Moleculaire genetica en functioneel onderzoek van mutaties in HSPB8 geassocieerd met erfelijke motorische zenuwaandoeningen Lezing door Dr. Joy Irobi-Devolder naar aanleiding van de prijsuitreiking van de prijs van het Frans Van Cauwelaert fonds 2007. 1
Geachte voorzitter van de academie, geachte leden van de academie, beste collega wetenschappers, beste familie en vrienden. Vandaag heb ik de eer om de prijs van het Frans van Cauwelaert fonds te ontvangen, en ik wil jullie allemaal bedanken om dit samen met mij te beleven. Ik ga jullie iets meer vertellen over mijn onderzoek ‘Moleculaire genetica en functioneel onderzoek van mutaties in HSPB8 geassocieerd met erfelijke motorische zenuwaandoeningen’.
2
Het zenuwstelsel wordt onderverdeeld in het centrale en het perifere zenuwstelsel. De hersenen en het ruggenmerg vormen het centrale zenuwstelsel. Het perifere zenuwstelsel bestaat uit de zenuwuitlopers die vanuit de hersenen tot in de periferie lopen. Het centrale zenuwstelsel staat in verbinding met je lichaam door een netwerk van zenuwen. Het perifere zenuwstelsel zorgt voor het overbrengen van de informatie die je hersenen over de buitenwereld nodig hebben. Zenuwcellen of neuronen zenden berichten van je hersenen naar je spiervezels. Hier zie je een doorsnede van het ruggenmerg. Er zijn twee zenuwuitlopers; de motorische zenuwvezels en de sensorische zenuwvezels. Langs de motorische zenuwvezels worden de berichten verzonden; langs de sensorische zenuwvezels worden de berichten ontvangen. De zenuwcellen werken niet alleen, maar samen met de myeliniserende Schwann cellen die zorgen voor een snellere geleiding van de zenuwimpulsen. Je zenuwen werken als de draden van een elektrisch apparaat door informatie als elektrisch impulsen naar je hersenen te zenden. Je hersenen zijn in staat om die te ontvangen en signalen uit te zenden, zodat je lichaam op de juiste wijze reageert.
3
Perifere neuropathieën zijn afwijkingen van het perifere zenuwstelsel, veroorzaakt door een aantal ziektes, bvb. diabetes of door schade aan de motorische, sensorische of beide zenuwen. De spieren op zich mankeren niets maar ze ontvangen onvoldoende prikkels via de aangetaste zenuwen, waardoor atrofie of spierverzwakking optreedt. De best gekende perifere neuropathie is de ziekte van Charcot Marie Tooth (CMT), een erfelijke en heterogene aandoening voor het eerst beschreven in 1886. 1
4
Erfelijke perifere zenuwaandoeningen komen wereldwijd voor met een prevalentie van 1/2500. In 1886 beschreven de drie neurologen JeanMarie Charcot en Pierre Marie uit Frankrijk, en Howard Henry Tooth uit Engeland, het ziektebeeld van een langzaam progressieve en familiaal voorkomende zenuwaandoening. Afgekort wordt deze ziekte CMT genoemd, naar de ontdekkers.
5
Door defecten in het perifere zenuwstelsel ontvangen de spieren minder prikkels waardoor ze minder geactiveerd worden. De belangrijkste klinische kenmerken van patiënten met CMT zijn spierverzwakking en verkleining, ook spier-atrofie genoemd.
6
Ik ga nu een video van een CMT patiënt tonen zodat jullie zelf de klinische kenmerken kunnen zien. Deze video werd gemaakt door neurologen die werken in ons departement, Prof Peter de Jonghe en Dr. Jonathan Baets. De eerste moeilijkheden beginnen aan de voeten en onderbenen, later aan de handen en voorarmen. In tegenstelling tot sommige andere neurologische aandoeningen verkort CMT de levensduur niet.
7
Bij de ziekte van CMT wordt onderscheid gemaakt tussen twee hoofdvarianten, de axonale CMT en demyelinisatie CMT. Bij patiënten met axonale CMT is de afwijking in de zenuwuitlopers of de axonen zelf gelegen. Door het afsterven van axonen worden er minder zenuwcellen vastgesteld. Hier zie je een vergroting van de myelineschede rond het axon. Bij patiënten met demyelinisatie CMT worden vaak afwijkingen van de myelineschede gevonden. De myelinescheden rond de axonen zijn dun of soms helemaal verdwenen. Het proces van het verdwijnen van myeline heet demyelinisatie. Het duurt daardoor langer voordat een prikkel vanuit de hersenen via het aangetaste perifere zenuwstelsel de spieren bereikt.
8
Hoe ziet een zenuwvezel eruit? Hier zie je een opname van dwarsdoorsneden door zenuwvezels zoals te zien onder de microscoop. Op foto A zie je gezonde zenuwvezels. De myelineschedes zijn de zwarte rondjes, die de axonen omgeven. Op foto B zie je zenuwvezels van een patiënt met demyelinisatie CMT. Rondom de zenuwvezels zijn ajuinschilbeelden, hier zie je een vergroting van ajuinschilbeelden. Dit is een teken van een zieke zenuw. Ook het aantal zenuwvezels is verminderd. 2
9
Een subgroep van CMT is de distale erfelijke motorische neuropathie, waarbij er een predominante degeneratie van de motorische neuronen is. Bij de aanvang van mijn doctoraat in 1998 was er een grote Belgische familie ter beschikking waarin distale motorische neuropathie werd vastgesteld. Het genetische defect in deze familie was gekoppeld aan een bepaald chromosoom maar het met ziekte geassocieerde gen was toen nog niet gekend. Het doel van mijn doctoraat was het identificeren van het ziektegen en het opsporen van de mutatie in de Belgische familie met motorische neuropathie.
10
De ziekte wordt doorgegeven aan de volgende generatie op een autosomaal dominante overervingswijze. Dat wil zeggen, als één van de ouders, vader of moeder de aandoening heeft, dan hebben alle kinderen 50% kans de ziekte over te erven. Om een gendefect te identificeren, beginnen we met het verzamelen van bloedstalen van alle individuen in een familie, zowel patiënten als gezonde mensen. Uit deze bloedstalen wordt DNA-materiaal geïsoleerd, daarna starten we de zoektocht in het genoom.
11
De kern van elke cel (bvb. bloedcel) heeft je unieke DNA dat al je erfelijke eigenschappen bevat, bvb. de kleur van je huid of je bloedgroep. DNA is een informatiedrager zoals een boek of een cd-rom. Elke cel bevat dezelfde chromosomen met hetzelfde DNA en in het DNA zitten verschillende genen. De zoektocht voor het defecte gen kan je vergelijken met het zoeken van een naald in een hooiberg.
12
Hoe doen we aan DNA onderzoek? Hier zie je de stamboom van een familie. Zwart gekleurd zijn de patiënten, wit zijn gezonde personen. De vader van de familie draagt het ziektegen en heeft het doorgegeven aan 4 van zijn 7 kinderen. Om het ziektegen te vinden concentreren we ons op die patiënten met het kleinste gemeenschappelijke chromosomale gebied, want dit stukje is aanwezig in alle patiënten. Ergens in dit gebied bevindt zich het ziektegen.
13
De volgende stap is mutatie screenen, dit is het bepalen van de volgorde van de bouwstenen van het DNA van alle genen in het verkleinde gebied. Dit gaat leiden tot de identificatie van mutaties in het defecte gen.
3
14
Wat zijn mutaties? Een gen draagt de informatie voor een specifieke erfelijke eigenschap in een cel. Mutaties in genen zijn veranderingen in het erfelijke materiaal. We kunnen ons chromosoom of DNA vergelijken met een woordenboek. Verandering in 1 van de vele letters kan leiden tot een ander woord met een andere betekenis. Mutaties in DNA of genen kunnen een normaal gen veranderen in een defect gen dat resulteert in een defect eiwit, en dit leidt tot problemen voor de patiënten.
15
Dit soort genetisch onderzoek in onze Belgische familie met motorische neuropathie toonde aan dat het ziektegen gelegen is op chromosoom 12. Mutatie analyse toonde 2 veranderingen in een eiwit, het klein heat shock B8 eiwit. Deze mutaties zijn aanwezig in alle patiënten en die mutaties waren afwezig in gezonde individuen. We hebben ook dezelfde mutaties gevonden in andere families met axonale neuropathie, dit wil zeggen dat die mutaties in HSPB8 eiwit kritisch zijn voor de ontwikkeling van neuropathie. De mutaties in het HSPB8 gen liggen in een heel belangrijk domein van het eiwit, namelijk het alpha-crystalline domein. Dus verandering in dit belangrijke domein zal resulteren in een abnormaal eiwit. Toen we die mutatie vonden in het HSPB8 gen, hebben we een literatuurstudie gedaan om meer over de functie van dit eiwit te leren. Uit de literatuur blijkt dat HSPB8 bindt of samen werkt met een ander eiwit HSPB1, ook van dezelfde eiwit familie. Zo’n functionele interactie kan zijn dat mutaties die optreden in het HSPB1 gen ook kunnen resulteren in motorische zenuwaandoeningen.
16
In samenwerking met collega’s uit Rusland hebben we een mutatie analyse gedaan met veel patiënten met zenuwaandoeningen. We hebben verschillende mutaties gevonden in het HSPB1 gen, in verschillende families met perifere neuropathie. Dit onderzoek toont voor de eerste keer dat mutaties in kleine heat shock eiwitten resulteren in axonale neuropathie.
4
17
Wat zijn kleine heat shock proteïnen ? Ze behoren tot een grote familie van alomtegenwoordige eiwitten die aggregatie en denaturatie van eiwitten voorkomen. Ze hebben een belangrijke functie bij het overleven van alle cellen. De mutatie treedt op in het lysine aminozuur. Dit aminozuur is een ‘hot spot’ voor mutaties in deze eiwitten familie. Verandering die optreedt in dit lysine of arginine aminozuur resulteert in verschillende menselijke ziekten zoals cataract, DRMyopathy en motorische neuropathie. Deze mutaties treffen aminozuren die kritisch zijn voor de strukturele en functionele integriteit van de klein HSP eiwit familie.
18
Om het gemakkelijk te begrijpen kunnen we onze eiwitten vergelijken met een huis. We hebben verschillende componenten nodig om een sterk en goed functionerend huis of goed functionerend zenuwstelsel te maken. Bvb. bakstenen kunnen vergeleken worden met een belangrijk eiwit van een zenuwcel, structurele myeline proteïnen. De taak van cement kan vergeleken worden met de functie van adhesiemoleculen eiwitten in de zenuwcel. Elektriciteit in ons huis kan je vergelijken met eiwitten betrokken in axonaal transport of stroming van eiwitten vanaf het ruggenmerg tot ons handen of tenen. Op deze tekening van de zenuwcel zie je dat de kleine HS eiwitten een belangrijke rol hebben in de overleving van de axonen en dus mutaties in die eiwitten resulteren in de afsterving van de axonen en zenuwcellen.
19
Onze centrale onderzoeksvraag is waarom mutaties in HSPB8 predominant de perifere neuronen treffen terwijl andere lichaamscellen, waarin eveneens mutant HSPB8 voorkomt, gespaard blijven. Het antwoord weten we nog niet. Daarom doen we functionele studies die ons zullen leren wat de mutante eiwitten doen in cellen. We gebruiken nu 3 strategieën, namelijk we willen weten wat de rol is van mutante eiwitten in de overleving van cellen, in de celdood en stabiliteit van cytoskelet.
5
20
Ons eerste functioneel onderzoek in getransfecteerde cel cultuur toont dat mutant HSPB8 eiwit resulteert in aggregatie of accumulatie van eiwitten. In Foto A zie je de expressie van het normale eiwit, dat geen aggregatie maakt. In Foto B en C zie je dat de 2 mutanten B8 eiwitten wel aggregatie vormen in cellen. Een correcte vouwing van het eiwit is noodzakelijk om zijn functie naar behoren te kunnen uitoefenen. Een verkeerde vouwing van het eiwit kan leiden tot een eiwit dat niet langer functioneel is of tot een aggregaat. Het neerslaan van deze geaggregeerde eiwitten is één van de kenmerken van een aantal ziektes, zoals bvb. de ziekte van Alzheimer.
21
De volgende vraag, zien wij ook aggregaten van mutant eiwit in cellen afkomstig van patiënten met B8 mutaties. Het antwoord is positief. We hebben een kleine huid biopsie genomen van 2 patiënten uit de Belgische familie met B8 mutaties. Ons onderzoek toont dat cellen van patiënten aggregaten vormen. Dit aggregaat is afwezig bij cellen van gezonde mensen.
22
De patiënten met die B8 mutaties hebben geen probleem met hun huidcellen, maar wel met cellen uit het perifere zenuwstelsel, namelijk de motorische en sensorische neuronen. We hebben het effect van het mutante B8 eiwit onderzocht in getransfecteerde glial / Schwann cellen, die zorgen voor de neuronen. De mutante eiwitten vormen aggregatie in Schwann cellen. Deze aggregatie kan de beschermende functie van Schwann cellen naar de neuronen inhibieren en dus kan leiden tot afsterving van het neuron. We hebben hetzelfde experiment gedaan met motorische neuronen en we zien ook aggregaten van het mutante B8 eiwit. Belangrijke eiwitten worden geproduceerd in het cellichaam van zenuwcellen en ze worden door de zenuwuitlopers of axonen vervoerd naar de spieren. Een van onze hypotheses is dat die mutante aggregaten kunnen leiden tot blockages van dit transport.
6
23
Omdat de perifere neuronen de langste axonen bezitten die de meest distale spieren innerveren kan er verwacht worden dat veranderingen in het axonale transport kunnen bijdragen tot de ontwikkeling van een perifere neuropathie. Diermodellen zijn essentieel om een beter inzicht te krijgen in de pathomechanismen en om op termijn het effect van mogelijke therapeutica na te gaan. Tot op heden bestaat er voor patiënten geen doeltreffende therapie die het verloop van de ziekte kan veranderen. De ontrafeling van het biologische mechanisme van motorische neuropathie aan de hand van cel en muismodellen kan hierin een eerste stap vormen tot de ontwikkeling van mogelijke therapeutica.
24
Dit is een belangrijke slide. Ik wil mijn collega’s in onze onderzoeksgroep perifere neuropathieën, bedanken voor hun steun en hulp in dit project. Ik dank Professor Christine van Broekhoven die mij de kans gegeven heeft om een doctoraat te kunnen doen in haar departement Moleculaire Genetica. Ik dank Professor Vincent Timmerman, onze groepsleider, voor zijn wetenschappelijke steun en begeleiding. Ik dank Prof. Peter de Jonghe, groepsleider van de Neurogenetica onderzoeksgroep en onze hoofd neuroloog die zorgt voor de klinische diagnose van alle CMT patiënten. Ik dank Ines Dierick voor de genetische analyse, Albena, Sophie, Leo voor de stimulerende discussies, onze laboranten en iedereen van onze PN groep. Ik wil ook de instituten en universiteiten waarmee wij samenwerken bedanken, zonder hen had ons onderzoek nog niet zo ver gestaan. Een speciale dank aan alle CMT patiënten voor hun interesse en medewerking in ons onderzoek. Tot slot een speciale dank aan Johan Devolder, mijn man, voor zijn steun, en ook aan onze kinderen: Lukas, Athan en Jana.
7
