xiangli Yang and Gerard Karsenty: Transcription factors in bone: developmental and pathological aspects Trends Mol Med 2002; 8:340-5.

[94]

de Crombrugghe B, Lefebvre V, Nakashima K:Regulatory mechanisms in the pathways of cartilage and bone formation. Curr Opin Cell Biol 2001;13:721-7.

[95]

Gutierrez S, Javed A, Tennant DK, Rees M, Montecino M, Stein GS, Stein JL, Lian JB: CCAAT/enhancer-binding proteins (C/EBP) beta and delta activate osteocalcin gene transcription and synergize with Runx2 at the C/EBP element to regulate bone-specific expression. J Biol Chem 2001; 277:1316–1323.

[96]

Umayahara Y, Billiard J, Ji C, Centrella M, McCarthy TL, Rotwein P: CCAAT/enhancer-binding protein delta is a critical regulator of insulin-like growth factor-I gene transcription in osteoblasts J Biol Chem 1999; 274:10609–10617.

[97]

Miyazawa K, Mori A, Yamamoto K, Okudaira H: Transcriptional roles of CCAAT/enhancer binding protein-beta, nuclear factor-kappaB, and C-promoter binding factor 1 in interleukin (IL)-1beta-induced IL-6 synthesis by human rheumatoid fibroblast-like synoviocytes. J Biol Chem 1988;273:7620-7.

[98]

Harrison JR, Kelly PL, Pilbeam CC: Involvement of CCAAT enhancer binding protein transcription factors in the regulation of prostaglandin G/H synthase 2 expression by interleukin-1 in osteoblastic MC3T3-E1 cells. J Bone Min Res 2000;15:1138-46.

[99]

Erices A, Conget P, Rojas C, Minguell JJ: Gp130 activation by soluble interleukin6 receptor/interleukin-6 enhances osteoblastic differentiation of human bone marrowderived mesenchymal stem cells. Exp Cell Res 2002; 280:24-32.

[100] Girasole G, Jilka RL, Passeri G, Boswell S, Boder G, Williams DC, Manolagas SC: 17 beta-estradiol inhibits interleukin-6 production by bone marrow-derived stromal cells and osteoblasts in vitro: a potential mechanism for the antiosteoporotic effect of estrogens. J Clin Invest 1992 ;89:883–891. [101] Bismar H, Diel I, Ziegler R, Pfeilschifter J: Increased cytokine secretion by human bone marrow cells after menopause or discontinuation of estrogen replacement. J Clin Endocrinol Metab 1995;80:3351–3355 110

[102] Vales LD, Friedl EM: Binding of C/EBP and RBP (CBF1) to overlapping sites regulates interleukin-6 gene expression. J Biol Chem 2002 ;277:42438-46. [103] Boruk M, Savory JG, Hache RJ: AF-2-dependent potentiation of CCAAT enhancer binding protein beta-mediated transcriptional activation by glucocorticoid receptor. Mol Endocrinol 1988 ;12:749- 63 [104] Seck T, Diel I, Bismar H, Ziegler R, Pfeilschifter J: Expression of Interleukin-6 (IL6) and IL-6 receptor mRNA in human bone samples from pre- and postmenopausal women. Bone 2002;30:217-22. [105] Hove-Madsen L, Tort L: Characterization of the relationship between Na+ -Ca2+ exchange rate and cytosolic calcium in trout cardiac myocytes. Pflugers Arch 2001;441:701-8. [106] Lytton J, Li XF, Dong H, Kraev A: K+-dependent Na+/Ca2+ exchangers in the brain. Ann N Y Acad Sci 2002 ;976:382-93. [107] Yamashita J, Kita S, Iwamoto T, Ogata M, Takaoka M, Tazawa N, Nishikawa M, Wakimoto K, Shigekawa M, Komuro I, Matsumura Y: Attenuation of ischemia/reperfusion-induced renal injury in mice deficient in Na+/Ca2+ exchanger. J Pharmacol Exp Ther 2003 ;304:284-93. [108] Moonga BS, Davidson R, Sun L, Adebanjo OA, Moser J, Abedin M, Zaidi N, Huang CL, Zaidi M: Identification and characterization of a sodium/calcium exchanger, NCX-1, in osteoclasts and its role in bone resorption. Biochem Biophys Res Commun 2001; 283:770-5. [109] Zaidi M, Moonga BS, Adebanjo OA: Novel mechanisms of calcium handling by the osteoclast: A review-hypothesis. Proc Assoc Am Physicians. 1999;111:319-27. [110] Stains JP, Gay CV: Asymmetric distribution of functional sodium-calcium exchanger in primary osteoblasts.J Bone Min Res 1988 ;13:1862-9. [111] Patton AJ, Genever PG, Birch MA, Suva LJ, Skerry TM: Expression of an Nmethyl-D-aspartate-type receptor by human and rat osteoblasts and osteoclasts suggests a novel glutamate signaling pathway in bone. Bone 1988 ;22:645-9. [112] Itzstein C, Espinosa L, Delmas PD, Chenu C: Specific antagonists of NMDA receptors prevent osteoclast sealing zone formation required for bone resorption. Biochem Biophys Res Commun 2000;268:201-9. [113] Toulon P, Bardin JM, Blumenfeld N: Increased heparin cofactor II levels in women taking oral contraceptives Thromb Haemost 1990;64:365-8.

111

[114] Rodan SB, Wesolowski G, Thomas K, Rodan GA: Growth stimulation of rat calvaria osteoblastic cells by acidic fibroblast growth factor. Endocrinology 1987;121:1917-1923. [115] Wronski TJ, Ratkus AM, Thomsen JS, Vulcan Q, Mosekilde L: Sequential Treatment with Basic Fibroblast Growth Factor and Parathyroid Hormone Restores Lost Cancellous Bone Mass and Strength in the Proximal Tibia of Aged Ovariectomized Rats. J Bone Min Res 2001;16:1399-407. [116] Hatfield JT, Rothnagel JA, Smith R: Characterization of the mouse hnRNP A2/B1/B0 gene and identification of processed pseudogenes. Gene 2002;295:33-42. [117] Aubin JE, Bonnelye E: Osteoprotegerin and its ligand: a new paradigm for regulation of osteoclastogenesis and bone resorption. Osteoporos Int 2000;11:905-13. [118] Shiotani A, Takami M, Itoh K, Shibasaki Y, Sasaki T: Regulation of osteoclast differentiation and function by receptor activator of NFkB ligand and osteoprotegerin. Anat Rec 2002;268:137-46. [119] Cheung J, Mak YT, Papaioannou S, Evans BA, Fogelman I, Hampson G: Interleukin-6 (IL-6), IL-1, receptor activator of nuclear factor kappaB ligand (RANKL) and osteoprotegerin production by human osteoblastic cells: comparison of the effects of 17-beta oestradiol and raloxifene. J Endocrinol 2003;177:423-33. [120] Cao J, Venton L, Sakata T, Halloran BP: Expression of RANKL and OPG correlates with age-related bone loss in male C57BL/6 mice. J Bone Min Res 2003;18:270-7. [121] Thomas GP, Baker SU, Eisman JA, Gardiner EM: Changing RANKL/OPG mRNA expression in differentiating murine primary osteoblasts. Endocrinol 2001;170:451-60. [122] Bord S, Ireland DC, Beavan SR, Compston JE: The effects of estrogen on osteoprotegerin, RANKL, and estrogen receptor expression in human osteoblasts. Bone 2003;32:136-41 [123] Hegedus Z, Czibula A, Kiss-Toth E: Tribbles: novel regulators of cell function; evolutionary aspects. Cell Mol Life Sci 2006;63:1632. [124] Sung HY, Francis SE, Crossman DC, Kiss-Toth E: Regulation of expression and signalling modulator function of mammalian tribbles is cell-type specific. Immunol Lett 2006;104:171.

112

[125] Grill C, Gheyas F, Dayananth P, Jin W, Ding W, Qiu P, Wang L, Doll RJ, English JM: Analysis of the ERK1,2 transcriptome in mammary epithelial cells. Biochem J 2004;381:635. [126] Murakami Y: Involvement of a cell adhesion molecule, TSLC1/IGSF4, in human oncogenesis. Cancer Sci 2005;96:543. [127] Lin CY, Strom A, Vega VB, Kong SL, Yeo AL, Thomsen JS, Chan WC, Doray B, Bangarusamy DK, Ramasamy A, Vergara LA, Tang S, Chong A, Bajic VB, Miller LD, Gustafsson JA, Liu ET: Discovery of estrogen receptor alpha target genes and response elements in breast tumor cells. Genome Biol 2004;5:R66. [128] Schroeder TM, Jensen ED, Westendorf JJ: Runx2: a master organizer of gene transcription in developing and maturing osteoblasts. Birth Defects Res C EmbryoToday 2005;75:213. [129] Komori T: Requisite roles of Runx2 and Cbfb in skeletal development. J Bone Miner Metab 2003;21:193. [130] Enomoto H, Shiojiri S, Hoshi K, Furuichi T, Fukuyama R, Yoshida CA, Kanatani N, Nakamura R, Mizuno A, Zanma A, Yano K, Yasuda H, Higashio K, Takada K, Komori T: Induction of osteoclast differentiation by Runx2 through receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) and osteoprotegerin regulation and partial rescue of osteoclastogenesis in Runx2-/- mice by RANKL transgene. J Biol Chem 2003;278:23971. [131] Franceschi RT, Xiao G: Regulation of the osteoblast-specific transcription factor, Runx2: responsiveness to multiple signal transduction pathways. J Cell Biochem 2003;88:446. [133] Woei Ng K, Speicher T, Dombrowski C, Helledie T, Haupt LM, Nurcombe V, Cool SM: Osteogenic differentiation of murine embryonic stem cells is mediated by fibroblast growth factor receptors. Stem Cells Dev 2007;16:305-318. [134] Tarjan G, Stern PH: Triiodothyronine potentiates the stimulatory effects of interleukin-1-beta on bone resorption and medium interleukin-6 content in fetal rat limb bone cultures. J. Bone Miner Res 1995; 10: 1321-1326. [135] Lakatos P, Földes P, Horváth Cs, Kiss L, Tátrai Á, Takács I, Tarján G, Stern HP. Serum interleukin-6 and bone metabolism in patiens with thyroid function disorders. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1997; 82: 78-81

113

10.SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE 10.1.Az értekezés témájával összefüggő saját közlemények jegyzéke 1

Kucsera M, Takács I, Nagy Z, Speer G, Bori Z, Demeter J, Horváth C, Kiss L, Lakatos P: A D vitamin-receptor génjének polimorfizmusa és a szérum alulkarboxilált osteocalcin szintjének összefüggése. Ca és csont. 1999. 2:54-58.

2

Nagy Zs, Speer G., Cseh K., Mohari K., Jánoki G., Takács I., Horváth C., Földes J., Lakatos P.: Tumor necrosis faktor alfa termelés és csont ásványianyag tartalom hyperthyreosisban. Ca és Csont 3: 11-15, 2000

3

Bajnok E, Takacs I, Vargha P, Speer G, Nagy Z, Lakatos P: Lack of association between IL-1RN gene polymorphism and bone mineral density in Hungarian postmenopausal women. Bone 2000. 27:559-562.

4

IF: 3.998

P. Lakatos, J. Földes, Z. Nagy, I. Takács, G. Speer, C. Horváth, S. Mohan, DJ. Baylink, PH. Stern: Serum IGF-I, IGF binding proteins and bone mineral content in hyperthyroidism. Thyroid 10: 417-423, 2000

5

IF: 2.047

Radeff JM, Nagy Z, Stern PH: Involvement of pkc-beta in pth, tnf-alpha, and il-1beta effects on IL6 promoterin osteoblastic cells and on pth-stimulated bone resorption. Exp Cell Res. 2001 Aug 15;268(2):179-88

6

IF: 3.25

Nagy Z, Radeff J, Stern PH: Stimulation of interleukin-6 promoter by parathyroid hormone, tumor necrosisfactor alpha, and interleukin-1beta in UMR-106 osteoblastic cells is inhibited by protein kinase C antagonists. J Bone Miner Res. 2001;16(7):12207.

7

IF: 6.477

Radeff JM, Nagy Z, Stern PH.Rho and Rho kinase are involved in parathyroid hormone-stimulated protein kinase C alpha translocation and IL-6 promoter activity in osteoblastic cells. J Bone Miner Res. 2004 ;19(11):1882-91. IF: 6.477

8

Takács I, Speer G, Bajnok E, Tabák A, Nagy Z, Horváth C, Kovács K, Lakatos P: Lack of association between calcium-sensing receptor gene "A986S" polymorphism and

bone

mineral

density

in

Bone 2002. 30 (6): 849-852.

Hungarian

postmenopausal IF.: 3.998

114

women.

9

Z. Bori Z, G. Speer, I. Takács, Z. Nagy, C. Horváth, P. Lakatos.: Interactive effect of vitamin D and estradiol receptor genotypes as a determinant of bone mineral density. Journal of Bone and Mineral Research, 14: S333, 1999

IF: 6.477

10 J. M. Radeff,Z. Nagy,P. H. Stern: Role of Small G Proteins in Parathyroid Hormone Signaling in UMR-106 Osteoblasts . Journal of Bone and Mineral Research (S1): M215, 2000

IF: 6.477

11 Z. Nagy,P. H. Stern,L. Madison Difference in Suppression by Human ERβ and Human ERα of PTH Induced IL-6 Expression in UMR-106 Rat Osteosarcoma Cells . Journal of Bone and Mineral Research (S1): M499, 2000

IF: 6.477

12 Radeff, J.M., Dossing D.A., Nagy, Z., Hsieh, M.-R.: Parathyroid hormone activationof protein kinase C-b in UMR-106 osteoblastic cells: Characteristics and potential role J. Bone Min. Res. 14: Suppl. 1: S421, 1999.

IF: 6.479

13 J.M. Radeff, Z. Nagy, P.H. Stern Role of Small G Proteins in Parathyroid Hormone Signaling in UMR-106 Osteoblasts Chicago Signal Transduction Symposium 2001 14 Nagy Zs.,P.H.Stern.:Szisztémás hormonok hatása az IGF-I gén promóterre. Magyar Endokrinológiai és Anyagcsere Társaság XVII. Kongresszusa, 1998. 15 Nagy Z, Puskas GL, Zvara A, Nagy BZS, Speer G, Takacs I, Bajnok E, Kosa J, Hamar P, Kokeny G, Lakatos P: Global transcription profiling of estrogen activity: Estrogen regulates gene expression in the mouse bone. Osteoporosis Int 2004. 15(S1):S17.

IF.: 3.893

16 Nagy Zs, Speer G., Lakatos P.: Az ösztrogén aktivitás átfogó transzkripcionális vizsgálata: ösztrogén regulálta gének egércsontban. Magyar Belorvosi Archivum. 2004. LVII.: 103. 17 J. M. Radeff,Z. Nagy,P. H. Stern: Role of Small G Proteins in Parathyroid Hormone Signaling in UMR-106 Osteoblasts . Journal of Bone and Mineral Research (S1): M215, 2000

IF: 6.477

18 Kósa JP, Balla B, Speer G, Kiss J, Borsy A, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Nagy Zs, Bácsi K, Orosz L, Lakatos P: Effect of menopause on gene expression pattern in bone tissue of nonosteoporotic women. Menopause 2009. 16(2): 367-377.

115

IF.: 3.670

10.2.További saját közlemények jegyzéke Könyvek, könyvrészletek: 1. K. Cseh, C. Keszthelyi, P. Szénási, G. Speer, Z. Nagy, D. Salamon, Á. Kovács: Increased tumor necrosis factor production of peripheral blood mononuclear cells in Crohn's disease. 22nd Congress of the International Society of Internal Medicine, International Proceedings Division, Monduzzi Editore 1994; 525-528. 2. Nagy Zs: Tumor nekrózis faktorok, In:A kálciumháztartás és a csontszövet betegségei. EDS: Lakatos P., Medicina, Budapest,1999. 3. Nagy Zs: Transzformáló növekedési faktorok, In:A kálciumháztartás és a csontszövet betegségei. EDS: Lakatos P., Medicina, Budapest,1999. 4. Nagy Zs: Endokrinológiai segédlet. Semmelweis Kiadó, Budapest, 2005. 5. Nagy Zs.: Anyagcsere csontbetegségek. In: Klinikai reumatológia (Szerk.: Gömör B), Medicina, Budapest, 2005, p.:706-712. 6. Nagy Zs : A csontszövet szerkezete és élettana. In: Klinikai reumatológia (Szerk.: Gömör B), Medicina, Budapest, 2005, p.:671-679. 7. Nagy Zs: A csontsejtek együttműködése. In: Metabolikus csontbetegségek 36-51. Szerk.: Lakatos P, Takács I. Medintel Könyvkiadó, Budapest, 2006. 8. Nagy Zs: A csontsejtek együttműködése. In: Metabolikus csontbetegségek 36-51. Szerk.: Lakatos P, Takács I. Medintel Könyvkiadó, Budapest, 2006. 9. Nagy Zs: Szekunder osteoporosisok. In: Metabolikus csontbetegségek 231-37. Szerk.: Lakatos P, Takács I. Medintel Könyvkiadó, Budapest, 2006. 10. Nagy Zs: Csontmetasztázisok. In: Metabolikus csontbetegségek 231-37. Szerk.: Lakatos P, Takács I. Medintel Könyvkiadó, Budapest, 2006. 11. Nagy Zs, Szekeres L, Lakatos P,: Labordiagnosztika. In: Csont-izületi daganatok és daganatszerű elváltozások p. 303-307. Szerk.: Szendrői M, Vízkelety T. Medicina, 2007. 12. Nagy Zs: In vitro laboratóriumi vizsgálatok.In: Pajzsmirigybetegségek a gyakorlat oldaláról. p35-50, Szerk: Lakatos P, Takács I. Semmelweis Kiadó, Budapest, 2007. 13. Győri G, Nagy Zs: Képalkotó vizsgálatok.In: Pajzsmirigybetegségek a gyakorlat oldaláról. P55-67, Szerk: Lakatos P, Takács I. Semmelweis Kiadó, Budapest, 2007.

116

14. Nagy Zs: A pajzsmirigybetegségek oszteologiai vonatkozásai.In vitro laboratóriumi vizsgálatok.In: Pajzsmirigybetegségek a gyakorlat oldaláról. p35-50, Szerk: Lakatos P, Takács I. Semmelweis Kiadó, Budapest, 2007.

Cikkek: 15. Winkler G., Lakatos P., Nagy Z., Speer G., Salamon F., Szekeres O., Kovács M., Cseh K.: Elevated serum tumor necrosis factor- and endothelin 1 levels correlate with increased C-peptide concentration in android type obesity. („Research letter” Letter to the Editor) Diabetes Care 21: 1778-1779, 1998 IF: 4.180 16. G. Winkler, P. Lakatos, F. Salamon, Z. Nagy, G. Speer, M. Kovács, G. Harmos, O. Dworak, K. Cseh: Elevated serum TNF- level as a link between endothelial dysfunction and insulin resistance in normotensive obese patients. Diabetic Medicine 16: 207-211, 1999

IF: 2.170

17. Lakatos P., Nagy Z., Kiss L., Horváth C., Takács I., Földes J., Speer G., Bossányi A.: Prevention of corticosteroid induced osteoporosis by alfacalcidol. Zeitschrift für Rheumatologie 59:S1: I48-I52, 2000

IF: 0.730

18. G. Speer, O. Dworak, K. Cseh, Z. Bori, D. Salamon, I. Török, G. Winkler, P. Vargha, Z. Nagy, I. Takács, M. Kucsera, P. Lakatos: Vitamin D receptor gene BsmI polymorphism correlates with the erbB-2/HER-2 expression in human rectal cancer. Oncology 58: 242-247, 2000

IF: 2.584

19. G. Speer, K. Cseh, G. Winkler, I. Takács, I. Barna, Z. Nagy, P. Lakatos: Estrogen and vitamin D receptor genotypes and the expression of erbB-2 and EGF receptor in human rectal cancer. European Journal of Cancer 37: 1463, 2001

IF: 3.460

20. G. Speer, M. Tóth, HH. Niller, D. Salamon, I. Takács, P. Miheller, A. Patócs, Z. Nagy, É. Bajnok, P. Nyiri, P. Lakatos: Calcium metabolism and endocrine functions in a family with familial hypocalciuric hypercalcemia. Experimental and Clinical Endocrinology and Diabetes 111: 486-490, 2003

IF.: 1.503

21. Fuszek P., Lakatos P., Tabak A., Papp J., Nagy Z., Takacs I., Horvath HC., Lakatos PL., Speer G.: Relationship between serum calcium and CA 19-9 levels in colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology 10:1890-1892, 2004

117

IF.: 3.318

22. F. Szalay, A. Folhoffer, A. Horvath, T. Csak, G. Speer, Z. Nagy, P. Lakatos, C. Horvath, A. Habior, I. Tornai, P.L. Lakatos: Serum leptin, soluble leptin receptor and free leptin index in patients with primary biliary cirrhosis. Eur. J. Gastroen. Hepat. 17:923-928, 2005

IF.: 1.690

23. Á. Lazáry, B. Balla, J.P. Kósa, K. Bácsi, Z. Nagy, I. Takács, PP. Varga, G. Speer,P.Lakatos:Effect of gypsum on proliferation and differentiation of MC3T3-E1 mouse osteoblastic cells. Biomaterials,2007 28:393-9,

IF.: 6.262

24. K. Bácsi, J. P. Kósa, G. Borgulya, B. Balla, Á. Lazáry, Z. Nagy, C. Horváth, G. Speer, P. Lakatos: CYP3A7*1C polymorphism, serum dehydroepiandrosterone sulphate level and bone mineral density in postmenopausal women. Calcified Tissue International 80: 154-159, 2007

IF.: 2.483

25. B. Balla, J. P. Kósa, J. Kiss, A. Borsy, J. Podani, I. Takács, Á. Lazáry, Z. Nagy, K. Bácsi, G. Speer, L. Orosz, P. Lakatos: Different gene expression patterns in the bone tissue of aging postmenopausal osteoporotic and healthy women Calcified Tissue International 82:12-26, 2008

IF.: 2.483

26. Á. Lazáry, G. Speer, P.P. Varga, B. Balla, K. Bácsi, J.P. Kósa, Z. Nagy, I. Takács, P. Lakatos: The effect of vertebroplasty filler materials on viability and gene expression of human nucleus pulposus cells. Journal of Orthopedic Research 26: 601-607, 2008 IF.: 2.784 27. Á. Lazáry, J. P. Kósa, B. Tóbiás, J. Lazáry, B. Balla, K. Bácsi, I. Takács, Z. Nagy, T. Mező, G. Speer, P. Lakatos: Single nucleotide polymorphisms in new candidate genes are associated with bone mineral density and fracture risk. European Journal of Endocrinology 159: 187-196, 2008

IF.: 3.145

28. K. Bácsi, J. P. Kósa, Á. Lazáry, B. Balla, H. Horváth, A. Kis, Zs. Nagy, I. Takács, P. Lakatos, G. Speer: Effect of LCT 13910 C/T polymorphism on serum calcium level and bone mineral density in postmenopausal women. Osteoporosis International (közlés alatt)

IF.: 3.893

29. Balla B, J.P. Kósa, J. Kiss, J. Podani, I. Takács, G. Speer, K. Bácsi, Á. Lazáry, Z. Nagy, P. Lakatos: Transcriptional profiling of immune system-related genes in postmenopausal osteoporotic versus non-osteoporotic human bone tissue. Clin Immunol. 2009 Feb 19.

IF.: 3.551

30. J. Kiss, B. Balla, J.P. Kósa, J. Podani, I. Takács, Á. Lazáry, Z. Nagy, K. Bácsi, G. Speer, P. Lakatos: Gene expression patterns in the bone tissue of women with fibrous dysplasia. (közlésre elküldve – Journal of Bone and Joint Surgery) 118

31. Bácsi K, Kósa JP, Lazáry Á, Balla B, Horváth H, Kis A, Nagy Z, Takács I, Lakatos P, Speer G: LCT 13910 C/T polymorphism, serum calcium, and bone mineral density in postmenopausal women. Osteoporos Int 2009. 20:639-645. 32. Nagy Zs: Az oszteoporotikus csontbetegségek diagnosztikája és kezelése. Magyar Orvos, 2006. 14: p29-32 33. Nagy Zs: A citokinek és növekedési faktorok szerepe a csontanyagcserében. Ca és csont 1998. 1(S1):S20-S24. 34. Nagy Zs, Speer G, Kiss L, Horváth C, Takács I, Földes J, Bossányi A, Lakatos P: Az alfacalcidol szerepe a glükokortikoidkezelés okozta osteoporosis megelőzésében: Hároméves követéses vizsgálat. Ca és csont 1998. 1(S1):S20-S24. 35. Bajnok É, Takács I, Tabák Á, Speer G, Nagy Zs, Horváth Cs, Mészáros Sz, Kósa J, Nyiri P, Lakatos P:Génpolimorfizmusok lehetséges szerepe a toxikus adenoma és az ezt kísérő osteopathia kialakulásában.Magyar Belorvosi Archívum, 2006. 61: p97-102 36. Speer G., Cseh K., Bori Z., Dworak O., Vargha P., Salamon D., Winkler G., Nagy Zs., Takács I., Kucsera M., Lakatos P.: A D vitamin receptor gén BsmI polimorfizmusa korrelál az erbB-2/HER-2 oncogen expressziójával humán rectalis daganatban. Magyar Belorvosi Archivum 52: 173-178, 1999 37. Kucsera M., Takács I., Nagy Zs., Speer G., Bori Z., Demeter J., Horváth C., Kiss L., Lakatos P.: A D vitamin receptor génjének polimorfizmusa és a szérum alulkarboxilált osteocalcin szintjének összefüggése. Ca és Csont 2: 54-58, 1999 38. Takács I., Bajnok É., Nagy Zs., Speer G., Bori Z., Kucsera M., Horváth C., Kiss L., Lakatos P.: Az interleukin-1 receptor antagonista protein génjének polimorfizmusa és a

csontásványianyag-tartalom

összefüggése

postmenopausás

nőknél.

Magyar

Belorvosi Archivum 52: 169-172, 1999 39. Speer G., Cseh K., Fuszek P., Dworak O., Vargha P., Takács I., Nagy Zs., Lakatos P.: Ösztrogén-, D-vitamin- és kalcium-érzékelő receptorok genotípusainak szerepe a colorectalis daganatok patogenezisében. Orvosi Hetilap 142: 947-951, 2001 40. Lakatos P., Nagy Zs., Takács I., Speer G., Horváth C., Vargha P.: Az alfacalcidiol kalcium- és csontanyagcserére kifejtett hatásának felmérése. Ca és Csont 1: 15-19, 1998 41. Speer G, Cseh K, Fuszek P, Dworak O, Vargha P, Takács I, Nagy Zs, Lakatos P: Ösztrogén-, D vitamin- és kalcium-érzékelő receptorok genotípusainak szerepe a colorectalis daganatok patogenezisében. Orvosi Hetilap 2001. 142:947-951.

119

42. Nagy Zs: Az osteoporosis okozta csonttörések

gyógyszeres megelőzése.

Orvostovábbképző Szemle XIII. évf. 1. szám, 2006. 43. Nagy Zs: Kommentár Bartl: A csontritkulás korszerű irányelvek szerinti kezelése c cikkhez. Orvostovábbképző Szemle, 2007. XIV(9):77-78. 44. Fuszek P, Lakatos P, Tabak A, Papp J, Nagy Zs, Lakatos PL, Speer G: A szérumkalciumszint jelentősége colorectalis daganatos betegekben. Orvosi Hetilap 2004. 145:1560-1565. 45. Speer G, Szenthe P, Kósa J, Tabák GÁ, Nagy Zs, Folhoffer A, Cseh K, Lakatos P: Az 1-es típusú kollagén A1-génjének – 1245 G/T polimorfizmusa összefügg a miokardialis infarktussaql: az új patogenetikai factor? Cardiologica Hungarica 2005. 35:64-69. 46. Demeter J, Nagy Zs, Horváth H: Csontvelőpunkció, csontvelő-biopszia : kommentár Orvostovábbképző szemle, 2007. (14. évf.) 3. sz. 85-86. old. 47. Bácsi K, Kósa J, Lazáry Á, Balla B, Horváth H, Takács I, Nagy Zs, Speer G, Lakatos P:

A

CYP3A7*1C-polimorfizmus

hatása

a

csont

ásványianyag-tartalmára

posztmenopauzás nőkben. Orvosi Hetilap 2007. 148:1273-1280. 48. Kósa J, Kis A, Bácsi K, Nagy Zs, Balla B, Lazáry Á, Takács I, Speer G, Lakatos P: Új, a glükokortikoid csontsejtekre gyakorolt hatásának közvetítésében szerepet játszó gének azonosítása izolált és immortalizált egér osteoblastsejteken. Magyar Belorvosi Archívum, 2007. 5:443-450. 49. Lazáry Á, Balla B, Kósa J, Bácsi K, Nagy Zs, Takács I, Varga PP, Speer G, Lakatos P: A szintetikus csontpótló graftok alkalmazásának összefoglalása. A gipsz szerepe a csontpótlásban: molekuláris biológiai megközelítéssel, saját eredmények alapján. Orvosi Hetilap, 2007. 148(51):2427-2433. 50. Bajnok É, Takács I, Tabák Á, Nagy Z, Horváth C, Mészáros S, Speer G, Lakatos P: Az ösztrogén receptor alpha gén Xba-I polimorfizmusa és annak hatása a hyperthyreosis

kialakulására,

valamint

a

pajzsmirigyhormonok

stimulálta

csontvesztésre. Orvosi Hetilap 2002. 143:972. 51. Speer G, Nagy Zs, Takács I, Cseh K, Winkler G, Bajnok É, Lakatos P: Szérum tumor necrosis factor alfa (TNF-α) szint és bioaktívitás, valamint D-vitamin (VDR) és ösztrogén receptor (ER) genotípusok android típusú obestitasban. Orvosi Hetilap 2002. 143:993. 52. Takács I, Horváth C, Bajnok É, Speer G, Nagy Zs, Tabák Á, Lakatos P: Genetikai polimorfizmusok hatása a csontminőségre hyperthyreotikus postmenopausas nőknél. 120

53. Nagy Zs: Hematológiai betegségek és a csontrendszer. Hematológia Transzfuziológia 2007. 40:49-57 54. Balla B., Kósa J., Takács I., Kiss J., Podani J., Borsy A., Lazáry Á., Bácsi K., Nagy Zs., Speer G., Orosz L., Lakatos P.: A menopauza hatása a csontszöveti génkifejeződésre posztmenopauzás és premenopauzás korú nem osteoporotikus nőkben. Magyar Belorvosi Archívum 61: 208-219, 2008 55. Nagy Zs: Gyakoribb mint gondolnánk: myeloma multiplex szekunder osteoporosis képében. Magyar Reumatológia, 2008, 49, 247–250. 56. Bácsi K, Kósa J, Balla B, Lazáry Á, Takács I, Nagy Z, Speer G, Lakatos P: A kalciummetabolizmus jelentősége a csontritkulás és a colorectalis daganat patogenezisében. Orvosképzés 2009. S2:101-110. 57. Nagy Zs: Kommentár: Az osteoporosis prevenciója és kezelése. Orvostovábbképző Szemle, 2009. 06, 10-13

121

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Lakatos Péter professzor segítőkészsége közismert. Mégis megkülönböztetett tiszteletemet, elismerésemet és külön baráti köszönetemet fejezem ki azért - a mellett, hogy a Klinikán laboratóriumában biztosította a kutatómunkámhoz szükséges feltételeket és hogy munkám során

végig mellettem volt és határozottan támogatott. Köszönettel tartozom Cseh Károly professzornak, aki elindított ezen az úton. Köszönettel tartozom Paula Sternek és Laird Madisonnak akik mellett megisherhettem a magasszintű kutatómunkát. Szeretném megköszönni témavezetőmnek, dr. Speer Gábor adjunktus úrnak baráti segítségét, bíztatását a Ph.D. dolgozat megírására és természetesen, hogy elvállalta témavezetésemet és a dolgozatom kijavításával is segítette munkámat. Különös hálával tartozom dr. Takács Istvánnak, dr. Kósa Jánosnak és dr. Tóth Tamásnak az együtt végzett munkáért és a sok szakmai segítségért. Köszönöm kutatócsoportunk tagjainak, Balla Bernadettnek, dr. Lazáry Áronnak, dr. Bácsi Krisztiánnak, dr. Kis Adriánnak, Tóbiás Bálintnak és mindazoknak, akik az elmúlt évek során

tanácsaikkal és kritikájukkal támogatták munkámat. Köszönöm laboratóriumunk minden kedves munkatársának. Szüleimnek, akik nélkül soha nem jutottam volna el ide.

Végül feleségem és fiam segítségét és törelmét köszönöm, akik az otthon melegét biztosították, melyből bármikor erőt meríthettem.

122

123