UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie Academiejaar 2014-2015
DE ONTWIKKELING VAN EEN HPLC-MS/MS MULTI-ANALYTMETHODE VOOR DE DETECTIE EN KWANTIFICATIE VAN DRUGS IN VOLBLOED
Saar FAVOREEL Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor Prof. Dr. C. Stove
Commissarissen Dr. Katleen Van Uytfanghe Dr. Marthe De Boevre
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie Academiejaar 2014-2015
DE ONTWIKKELING VAN EEN HPLC-MS/MS MULTI-ANALYTMETHODE VOOR DE DETECTIE EN KWANTIFICATIE VAN DRUGS IN VOLBLOED
Saar FAVOREEL Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor Prof. Dr. C. Stove
Commissarissen Dr. Katleen Van Uytfanghe Dr. Marthe De Boevre
AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.” 21 mei 2012 Promotor
Auteur
Prof. Dr. C. Stove
Saar Favoreel
SAMENVATTING
Het besturen van voertuigen onder invloed van drugs is een actueel probleem. Het doel van deze thesis is de ontwikkeling van een HPLC-MS/MS multi-analytmethode voor de detectie en kwantificatie van verscheidene klassen drugs in volbloed. Tijdens deze thesis moeten zowel cannabinoïden, opiaten, cocaïne en benzoylecgonine, amfetamine, methamfetamine, en amfetamine-analogen worden bepaald binnen eenzelfde run. Hierbij is het belangrijk dat de ontwikkelde methode voldoende gevoelig is. Waarden lager dan de cut-off waarden die opgenomen zijn in wet betreffende rijden o.i.v. drugs moeten kunnen gekwantificeerd worden. Tijdens de ontwikkeling van deze methode werden eerst de MS-parameters geoptimaliseerd door gebruik te maken van infusie en flow injection analysis. Vervolgens werd de chromatografie geoptimaliseerd door verschillende kolommen, mobiele fases te evalueren. Uiteindelijk werd geopteerd voor een Kinetex C18 kolom, een core-shell kolom en als mobiele fase A 0,01 % mierenzuur, 1 % acetonitrile in water, mobiele fase B 0,01 % mierenzuur in acetonitrile. Het gradiënt werd geoptimaliseerd zodat voldoende resolutie werd bekomen in een zo kort mogelijke run. Tijdens de run moet gebruik gemaakt worden van polarity switching omdat 11-OH-THC en THC-COOH negatieve ionisatie ondergaan, terwijl de andere componenten positieve ionisatie ondergaan. Er werd ook gezocht naar een eenvoudige staalvoorbereiding met een voldoende hoog extractierendement. Uiteindelijk zijn twee verschillende staalvoorbereidingen uitgevoerd. Namelijk proteïneprecipitatie en vloeistof-vloeistof extractie. Uiteindelijk werd een chromatografische methode ontwikkeld van 10,5 minuten waarin alle componenten gevisualiseerd konden worden en zo goed mogelijk gescheiden zijn. De twee uitgevoerde
staalvoorbereidingsmethodes
moeten
in
de
toekomst
nog
geoptimaliseerd worden. Ook methodevalidatie zal nog moeten worden uitgevoerd.
verder
DANKWOORD
Het schrijven van een thesis is geen simpele opdracht; het zou onmogelijk zijn zonder hulp en steun van anderen. Als eerste wil ik mijn promotor Prof. Dr. C. Stove bedanken voor het interessante onderzoeksonderwerp en het ter beschikking stellen van het Laboratorium voor Toxicologie. Vervolgens wil ik mijn begeleidster Sara Capiau bedanken voor de goede begeleiding, grondige verbetering en interessante feedback. De doctoraatsstudenten wil ik bedanken voor de aangename werksfeer. Mijn medethesisstudent Sophie wil ik bedanken voor dit leuke semester. Ook wil ik vrienden en kotgenoten bedanken voor de steun tijdens deze stressvolle periode. Mijn vriend Siel wil ik bedanken voor het verdragen van mijn ‘kuren’. Als laatste en evenzeer de belangrijkste wil ik mijn ouders bedanken voor de steun tijdens deze thesis en om me de kans te geven deze studie aan te vatten. Dank je dat ik op kot mocht en hier een fantastische tijd heb. Ik weet dat jullie altijd in mij geloven en er altijd voor mij zullen zijn. Papa en Mama, bedankt voor alles.
1. INLEIDING ..................................................................................................................... 1 1.1 SITUERING VAN HET ONDERZOEK ........................................................................................ 1 1.2 DRUGSBEPALINGEN.............................................................................................................. 2 1.2.1 Screeningstesten ...................................................................................................... 2 1.2.1.1 Algemeen ....................................................................................................................... 2 1.2.1.2 Speekseltest ................................................................................................................... 2 1.2.1.3 Andere screeningstechnieken ........................................................................................ 3 1.2.2 Bevestigende testen ................................................................................................. 4 1.2.2.1 Algemeen ....................................................................................................................... 4 1.2.2.2 Speekselanalyse ............................................................................................................. 5 1.2.2.3 Bloedanalyse .................................................................................................................. 6 1.3 PSYCHOTROPE EN VERDOVENDE STOFFEN ......................................................................... 7 1.3.1 Cannabinoïden ......................................................................................................... 7 1.3.1.1 Algemeen ....................................................................................................................... 7 1.3.1.2 Metabolisatie ................................................................................................................. 7 1.3.2 Opiaten .................................................................................................................... 8 1.3.2.1 Algemeen ....................................................................................................................... 8 1.3.2.2 Morfine ........................................................................................................................... 9 1.3.2.3 Codeïne........................................................................................................................... 9 1.3.2.4 Heroïne ........................................................................................................................... 9 1.3.2.5 Metabolisatie ................................................................................................................. 9 1.3.3 Cocaïne .................................................................................................................. 11 1.3.3.1 Algemeen ..................................................................................................................... 11 1.3.3.2 Metabolisatie ............................................................................................................... 11 1.3.4 Amfetamines.......................................................................................................... 12 1.3.4.1 Algemeen ..................................................................................................................... 12
1.3.4.2 Metabolisatie ............................................................................................................... 13 1.3.5 Amfetamine-analogen ............................................................................................ 13 1.3.5.1 Algemeen ..................................................................................................................... 13 1.3.5.2 Metabolisatie ............................................................................................................... 13 1.4 HOGE DRUK VLOEISTOFCHROMATOGRAFIE TANDEM MASSASPECTROMETRIE .............. 14 1.4.1 Algemeen ............................................................................................................... 14 1.4.2 Hoge druk vloeistofchromatografie ........................................................................ 14 1.4.3 Massaspectrometrie ............................................................................................... 15 2. OBJECTIEVEN .............................................................................................................. 17 3. MATERIALEN EN METHODEN....................................................................................... 19 3.1 REAGENTIA ......................................................................................................................... 19 3.2. TOESTELLEN EN ANDERE MATERIALEN ............................................................................. 19 3.3 MEETINSTRUMENTEN ........................................................................................................ 20 3.4 AANMAKEN WERKOPLOSSINGEN ...................................................................................... 20 3.5 METHODEONTWIKKELING ................................................................................................. 21 3.5.1 Optimalisatie MS-parameters ................................................................................. 21 3.5.1.1 Startcondities gebaseerd op bestaande literatuur ...................................................... 21 3.5.1.2 Bepaling MRM-transities en optimalisatie componentspecifieke MS-parameters..... 21 3.5.1.3 Optimalisatie bronspecifieke MS-parameters ............................................................. 22 3.5.2 Optimalisatie chromatografie ................................................................................. 23 3.5.2.1 Startcondities gebaseerd op literatuur ........................................................................ 23 3.5.2.2 Kolomkeuze .................................................................................................................. 23 3.5.2.3 Mobiele fase ................................................................................................................. 23 3.5.2.4 Gradiënt........................................................................................................................ 24 3.5.2.5 Dwell-tijden .................................................................................................................. 25 3.5.2.6 Needle wash ................................................................................................................. 25
3.5.3 Staalvoorbereiding ................................................................................................. 25 3.5.3.1 Proteïneprecipitatie ..................................................................................................... 25 3.5.3.1.1 Proteïneprecipitatie met ACN ................................................................................... 25 3.5.3.1.2 Proteïneprecipitatie met MeOH ............................................................................... 26 3.5.3.1.3 Recovery proteïneprecipitatie ................................................................................... 26 3.5.3.1.4 Matrixeffect proteïneprecipitatie ............................................................................. 27 3.5.3.1.5 Selectiviteit ................................................................................................................ 27 3.5.3.2 Vloeistof-vloeistof extractie ......................................................................................... 27 3.5.3.2.1 Enkelvoudige vloeistof-vloeistof extractie ................................................................ 27 3.5.3.2.2 Dubbele vloeistof-vloeistof extractie ........................................................................ 28 3.5.3.2.3 Recovery en matrixeffect vloeistof-vloeistof extractie ............................................. 28 3.6 TOEPASSING VAN DE ONTWIKKELDE METHODE OP ROUTINESTALEN ............................. 28 3.6.1 Case 1 .................................................................................................................... 29 3.6.2 Case 2 .................................................................................................................... 29 4 RESULTATEN ................................................................................................................ 30 4.1. METHODEONTWIKKELING ................................................................................................ 30 4.1.1 Optimalisatie MS-parameters ................................................................................. 30 4.1.1.1 Bepaling MRM-transities en optimalisatie componentspecifieke MS-parameters..... 30 4.1.1.2 Optimalisatie bronspecifieke MS-parameters ............................................................. 32 4.1.2 Optimalisatie chromatografie ................................................................................. 32 4.1.2.1. Evaluatie methode gebaseerd op literatuur ............................................................... 32 4.1.2.2 Kolomkeuze .................................................................................................................. 33 4.1.2.3 Mobiele fase ................................................................................................................. 33 4.1.2.3 Gradiënt........................................................................................................................ 34 4.1.2.4 Needle wash ................................................................................................................. 37 4.1.3 Staalvoorbereiding ................................................................................................. 38
4.1.3.1 Proteïneprecipitatie ..................................................................................................... 38 4.1.3.1.1 Proteïneprecipitatie met ACN ................................................................................... 38 4.1.3.1.2 Proteïneprecipitatie met MeOH ............................................................................... 38 4.1.3.1.3 Recovery van de proteïnepreciptatie ........................................................................ 38 4.1.3.1.4 Matrixeffect proteïneprecipitatie ............................................................................. 39 4.1.3.1.5 Selectiviteit ................................................................................................................ 40 4.1.3.2 Vloeistof-vloeistof extractie ......................................................................................... 40 4.1.3.2.1 Enkelvoudige vloeistof-vloeistof extractie vs. dubbele vloeistof-vloeistof extractie40 4.1.3.2.2 Recovery vloeistof-vloeistof extractie ....................................................................... 41 4.1.3.2.3 Matrixeffect vloeistof-vloeistof extractie ................................................................. 41 4.2 TOEPASSING VAN DE ONTWIKKELDE METHODE OP ROUTINESTALEN ............................. 42 4.2.1 Case 1 .................................................................................................................... 42 4.2.2 Case 2 .................................................................................................................... 42 5. DISCUSSIE ................................................................................................................... 43 5.1 METHODEONTWIKKELING ................................................................................................. 43 5.1.1 Optimalisatie MS-parameters ................................................................................. 43 5.1.1.1 Bepaling MRM en optimalisatie componentspecifieke MS-parameters……………………44 5.1.1.2 Optimalisatie bronspecifieke MS-parameters ............................................................. 43 5.1.2 Optimalisatie chromatografie ................................................................................. 43 5.1.2.1. Evaluatie methode gebaseerd op literatuur ............................................................... 43 5.1.2.2 Kolomkeuze .................................................................................................................. 44 5.1.2.3 Mobiele fase ................................................................................................................. 44 5.1.2.4 Gradiënt........................................................................................................................ 44 5.1.2.5 Needle wash ................................................................................................................. 45 5.1.3 Staalvoorbereiding ................................................................................................. 45 5.1.3.1 Proteïneprecipitatie ..................................................................................................... 45
5.1.3.2 Vloeistof-vloeistof extractie ......................................................................................... 46 5.1.3.3 Recovery en matrixeffect ............................................................................................. 46 5.2 TOEPASSING VAN DE ONTWIKKELDE METHODE OP ROUTINESTALEN ............................. 47 6. CONCLUSIE.................................................................................................................. 48 7. BIBLIOGRAFIE.............................................................................................................. 49
LIJST MET AFKORTINGEN 11-OH-THC 6-MAM ACN BE CB CE CXP CYP DBS DP ELISA EME EMIT EP FIA GC-MS HCOOH HPLC IS LFIA LLE LLOQ m/z MDA MDEA MDMA MeOH MS PP S/N SPE THC THC-COOH UP
11-hydroxy-∆9-tetrahydrocannabinol 6-monoacetylmorfine Acetonitrile Benzoylecgonine Cannabinoïdreceptoren Collision Energy Cell exit potential Cytochroom P450 Dried blood spots of gedroogde bloedspots Declustering potential Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay Ecgoninemethylester Enzyme Multiplied Immunoassay Technique Entrance potential Flow injection analysis Gaschromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie Mierenzuur High Pressure Liquid Chromatography of Hoge druk vloeistofchromatografie Interne standaard Lateral Flow Immuno Assay Liquid-liquid extraction of vloeistof-vloeistof extractie Lower Limit Of Quantification Massa over lading verhouding 3,4-methyleendioxyamfetamine 3,4-methyleendioxyethylamfetamine 3,4-methyleendioxymethamfetamine Methanol Massaspectrometrie Proteïneprecipitatie Signaal over ruis verhouding Solid phase extraction of vaste fase extractie ∆9-tetrahydrocannabinol 11-nor-9-carboxy-tetrahydrocannabinol Ultrapure
1. INLEIDING 1.1 SITUERING VAN HET ONDERZOEK In het verkeer is druggebruik de oorzaak van veel verkeersongevallen en fataliteiten.
1,2
Afhankelijk van het type drugs dat gebruikt wordt, zal een andere invloed op het rijgedrag worden waargenomen.
3
Zo zal het gebruik van cannabinoïden de motorische coördinatie
van de bestuurder veranderen.
4
Personen onder invloed van amfetamine of zijn analogen
zijn dan weer gevoeliger voor licht doordat de pupillen gedilateerd zijn o.i.v. het sympathicomimetische effect van deze drugs.
5
Stimulerende drugs zorgen er bovendien
voor dat bestuurders meer risico’s nemen. Daarnaast kan het gebruik van drugs hallucinaties, slaperigheid en psychosen uitlokken. 1,6 Om drugs op te sporen in het kader van het verkeer, is het veelal noodzakelijk dat er volbloedstalen worden afgenomen voor verdere analyse. Naar de toekomst toe zou het echter nuttig zijn dat in de plaats van deze klassieke bloedstalen, gedroogde bloedspots (DBS) zouden kunnen worden geanalyseerd. Hierbij wordt een druppel capillair bloed opgevangen op een filterpapiertje en twee uur gedroogd aan de lucht. Het grote voordeel van DBS is enerzijds de eenvoudige staalname, wat inhoudt dat deze in principe niet door een medisch getraind persoon dient te worden uitgevoerd. Anderzijds kan het bereiden van DBS (via een vingerprik of uit een klassiek veneus staal) beschouwd worden als een eenvoudige staalvoorbereidingstechniek, die bovendien slechts een zeer klein volume bloed vereist. De DBS-analyse zelf kan daarenboven ook volledig geautomatiseerd verlopen. 7 Om die redenen wil het Laboratorium voor Toxicologie een DBS-methode ontwikkelen voor de kwantificatie van verscheidene drugs. In eerste instantie moet hiervoor een volbloedanalyse worden ontwikkeld, zodat resultaten bekomen a.d.h.v. de DBS-analyse kunnen worden vergeleken met resultaten bekomen via de klassieke methode. Dit om te bevestigen dat de analyses op DBS dezelfde kwalitatieve en kwantitatieve resultaten opleveren als de analyses op volbloed. Deze thesis kadert dan ook in de ontwikkeling van een Hoge druk vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie (HPLC-MS/MS) multi-analytmethode om meerdere drugs zoals cannabinoïden, opiaten, cocaïne, amfetamine en amfetamineanalogen op te sporen in volbloed.
1
1.2 DRUGSBEPALINGEN 1.2.1 Screeningstesten 1.2.1.1 Algemeen Wanneer een staal moet gecontroleerd worden op de aanwezigheid van drugs, wordt er eerst een screeningstest uitgevoerd. Dergelijke test vereist immers geen of minimale 5,8
staalvoorbereiding en kan snel een eerste indicatie geven van druggebruik. Screeningstesten zijn semi-kwantitatief en werken volgens immunologische principes.
9
Meer bepaald maken ze gebruik van antilichamen. Deze antilichamen kunnen bepaalde klassen drug(s) herkennen door te interageren met een epitoop op deze drug (het antigen). Een antigen kan meerdere epitopen hebben. 10 Een groot nadeel van screeningstesten is het voorkomen van vals positieven en vals negatieven. Vals negatieven treden op wanneer de test niet voldoende gevoelig is, vals positieven door kruisreactiviteit. Daarom is het noodzakelijk dat de resultaten van screeningstesten steeds bevestigd worden. 9 1.2.1.2 Speekseltest Sinds oktober 2010 is de wet op het uitvoeren van speekseltesten in het verkeer van kracht. 11
Deze speekseltest vervangt het gebruik van urinestalen voor drugsscreening in het verkeer
en heeft als voordeel dat deze moeilijker kan vervalst worden. Bovendien zijn speekseltesten eenvoudiger toepasbaar in de praktijk.
5,12
Een speekseltest wordt pas afgenomen nadat er
via een gestandaardiseerde checklist wordt nagegaan of er tekenen van mogelijk druggebruik worden waargenomen bij de bestuurder. Hiervoor moet een bestuurder aan tenminste drie tekenen voldoen uit twee verschillende rubrieken van de checklist of betrokken zijn in een verkeersongeval.
11,13
De test die in België gebruikt wordt, is de
drugwipe® 5S+ van het merk Securetec. Deze kan drugs uit verschillende klassen detecteren, namelijk cannabinoïden, opiaten, cocaïne en benzoylecgonine (een metaboliet van cocaïne), amfetamines, methamfetamines en 3,4-methyleendioxymethamfetamine (MDMA). 8,14
De drugwipe® werkt volgens het principe van een Lateral Flow Immuno Assay (LFIA).
15
Bij
LFIA (Fig. 1.1) bevinden zich in de staalapplicatiezone antilichamen gericht tegen de verscheidene klassen drugs die geconjugeerd zijn met colloïdale goudpartikels. De antilichamen kunnen een complex vormen met de drugs door te interageren ter hoogte van
2
het epitoop van elke drug. Na het openen van een reservoir aanwezig in de test, zal een bepaalde hoeveelheid buffer vrijkomen. Hierdoor migreert het staal o.i.v. capillaire krachten samen met de antilichamen door de teststrip. Wanneer er vervolgens een verkleuring optreedt bij een van de testlijnen betekent dit dat er drugs aanwezig zijn in het speeksel van de bestuurder. Op elke testlijn bevinden zich namelijk geïmmobiliseerde antilichamen tegen een bepaalde klasse van drugs. Onafhankelijk van het feit of er drugs aanwezig zijn in het staal of niet zal er een verkleuring van de controlelijn optreden. De controlelijn verkleurt door de kleurreactie van de colloïdale goudpartikels die geconjugeerd zijn aan de antilichamen tegen de drugs. Deze antilichamen worden weerhouden op de controlelijn, doordat zich op de controlelijn geïmmobiliseerde antilichamen bevinden tegen de antilichamen die geconjugeerd zijn met de colloïdale goudpartikels. Verkleuring van de controlelijn is een indicatie van een correct uitgevoerde test. 6,15,16
Figuur 1.1: Schematische weergave LFIA
15
1.2.1.3 Andere screeningstechnieken Wanneer een drugsscreening dient te gebeuren op urine, bloed of speekselstalen, zal veelal gebruik worden gemaakt van Enzyme Multiplied Immunoassay Technique (EMIT) of Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA). EMIT is een homogene en competitieve screeningstechniek.
10,17,18
ELISA daarentegen is een heterogene screeningstest daar
verscheidene wasstappen moeten worden uitgevoerd.
Bij ELISA kan een onderscheid
gemaakt worden tussen een competitieve ELISA en een sandwich ELISA. Bij een competitieve ELISA is het zo dat wanneer er drugs aanwezig zijn in het staal, er weinig kleurreactie zal optreden. Bij een sandwich ELISA zal er daarentegen een sterkere kleurreactie optreden wanneer de concentratie drugs aanwezig in het staal hoger is. 19,20
3
1.2.2 Bevestigende testen 1.2.2.1 Algemeen Volgens de Belgische wetgeving moet een positieve screeningstest altijd geconfirmeerd worden a.d.h.v. een tweede onafhankelijke analyse. 11 Dergelijke analyse moet in het kader van druggebruik in het verkeer uitgevoerd worden op een bloed- of speekselstaal d.m.v. gaschromatografie of vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie.
5,11
In
België wordt in het kader van het verkeer gebruik gemaakt van bepaalde cut-off waarden (Tabel 1.1) om druggebruik vast te stellen. Bij een concentratie hoger dan deze cut-off waarde is de bestuurder onder invloed van de drug.
3,5
Wanneer de waarden van de
kwantitatieve bepaling onder de vastgelegde cut-off waarden vallen, wordt de speeksel- of bloedanalyse dan ook als negatief beschouwd.
11
Hierdoor is het essentieel dat de Lower
Limits of Quantification (LLOQ) van de nieuw ontwikkelde technieken lager zijn dan onderstaande cut-off waarden. 22
Tabel 1.1: Cut-off waarden voor speeksel- en bloedanalyse in het kader van verkeer opgenomen in de Belgische wet.
Stof
Cut-off waarden
Cut-off waarden
bloedanalyse (ng/mL)
speekselanalyse (ng/mL)
Delta-9-tetrahydrocannabinol
1
10
Amfetamine
25
25
MDMA
25
25
Morfine (vrij)
10
5
Cocaïne of benzoylecgonine
25
10
Bovendien moet volgens de wet voor deze bevestigende analyse gebruik worden gemaakt van gedeutereerde interne standaarden (IS). Bij gedeutereerde componenten worden waterstofatomen vervangen door deuterium (2H). Deuterium is een stabiele isotoop van waterstof en bevat naast een proton ook een neutron in zijn kern.
11
Gedeutereerde IS
hebben dezelfde chemische eigenschappen als de target component. Hierdoor zijn gedeutereerde standaarden betere IS dan structuuranalogen. 21
4
1.2.2.2 Speekselanalyse Wanneer de speekseltest een positief resultaat oplevert voor een bepaalde drug of meerdere drugs, moet volgens de wet een speekselanalyse voor bevestiging zorgen.
5
Na
een positieve speekseltest moet bij de geteste persoon een nieuw speekselstaal worden afgenomen voor analyse. Deze speekselanalyse dient plaats te vinden in erkende laboratoria. 22
Het gebruik van speeksel heeft verschillende voordelen.
23,24
Een eerste groot voordeel is
dat de afname van speeksel een niet-invasieve vorm van staalname is. Hierdoor kan de politie zelf gemakkelijk een speekselstaal afnemen in het kader van verkeer. Een ander theoretisch voordeel is dat de speekselconcentratie van drugs in relatie staat tot de vrije fractie drugs in het bloed, aangezien enkel de vrije fractie vanuit de bloedbaan naar het speeksel kan diffunderen.
25
De vrije fractie in het bloed is door interactie met de receptor
verantwoordelijk voor het effect van de drugs. Echter in de praktijk is gebleken dat er een grote variabiliteit is in de verhouding van de concentratie van de drugs in speeksel tot de systemische concentratie. Hierdoor is het niet correct om een systemische concentratie te berekenen uitgaande van een speekselconcentratie. 26 Een belangrijk nadeel is echter dat de concentratie in het speekselstaal sterk afhankelijk is van de manier van afname (bijvoorbeeld opwekken van speeksel door een swab met citroenzuur versus het afnemen met een neutrale swab 24). De passieve niet ionische diffusie van bloed naar speeksel en omgekeerd is afhankelijk van fysische eigenschappen van de drugs zoals moleculair gewicht, vetoplosbaarheid en ionisatiegraad. Ook de pH van speeksel heeft een invloed op de speekselconcentratie van drugs. Wanneer het speeksel een lage pH heeft, zullen de basische drugs geïoniseerd zijn en dus aangeconcentreerd worden in het speeksel. Dit fenomeen heet ion-trapping
23
Speeksel kan bovendien passief gecontamineerd worden met drugs,
bijvoorbeeld wanneer men zich in een ruimte bevindt waar cannabis gerookt wordt.
27
In
speeksel zijn drugs minder lang detecteerbaar dan in urine. Zo kan speeksel een betere indicator zijn voor het onder invloed zijn. 5
5
1.2.2.3 Bloedanalyse Volgens de wet moet een bloedanalyse worden uitgevoerd wanneer er geen speekseltest of speekselanalyse kan worden uitgevoerd. De speekselanalyse is in België echter nog niet ingevoerd, bijgevolg worden in de praktijk momenteel nog steeds bloedanalyses uitgevoerd. Wanneer er wel speekselanalyses kunnen uitgevoerd worden, zijn bloedanalyses nog steeds noodzakelijk wanneer een persoon weigert een speekselstaal af te leveren of de speekselproductie te gering is. Het bloedstaal moet worden afgenomen door een opgevorderde geneesheer.
22
Als alternatief zou in de toekomst gebruik kunnen worden
gemaakt van DBS in plaats van volbloedstalen voor de bloedanalyses.
DBS worden al meer dan 100 jaar gebruikt. Een voorbeeld hiervan is de hielprik bij baby’s die aangewend wordt om stofwisselingsziektes zoals fenylketonurie op te sporen. Het gebruik van DBS is gekoppeld aan een aantal voordelen. Een eerste voordeel van DBS is de minimaal invasieve afname. Een bloedspot kan heel gemakkelijk afgenomen worden door middel van een contact activated lancet en vergt geen medisch getraind personeel. Met behulp van de contact activated lancet wordt een prikje in de vingertop gemaakt waarna een druppel capillair bloed opgevangen kan worden op een filterpapiertje. Vervolgens wordt dit filterpapiertje gedroogd aan de lucht. Andere voordelen zijn de geringe hoeveelheid bloed die nodig is voor het bereiden van een DBS en het feit dat transport en bewaring van DBS bij omgevingsomstandigheden kan plaatsvinden. 28,29
Een belangrijk probleem bij DBS-analyse is echter het zogenaamde hematocriet-effect. De hematocrietwaarde is de volumefractie van het bloed die ingenomen wordt door de rode bloedcellen en is afhankelijk van het aantal rode bloedcellen en het volume ervan. Bij een hoge hematocrietwaarde is het bloed viskeuzer en bekomt men een kleinere, meer geconcentreerde bloedspot. Wanneer voor de DBS-analyse een deel van de bloedspot wordt uitgeponst, zal de bekomen punch bij mensen met een hoge hematocrietwaarde meer bloed bevatten en bijgevolg ook meer van de op te sporen stof.
29
Dit houdt in dat het
kwantitatieve resultaat van een DBS-analyse beïnvloed wordt door het hematocriet van het bloed dat gebruikt werd om de DBS te bereiden. Daarnaast beïnvloedt het hematocriet ook de droogtijd van een bloedspot, de extractie-efficiëntie en mogelijk ook het matrixeffect.30
6
Het hematocriet van een DBS kan echter voorspeld worden a.d.h.v. het endogene kaliumgehalte in een DBS. Het effect van het hematocriet op een kwantitatief resultaat kan bovendien gecompenseerd worden door gebruik te maken van een op kalium gebaseerd correctie-algoritme. 29,31 1.3 PSYCHOTROPE EN VERDOVENDE STOFFEN E
1.3.1 Cannabinoïden 1.3.1.1 Algemeen De cannabinoïden zijn afkomstig van het harsachtig secreet van de vrouwelijk bloeiwijzen van Cannabis sativa. Met cannabis wordt zowel hasj als marihuana bedoeld. Cannabis is de meest gebruikte illegale softdrug. Delta-9-tetrahydrocannabinol (THC) is de meest psychoactieve component in cannabis. De gebruiker ervaart een kalmerend en euforisch gevoel. Door verlies van het korte termijngeheugen kan de gebruiker de realiteit ontvluchten. Daarnaast kan cannabis therapeutisch worden gebruikt tegen chronische pijn of als anti-emeticum bij de behandeling met chemotherapie. 4,32 Delta-9-tetrahydrocannabinol werkt in op het centrale zenuwstelsel door stimulatie van de cannabinoïdreceptoren. Er zijn twee soorten cannabinoïdreceptoren, namelijk CB 1 en CB2, die beide behoren tot de G-proteïne gekoppelde receptoren. Deze zijn negatief gekoppeld aan adenylaatcyclase. De CB1-receptor bevindt zich voornamelijk in de hersenen, terwijl de CB2-receptor zich voornamelijk in cellen van het immuunsysteem bevindt, zoals de T-cellen, B-cellen, macrofagen en hematopoëtische stamcellen.
4
Stimulatie van de CB1-receptoren
zorgt voor een vermindering van pijn en inwerking op de CB2-receptor voor de regulatie van inflammatoire reacties. De endogene neurotransmitters die inwerken op deze receptoren zijn anandamide en 2-arachidonoylglycerol, die ook wel de endocannabinoïden worden genoemd. 4,32 1.3.1.2 Metabolisatie De metabolisatie van THC vindt voornamelijk plaats in de lever en longen onder invloed van cytochroom P450 enzymen (CYP). De twee hoofdmetabolieten van THC zijn 11-hydroxydelta-9-tetrahydrocannabinol (11-OH-THC) en 11-nor-9-carboxy-tetrahydrocannabinol (THCCOOH) (Fig. 1.2). Deze komen, vanwege hun lipofiliciteit, voornamelijk voor in minder goed
7
gevasculariseerde weefsels zoals vetweefsel. De halfwaardetijd van THC is 4 uur.
33
THC-
COOH heeft de langste halfwaardetijd en is dus belangrijk in bloed- en urineanalyses. 11-OHTHC werkt psychoactief, THC-COOH niet. THC-COOH kan nog verder geglucuronideerd worden tot THC-COOH-glucuronide. 34
Figuur 1.2 Metabolisatie van THC
4
1.3.2 Opiaten 1.3.2.1 Algemeen Opiaten zijn afkomstig uit het gedroogde melksap van de Papaver somniferum. Opiaten mimeren het effect van de endogene opioïden en hebben een typische heterocyclische ringstructuur. Deze drugs worden voornamelijk intraveneus misbruikt. Door het parasympathicomimetische effect zijn de pupillen vernauwd. Dit vormt een probleem voor het besturen van voertuigen in de duisternis. In de geneeskunde worden opiaten voornamelijk aangewend voor hun analgetisch effect. Opiaten hebben veel nevenwerkingen zoals afhankelijkheid, verslaving, dervingverschijnselen, braken en constipatie.
35
Opiaten
werken in op de opioïdreceptoren, die G-proteïne gekoppeld zijn. Het analgetisch effect wordt voornamelijk veroorzaakt door inwerking op de µ-receptor. 36 De endogene opioïde peptiden zoals enkefalines, endorfines en dynorfines zijn kleine peptiden die fungeren als neuromodulatoren en als hormonen. Neuromodulatoren beïnvloeden de activiteit van andere neurotransmitters. Hormonen voeren een effect uit op receptoren in verder afgelegen weefsels. Opioïde peptiden zorgen voor analgesie. Door acupunctuur bijvoorbeeld kunnen endogene opioïden worden vrijgesteld en bekomt men een analgetisch effect. Andere effecten van de endogene opioïden zijn het vertragen van de darmmotiliteit, het verminderen van de respiratie en het ontstaan van een euforisch gevoel. 37
8
1.3.2.2 Morfine Morfine wordt voornamelijk gebruikt als analgeticum bij chronische pijn, geformuleerd in pleisters met vertraagde vrijstelling of via infusen. Daarnaast wordt morfine ook gebruikt bij acute pijn via orale inname of injectie. Het pijnstillend effect van morfine ontstaat door stimulatie van de µ-receptor. Een groot nadeel van morfine is afhankelijkheid en gewenning, i.e. de nood aan een steeds hogere dosis voor eenzelfde effect. Overdosering leidt tot coma wegens respiratoire depressie. Morfine wordt misbruikt als drug omwille van het euforiserend effect en het optreden van hallucinaties. 35 1.3.2.3 Codeïne Codeïne of 3-methylmorfine wordt voornamelijk gebruikt als antitussivum in hoestsiropen. Door de aanwezigheid van een methylgroep is het een minder potente agonist voor de opioïdreceptor dan morfine. Codeïne wordt ook gebruikt in combinatiepreparaten met paracetamol als pijnstiller omdat een kleine hoeveelheid codeïne in de lever wordt omgezet tot morfine. 35,38 1.3.2.4 Heroïne Heroïne of diacetylmorfine wordt synthetisch aangemaakt door acetylering van morfine. Heroïne wordt misbruikt vanwege het euforiserend effect, veroorzaakt door de dopaminerge werking van de drug. 39 Het hydrochloride zout van heroïne wordt ingespoten of gesnoven. De base wordt voornamelijk gerookt of geïnhaleerd. Door de esterstructuur is heroïne lipofieler dan morfine en kan het sneller doorheen de bloedhersenbarière diffunderen. Heroïne werkt in op de opioïdreceptor na metabolisatie tot morfine. 4,5,40 1.3.2.5 Metabolisatie Morfine wordt geconjugeerd met glucuronzuur tot hydrofiele verbindingen. Zestig procent wordt omgezet tot morfine-3-glucuronide. Vijf tot tien procent wordt omgezet tot morfine6-glucuronide.
Wanneer
beide
glucuronidaties
plaatsvinden
ontstaat
mofine-3,6-
diglucuronide (Fig. 1.3). Morfine-6-glucuronide heeft een hogere affiniteit voor de opioïdreceptor en is hierdoor meer analgetisch dan morfine-3-glucoronide en morfine. 38
9
Ook codeïne wordt voornamelijk geconjugeerd met glucuronzuur tot codeïne-6-glucuronide. Deze omzetting gebeurt onder invloed van het uridinedifosfaat-glucuronosyltransferase-2B7. Codeïne kan door het CYP2D6 en in mindere mate door het CYP2D7 ge-O-demethyleerd worden tot morfine (Fig. 1.3) dat 200 keer meer affiniteit heeft voor de opioïdreceptor. Genetische polymorfismen in het CYP2D6 zorgen ervoor dat er zowel poor metabolizers als rapid metabolizers bestaan. Poor metabolizers zullen een minder goed pijnstillend effect ondervinden van codeïne dan rapid metabolizers. De omzetting van codeïne tot morfine varieert van 0 tot 15 procent. Daarnaast wordt 10 tot 15 procent van codeïne gedemethyleerd tot norcodeïne door het CYP3A4. 38 Heroïne heeft een lage affiniteit voor de opioïdreceptor dan morfine maar wordt door carboxylesterasen in de lever en de hersenen en door esterasen in het bloed snel gemetaboliseerd tot 6-monoacetylmorfine (6-MAM) en vervolgens verder gehydrolyseerd tot morfine (Fig. 1.3). 6-MAM is, in tegenstelling tot morfine, een specifieke merker voor heroïnegebruik. De aanwezigheid van morfine in een bloedstaal kan immers te wijten zijn aan het gebruik van heroïne, codeïne of morfine. 41
Figuur 1.3: Metabolisatie van opiaten
10
41
1.3.3 Cocaïne 1.3.3.1 Algemeen Cocaïne behoort tot de psychoanaleptica en is afkomstig uit de cocabladeren van de plant Erythroxylon Coca.
5
Andere namen voor deze drug zijn coke of snow. Cocaïne wordt
voornamelijk gesnoven of ingespoten. De cocaïnebase kan worden gerookt. Cocaïne werkt als indirect sympathicomimeticum doordat cocaïne de heropname van dopamine, serotonine, epinefrine en norepinefrine remt. Cocaïne werd vroeger gebruikt als lokaal anestheticum daar het de natriumkanalen blokkeert, waardoor er geen prikkeloverdracht kan
plaatsvinden
tussen
de
verschillende
neuronen.
42
Door
de
verhoogde
dopamineconcentratie werkt cocaïne euforiserend en leidt het tot een gevoel van onvermoeibaarheid. Er kan gewenning optreden aan de verhoogde dopamineniveaus. 43 1.3.3.2 Metabolisatie Cocaïne wordt snel gemetaboliseerd (Fig. 1.4). De grootste fractie van cocaïne wordt door butyrylcholinesterase gemetaboliseerd tot het inactieve ecgoninemethylester (EME). Dertig tot veertig procent wordt door weefselesterasen en spontane omzetting omgevormd tot benzoylecgonine (BE), ook een inactieve metaboliet. Een minimaal deel van cocaïne wordt via CYP3A4 omgezet tot het actieve norcocaïne. Voornamelijk BE wordt gebruikt om cocaïnemisbruik aan te tonen, omwille van de lange halfwaardetijd van deze component. Benzoylecgonine kan namelijk tot vijf dagen na inname gedetecteerd worden in urine. 44 Wanneer er ook ethanol aanwezig is in het bloed, ondergaat cocaïne een transesterificatie tot cocaethyleen, het ethylester van cocaïne. Cocaethyleen is een farmacologisch actieve metaboliet, waardoor het effect van cocaïne verlengd wordt na alcoholinname. 45,46
11
Figuur 1.4: Metabolisatie van cocaïne en zijn metabolieten
47
1.3.4 Amfetamines 1.3.4.1 Algemeen Amfetamines of speed zijn stimulantia en hebben een sympathicomimetische werking. Ze zijn afgeleid van fenylethylamine. Stimulantia worden misbruikt om vermoeidheid tegen te gaan en waarbij een verhoging plaatsvindt van de vrijstelling van catecholamines zoals adrenaline en dopamine. Methamfetamine (crystal meth) is het N-gemethyleerde analoog van amfetamine. Amfetamines zorgen voor een verhoging van de bloeddruk en een versnelde hartslag. Fenylethylamines worden gebruikt voor de behandeling van ADHD en rookstop. Vroeger hadden fenylethylamines ook een toepassing als vermageringsmiddel. Dextro-amfetamine is 3 tot 4 keer meer potent dan levo-amfetamine. 42 ,48,49
Figuur 1.5: Chemische structuren van amfetamine (links) en methamfetamine (rechts)
12
50
1.3.4.2 Metabolisatie Amfetamine wordt gedeamineerd tot fenyllacton en verder geoxideerd en gehydrolyseerd tot
verschillende
afbraakproducten
zoals
noradrenaline
en
hydroxyamfetamine.
Methamfetamine wordt door N-demethylatie door CYP450 enzymen gemetaboliseerd tot amfetamine. 50 1.3.5 Amfetamine-analogen 1.3.5.1 Algemeen MDMA en 3,4-methyleendioxyethylamfetamine (MDEA) zijn methamfetamine-analogen met een methyleendioxygroep op positie drie en vier van de fenylring. Daarnaast is ook 3,4methyleendioxyamfetamine (MDA) een analoog van amfetamine. (Fig. 1.6) Een andere benaming voor MDMA en MDEA zijn respectievelijk Adam en Eve. Deze amfetamineanalogen werden oorspronkelijk ontwikkeld om de wetgeving te omzeilen. 51 Drugs afgeleid van amfetamine stimuleren de vrijstelling en inhiberen de heropname van serotonine, noradrenaline en dopamine. Inname zorgt voor een euforisch gevoel en vermindert de vermoeidheid. Hierdoor zijn de amfetamine-analogen zeer populair in het uitgaansleven. Gebruikers van deze drug beleven hallucinaties, depressies en verwardheid en zijn daarnaast snel geagiteerd. De bloeddruk en het hartritme zijn verhoogd, net als de lichaamstemperatuur. 52
Figuur 1.6 Chemische structuren van respectievelijk MDMA, MDEA en MDA
53
1.3.5.2 Metabolisatie MDMA wordt gemetaboliseerd door CYP450 enzymen. De metabolisatie van MDMA kan opgedeeld worden in twee grote pathways. De eerste begint met een O-demethylatie gevolgd door methylatie o.i.v. catechol-o-methyltransferase. Later vindt er eventueel een glucuronide- of sulfaatconjugatie plaats. De tweede pathway start met een N-dealkylatie tot 3,4-methyleendioxyamfetamine (MDA) gevolgd door een deaminatie en verdere oxidatie
13
naar de corresponderende benzoëzuurderivaten. Daarna kan conjugatie met glycine optreden. De halfwaardetijd van MDMA is 8 tot 9 uur. Dit is korter dan methamfetamine met een halfwaardetijd van 10 tot 12 uur en amfetamine met een halfwaardetijd van 12 tot 15 uur. 42,53 1.4 HOGE DRUK VLOEISTOFCHROMATOGRAFIE TANDEM MASSASPECTROMETRIE 1.4.1 Algemeen In deze thesis wordt gebruik gemaakt van HPLC-MS/MS om drugs op te sporen en te kwantificeren in volbloedstalen. Vroeger werd voornamelijk gaschromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (GC-MS) gebruikt voor de opsporing van drugs. Bij GC-MS is echter vaak derivatisatie noodzakelijk om de componenten vluchtig te maken. Bovendien is GC-MS nadelig voor thermolabiele componenten. Bij vloeistofchromatografie moeten de componenten niet vervluchtigd worden. 1.4.2 Hoge druk vloeistofchromatografie HPLC wordt steeds voorafgegaan door een vorm van staalvoorbereiding. Dit kan o.a. proteïneprecipitatie (PP), vaste fase extractie (SPE) of vloeistof-vloeistof extractie (LLE) zijn. 30
Het doel van staalvoorbereiding is het creëren van een geconcentreerd en zuiver extract.
Na de staalvoorbereiding wordt het bekomen extract geïnjecteerd. 54 De verschillende componenten worden van elkaar gescheiden op de HPLC-kolom. Doordat iedere component op een andere manier interageert met de stationaire fase en mobiele fase, zal uiteindelijk een scheiding van de verscheidene analyten worden bekomen op basis van hun polariteit wanneer gebruik wordt gemaakt van reversed phase chromatografie. 55 Een belangrijk concept in HPLC is de Van Deemtervergelijking (Vergelijking 1.1). Deze beschrijft een verband tussen de schotelhoogte H (een maat voor de efficiëntie van de kolom; hoe hoger de schotelhoogte hoe beter) en de snelheid van de mobiele fase, u. 55-57 𝐵
𝐻 =𝐴+𝑢+𝐶∗𝑢 waarin: H: schotelhoogte u: snelheid mobiele fase A: eddydiffusie B: longitudinale diffusie C: massatransfer
14
(1.1)
De termen A, B en C in de Van Deemtervergelijking staan allen voor een oorzaak van piekverbreding. Een eerste oorzaak van piekverbreding is de eddydiffusie (term A) bij gepakte kolommen. Eddydiffusie slaat op het feit dat de ene molecule een langere weglengte kan hebben dan een andere door variabiliteit in de pakking.
58
De term B staat
voor de longitudinale diffusie. De analyten zullen diffunderen van gebieden met hoge concentratie in de mobiele fase naar gebieden met lagere concentratie. Wanneer deze diffusie radiaal is, is er geen piekverbreding, bij axiale diffusie wel. Term C geeft weer hoe diep analyten in de pakking dringen. Sommige moleculen penetreren dieper in de silicaporiën dan andere, ook dit zorgt voor piekverbreding.
59,58
De snelheid van de mobiele
fase heeft een impact op zowel term B als C. 1.4.3 Massaspectrometrie De detectie gebeurt op basis van massaspectrometrie (MS). Bij MS worden de componenten die van de HPLC-kolom elueren, geïoniseerd en gescheiden volgens hun massa over lading (of m/z-verhouding) en vervolgens gedetecteerd.
56
De eerste stap in het detectieproces is
de ionisatie. Hiervoor wordt in deze thesis gebruik gemaakt van electrospray ionisatie (ESI). Bij ESI gebeurt de ionisatie onder atmosferische druk.
54
Het effluent van de HPLC-kolom
komt in de ionenbron en wordt door een capillair gedwongen. Aan het uiteinde van het capillair wordt een potentiaal aangelegd. 56 Er ontstaat een wolk van druppels met eenzelfde lading, die vervolgens worden gedesolvateerd door een tegenstroom van drooggas.
54
Wanneer de Coulombse kracht de oppervlaktespanning overwint, zullen de druppels exploderen. Dit proces herhaalt zich tot er naakte ionen ontstaan. 60 Na de ionisatie worden de gewenste ionen geselecteerd door een massafilter, in dit geval een
quadrupool.
Tandem-massaspectrometrie
bestaat
uit
quadrupolen, Q1 en Q3, met ertussen een collisiecel Q2 (Fig. 1.7).
twee
opeenvolgende
54,56,61
In Q1 worden de
precursorionen geselecteerd. Deze zullen in de collisiecel botsen met een botsingsgas en fragmenteren. Dit proces heet collisie geïnduceerde dissociatie. Het gewenste fragmention kan op basis van de m/z-waarde geselecteerd worden in Q3. De geselecteerde
15
fragmentionen worden uiteindelijk gedetecteerd door een electron multiplier. 54 Deze zet de ionbundel om in een meetbaar elektrisch signaal. 56,63
Figuur 1.7: Schematische weergave tandem massaspectrometrie
16
62
2. OBJECTIEVEN Rijden onder invloed van drugs in het verkeer is een actueel probleem. Om druggebruik op te sporen kan de politie in eerste instantie een speekselscreeningstest uitvoeren. De resultaten hiervan dienen echter altijd bevestigd te worden met een tweede onafhankelijke techniek. Wanneer een staal binnenkomt in een laboratorium ter bevestiging van de speekselscreening moet gas- of vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie gebruikt worden. Volgens de wet moet tijdens de bevestigende test gebruik gemaakt worden van gedeutereerde IS. Hierbij is het bovendien gewenst dat zoveel mogelijk stoffen in een zo kort mogelijk tijdsbestek kunnen worden opgespoord. Deze thesis kadert dan ook in de ontwikkeling van een HPLC-MS/MS multi-analytmethode voor de detectie en kwantificatie van drugs in volbloed. De drugs die in deze multi-analytmethode moeten gedetecteerd en gekwantificeerd worden d.m.v. LC-MS/MS zijn: Cannabinoïden: THC, 11-OH-THC en THC-COOH -
Opiaten: morfine, codeïne en 6-MAM
-
Amfetamine en methamfetamine
-
Cocaïne en benzoylecgonine
-
Amfetamine-analogen: MDMA, MDA en MDEA
Om een dergelijke methode te ontwikkelen, zullen volgende stappen worden uitgevoerd: - Bepalen van de MRM-transities van iedere component en de bijhorende IS. - Optimaliseren van de componentspecifieke en bronspecifieke MS-parameters voor de verscheidene componenten en de bijhorende IS. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van infusie en Flow Injection Analysis (FIA). - Het opstellen van het meest geschikte gradiënt door het selecteren van de meest geschikte kolom en mobiele fase. Ook de meest geschikte needle wash moet geselecteerd worden en de dwell-tijden dienen voor elke component zo ingesteld te worden dat goed gedefinieerde pieken worden bekomen.
17
- De ontwikkeling van een staalvoorbereiding waarbij alle componenten en IS in voldoende mate en op reproduceerbare wijze worden geëxtraheerd. Bij voorkeur wordt hiervoor gebruik gemaakt van een gemeenschappelijke staalvoorbereiding voor alle componenten van de verscheiden klassen drugs. - Beoordeling van recovery en matrixeffect van de geoptimaliseerde extractiemethode. - Uiteindelijk zal de multi-analytmethode ook gevalideerd moeten worden. Deze validatie valt echter buiten de scope van deze thesis. - Toepassing van de methode op stalen van het routinelabo. Bij het ontwikkelen van deze multi-analyt methode is het belangrijk dat voldoende gevoeligheid wordt gehaald zodat waarden onder de cut-off waarden die opgenomen zijn in de verkeerswet kunnen gekwantificeerd worden. Tijdens deze thesis wordt gebruik gemaakt van een Prominence liquid chromatography system van Shimadzu en een QTRAP™ 5500 massaspectrometer van AB Sciex® die in triple quad modus wordt gebruikt. In de literatuur werd op zoek gegaan naar gelijkaardige methodes om daaruit verder te bouwen. Er werd geen enkele methode teruggevonden in de literatuur waarin alle componenten van deze thesis geïncorporeerd zijn. Daarom baseerden we ons op drie methoden: -
Het artikel van Di Corcia et al. waarin amfetamine, methamfetamine, cocaïne, BE, MDA, MDMA, morfine, codeïne, 6-MAM en THC werden bepaald in speeksel. Bij Di Corcia et al. wordt gebruik gemaakt van een API 5500 in positieve modus. 64
-
In het artikel van Schwope et al. werd gebruik gemaakt een AB Sciex® 3200 QTRAP™ voor de bepaling van cannabinoïden in volbloed.
-
Uit het artikel van Sergi et al. werden amfetamine, methamfetamine, morfine, 6MAM, MDA, MDEA, MDMA, cocaïne, BE, THC, THC-COOH bepaald in plasma gebruik makend van een API 2000. 66
18
3. MATERIALEN EN METHODEN 3.1 REAGENTIA - Mierenzuur (HCOOH) (Sigma Aldrich®, Missouri, VS) - Acetonitrile (ACN) (Biosolve®, Dieuze, France) - Ethylacetaat (Merck, Darmstadt, Germany) - Azijnzuur (Merck, Darmstadt, Germany) - Methanol (MeOH) (Biosolve®, Dieuze, France) - n-Hexaan (Merck, Darmstadt, Germany) - Ultrapuur water (UP water) (Synergy® Ultrapure waterpurificatiesysteem, Merck Millipore, Massachusetts, VS).
- LC-MS water (Biosolve®, Dieuze, France) - De standaarden (-)-delta9-THC, (+/-)-11-hydroxy-delta9-THC, (+/-)-11nor-9-carboxy-delta9THC, benzoylecgonine, cocaïne, (+/-)-amfetamine, (+/-)-metamfetamine, (+/-)-MDMA, (+/-)MDEA, (+/-)-MDA, 6-acetylmorfine, morfine, codeïne (Sigma Aldrich®, Missouri, VS) - De interne standaarden: (-)-delta9-THC-D3, (+/-)-11-hydroxy-delta9-THC-D3, (+/-)-11-nor-9carboxy-delta9-THC-D9, benzoylecgonine-D8, cocaïne-D3, (+/-)-amfetamine-D11, (+/-)methamfetamine-D14, (+/-)-MDMA-D5, 6-acetylmorphine-D6, morfine-D6, codeïne-D6 (Sigma Aldrich®, Missouri, VS) 3.2. TOESTELLEN EN ANDERE MATERIALEN
- Puntbuizen 10 mL (Hirschmann, Eberstadt, Duitsland) - Vials amber 1.5 mL (VWR®, Radnor PA, VS) - Micro-Inserts clear glass 0.1 mL (VWR®, Radnor PA, VS) - Screw cap polypropylene blue 9mm (VWR®, Radnor PA, VS) - BEH-C18-kolom (Waters™, Milford, Massachusetts, VS) - Kinetex C18-kolom (Phenomenex®, Californië, US) - Kinetex biphenyl kolom (Phenomenex®, Californië, US) - Kinetex fenyl/hexyl kolom (Phenomenex®, Californië, US) - K2EDTA bloedbuizen (Venosafe™, VF-109SDK, 9-mL, Terumo, Leuven, België) - Zymark (Zymark, Hopkinton, USA) - Centrifuge 5804 (Eppendorf®, Hamburg, Duitsland)
19
- Sonicator (Branson, Dansbury, USA) - Rotary mixer L26 (Labinco, Breda, Nederland) - Analyst® software 1.5.1 (AB Sciex™, Warrington, UK) - Multiquant® software (AB Sciex™, Warrington, UK) 3.3 MEETINSTRUMENTEN In deze thesis werd gebruik gemaakt van een Shimadzu Prominence liquid chromatography system (Shimadzu®, Duisburg, Duitsland) die tegendrukken aankan tot 400 bar. Als massaspectrometer werd een QTRAP™ 5500 (AB Sciex™, Warrington, UK) gebruikt. Deze werd gebruikt in triple quad modus hierbij selecteren Q1 en Q3 ionen en fungeert Q2 als collisiecel. Daarnaast kan de QTRAP™ 5500 in ion trap modus gebruikt worden waarbij Q3 als lineair ion trap wordt gebruikt. 67,68
Figuur 3.1 Shimadzu prominence liquid chromatography system (links) QTRAP™ 5500 (rechts)
3.4 AANMAKEN WERKOPLOSSINGEN Voor overgegaan kon worden tot methodeontwikkeling, werden eerst werkoplossingen bereid van de standaarden enerzijds en de IS anderzijds. Voor de 13 standaarden werd uitgegaan van het startmateriaal beschreven onder 3.1. Om een multi-analytmix te bereiden waarin elke drug aanwezig was in een concentratie van 2 µg/mL. Deze mix werd aangemaakt in MeOH en werd verdund met het geschikte solvent tot de gewenste concentratie voor de hieronder beschreven experimenten, tenzij anders vermeld.
20
Daarnaast werd ook van de 11 gedeutereerde IS een multi-analytmix bereid, uitgaande van het startmateriaal beschreven onder 3.1. In deze mix was de concentratie van elke gedeutereerde IS 440 ng/mL. Deze mix werd aangemaakt in een mengsel van MeOH/water (50:50; V:V) en verdund voor de hieronder beschreven experimenten, indien nodig. Zowel de werkoplossingen van de standaarden als deze van de IS werden bewaard bij -20 °C in amberkleurige vials met glazen inserts. De amberkleurige vials beschermen de componenten tegen de invloed van licht, wat voornamelijk belangrijk is voor de opiaten en cannabinoïden.
67,70
Er werd gebruik gemaakt van glazen inserts, aangezien gekend is dat
cannabinoïden adsorberen aan plastics. 71 3.5 METHODEONTWIKKELING 3.5.1 Optimalisatie MS-parameters 3.5.1.1 Startcondities gebaseerd op bestaande literatuur Aangezien de drugs die geïncorporeerd werden in de multi-analytmethode in het verleden reeds allemaal bepaald werden a.d.h.v. LC-MS/MS, werd in bestaande literatuur gezocht naar te gebruiken MRM-transities en bijhorende componentspecifieke MS-parameters. De gebruikte MS-parameters werden gebaseerd op een artikel van Di Corcia et al..
64
Amfetamine, methamfetamine, cocaïne, BE, MDA, MDMA, morfine, codeïne, 6-MAM en THC worden opgespoord in speeksel gebruikmakend van een API 5500. De instellingen voor 11OH-THC en THC-COOH in positieve modus werden gebaseerd op een artikel van Schwope et al. waarin gebruik wordt gemaakt van een QTRAP™ 3200. 65 Voor de negatieve ionisatie van 11-OH-THC en THC-COOH werden de initiële parameters gehaald uit een artikel van Sergi et al. waar gebruik werd gemaakt van een API 2000. 66 Een indicatie van de bronspecifieke parameters werd bekomen a.d.h.v. het artikel van Di Corcia et al., aangezien in deze methode gebruik werd gemaakt van een API 5500. 3.5.1.2 Bepaling MRM-transities en optimalisatie componentspecifieke MS-parameters De MRM-transities en componentspecfieke parameters uit de literatuur werden geverifieerd en indien nodig aangepast a.d.h.v. infusie. Bij infusie werden de componenten en IS afzonderlijk rechtstreeks in de ionbron gebracht en onmiddellijk geïoniseerd. Hiervoor werd
21
gebruik gemaakt van individuele oplossingen per component met een concentratie van 10 ng/mL in MeOH/water (50:50; V:V). Bij infusie kunnen de precieze m/z-waarden van het precursorion en de fragmentionen bepaald worden. De meest intense MRM-transities werden na infusie weerhouden. Daarna werden de twee beste geselecteerd op basis van S/N verhouding na chromatografie. De componentspecifieke parameters declustering potential (DP), collision energy (CE) en collision cell exit potential (CXP) werden ook geoptimaliseerd d.m.v. infusie. De entrance potential (EP) werd niet geoptimaliseerd aangezien voor de QTRAP 5500™ deze standaard wordt ingesteld op ±10 V. De keuze van de EP heeft een invloed op de andere potentialen. 72
CXP
DP
CE
Figuur 3.2 Componentspecifieke MS-parameters: declustering potential (DP), collision energy (CE), cell exit potential 72 (CXP)
3.5.1.3 Optimalisatie bronspecifieke MS-parameters Omdat er wanneer FIA uitgevoerd werd nog gewerkt werd met een chromatografische methode met drie periodes (positief, negatief, positief) werd uit elke periode de moeilijkste component gekozen om daarvoor de bronparameters te optimaliseren. FIA werd uitgevoerd in positieve modus voor morfine, THC en in negatieve modus voor 11-OH-THC. Bij herhaaldelijke injecties van een multi-analytmix van morfine, THC, 11-OH-THC met een concentratie van 10 ng/mL zonder kolom op het toestel werden alle parameters (ion spray voltage, temperatuur, curtain gas, ionbron gassen) één voor één geoptimaliseerd tot de beste S/N verhouding bekomen werd.
22
3.5.2 Optimalisatie chromatografie 3.5.2.1 Startcondities gebaseerd op literatuur Initieel werd getracht de chromatografie van Di Corcia et al. over te nemen, aangezien de meeste componenten die bepaald moeten worden in de multi-analytmethode, ook bepaald werden in dit artikel. Hiervoor werd gebruik gemaakt van een BEH-C18-kolom en 5 mM HCOOH in water als mobiele fase A en 5 mM HCOOH in ACN als mobiele fase B. Het gradiënt gebruikt door Di Corcia et al. zag er als volgt uit: 98:2 (A:B; V:V) tot 0:100 in vijf minuten, gevolgd door één minuut isocratisch 100 % B. Vervolgens werd drie minuten gereëquilibeerd naar de startcondities (2 % B). Hoewel dit gebaseerd was op het gradiënt van Di Corcia et al, waren lichte wijzigingen noodzakelijk aangezien niet bij hetzelfde debiet kon worden gewerkt (UPLC vs. HPLC). Daarom werd het gradiënt verder aangepast totdat een meer geschikte chromatografie voor onze toepassing werd bekomen. 3.5.2.2 Kolomkeuze Omdat de chromatografie bekomen op basis van gegevens uit de literatuur (cfr. supra) een aantal nadelen had, werd overgegaan tot het opstellen van een nieuwe chromatografische methode. In eerste instantie werden hiertoe verschillende kolommen geëvalueerd en vergeleken met de resultaten bekomen met de BEH-C18-kolom. Tijdens deze thesis werd gebruik gemaakt van een BEH-C18-kolom van 5 cm en niet van 10 cm. Bij Di Corcia et al. was deze 10 cm, maar daar werd gebruik gemaakt van een UPLC toestel (Shimadzu Nexera LC-30 A Series system). Drie verschillende Kinetex kolommen werden uitgetest. Er werd overgeschakeld op Kinetex kolommen omdat deze core-shell kolommen zijn en een lagere tegendruk opleveren. Omdat de methode waarop we ons baseren gebruik maakt van een C18 kolom werd een Kinetex C18 kolom uitgetest. Daarnaast werden ook een Kinetex fenyl/hexyl en een Kinetex biphenyl kolom getest. 73 3.5.2.3 Mobiele fase Omdat morfine zeer weinig retentie vertoonde, zelfs wanneer het gradiënt startte met één minuut isocratische elutie bij 1 % ACN, werd getracht de retentietijd van deze component te verlaten door gebruik te maken van MeOH met 5 mM HCOOH als mobiele fase B. De
23
elutiesterkte van MeOH is namelijk lager. Hierdoor elueren componenten later wanneer er gebruik gemaakt wordt van een zelfde percentage organisch solvent en hetzelfde debiet. Een nadeel is dat MeOH hogere tegendrukken oplevert.74 Aangezien Di Corcia et al. gebruik maakte van 5 mM HCOOH in de mobiele fase, terwijl een bestaande methode voor THC in het Laboratorium voor Toxicologie gebruik maakt van 0,1 % HCOOH, werd geëvalueerd wat voor de multi-analytmix de meest optimale concentratie HCOOH was. Mierenzuur beïnvloedt de ionisatiegraad, daarom werden drie verschillende mobiele fases, elk met een verschillende concentratie aan mierenzuur in ACN uitgetest: 5 mM HCOOH, 0,1 % HCOOH, en 0,01 % HCOOH. Om de invloed van de concentratie aan mierenzuur te evalueren werd gekeken naar de signaal over ruis verhouding (S/N) van de cannabinoïden. THC, THC-COOH en 11-OH-THC hebben namelijk de laagste S/N waarden. 3.5.2.4 Gradiënt Het is noodzakelijk dat de componenten die negatieve ionisatie ondergaan (11-OH-THC en THC-COOH) kunnen gevisualiseerd worden binnen dezelfde run als de positief ioniserende componenten. Daarom moesten de negatief ioniserende componenten voldoende gescheiden worden van de positief ioniserende. Op deze manier kon gewerkt worden met verscheidene opeenvolgende positieve en negatieve periodes. Om van positieve naar negatieve modus over te gaan (polarity switching) heeft de QTRAP™ 5500 50 msec nodig. Ook werden de componenten die positief ioniseren in verschillende periodes opgesplitst. Zo zijn er binnen eenzelfde periode minder concurrerende transities en kunnen meer datapunten bekomen worden voor de transities binnen een periode. Nadat de laatste component is geëlueerd moet een tijd een hoog % organisch worden gepompt zodat onzuiverheden die mogelijks achterblijven op de kolom kunnen weggespoeld worden. Vervolgens is het belangrijk om voldoende lang te reëquilibreren (minstens tien keer het kolomvolume) zodat de volgende run niet beïnvloed wordt.75 Ook is het belangrijk dat het debiet van de mobiele fase niet te hoog is zodat de maximale druk niet overschreden wordt. Omdat er dicht bij 11-OH-THC en THC-COOH een interferentie aanwezig was, die zich voordeed bij één transitie van THC-COOH, moest ervoor gezorgd worden dat deze
24
interferentie zich ver genoeg van deze twee eluerende componenten bevond. Vervolgens werd nagegaan of deze interferentie afkomstig was uit het UP water door gebruik te maken van LC-MS water. 3.5.2.5 Dwell-tijden Het is ook van groot belang dat de dwell-tijd geoptimaliseerd worden voor iedere transitie. Door de dwell-tijd te verlagen zullen meer datapunten per piek bekomen worden. De dwelltijd is namelijk het aantal seconden dat de MS naar een bepaalde transitie kijkt. Om een ideale piekvorm te bekomen moeten 15 datapunten per piek aanwezig zijn. 3.5.2.6 Needle wash Bij de gebruikte HPLC van Shimadzu is het niet mogelijk om sequentieel met een sterke en zwakke needle wash te werken, er kan slechts één needle wash gebruikt worden. Het is belangrijk dat deze voldoende sterk is zodat geen enkele component in de naald achterblijft na injectie, om carry-over naar de volgende run te vermijden. Er werden drie verschillende soorten needle wash uitgetest en met elkaar vergeleken: 1% ACN in water, 20 % ACN in water en 90 % ACN in water. 3.5.3 Staalvoorbereiding 3.5.3.1 Proteïneprecipitatie Als staalvoorbereiding werd in eerste instantie gekozen voor proteïneprecipitatie (PP). De bedoeling was om een staalvoorbereiding te ontwikkelen die geschikt was om alle op te sporen drugs te extraheren. Door toevoeging van een organisch solvent aan een bloedstaal gaan de eiwitten denatureren en neerslaan. PP is snel en eenvoudig toe te passen. Twee verschillende soorten PP gebaseerd op literatuur werden uitgevoerd: één met ACN 76 en een andere met MeOH. 77 3.5.3.1.1 Proteïneprecipitatie met ACN De PP werd uitgevoerd op drie hoeveelheden volbloed (200 µL, 100 µL en 50 µL) en op drie verschillende concentratieniveaus (100 ng/mL, 10 ng/mL, 1 ng/mL). De PP werd steeds uitgevoerd in glazen puntbuizen omwille van de adsorptie van THC aan plastics. Aan 200 µL volbloed werd 20 µL IS-oplossing toegevoegd en gevortext. Vervolgens werden
25
respectievelijk 20 µL MeOH en 500 µL ijskoude ACN toegevoegd. Dit laatste gebeurde in stappen van 100 µL, 100 µL en 300 µL. Na elke stap werd kort gevortext en na de laatste stap werd bovendien tien minuten gesoniceerd. Vervolgens werden de stalen tien minuten bewaard bij -20 °C en 20 minuten gecentrifugeerd bij 0 °C aan 5000 rpm. Van het resulterende supernatans werd 500 µL overgepipetteerd in een tweede puntbuis en met behulp van stikstof ingedampt bij 40 °C. Het bekomen residu werd uiteindelijk gereconstitueerd in 50 µL mobiele fase (1 % ACN in water) zonder HCOOH. Dit laatste werd gedaan o.w.v. mogelijke stabiliteitsredenen.
78
Vervolgens werd nogmaals 20 minuten
gecentrifugeerd aan 5000 rpm. Hierna werd het supernatans overgebracht in een vial met glazen insert. Voor de PP uitgevoerd op 100 µL en 50 µL volbloed werden de gebruikte hoeveelheden van de IS-oplossing en de organische solventen respectievelijk gehalveerd of gedeeld door vier. Het residu werd wel telkens gereconstitueerd in 50 µL mobiele fase zonder HCOOH. 3.5.3.1.2 Proteïneprecipitatie met MeOH Deze proteïneprecipitatie werd uitgevoerd op drie hoeveelheden volbloed (200 µL, 100 µL, 50 µL) en op drie verschillende concentratieniveaus (100 ng/mL, 10 ng/mL, 1 ng/mL). De PP werd uitgevoerd in glazen puntbuizen omwille van de adsorptie van THC aan plastics. Hierbij werd aan 200 µL volbloed 20 µL IS-oplossing toegevoegd en gevortext. Vervolgens werd 440 µL MeOH toegevoegd aan het staal, zacht gevortext. Vervolgens werd het staal 10 minuten gesoniceerd en 20 minuten gecentrifugeerd aan 5000 rpm bij kamertemperatuur. Na centrifugatie werd 300 µL supernatans overgebracht in een nieuwe puntbuis en gedroogd onder een stikstofstroom bij 40 °C. Vervolgens werd het residu gereconstitueerd in 50 µL mobiele fase zonder HCOOH, waarna kort werd gevortext. Uiteindelijk werd het bekomen extract overgebracht in een vial met insert. 3.5.3.1.3 Recovery proteïneprecipitatie Om de recovery van de gekozen proteïneprecipitatie te evalueren werd op 100 µL volbloed met een concentratie van 100 ng/mL, 10 ng/mL of 1 ng/mL in drievoud PP uitgevoerd volgens bovenstaande procedures. De enige aanpassing was dat ditmaal werd gereconstitueerd in 25 µL mobiele fase. Dit was voornamelijk van belang bij de toepassing op routinestalen aangezien de beschikbare hoeveelheid bloed gelimiteerd is. Daarnaast
26
werd vervolgens negen keer op 100 µL blanco volbloed PP uitgevoerd. Aan de geëxtraheerde blanco
volbloedstalen
werden
standaarden
IS
gespiked
op
drie
verschillende
concentratieniveaus en in drievoud om zo 100 % extractierendement na te bootsen. Om het percentage recovery te bereken werd volgende formule (Vergelijking 3.1) gebruikt: 79
% 𝑅𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 =
𝑃𝑖𝑒𝑘𝑜𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑝𝑟𝑒−𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑖𝑒 𝑔𝑒𝑠𝑝𝑖𝑘𝑒𝑑 𝑃𝑖𝑒𝑘𝑜𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑝𝑜𝑠𝑡−𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑖𝑒 𝑔𝑒𝑠𝑝𝑖𝑘𝑒𝑑
∗ 100 %
(3.1)
3.5.3.1.4 Matrixeffect proteïneprecipitatie Het matrixeffect werd nagegaan door de piekoppervlakte van standaardoplossingen opgelost in mobiele fase (zonder HCOOH) te vergelijken met de piekoppervlaktes van de geëxtraheerde blanco volbloedstalen waaraan achteraf drugs en IS gespiked werden (Cfr. Supra). Het matrixeffect werd geëvalueerd door volgende formule (vergelijking 3.2) toe te passen: 79 % 𝑀𝑎𝑡𝑟𝑖𝑥𝑒𝑓𝑓𝑒𝑐𝑡 =
𝑃𝑖𝑒𝑘𝑜𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑝𝑜𝑠𝑡 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑖𝑒 𝑔𝑒𝑠𝑝𝑖𝑘𝑒𝑑 𝑃𝑖𝑒𝑘𝑜𝑝𝑝𝑒𝑟𝑣𝑙𝑎𝑘𝑡𝑒 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑎𝑟𝑑
∗ 100 %
(3.2)
3.5.3.1.5 Selectiviteit Om de selectiviteit van de PP na te gaan werd op twee blanco bloedstalen PP uitgevoerd. Het bekomen extract werd geïnjecteerd en er werd nagegaan of geen enkele transitie van de multi-analytmethode gedetecteerd werd ter hoogte van de respectievelijke retentietijden. 3.5.3.2 Vloeistof-vloeistof extractie Omdat beide proteïneprecipitaties niet voor alle componenten voldoende recovery vertoonden, werd daarnaast ook vloeistof-vloeistof (LLE) extractie geëvalueerd. Omdat het probleem van onvoldoende recovery zich voordeed voor de cannabinoïden, werd de LLEmethode gebaseerd op del Mar Ramirez Fernandez et al..77 3.5.3.2.1 Enkelvoudige vloeistof-vloeistof extractie De vloeistof-vloeistof extractie werd uitgevoerd op drie concentratieniveaus: 100 ng/mL, 10 ng/mL en 1 ng/mL. Hier werd een geschikte hoeveelheid standaard gespiked aan blanco volbloed, waarbij het volume dat werd toegevoegd niet meer dan 5 % bedroeg. Aan 250 µL volbloed werd 25 µL IS toegevoegd alsook 750 µL UP water om het werkvolume te
27
vergroten. Vervolgens werd 200 µL 15 % azijnzuur toegevoegd zodat zowel THC, 11-OH-THC als THC-COOH niet geïoniseerd zijn in de waterige fase en kunnen overgaan naar de organische fase. Na vortexen werd hieraan 4 mL hexaan:ethylacetaat (90:10; V:V) toegevoegd en 30 minuten gemengd d.m.v. een rotary mixer.
Figuur 3.3 Bloedstalen die vloeistof-vloeistof extractie ondergaan op rotary mixer
Vervolgens werden de stalen 15 minuten gecentrifugeerd aan 3000 g bij kamertemperatuur. Van de bovenstaande organische fase werd 3,9 mL overgepipetteerd en gedroogd onder een stikstofstroom bij 40 °C. Het bekomen residu werd gereconstitueerd in 25 µL mobiele fase zonder HCOOH. 3.5.3.2.2 Dubbele vloeistof-vloeistof extractie Om te evalueren of het extractierendement kon verhoogd worden, werd een tweevoudige LLE vergeleken met de hierboven beschreven enkelvoudige LLE. Hierbij werd in eerste instantie hetzelfde protocol als bij de enkelevoudige LLE uitgevoerd. Na het overpipeteren van de 3,9 mL organische fase werd opnieuw 4 mL hexaan:ethylacetaat toegevoegd aan het volbloed en werd de extractieprocedure herhaald. Na de tweede extractie werd opnieuw 3,9 mL overgepipetteerd en bij de eerste organische fase gevoegd. De samengevoegde organische fasen werden gedroogd onder een stikstofstroom bij 40 °C en het residu gereconstitueerd in 25 µL mobiele fase zonder HCOOH. 3.5.3.2.3 Recovery en matrixeffect vloeistof-vloeistof extractie Recovery en matrixeffect werden uitgevoerd zoals bij PP. 3.6 TOEPASSING VAN DE ONTWIKKELDE METHODE OP ROUTINESTALEN De ontwikkelde methode werd toegepast op stalen van twee personen, die reeds waren geanalyseerd in het routinelabo van het Laboratorium voor Toxicologie. Dit werd gedaan om
28
te evalueren of de nieuwe methode dezelfde resultaten opleverde als de routinematig uitgevoerde analyses. De methode werd niet enkel toegepast op volbloed, maar ook op de corresponderende urine- en plasmastalen. Op elke matrix werd zowel PP als LLE uitgevoerd. Van de tweede persoon was echter te weinig plasma beschikbaar, waardoor er enkel PP kon worden uitgevoerd. 3.6.1 Case 1 In deze case wees de screeningstest in het routinelaboratorium uit dat er in de urine vermoedelijk cannabinoïden aanwezig waren aangezien de screeningstest positief was. De bloedscreening leverde een positief resultaat voor valproïnezuur en benzodiazepines. Tijdens de onafhankelijke bevestigende testen werden in de urine THC-COOH, nordazepam en diazepam teruggevonden. In het bloed werden tijdens de bevestigende testen enkel benzodiazepines teruggevonden, maar geen cannabinoïden. 3.6.2 Case 2 De urinescreening gaf een positief resultaat voor cafeïne, cannabis, paracetamol en benzodiazepines. Tijdens de chromatografische bevestiging werd in de urine geen cannabis teruggevonden; enkel benzodiazepines en paracetamol. Tijdens de bevestigende testen op bloed werden enkel cafeïne en benzodiazepines gedetecteerd.
29
4 RESULTATEN 4.1. METHODEONTWIKKELING 4.1.1 Optimalisatie MS-parameters 4.1.1.1 Bepaling MRM-transities en optimalisatie componentspecifieke MS-parameters Onderstaande tabellen (Tabel 4.1 en Tabel 4.2) bevatten de resultaten van de infusie van de standaarden enerzijds en de IS anderzijds. Tabel 4.1: Resultaten van infusie van de standaarden. In vet de transities die uiteindelijk gekozen werden als quantifier en qualifier. De Quantifier staat steeds bovenaan.
30
Component
Q1 (m/z)
Q3 (m/z)
DP (V)
EP (V)
CE (V)
CXP (V)
6-MAM
328,1
171
10
Amfetamine
135,9
16
10
Benzoylecgonine
290,0
51
10
Cocaïne
304,1
146
10
Codeïne
300,1
151
10
MDA
180,0
1
10
MDEA
208,0
46
10
MDMA
194,0
46
10
Methamfetamine
150,0
11
10
Morfine
286,1
165,1 211,0 152,0 193,0 119,0 91,0 78,0 73,8 168,0 105,0 77,0 104,9 182,1 81,9 76,9 104,9 115,0 152,0 215,1 165,1 132.9 105,2 104,9 77,0 163,0 134,9 105,0 76,9 162,8 133,1 162,7 105,0 91,0 119,1 76,9 78,0 152,0 201,1 164,9
176
10
53 35 91 39 23 51 97 27 27 71 39 35 25 81 37 39 79 35 57 91 29 29 23 25 19 35 29 57 17 17 33 27 27 15 63 61 81 51 73
18 14 10 14 8 12 12 6 10 12 10 4 14 8 12 8 10 12 10 12 4 16 10 8 12 10 8 12 8 6 10 10 10 8 12 10 12 10 8
183,1 THC
286,1
THC-COOH
343,1
11-OH-THC
329,1
193,0 259,1 164,9 183,1 299,0 190,8 245,2 297,2 267,9 311,1 267,2 129,8
176
10
-160
-10
-140
-10
47
12
81 51 73 47 -28 -38 -42 -36 -40 -40 -46 -52
12 10 8 12 -21 -17 -11 -21 -17 -15 -13 -9
Tabel 4.2: Resultaten van de infusie van de interne standaarden. In vet de transities die uiteindelijk gekozen werden als qualifier. Interne standaard
Q1
Q2
DP (V)
EP (V)
CE (V)
CXP (V)
Amfetamine-D11
147,1
165,1 70,0 97,5 82,0
31
10
27 49 23 59
8 10 8 14
Benzoylecgoninge-D8
298,1
171,1 81,9 110,0 85,0
91
10
27 75 39 37
10 14 8 12
Cocaïne-D3
307,9
185,1 76,09 85,0 105,0
1
10
27 77 39 45
10 12 10 8
Codeïne-D6
306,2
218,1 152,0 165,0 115,0
171
10
35 89 57 97
14 10 10 10
MDMA-D5
199,1
165,0 135,1 107,1 136,0
26
10
17 27 33 29
10 8 8 8
MethamfetamineD14
164,1
98,1 130,1 97,5 70,0
56
10
27 17 25 57
8 10 8 8
Morfine-D6
292,1
152,0 128,1 153,1 181,0
191
10
83 55 75 53
12 10 10 14
THC-D3
318,2
196,0 318,3 123,1 262,2
26
10
11 31 43 27
18 12 8 12
11-OH-THC-D3
332,1
271,2 172,9
-140
-10
-36 -42
-19 -11
31
270,0 129,9 THC-COOH-D3
352,4
308,2 254,1 194,0 306,1
-160
-10
-46 -52
-19 -9
-30 -40 -44 -36
-19 -15 -11 -17
4.1.1.2 Optimalisatie bronspecifieke MS-parameters Onderstaande tabel (Tabel 4.3) bevat de resultaten van FIA voor elke periode. In periode één gebeurde de optimalisatie voor morfine, in periode twee voor 11-OH-THC en in periode drie voor THC. Tabel 4.3: Resultaten van Flow Injection Analysis in rood oude parameters overgenomen uit literatuur, zwart nieuwe parameters na FIA Ion spray
Temperatuur (°C)
Ionbron gas1
Ionbron gas2
Curtain gas
(psi)
(psi)
(psi)
voltage (V) Periode 1:
+4000
550
45
40
30
MORFINE, codeïne, heroïne,
+5500
550
60
60
50
Periode 2:
-4000
650
50
50
35
11-OH-THC,
-3000
550
40
50
30
Periode 3:
+4000
550
45
40
30
THC
+2500
650
50
50
30
amfetamine, methamfetamine, MDA, MDEA, MDMA, cocaïne en BE
THC-COOH
Periode één werd later in de methodeontwikkeling opgedeeld in vier periodes: periode één bevat morfine, periode twee bevat amfetamine, methamfetamine en MDA, periode drie bevat codeïne, MDMA, 6-MAM, MDEA, BE, en cocaïne. Hierdoor werden periode twee en drie zoals aangeduid in de tabel respectievelijk periode vijf en zes. 4.1.2 Optimalisatie chromatografie 4.1.2.1. Evaluatie methode gebaseerd op literatuur Bij de toepassing van de methode die gebaseerd was op het artikel van Di Corcia et al. was er coëlutie van de meeste componenten. Ook was de druk te hoog voor de gebruikte vloeistofchromatograaf, zelfs wanneer gebruik werd gemaakt van een BEH-C18 kolom van 5 cm. Hierdoor moest het debiet aangepast worden van 0,6 mL/min naar 0,4 mL/min.
32
Wanneer het gradiënt werd aangepast om zo een betere resolutie te verkrijgen, nam de lengte van de run aanzienlijk toe. Uiteindelijk werd een run bekomen van 21 minuten wat te lang is om in de praktijk toe te passen. 4.1.2.2 Kolomkeuze De Kinetex bifenyl kolom gaf een vrij goede scheiding en scherpe pieken voor de opiaten, amfetamines en analogen maar een zeer hoge basislijn en sterk verbrede pieken voor de cannabinoïden. Omdat de cut-off waarde voor THC het laagst is en dus een hoge S/N verhouding moet bekomen worden werd deze kolom uitgesloten. Bij de Kinetex fenyl/hexyl kolom werd een gelijkaardig resultaat bekomen. Enkel bij de Kinetex C-18-kolom en de BEHC18-kolom werden goede pieken bekomen voor de cannabinoïden. Er was wel nog onvoldoende resolutie. Uiteindelijk werd gekozen voor een Kinetex C18-kolom omdat deze kolom lagere tegendrukken geeft. Hierdoor kon het debiet van de mobiele fase verhoogd worden tot 0,7 mL/min zonder dat de druk boven de 250 bar uitsteeg. 4.1.2.3 Mobiele fase Bij het gebruik van MeOH als mobiele fase werd voor de cannabinoïden een hoge basislijn en zeer lage S/N verhouding waargenomen. Ook was de tegendruk bij gebruik van MeOH hoger dan met ACN. Daarenboven werd de retentietijd van morfine niet uitgesproken beïnvloed door het gebruik van MeOH i.p.v. ACN. Omwille van bovenstaande redenen werd bijgevolg opnieuw voor ACN gekozen als mobiele fase B. Bovendien werd ervoor geopteerd om 1% ACN toe te voegen aan mobiele fase A, aangezien dit tot meer reproduceerbare retentietijden leidde voor morfine. Vervolgens werd de invloed van de concentratie HCOOH op de S/N waarden van de cannabinoïden geëvalueerd. Om te evalueren wat de concentratie aan HCOOH in de mobiele fase teweegbracht werden de bekomen S/N verhoudingen bij 0,1 % HCOOH en 0,01 % HCOOH relatief uitgezet tegenover de S/N verhoudingen bekomen wanneer gebruik gemaakt werd van de startconditie 5 mM HCOOH (zie grafiek 4.1). Het is duidelijk merkbaar dat bij een lagere concentratie HCOOH een grote stijging van de S/N verhouding werd waargenomen voor 11-OH-THC. Dit is een grote vooruitgang omdat de S/N verhouding van 6,5 bij 5 mM steeg tot 15 bij 0.01 % mierenzuur. Er werd slechts een kleine negatieve invloed
33
waargenomen op de S/N verhouding van THC deze ging van 79,7 naar 73,1. Ook de S/N verhouding van THC-COOH daalde van 790,8 naar 624,8. Maar omdat de S/N verhouding van 11-OH-THC de laagste is, werd geopteerd om bij 0,01 % HCOOH te werken om zo een betere signaal over ruis verhouding te bekomen voor 11-OH-THC.
Optimalisatie concentratie HCOOH in mobiele fase S/N verhouding t.o.v S/N verhouding bij 5 mM HCOOH (%)
11-OH-THC
11-COOH-THC
THC
160% 140% 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% 0,1% HCOOH
5mM HCOOH
0,01% HCOOH
Grafiek 4.1: Signaal over ruis (S/N) verhouding van 11-OH-THC, THC-COOH en THC bij de aanwezigheid van verschillende concentraties mierenzuur (HCOOH) in de mobiele fase. De S/N waarden worden relatief uitgedrukt t.o.v. de S/N verhouding bekomen bij 5mM mierenzuur.
4.1.2.3 Gradiënt Wanneer het gradiënt dat gebaseerd was op het artikel van Di Corcia et al. werd gebruikt in combinatie met de Kinetex C18-kolom werd waargenomen dat de retentietijd van morfine zeer variabel was. Ook elueerde deze component reeds bij 0,3 minuten. Om morfine later te laten elueren werd eerst beslist de concentratie van ACN bij de start te verlagen tot 1 % i.p.v. 2 % en één minuut isocratisch te werken i.p.v. onmiddellijk een lineaire stijging toe te passen. Het bekomen gradiënt (Fig. 4.1) was als volgt: van 0 tot 1 minuut werd 0 % B gepompt, waarna het % B geleidelijk steeg tot 40 % bij 3,5 minuten. In de volgende 2 minuten steeg het % B verder tot 75 %. Vanaf 5.51 tot 7 minuten steeg het % B verder tot 95 % B en vervolgens drie minuten reëquilibreren naar 0 % B. Er werd gebruik gemaakt van een debiet van 0,7 mL per minuut.
34
De run werd opgedeeld in 6 verschillende periodes. In de eerste periode elueerde morfine, in de tweede amfetamine en in de derde periode methamfetamine, MDA en codeïne. In de vierde periode eluerden MDMA, 6-MAM, MDEA, BE, cocaïne. Bij de vijfde periode werd een polarity switch uitgevoerd waarna in negatieve modus gekeken wordt naar 11-OH-THC en THC-COOH. Vervolgens werd weer overgeschakeld naar de positieve modus voor de detectie van THC. (Fig. 4.2) Wanneer de interne standaarden samen met de componenten werden geïnjecteerd bleek dat deze niet op hetzelfde moment elueerden als de corresponderende niet gelabelde standaarden.
Figuur 4.1 Total ion chromatogram (TIC) met superpositie van het gebruikte gradiënt (uitgedrukt als % B i.f.v. tijd)
35
Figuur 4.2: Total ion chromatogram met daaronder een afzonderlijk chromatogram van iedere component. Van boven naar onder gerangschikt volgens retentietijd: morfine, amfetamine, methamfetamine, MDA, codeïne, MDMA, 6-MAM, MDEA, BE, cocaïne, 11-OH-THC, THC-COOH, THC.
Er werd een interfererende piek teruggevonden in de periode van 11-OH-THC en THC-COOH. Het ging om één transitie van THC-COOH die niet uit de methode verwijderd kon worden omdat het om de meest intense transitie ging met m/z 343,1 -> 299. Er werd nagegaan of de interfererende piek afkomstig was van het gebruikte UP water. Dit deden we door de mobiele fase eens aan te maken met LC-MS/MS water. De interfererende piek was echter nog steeds aanwezig, dus werd verder altijd met UP water gewerkt (Fig. 4.3 en Fig. 4.4).
36
Figuur 4.3: Injectie van een blanco met LC-MS/MS water, interferentie zichtbaar bij RT 4,39
Figuur 4.4: Injectie van een blanco met UP-water, interferentie zichtbaar bij RT 4,39
4.1.2.4 Needle wash Bij gebruik van de needle wash met 90 % ACN in water werd peak splitting waargenomen. Bij de needle washes van 1 % ACN en 20 % ACN in water werden hieromtrent geen problemen waargenomen. Aangezien bij het gebruik van de needle wash met 20 % ACN in water geen carry-over werd waargenomen na het injecteren van standaardoplossingen van 100 ng/mL, werd deze geselecteerd.
37
4.1.3 Staalvoorbereiding 4.1.3.1 Proteïneprecipitatie 4.1.3.1.1 Proteïneprecipitatie met ACN Bij de proteïneprecipitatie met ACN werd na extractie op bloed met een concentratie van iedere standaard van 1 ng/mL een voldoende hoge S/N verhouding teruggevonden om alle componenten te kunnen kwantificeren behalve voor 11-OH-THC en THC-COOH. 4.1.3.1.2 Proteïneprecipitatie met MeOH Bij de proteïneprecipitatie met MeOH werden ook de meeste componenten teruggevonden met een voldoende hoge S/N verhouding, maar de S/N verhoudingen waren lager dan deze bij de proteïneprecipitatie met ACN. Ook hier werden de cannabinoïden niet voldoende geëxtraheerd. 4.1.3.1.3 Recovery van de proteïnepreciptatie In onderstaande tabel (Tabel 4.4) wordt de Recovery (%) van de PP met ACN weergegeven. Bepaalde waarden worden niet weergegeven omdat de S/N waarde te klein was om kwantificatie toe te laten. Tabel 4.4 Recovery (%) van de proteïneprecipitatie met ACN
38
Recovery (%)
1 ng/mL
10 ng/mL
100 ng/mL
Morfine Amfetamine Amfetamine-D11 MDA Morfine-D6 Methamfetamine Methamfetamine-D14 Codeïne Codeine-D6 6-MAM 6-MAM-D3 MDEA BE Cocaïne BE-D8
41,66 22,39 58,45 4,06 146,29 156,50 53,40 207,57 185,53 215,72 140,89 22,15 41,69 55,23 114,87
37,04 6,54 27,09 59,39 144,34 12,22 32,38 44,68 163,95 32,10 88,24 26,38 53,88 62,82 102,16
75,57 31,04 30,35 78,11 97,50 32,78 88,01 143,03 144,66 47,04 62,70 90,53 96,65 97,44 99,00
Cocaïne-D3 MDMA-D3 MDMA THC-COOH THC-OH THC-COOH D3 THC-OH D3 THC THC-D3
117,60 108,74 11,90 / / 5789,36 250,19 / 4310,52
110,71 76,37 21,50 58,36 174,44 218,22 621,57 405,27 3380,29
104,15 123,83 101,23 87,77 9,34 946,10 333,74 6,63 2860,60
4.1.3.1.4 Matrixeffect proteïneprecipitatie In onderstaande tabel (Tabel 4.5) wordt het matrixeffect (%) weergegeven. Bepaalde waarden konden niet berekend worden omdat een te lage S/N verhouding werd bekomen. Tabel 4.5 Matrixeffect (%) van de proteïneprecipitatie met ACN
Matrixeffect (%) Morfine Morfine-D6 Amfetamine Amfetamine-D11 Methamfetamine Methamfetamine-D14 MDA Codeïne Codeine-D6 MDMA MDMA-D3 6-MAM 6-MAM-D3 MDEA BE BE-D8 Cocaïne Cocaïne-D3 11-OH-THC 11-OH-THC-D3 THC-COOH THC-COOH-D9
THC THC-D3
1 ng/mL 40,5 41,15 85,29 81,53 95,48 99,86 541,24 96,62 91,86 98,41 92,96 88,21 96,06 125,18 120,56 102,12 30,59 84,44 / 1,99 / 84,04 / 94,74
10 ng/mL 43 38,15 79,91 78,17 87,9 114,37 108,11 97,88 99,23 86,69 84,53 75,6 86,1 102,77 106,69 100,64 74,07 83,99 24,2 945,19 1,48 37,27 59,58 28,36
100 ng/mL 71,06 57,93 49,79 49,56 106,42 81,54 100,96 98,2 103,04 91,73 72,21 95,49 83,08 71,09 94,24 96,99 92,51 89,96 89,64 0,19 1,26 7,67 83,64 1,35
39
4.1.3.1.5 Selectiviteit Bij de injectie van het geëxtraheerde blanco staal na PP (Fig. 4.5) werden geen MRMtransities waargenomen van de op te sporen drugs bij de respectievelijke retentietijden.
Figuur 4.5: Injectie van een blanco extract na proteïneprecipitatie om de selectiviteit na te gaan.
4.1.3.2 Vloeistof-vloeistof extractie 4.1.3.2.1 Enkelvoudige vloeistof-vloeistof extractie vs. dubbele vloeistof-vloeistof extractie Het mechanisch schudden werd ingekort tot 2 minuten in de plaats van 30 minuten, aangezien dit geen merkbare invloed op het extractierendement. Uit de vergelijking van dubbele en enkele vloeistof-vloeistof extractie bleek dat dubbele vloeistof-vloeistof extractie geen betere resultaten gaf (grafiek 4.2). Daarom werd ervoor gekozen voor alle komende experimenten gebruik te maken van enkelvoudige vloeistof-vloeistof extractie waarbij gedurende 2 minuten wordt geëxtraheerd en matrixeffect uit te voeren met enkelvoudige vloeistof-vloeistof extractie.
40
Enkele LLE vs. dubbele LLE (2 min) 2500
1ng/mL (enkelvoudig LLE) 10ng/mL (enkelvoudig LLE) 100ng/mL (enkelvoudig LLE)
1ng/mL (dubbele LLE) 10ng/mL (dubble LLE) 100ng/mL(dubble LLE)
S/N verhouding
2000
1500
1000
500
0 THC-OH
THC-OH-D3
THC-COOH
THC-COOH-D9
THC
THC-D3
Grafiek 4.2: Vergelijking van enkelvoudige LLE en dubbele LLE a.d.h.v. de S/N verhouding. Voor elke component wordt per conditie het gemiddelde weergegeven (n = 3) ± standaard deviatie.
4.1.3.2.2 Recovery vloeistof-vloeistof extractie In onderstaande tabel (Tabel 4.6) worden de resultaten van het recovery experiment voor de vloeistof-vloeistof extractie. Tabel 4.6 Recovery vloeistof-vloeistof extractie
Recovery (%) 11-OH-THC 11-OH-THC-D3 THC-COOH THC-COOH-D9 THC THC-D3
1 ng/mL / 12,38 16,95 66,30 / 134,6
10 ng/mL 45,67 13,12 70,21 58,70 50,37 62,88
100 ng/mL 32,72 7,05 89,35 32,46 73,48 87,04
4.1.3.2.3 Matrixeffect vloeistof-vloeistof extractie Onderstaande tabel (Tabel 4.7) het matrixeffect van de vloeistof-vloeistof extractie. Hieruit is duidelijk dat er enorme ion suppressie aanwezig is voor alle cannabinoïden.
41
Tabel 4.7 Matrixeffect vloeistof-vloeistof extractie
Matrixeffect (%)
1 ng/mL
10 ng/mL
100 ng/mL
11-OH-THC
/
28,01
16,82
11-OH-THC-D3
18,00
6,40
98,66
THC-COOH
54,22
33,11
37,43
THC-COOH-D9
11,50
57,44
65,78
THC
33,16
36,31
37,24
THC-D3
/
35,18
33,98
4.2 TOEPASSING VAN DE ONTWIKKELDE METHODE OP ROUTINESTALEN 4.2.1 Case 1 In de urine werd met PP en LLE THC-COOH teruggevonden. Er was geen THC-COOH aanwezig in het bloed of plasma. Amfetamine werd ook duidelijk gedetecteerd in de urine (Fig. 4.6). Er werd echter geen amfetamine teruggevonden in het bloed of plasma.
Figuur 4.6: Transities amfetamine bekomen via de PP op de urine van case 1
4.2.2 Case 2 Bij case 2 werd met PP THC-COOH teruggevonden in de urine en THC in het plasma. Ook werd er via LLE amfetamine gedetecteerd in de urine.
42
5. DISCUSSIE 5.1 METHODEONTWIKKELING 5.1.1 Optimalisatie MS-parameters 5.1.1.1 Bepaling MRM-transities en optimalisatie component specifieke MS-parameters
Omdat 11-OH-THC en 11-OH-THC-D3 in literatuur reeds in positieve en in negatieve modus werden bepaald, werd de infusie voor beide componenten zowel in positieve als in negatieve modus gedaan. Ondanks dat voor beide componenten een zeer intense transitie werd waargenomen bij respectievelijk m/z 331 naar 313 en 334,1 naar 316, werd geopteerd deze transities niet te gebruiken, aangezien deze te wijten waren aan waterverlies en dergelijke transities beter worden vermeden.
81
Mogelijke problemen met de gevoeligheid
voor deze componenten werden reeds duidelijk bij infusie aangezien voor deze componenten een hogere concentratie moest worden gebruikt om de infusie uit te kunnen voeren (respectievelijk 100 ng/mL en 1 µg/mL voor 11-OH-THC en 11-OH-THC-D3). 5.1.1.2 Optimalisatie bronspecifieke MS-parameters
Ondanks dat FIA aangaf dat in de derde periode een brontemperatuur van 650 °C optimaal was werd dit niet ingevoerd. Er werd overal gewerkt met een brontemperatuur van 550 °C omdat de bron niet tijdig kan opwarmen tot 650 °C en ook niet opnieuw kan afkoelen voor de start van een nieuwe run. Daarom werd geopteerd om bij 550 °C te werken omdat dit de brontemperatuur was die optimaal was voor de negatieve periode. 5.1.2 Optimalisatie chromatografie 5.1.2.1. Evaluatie methode gebaseerd op literatuur Het was noodzakelijk dat het gradiënt werd aangepast en dat er werd gebruik gemaakt van een Kinetex C18 kolom. Met de BEH-C18-kolom was de tegendruk te hoog, ookal was deze maar 5 cm. Voor 11-OH-THC en 11-OH-THC-D3 werd telkens zeer lage S/N verhoudingen bekomen.
43
5.1.2.2 Kolomkeuze Als kolom werd uiteindelijk voor een Kinetex C18-kolom gekozen. Kinetex kolommen leveren een lagere tegendruk toch wordt met deze kolommen een betere resolutie bekomen. Coreshell partikels bestaan uit een harde niet poreuze kern bedekt met een poreuze silicalaag. De piekverbreding bij core-shell kolommen is minder doordat er minder diffusie kan optreden in de stationaire fase. Ook is de variabiliteit in grootte van partikels van de pakking minder waardoor de eddydiffusie sterk verminderd is. 73 5.1.2.3 Mobiele fase MeOH kon het probleem van de vroegtijdige retentie van morfine niet oplossen, een groot nadeel was dat MeOH een hogere tegendruk gaf. Dit moet ten allen tijde vermeden worden omdat deze techniek later moet toegepast worden op een DBS en de DBSA kan slechts drukken aan tot 250 bar. Bij de keuze van de mobiele fase was de concentratie van HCOOH cruciaal. HCOOH is een protondonor en heeft bijgevolg een positieve invloed op de positieve ionisatie, maar is nadelig voor de negatieve ionisatie van 11-OH-THC en THC-COOH. Daarom was het van essentieel belang dat de concentratie aan HCOOH voldoende hoog was om de positieve ionisatie te stimuleren, maar ook voldoende laag zodat geen hinder werd ondervonden voor de ionisatie van 11-OH-THC en THC-COOH. Bovendien werd voornamelijk gelet op het effect op 11-OH-THC, aangezien deze component de grootste uitdaging vormde wat gevoeligheid betreft. Bij het gebruik van 0.01 % HCOOH in mobiele fase A en B bleek de ionisatie van 11-OH-THC het best te verlopen. Zonder dat de ionisatie van de andere componenten te erg werd gehinderd. 5.1.2.4 Gradiënt Tijdens deze thesis werd nog gebruik gemaakt van een methode met verscheidene periodes. Toch zou het in de toekomst nuttig zijn om gebruik te kunnen maken van enhanced scheduled MRM. Hierbij wordt op een veel efficiëntere manier gekeken naar de verscheidene componenten, omdat onmiddellijk rond de retentietijd naar een transitie wordt gekeken. Dit is beter dan dat in een periode bv. naar de transities van 3 componenten wordt gekeken. Ook is het gebruik van enhanced scheduled MRM belangrijk omdat in de
44
toekomst nog vele andere componenten moeten geïncorporeerd worden in deze multianalytmethode. Wanneer de interferentie zou kunnen verwijderd worden zou de run nog sterk ingekort kunnen worden. Daarom is het noodzakelijk dat de oorzaak van deze interferentie kan worden achterhaald. Die ene transitie van THC-COOH kan niet geëxcludeerd worden uit de methode. Het is namelijk wenselijk dat de transitie met de meest intense S/N verhouding behouden blijft. Wanneer het gradiënt gebruikt werd om een mix van standaarden en IS te detecteren viel op dat deze niet op hetzelfde moment elueren. Dit werd veroorzaakt door het deuterium isotoop effect. Door de deuteratie is de lipofiliciteit van de componenten veranderd, waardoor er een andere interactie plaatsvond met de stationaire en mobiele fase. Hierdoor zullen de IS mogelijk minder goed compenseren voor variaties in de analyse. 82 5.1.2.5 Needle wash Ondanks dat geen carry-over meer werd gezien bij gebruik van een needle wash van 20 % ACN in water, werd wel in elke run een zeer sterk signaal gedetecteerd voor cocaïne. Dit was niet te wijten aan een onvoldoende sterk wassolvent voor de naald aangezien zelfs na herhaaldelijk spoelen met 100 % ACN het signaal voor cocaïne niet verminderde. De aanwezigheid van dit sterke signaal voor cocaïne zelfs tijdens injecties van water of ACN betekent dat cocaïne niet betrouwbaar kan gedetecteerd worden in een staal en zeker niet correct gekwantificeerd zal kunnen worden. 5.1.3 Staalvoorbereiding 5.1.3.1 Proteïneprecipitatie Doordat er in glazen puntbuizen moet gewerkt worden in plaats van in eppendorfjes (wegens de adsorptie van THC aan plastic) is het moeilijk om het supernatans af te pipetteren. Het zou eenvoudiger zijn en er zou met veel kleinere volumes kunnen gewerkt worden wanneer er kon gebruik gemaakt worden van eppendorfjes omdat deze een kleinere diameter hebben. Een ander groot voordeel van het werken met eppendorfjes is het feit dat aan een hogere snelheid kan gecentrifugeerd worden en het precipitaat dus beter zal
45
uitzakken. PP gaf een te lage S/N verhouding voor de cannabinoïden wanneer 1 ng/mL werd geïnjecteerd. 5.1.3.2 Vloeistof-vloeistof extractie LLE bleek geen goede oplossing voor de extractie van cannabinoïden, enkel THC-COOH was kwantificeerbaar bij een injectie van 1 ng/mL. Bij de vergelijking tussen enkelvoudige en dubbele LLE werd geopteerd voor enkelvoudige LLE. Dit omdat de resultaten zeer tegenstrijdig waren. 5.1.3.3 Recovery en matrixeffect De bepaling van recovery en matrixeffect voor zowel PP als LLE gaf geen goede resultaten. Bovendien vertoonden deze resultaten veel variatie. In de toekomst zal het noodzakelijk zijn dit experiment opnieuw uit te voeren of eventueel over te gaan op een andere staalvoorbereidingsmethode. De variatie kan immers te wijten zijn aan de uitvoering van het experiment, maar mogelijks ook aan de niet-reproduceerbaarheid van de staalvoorbereiding zelf. Om de variatie te verminderen kan in de toekomst eventueel in zesvoud worden gewerkt i.p.v. in drievoud. Ook is het zo dat deze stalen al eerder werden bereid en meer dan drie weken in de diepvries zijn bewaard voor de eigenlijke analyse kon plaatsvinden. Dit heeft mogelijk de bekomen resultaten beïnvloed. Voor de recovery van de proteïneprecipitatie compenseren de IS niet goed voor de bijhorende standaarden, dit is bij het matrixeffect van de PP veel meer het geval. Enkel is dit niet het geval bij de cannabinoïden, waarschijnlijk door het lage extractie rendement. Morfine ondervindt een groot matrix effect dit is mogelijks veroorzaakt door de vroege retentietijd. De waarden voor cocaïne mogen niet geïnterpreteerd worden omdat bij de injecties van water cocaïne aanwezig was. De recovery van de cannabinoïden is beter bij LLE dan bij PP, ze zijn ook sterk onderhevig aan matrixeffecten. Er is sprake van een enorme ion suppressie. Wanneer de waarde voor het matrixeffect gelijk is aan 100 % dan is er geen matrixeffect, wanneer de waarde kleiner is dan 100 % is er sprake van ion suppressie. Is de waarde groter dan 100 % dan is er sprake van ion enhancement.79 Doordat sommige IS op een ander moment elueren de bijhorende component kan het zijn dat deze een verschillend matrixeffect ondervinden.
46
5.2 TOEPASSING VAN DE ONTWIKKELDE METHODE OP ROUTINESTALEN Bij case 1 werd THC-COOH teruggevonden in de urine maar niet in bloed of plasma. THCCOOH is de langst detecteerbare metaboliet in het lichaam. Bij case 2 werd THC-COOH teruggevonden in de urine en THC in het plasma. In het routinelaboratorium werd voor beide cases niet positief getest voor amfetamine, toch werd in de urine telkens amfetamine teruggevonden. Beide positieve resultaten zijn mogelijks veroorzaakt door een stof die aanwezig is in urine en dezelfde transities heeft als amfetamine.
47
6. CONCLUSIE Het ontwikkelen van een HPLC-MS/MS methode waarin zowel cannabinoïden, opiaten, cocaïne, amfetamines en amfetamine-analogen worden bepaald, is niet vanzelfsprekend. Ondanks dat deze drugs reeds veelvuldig apart zijn bepaald in literatuur, is het moeilijk een methode te ontwikkelen die voor alle componenten in de multi-analytmethode voldoende goed is. Al deze verschillende klassen drugs hebben immers verschillende chemische eigenschappen. Uiteindelijk konden de MS-parameters geoptimaliseerd worden en ook de chromatografie werd al aanzienlijk verbeterd. In de toekomst zal gewerkt moeten worden met enhanced scheduled MRM zeker wanneer nog meer componenten moeten worden opgenomen in de multi-analytmethode. Het deuterium isotoop effect zorgt ervoor dat de interne standaarden een ander matrixeffect kunnen ondervinden dan de componenten omdat beide niet op hetzelfde moment elueren.
Het was niet mogelijk om een gemeenschappelijke staalvoorbereiding te ontwikkelen voor alle componenten. Zowel de PP al de LLE staalvoorbereidingsmethoden die werden getest, zullen
verder
geoptimaliseerd
moeten
worden
of
er
zullen
andere
staalvoorbereidingsmethoden, zoals SPE, moeten worden geëvalueerd. Het is namelijk van groot belang dat een voldoende hoog extractierendement kan bekomen worden voor alle componenten in de methode. Hierbij vormen de cannabinoïden en in het bijzonder 11-OHTHC de grootste uitdaging, aangezien deze klasse drugs niet enkel de laagste S/N verhouding vertoont in de gebruikte methode, maar ook dat THC de laagste cut-off waarde (1 ng/mL) heeft die in de wet is opgenomen. In de toekomst is een grondige validatie noodzakelijk voordat de methode kan worden gebruikt voor de analyse van volbloed routinestalen of voor de vergelijking met een bloedspotmethode.
48
7. BIBLIOGRAFIE
1.
Concheiro M, de Castro A, Quintela O, López-Rivadulla M, Cruz A. Determination of drugs of abuse and their metabolites in human plasma by liquid chromatographymass spectrometry: An application to 156 road fatalities. J. Chromatogr. B, 2006; 832: 81–89.
2.
Walsh JM, Verstraete AG, Huestis M, Mørland J. Guidelines for research on drugged driving. Addiction, 2008; 103: 1258–1268.
3.
Scheers M, Verstraete A, Adriaensen M, Raes E, Tant M. Rijden onder invloed van psychoactieve stoffen: literatuurstudie en evaluatie van het handhavingsbeleid. Academia Press, 2006; p.1–13.
4.
Dewick PM. Medicinal Natural Products. 3rd ed. UK: Wiley; 2009. p. 120-122.
5.
Wille SMR. Toxicologie “train the trainers”. Website wegcode 2010. Beschikbaar via: www.wegcode.be/docupol/presentatie_politie_sept2010SWIdefinitief.ppt. Geraadpleegd op 2015 februari 11.
6.
Cruz A, Quintela O, Castro A De, Concheiro M. Chapter 8 : Evaluation of roadside oral fluid drug testing devices. Website Rosita 2000. Beschikbaar via: http://www.rosita.org/docs/Chapter%208.pdf. Geraadpleegd op 2015 maart 10.
7.
Oliveira R V., Henion J, Wickremsinhe ER. Automated direct extraction and analysis of dried blood spots employing on-line SPE high-resolution accurate mass bioanalysis. Bioanalysis, 2014; 6(15): 2027–2041.
8.
Samyn N, Van Haeren C. On-site testing of saliva and sweat with Drugwipe and determination of concentrations of drugs of abuse in saliva, plasma and urine of suspected users. Int J Legal Med., 2000; 113: 150–154.
9.
Moeller KE, Lee KC, Kissack JC. Urine Drug Screening: Practical Guide for Clinicians. Mayo Clin Proc, 2008; 83(1): 66–76.
10.
Armbruster D a., Schwarzhoff RH, Hubster EC, Liserio MK. Enzyme immunoassay, kinetic microparticle immunoassay, radioimmunoassay, and fluorescence polarization immunoassay compared for drugs-of-abuse screening. Clin. Chem., 1993; 39(10): 2137–2146.
11.
FGOV. Wet tot invoering van speekseltesten op drugs in het verkeer. Website FGOV 2009. Beschikbaar via: http://www.ejustice.just.fgov.be/cgi_loi/ change _lg.p l?language=nl&la=N&table_name=wet&cn=200907313715 september 2009. Geraadpleegd op 2015 februari 11.
12.
Mlkkelsen SL, Ash KO. Adulterants Causing False Negatives in Illicit Drug Testing. Clin. Chem., 1988; 34(11): 2333–2336.
49
50
13.
KB. Koninklijk besluit betreffende het model en de toepassingsregels van de gestandaardiseerde checklist tot vaststelling van indicaties van tekenen van recent druggebruik in het verkeer. Website wegcode2010.Beschikbaar via: http://wegcode.be/act ueel/ 208-kb/kb-170910/1616-art1-4 Geraadpleegd op 2015 februari 12.
14.
Wille SMR, Samyn N, Ramírez-Fernández MDM, De Boeck G. Evaluation of on-site oral fluid screening using Drugwipe-5+®, RapidSTAT® and Drug Test 5000® for the detection of drugs of abuse in drivers. Forensic sci int, 2010; 198: 2–6.
15.
Aberl F, VanDine R. Chapter 10 Saliva and Sweat Testing With Drugwipe ®: A Review. In: Drugs of abuse body fluid testing. Wong RC, Tse HY. New York City (US): Humana Press; 2005. p. 161-175.
16.
Posthuma-Trumpie G a., Korf J, Van Amerongen A. Lateral flow (immuno)assay: Its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey. Anal. Bioanal. Chem., 2009; 393: 569–582.
17.
Sarris G, Borg D, Liao S, Stripp R, Labs A, Road L, et al. Validation of an EMIT Screening Method to Detect 6-Acetylmorphine in Oral Fluid. J. Anal. Toxicol., 2014; 38(2): 605– 609.
18.
Mulé SJ, Bastos ML, Jukofsky D. Evaluation of immunoassay methods for detection, in urine, of drugs subject to abuse. Clin. Chem., 1974; 20: 243–248.
19.
SINO BIOLOGICAL INC. ELISA types. Website elisa antybody 2015.Beschikbaar via: http://www.elisa-antibody.com. Geraadpleegd op 2015 april 5.
20.
Agius R, Nadulski T. Utility of ELISA screening for the monitoring of abstinence from illegal and legal drugs in hair and urine. Drug Test Anal., 2014; 6(Oktober): 101–109.
21.
Wieling J. LC-MS-MS experiences with internal standards. Chromatographia 2002, 55(1): 107–13.
22.
Wegcode. Wet betreffende de politie over het wegverkeer. Website wegcode 2015. Beschikbaar via: http://www.wegcode.be/wetteksten/secties/wetten/verkeerswet/477-t5hs1afd2 Geraadpleegd op 2015 maart 27.
23.
Idowu OR, Caddy B. A review of the use of saliva in the forensic detection of drugs and other chemicals. FSSoc, 1982; 22: 123–135.
24.
Schepers RJF, Oyler JM, Joseph RE, Cone EJ, Moolchan ET, Huestis M. Methamphetamine and amphetamine pharmacokinetics in oral fluid and plasma after controlled oral methamphetamine administration to human volunteers. Clin. Chem., 2003; 49: 121–132.
25.
Yonamine M, Tawil N, De Moraes Moreau RL, Alves Silva O. Solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry and headspace-gas chromatography of tetrahydrocannabinol, amphetamine, methamphetamine, cocaine and ethanol in saliva samples. J. Chromatogr. B, 2003; 789: 73–78.
27.
Moore C, Coulter C, Uges D, Tuyay J, van der Linde S, van Leeuwen A, et al. Cannabinoids in oral fluid following passive exposure to marijuana smoke. Forensic Sci int, 2011; 212(1-3): 227–230.
28.
Wilhelm AJ, Klijn A, den Burger JCG, Visser OJ, Veldkamp AI, Janssen JJWM, et al. Clinical validation of dried blood spot sampling in therapeutic drug monitoring of ciclosporin a in allogeneic stem cell transplant recipients: direct comparison between capillary and venous sampling. Ther Drug Monit, 2013; 35: 92–95.
29.
De Kesel PM, Sadones N, Capiau S, Lambert WE, Stove CP. Hemato-critical issues in quantitative analysis of dried blood spots: challenges and solutions. Bioanalysis, 2013; 5(16): 2023–2041.
30.
Dams R, Huestis M a., Lambert WE, Murphy CM. Matrix effect in bio-analysis of illicit drugs with LC-MS/MS: Influence of ionization type, sample preparation, and biofluid. J. Am. Soc. Mass Spectrom, 2003; 14(11): 1290–1294.
31.
De Kesel PMM, Capiau S, Stove V V., Lambert WE, Stove CP. Potassium-based algorithm allows correction for the hematocrit bias in quantitative analysis of caffeine and its major metabolite in dried blood spots. Anal. Bioanal. Chem., 2014; 406(26): 6749–6755.
32.
Pertwee RG. The pharmacology of cannabinoid receptors and their ligands: an overview. Int. J. Obes., 2006; 30 (Supplement 1): 13–18.
33.
Hunault CC, van Eijkeren JCH, Mensinga TT, de Vries I, Leenders MEC, Meulenbelt J. Disposition of smoked cannabis with high δ9-tetrahydrocannabinol content: A kinetic model. YTAAP, 2010; 246(3): 148–153.
34.
Nederlands Forensisch Instituut. Consultatie toxicologie. Website commisie van toezicht 2013. Beschikbaar via: http://www.google.be/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=3&ved=0CCcQFj AC&url=http%3A%2F%2Fwww.commissievantoezicht.nl%2Fdossiers%2Fmiddelengebr uik%2Frapport-nfi.pdf&ei=n1g1VfWBCeHLyAOmqIGIDA&usg=AFQjCNH4_yPRAA7IgEjQeYwUi4QZhXqow. Geraadpleegd op 2015 maart 25
35.
Van Caelenberg S, Herdewijn P. Medicinale chemie Deel 2. 2014. p. 1-25.
36.
Dhawan BN, Cesselin F, Raghubir R, Reisine T, Bradley PB, Portoghese PS, et al. International Union of Pharmacology. XII. Classification of opioid receptors. Pharmacol rev, 1996; 48(4): 567–592.
37.
Hughes J, Kosterlitz HW. Opioid peptides. Br Med Bull, 1977; 33(2): 157–161.
51
52
38.
Thorn CF, Klein TE, Altman RB. Codeine and morphine pathway. Pharmacogenet genom, 2009; 19(7): 556-558.
39.
Moreira F, Dalley JW. Dopamine receptor partial agonists and addiction. J. Pharm., 2015; 752: 112–115.
40.
Herdewijn P, Van Caelenberg S. Medicinale Chemie Deel 2. 2013. p. 27-33
41.
Rook EJ, Hillebrand MJX, Rosing H, van Ree JM, Beijnen JH. The quantitative analysis of heroin, methadone and their metabolites and the simultaneous detection of cocaine, acetylcodeine and their metabolites in human plasma by high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B, 2005; 824(1-2): 213–221.
42.
Herdewijn P, Van Caelenberg S. Medicinale Chemie Deel 1. 2013. p. 35 -45.
43.
Thompson ML, Shuster L, Shaw K. Cocaïne induced hepatic necrosis in micemetabolism. Biochem. Pharmacol., 1979; 28: 2389–2395.
44.
Shindler CW, Goldberg SR. Accelerating cocaine metabolism as an approach to the treatment of cocaine abuse and toxicity. Future Med Chem, 2012; 4(2): 163–175.
45.
Katz JL, Terry P, Witkin JM. Comparative behavioral pharmacology and toxicology of cocaine and its ethanol-derived metabolite, cocaine ethyl-ester (cocaethylene). Life Sci., 1992; 50(18): 1351–1361.
46.
McCance-Katz EF, Kosten TR, Jatlow P. Concurrent use of cocaine and alcohol is more potent and potentially more toxic than use of either alone: a multiple-dose study. Biol. Psychiatry, 1998; 44(4): 250–259.
47.
Laizure SC, Mandrell T, Gades NM, Parker RB. Cocaethylene metabolism and interaction with cocaine and ethanol: Role of carboxylesterases. Drug Metab. Dispos., 2003; 31(1): 16–20.
48.
Logan BK. Amphetamines: an update on forensic issues. J. Anal. Toxicol., 2001; 25: 400–404.
49.
Sulzer D, Sonders MS, Poulsen NW, Galli A. Mechanisms of neurotransmitter release by amphetamines: A review. Prog Neurobiol, 2005; 75: 406–433.
50.
Wikipedia. Figuur chemische structuur amfetamine. Website wikipedia 2015. Beschikbaar via: http://nl.wikipedia.org/wiki/Amfetamine#/media/File:Amphetamine.png. Geraadpleegd op 2015 maart 17.
51.
Cho AK, Wright J. Pathways of metabolism of amphetamine. Life sci., 1978; 22(5): 363–372.
52.
Battaglia G, Brooks BP, Kulsakdinun C, De Souza EB. Pharmacologic profile of MDMA (3,4-methylenedioxymethamphetamine) at various brain recognition sites. Eur. J. Pharmacol., 1988; 149: 159–163.
53.
De la Torre R, Farré M, Roset PN, Pizarro N, Abanades S, Segura M, et al. Human pharmacology of MDMA: pharmacokinetics, metabolism, and disposition.Ther drug monit, 2004; 26(2): 137–144.
54.
Zimmer D. Introduction to quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS-MS). Chromatographia, 2003; 57: 325–332.
55.
Koerner PJ. General Principles of HPLC Method Development. Website Phenomenex 2013. Beschikbaar via: http://www.fortunesci.com/download%20document/siminar2_56/General%20Princip les%20of%20HPLC%20Method%20Development.pdf. Geraadpleegd op 13 februari 2015.
56.
THIENPONT L. Instrumentele Analytische Chemie. 2013. p.133-142.
57.
McGinley M, Jarrett D, Layne J, Chitty M, Farkas T. Optimising Core-Shell UHPLC Columns for Improving Protein and Peptide Separations. Chromatogr. Today, 2011; 4(4): 33–6.
58.
Van Deemter JJ, Zuiderweg FJ, Klinkenberg A. Longitudinal diffusion and resistance to mass transfer as causes of nonideality in chromatography. Chem Eng Sci, 1995; 5(24): 3869–3882.
59.
Knox JH, Scott HP. B and C terms in the Van Deemter equation for liquid chromatography. J. Chromatogr. A, 1983; 282: 297–313.
60.
Banerjee S, Mazumdar S. Electrospray Ionization Mass Spectrometry: A Technique to Access the Information beyond the Molecular Weight of the Analyte. J. Anal. Chem., 2012; 2012: 1–40.
61.
De Hoffmann E. Tandem mass spectrometry: A primer. J. Mass Spectrom., 1996; 31 (2): 129–137.
62.
Wikipedia. Tandem Massaspectrometrie. Website wikipedia 2015. Beschikbaar via: http://en.wikipedia.org/wiki/Triple_quadrupole_mass_spectrometer#/media/File:Trip le_quadrupole_schematic.jpeg. Geraadpleegd 17 maart 2015.
63.
Restek Chromatograpy Products. Electron Multipliers for Mass Spectrometry. Website restek Chromatography Products 2008. Beschikbaar via: http://www.restek.com/pdfs/GNBR1000A-UNV.pdf. Geraadpleegd 31 maart 2015.
64.
Di Corcia D, Lisi S, Pirro V, Gerace E, Salomone A, Et al. Determination of pharmaceutical and illicit drugs in oral fluid by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B, 2012; 927: 133 -141.
53
54
65.
Schwope DM, Scheidweiler KB, Huestis MA. Direct quantification of cannabinoids and cannabinoid glucuronides in whole blood by liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem., 2011; 401(4): 1273 – 1283.
66.
Sergi M, Bafile E, Compagnone D, Curini R, et al. Multiclass analysis of illicit drugs in plasma and oral fluids by LC-MS/MS. Anal Bioanal Chem, 2009; 393: 709–718.
67.
AB Sciex. Advanced Hybrid Triple Quadrupole Linear Ion Trap Technology Website AB sciex 2015. Beschikbaar via: http://www.absciex.com/Documents/Downloa ds/Literature/mass-spectrometry-cms_040200.pdf. Geraadpleegd op 30 mei 2015.
68.
Douglas DJ, Frank AJ, Mao D, Linear ion traps in mass spectrometry. Mass Spectrom, 2005; 24(1): 1 – 29.
69.
Merck Index. 9th ed. USA: Rahway; 1976 p. 890
70.
Fairbairn JW, Liebmann JA, Rowan MG. The stability of cannabis and its preparations on storage. J Pharm Pharmacol. 1976; 28 (1): 1-7.
71.
Molnar A, Lewis J, Fu S. Recovery of spiked delta9-tetrahydrocannabinol in oral fluid from polypropylene containers. Forensic sci int, 2013; 277(3): 67-73.
72.
AB Sciex. Powerpoint training QTRAP™ 5500.
73
Phenomenex. Core-Shell science Website phenomenex 2015. Beschikbaar via: https://www.phenomenex.com/Kinetex/CoreShellTechnology. Geraadpleegd op 2 mei 2015.
74.
Shimadzu. Differences Between Using Acetonitrile and Methanol for Reverse Phase Chromatography. Website Shimadzu 2015. Beschikbaar via: http://www.shimad zu.com/an/h plc/support/lib/lctalk/35/35lab.html. Geraadpleegd op 30 mei 2015.
75.
Swartz ME. Analytical Techniques in Combinatorial Chemistry. 10th ed. New York: Marcel Dekker; 2000. p. 121-123.
76.
Wohlfarth A, Roth N, Auwärter V. LC-MS/MS analysis of Δ9-tetrahydrocannabinolic acid in serum after protein precipitation using an in-house synthesized deuterated internal standard. J. Mass Spectrom., 2012; 47778 – 785.
77.
Del Mar Ralurez Fernandez M, De Boeck G., Wood M. Lopez-Rivadulla M., Samyn N. Simultaneous analysis of THC and its metabolites in blood using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B, 2008; 875(2): 465470.
78.
Aphios. Δ9-Tetrahydrocannabinolic Acid (Δ9-THCA). Website Aphios 2015. Beschikbaar via: http://www.aphios.com/products/research-chemicals/d9-thca.html. Geraadpleegd op 1 juni 2015.
79.
Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Strategies for the Assessment of Matrix Effect in Quantitative Bioanalytical Methods Based on HPLC-MS/MS. Anal. Chem. 2003; 75: 3019-3030.
80.
Synergy. Synergy water purification systems Website Synergy 2015. Beschikbaar via: http://www.synergy.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2 &ved=0CCcQFjAB&url=http%3A%2F%2Fwww.labena.hr%2Findex.php%3Foption%3D com_k2%26view%3Ditem%26task%3Ddownload%26id%3D329_10d641c3fa1613dae 4103405363394a7%26Itemid%3D117&ei=YaRrVcuhLIXwUuWygdAD&usg=AFQjCNFJG xHPZ6u7OBDlZZYa4M2FUM3WoQ&bvm=bv.94455598,d.bGg. Geraadpleegd op 15 mei 2015.
81.
IonSource. Develop an MRM transition. Website IonSource 2015. Beschikbaar via: http://www.ionsource.com/tutorial/msquan/srm.htm. Geraadpleegd op 31 mei 2015.
82.
Erin E, Diane M, Waters Corporation. The use of stable-isotope-labeled (SIL) internal standards to compensate for matrix effects: key considerations. Website Waters 2015. Beschikbaar via: http://www.waters.com/webassets/cms/library/doc s/7200024 38en.pdf. Geraadpleegd op 14 mei 2015.
55
EVENING LECTURES Lezing 1: Research on the causes of human cancer and scientific strategies for cancer prevention and control – Dr. Inge Huybrechts De prevalentie van kanker stijgt en in 2030 zullen minstens 75 miljoen mensen aan kanker lijden. De twee grote kanker risicofactoren zijn genetische factoren en omgevings factoren. Iarc is een uniek agentschap die beroepsblootstelling, fysische en biologische stoffen, levensstijlfactoren
klasseert in verschillende groepen (groep 1-4). Waarbij groep één
carcinogeen is, groep 2A en 2B waarschijnlijk carcinogeen en groep 3 omvat niet geklasseerde factoren. Groep 4 omvat elementen die niet carcinogeen zijn. De Iarc monographs zijn reviews die omgevingsfactoren rapporteren die de kans op kanker doen verhogen. Een voorbeeld hiervan is roken. Deze monographs bestaan uit een review en evaluatie van de bewijskracht. Lezing 2: RNA Therapeutics: Opportunities & challenges – Raymond Schiffelers RNA geneesmiddelen interageren met de proteïnesynthese of blokkeren de synthese van een bepaald proteïne (inhiberen translatie). Een eerste voorbeeld is een enkelstrengig stukje DNA dat complementair is met het mRNA. Er ontstaat een mRNA-RNA adduct waardoor de translatie stopt. RNA geneesmiddelen hebben andere eigenschappen dan de klassieke geneesmiddelen. Ze hebben een hoger moleculair gewicht, een negatieve lading en moeten tot in de cel geraken. Voordelen zijn dat het drugdesign snel kan gebeuren, de tests gebeuren in een aantal weken en het kan als target een proteïne hebben. Een voorbeeld van een RNA geneesmiddel is Fomivirsen dat het cytomegalovirus (een mRNA virus) dood. De volledige dosis wordt in het oog gespoten, maar slechts een klein deel dringt de cellen binnen. RNA is zeer hydrofiel en wordt dus snel uitgescheiden. Een mogelijke oplossing voor het feit dat de medicatie slechts gedeeltelijk in de cellen dringt is elektroporatie. Lezing 3: The evolution of microbiology in cystic fibrosis – Dr. J. LiPuma Mucoviscidose of cystische fibrose is een genetische recessieve aandoening, het is bovendien de meest voorkomende genetische stoornis. Het komt door een mutatie in het CFTRgen, die verantwoordelijk is voor een ionkanaal. 70% van de patiënten heeft ook een frame deletie in het delta F508 gen. Mucoviscidose vormt niet enkel een probleem in het ademhalingsstelsel maar ook in meerdere lichaamssystemen. Vooral de symptomen aan de
56
luchtwegen leiden tot de dood. Door het abnormale ionkanaal wordt een taai slijm gesecreteerd in de luchtwegen, dit zorgt voor obstructie, infectie en inflammatie. Deze inflammatie zorgt dan weer voor secretie van het taaie slijm. Het is dus een vicieuze cirkel wat leid tot meer obstructi Door deze structurele schade kan pulmonaire insufficiëntie ontstaan met de dood als gevolg. Men vond vooral S. aureus terug bij culturen van overleden mensen. Allerlei antibioticums combineren zorgde voor een betere overleving. Later werd P. aeruginosa bij patiënten met CF teruggevonden, de meeste hadden een Blactam resistentie. Deze P. aeruginosa kan zich verspreiden van patiënt tot patiënt. Later werd ook Burkholderia teruggevonden, er zijn dus veel verschillende species aanwezig in een CF long. Pseudonomas bevinden zich in de orale flora en zijn meer dodelijk want ze organiseren zich met elkaar. Pseudonomas van in de omgeving kunnen niet goed de long infecteren van gezonde individuen, deze kunnen deze makkelijk afdoden. CF patienten hebben een chronische infectie, en zo kan de long geïnfecteerd worden door pseudonomas. Lezing 4: Bioanalysis in pharma R&D in the 21st century - Philip Timmerman Bioanalyse is het opsporen van analyten in biologische monsters. Enerzijds kunnen we een onderscheid maken tussen kleine chemische moleculen en proteïnen. Proteïnen moeten de dag van vandaag opgespoord worden door ligand bindings studies. Kleine moleculen en peptides kunnen opgespoord en gekwantificeerd worden met LC-MS. Naargelang het op de markt brengen van een nieuw chemisch geneesmiddel of een biologisch geneesmiddel zijn de richtlijnen verschillend. Het op de markt brengen van een biologisch geneesmiddel vergt veel meer papierwerk en moeilijkere richtlijnen. Op de markt brengen van een NCE is een bekende regel ‘4 6 15’ dit wil zeggen dat 4 van de 6 contolestalen maar 15 % mogen afwijken. Ieder land heeft echter verschillende richtlijnen waaraan voldaan moet worden. Micro-samples zijn een nieuw fenomeen, er zijn steeds kleinere volumes staal nodig voor een analyse. DBS en Small liquid samples zijn hier voorbeelden van. Bij DBS is een groot probleem het hematocrieteffect en spot homogeniciteit. Liquid binding assay heeft ook een groot nadeel, soms wordt naast de stof ook het actieve en inactieve metaboliet gebonden door antilichamen, in andere gevallen enkel de actieve stof. Er is nog onvoldoende specificiteit en daar moet nog enorm aan gesleuteld worden. Antibody drug conjugate is ook een nieuw fenomeen hierbij wordt het geneesmiddel gekoppeld aan het antilichamen en kunnen specifieke cellen getarget worden.
57
