IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN KATEKIN TEH HIJAU DAN TEH HITAM SERTA PENETAPAN KADAR EGGC DENGAN METODE LC-MS/MS
KARYA TULIS ILMIAH
OLEH PRISCILLIA DWI FEBRIANA SARI 12.034
AKADEMI ANALIS FARMASI DAN MAKANAN PUTRA INDONESIA MALANG JULI 2015
IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN KATEKIN TEH HIJAU DAN TEH HITAM SERTA PENETAPAN KADAR EGGC DENGAN METODE LC-MS/MS
KARYA TULIS ILMIAH
Diajukan kepada Akademi Analis Farmasi dan Makanan Putra Indonesia Malang untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam menyelesaikan program D-3 bidang Farmasi
OLEH PRISCILLIA DWI FEBRIANA SARI NIM 12.034
AKADEMI ANALIS FARMASI DAN MAKANAN PUTRA INDONESIA MALANG JULI 2015
LEMBAR PERSEMBAHAN
Terimakasih kepada ALLAH SWT yang telah memberikan karunianya sehingga KTI ini dapat diselesaikan dengan lancar. Karya Tulis Ilmiah ini saya persembahkan untuk : 1. Mama yang selalu mendoakan saya 2. Bude yang telah memberikan materi selama perkuliahan ini 3. Mbak che yang sudah memberikan materi dan dukungan 4. Robby Krisnu yang banyak membantu dan sesuatu pokoknya 5. Teman-teman AKAFARMA yang juga sudah membantu Terimakasih buat semuanya, kalian sangat saya cintai.... I love u all...
i
ABSTRAK
Dwi, Priscillia.2015. Identifikasi Senyawa Golongan Katekin pada Teh Hijau dan Teh Hitam serta Penetapan Kadar EGCG Menggunakan LC-MS/MS. Karya tulis Ilmiah. Akademi Analis Farmasi dan Makanan Putra Indonesia Malang. Pembimbing : Erna Susanti, MBiomed, Apt.
Kata Kunci : katekin, teh, EGCG, LC-MS/MS
Salah satu sumber katekin adalah teh. Teh memiliki banyak manfaat bagi kesehatan sehingga perlu eksplorasi lebih dalam tentang jenis teh mana yang paling efektif untuk digunakan. Pada penelitian ini, dilakukan analisis senyawa golongan katekin dan penetapan kadar EGCG pada teh hijau dan teh hitam menggunakan LC-MS/MS. Ditetapkan kadar EGCG karena EGCG merupakan komponen terbesar pada katekin teh. Metode LC-MS/MS dinilai efektif karena dapat mengetahui senyawa golongan katekin dan menetapkan kadar EGCG pada teh hijau dan teh hitam. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa pada teh hijau dan teh hitam teridentifikasi mengandung katekin, epikatekin, galokatekin, epigalokatekin, epikatekingalat, katekin galat, epigalokatekin galat, galokatekin galat. Kadar EGCG pada teh hijau sebesar 0,235 ppm sedangkan kadar teh hitam < LOQ. Penelitian ini perlu pengembangan lain mengingat masih banyak jenis teh lain yang juga memiliki manfaat bagi kesehatan.
i
ABSTRACT
One source of catechin is tea. Tea has many health benefits, so it needs to be explored in depth about the kind of the is most effective to use. In this study, an analysis of classes of compounds catechins and assay EGCG on green tea and black tea using LC-MS/MS. Defined levels of EGCG because EGCG is the largest component in tea catechins. Methods LC-MS/MS is considered effective because it can determine the compounds class catechin and assign level of EGCG on green tea and black tea. The result obtained showed that the green tea and black tea contains catechin, epicatechin, gallocatechin, epigallocatechin, catechin gallate, epicatechin gallate, gallocatechin gallate and epigallocatechin gallate. Levels of EGCG in green tea at 0.235 ppm, black tea while < LOQ. This research needs another development, since there are many other types of tea also has benefits for health.
Keywords : catechin, tea, EGCG, LC-MS/MS
ii
KATA PENGANTAR
Segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat hidayah serta inayah-Nya, sehingga penulis mampu menyelesaikan Karya Tulis Ilmiah yang berjudul “Identifikasi Senyawa Golongan Katekin pada Teh Hijau dan Teh Hitam serta Penetapan Kadar EGCG Menggunakan LC-MS/MS” ini tepat pada waktunya. Tujuan penulisan Karya Tulis Ilmiah ini sebagai persyaratan untuk menyelesaikan program D-3 di Akademi Analis Farmasi dan Makanan Putra Indonesia Malang. Dengan selesainya laporan ini penulis mengucapkan banyak terimakasih kepada : 1. Dra. Wigang Solandjari selaku direktur Akademi Analis Farmasi dan Makanan Putra Indonesia Malang. 2. Ibu Erna Susanti, MBiomed, Apt selaku dosen pembimbing. 3. Bapak dan Ibu Dosen Akademi Analis Farmasi dan Makanan Putra Indonesia Malang. 4. Orang tua yang selalu mendukung secara materi dan spiritual. 5. Robby Krisnu Wardana yang selalu memberi dukungan 6. Rekan-rekan mahasiswa dan semua pihak yang langsung atau tak langsung telah memberikan bimbingan, bantuan serta arahan kepada penulis. Penulis menyadari bahwa laporan ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan. Semoga Karya Tulis Ilmiah ini bermanfaat dan dapat memberikan tambahan informasi bagi para pembaca.
Malang, Juli 2015
Penulis
iii
DAFTAR ISI
ABSTRAK..................................................................................................................................... i ABSTRACT................................................................................................................................. ii KATA PENGANTAR ............................................................................................................ iii DAFTAR ISI .............................................................................................................................. iv DAFTAR GAMBAR .............................................................................................................. vii DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................................ viii BAB I PENDAHULUAN ........................................................................................................ 1 1.1 Latar Belakang .................................................................................................................. 1 1.2 Rumusan Masalah ............................................................................................................ 3 1.3 Tujuan Penelitian ............................................................................................................. 3 1.4 Manfaat Penelitian ........................................................................................................... 3 1.5 Ruang Lingkup dan Keterbatasan Masalah .............................................................. 4 1.6 Asumsi Penelitian ............................................................................................................ 4 1.7 Definisi Istilah................................................................................................................... 5 BAB II TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................................... 6 2.1 Kajian Teh......................................................................................................................... 6 2.2 Kajian Katekin ................................................................................................................ 15 2.3 Katekin pada Teh ........................................................................................................... 17 2.4 Liquid Chromatograph-tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) ................. 17 2.4 Kerangka Operasional................................................................................................... 20
iv
2.5 Kerangka Teori ............................................................................................................. 20 BAB III METODE PENELITIAN ................................................................................... 22 3.1 Rancangan Penelitian.................................................................................................. 22 3.2 Populasi dan Sampel ................................................................................................... 22 3.3 Lokasi dan Waktu Penelitian .................................................................................... 22 3.4 Definisi Operasional Variabel .................................................................................. 22 3.5 Instrumen Penelitian ................................................................................................... 23 3.6 Pengumpulan Data ..................................................................................................... 24 3.7 Analisis Data ................................................................................................................ 25 BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN ........................................... 26 4.1 Hasil Pengamatan ......................................................................................................... 26 4.2 Pembahasan .................................................................................................................. 29 BAB V PENUTUP................................................................................................................... 35 5.1Kesimpulan ..................................................................................................................... 35 5.2Saran ................................................................................................................................. 35 DAFTAR RUJUKAN ............................................................................................................ 36 LAMPIRAN ............................................................................................................................. 38
v
DAFTAR TABEL
Tabel 2.1 Sifat fisika dan kimia senyawa katekin ............................................. 16 Tabel 3.1 Definisi Operasional Variabel ........................................................... 23 Tabel 4.1 Organoleptis Ekstrak Teh Hijau Dan Teh Hitam .............................. 25 Tabel 4.2 Hasil Rekapitulasi Stabdard EGCG .................................................. 28 Tabel 4.3 Hasil Rekapitulasi Sampel EGCG..................................................... 29
vi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Daun Teh ....................................................................................... 7 Gambar 2.2 Struktur Katekin ............................................................................ 15 Gambar 2.3 Struktur EGCG .............................................................................. 17 Gambar 4.1 Hasil Analisa Teh Hijau ................................................................ 26 Gambar 4.2 Hasil Analisa Teh Hitam ............................................................... 27 Gambar 4.3 Kurva Kalibrasi Standard EGCG .................................................. 29
vii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Determinasi Tanaman Teh ............................................................ 39 Lampiran 2 Data Hasil Replikasi Sampel Teh ........................................................... 40 Lampiran 3 Hasil Fragmentasi Standard Egcg ......................................................... 44 Lampiran 4 Dokumentasi ................................................................................................. 56
viii
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Katekin merupakan segolongan metabolit sekunder yang secara alami dihasilkan oleh tumbuhan dan termasuk golongan flavonoid. Telah banyak dilakukan penelitian yang meneliti manfaat katekin. Beberapa contoh penelitian katekin yaitu penelitian yang berjudul isolasi katekin daun gambir sebagai functional food pada mie oleh Anidya Ariani dkk yang menyatakan bahwa katekin pada gambir sebagai antioksidan dapat dimanfaatkan sebagai pangan fungsional. Penelitian selanjutnya yaitu penelitian yang berjudul Efek Pemberian Katekin Teh Hijau Pada Pertumbuhan Tumor Kelenjar Susu Mencit Strain Gr oleh Gunawijaya dkk yang menyimpulkan bahwa Katekin teh 400 mg/kg BB/ hari mempunyai efek penghambatan terbentuknya tumor sebesar 34,29%. Penelitian lain tentang aktivitas katekin dari teh hijau juga ditulis oleh Velayutam P.Babu. Salah satu sumber potensial katekin adalah teh. Aktivitas katekin pada teh banyak memberikan manfaat antara lain sebagai pencegahan beberapa penyakit sehingga perlu eksplorasi lebih dalam tentang bagaimana mengekstraksi katekin dari teh dan menetapkan kadar katekin sehingga bisa dimanfaatkan secara luas tidak hanya terbatas sebagai minuman. Setelah diketahui kadar katekin teh berikut proses ekstraksi maka dapat digunakan sebagai acuan dalam memformulasi teh dalam bentuk sediaan farmasi yang bisa diterima oleh konsumen secara luas. Secara umum, varietas teh di Indonesia ada tiga yaitu teh hitam, teh hijau dan teh oolong. Teh hitam adalah teh yang diolah melalui tahap oksidasi, teh hijau
1
2
adalah teh yang diolah tanpa oksidasi dan teh oolong adalah teh yang diolah dengan tahap semioksidasi. Kadar katekin dalam teh dipengaruhi oleh berbagai faktor antara lain varietas teh, usia tanam, kondisi tanah, cuaca serta proses pengolahan teh. Katekin sebagai metabolit sekunder terbentuk pada kondisi ekstrim. Kondisi tanah yang cocok untuk tanaman teh adalah tanah pegunungan dengan tinggi 1800 meter diatas permukaan laut. Proses pengolahan ataupun pengemasan produk teh juga mempengaruhi kadar katekin dalam teh. Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Putra Indonesia Malang dan Laboratorium Kimia Politeknik Negeri Malang. Sampel teh yang diambil antara lain teh hijau dan teh hitam. Alasan memilih teh hijau dan teh hitam karena kedua teh ini sering digunakan masyarakat dan memiliki perbedaan proses pengolahan teh yang signifikan. Setelah pengambilan sampel dilanjutkan dengan preparasi sampel kemudian dilakukan penetapan kadar katekin pada sampel teh hijau dan teh hitam. Senyawa golongan katekin antara lain adalah katekin, epikatekin, katekin galat, epikatekin galat, galokatekin, epigalokatekin, galokatekin galat, dan epigalokatekin galat. Senyawa turunan katekin terbesar yang terkandung dalam teh adalah epigalokatekin galat (EGCG), yaitu 60-70% dari total katekin Metode yang digunakan pada penetapan kadar katekin teh adalah LCMS/MS. Alasan menggunakan LC-MS/MS karena metode ini dapat mengukur kadar analit yang sangat polar dan dapat diketahui senyawa golongan katekin. Selain dapat mengetahui senyawa golongan katekin, LC-MS/MS juga dapat untuk menetapkan kadar EGCG.
3
1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan pendahuluan di atas, maka rumusan masalah dalam penelitian ini : 1. Senyawa apa sajakah yang terdapat pada teh hijau dan teh hitam berdasarkan hasil identifikasi menggunakan LC-MS/MS? 2. Berapakah kadar EGCG pada teh hijau dan teh hitam menggunakan LCMS/MS? 3. Apakah ada perbedaan yang signifikan kadar EGCG pada teh hijau dan teh hitam? 1.3 Tujuan Penelitian 1.3.1 Tujuan Umum 1. Untuk mengidentifikasi senyawa golongan katekin dan menetapkan kadar EGCG dalam teh sehingga dapat digunakan sebagai alternatif obat untuk mencegah berbagai macam penyakit. 1.3.2 Tujuan Khusus 1. Untuk mengetahui kadar EGCG pada teh hijau dan teh hitam dengan metode LC-MS/MS. 2. Untuk membuktikan ada atau tidaknya perbedaan yang signifikan kadar EGCG pada teh hijau dan teh hitam. 1.4 Manfaat Penelitian Adapun manfaat dari penelitian ini adalah dapat mengetahui senyawa golongan katekin dan kadar EGCG pada teh hijau dan teh hitam. 1.4.1 Manfaat bagi Peneliti
4
Sebagai penerapan teori pembelajaran yang telah didapatkan selama perkuliahan serta dapat menambah pengetahuan bagi peneliti. 1.4.2 Manfaat bagi Instansi Untuk menambah informasi serta digunakan sebagai bahan acuan tambahan referensi pada penelitian selanjutnya. 1.4.3 Manfaat bagi Masyarakat Agar masyarakat lebih mempunyai wawasan dalam pengembangan dan pemanfaatan katekin pada teh untuk kedepannya. 1.5 Ruang Lingkup dan Keterbatasan Masalah Ruang lingkup dalam penelitian ini adalah pengambilan sampel teh hijau dan teh hitam dari kebun teh Wonosari, Malang lalu preparasi sampel. Kemudian dilanjutkan dengan penetapan kadar menggunakan metode LC-MS/MS. Kadar katekin yang ditentukan berdasarkan kadar EGCG karena merupakan komponen terbesar dari katekin. Keterbatasan masalah dalam penelitian ini adalah sampel yang digunakan adalah produk jadi sehingga tidak diketahui usia tanaman teh yang dipetik. 1.6 Asumsi Penelitian 1. Katekin adalah segolongan metabolit sekunder yang secara alami dihasilkan oleh tumbuhan dan termasuk golongan flavonoid. 2. Penetapan kadar katekin pada teh dapat dilakukan dengan metode LC-MS/MS
5
1.7 Definisi Istilah 1. Katekin adalah golongan flavonoid dan memiliki komponen terbesar yaitu EGCG. 2. Liquid Chromatograph-tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) adalah teknik kromatografi cair dengan detektor spektrometer massa.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Kajian Teh 2.1.1 Sejarah Teh Negeri Cina menjadi tempat lahirnya teh (Camellia Sinensis). Tepatnya di provinsi Yunnan, bagian barat daya Cina. Iklim wilayah itu tropis dan subtropis, dimana daerah tersebut memang secara keseluruhan adalah hutan zaman purba. Daerah demikian, yang hangat dan lembab menjadi tempat yang sangat cocok bagi tanaman teh, bahkan ada teh liar yang berumur 2,700 tahun dan selebihnya tanaman teh yang ditanam yang mencapai usia 800 tahun ditemukan ditempat ini. Teh Cina pada awalnya memang digunakan untuk bahan obatobatan (Abad ke-8 SM) dan sudah berumur ribuan tahun riwayatnya. Orangorang Cina pada waktu itu mengunyah teh (770 SM – 476 SM) mereka menikmati rasa yang menyenangkan dari sari daun teh. Teh juga sering kali dipadukan dengan ragam jenis makanan dan racikan sop. Pada mulanya tanaman teh (Camellia Sinensis) diduga berasal dari daratan Asia Selatan dan Tenggara, namun sekarang telah dibudidayakan di seluruh dunia, baik daerah tropis maupun subtropis. Tumbuhan ini meruakan perdu atau pohon kecil yang biasanya dipangkas bila dibudidayakan untuk dipanen daunnya (Fandy, 2009). Tanaman teh pertama kali masuk ke Indonesia pada tahun 1686, berupa biji teh dari Jepang yang dibawa oleh seorang ahli botanical sekaligus dokter dari Belanda bernama Andreas Cleyer di perkebunan Batavia (Anonim, 2010).
6
7
Perkebunan teh di Indonesia banyak dibuka pada masa pemerintahan Hindia Belanda, zaman Gubernur Jenderal Van De Bosch (1830-1870), sebagai bagian dari politik tanam paksa. Pada mulanya, bibit teh yang ditanam berasal dari Cina, namun setelah datang bibit teh Assam dari India pada tahun 1872 maka banyak perkebunan teh memakai bibit teh Assam karena lebih cocok dengan iklim Indonesia (Anonim, 2010). Indonesia memiliki banyak perkebunan teh di Jawa dan Sumatra. Daftar nama perkebunan teh yang cukup terkenal di Indonesia antara lain perkebunan teh Gunung Mas Puncak Bogor, Cianten Bogor, Malabar Bandung, Pagilaran Batang, Jolotigo Pekalongan, Pangalengan Bandung, Argo Wilis Jatim, tanjung Sari Wonosobo, PTPN XII, Kayoe Aro Kerinci Jambi, Kali Gua Purbalingga dan perkebunan teh Wonosari Malang (Anonim, 2010). 2.1.2 Tanaman Teh
Gambar 2.1 Daun Teh Teh (Camellia Sinensis) banyak tumbuh di daerah pegunungan ang beriklim sejuk, pada ketinggian lebih dari 1800 meter diatas permukaan laut. Tanaman ini berakar tunggang dengan banyak cabang, setinggi 4-8 meter. Tanaman teh memiliki daun sepanjang tahun. Daun teh yang berwarna hijau
8
terlihat mendominasi perkebunannya yang identik dengan hamparan hijau di kaki pegunungan (Sari, 2008). Bunga teh berwarna putih dengan serbuk sari berwarna kuning, dengan masa untuk berbunga antara Maret sampai mei. Bunga teh meruakan bunga hermaprodit (memiliki organ jantan dan betina) dan mengalami penyerbukan yang dibantu oleh lebah karena walauun bersifat hermaprodit tetapi tidak dapat terjadi penyerbukan sendiri (Sari, 2008). Tanaman teh akan diambil daunnya untuk diproses lebih lanjut baik untuk skala industri rumah tangga atau juga skala industri besar menjadi bermacam minuman teh di pasaran (Sari, 2008). Saat ini, telah banyak beredar berbagai macam olahan produk teh dengan berbagai varian. 2.1.3 Taksonomi dan morfologi Teh Kingdom
: Plantae
Division
: Spermatophyta
Sub divisio : Angiospermae Kelas : Dichotyledoneae Ordo
: Trantroemiaccae
Family
: Theaceae
Genus
: Camellia
Spesies
: Camellia sinensis (L)
Tanaman teh berbentuk pohon.tingginya bisa mencapai belasan meter. namun tanaman teh di perkebunan selalu dipangkas untuk memudahkan pemetikan, sehingga tingginya mencapai 90-10 cm, mahkota tanaman teh berbentuk kerucut, daunnya berbentuk jorong atau agak bulat telur berbalik, tepi
9
daun bergerigi. daun tunggal dan letaknya hampir berseling. tulang daun menyirip. permukaan atas daun muda, berbulu halus, sedangkan permukaan bawah bulunya hanya sedikit permukaan daun tua halus dan tidak berbulu lagi (Rufaida, 2008) Pucuk teh memiliki bunga tunggal dan ada yang tesusun dalam rangkaian kecil. bunga muncul dari ketiak daun. warnanya putih bersih dan berbau wangilembut namun ada bunga yang semu merah jambu. Mahkota bunga berjumlah 5-6 helai.putik dengan tangkai yang panjangatau pendek pada kepalanyaterdapaty 3 buah sirip. jumlah benang sari 100-200. buah teh berupa buah kotak berwarna hijau kecoklatan. dalam buah berisi 1-6 biji, rata-rata 3 biji. buah yang masak dan kering akan pecah dengan sendirinya dan bijinya akan keluar. bijinya berbentuk bulat atau gepeng pada satu sisinya, berwarna putih sewaktu masih mudadan berubah coklat setelah tua.akar teh berupa akar tunggang dan mempunyai banyak akar cabang. apabila akar tunggangnya putus, akar-akar cabang akan menggantikan fungsinya dengan arah tumbuh yang semula melintang(horizontal) menjadi kebawah (Rufaida, 2008). Akar bisa tumbuh besar dan cukup dalam, tanaman teh mengalahi pertumbuhan tunas yang silih berganti. tuna stumbuh pada ketiak/ bekas ketiak daun. tunas yang tumbuh kemudian diikuti dengan pertumbuhan daun. tunas baru pada teh memiliki daun kuncup yang menutupi titik tumbuh serba daunnya. 2.1.4 Jenis dan Pengolahannya Secara garis besar teh dibagi dalam tiga kelas yaitu, teh hijau (green tea), teh hitam (black tea) dan teh oolong (Sari, 2008). Ketiga jenis teh di atas dapat dibuat dari daun teh yang sama tergantung pada bagaimana daun teh diproses.
10
Terjadi perbedaan yang sangat besar dari proses oksidasi enzimatik dari komponen tanin di dalam daun teh. Jika enzim tersebut dibiarkan bereaksi, enzim tersebut merubah hijau daun menjadi hitam, hal tesebut juga terjadi pada buah apel segar yang dipotong atau dikupas dapat mengakibatkan penurunan kesegarannya. Jika enzim di dalam daun teh tersebut dinonaktifkan oleh panas, misalnya pada proses pemutihan, sisa dari daun teh hijau. Jika oksidasi parsial yang terjadi dengan pemanasan yang tertunda, akan menghasilkan sebuah intermediat teh yaitu teh Oolong. Oksidasi enzimatis dari daun teh disebut fermentasi. Fermentasi daun teh ini menghasilkan teh hitam, daun teh yang difermentasi sebagian menghasilkan teh Oolong. Pada penelitian ini, ditetapkan kadar katekin pada teh hijau dan teh hitam. 2.1.4.1 Teh Hijau Teh hijau diolah tanpa mengalami oksidasi, tidak memberi kesempatan terjadinya fermentasi. Setelah layu daun teh langsung digulung, dikeringkan, dan siap untuk dikemas. Biasanya pucuk teh diproses langsung dengan uap panas (steam) atau digoreng (pan frying) untuk menghentikan aktivitas enzim. Warna hijau tetap bertahan dan kandungan taninnya relatif tinggi. Teh hijau dipercaya menurunkan bobot tubuh. Hal ini disebabkan kandungan polifenolnya tinggi. Teh hijau pas dinikmati saat banyak aktivitas karena dipercaya meningkatkan konsentrasi, jadi tidak cocok diminum sebelum berangkat tidur. Sebelum menjadi teh hijau yang kering, teh hijau ini juga mengalami beberapa proses yaitu:
11
1. Proses Pemetikan Proses ini dilakukan dengan tangan agar lebih selektif. Kalau dengan alat pemotong misalnya ani-ani yang digunakan untuk memanen padi, batang keras pun kemungkinan besar akan ikut terpotong. 2. Proses Pelayuan Proses selanjutnya adalah pelayuan. Proses ini bertujuan untuk inaktivasikan enzim polifenol oksidase dan mengurangi kadar air hingga 60-70 %. Proses ini dilakukan dengan system rotary panner dengan panas (80-100)0C selama 2 sampai 4 menit. 3. Proses Penggulungan Proses peggulungan ini dilakukan dengan sistem open top roller selama 15 sampai17 menit. Tujuannya adalah untuk memecah sel daun sehingga menghasilkan rasa sepet. Tapi proses penggulungannya tidak sampai hancur seperti pada proses teh hitam (pada bagian penggilingan). 4. Proses Pengeringan Proses selanjutnya adalah pengeringan yang dilakukan dalam dua tahap. Tahap pertama dilakukan pada suhu (110-135)0 C selama 30 menit. Tahap berikutnya pemanasan (70-90)0 C dalam waktu 60-90 menit, selanjutnya proses sortasi dan pengemasan. 2.1.4.2 Teh Hitam Teh hitam didapat dari hasil penggilingan yang menyebabkan daun terluka dan mengeluarkan getah. Getah itu bersentuhan dengan udara sehingga menghasilkan senyawa tea flavin dan tearubigin. Artinya, daun teh mengalami perubahan kimiawi sempurna sehingga hampir semua kandungan katekin
12
terfermentasi menjadi teaflavin dan tearubugin. Warna hijau bakal berubah menjadi kecoklatan dan selama proses pengeringan menjadi hitam. Teh hitam paling dikenal luas dan banyak dikonsumsi. Teaflavin menurunkan warna merah kekuning-kuningan dalam setiap seduhan, tearubigin memberi kombinasi warna coklat kemerahan dan kuning. Soal rasa seperti katekin, teaflavin memberi kesegaran (Sujayanto, 2008). Sebelum menjadi teh hitam yang kering daun-daun teh tersebut telah melewati berbagai proses yaitu : 1. Proses Pemetikan Proses ini dilakukan dengan tangan agar lebih selektif. Kalau dengan alat pemotong misalnya ani-ani yang digunakan untuk memanen padi, batang keras pun kemungkinan besar akan ikut terpotong. 2. Proses Pelayuan Proses selanjutnya adalah pelayuan. Proses ini bertujuan untuk mengurangi kadar air sehingga kandungan enzim dalam pucuk teh lebih kental. Proses ini dilakukan pada tempat pelayuan (withering trough) berupa kotak persegi panjang beralaskan kawat kasa. Di bawah kawat kasa ini terdapat blower penghembus udara kearah kasa. Pucuk daun teh dibeberkan di atas withering trough dengan ketebalan 30 cm, bagian permukaannya harus rata agar pelayuan merata. Hembusan udara tadi dapat menerbangkan air dalam daun teh. Proses pelayuan berlangsung 7 sampai 24 jam. Untuk mencapai kadar air yang diinginkan maka dilakukan proes pembalikan. Langkah ini juga supaya pucuk teh tidak terbang tertiup blower. Kemudian hamparan pucuk teh dibongkar untuk dimasukkan ke dalam conveyor (semacam corong yang dihubungkan dengan
13
alat penggiling). Lalu teh dimasukkan ke dalam tong plastik lantas diletakkan ke ban berjalan untuk masuk ke ruang giling. 3. Proses Penggilingan Setelah itu daun masuk ke mesin penggilingan. Yaitu Green Leaf Shifter, pada proses ini pucuk teh masuk ke mesin getar. Dengan demikian pucuk teh terpisahkan dari ulat, kerikil, pasir dan serpihan lain melalui perbedaan berat jenisnya. Pucuk teh tersebut masuk ke conveyor untuk mengalami proses penggilingan awal dengan mesin BLC (Barbora Leaf Conditioner), dimana pucuk teh dipotong menjadi serpihan kecil-kecil sebagai prakondisi untuk proses penggilingan selanjutnya menggunakan mesin Crush Tear & Curl (CTC) dan agar fermentasi dapat berlangsung dengan lancar. Output yang dihasilkan adalah berupa bubuk teh basah berwarna hijau. 4. Proses Fermentasi Proses ini lebih tepat disebut oksidasi enzimatik. Mesin bekerja membeber bubuk daun teh basah hingga terpapar oksigen sehingga terjadi perubahan warna. Pada ujung fermentasi teh akan berwarna kecoklatan. Selain perubahan warna juga terjadi perubahan aroma, dari bau daun menjadi harum teh. Proses ini berlangsung selama 1 sampai 5 jam dengan suhu optimal (26-27)oC . 5. Proses Pengeringan Tujuan dari proses ini adalah untuk menghentikan reaksi oksidasi enzimatik pada daun teh. Selain itu juga untuk membunuh mikroorganisme yang beresiko terhadap kesehatan. Pengeringan ini juga dapat membuat teh tahan lama disimpan karena kadar air yang rendah dapat menghambat pertumbuhan mikroba. Pengeringan dilakukan dengan menggunakan oven besar Fluid Bed
14
Dryer (FBD), dengan suhu masuk (100-120)0 C dan suhu keluarnya (80-105)0C selama 15 sampai 20 menit. Sehingga kadar airnya hanya 2,5 sampai 3 % saja di dalam teh, selanjutnya proses sortasi dan pengemasan. 2.1.4.3 Teh Oolong Teh oolong merupakan teh yang diproses melalui pemanasan daun dalam waktu singkat setelah penggulungan. Oksidasi terhenti dalam proses pemanasan, sehingga teh oolong disebut juga dengan teh semifermentasi. Karakteristik teh oolong berada diantara teh hitam dan teh hijau (Christianty, 2008) 2.1.5 Kandungan Kimia Teh Komponen aktif yang terkandung dalam teh terdiri dari polifenol (termasuk katekin), kafein, asam amino, vitamin, flavonoid, polisakarida dan flori (Heroniaty, 2012). 2.1.6 Varietas teh di kebun teh Wonosari Tanaman teh memang sudah mulai bisa tumbuh baik pada ketinggian sekitar 500 m. dpl. Kebun-kebun teh di Jawa, yang terletak di lereng gunung, umumnya berawal pada ketinggian sekitar 500 m. dpl. Bahkan banyak yang sudah dimulai pada ketinggian 400 m. dpl. Namun pucuk daun teh kualitas terbaik, baru akan diperoleh dari tanaman yang tumbuh pada ketinggian di atas 1.000 m. dpl. dan dengan naungan cukup. Kebun teh Wonosari di Lawang, Jatim, (PTPN XII), dan kebun Pagilaran di Batang, Jateng (UGM, Yogya), serta kebun teh Ciater di Subang, Jabar, (PTPN VIII), berelevasi mulai dari ketinggian sekitar 500 m. dpl, sampai dengan 1.700 m. dpl. Hingga kualitas pucuk yang dihasilkan juga beragam.
15
Varietas assamica berbatang tunggal (jika tidak dipangkas) dengan ketinggian pohon antara 6-8m. Varietas ini dapat dibedakan lima subvarietas, yaitu teh assam berdaun cerah, teh assam berdaun kelam, manipuri, burma, dan lushia. ciri ciri varietas secara umum adalah daun panjang (15-20cm), lebar, berbentuk lonjong(oval), berkilat, berbobot, bergerigi banyak dengan ujung yang jelas, berwarna hijautua, duduk daun pada cabang dan ranting nagak tegak, kuantitas dan kualitas hasil teh tinggi.
2.2 Kajian Katekin Katekin adalah segolongan
metabolit sekunder yang secara alami
dihasilkan oleh tumbuhan dan termasuk dalam golongan flavonoid. Senyawa ini memiliki aktivitas antioksidan karena gugus fenol yang dimilikinya. Strukturnya memiliki dua gugus fenol (cincin-A dan -B) dan satu gugus dihidropiran (cincinC). Karena memiliki lebih dari satu gugus fenol, senyawa katekin sering disebut senyawa polifenol.
Gambar 2.1 Struktur katekin Katekin bersifat asam lemah dan sangat tidak stabil di udara terbuka. Bersifat mudah teroksidasi pada pH mendekati mendekati netral. Katekin juga mudah terurai oleh cahaya dengan laju reaksi lebih besar pada pH rendah yaitu 3,45 dibanding pH 4,9 (Lucida dalam Heroniaty, 2012:12)
16
Katekin biasanya disebut juga asam catechoat dengan rumus kimia C15H14O6, tidak berwarna dan dalam keadaan murni sedikit tidak larut dalam air dingin tetapi sangat larut dalam air panas, larut dalam alkohol dan etil asetat, hampir tidak larut dalam kloroform, benzen dan eter. Selain itu, katekin berbentuk kristal halus menyerupai jarum, larut dalam air mendidih dan alkohol dingin. Katekin dalam larutan asam asetat akan membentuk larutan yang bening, tetapi jika direaksikan dengan besi klorida (FeCl3) akan membentuk cairan berwarna hijau. Katekin merupakan senyawa fenolik yang komplek sehinnga sering disebut polifenol (Heroniaty, 2012). Katekin memiliki dua atom karbon simetris yang membuatnya memiliki 4 isomer, yaitu (+) katekin, (-) katekin, (+) epikatekin dan (-) epikatekin. (-) katekin dan (-) epikatekin paling banyak terdapat di alam. Katekin dan epikatekin memiliki turunan, yaitu katekin galat, galokatekin, galokatekin galat, epikatekin galat dan epigalokatekin galat (Heroniaty, 2012). Tabel 2.1 Sifat Fisika dan Sifat Kimia Senyawa Katekin Sifat Fisika
Sifat Kimia
Warna : putih
Sensitif terhadap oksigen
Melting point : 104-106o C
Sensitif terhadap cahaya
Boiling Point : 254o C
Substansi yang dihindari : unsur
Tekanan uap : 1 mm Hg pada 75o
oksidasi,
C
anhidrida, basa dan asam nitrit.
asam
klorida,
asam
Densitas uap : 3,8 g/m3
Larut dalam air hangat
Flash point : 137o C
Stabil dalam kondisi agak asam
Eksplosion limit : 1,79 %
atau netral (pH optimum 4-8)
Sumber : Anonim, 2001 dan Alamsyah, 2006
17
2.3 Katekin pada Teh Kandungan katekin berkisar 20-30% dari seluruh berat kering daun. Diantara turunan katekin, epigalotekingalat merupakan bahan terbanyak.
Gambar 2.2 Struktur Epigallocatechin gallate Selama proses pelayuan kandungan katekin akan berkurang 3%. Kemudian pada waktu penggulungan daun susut lagi, dan pada oksidasi enzimatis kadar katekin susut sekitar 20% - 23%, dan waktu pengeringan kadarnya susut lagi sebanyak 5%.
2.4 Liquid Chromatograph-tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Liquid Chromatograph-tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) merupakan satu-satunya teknik kromatografi cair dengan detektor spektrometer massa. Penggunaan LC-MS/MS untuk penelitian bio-analisis dimulai pada akhir 1980-an. Kelebihan dari teknologi LC-MS/MS meliputi spesifitas yaitu hasil analisis yang khas dan spesifik diperoleh dari penggunaan spektrometer massa sebagi detektor, aplikasi yang luas dengan sistem yang praktis. Berbeda dengan GC- MS sebagai spektrometer masa “klasik”, penerapan LC-MS/MS tidak tebatas untuk molekul volatil (biasanya dengan berat molekul dibawah 500 Da). Mampu mengukur analit yang sangat polar, selain itu persiapan sampel cukup sederhana tanpa adanya teknik derivatisasi. Kelebihan lain adalah fleksibilitas dan kaya informasi (Karisma,2012)
18
Ion Mass
source
analyzer
Sa sampel
Data detektor analys iss
Sampel yang diinjekkan masuk ke sumber ion kemudian dianalisis menggunakan massa lalu masuk kembali ke detektor massa yang kemudian muncul data berupa fragmen-fragmen dan dibandingkan berdasarkan berat molekul. Spektrometer massa mampu memberikan data spektra massa suatu senyawa. Hasil ini memberikan informasi yang berharga mengenai struktur, berat molekul, identitas, jumlah, dan kemurnian sampel. Data spektra massa menambahkan kekhususan yang mampu meningkatkan kepercayaan akan hasil yang diperoleh, baik secara kualitatif maupun kuantitatif. Hal ini disebabkan seleksi ion yang sangat cepat dengan banyak parameter spektrometer massa bekerja dengan molekul pengion yang kemudian akan memilah dan mengidentifikasi ion menurut massa, sesuai rasio fragmentasi mereka. Dua komponen kunci dalam proses ini adalah sumber ion (ion source) yang akan menghasilkan ion, dan analisis massa (mass analyzer) yang menseleksi ion. Sistem LC-MS/MS umumnya menggunakan beberapa jenis ion source dan mass analyzer yang dapat disesuaikan dengan kepolaran senyawa yang akan
19
dianalisa. Masing-masing ion source dan mass analyzer memiliki kelebihan dan kekurangan sehingga harus disesuaikan dengan jenis informasi yang dibutuhkan. Pengenalan teknik ionisasi tekanan atmosfer (atmospheric pressure ionization / API) sangat memperluas jumlah senyawa yang dapat dianalisis dengan LC-MS/MS. Pada teknik ionisasi tekanan atmosfer, molekul analit terionisasi terlebih dahulu pada tekanan atmosfer. Ion-ion analit tersebut kemudian secara mekanis dan elektrostatis terpisah dari inti molekul. Teknik ionisasi tekanan atmosfer umumnya adalah ionisasi elektrospray (electrospray ionization / ESI), ionisasi kimia tekanan atmosfer (APCI) dan photoionisasi tekanan atmosfer (Karisma,2012) Dalam setiap pengukuran, sifat analit dan kondisi pemisahan memiliki pengaruh kuat untuk memberikan hasil terbaik dalam teknik ionisasi pada memungkinkan analit mampu mengion dengan baik sebelum mencapai spektrometer massa (Karisma,2012). Pada penelitian ini, ion yang digunakan adalah ion positif. Ion positif lebih baik digunakan untuk mengukur senyawa beserta matrik-matriksnya (Spacil, 2010). Data yang muncul pada hasil analisa meliputi grafik dengan puncak dan waktu retensi tertentu beserta data berat molekul. Dari data berat molekul, dapat diketahui senyawa golongan katekin apakah yang terdeteksi. Untuk mengetahui kadar EGCG perlu membandingkan waktu retensi standard dengan sampel. Hasil konsentrasi diperoleh dari perhitungan dari persamaan kurva kalibrasi standard. Selain itu, diperlukan analisis statistik untuk mengetahui LOQ (Limit of Quantity) sampel yang dianalisa.
20
2.4 Kerangka Operasional Sumber potensial
Teh
katekin
Teh hijau
Dipengaruhi oleh
Teh hitam
Ditetapkan kadar
kondisi alam
Berdasarkan EGCG
katekin
Metode LC-MS/MS
Diketahui senyawa
Diketahui kadar EGCG dari
golongan katekin
teh hijau dan teh hitam
2.5 Kerangka Teori Salah satu sumber potensial katekin adalah teh. Secara umum jenis teh yang sering dipakai di Indonesia yaitu teh hijau dan teh hitam. Teh hijau merupakan teh yang diproses tanpa oksidasi, teh hitam merupakan teh yang diproses melalui proses. Teh hijau dan teh hitam selanjutnya akan dianalisis kadar katekinnya. Perbedaan kadar katekin dapat dipengaruhi oleh varietas, kondisi alam dan proses pengolahan. Penetapan kadar katekin pada teh hijau dan teh hitam juga didasarkan pada EGCG karena EGCG merupakan komponen
21
terbesar katekin teh. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah LCMS/MS dimana dari metode ini akan diketahui kadar masing-masing EGCG pada ekstrak teh hijau dan teh hitam dan diketahui senyawa golongan katekinnya.
BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif yang bertujuan untuk mengetahui senyawa golongan katekin dan penetapan kadar EGCG pada teh hijau dan teh hitam dengan menggunakan metode LC-MS/MS.. Penelitian ini meliputi tiga tahap, tahap pertama adalah tahap persiapan dimana seluruh alat, bahan, dan sampel disiapkan secara menyeluruh. Tahap kedua adalah tahap pelaksanaan, penelitian dilakukan menggunakan metode LC-MS/MS. Dan pada tahap akhir dari penelitian ini adalah pengolahan data hasil analisis.
3.2 Populasi dan Sampel Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak teh hijau dan teh hitam yang diambil dari kebun teh Wonosari, Malang. Sampel yang digunakan adalah cuplikan ekstrak teh hijau dan teh hitam 3.3 Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Putra Indonesia Malang dan Laboratorium Teknik Kimia Politeknik Negeri Malang pada Maret 2015.
3.4 Definisi Operasional Variabel Pada penelitian ini terdapat 1 variabel yaitu variabel terikat. Variabel terikat dalam penelitian ini adalah identifikasi senyawa golongan katekin dan penetapan kadar EGCG.
22
23
Tabel 3.1 Definisi Operasional Variabel Variabel
Sub variabel
Definisi
Alat
Hasil ukur
ukur Identifikasi-
- Identifikasi
- Mengidentifi-
- LC-
- Hasil
senyawa
senyawa
kasi senyawa
MS
fragmentasi
golongan
golongan
golongan
/MS
yang
katekin dan
katekin
katekin
penetapan -
- Penetapan
kadar
kadar EGCG
EGCG
-
menunjukkan
berdasarkan
berat molekul
berat molekul.
senyawa
- Menetapkan kadar EGCG.
golongan katekin. - Hasil fragmentasi yang dibandingkan dengan standard EGCG.
3.5 Instrumen Penelitian 3.5.1 Alat :
LC-MS/MS
Syringe
Beaker glass
24
Gelas ukur
Thermometer
Heater
Timbangan analitik
Gelas pengaduk
3.5.2 Bahan :
ekstrak teh hijau dan teh hitam
0,1 % FA in water
0,1 % FA in Acetonitril
Aquadest
3.6 Pengumpulan Data 3.6.1 Prosedur Penelitian 1. Ditimbang sebanyak 10 gram sampel teh. 2. Diekstraksi dengan 100 ml air panas (900C) selama 5 menit dengan pengadukan ringan. 3. Didinginkan dan disaring melalui 0,22 µm dengan syringe 4. Diencerkan dengan fase gerak dengan faktor pengenceran 4. 5. Dimasukkan ke dalam vial. 6. Diinjekkan ekstrak teh hijau dan teh hitam pada LC-MS/MS. 7. Diamati hasil fragmentasi berdasarkan berat molekul. 8. Diidentifikasi, perhitungan kadar dan analisis data.
25
3.7 Analisis Data Analisis data pada penelitian ini menggunakan SPSS dengan metode uji signifikasi t-independent untuk mengetahui apakah ada perbedaan yang signifikan kadar EGCG pada ekstrak teh hijau dan teh hitam.
BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan 4.1.1 Determinasi Adapun hasil determinasi tanaman teh (Camellia Sinensis) dapat dilihat pada lampiran 1. 4.1.2 Organoleptis ekstrak teh hijau dan teh hitam Adapun hasil pengamatan organoleptis ekstrak teh hijau dan teh hitam terdapat pada tabel 4.1 organoleptis ekstrak teh hijau dan teh hitam : Tabel 4.1 Organoleptis Ekstrak Teh Hijau Dan Teh Hitam Pengamata n Bentuk Bau Warna Rasa
Ekstrak Teh
Ekstrak Teh
hijau
hitam
Cairan encer Bau khas teh Coklat kehijauan Hambar
Cairan encer Bau khas teh Coklat kehitaman Hambar
4.1.3 Data hasil LC-MS/MS Adapun grafik hasil fragmentasi pada teh hijau dan teh hitam dapat dilihat pada lampiran 2. 4.1.3.1 Analisa Kualitatif Analisa
kualitatif
menggunakan
LC-MS/MS
dilakukan
untuk
mengetahui senyawa golongan katekin pada teh hijau dan teh hitam. Adapun perbandingan m/z literatur dan m/z hasil analisis LC-MS/MS pada teh hijau dan teh hitam dapat dilihat pada tabel 4.2 :
26
27
Tabel 4.2 Perbandingan m/z literatur dan m/z hasil analisis LC-MS/MS m/z literatur 291 139 307 139 443 139 459 139
m/z hasil Parent ion Product ion 291 139 307 139 443 139 459 139
4.1.3.2 Analisa Kuantitatif Teh Hijau dan Teh Hitam Analisa kuantitatif dilakukan untuk mengetahui kadar EGCG pada sampel ekstrak teh hijau dan teh hitam yang dibandingkan dengan standard EGCG. Hasil fragmentasi standard dapat dilihat pada lampiran 3. Hasil rekapitulasi perhitungan standard EGCG dapat dilihat pada tabel 4.3 : Tabel 4.3 Hasil Rekapitulasi Standard EGCG No Nama Kromatogram Std 1. 2. 3. 4.
2205_STD_1_EGCG_INJ1 2205_STD_1_EGCG_INJ2 2205_STD_2_EGCG_INJ2 2205_STD_2_EGCG_INJ3 2205_STD_3_EGCG_INJ1 2205_STD_3_EGCG_INJ2 2205_STD_4_EGCG_INJ1 2205_STD_4_EGCG_INJ2
Kons. (µg/mL)
0.760 0.760 1.520 1.520 2.280 2.280 3.040 3.040
Area 71,827.50 71,450.23 130,800.47 130,449.85 187,358.91 188,937.34 251,237.83 250,543.07
Kons. terukur (µg/mL) 0.77 0.77 1.52 1.52 2.25 2.27 3.06 3.05
% Akurasi 101.33 100.70 100.20 99.91 98.47 99.35 100.68 100.39
Selanjutnya, hasil rekapitulasi standard EGCG disajikan dalam Kurva kalibrasi yang dapat dilihat pada gambar 4.1 :
28
Gambar 4.1 Grafik hubungan konsentrasi (ppm) dengan area
Adapun hasil rekapitulasi perhitungan sampel EGCG dapat dilihat pada tabel 4.4 : Tabel 4.4 Rekapitulasi Perhitungan Sampel EGCG No. Nama Sampel
Nama Kromatogram
Area
1.
2205_SPL_TEH_HIJAU_ 250_INJ1 2205_SPL_TEH_HIJAU_ 250_INJ2 2205_SPL_TEH_HIJAU_ 250_INJ3 2205_SPL_TEH_HITAM_ 250_INJ1 2205_SPL_TEH_HITAM_ 250_INJ2 2205_SPL_TEH_HITAM_ 250_INJ3
2. 3. 4. 5. 6.
Teh Hijau Teh Hijau Teh Hijau Teh Hitam Teh Hitam Teh Hitam
30210
Kons. Terukur (µg/mL) 0.239
Kadar EGCG (ppm) 0.239
29740
0.233
0.233
29850
0.234
0.234
700
0.137
190
0.144
440
0.141
0.137 (< LOQ) 0.144 (< LOQ) 0.141 (< LOQ)
29
4.2 Pembahasan Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui senyawa golongan katekin yang terdapat dalam sampel serta menetapkan kadar EGCG. Katekin merupakan
salah
satu
contoh
metabolit
sekunder
golongan
flavonoid.
Pembentukan metabolit sekunder dipengaruhi oleh banyak faktor antara lain suhu, pH, aktivitas air dan intensitas cahaya (Vinolina, 2014) Sampling dilakukan di Kebun Teh Wonosari, Malang. Selanjutnya dilakukan determinasi untuk mengetahui apakah benar sampel yang digunakan merupakan teh. Teh yang digunakan adalah teh hijau dan teh hitam. Teh hijau dan teh hitam diekstrak mengguanakan air suhu 900C dengan pengadukan ringan selama 5 menit (Spacil, 2010). Suhu 900C merupakan suhu terbaik dalam ekstraksi teh agar kandungan antioksidan dalam teh tidak rusak (1001 Teh). Karakteristik ekstrak yaitu berbentuk cairan encer, berwarna kecoklatan ( teh hitam) dan berwarna kehijauan (teh hijau) serta bau khas teh. Untuk mengidentifikasi komponen senyawa katekin dan mengetahui kadar EGCG dilakukan analisis dengan LC-MS/MS menggunakan ion positif. Sebelum dilakukan
analisis,
sampel
harus
dipreparasi
terlebih
dahulu
meliputi
pengekstrakan, penyaringan serta pengenceran dengan fase gerak (Spacil, 2010). Selanjutnya dilakukan analisis menggunakan LC-MS/MS dengan fase gerak 0,1% Formic Acid in water dan 0,1% Formic Acid in Acetonitril serta fase diam yang digunakan yaitu Coloumn Hypersil Gold. LC-MS menggunakan fase gerak atau pelarut untuk membawa sampel melalui kolom yang berisi padatan pendukung yang dilapisi cairan sebagai fasa diam. Selanjutnya analit dipartisikan di antara fasa gerak dan fasa diam tersebut,
30
sehingga terjadi pemisahan karena adanya perbedaan koefisien partisi. Sampel yang telah dipisahkan dalam kolom diuapkan pada suhu tinggi, kemudian diionisasi. Ion yang terbentuk difragmentasi sesuai dengan rasio massa/muatan (m/z), yang selanjutnya dideteksi secara elektrik menghasilkan spektra massa. Spektra massa merupakan rangkaian puncak-puncak yang berbeda-beda tingginya (Khopkar, 2008). Untuk LC-MS/MS, dilanjutkan masuk ke detektor MS lagi untuk mengetahui berat molekul senyawa tersebut. Katekin dan senyawa golongannya dapat diidentifikasi berdasarkan berat molekul. Dari hasil akan mucul grafik disertai dengan berat molekul sehingga dapat diketahui senyawa golongan katekin yang muncul. Tetapi, terdapat senyawa golongan katekin yang memiliki berat molekul yang sama, tetapi strukturnya berbeda. Contohnya, katekin dan epikatekin, galokatekin dan epigalokatekin, galokatekin galat dan epigalokatekin galat, katekin galat dan epikatekin galat yang memiliki berat molekul sama tetapi strukturnya berbeda. Berdasarkan hasil pengamatan, hasil keseluruhan fragmentasi yang tampak pada teh hijau terdapat 3 puncak. Setelah diperbesar, hasil fragmentasi lebih dari 3 puncak. Fragmen 1 terdapat 2 puncak, fragmen 2 terdapat 2 puncak, fragmen 3 tidak terdapat puncak karena banyak pengotor yang muncul, fragmen 4 terdapat 1 puncak. Pada teh hitam, hasil keseluruhan fragmentasi yang tampak terdapat 1 puncak. Fragmen 1 terdapat 1 puncak sedangkan fragmen 2,3 dan 4 tidak terdapat puncak karena banyak pengotor yang muncul. Hasil m/z sampel teh hijau dan teh hitam dengan m/z literatur Fragmen 1 terdapat pada ms2 291.000 yaitu katekin dan epikatekin. Fragmen 2, terdapat 2 puncak pada ms2 307.000 yaitu galokatekin, dan epigalokatekin. Pada fragmen 3
31
tidak diketahui puncak yang muncul pada ms2 443.000 yaitu katekin galat dan epikatekingalat. Fragmen 4, pada ms2 459.000 yaitu galokatekin galat dan epigalokatekin galat. Pada teh hitam hasilnya juga identik, fragmen 1 pada ms2 291.000 yaitu
katekin dan epikatekin. Fragmen 2, pada ms2 307.000 yaitu
galokatekin, dan epigalokatekin. Fragmen 3, pada ms2 443.000 yaitu katekin galat dan epikatekingalat. Fragmen 4, pada ms2 459.000 yaitu galokatekin galat dan epigalokatekin galat. Kadar EGCG dapat diketahui dengan menghitung dari persamaan kurva kalibrasi. Hasil yang didapat merupakan konsentrasi terukur sehingga perlu dibandingkan dengan hasil statistik standard apakah kadar katekin kurang dari atau lebih dari Limit of Quantity (LOQ) dan hasil tersebut merupakan hasil konsentrasi terhitung. Perhitungan LOQ diperlukan untuk menentukan batasan konsentrasi terkecil sehingga data tersebut dapat dinyatakan valid. Selain LOQ, validitas metode juga ditentukan oleh LOD, presisi, akurasi dan koefisien korelasi (R). Pada penelitian ini, validitas metode meliputi LOQ, LOD, % akurasi dan koefisien korelasi (R). Nilai R pada penelitian mendekati 1 artinya data yang dihasilkan bisa dikatakan valid. Pada teh hijau, kadar EGCG sebesar 0,235 ppm sedangkan pada teh hitam 0,141 ppm. Penurunan kadar EGCG pada teh hitam kemungkinan juga disertai penurunan kadar senyawa golongan katekin lain dikarenakan puncak yang muncul pada fragmentasi teh hijau lebih banyak dibandingkan fragmentasi teh hitam. Perbedaan kadar EGCG pada teh hijau dan teh hitam dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti proses pengolahan teh dan kondisi terbentuknya metabolit sekunder seperti kondisi alam dan cuaca. Proses pengolahan teh hijau dilakukan
32
tanpa fermentasi sedangkan teh hitam diolah dengan proses fermentasi. Pada proses fermentasi teh hitam, katekin dioksidasi secara enzimatis membentuk pigmen teh hitam yaitu theaflavin dan thearubigin. Theaflavin ini berkontribusi terhadap karakteristik warna kecoklatan dari teh hitam. Untuk mengetahui apakah ada perbedaan yang signifikan kadar EGCG pada teh hijau dan teh hitam, maka dilakukan analisis statistik menggunakan SPSS dengan metode uji signifikansi t-independen. Kadar EGCG pada teh hitam ditentukan berdasarkan nilai yang terdeteksi pada instrument meskipun dibawah LOQ. Sebelum melakukan uji signifikansi t-independen, harus dilakukan uji normalitas. Uji normalitas bertujuan untuk menguji apakah data memiliki distribusi normal. Uji normalitas pada dasarnya melakukan perbandingan antara data yang dimiliki dengan data berdistribusi normal yang memiliki mean dan standar deviasi yang sama. Data yang mempunyai distribusi normal merupakan syarat dilakukannya parametric-test dan berarti mempunyai sebaran yang normal pula, sehingga data tersebut dianggap bisa mewakili populasi. Untuk menguji apakah sampel penelitian berdistribusi normal, maka digunakan pengujian Kolmogorov Smirnov Test terhadap masing-masing variabel dengan α = 5%. Hipotesis pengujian yaitu: H0 : Data menyebar normal H1 : Data tidak menyebar normal Kriteria pengujian menyatakan jika probabilitas hitung > level of significance () maka data dikatakan berdistribusi normal. Berikut ini adalah hasil pengujian asumsi normalitas melalui Kolmogorov-Smirnov Test :
33
Konsentrasi Pada Teh Hijau dan Teh Hitam Kolmogorov- Smirnov Z
0.752
Asymp. Sig. (2-tailed)
0.624
Hasil
pengujian
tersebut
menunjukkan
probabilitas
hitung
pada
konsentrasi pada teh hijau dan teh hitam = 0. 624 > level of significance (=5%). Hal ini berarti data berdistribusi normal. Dengan demikian asumsi normalitas terpenuhi. Sehingga dapat dilakukannya parametric-test dan data tersebut dianggap bisa mewakili populasi. Sebelum melakukan uji signifikansi t independen, maka perlu dilakukan pengujian kehomogenan ragam 2 sampel tersebut. Pengujian digunakan untuk mengetahui apakah 2 sampel tersebut memiliki ragam yang homogen (konstan) atau tidak. Untuk menguji apakah 2 sampel penelitian memiliki ragam yang homogen, maka digunakan pengujian ratio 2 ragam terhadap masing-masing sampel dengan α = 5%. Hipotesis pengujian yaitu: H0 : Kedua sampel memiliki ragam yang homogen H1 : Kedua sampel tidak memiliki ragam yang homogen Kriteria pengujian menyatakan jika probabilitas hitung > level of significance () maka 2 sampel tersebut dikatakan memiliki ragam yang homogen. Berikut ini adalah hasil pengujian ratio 2 ragam :
34
df
Fhitung
P-value
2,2
1.15
0.931
Ragam (konsentrasi teh hijau) Ragam (konsentrasi teh hitam)
Hasil pengujian tersebut menunjukkan probabilitas hitung (p-value) pada rasio konsentrasi teh hijau dengan teh hitam = 0.931 > level of significance (=5%). Hal ini berarti kedua sampel tersebut memiliki ragam yang homogen. Uji Signifikansi t-independen dimaksudkan untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan rata-rata antara kadar katekin pada teh hijau dan teh hitam yang didasarkan pada EGCG. Secara umum, hipotesis dalam penelitian ini adalah H0 : Tidak ada perbedaan siginifikan antara kadar EGCG pada teh hijau dan teh hitam. H1 : Terdapat perbedaan signifikan antara kadar EGCG pada teh hijau dan teh hitam. Hasil pengujian menyatakan bahwa nilai statistik t pada selisih konsentrasi antara teh hijau dan teh hitam tersebut sebesar 37.160 dengan probabilitas (Sig.) sebesar 0.000. Kriteria pengujian menyebutkan apabila probabilitas hitung < level of significance (alpha () = 5%) maka terdapat perbedaan signifikan kadar EGCG pada teh hijau dan teh hitam. Hasil pengujian menunjukkan bahwa probabilitas sebesar 0.000 < alpha 5% atauprobabilitas (Sig.) > level of significance (alpha () = 5%), sehingga H0 ditolak. Hal ini menunjukkan bahwa terdapat perbedaan signifikan antara kadar EGCG pada teh hijau dan teh hitam.
BAB V PENUTUP
5.1 Kesimpulan Hasil analisis kualitatif menggunakan LC-MS/MS, pada teh hijau dan teh hitam teridentifikasi mengandung katekin, epikatekin, katekin galat, epikatekin galat, galokatekin, epigalokatekin, galokatekin galat dan epigalokatekin galat. Hasil analisis kuantitatif menggunakan LC-MS/MS, kadar EGCG pada teh hijau sebesar 0,235 ppm sedangkan kadar teh hitam < LOQ sehingga belum bisa ditentukan kadar EGCG di teh hitam. Hasil analisis statistik menggunakan SPSS dengan uji signifikansi tindependen menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan antara kadar EGCG pada teh hijau dan teh hitam.
5.2 Saran 1. Perlu penelitian menggunakan alat dengan sensitivitas lebih tinggi untuk mengetahui kadar EGCG pada teh hitam. 2. Perlu penelitian lebih lanjut mengenai jenis teh lain sehingga tidak terbatas pada teh hijau dan teh hitam.
35
DAFTAR RUJUKAN
Agustina, Maria (Ed).2010.1001 Teh.Yogyakarta: Bestbook. Christianty, Fanny.2008. Perbandingan Efektivitas Berkumur dengan Larutan Teh Hijau Seduh Konsentrasi 50% dan 25% dalam Menghambat Pembentukan Plak Gigi secara Klinis pada Enam Permukaan Gigi. Depok: Universitas Indonesia. Fandy, Ryo Tindao.2009.Identifikasi Sistem Produksi Teh di PTPN IV Kebun Bah Butong.Medan: Universitas Sumatra Utara. Heroniaty, 2012.Sintesis Senyawa Dimer Katekin dari Ekstrak Teh Hijau menggunakan
Katalis
Enzim
Peroksidae
dari
Kulit
Bawang
Bombay.Depok: Universitas Indonesia Karisma, Maris Ginting.2012.Validasi Metode Lc-Ms/Ms Untuk Penentuan Senyawa Asam Trans, Trans-Mukonat, Asam Hippurat, Asam 2-Metil Hippurat, Asam 3-Metil Hippurat, Asam 4-Metil Hippurat Dalam Urin Sebagai Biomarker Paparan Benzena, Toluena, Dan Xilena.Depok: Universitas Indonesia Khopkar.2008.Konsep Dasar Kimia Analitik.Jakarta: UI-Press Rufaida, Fifi.2008. Analisis Pelatihan di PTPN VIII UNIT Tambaksari Pabrik Bukanagara Subang, Jawa Barat. Jakarta: Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah. Sari, Fitria Wulaningsih.2008. Uji Aktivitas Antioksidan Senyawa Campuran Derivat Kurkumin dan Katekin Hasil Isolasi dari Daun Teh.Depok: Universitas Indonesia.
36
37
Susanti, Erna.2012.Pengaruh Isolat Golongan Senyawa Katekin Teh Hijau terhadap Ekspresi p110 Phosphatidil Inositol 3-Kinase dan Aktivitas p38 Mitogen Activated Protein Kinase pada Aorta Tikus Wistar Jantan dengan Diet Tinggi Lemak.Malang: Universitas Brawijaya. Velayutam P.Babu and Liu.2008. Green Tea Catechins and Cardiovascular Health : An Update, Current Medicinal Chemistry, Vol 15 No.18,pp.18401850 Zdene Spacil, Lucie Nováková a, Petr Solich a.2010.Comparison of positive and negative ion detection of tea catechins using tandem mass spectrometry and ultra high performance liquid chromatography.
LAMPIRAN 1
38
39
LAMPIRAN 2
1
2
3
4
40
41
42
1
2
3
4
43
44
45
LAMPIRAN 3
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
LAMPIRAN 4
57
