MULTIDROG REZISZTENCIA IN VIVO KIMUTATÁSA PETEFÉSZEK TUMOROKBAN MOLEKULÁRIS LEKÉPEZÉSSEL Dr. Krasznai Zoárd Tibor
Debreceni Egyetem OEC Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Debrecen, 2011. 10.17.
Bevezetés • A petefészek hám eredetű rosszindulatú daganatai – Incidencia 1276 eset, 24.1/ 100 000* – Mortalitás – Felismeréskor 70% III- IV stádium
• Kezelés: – sebészi (maximális tumorredukció) – kemotherápia (Taxol 175 mg/m2 + Carboplatin 6AUC) (GOG111- 1996)
• I.- II.-III. vonalbeli kezelések – (Doxorubicin, paclitaxel, platina, topotecan, gemcitabin, etoposid, Bevacizumab)
• Progresszió- ascites megjelenése • Citokinek, növekedéi faktorok, neovaszkularizáció, direkt limfatikus blokád, érpermeabilitás, haemodinamikai okok
• Progresszió okai
* Nemzeti rákregiszter 2006
Bevezetés • A petefészek hám eredetű rosszindulatú daganatai – Incidencia 1276 eset, 24.1/ 100 000* – Mortalitás – Felismeréskor 70% III- IV stádium
• Kezelés: – sebészi (maximális tumorredukció) – kemotherápia (Taxol 175 mg/m2 + Carboplatin 6AUC) (GOG111- 1996)
• I.- II.-III. vonalbeli kezelések – (Doxorubicin, paclitaxel, platina, topotecan, gemcitabin, etoposid, Bevacizumab)
• Progresszió- ascites megjelenése • Citokinek, növekedéi faktorok, neovaszkularizáció, direkt limfatikus blokád, érpermeabilitás, haemodinamikai okok
• Progresszió okai
* Nemzeti rákregiszter 2006
A P-glikoprotein • MDR1 gén által kódolt Pgp (ABCB1) • • • • • •
170 kD glycoprotein, 1280 aminosav ABC transzporter család tagja 7q (28 exon, 100 kb) 12 transzmembán hélix, „linker” szakasz ATP kötő hely Fiziológiás funkció (máj, vese, bél, vér- agy gát)
• Csökkent intracelluláris drogkoncentráció • • • • • •
Topoizomeráz inhibítorok (Hycamtin) Taxánok (Taxol, Taxotere) Anthracyclinek (Doxorubicin, Daunorubicin) Vinca alkaloidok (Vinblastin, Vincristin) Antibiotikumok Egyéb hidrofób anyagok (pl. Rhodamin 123, digoxin, quinidine)
A Pgp működésének „hidrofób porszívó” modellje Aktív drog efflux
Beoldódás a membránba
Pgp
Pgp szubsztrátok: pl. antraciklinek, vinca alkaloidok, epipodophyllotoxinok
Kioldódás a membránból
Biológiai rendszerek funkcionális vizsgálata
Molekuláris szintű
Celluláris, szöveti szintű
Élő szervezet szintjén PET/CT, SPECT/CT PET/MRI
Szöveti aktivitás
glükóz metabolizmus
Előzetes kutatási eredményeink 1. Áramlási citometriás módszert dolgoztunk ki a multidrog rezisztenciáért (MDR) felelős Pgp expressziójának kimutatására, valamint pumpa funkciójának vizsgálatára hám eredetű petefészek tumorban szenvedő betegek asciteséből származó sejteken. 2. Vizsgáltuk a kemoterápiás szerek akut hatását a tumordiagnosztikai radiofarmakonok felvételére MDR pozitív és MDR negatív tumorsejteken.
Petefészekrákos betegek asciteséből származó sejteken kimutatott különböző mértékű Pgp expresszió (konfokális fluoreszcens mikroszkópos felvétel)
• Ascites sejtek – jelölése: – (a) FITC-MM6.15 antitesttel – (b) PI-al – (c) Transzmissziós fénymikroszkópos felvétel – (d) fluoreszcens és transzmissziós képek fúziója
A Pgp pumpa különböző mértékű expressziójának kimutatása petefészek tumoros betegek asciteséből származó sejteken áramlási sejtanalizátoros méréssel B
A
izotipikus kontroll+FITC RAMIG UIC2+FITC RAMIG MM615+FITC RAMIG
izotipikus kontroll+FITC RAMIG UIC2+FITC RAMIG MM615+FITC RAMIG
100,00
100,00
80,00
80,00 Sejtszám
120,00
Sejtszám
120,00
60,00
60,00
40,00
40,00
20,00
20,00
0,00 1,00
10,00 100,00 1000,00 Fluorescencia intenzitás (arb. unit)
Pgp+=70%
10000,00
0,00 1,00
10,00
100,00
1000,00
Fluorescencia intenzitás(arb. unit)
Pgp+=28%
10000,00
A Pgp pumpa működésének vizsgálata R123 akkumulációjával A 160,00
Sejtszám
120,00
80,00
40,00
0,00 1,00
10,00 100,00 1000,00 Fluoreszcencia intenzitás (arb. unit )
10000,00
200,00
B
MDR- kontroll MDR- CSA 160,00
Sejtszám
• R123 (Pgp szubsztrát) • NIH 3T3 MDR1 G185 (Pgp+) (A) • NIH 3T3 (Pgp-) (B) sejteken teszteltük • 2 μM R-123 • 20 μM cyclosporin A
MDR+ kontroll MDR+ CSA
120,00
80,00
40,00
0,00 1,00
10,00 100,00 1000,00 Fluorescencia intenzitás ( arb . unit )
10000,00
A Pgp pumpa expressziójának és működésének párhuzamos vizsgálata áramlási sejtanalizátoros méréssel A
160
80
40
0 1,00
10,00 100,00 1000,00 10000,00 Fluoreszcencia intenzitás (arb. unit)
R123 kontroll R123 CSA 100,00
80,00 Sejtszám
• Pumpa funkció vizsgálat • R123 (CSA) B • (Pgp+=60%)
MM6.15+FITC RAMIG
120 Sejtszám
• Pgp kimutatás • MM6.15 MAB+ FITC RAMIG • (Pgp+=58%)
izotipikus kontroll+FITC RAMIG
60,00
40,00
20,00
0,00 1,00
10,00 100,00 1000,00 10000,00 Fluoreszcencia intenzitás (arb. unit)
A Pgp pumpa expressziójának és funkcionális vizsgálatának eredményei nyolc petefészek tumoros beteg ascites mintájában Betegek sorszáma
Sejt koncentráció x 105ml-1
RMM6.15
Pgp+ sejt % (MM6.15)
RR123
R123+ sejt %
PI+ %
15
0.1
9
28
1.57
20
10
16
0.4
6
43
1.4
30
8
17
5.5
18
76
2.1
70
5
18
0.5
14
47
2.6
40
7
19
1
17
21
2
20
3
21
1.2
8
58
2.8
60
3
22
0.7
11
67
1.3
60
10
23
3.7
16
89
2.5
70
10
RMM615 = az MM6.15 antitesttel jelölt átlagos FI és az izotipikus kontroll FI aránya RR123 = a CSA jelenlétében mért átlagos R123 FI és a kezeletlen kontroll FI aránya
A Pgp pumpa expressziójának és funkcionális vizsgálatának eredményei nyolc petefészek tumoros beteg ascites mintájában Betegek sorszáma
Sejt koncentráció x 105ml-1
RMM6.15
Pgp+ sejt % (MM6.15)
RR123
R123+ sejt %
PI+ %
15
0.1
9
28
1.57
20
10
16
0.4
6
43
1.4
30
8
17
5.5
18
76
2.1
70
5
18
0.5
14
47
2.6
40
7
19
1
17
21
2
20
3
21
1.2
8
58
2.8
60
3
22
0.7
11
67
1.3
60
10
23
3.7
16
89
2.5
70
10
RMM615 = az MM6.15 antitesttel jelölt átlagos FI és az izotipikus kontroll FI aránya RR123 = a CSA jelenlétében mért átlagos R123 FI és a kezeletlen kontroll FI aránya
r=0.976 p =3.2X10-5
• Az általunk kidolgozott áramlási citometriás módszer alkalmas a Pgp kimutatására és funkciójának élő sejteken történő detektálására. • Az ascitesből származó sejtek Pgp expressziós ill. funkcionális különbségei nem a sejtek eltérő proliferációs aktivitásának következményei. • Klinikai vizsgálatokban először mutattuk ki, hogy a petefészek tumoros betegek asciteséből származó sejtekben a Pgp fehérje különböző mértékben jelen van. Anticancer Res. 25, 1187-11892. 2005.
Kemoterápiás szerek hatása a tumordiagnosztikai radiofarmakonok akkumulációjára Pgp pozitív és negatív daganatos sejtekben •
18FDG
• szénhidrát anyagcsere • 18FDG-6P
•
11C-kolin
• kolin metabolizmus • tumorokban fokozott kolin kináz aktivitás
•
99mTc-MIBI
• perfúziós SPECT tracer • Lipofil kation • Pgp szubsztrát
11CH3
CH3
N+ CH3
CH2
CH2
OH
% FDG felvétel / millió sejt
Paclitaxel hatása A2780AD és A2780 sejtek 18FDG felvételének kinetikájára
A2780AD kontroll A2780AD paclitaxel (25 µM) A2780AD paclitaxel (50 µM) A2780 kontroll A2780 paclitaxel (25 µM) A2780 paclitaxel (50 µM)
1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0
10
20
30
40
Idő (perc)
50
60
70
% Tc-MIBI felvétel / millió sejt
Paclitaxel hatása A2780AD és A2780 sejtek 99mTc-MIBI felvételének kinetikájára
A2780AD kontroll A2780AD paclitaxel (25 µM) A2780AD paclitaxel (50 µM) A2780 kontroll A2780 paclitaxel (25 µM) A2780 paclitaxel (50 µM)
2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0
10
20
30 40 Idő (perc)
50
60
70
Tc-MIBI felvétel (kontroll %-ban)
Paclitaxel kezelés hatása A2780A (Pgp+) és A2780 (Pgp-) valamint JY (Pgp-) sejtek 99mTcMIBI felvételére 2100 1800
A2780AD A2780 JY
1500 1200 900 600 300 0 0
20
40 60 Paclitaxel cc (µM)
80
Kezelés
R123 felvétel a kontroll %-ban
DNR felvétel a kontroll %ban
99mTc-MIBI
18FDG
felvétel a kontroll % -ban
felvétel a kontroll % -ban
11C-kolin
felvétel a kontroll % ban
A2780AD CSA (20 µM)
2100
120*
550
15*
1700
VER (50 µM)
1200
63*
800
21*
92
Paclitaxel (10 µM)
180
10**
150
11**
120
Paclitaxel (25 µM)
210
10**
150
6**
250
Paclitaxel (50 µM)
208
13**
150
11**
1200
Paclitaxel (70µM)
212
11**
150
11**
1600
CSA (20 µM)
108
5
92
6
180
VER (50 µM)
91 13
96
8
Paclitaxel (10 µM)
86
6
92
Paclitaxel (25 µM)
80
7
Paclitaxel (50 µM)
83
Paclitaxel (70µM)
80
70*
140
11#
101
3
145
12#
52
5**
9
120
8
98
4
8**
130
11
102
110*
165
20**
97
6
130*
160
20**
95
7
8**
145
12#
103
3
130
7
92
12
49
6**
11
110
8
111
8
97
4
91
6
150
6**
123
11
97
5
9
88
11
180
15**
140
12#
102
11
75
5
210
17**
145
17#
96
7
4
A2780
6 7
Kezelés
R123 felvétel a kontroll %-ban
DNR felvétel a kontroll %ban
99mTc-MIBI
18FDG
felvétel a kontroll % -ban
felvétel a kontroll % -ban
11C-kolin
felvétel a kontroll % ban
A2780AD CSA (20 µM)
2100
120*
550
15*
1700
70*
140
11#
101
3
VER (50 µM)
1200
63*
800
21*
92
145
12#
52
5**
Paclitaxel (10 µM)
180
10**
150
11**
120
9
120
8
98
4
Paclitaxel (25 µM)
210
10**
150
6**
250
8**
130
11
102
Paclitaxel (50 µM)
208
13**
150
11**
1200
110*
165
20**
97
6
Paclitaxel (70µM)
212
11**
150
11**
1600
130*
160
20**
95
7
CSA (20 µM)
108
5
92
6
180
8**
145
12#
103
3
VER (50 µM)
91 13
96
8
130
7
92
12
49
6**
Paclitaxel (10 µM)
86
6
92
11
110
8
111
8
97
4
Paclitaxel (25 µM)
80
7
91
6
150
6**
123
11
97
5
Paclitaxel (50 µM)
83
9
88
11
180
15**
140
12#
102
Paclitaxel (70µM)
80
11
75
5
**
145
17#
96
7
4
A2780
6 7
Az A2780AD (Pgp+) ovárium carcinóma sejtvonal 18FDG felvétele magasabb, mint a Pgp- A2780 párjáé, ennek oka a pumpa működése következtében a Pgp+ sejtek fokozott energia igénye A paclitaxel (Pgp szubsztrát) megnöveli mind a Pgp+ mind a Pgp- sejtek 18FDG felvételét, de nincs hatással a 11Ckolin felhalmozódásra Paclitaxel kezelés revertálta a 99mTc-MIBI akkumulációját a Pgp+ sejtekben és csak kismértékben változtatta meg a Pgp- sejtek 99mTc-MIBI felvételét Eur. J. Pharm.Sci.28, 249-256, 2006
120 A2780AD A2780
100 80
^ ^
60
140
40 20 0 0
2
4
6
8
10
12
11C-kolin felvétel (a kontroll %-ban)
Daunorubicin concentráció (µM)
120 100
A2780AD A2780
^^
80
^
60
Izotóp felvétel (kontroll %-ban)
11
C-kolin felvétel (a kontroll %-ban)
Antraciklin származékok csökkentik a 11C-kolin felhalmozódását és nem befolyásolják az 18FDG felvételét a petefészek daganatos sejtekben
120
1 µM DNR (choline)
1 µM DNR (FDG)
5 µM DNR (choline)
5 µM DNR (FDG)
100
^
^
^
80 60
^ *
*
* *
40
* *
20 0 A2780AD
40
A2780
KBV-1
KB-3-1
JY
DDT1 MF2
20 0 0
2
4 6 8 Doxorubicin koncentráció (µM)
10
12
Antraciklin terápia befolyásolhatja a 11C-kolin-PET tumor diagnosztika eredményét, amit a helyes diagnozis felállításánál fegyelembe kell venni Appl.Radiation Isot. 67, 1806-1811, 2009
A
B 600
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
A2780AD A2780
0
5
10 15 CSA koncentráció (µM)
20
25
R123 fluoreszcencia intenzitás
UIC2/FITC Fluoreszcencia intenzitás
Kombinált kezelés (Pgp specifikus UIC2 antitest + Pgp blokkoló) hatékonyan blokkolja a Pgp pumpát a petefészek tumoros sejteken 500 400 300 A2780AD CSA A2780AD CSA+UIC2 (wash) A2780 CSA+UIC2 (wash)
200 100 0 0
5
C
10 15 CSA concentration (µM)
20
25
300
45000
DNR fluoreszcencia intenzitás
Tc-MIBI felvétel (cpm / millió sejt)
D 50000 40000 35000 30000 25000 20000 15000
A2780AD CSA A2780AD CSA+UIC2 (wash) A2780 CSA+UIC2 (wash)
10000 5000 0 0
5
10
15
CSA koncentráció (µM)
20
25
250 200 150 100
A2780AD CSA A2780AD CSA+UIC2 (wash) A2780 CSA+UIC2 (wash)
50 0 0
5
10 15 CSA koncentráció (µM)
20
25
A kombinált kezelés hatása nyomonkövethető tumordiagnosztikai tracerekkel
FDG felvétel a kontroll %-ában
A2780AD
A2780
100 *
*
80 60 40 20
Tc-MIBI felvétel a kontrol %-ában
1200
120
#
#
1000 A2780AD A2780
800 600 400 200 0
0 CSA
Pacl
UIC2
CSA+UIC2
Pacl+UIC2
Eur.J.Pharm.Sci. 41, 665-669. 2010
CSA
Pacl
UIC2
CSA+UIC2
Pacl+UIC2
Szodoray pályázat kutatási célkitűzései 1. Citosztatikumok hatása a PET tumordiagnosztikai tracerek szöveti akkumulációjára- in vivo vizsgálatok Pgp pozitív és Pgp negatív tumorok esetén
Szodoray pályázat kutatási célkitűzései II. • Xenotranszplantációs kísérleti állatmodell kialakítása – SCID BC-17 egér – Multidrog rezisztens és szenzitív daganat – In vivo mini PET kamera (1mm) – Statikus és dinamikus vizsgálatok
Tumordiagnosztika és terápia mini-PET kamerával
Pgp pozitív
Pgp negatív
Xenograft állatmodell Pgp pozitív és Pgp negatív humán daganatok in vivo vizsgálatára
Szodoray pályázat kutatási célkitűzései III. • Petefészekrákos betegek primer műtéti anyagából származó minták vizsgálata – Áramlási cytometriás vizsgálatok (immunfluorescens technika, UIC2 jelölés, R123- funkcionális vizsgálatok) – Ascites – Szöveti minták – Pgp státusz összefüggése a progressziómentes túléléssel (standard)
• 11C- verepamil in vitro mérésekkel történő validálása az in vivo miniPET mérésekhez
Várható tudományos eredmények Eredményeink hozzájárulnak: • A petefészek tumoros betegek kemoterápiájának hatékonyabb tervezését lehetővé tevő módszer kidolgozásához. •
Petefészek tumoros betegek izotópdiagnosztikai vizsgálata során nyert információk helyes értelmezését elősegítő eljárás kialakításához.
Kollaborációs kapcsolatok
• • • •
DE OEC Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Nőgyógyászati Onkológiai Tanszék DE OEC Nukleáris Medicína Intézet DE OEC Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet DE EOC Pathológiai Intézet
Köszönet nyilvánítás • DEOEC Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet Dr. Goda Katalin, Prof. Szabó Gábor • DEOEC Nukleáris Medicina Intézet Prof. Trón Lajos, Prof. Galuska László, Dr. Balkay László, Dr. Mikecz Pál, Dr. Trencsényi György, Nagy Tamás • DEOEC Szülészet és Nőgyógyászati Klinika Prof. Hernádi Zoltán, Prof. Tóth Zoltán • Továbbá: közös publikációink társszerzőinek
Köszönöm a figyelmet!
