Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat
Molekulárně genetická charakteristika vybraných onemocnění u koní Bakalářská práce
Vedoucí práce: Ing. Libor Stehlík, Ph.D.
Vypracovala: Tereza Proroková
Brno 2012
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Molekulárně genetická charakteristika vybraných onemocnění u koní vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne ………………………………………. podpis …………...……………………….
PODĚKOVÁNÍ Ráda bych poděkovala Ing. Liboru Stehlíkovi, Ph.D. za odbornou pomoc a vedení při psaní bakalářské práce. Dále pak mému příteli za trpělivou podporu a svým přátelům za cenné rady.
ABSTRAKT Cílem bakalářské práce je popsat vybraná onemocnění u koní, která jsou způsobena genetickými mutacemi a vyhledat a zpracovat o daném tématu dostupné a podstatné informace. První část práce je věnována karyotypu koně a zmapovanému genomu koní. Dále pak mutacím, které mají za následek vady a onemocnění u koní. Práce obsahuje mimo jiné popis bodových mutací a chromozomálních aberací. Hlavní část se zabývá v současnosti známými genetickými chorobami, na jejichž určení jsou dostupné genetické testy. V práci jsou popsány následující choroby - hyperkalemická periodická paralýza (HYPP), syndrom smrtící bílé u hříbat (OLWS), deficience glykogen větvícího enzymu (GBED), těžká kombinovaná porucha imunitního systému (SCID) a polysacharidová myopatie (PSSM). Důraz je kladen na způsob dědičnosti a genetické mutace ovlivňující tyto onemocnění, dále klinické příznaky, diagnózu, léčbu a popřípadě prevenci. Klíčová slova: kůň, karyotyp, mutace, dědičnost, geny, genetická onemocnění
ABSTRACT The objective of this bachelor thesis is to describe selected diseases in horses which are caused by genetic mutations and to find, as well as process, relevant and available information. The first part is dedicated to the equine karyotype and the recently mapped horse genome, also the mutations that cause defects and diseases in horses. It mostly contains the description of point mutations and chromosome aberrations. The body of this thesis contains known genetic diseases that can be discovered through available testing methods. It refers to hyperkalemic periodic paralysis (HYPP), overo lethal white foal syndrome (OLWS), glycogen branching enzyme deficiency (GBED), severe combined immunodeficiency disorder (SCID) and polysacharid storage myopathy (PSSM). An emphasis is put on types of heredity along with genetic mutations that affect these diseases, their clinical signs, diagnosis, treatment and prevention.
Keywords: horse, karyotype, mutations, hereditary, genes, equine diseases
OBSAH 1 ÚVOD ............................................................................................................................................ 7 2 CÍL PRÁCE .................................................................................................................................. 8 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED .............................................................................................................. 9 3.1 Karyotyp koně ............................................................................................................................ 9 3.2 Mutace .......................................................................................................................................10 3.2.1 Genové mutace (bodové mutace) ..........................................................................................11 3.2.1.1 Substituce (tranzice, transverze)......................................................................................11 3.2.1.2 Posunové mutace (inzerce, delece) ..................................................................................12 3.2.1.3 Mutace – tiché mutace, měnící smysl a nesmyslné ..........................................................12 3.2.2 Chromozomální aberace........................................................................................................13 3.2.2.1 Numerické aberace .........................................................................................................13 3.2.2.2 Strukturní aberace...........................................................................................................14 3.3 Přehled vybraných onemocnění ................................................................................................14 3.3.1 Hyperkalemická periodická paralýza (HYPP) .......................................................................14 3.3.1.1 Způsob dědičnosti...........................................................................................................14 3.3.1.2 Genetická mutace ...........................................................................................................16 3.3.1.3 Klinické příznaky ...........................................................................................................17 3.3.1.4 Diagnóza ........................................................................................................................18 3.3.1.5 Léčba, prevence ..............................................................................................................18 3.3.2 Syndrom smrtící bílé (OLWS) ..............................................................................................19 3.3.2.1 Způsob dědičnosti...........................................................................................................20 3.3.2.2 Genetická mutace ...........................................................................................................21 3.3.2.3 Klinické příznaky ...........................................................................................................22 3.3.2.4 Diagnóza ........................................................................................................................23 3.3.2.5 Léčba, prevence ..............................................................................................................23 3.3.3 Deficience glykogen větvícího enzymu (GBED) ...................................................................24 3.3.3.1 Způsob dědičnosti...........................................................................................................24 3.3.3.2 Genetická mutace ...........................................................................................................25 3.3.3.3 Klinické příznaky ...........................................................................................................25 3.3.3.4 Diagnóza ........................................................................................................................26 3.3.3.5 Léčba a prevence ............................................................................................................27 3.3.4 Těžká kombinovaná porucha imunitního systému (SCID) .....................................................27 3.3.4.1 Způsob dědičnosti...........................................................................................................27 3.3.4.2 Genetická mutace ...........................................................................................................28 3.3.4.3 Klinické příznaky ...........................................................................................................29 3.3.4.4 Diagnóza ........................................................................................................................30 3.3.4.5 Léčba a prevence ............................................................................................................30 3.3.5 Polysacharidová myopatie (PSSM) .......................................................................................31 3.3.5.1 Způsob dědičnosti...........................................................................................................31 3.3.5.2 Genetická mutace ...........................................................................................................32 3.3.5.3 Klinické příznaky ...........................................................................................................32 3.3.5.4 Diagnóza ........................................................................................................................33 3.3.5.5 Léčba a prevence ............................................................................................................33 4 DISKUZE .....................................................................................................................................35 5 ZÁVĚR .........................................................................................................................................37 6 POUŽITÁ LITERATURA ..........................................................................................................38 7 SEZNAM OBRÁZKŮ..................................................................................................................43 8 SEZNAM TABULEK ..................................................................................................................44
1 ÚVOD Již po mnohé generace chovatelé koní usilují o ovlivnění charakteru a fyzické stavby koní. Tohoto dosahují šlechtěním, k čemuž využívají plemenitby, ale také zkušeností, jež umožňují, aby zvolené procesy vedly k vytyčenému cíli. Po dlouhou dobu byli chovatelé odkázáni pouze na své zkušenosti. V poslední době došlo k rozkvětu ve šlechtění díky výsledkům genetického zkoumání, jež jsou podpořeny prudkým technickým a vědeckým rozvojem. Na základě informací, které byly v posledních letech zjištěny, byl popsán genom koně. Rozvíjením poznatků o genomu bylo dosaženo jeho zmapováním a tím bylo umožněno zkoumání genetických chorob u koní. Byly objeveny a prozkoumány mnohé mutace, které byly přesně lokalizovány v genomu. Význam informací pocházejících z genetických testů a studia genetické výbavy koně je velice rozsáhlý a významný. Jedná se o informace, jejíchž využití je podstatné jak v chovatelské praxi, tak i z hlediska ekonomického. Chovatelé mohou využít genetické informace k ovlivňování plemenných znaků bez rizika vzniku defektů a zároveň mohou zamezit výskytu mutací v jednotlivých liniích. Z ekonomického hlediska je podstatným přínosem možnost vyhnout se genetickým chorobám, které zvyšují úmrtnost koní a jejich nízkou využitelnost. U samotných koní předchází genetický výzkum bolestivým a smrtelným chorobám.
7
2 CÍL PRÁCE Cílem bakalářské práce je: -
vytvořit přehled vybraných, v současné době známých chorob u koní
-
vybrat podstatné informace k tomuto tématu pomocí odborné literatury
-
analyzovat důležité geny odpovídající za tyto defekty
-
popsat a pochopit onemocnění především z molekulárně genetického pohledu a genetické dědičnosti
8
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Karyotyp koně Genetická informace všech koní je téměř totožná. Koně všech plemen tudíž mají stejný počet, velikost a tvar chromozomů. Karyotyp je soubor všech chromozomů v jádře buňky. V prvním desetiletí dvacátého století byl vědci zveřejněn údaj o equinním karyotypu, jenž uváděl, že počet chromozomů se pohybuje mezi 20 a 34 chromozomy u samců koní (2n). Avšak teprve v roce 1956 byl uveden správný počet chromozomů, který je 64 (Bowling, 1996).
Obrázek 1 – Karyotyp koně (Ensembl, 2012). Kůň domácí (Equus caballus) má 31 párů chromozomů plus jeden pár pohlavních chromozomů, z toho tedy plyne, že diploidní počet chromozomů je 64. Z toho je 13 metacentrických autozomálních párů, 18 párů akrocentrických autozomálních a jeden pár pohlavních chromozomů. Díky poznatku, že kůň převalský má 66 chromozomů, z nichž je 12 metacentrických, 20 akrocentrických párů a jeden pár pohlavních chromozomů si můžeme utvořit závěr, že u koňovitých (Equidae) nastala rychlá evoluce, tedy rychlý vývoj satelitní DNA a chromozomů. Rozdíl spočívá v chromozomálním štěpení nebo splynutí (záleží na směru evoluční změny) na 5 chromozomu (ECA5) (Bowling a Ruvinsky, 2000).
9
Ačkoliv je si většina druhů čeledi Equidae příbuzensky poměrně blízko, je škála počtu chromozomů velice široká, počínaje zebrou hartmannovou (Equus zebra hartmannae) s 32 (2n) chromozomy až po koně převalského (Equus prewalskii) s 66 (2n) chromozomy (Bowling a Ruvinsky, 2000; Ryder et al., 1978). Genom koně byl zmapován teprve v posledních letech. Prvním koněm, u kterého byl zmapován celý genom, byla klisna Twilight plemene anglický plnokrevný kůň. Z těchto informací v současnosti vychází vědci pro zkoumání a vyšetřování například chorob koní (Ensembl, 2012; Horse genome project, 2012). Tabulka 1 – Současný genom koně (sestavený 2007). Tyto počty jsou v haploidní sadě chromozomů (Ensembl, 2012). Páry bází
2 428 773 513
Známé geny kódující bílkoviny
4 623
Odhad genů kódující bílkoviny
12 505
Nové geny kódující bílkoviny
3 308
Pseudogeny
4 400
RNA geny
2 118
Exony
211 815
Transkripty
29 159
3.2 Mutace Základem dědičnosti jsou informace, jež jsou uloženy v genech v podobě sekvencí, které jsou tvořeny páry nukleotidů v DNA nebo v RNA. Tyto se během rozmnožování přenášejí z rodičů na potomky. I přes mnohé kontrolní a opravné mechanismy dochází při přenosu k chybám. Tyto chyby v genetickém materiálu se nazývají mutace (Snustad a Simmons, 2009). Mutace se projevují jako trvalé modifikace DNA. Tvoří je aneuploidie, chromozomální přestavby, bodové mutace zahrnující substituce, delece nebo inzerce páru bází, duplikace a inverze DNA a mutace posttranskripčních úprav RNA (Pritchard a Korf, 2007).
10
Mutace spočívá v dědičné změně genetického materiálu a vytvářejí nové genetické varianty, díky nímž dochází k evoluci organismů (Snustad a Simmons, 2009). Jsou známy odchylky v sekvenci, které nemají na fenotyp takřka žádný dopad, ovšem jiné jsou přímo zodpovědné za vznik nemocí. Existují také odchylky, jež jsou zodpovědné za geneticky determinované fenotypické odlišnosti, které se projevují odlišností v anatomii, fyziologii, dietní toleranci, v reakci na léčbu, nežádoucích reakcích na léky, náchylnosti k infekcím a nádorům. Avšak ovlivňují i temperament a predispozice ke sportovnímu výkonu (Nussbaum et al., 2004). Mutaci definujeme jako jakoukoliv změnu uspořádání DNA či nukleotidové sekvenci (Nussbaum et al., 2004). Vzhledem k tomu že, struktury bází v DNA nejsou statické, mohou vodíkové atomy přecházet z jedné pozice purinu nebo pyrimidinu na pozici jinou. Tyto změny označujeme jako tautomerní přesmyky. Ačkoliv jsou tyto přesmyky vzácné, dojde-li k nim, mají důležitý význam v metabolismu DNA, neboť některé z nich mají vliv na způsob párování bází. Je pravděpodobné, že báze v tautomerních formách jsou méně stabilní a existují pouze krátkou dobu, ovšem budou-li existovat v okamžiku replikace nebo při začleňování do nově vznikajícího řetězce DNA, může dojít ke vzniku mutace (Snustad a Simmons, 2009). Určením původu můžeme rozdělit mutace na genové mutace, chromozomové mutace a genomové mutace.
3.2.1 Genové mutace (bodové mutace) Jedná se o mutace ovlivňující jednotlivé geny na úrovni párů bází v DNA. Nazývají se také jako mutace bodové. Bodové mutace dělíme na substituce, inzerce a delece párů bází. K změnám dochází substitucí jednoho páru bází za jiný nebo inzercí či delecí jednoho nebo více párů bází ve specifickém místě genu.
3.2.1.1 Substituce (tranzice, transverze) Substituce spočívají v záměně páru bází. Hovoříme-li o tranzicích, jedná se o nukleotidové změny zahrnující substituci purinu purinem (A za G) či pyrimidinu pyrimidinem (T za C). Hovoříme-li o transverzích, pak se jedná o náhradu purinu pyrimidinem nebo naopak (Nussbaum et al., 2004). U každého páru bází přichází v úvahu tři různé druhy substitucí a to jedna tranzice a dvě transverze. Dohromady tedy připadají v úvahu čtyři různé tranzice a osm různých transverzí (Snustand a Simmons, 2009). 11
3.2.1.2 Posunové mutace (inzerce, delece) -
Inzerce (adice) - u inzerce dochází k vložení jednoho nebo více nukleotidů, což má za následek přidání jedné nebo více aminokyselin do polypeptidického řetězce. Je-li zařazen počet nukleotidů, jenž není celočíselným násobkem čísla tři (3n), pak dochází k posunu čtecího rámce (frameshift mutace) a v důsledku toho dochází k syntéze zcela odlišného polypeptidu. V některých případech může dojít k předčasnému ukončení proteosyntézy se vznikem terminačního kodonu. Dojde-li k vložení nukleotidu v násobku tří (3n), nedojde k narušení původního čtecího rámce a dochází k prodloužení polypeptidového řetězce o daný počet aminokyselin na základě inzerované sekvence.
-
Delece - jedná se o ztrátu jednoho nebo více nukleotidů z původní sekvence. Účinek se projeví podobně jako u inzerce avšak na místo prodloužení polypeptidového řetězce dojde k jeho zkrácení. I u delece může docházet k posunu čtecího rámce (podle počtu trojnásobku aminokyselin) (Snustad a Simmons, 2009; Genetika-biologie, 2012).
Příklad: Původní sekvence
G-G-G-A-A-A-C-C-C-T-T-T
Inzerce
G-G-G-A-A-T-T-A-C-C-C-T-T-T
Delece
G-G-G-A-_-A-C-C-C-T-T-T
Substituce
G-G-G-A-G-A-C-C-C-T-T-T
3.2.1.3 Mutace – tiché mutace, měnící smysl a nesmyslné Existuje i rozdělení mutací, k nimž došlo v kódujícím úseku DNA, a to podle způsobu již tyto mutace ovlivňují proteosyntézu. Mutace neměnící smysl (tiché mutace, silence mutace) – využívají degeneraci genetického kódu (tedy toho, že některé aminokyseliny jsou kódovány různými triplety). O tichou mutaci se jedná, je-li kódována novým kodonem, avšak aminokyselina zůstává totožná. Mutace měnící smysl (missense mutace) – tyto mutace vedou ke změně smyslu polypeptidového vlákna. Způsobují je především takové substituce, jež způsobují i zařazování odlišné aminokyseliny při proteosyntéze. Nesmyslné mutace (nonsense mutace) – jedná se o mutace, které jsou příčinou vzniku předčasného terminačního kodonu v sekvenci DNA. V takovém případě nedojde k 12
dokončení syntézy polypeptidu a následkem toho dochází k nefunkčnosti proteinu (Pritchard a Korf, 2007).
3.2.2 Chromozomální aberace Chromozomální aberace jsou rozděleny do dvou základních skupin. První skupinu tvoří aberace autozomů a druhou aberace pohlavních chromozomů. Tyto dvě skupiny jsou členěny do dvou podskupin. Jedná se o strukturální aberace a numerické aberace. U koní nacházíme šest strukturálních chromozomálních aberací, z čehož tři jsou delece a tři jsou translokace. Vyskytují se také numerické aberace autozomů, které jsou všechny trizomie (Bowling a Ruvinsky, 2000; Chowdhary a Raudsepp, 2000).
3.2.2.1 Numerické aberace Numerické aberace nazývané genomové mutace se týkají změn v počtu chromozomů. Může se jednat o aneuploidii (trizomie, monozomie) neboli změnu počtu jednotlivých chromozomů nebo o euploidii (triploidie, tetraploidie), při níž dochází k znásobení počtu chromozomů. K numerickým aberacím dochází chybou při rozdělování chromozomů do dceřiných buněk v průběhu buněčného dělení. V případě aneuloidie se jedná o stav, při kterém chybí nebo naopak přebývá jen některý chromozom z velké chromozomální sady. Jestliže v diploidní buňce absentuje jeden chromozom z páru, jedná se o stav zvaný monozomie (2n – 1), přebývá-li naopak jeden chromozom, jedná se o stav trizomie (2n + 1) (Nussbaum et al., 2004; Genetika-biologie, 2012). Tak jako u jiných druhů i u koní jsou všechny trizomie na malých akrocentrických chromozomech. Způsobuje to okolnost, že trizomie zahrnující menší chromozomy jsou slučitelné se životem a nedochází u nich k častému embryonálnímu úhynu. Zvýšené riziko výskytu dalších chyb během prvního meiotického dělení při oogenezi, bývá mimo jiné spojeno s vyšším věkem klisny (Buoen et al., 1997; Lear et al., 1999; Chowdbary a Raudsepp, 2000). U koní je známo velké množství numerických aberací na pohlavních chromozomech. Čistá trizomie chromozomu X (65,XXX) se u koní nevyskytuje příliš často a je spojena s neplodností klisen. Nejčastější jsou monozomie na chromozomu X (např. 63,XO) (MorenoMillan et al., 1986; Power, 1987).
13
3.2.2.2 Strukturní aberace Strukturní aberace neboli chromozomové mutace způsobují změny struktury chromozomů na větším úseku. K strukturním přestavbám dochází v důsledku chromozomových zlomů. K chybné kombinaci potom dochází při následné rekonstituci. Strukturní přestavby dělíme na balancované a nebalancované. V případě přestaveb balancovaných je v chromozomové sadě ponecháno normální množství chromozomového materiálu. V druhém případě jistá část chromozomového materiálu v karyotypu buď chybí, nebo naopak přebývá. Rozlišujeme několik způsobů přestaveb: duplikace, delece, inzerce, translokace, inverze, izochromozomy, marker chromozomy a kruhové chromozomy (Nussbaum et al., 2004; Genetika-biologie, 2012).
3.3 Přehled vybraných onemocnění 3.3.1 Hyperkalemická periodická paralýza (HYPP) Hyperkalemická periodická paralýza (Hyperkalemic periodic paralysis) je dědičně podmíněné onemocnění, které se vyskytuje u koní. Nejčastěji jsou touto chorobou postižena plemena quarter horse, paint horse, appaloosa a další kříženci plemene quarter horse. Původcem tohoto onemocnění byl plemenný hřebec Impressive (plemeno quarter horse (QH)). Tento hřebec byl nalezen v rodokmenu u více než 100 000 koní plemene QH, což je již tak velký počet, že můžeme hovořit spíše o vzniku populace s tímto postižením než o pouhé linii (Bowling et al., 1996). Onemocnění bylo poprvé popsáno J. H. Coxem v roce 1985. Cox jej popsal jako opakující se záchvaty náhlé slabosti s dalšími průvodními jevy (Cox, 1985). Nejčastěji jsou postiženi koně s výrazně vyvinutou kosterní svalovinou (tzv. halterový typ koně), avšak toto postižení se může vyskytnout i u koní subtilnější konstituce (Kálová a Jahn, 2003).
3.3.1.1 Způsob dědičnosti HYPP je dominantně autozomální onemocnění tedy podmíněné přítomností dominantní alely, při němž dochází k onemocnění bez vazby na pohlaví jedince. Přes tento fakt se však vyskytuje vyšší počet afektovaných samců než samic. I když již byla vyloučena vazba na X nebo Y chromozom, nebylo dosud objasněno, proč k tomuto jevu dochází (Naylor, 1997). Hyperkalemická periodická paralýza se vyskytuje ve dvou variantách. Postižení jedinci mohou být heterozygoti (označovaní N/H) nebo homozygoti (označovaní H/H) v daném genu. Při čemž zdraví jedinci jsou homozygotního genotypu (N/N). 14
U homozygotních jedinců (H/H) lze první projevy nemoci odhalit již v raném věku, někdy však začínají být zřetelné až ve věku okolo třetího roku. U těchto jedinců jsou záchvaty výraznějšího a častějšího charakteru. U heterozygotních jedinců (N/H) se nemoc projevuje až v pozdějším věku (mezi druhým až čtvrtým rokem) a záchvaty jsou méně výrazné. S vyšším věkem se záchvaty stávají řidčími až ojedinělými. Je však pravděpodobné, že nemoc se projeví u všech koní, jež ve své genetické výbavě nesou mutantní alelu (Naylor, 1997; Kálová a Jahn, 2003). Vzhledem k tomu, že HYPP je autozomálně dominantní defekt, při křížení zdravého jedince (N/N) s jedincem heterozygotním (N/H) dochází z 50 % k narození zdravého jedince a 50 % k narození heterozygotního jedince (N/H) s vadou HYPP. Při křížení homozygotního jedince postiženého HYPP (H/H) s jedincem zdravým (N/N) dojde vždy k narození heterozygotního jedince (N/H). Při křížení dvou heterozygotních jedinců (N/H) dochází k narození heterozygotního jedince (N/H) z 50 %, k narození postiženého homozygotního jedince (H/H) z 25 % a k narození zdravého jedince (N/N) též z 25 %. Při křížení postiženého homozygotního jedince (H/H) s heterozygotním jedincem (N/H) je 50 % možnost narození homozygotně postiženého jedince (H/H) a 50 % možnost narození jedince heterozygotního (N/H) (Tab. 2) (Finno et al., 2009). I přes případnou nepřítomnost klinických příznaků nemoci HYPP, sdílejí všichni postižení jedinci některou z výše uvedených variant genetické mutace (Zhou et al., 1994). Při křížení dvou neafektovaných jedinců (N/N) je nemožné zplození potomka postiženého nemocí HYPP. Vzhledem k tomu že HYPP je onemocnění dominantní, nerecesivní, přenáší se z rodičů na potomky nikoli například ob generaci. Tabulka 2- N/N – zdravý jedinec (homozygot), N/H – postižený jedinec (heterozygot), H/H postižený jedinec (homozygot) Rodiče
Potomci
N/H × N/N
50% N/N 50% N/H
H/H × N/N
100% N/H 50% N/H 25% N/N 25% H/H 50% N/H 50% H/H
N/H × N/H H/H × N/H
15
3.3.1.2 Genetická mutace HYPP je způsobeno missense mutací tedy záměnou nukleotidu (substitucí). Jedná se o bodovou mutaci. Substituce způsobuje, že ve vznikajícím proteinu je řetězec aminokyselin vytvořen defektně. K defektu dochází záměnou jedné určité aminokyseliny jinou. Tato mutace mění smysl kodonu, tudíž dochází k inkorporaci odlišné aminokyseliny. U HYPP onemocnění dochází k substituci C za G, která způsobuje záměnu fenylalaninu za leucin v genu SCN4A v alfa podjednotce proteinu. Tento gen SCN4A byl zmapován na chromozomu 11 na 15463656-15513655 (Ensembl, 2012). Význam tohoto genu spočívá v jeho zodpovědnosti za napětí sodíkového kanálu u kosterního svalstva (Finno et al., 2009). Důsledkem této mutace je nesprávná funkce sodíkového kanálu, která spočívá v narušení rychlé inaktivace tohoto kanálu a k jeho nadměrnému otvírání a zavírání. Dochází k hromadění Na+ uvnitř buněk a k vyplavování K+, tento proces má vliv na tkáň kosterního svalstva. Při normálním stavu je sodík ve vyšších koncentracích mimo buňku a draslík je ve vyšší koncentraci uvnitř buňky. Homeostaze je udržována tokem iontů přes koncentrační gradient a tak je objem buňky udržován ve stabilním stavu. Koncentrace a relaxace svalových vláken je řízena tímto tokem. U jedinců postižených HYPP fungují zmíněné mechanismy chybně. To umožňuje draslíku vytékat z buňky a sodíku vtékat. Zvýšená hladina sodíku snižuje membránový potenciál, což vede k nárazům trvalé aktivity. U koní dochází k svalové fascikulaci, k uléhání, pocení a k neschopnosti postavit se, tento stav může trvat i delší dobu, může se stupňovat a může dojít až k úhynu zvířat (Buehrer, 2005). Záchvat může trvat několik minut, ale i několik hodin. U zdravých a nemocných koní je membránový potenciál svalových vláken značně odlišný. U koní s HYPP je potenciál postižených svalových vláken nižší (-55mV) oproti zdravým koním (-70mV) (Kálová a Jahn, 2003). Tabulka 3 – srovnání HYPP sekvence DNA a aminokyselin od normální alely. (Bowling, 1996). Normální alela (N) DNA sekvence Sekvence aminokyselin
HYPP alela (H)
...ATC TTC GAC TTC... ...ATC TTG GAC TTC... ...isoleucinfenylalaninasparaginfenylalanin...
16
...isoleucinleucinasparaginfenylalanin...
Bylo zjištěno, že onemocnění je analogické k lidské verzi popisované choroby zvané nemoc Gamstorpové (Rudolph et al., 1992). Výzkum této lidské verze choroby identifikoval dvě bodové mutace na genu SCN4A na 17q23-q25.3 v blízkosti seskupení růstového hormonu (GH). Jedna mutace je transverze G za T vedoucí k substituci valinu za glycin, který je jedním ze dvou glycinů přítomných ve všech známých sodíkových kanálech. Druhou mutací je přeměna C za T vedoucí k záměně threoninu za methionin (Buehrer, 2005). Genetická vada je jak u lidí tak u koní autozomálně dominantní porucha metabolismu kália, většinou se projevuje hyperkalemií vzácněji hypokalemií. U lidí byly popsány záchvaty hyperkalemie po působení chladu a po aplikaci steroidů (Naylor, 1997).
3.3.1.3 Klinické příznaky Pravděpodobnost, že kůň dostane záchvat, závisí na genetických predispozicích, stresu i dietách. Záchvaty a paralýzy vypadají velice podobně u heterozygotů i u homozygotů. Přesto však se u homozygotů vyskytují častěji a dochází při nich k závažným obstrukcím horních cest dýchacích (Carr et al., 1996). Homozygotní hříbata vykazují často klinické příznaky choroby již v prvních dnech života. U hříbat heterozygotních se obvykle klinické příznaky projeví teprve po odstavení a tato hříbata jsou postižena méně závažně. Záchvaty se začínají projevovat v době systematického zvyšování fyzické zátěže (trénink, výcvik) obvykle tedy mezi druhým a třetím rokem. Mezi jednotlivými epizodami u koní nejsou pozorovány žádné zjevné abnormality. Ačkoli v odborné literatuře převažuje názor, že během zátěže a práce jsou záchvaty vyloučeny, byl popsán i případ záchvatu během této činnosti (Meyer et al., 1999; Kálová a Jahn, 2003; Finno et al., 2009). Jednotlivé záchvaty HYPP se výrazně liší jak v etiologii a trvání tak i v závažnosti. Je vysoce pravděpodobné, že se vyskytují jedinci postižení touto mutací, kteří během svého života neprodělají ani jediný záchvat (Groves, 1996). Přirozeně tuto teorii je náročné prokázat. Avšak prodělal-li nemocný jedinec již jeden záchvat, je nanejvýš pravděpodobné, že se dostaví záchvaty další (Gesel, 1999). Během záchvatů HYPP je kůň stižen třesem svaloviny, silným pocením a selháním svalů, které vede až k jeho ulehnutí. Skončí-li záchvat v této fázi, můžeme ho označit za relativně lehký. Pokračuje-li však, dochází ke spazmu facialních svalů („sardonický úsměv“), mrkání, zívání, kůň není schopen držet hlavu ve vztyčené poloze. Může dojít k střídavému vyhřeznutí třetího víčka. V případě opravdu progresivních klinických příznaků může dojít až k 17
respiračnímu stridoru, při němž dochází ke kolapsu hltanu a nosohltanu. Provází jej i zvýšení dechové frekvence, dochází k neschopnosti polykání (odkapávání slin), selhávání pánevních končetin. V extrémních případech může dojít i k úhynu způsobenému kolapsem srdečního svalu a dýchacího aparátu. Postižená zvířata zůstávají během záchvatu při plném vědomí, vnímají své okolí a s největší pravděpodobností nepociťují žádné bolesti. K záchvatu vysoké intenzity může dojít i bez předešlých příznaků a může ustat v jakékoli fázi. Zatímco během záchvatu se hladina draslíku zvyšuje, po ukončení záchvatu se jeho hladina vrací k normálu (Spier, 1990; Naylor, 1997; Meyer et al., 1999; Kálová a Jahn, 2003).
3.3.1.4 Diagnóza Diagnóza koně je stanovena jednou z několika různých metod. Genetický test je oproti ostatním testům všeobecně považován za přesnější ve výsledku a také je šetrnější ke zvířeti. Je prováděn z biologického materiálu (žíně s kořenovými cibulkami). Náročnost testování spočívá v okolnosti, že tyto testy provádí pouze relativně malé množství licencovaných laboratoří mezi nimi například i veterinární genetická laboratoř na University of the California, Davis (www.vgl.ucdacis.edu) (Finno et al., 2008). Test pro identifikaci onemocnění HYPP je prováděn analýzou DNA sekvence v daném genu a za pozitivní je považován, je-li nalezena mutace (Rudolf et al., 1992). Další možná metoda uváděna v literatuře je aplikace KCl p.o., která vede k náhlému zvýšení hladiny draslíku, což vyvolá záchvat. Tato metoda se však jeví v praxi jako nevhodná neboť není možné odhadnout závažnost a sílu záchvatu. Proto je tento test poměrně nebezpečný a vůči zvířeti nešetrný (Meyer et al., 1999).
3.3.1.5 Léčba, prevence V případě akutního ataku provázeného mírnými příznaky se doporučuje chůze popř. klus. Při výraznějších zdravotních komplikacích je doporučeno přivolání veterinárního ošetřovatele, v jehož péči se pacient trvale nachází. Prevencí klinických příznaků nemoci je dodržování pravidelného denního režimu stávajícího z cvičení v přiměřeném zatížení a úpravou stravy (s nízkým obsahem draslíku). Kůň by se měl vyhnout stresu a hladovění. Základním bodem v prevenci šíření této genetické vady zůstává zodpovědný přístup v řadách chovatelů, kteří by měli důsledně zamezit páření postižených jedinců (Kálová a Jahn, 2003). 18
Obrázek 2 – DNA test na HYPP z veterinární laboratoře genetiky (University of California, Davis). Vidíme zde alely HYPP – N (normální) a HYPP – H (postižené). Každý vzorek je zesílen dvěma páry primerů pro vnitřní kontrolní test PCR (Finno et al., 2009).
3.3.2 Syndrom smrtící bílé (OLWS) Syndrom smrtící bílé (Overo lethal white foal syndrome) nebo také syndrom overo neboli ileocolonic aganglionosis zvaný též aganglionic megakolon je vrozená anomálie u koní. Jedná se o autozomálně recesivní poruchu, která postihuje hříbata plemen paint horse, quarter horse, pinto horse, american miniature horse, křížence arabských koní a plnokrevníky. Hříbata postižená touto vadou se vyznačují bílou barvou srsti při narození (Metallinos et al., 1998; Yang et al., 1998; Lightbody, 2002). Bílé plášťové zbarvení se zanedbatelným výskytem skvrn popřípadě i s jejich naprostou absencí doprovázené rozsáhlou agangliózou je projev fatální novorozenecké střevní obstrukce, která vede k úmrtí hříběte (Hultgren, 1982; McCabe., 1990). Hříbata se rodí bez chorobných příznaků, ale nedochází u nich k vyprázdnění do 5–24 hodin po porodu, což vede k úmrtí do 24–132 hodin (Hultgen, 1982). Aganglionóza se vyskytuje i u hlodavců koček a prasat. U lidí se tato choroba nazývá Hirschsprugova choroba (HSCR). Jedná se o vrozenou poruchu vyznačující se absencí střevních gangliových buněk (aganglionosis) v distálním gastrointestinálním traktu (Cass 1989; Yang et al., 1998).
19
3.3.2.1 Způsob dědičnosti V minulosti se považovalo zbarvení overo za recesivní způsob dědičnosti a bylo cíleně využíváno pro dosažení strakatého zbarvení, jež se stalo základním a charakteristickým rysem plemene paint horse. Později však bylo zjištěno, že zbarvení overo vůči ostatním zbarvení koní je způsobené dominantně autozomální dědičností (Bowling a Ruwinsky, 2000). Avšak onemocnění OLWS je recesivní (Rieder, 2009). Koně heterozygotní v daném genu (Oo) nesou zbarvení overo. Charakteristickým znakem těchto koní je výskyt bílé barvy, která se nachází uprostřed trupu, krku a hlavy a jež je rámovaná základní tmavou barvou. Ohraničení bílé barvy je ostré, jasně zřetelné a skvrny bývají asymetrické s nepravidelnými okraji. U koní s tímto typem zbarvení dochází k výskytu extrémních variant. Jednak můžeme nalézt koně s tmavou srstí, na které se vyskytuje malé množství světlých skvrn, a naopak se vyskytují jedinci v opačném extrému. V takovéto situaci bývá jistým vodítkem výskyt výrazných bílých odznaků na hlavě a jejich minimální výskyt v oblasti nohou (Apha, 2012).
Obrázek 3 – Různé typy koní s overo zbarvením (heterozygoti - Oo) (Apha, 2012). Nelze však usuzovat pouze ze zbarvení srsti neboť v případě plemene paint horse může být hodnocení podle těchto měřítek matoucí a nespolehlivé. Dochází totiž k případům kdy i jedinci, kteří nevykazují charakteristické zbarvení, jsou heterozygoti (Oo) tudíž přenašeči (Metallinos et al., 1998; Apha, 2012). Heterozygoti se skvrnami byli jako přenašeči potvrzeni ve více jak 95 % případů. V necelém 1 % byli zjištěni heterozygoti jako jedinci nesoucí zdánlivě celoplášťové zbarvení (Vrotsos et al., 1999). Heterozygotní jedinci, kteří nesou zbarvení overo, nejsou postiženi onemocněním, ale jsou pouze přenašeči dominantní alely pro toto zbarvení či pro onemocnění. Někteří heterozygotní jedinci – přenašeči u plemene paint horse se mohou vyznačovat i jinou barvou srsti, nežli je zbarvení overo a to například tobiano, tovero a sabíno. V minulosti bylo zaznamenáno v případě spojení dvou sabino koní jak narození zdravých jedinců bílého zbarvení, tak hříbat se syndromem smrtící bílé (Yang et al., 1998; Santschi et al., 2001; 20
Apha, 2012). Zde však je jasné, že záleží na daném koni, jestli nesl jak gen pro sabino zbarvení tak gen pro overo zbarvení. Dominancí alely (O) je ovlivněno jak zbarvení tak onemocnění zvířete. Jedinci nesoucí ve své genetické výbavě jednu tuto alelu jsou heterozygoti (Oo), tedy jedinci, kteří mají zbarvení overo a nejsou postiženi onemocněním, jsou tedy zdraví. Jedinci, nesoucí ve svém genotypu obě tyto alely jsou homozygoti (OO) a podléhají smrtelnému onemocnění Ileocolonic aganglionosis neboli syndromu smrtící bílé (Bowling, 1996; Rieder, 2009). Při zkřížení dvou heterozygotních jedinců se zbarvením overo (Oo) se předpodkládá v 50 % narození zdravého heterozygotního jedince (Oo) s tímto zbarvením, v 25 % narození homozygotního jedince (OO) s vadou OLWS a v 25 % narození zdravého homozygotního jedince (oo) bez strakatého zbarvení (Tab. 4) (Bowling, 1996). Údaje uvedené v evidenci narozených hříbat uvádí, že počet zvířat narozených s vadou OLWS se pohybuje pod hranicí 25 %. Takto nízké číslo můžeme vysvětlit selháním hlášení OLWS hříbat do chovné evidence nebo jej můžeme považovat za důsledek častých embryonálních ztrát těchto homozygotních hříbat. Nezanedbatelný vliv na tato data může mít nejistý počet přenašečů (McCabe et al., 1990). Tabulka 4 – Zkřížení heterozygotních jedinců (Oo) – 50% heterozygoti (Oo), 25% homozygoti (oo) a 25% homozygoti (OO) (Bowling, 1996). Alely od matky
Alely od otce O
O
O
OO letální bílá 25%
Oo overo 25%
O
Oo overo 25%
oo solid 25%
. 3.3.2.2 Genetická mutace Za onemocnění syndromem smrtící bílé (OLWS) a zároveň za zbarvení overo je zodpovědná missense mutace. Jedná se o záměnu jednoho páru bází tedy dinukleotidovou mutaci v endothelin B receptor genu (ENDRB). Tento gen má celkový počet páru bází 1 666 a počet aminokyselin je 458. Tato dinukleotidová mutace TC za AG v nukleotidu je na pozici 353354 (TC353-354AG – AF019072; AF038900) v genu ENDRB, kde dochází k substituci lyzi21
nu za isoleucin v kodonu 118 tohoto genu. Postižená hříbata jsou vzhledem k Lys v genu homozygotní (Lys118/Lys118). Přenašeči OLWS a nosiči zbarvení overo jsou heterozygoti (Ile118/Lys118). Substituce aminokyseliny je v první transmembránové doméně receptoru Gproteinu. Receptor endotelinu B a endotelin 3 jsou nezbytné pro normální výboj střevních uzlin a melanocytů. Gen ENDRB je umístěn na 17 chromozomu na lokusu 23-24 (ECA17q2324), přesnější lokace je na 17 : 50,604,167-50,625,930 (Metallinos et al., 1998; Santschi et al., 1998; Yang et al., 1998; Rieder, 2009; Ensembl, 2012).
Obrázek 4– Elektroferogram (pozice 348 – 356 v genu pro endothelin B receptor) zdravého koně (vlevo) a hříběte s vadou OLWS (vpravo) (Metallinos et al., 1998). 3.3.2.3 Klinické příznaky Syndrom letální bílé se vyznačuje bílým plášťovým zbarvením a vzniká absencí melanocytů v kůži. Vyskytují se případy kdy bíle zbarvené hříbě má v srsti několik drobných tmavých skvrn, což však nemění nic na jeho diagnóze. Koně postiženi touto chorobou mají kvůli depigmentaci modrou duhovku. Ačkoli většina postižených hříbat nebyla v tomto směru testována, byla u některých z nich prokázána hluchota (McCabe et al., 1990; Kahn, 2005). Střevní poruchy jsou způsobeny absencí gangliových buněk (submukózní a myenterická pleteň) na konci tenkého střeva, v slepém střevě a v celém tlustém střevě. Dolní část tenkého střeva (ileum) a část tlustého střeva (colon) je v tomto směru nejvíce postiženým místem (Hultgren, 1982; Vonderfecht et al., 1983). Defekty vznikají jako důsledek zástavy embryonálního vývoje (Hultgren, 1982). Hříbě, které se narodí s tímto postižením, se obvykle v prvních hodinách života chová přirozeně a projevuje normální aktivitu. Zpravidla od první konzumace mleziva dochází k prvním projevům koliky do 12 až 16 hodin. Nedochází k vyloučení meconia. Hříbata začínají pociťovat nepříjemné pocity, mění polohu a zvyšuje se jim tepová frekvence (110-120 tepů/min). Větší část prostoru trávicího traktu je naplněna plynem, ale výrazné nadýmání není
22
doprovázeno defekací. V případě koliky je vysoká rezistence vůči analgetikům (Hultgren, 1982; Vonderfecht et al., 1983; Vrotsos et al., 1999; Lightbody, 2002). Tato nemoc má svůj ekvivalent v nemoci, která je nazývána Hirschsprungova choroba (megacolon congenitum), jež je její variantou u lidí. Hirschsprungova choroba se od OLWS liší mimo jiné tím, že se neprojevuje poruchou pigmentu a má tu výhodu, že problém může být obvykle chirurgicky odstraněn (Bowling, 1996; Chakravarti, 1996).
3.3.2.4 Diagnóza Diagnostikovat je nejvhodnější nejdříve rodiče a tím zjistit zda nejsou nositeli mutantní alely. Předchází se tím zrození defektního jedince, jehož diagnostikování je často již nepotřebné, neboť se nedožívá více jak několika hodin. Diagnostika probíhá obvykle genetickým testem na vzorcích odebraných z biologického materiálu koně (žíně s cibulkami).
3.3.2.5 Léčba, prevence Jediný způsob jak předejít zplození hříběte s touto chorobou je prevence. Ta je však výrazně omezena, neboť jediným způsobem, jak ji docílit je laboratorní zjištění genetických dispozic rodičů pomocí testu (Metallinos et al., 1998). V současnosti v případě narození hříběte nemocného touto chorobou neexistuje žádná účinná léčba. Nejsou-li zvířata utracena, pak sama umírají v rámci několika desítek hodin po porodu (Finno et al., 2009).
Obrázek 5 – Hříbata se syndromem letální bílé (Vetnext, 2012).
23
3.3.3 Deficience glykogen větvícího enzymu (GBED) Letální porucha metabolismu glykogenu (Glycogen branching enzyme deficiency) neboli deficience glykogen větvícího enzymu je genetická vada, která se vyskytuje u hříbat nebo u potracených plodů. Spočívá v nefunkčnosti enzymu pro tvorbu glykogenu ve svalech. Jedná se o fatální onemocnění s autozomálně recesivním typem dědičnosti. Postihuje především koně plemene quarter horse, paint horse a jejich křížence. Tato vada byla odhalena a určena Drs. Stefanie Valberg jako genetická mutace v roce 2004 na Univerzitě v Minnesotě. Četnost nositelů této vady byla odhadována na 7,1 % u koní plemene paint horse a 8,3 % u koní plemene quarter horse. Koně postižení touto vadou jsou pokrevně spřízněni. GBED byla dále zjištěna u 2-4 % potratů v druhém až třetím trimestru. Postižená hříbata sama uhynou po pár měsících života (Valberg a Mickelson., 2006; Wagner et al., 2006). Obdobné onemocnění bylo popsáno u lidí a norské lesní kočky (Valberg a Mickelson, 2006).
3.3.3.1 Způsob dědičnosti Tato porucha metabolismu je způsobena mutací, která se projevuje autozomálně recesivním způsobem dědičnosti stejně jako u lidí. Z toho vyplívá, že mutace není vázaná na pohlaví a že přenašeči (heterozygotní jedinci) nevykazují známky onemocnění, ale mohou předávat svým potomkům afektovanou alelu a tím ovlivňovat svoje potomstvo. Postižená hříbata jsou recesivní homozygoti (g/g) a dostávají afektovanou alelu jak od matky tak od otce. Při zkřížení dvou heterozygotních jedinců (G/g) se rodí 25 % hříbat jako recesivně homozygotních (g/g) postižených vadou GBED, 25 % hříbat se narodí zdravých (G/G) a z 50 % dochází k narození heterozygotních jedinců (G/g) tedy přenašečů. Pokud však zkřížíme normálního zdravého jedince tedy dominantního homozygota (G/G) s heterozygotním jedincem (G/g), narodí se z 50 % heterozygotní jedinci, jež jsou přenašeči (G/g) nebo jen zdravý jedinec (G/G) nepostižený touto vadou. Z tohoto spojení za žádných okolností nevznikne postižený jedinec tedy recesivní homozygot (Tab. 5) (Valberg a Mickelson, 2012a).
24
Tabulka 5 – Možnosti zkřížení rodičů a vznik jejich potomstva (G/G – zdravý jedinec, G/g – přenašeč, g/g – jedinec postižený vadou GBED). Rodiče
Potomci
G/G × G/g
50% G/G 50% G/g
G/g × G/g
50% G/g 25% G/G 25% g/g
Kříženci s g/g
Nelze (g/g nedožijí se pohlavní dospělosti)
3.3.3.2 Genetická mutace Onemocnění GBED je způsobeno bodovou mutací a také nonsense mutací. Mutace je v genu GBE1, který kóduje glykogen větvící (branching) enzym. Tento gen byl u koní zmapován na chromozomu 26 (33459264-33657117). Onemocnění je zapříčiněno bodovou mutací tedy záměnou C za A v bázi 102, což má za následek vznik předčasného terminačního kodonu v exonu 1 v genu GBE1 a dochází tím k nefunkčnosti tohoto proteinu (Valberg et al. 2006, Ensembl, 2012). Glykogen je zásobní polysacharid v těle živočichů. Je to vysoce větvený polymer tvořený glukózami, které jsou navzájem pospojované. Glykogen je nemírně důležitý zdroj energie pro rychle rostoucí a vyvíjející se plod a pro vývoj novorozence. Je syntetizován glykogensyntázou, která vytváří přímé řetězce glukózy alfa 1,4 glykosidickými vazbami a GBE (Glykogen Branching Enzyme) neboli enzym větvící glykogen, za pomoci kterého se vytváří rozvětvená struktura (alfa 1,6 vazby) glykogenu. Tkáně hříbat postižené GBED nemají žádnou aktivitu GBE enzymu a tudíž nemohou vytvářet požadovaný normálně rozvětvený glykogen. V důsledku toho nemohou srdeční a kosterní tkáně, játra ani mozek ukládat a později mobilizovat glykogen k udržení glukózové homeostaze. Tkáně jsou slabé a neschopné funkce (Valberg et al., 2001; Bruno et al., 2007; Finno et al., 2009; Valberg a Mickelson, 2012a).
3.3.3.3 Klinické příznaky Celá řada klinických příznaků se podobá mnoha dalším chorobám u hříbat, zřejmě proto bylo onemocnění GBED objeveno poměrně nedávno. Mnoho hříbat postižených touto nemocí je potraceno v poslední třetině gravidity, mrtvě narozeno nebo narozeno předčasně (Wagner et al., 2006; Valberg a Mickelson, 2012a). Pokud se hříbě narodí živé, ať už v oče25
kávaném termínu či předčasně, můžeme pozorovat, že je slabé, méně aktivní, podchlazené, což může vést k hypoglykemickému záchvatu až k náhlé smrti (srdeční nebo respirační selhání). Obvykle mívají hříbata vyvinuty v ohybu končetin deformace. Hříbata s onemocněním GBED mají velmi často nízký počet bílých krvinek a nízkou hladinu glukózy v krvi a vysokou hladinu CK a AST enzymů ve svalech a GGT enzymu v játrech. Při palpaci není zřetelná ztuhlost ani bolestivost svalů. Všechna postižená hříbata uhynula nebo byla utracena po 8 týdnech života vzhledem k závažnosti svalové slabosti. (Ludvíková a Jahn, 2005; Valberg a Mickelson, 2006).
3.3.3.4 Diagnóza Určení diagnózy si vyžaduje použití barvení kosterní případně srdeční svaloviny metodou PAS. Proměnlivé abnormální PAS pozitivních globulárních či krystalických intracelulárních inkluzí v kosterním a srdečním svalstvu a nedostatečné zbarvení pozadí je pro GBED charakteristické (Obr. 6) (Ludvíková a Jahn, 2005).
Obrázek 6 – Biopsie svaloviny normálního koně (vlevo) a koně postiženého GBED (vpravo) obarvené metodou PAS. U postižené svaloviny je vidět nedostatečné zbarvení pozadí a abnormální PAS pozitivní globulární či krystalické intracelulární inkluze (Valberg a Mickelson, 2012a). Nejpřesnější a konečná diagnóza onemocnění GBED vyžaduje identifikaci pomocí genetického testu v licencovaných laboratořích. Pro tento test mohou být předloženy žíně s neporušenými kořeny nebo fetální jaterní tkáně. Pomocí tohoto materiálu se zjišťuje, jestli jsou koně homozygotní nebo heterozygotní pro toto onemocnění. (Ludvíková a Jahn, 2005; Valberg a Mickelson, 2006).
26
3.3.3.5 Léčba a prevence Jedinou prevencí proti této chorobě je zohlednění reálného nebezpečí zplození hříběte hřebcem nebo klisnou, u jejíchž potomků se tato nemoc vyskytla. V případě, že dojde k narození hříběte s touto chorobou je nutno otestovat oba rodiče genetickým testem pro tuto chorobu, je-li pozitivní, zabránit plození potomstva se stejně postiženým partnerem (Wagner, 2006). V současnosti neexistuje žádná léčba GBED. Včasné rozpoznání nemoci a eutanazie je nejlepší řešení jak pro majitele tak pro hříbě. 3.3.4 Těžká kombinovaná porucha imunitního systému (SCID) Těžká kombinovaná porucha imunitního systému (Severe combined immunodeficiency disorder) je genetické onemocnění vyskytující se u všech linií arabských koní a jejich kříženců (např. Angloarabský kůň) a to po celém světě. Odhady hovoří o 26 % dospělých arabských koní v USA jako o heterozygotních nositelích mutovaného genu a zhruba 2-3 % hříbat arabských koní uhyne do věku 5 měsíců na tuto chorobu (Toman, 2009; Novotná, 2010). Vzhledem k tomu, že hříbata se rodí se silně oslabeným imunitním systémem, je jejich odolnost vůči infekcím velice nízká, což vede k úhynu. Tato imunodeficience byla doposud zjištěna u myší, koček, drůbeže, psů, skotu, lam a lidí (Bárta, 2008; Tizard, 2009; Novotná, 2010).
3.3.4.1 Způsob dědičnosti Těžká kombinovaná imunodeficience je genetická choroba s autozomálně recesivním způsobem dědičnosti. Až do nedávna byla jedinou genetickou poruchou u arabských koní, u které byly možné genetické testy. Taktéž u této choroby jako u jediné byl znám způsob dědičnosti (Bárta, 2008). Postižený jedinec je recesivní homozygot, musí tedy zdědit obě zmutované alely od každého rodiče jednu. Je-li narozené hříbě postižené, jsou oba jeho rodiče heterozygotní jedinci tedy přenašeči. Přenašeči nejeví žádné projevy nemoci, ale chorobu předávají dál svým potomkům. Až do okamžiku narození postiženého hříběte z konkrétního jedince nevíme, jestli je tento jedinec SCID negativní tudíž dominantní homozygot (S/S) nebo jedná-li se o přenašeče – heterozygota (S/s). Dojde-li ke zkřížení zdravého jedince tedy dominantního homozygota (S/S) s heterozygotním jedincem (S/s), je předpoklad, že polovina narozených hříbat bude zdravých (S/S) a polovina budou přenašeči. Nikdy z takového spojení nevznikne recesivní 27
homozygotní jedinec tedy hříbě postižené chorobou SCID. Zkřížíme-li dva přenašeče (S/s) bude jedna čtvrtina potomků zdravých dominantních homozygotů (S/S), jedna polovina přenašečů (S/s) a jedna čtvrtina budou recesivní homozygoti, kteří budou postiženi chorobou SCID (s/s) (Tab. 6) (Novotná, 2010). Tabulka 6 – S/S – zdravý jedinec (dominantní homozygot), S/s – přenašeč (heterozygot), s/s jedinec postižený vadou SCID (recesivní homozygot). Rodiče
Potomci
S/s × S/s
50% - S/s 25% - S/S 25% - s/s
S/S × S/s
50% - S/s 50% - S/S
Křízenci s/s
Nelze, nedožijí se pohlavní dospělosti
3.3.4.2 Genetická mutace Za genetický defekt, který způsobuje vadu SCID, je zodpovědná bodová mutace. Jedná se o deleci pěti párů bází (TCT CA) v kodonu 9480 vedoucí k posunové mutaci (frameshift mutace) a deleci 967 aminokyselin. Po této deleci vzniká předčasný stop kodon a nefunkčnost aminokyselin, včetně celé PI3 kinázové domény a vzniká nestabilní bílkovina v genu. Tento gen kóduje enzym zvaný DNA závislá proteinkináza (DNA-PK). U tohoto enzymu dochází k defektu, chybí mu jedna ze tří komponent (komponent p350). Gen se nachází na chromozomu 9 (Shin et al., 1997; Barley, 2000; Finno, 2009; Tizard, 2009). Je to porucha v brzkém stádiu imunologické diferenciace buněk. Defektní komponent (p350) v DNA-PK způsobuje chybné přeskupení VDJ genů s následnou poruchou V oblasi u TCR receptoru T-buněk a BCR receptoru B-buněk. VDJ jsou genové segmenty, které jsou přítomny už v zárodečné linii. Jejich význam spočívá v podílu na principu překupování genů pro vznik variability vazebného místa pro antigen u receptorů T- a B- lymfocytů i protilátek. U postižených hříbat dochází k výraznému poklesu T-lymfocytů, kterým chybí znaky CD3 (fenotypická molekula T-lymfocytů, přenos antigenního signálu z TCR do buňky), CD4 (koreceptor pomocného Th lymfocytu), CD8 (koreceptor cytotoxického Tc lymfocytu). Důsledkem snížení hladiny B-lymfocytů je pokles imunoglobinů. Jediným indikátorem humorální deficience u postižených hříbat je hladina IgM, která je dodávána kolostrem v malém množství. Metabolismus IgM probíhá třikrát rychleji než je tomu u IgG. Proto hladina IgG u posti28
žených hříbat bývá v důsledku přetrvávání pasivně přijatých kolostrálních protilátek v normálu (McGuire et al., 1974, Bárta, 2008; Toman, 2009). Tabulka 7 – Srovnání SCID alely sekvence DNA a aminokyselin od alely normálního jedince (Tizard, 2009). Normální alela (S)
DNA sekvence
... AAT TTA TCA TCT CCA ATT CCC CCT AAG AGA ...
Sekvence aminokyselin
… Gly Asn Leu Ser Ser Gln Ile Pro Leu Lys Arg ...
SCID alela DNA sekvence (s) Sekvence aminokyselin
... AAT TTA TCA - - - - - AAT TCC CCC TAA GAG... … Gly Asn Leu Ser _ _ _ _ _ Asn Ser Pro STOP
3.3.4.3 Klinické příznaky Těžká kombinovaná imunodeficience u koní se řadí do primárních imunodeficiencí. U primární imunodeficience se jedná o vrozené, geneticky podmíněné poruchy imunitního systému. Klinickými projevy bývají zpravidla vážné, život ohrožující infekční nebo parazitální choroby. Úroveň genových poruch se může lišit a může se projevovat na jakékoli složce imunitního systému, které se projevují nesprávnou produkcí nebo nedostatkem buněčných proteinů (Toman, 2009). Hříbata se rodí bez klinických příznaků. Onemocnění se klinicky začne projevovat až v období poklesu kolostrální imunity ve věku 3-8 týdnů (Toman, 2009). Projevují se nedostatečnou funkčností obranyschopnosti proti infekcím, čímž dochází k napadení hříbat infekčními chorobami. Věk, ve kterém se začnou projevovat první příznaky choroby, je také závislí na životním prostředí nemocného hříběte. Obvykle hříbata, nejsou-li utracena dříve, hynou ve věku kolem pátého měsíce (Perryman et al., 1978; Studdert, 1978; Toman, 2009). Pro nemoc je charakteristické, že se souběžně projevuje infekce gastrointestinální provázená průjmem a infekce horních cest dýchacích, která může později přejít v bronchopneumonii. U některých zvířat se vyskytuje ulcerativní dermatitida, stomatitida nebo glositida. Dochází k střídavému výskytu horečky. V době do 3 týdnů od prvních klinických příznaků zvířata uhynou. V zažívacím a dýchacím traktu nalézáme mikroorganismy, které se vyskytují v prostředí, v němž se hříbě nachází (např. Escherichia coli, Pneumocystis carinii, Streptococcus zooepidemicus a další). V horních cestách dýchacích lze nalézt adenoviry, ve výkalech potom nalézt oocysty Cryptosporidium parvum (Bárta, 2008; Toman, 2009).
29
Obrázek 7 – Klinické příznaky nemoci SCID (infekce horních cest dýchacích a gastrointestinální) (Animal health trust, 2012).
3.3.4.4 Diagnóza Hypo- nebo agamaglobulinemie můžeme obvykle pozorovat u straších zvířat, charakteristické pro ně je nízká hladina IgG. Klinické příznaky deficience IgM se projevuje u starších hříbat a většinou nejsou spojeny s průjmy. Nedostatek IgM není spojován se selektivní deficiencí T-lymfocytů (Bárta, 2008). Nejlepším způsobem jak diagnostikovat toto onemocnění je použití genetického testu. Narodí-li se postižené hříbě, prokážou se tím oba rodiče jako přenašeči. Ve světě se začal tento test používat v roce 1997 (Novotná, 2010).
3.3.4.5 Léčba a prevence Nejlepší prevence je selekce a následné vyřazení z chovu zvířat plodící hříbata s vadou SCID. Jediná léčba je transplantace kostní dřeně od příbuzného zvířete, avšak toto se nedoporučuje, z důvodu nízké úspěšnosti. Hříběti můžeme život prodloužit antibiotiky a injekcemi hyperimunitnního séra nebo plazmy, avšak nedá se tímto vyléčit úplně. Obecně léčba primárních imunodeficiencí většinou neexistuje. Tato imunodeficience u arabských koní je nevyléčitelná a uspání zvířete je nejhumánnější řešení tohoto problému (Bue et al., 1986; Bárta, 2008; Finno et al., 2009).
30
3.3.5 Polysacharidová myopatie (PSSM) Při polysacharidové myopatii (Polysacharide storage myopathy) dochází k metabolickému onemocnění svalů. Existují dva odlišné typy PSSM, které můžeme nalézt u koní. Typ 1 se nachází u více jak 20 plemen koní mezi nimi nalezneme quarter horse, paint horse, appaloosa, teplokrevné a chladnokrevné koně (belgický kůň, Perscheron). PSSM typu 2 můžeme nalézt u plemen quarter horse, arabských a plnokrevných koní a koní lehčího typu.(McCue et al., 2006; Finno et al., 2009; Loving, 2009). Výskyt PSSM typu 1 se odhaduje do 10 % u koní plemene quarter horse a na 39 % u chladnokrevných belgických koní a u Percheron koní dokonce na 62 % (Valentine et al., 1997; Valberg a Mickelson, 2012b). Toto onemocnění je charakterizováno autozomálně dominantním způsobem dědičnosti u koní quarter horse a jemu příbuzných plemen. Při této poruše nastává abnormální nahromadění glykogenu a tím vznik patologických forem glykogenu ve svalových vláknech. PSSM je jedním z onemocnění, které se projevuje akutní zátěžovou rabdomyolýzou. Je to tedy poškození kosterních svalů, které se odvíjí od aktuální fyzické zátěže koně. Projevuje se též svalovým řesem a abnormalitami chodů. Příznaky jsou také známé jako tying-up neboli ne přesně výstižné černé močení nebo sváteční nemoc (Valberg et al., 1997; Firshman, 2005; Loving, 2009;).
3.3.5.1 Způsob dědičnosti Porucha PSSM se vyznačuje autozomálně dominantním způsobem dědičnosti. Koně postiženi PSSM mohou být jak heterozygoti (N/P) tak homozygoti (P/P), obě tyto varianty nesou příznaky onemocnění. Bude-li mít kůň s vadou PSSM (P/N nebo P/P) potomky a je jedno jestli s jedincem zdravým nebo postiženým chorobou PSSM, pak je pravděpodobné, že minimálně 50% potomstva bude mít vadu PSSM. V následující tabulce (Tab. 8) jsou uvedeny všechny variant křížení (Valberg a Mickelson, 2012b). U koní postižených PSSM nebyl zjištěn skutečný rozdíl v klinických příznacích mezi dominantními homozygoty a heterozygoty. Avšak u homozygotů se zdá, že nejsou postiženi tak závažně (Valberg, 2002). Porucha typu 2 u postižení PSSM není dosud geneticky identifikována a způsob dědičnosti není jasný. Analýza rodokmenu naznačuje, že se porucha vyskytuje na základě rodové příbuznosti (Valberg a Mickelson, 2012b).
31
Tabulka 8 – Varianty křížení u PSSM (Valberg a Mickelson, 2012b). Jedinci postižení PSSM (P/N, P/P) Genotyp od otce
Genotyp od matky N/N
P/N
P/P
N/N
0%
50% P/N
100% P/N
P/N
50% P/N
50% P/N 25% P/P
50% P/N 50% P/P
P/P
100% P/N
50% P/N 50% P/P
100% P/P
3.3.5.2 Genetická mutace U koní s poruchou PSSM typu 1 se jedná o bodovou mutaci. Dochází k substituci deseti páru bází v genu GYS1 (Obr. 8), který se nachází na chromozomu 10 (10: 18,933,08918,946,403). Tento gen GYS1 kóduje enzym, který odpovídá za syntézu svalového glykogenu (glykogensyntázu). Dochází k substituci G za A v exonu 6, je to tedy substituce argininu (CGT) na histidin (CAT) v kodonu 309 (Arg309His) (McCue et al., 2008; Ensembl, 2012; Valberg a Mickelson, 2012b). Mutace na genu GYS1 ovlivňuje enzym odpovědný za glykogensyntázu v kosterní svalovině. Tento enzym se stává díky mutaci neustále aktivní a tím dochází k abnormálnímu hromadění glykogenu v buňkách. Příčina poruchy PSSM typu 2 není prozatím známa. Postižení koně postrádají mutaci v genu GYS1, která je specifická pro typ 1 PSSM. Prozatím neexistuje ani důkaz o dědičnosti této varianty onemocnění (Valberg a Mickelson, 2012b). Studie ukazují, že skoro polovina koní (46 %) s mutací v genu GYS1 nese ještě jinou genovou mutaci. A to mutaci v genu RYR1, která způsobuje jiné onemocnění - maligní hypertermii, která způsobuje u koní nadbytečné uvolňování vápníku. Celkově se tato mutace v genu RYR1 vyskytuje jen u malého množství koní plemene quarter horse (Loving, 2009).
3.3.5.3 Klinické příznaky Průměrný věk nástupu klinických příznaků u plemene quarter horse je kolem 5. roku, u chladnokrevných koní se věk, kdy je toto onemocnění diagnostikováno, pohybuje kolem 8. roku, avšak chladnokrevní koně jsou ve většině případů asymptomičtí. U teplokrevných koní můžeme tuto chorobu diagnostikovat kolem 8.-11. roku života. Postiženi jsou jak heterozygotní jedinci tak i homozygotní. Nástup onemocnění je vyvolán fyzickou zátěží například tré32
ninkem a to zejména pokud kůň před výkonem několik dnů odpočíval. Koně však mohou mít příznaky i bez předchozí zátěže (Firshman et al., 2003; McCue a Valberg, 2007; Valberg a Mickelson, 2012b). Toto onemocnění se projevuje akutní rabdomyolýzou. Koně s oběma typy PSSM mají klinické příznaky spojené s tying-up neboli myopatií (poškozením svalů) nebo myalgií (bolesti svalů). Postižené svaly jsou nateklé a na pohmat výrazně tvrdé. Zvíře má dále ztuhlé svaly, trpí pocením a nechutí k pohybu a v některých případech dochází až k ulehnutí. Postižené svaly jsou obvykle v oblasti zad, hřbetu a plecí. Někdy se objevuje i tmavé zbarvení moči (myoglobinurie). Během záchvatu se zdají koně být méně aktivní, napínají břicho a chvějí se jim svaly v okolí boků. Většina koní má časté záchvaty, avšak mohou se vyskytovat i koně s mírnějšími příznaky a mít jen jeden nebo dva záchvaty do roka (Valentine et al., 1997; Firshman et al., 2003; Ludvíková a Jahn, 2005; Valberg a Mickelson, 2012). U mladých hříbat se PSSM projevuje známkami silné svalové bolesti a slabosti. Trpí souběžnými infekcemi jako je zápal plic nebo průjem. Některá odstávčata trpící zejména PSSM typu 2 mohou mít svalovou ztuhlost a mohou obtížněji růst (Valberg a Mickelson, 2012). Pokud se prokáže, že kůň není postižený vadou PSSM (N/N), ale vykazuje známky tying-up nebo svalové bolesti, je možné, že má jinou svalovou poruchu a měl by být diagnostikovám pomocí svalové biopsie (Valberg a Mickelson, 2012).
3.3.5.4 Diagnóza Pro potvrzení myopatie je nezbytné zjištění a stanovení aktivity svalových enzymů v krevním séru nebo plazmě pomocí biochemického vyšetření. Přesně určit o jaký typ myopatie se jedná je možno především na základě svalové biopsie. U koní s opakující se formou PSSM je doporučeno provést genetický test na obě mutace (GYS 1 a RYR1), je-li tento test negativní, můžeme potvrdit diagnózu PSSM typu 2 nebo jiného svalového onemocnění použitím svalové biopsie (McCue et al., 2001; Valberg, 2002; Valberg a Mickelson, 2012b).
3.3.5.5 Léčba a prevence Záchvatům lze předcházet každodenním pohybem a maximálním snížením polysacharidů v krmné dávce (jako zdroj energie používat rostlinné oleje). Při dodržování preventivních
33
opatření pravidelném pohybu a vyvážené dietní stravě dochází k zlepšení stavu koně až o 90 %. Dochází k výraznému snížení počtu záchvatů. Vzhledem k tomu, že tato choroba je velmi bolestivá, měli by chovatelé jejímu šíření předcházet vyřazením postižených jedinců z chovu (McCue et al., 2001; Fishman, 2003; Valberg a Mickelson, 2012).
Obrázek 8 – Chromozom 10 se zvýrazněným genem GYS 1 (McCue, 2008).
34
4 DISKUZE Ačkoli mutace jsou obvykle považovány za negativní jev, musíme si uvědomovat i jejich pozitivní roli ve vývoji organismů, díky níž dochází k evoluci. Mnohé genetické mutace však mají negativní vliv na vývoj organismu a je potřeba je eliminovat. S pomocí genetického výzkumu se nám daří stále hlouběji poznávat podstatu genů. Stále se ovšem nacházíme v počátcích vědeckého zkoumání sekvencí DNA, genů a mutací. Hyperkalemická periodická paralýza je onemocnění, u něhož je znám konkrétní průběh genetické mutace. Ačkoli klademe vznik tohoto onemocnění do linie po hřebci Impressive, měli bychom si položit otázku, zda se tato choroba nevyskytuje i u dalších linií. Uspokojivou odpověď nám může podat širší systematický genetický výzkum, jenž se bude vztahovat i na linie, které dosud nebyly testovány. Je nutno zvážit, že mohlo-li dojít ke vzniku této mutace u hřebce Impressive, pak není vyloučeno, že k jejímu vzniku mohlo dojít i u jakéhokoli jiného jedince, jenž nemusel mít žádný příbuzenský vztah k hřebci Impressive. Onemocnění HYPP je autozomálně dominantní onemocnění tedy se neváže na pohlaví. Podle Naylor (1997) nebylo doposud objasněno, proč dochází k vyššímu výskytu onemocnění u hřebců a valachů nežli u klisen. Ačkoli disponujeme poměrně velkým množstvím informací, o této chorobě zůstává nám skryto několik zásadních aspektů jejího průběhu. Podle Gloves (1999) se vyskytují případy, kdy postižený kůň nedostane ani jediný záchvat za celý svůj život, záchvaty se též výrazně liší co do intenzity, četnosti a okolností, při kterých k nim dochází. Otázkou také zůstává, jakou roli u tohoto postižení hraje věk zvířete, neboť se setkáváme se sníženým výskytem záchvatů se vzrůstajícím věkem zvířete při nezměněných životních podmínkách. V případě syndromu letální bílé u hříbat hraje genetický výzkum významnou roli. Kvůli velkému množství variant zbarvení koní je těžké bez genetického testu s naprostou jistotou určit koně se zbarvením overo. Z tohoto důvodu dochází k případům, kdy chovatel nepřikládá důležitost vykonání testů u koní s charakteristickým zbarvením jako je například zbarvení tobiano či sabino. Avšak i u těchto koní je možné, že se narodí potomek postižený syndromem letální bílé, pokud nesou oba jedinci, které zkřížíme, afektovanou alelu. Ideálním stavem by bylo úplné odstranění tohoto defektu z chovu, což však není možné, protože zbarvení overo je žádoucí a je způsobeno jednou afektovanou alelou v genotypu koně. V současnosti je jediným možným řešením veškeré jedince podrobovat genetickým testům.
35
Deficience glykogen větvícího enzymu spolu s hypekalemickou paralýzou a mnohými dalšími onemocněními postihují především koně plemene quarter horse a paint horse a zasahují jejich kosterní svalstvo. Vzhledem k tomu, že tito koně mají větší osvalení než většina ostatních plemen, nabízí se zde otázka, zda neexistuje souvislost mezi jejich tělesnou stavbou a podstatou těchto genetických nemocí. U polysacharidové myopatie existují dva odlišné typy nemoci. U prvního typu je určeno přesné místo, na kterém se mutace nachází, není však zcela jasné zda není ovlivňována ještě dalšími mutacemi a jinými vlivy. U typu druhého doposud místo mutace nebylo popsáno a gen ovlivňující toto onemocnění se ještě hledá. U tohoto druhého typu připadá v úvahu i varianta, že se zde nejedná o genetickou chorobu. Tato teorie však teprve čeká na svoje potvrzení nebo vyvrácení.
36
5 ZÁVĚR Cílem této práce bylo vytvoření přehledu vybraných onemocnění, které jsou způsobeny mutacemi v sekvencích DNA a na které existuje dostupný genetický test. Ve větší míře se genetické choroby vyskytují u koní, jenž se v posledních letech začali chovat ve velkém množství a našli oblibu u chovatelů, jedná se o plemena quarter horse, paint horse či arabské plnokrevníky. Informace použité v této práci byly čerpány z odborné literatury pojednávající především o genetických mutacích a způsobu dědičnosti. Bylo zkoumáno pět onemocnění. Hyperkalemická periodická paralýza, u které byla zjištěna bodová mutace v genu SCN4A, způsobující záchvaty náhlé slabosti, postihující koně s výrazně vyvinutou svalovinou. Touto nemoci jsou postiženi především koně plemen quarter horse a paint horse. Dalším onemocněním postihující tyto koně je syndrom smrtící bílé u hříbat, který způsobuje letalitu hned v prvních hodinách života. Příčina byla zjištěna v dinukleotidové mutaci v genu ENDRB pro endothelin B receptor. U tohoto defektu se jedná o recesivní způsob dědičnosti. V heterozygotní formě je tato mutace žádaná u mnoha chovatelů pro své specifické strakaté zbarvení. Proto se snažíme předcházet narození bílého hříběte tedy recesivního homozygota. Další vadou je těžká imunodeficience u arabských koní, která je způsobena delecí pěti páru bází v genu kódujícím enzym DNA závislá proteinkináza. U postižených koní je tato imunodeficience velký problém. Ačkoli pravděpodobnost narození takto postiženého hříběte není příliš vysoká, může chovatel v případě jeho narození očekávat značné finanční ztráty. Deficience glykogen větvícího enzymu způsobuje nefunkčnost enzymu pro tvorbu glykogenu ve svalech, příčinou tohoto stavu je mutace v genu GBE1. Oproti tomu onemocnění polysacharidové myopatie způsobuje abnormální nahromadění glykogenu ve svalových vláknech, což je způsobeno mutací v genu GYS1. V dosahování požadovaného chovatelského cíle, ať se jedná o zbarvení, osvalení či proporce, bychom měli přikládat velkou váhu právě genetice a nepodceňovat využití genetických testů. Tyto testy jsou schopny odhalit různé genetické defekty, kterých bychom se měli vyvarovat. Vzhledem k tomu, že tato onemocnění jsou obvykle velmi bolestivá a často i smrtelná, přináší studium genetiky výrazné zlepšení chovatelských perspektiv jak z hlediska zlepšení genofondu chovaných zvířat tak následných ekonomických dopadů.
37
6 POUŽITÁ LITERATURA Animal Health Trust, 2012: Foal Immunodeficiency Syndrome. Databáze online [cit. 201201-01]. Dostupné na:
Apha, 2012: Genetic Equation, Databáze online [cit. 2012-02-03]. Dostupné na: Bailey E., 2000: Immunogenetics of the horse, 140-157. In: Bowling A.T. a Ruvinsky M.J.: The genetics of the horse. 5. vydání. New York, N.Y.: CABI Pub. 527. ISBN 08-519-9429-6. Bárta O., 2008: Veterinární klinická imunologie: imunitní choroby domácích zvířat. 1. vydání. Brno: Akademické nakladatelství CERM, 322. ISBN 978-80-7204-553-2. Bowling A.T., 1996: Horse genetics. Wallingford, Oxon, UK: CAB International. 200 s. ISBN 08-519-9101-7. Bowling A.T., Byrns G. a Spier S., 1996: Evidence for a single pedigree source of the hyperkalemic periodic paralysis susceptibility gene in quarter horses. Animal Genetics 27, 279–281. Bowling A.T. a Ruvinsky M.J., 2000: The genetics of the horse. 5. vydání. New York, N.Y.: CABI Pub. 527. ISBN 08-519-9429-6. Bruno C., Cassandrini D., Assereto S., Akman H.O., Minetti C.a Di Mauro S., 2007: Neuromuscular forms of glycogen branching enzyme deficiency. Acta Myologica XXVI, 75-78. Buehrer P., 2005: Hyperkalemic Periodic Paralysis (HYPP): Biology, Genetics, & Care. Databáze online [cit. 2012-03-03] Dostupné na: Buoen L.C., Zhang T.Q., Weber A.F., Turner T., Bellamy J. a Ruth G.R., 1997: Arthrogryposis in the foal and its possible relation to autosomal trisomy. Equine Veterinary Journal 29, 60-62. Cass D.T., 1986: Hirschsprungs disease: a historical review. Pediatric Surgery Program 20, 199–214. Carr E.A., Spier S.J., Kortz G.D. a Hoffman E.P., 1996: Laryngeal and pharyngeal dysfunction in horses homozygous for hyperkalemic periodic paralysis. Journal of the American Veterinary Medical Association 209, 798–803. Cox J. H., 1985: An episodic weaknes in four horses associated with intermitent serum hyperkalemia and the similarity of the disease to hyperkalemic periodic paralysis in man. American Association of Equine Practitioners 21, 383-391. Ensembl, 2012: Whole genome. Databáze online [cit. 2012-03-18]. Dostupné na :
38
Finno C.J., Spier S.J. a Valberg S.J., 2009: Equine diseases caused by known genetic mutations. The Veterinary Journal 179, 336–347. Firshman A.M., Valberg S.J., Bender J.B. a Finno C.J., 2003: Epidemiologic characteristics and management of polysaccharide storage myopathy in Quarter Horses. American Journal of Veterinary Research 64, 1319–1327. Firshman A.M., Baird J.D., Valberg S.J., 2005: Prevalences and clinical signs of polysaccharide storage myopathy and shivers in Belgian draft horses. Journal of the American Veterinary Medical Association 227, 1958–1964. Genetika-biologie, 2012: Chromozomální aberace. Databáze online [cit. 2012-03-23] Dostupné na: Gesel W., 1999: HYPP: The Practical Perspective. Ohio Quarter Horse News 6, 16-18. Groves L., 1996: HYPP:Someone else’s problem? The Quarter Horse Journal 1, 52-59. Horse Genome Project, 2012: Horse Genome. Databáze online [cit. 2012-03-18]. Dostupné na: Hultgren B.D., 1982: Ileocolonic aganglionosis in white progeny of overo spotted horses. Journal of the American Veterinary Medical Association 180, 289–292. Chakravarti A., 1996: Endothelin receptor-mediated signaling in Hirschsprung Disease. Human Molecular Genetics 5, 303–307. Chowdhary B.P. a Raudsepp T., 2000: Cytogenetics and physical gene maps, 171-187. In: Bowling A.T. a Ruvinsky M.J.: The genetics of the horse. 5. vydání. New York, N.Y.: CABI Pub. 527. ISBN 08-519-9429-6. Kahn, Ed., 2005: Cynthia M. 9. Aufl. Whitehouse Station, NJ: Merck. ISBN 09-119-1050-6. Kálová L. a Jahn P., 2003: Hyperkalemická periodická paralýza: první diagnostikovaný případ v ČR. Veterinářství 53, 285-287. Dostupné z: Lear T.L., Cox J.H. a Kennedy G.A., 1999: Autosomal trisomy in a thoroughbred colt: 65,XY,+31. Equine Veterinary Journal 31, 85-88. Lightbody T., 2002: Foal with Overo lethal white syndrome born to a registered quarter horse mare. Canadian Veterinary Journal 43, 715–717. Loving N.S., 2009: Genetika a sváteční nemoc, Databáze online [cit. 2012-01-03] Dostupné na: Ludvíková E. a Jahn P., 2005: Myopatie u koní a jejich diferenciální diagnostika. Veterinářství 55, 345-348.
39
McCabe L., Griffin L.D., Kinzer A., Chandler M., Beckwith J.B. and McCabe E.R.B., 1990: Overo lethal white foal syndrome: equine model of aganglionic megacolon (Hirschsprung disease). American Journal of Medical Genetics 36, 336–340. McCue M.E., Ribeiro W.P. a Valberg S.J., 2006: Prevalence of polysaccharide storage myopathy in horses with neuromuscular disorders. Equine Veterinary Journal Supplement 36, 340–344. McCue M.E., Valberg S.J., Miller M.B., Wade C., DiMauro S., Akmand H.O. a Mickelson J.R., 2008: Glycogen synthase (GYS1) mutation causes a novel skeletal muscle glycogenosis. Genomics 91, 458–466. McCue M.E. a Valberg S.J., 2007: Estimated prevalence of polysaccharide storage myopathy among overtly healthy Quarter Horses in the United States. Journal of the American Veterinary Medical Association 231, 746–750. McGuire T.C., Poppie M.J. a Banks K.L., 1974: Combined (B- and T-lymphocyte) immunodeficiency: a fatal genetic disease in Arabian foals. Journal of the American Veterinary Medical Association 164, 70–76. Metallinos D.L., Bowling A.T. a Rine J., 1998: A missense mutation in the endothelin-B receptor gene is associated with Lethal White Foal Syndrome: an equine version of Hirschsprung Disease. Mammalian Genome 9, 426–431. Meyer T.S., Fedde M.R., Cox J.H. a Erickson H.H., 1999: Hyperkalemic periodic paralysis in horses: a review. Equine Veterinary Journal 31(5), 362–367. Moreo-Millan M., Delgado Bermejo J.V. a Castillo L.G., 1989: An entersex horse with X chromosome trisomy. Veterinary Records 124, 169-170. Naylor J. M., 1997: Hyperkalemic periodic paralysis. Veterinary Clinics of North America: Equine Practice 13(1), 129–144. Novotná M., 2010: Genetické choroby plnokrevných arabských koní (SCID, GPT, CA, LFS, JES, OAAM). Databáze online [cit. 2012-01-12]. Dostupné na: Nussbaum R.L., McInnes R.R. a Willard H.W., 2004: Klinická genetika (Thompson&Thompson). 6. vydání. Praha: Triton. 426. ISBN 80-7254-475-6. Perryman L.E., McGuire T.C. a Crawford T.B., 1978: Maintenance of foals with combined immunodeficiency: causes and control of secondary infections. American Journal of Veterinary Research 39, 1043–1047. Power M.M., 1987: Equine half sibs with an unbalanced X; 15translocation or trisomy 28. Cytogenetics and Cell Genetics 45, 163-168. Pritchard D.J. a Korf B.R., 2007: Základy lékařské genetiky. 1. vydání. Praha: Galén. 182. ISBN 978-80-7262-449-2.
40
Rieder S., 2009: Molecular tests for coat colours in horses. Journal of Animal Breeding and Genetics 126, 415–424. Rudolph J. A., Spier S. J., Byrns G. a Hoffman E. P., 1992a: Linkage of Hyperkalemic Periodic Paralysis in Quarter Horses to the Horse Adult Skeletal Muscle Sodium Channel Gene. Animal Genetics 23, 241-250. Rudolph J.A., Spier S.J., Byrns G., Rojas C.V., Bernoco D. a Hoffman, E.P., 1992b: Periodic paralysis in quarter horses: a sodium channel mutation disseminated by selective breeding. Nature Genetics 2, 144–147. Ryder O.A., Epel N.C. a Benirschke K., 1978: Chromosome banding studies of the Equidae. Cytogenet Cell Genet 20, 323–350. Santschi E.M., Vrotsos P.D., Purdy A.K. a Mickelson J.R., 2001: Incidence of the endothelin receptor B mutation that causes lethal white foal syndrome in white-patterned horses. American Journal of Veterinary Research 62, 97–103. Shin E.K., Perryman L.E. a Meek K., 1997: A kinase-negative mutation of DNA-PK(CS) in equine SCID results in defective coding and signal joint formation. Journal of Immunology 158, 3565–3569. Snustad D. a Simmons M.J., 2009: Genetika. 5. vydání. Brno: Masarykova univerzita. 871. ISBN 978-80-210-4852-2. Spier S.J., Carlson G.P., Holliday T.A., Cardinet III G.H. a Pickar J.G., 1990: Hyperkalemic periodic paralysis in horses. Journal of the American Veterinary Medical Association 197, 1009–1017. Studdert M.J., 1978: Primary, severe, combined immunodeficiency disease of Arabian foals. Australian Veterinary Journal 54, 411–417. Tizard I.R., 2009: Veterinary immunology: an introduction. 8. vydání. St. Louis, Mo.: Saunders. 574. ISBN 978-1-4160-4989-0. Toman M., 2009: Veterinární imunologie. 2. vydání. Praha: Grada. 392. ISBN 978-80-2472464-5. Valberg S.J., MacLeay J.M. a Mickelson J.R., 1997: Exertional rhabdomyolysis and polysaccharide storage myopathy in horses. Compendium of Continuing Education 19, 1077-1084. Valberg S.J., Ward T.L., Rush B., Kinde H., Hiraragi H., Nahey D., Fyfe J. a Mickelson J.R., 2001: Glycogen branching enzyme deficiency in quarter horse foals. Journal of Veterinary Internal Medicine 15, 572–580. Valberg S.J., 2002: A review of the diagnosis and treatment of rhabdomyolysis in foals. American Association of Equine Practitioners 48, 117-121. Valberg S.J. a Mickelson J., 2006: Glycogen-Branching Enzyme Deficiency. American Association of Equine Practitioners 52, 351-353. 41
Valberg S.J. a Mickelson J., 2012a: Glycogen Branching Enzyme Deficiency (GBED) in Horses. Databáze online [cit. 2012-02-011]. Dostupné na: Valberg S.J. a Mickelson J., 2012b: Polysaccharide Storage Myopathy (PSSM) in horses, Databáze online [cit. 2012-03-25]. Dostupné na: Valentine B.A., Credille K.M., Lavoie J.P., Fatone S., Guard C., Cummings J.F. a Cooper B.J., 1997: Severe polysaccharide storage myopathy in Belgian and Percheron draught horses. Equine Veterinary Journal 29, 220–225. Valentine B.A., Van Saun R.J., Thompson K.N. a Hintz H.F., 2001: Role of dietary carbohydrate and fat in horses with equine polysaccharide storage myopathy. Journal of the American Veterinary Medical Association 219, 1537-1543. Vetnext, 2012: Overo Lethal White Foal Syndrome: Equine Aganglionic Megacolon. Databáze online [cit. 2012-01-01]. Dostupné na: Vonderfecht S.L., Bowling, A.T. a Cohen M., 1983: Congenital intestinal aganglionosis in white foals. Veterinary Pathology 20, 65–70. Vrotsos P.D., Santschi E.M., Purdy A.K. a Mickelson J.R., 1999: Incidence of an endothelin receptor B mutation in white patterned horses; evidence for genetic heterogeneity in the overo coat pattern. Plant & Animal Genome VII, 456-459. Wagner M.L., Valberg S.J., Ames E.G., Bauer M.M., Wiseman J.A., Penedo M.C., Kinde H., Abbitt B. a Mickelson, J.R., 2006: Allele frequency and likely impact of the glycogen branching enzyme deficiency gene in Quarter Horse and Paint Horse populations. Journal of Veterinary Internal Medicine 20, 1207–1211. Yang G.C., Croaker D., Zhang A.L., Manglick P., Cartmill T. a Cass D., 1998: A dinucleotide mutation in the endothelin-B receptor gene is associated with lethal white foal syndrome (LWFS); a horse variant of Hirschsprung disease (HSCR). Human Molecular Genetics. 6, 1047-1052. Zhou J., Spier S.J., Beech J. a Hoffman E.P., 1994: Pathophysiology of sodium channelopathies: correlation of normal/mutant mRNA ratioswith clinical phenotype in dominantly inherited periodic paralysis. Human Molecular Genetics 3, 1599–1603.
42
7 SEZNAM OBRÁZKŮ Obrázek 1 – Karyotyp koně (Ensembl, 2012). ........................................................................ 9 Obrázek 2 – DNA test na HYPP z veterinární laboratoře genetiky (University of California, Davis). Vidíme zde alely HYPP – N (normální) a HYPP – H (postižené). Každý vzorek je zesílen dvěma páry primerů pro vnitřní kontrolní test PCR (Finno et al., 2009). ................... 19 Obrázek 3 – Různé typy koní s overo zbarvením (heterozygoti - Oo) (Apha, 2012). ............. 20 Obrázek 4– Elektroferogram (pozice 348 – 356 v genu pro endothelin B receptor) zdravého koně (vlevo) a hříbětě s vadou OLWS (vpravo) (Metallinos et al., 1998). ............................. 22 Obrázek 5– Hříbata se syndromem letální bílé (Vetnext, 2012). ........................................... 23 Obrázek 6 – Biopsie svaloviny normálního koně (vlevo) a koně postiženého GBED (vpravo) obarvené metodou PAS. U postižené svaloviny je vidět nedostatečné zbarvení pozadí a abnormální PAS pozitivní globulární či krystalické intracelulární inkluze (Valberg a Mickelson, 2012a)................................................................................................................ 26 Obrázek 7 – Klinické příznaky nemoci SCID (infekce horních cest dýchacích a gastrointestinální) (Animal health trust, 2012). ..................................................................... 30 Obrázek 8 – Chromozom 10 se zvýrazněným genem GYS 1 (McCue, 2008)........................ 34
43
8 SEZNAM TABULEK Tabulka 1 – Současný genom koně (sestavený 2007). Tyto počty jsou v haploidní sadě chromozomů (Ensembl, 2012). ............................................................................................ 10 Tabulka 2- N/N – zdravý jedinec (homozygot), N/H – postižený jedinec (heterozygot), H/H postižený jedinec (homozygot) ............................................................................................. 15 Tabulka 3 – srovnání HYPP sekvence DNA a aminokyselin od normální alely. (Bowling, 1996). .................................................................................................................................. 16 Tabulka 4 – Zkřížení heterozygotních jedinců (Oo) – 50% heterozygoti (Oo), 25% homozygoti (oo) a 25% homozygoti (OO) (Bowling, 1996). ................................................ 21 Tabulka 5 – Možnosti zkřížení rodičů a vznik jejich potomstva (G/G – zdravý jedinec, G/g – přenašeč, g/g – jedinec postižený vadou GBED). ................................................................ 25 Tabulka 6 – S/S – zdravý jedinec (dominantní homozygot), S/s – přenašeč (heterozygot), s/s jedinec postižený vadou SCID (recesivní homozygot). ......................................................... 28 Tabulka 7 – Srovnání SCID alely sekvence DNA a aminokyselin od alely normálního jedince (Tizard, 2009). ..................................................................................................................... 29 Tabulka 8 – Varianty křížení u PSSM (Valberg a Mickelson, 2012b). .................................. 32
44
