Diagnostika bronchi álního bronchiálního astmatu HPLC/MS analýzou Kamila Syslov á Syslová Ú stav organick é technologie Ústav organické
Bronchi ální astma Bronchiální Civilizační onemocnění – rostoucí počet případů – snižující se věková hranice prvních projevů - u více než 50% nemocných – výskyt do 3 let věku – astma kojenců a batolat
Leukotrieny Bronchokonstrikce hladkého svalstva bronchů a bronchiol
Překrvení a otok sliznice
Zvýšená sekrece hlenu
Opakované epizodická stavy výdechové dušnosti
Astmatický záchvat Astma atopické - alergická reakce na cizorodé látky – inhalované částice - prach, pyly, plísně, roztoči, nebo požité potraviny či léky pylové zrno ambrózie
roztoč
Astma neatopické – vyvolává – fyzická, psychická zátěž, stres, změna teploty a tlaku, infekce
Diagnostika bronchi álního astmatu bronchiálního Vyšetření Invazivní – zatěžují organismus pacienta, může vzniknout astmatický záchvat Kožní imunologické vyšetření Bronchoprovokační test – provádí se nespecifickým podnětem – histamin, acetylcholin
Neinvazivní Poslechově – pískot, šumy – vyskytuje i u jiných nemocí Spirometricky - měří ventilační funkce plic Analýza dechového kondenzátu HPLC/MS metodou spirometr
Leukotrieny v lidsk ém organismu lidském Markery bronchiálního astmatu fosfolipáza A2
5-lipoxygenáza
O
Kyselina arachidonová
Membránové fosfolipidy
LTA4
COOH
glutation S transferáza
OH COOH
S
glutamyltransferáza
glutation
O
NH CH2 COOH CH2 CH2 CH COOH N H O NH2
LTC4
OH HOOC
S
O
CH2 CH2 CH COOH NH2
dipeptidáza
OH
COOH
S H2N CH2 COOH
COOH
LTB4
COOH
NH C COOH H2 NH2
LTA4 hydroláza
OH
OH
LTD4
COOH
LTE4
COOH NH2
Dechový kondenz át kondenzát Aerosolové částice ve vydechnutém vzduchu odráží složení bronchoalveolární extraceluární tekutin, která koresponduje s ději odehrávajících se v plicích
Složení dechového kondenzátu: - plynná fáze - těkavé látky (CO,CO2, NO) - kapalná fáze ve formě aerosolů – vodní fáze, H2O2 a netěkavé látky - metabolity kyseliny arachidonové, řada proteinů, histamin, serotonin, vazoaktivní peptidy náustek lamelární kondensátor jednosměrný dechový ventil kondenzovaný vzorek chladící manžeta
Kapalinov á chromatografie - HPLC Kapalinová Separační metoda pro MS u vysokomolekulárních (netěkavých) látek Pumpa
HPLC kolona
Autosampler
nástřik vzorku
pumpa
vstup do MS MS
mobilní fáze
HPLC kolony
Hmotnostn Hmotnostníí spektrometr Vstup do MS
Separace iontů
Ionizace
Detektor
Ionizace Podmínka pro MS -molekula v plynné fázi a iontovém stavu
Hmotové spektrum ESI
Ionizace pomocí ESI – ElectroSpray Ionisation sprejovací kapilára
Taylorův kužel rozpouštědlo
- - - + -- -- + + - - - + - ++ + -
odpařování rozpouštědla
analyzované molekuly
Culombická exploze
nabité kapičky
+
Zdroj vysokého napětí
-
analyzované ionty
Hmotnostn Hmotnostníí spektrometr Separace iontů
Kvadrupolový separátor
Hmotnostní spektrometr se třemi kvadrupoly
kvadrupolové tyče
ionty
+
-
-
+
turbomolekulární pumpa
Q1
kolizní kvadrupol
ESI detektor
Q3
průřez kolizním kvadrupolem
Imunoseparace Známé množství izotopově značeného standardu
Sorbenty s antileukotrieny
Dechový kondenzát
Molekuly imunochemicky navázané na sorbent
Použitá antiséra na pevném sorbentu odpad
SPE (Solid Phase Extraction)
Molekuly nepodlehlé imunochemické reakci
Zkoncentrované molekuly po imunoseparaci
Zkoncentrované molekuly po SPE
HPLC/MS analýza
Biologický vzorek bez sledovaných molekul - odpad
MS/MS mode MRM – multiple reaction monitoring SRM – selected reaction monitoring -analýza většího počtu iontů současně
-analýza jednoho iontu , vysoká selektivita a citlivost (fg/µl) i pro vzorky se složitou matricí LTD4 LTE4 LTD4 LTC4
176
100%
MRM spektrum LTD4 75%
Optimalizace kolizní energie u LTD4
50%
142
177
25% 495 460 317
493
0% 100
100%
75%
50%
200
SRM spektrum LTD4
300
176
400
500
m/z
Relativní intenzita %
167 113
100 80 60 40 20 0 8
16
24
Collision energie [eV] 25%
ion 495,2
ion 176
malé fragmenty
Výsledky m ěření měření Kalibrační křivka 1600000
LTE4 Area
1200000 800000 400000 0 0
100
200
300
400
500
C(pg/20µl)
LTD4
Mez detekce: 0,05 pg/µl Mez kvantifikace: 0,1 pg/µl Kinetika LTC4, LTD4, LTE4
LTE4
LTC4
LTD4
LTC4
c (pg/ml)
0
5 hod.
Čas
Výsledky 200 180
∑ (LTC4, LTD4, LTE4) [pg/ml]
160 140 120 100 80 60 40 20 0
zdraví
Fyziologická hladina:
astmatici
1-100 pg/ml
Patologická hladina:
> 110 pg/ml
Z ávěrem… Závěrem… Byla vyvinuta metoda pro detekci leukotrienů jako markerů bronchiálního astmatu
Odběr vzorku
Diagnóza
Uchování vzorku při –80°C
Kvalitativní a kvantitativní informace o markeru
Extrakce monitorovaných látek- využití imunoseparace
HPLC/MS analýza
Touto metodou bylo vyšetřeno cca 500 pacientů Dlouhodobá klinická studie bude probíhat v následujících 3 letech na 1. LF UK
D ěkuji za pozornost Děkuji
