SEMINAR NASIONAL L TEKNIK KIIMIA SOEBA ARDJO BROTOHARDJO ONO IX Program Stu udi Teknik Kimia UPN “V Veteran” Jawaa Timur Surabayya, 21 Juni 20012
PRODU UKSI HIDR ROGEN D DARI JER RAMI PAD DI MELA ALUI HID DROLISIIS ENZIM MATIK DA AN FERM MENTASI Mu ufnaiti Prihaatini, Arief Widjaja *) Laboraatorium Tekn nologi Biokiimia Program m Studi Teknnik Kimia, FTI F Institut Tek knologi Sepuuluh Nopembber, Kampuss ITS Sukolilo, Surabayaa 60111 *) C Coresspondin ng author’s eemail: arief_
[email protected] Abstrak Bahan bakar fosil yanng sampai saaat ini merupakaan sumber eneergi utama, perrsediaannya seemakin menuruun. unaan bahan bakar b fosil juga a telah berkonntribusi dalam penurunan kondisi lingkung gan. Oleh karena Penggu itu perllu mencari sum mber energi alteernatif yang teerbarukan dan ramah lingkunngan. Salah sattu sumber enerrgi yang po otensial mengg gantikan bahann bakar fosil aadalah hidrogeen karena ramaah lingkungan,, terbarukan dan da tinggi nilai n energi. Dari D berbagai metode produuksi hidrogen, proses fermeentasi merupakkan proses yanng paling murah dan mu udah karena dapat d dilakukan pada suhu dan d tekanan am mbient. Materrial lignoseluloose p sebagaai material subbstrat untuk produksi biohiddrogen karena terbarukan dan d memegaang peranan penting keberaddaannya berlim mpah. Jerami padi p merupakaan salah satu material m lignosselulose dari limbah l pertanian yang dapat d dimanfa aatkan sebagaai material suubstrat. Penellitian ini berttujuan mempeelajari hidrolissis enzimattik jerami paddi menggunakaan crude enzim m dan commerrcial enzim daan memproduks ksi hidrogen daari hidrolissat jerami pad di menggunakaan Enterobacteer aerogenes NBRC N 13534 ssecara fermenntatif. Rangkaian penelitiian meliputi peembuatan larutan enzim baikk murni (komersial) maupun kasar dari Trrichodema reessei dan Asppergillus nigerr, pretreatmen nt jerami padi dengan NaOH H 1% pada teemperatur 600C selama 8 jam, hidrolissis enzimatik jeerami padi hassil pretreatmennt pada temperratur 600C, pH H 3 serta konseentrasi enzim 93 U/5g jeerami padi, dann fermentasi hiidrolisat jeram mi padi menggu unakan Enterobbacter aerogen nes NBRC 13534 untuk menghasilkan m hidrogen pada da temperatur 300C, pH 6 dan d konsentraasi gula redukksi 6 g/L. Enzim xilanasee dan selulasee dari A. nigeer yang digunakan dalam penelitian p ini mempunyai aktivitas a masinngmasing 1,8 U/ml dann 2 U/ml. Yieldd hidrolisis sebbesar 0,39 g gula g reduksi/ g jerami padi. Yield hidroggen 0,23 mol H2/mol gulaa reduksi. Kata ku unci : Hidrogeen, Enterobacteer aerogenes N NBRC 13534, fermentasi, fe hidrrolisis, jerami padi. p I. PEND DAHULUAN N B Bahan bakar fosil f yang sam mpai saat ini m merupakan sum mber energi uutama, persediiaannya semakkin menuru un. Penggunaan n bahan bakar fosil juga telahh berkontribussi dalam penuruunan kondisi lingkungan. Olleh karena itu perlu menccari sumber ennergi alternatif yang terbarukaan dan ramah lingkungan. Saalah satu sumbber energi yang potensiaal menggantikaan bahan bakaar fosil adalahh hidrogen kaarena ramah liingkungan (haasil karan berupa H2O), terbarukkan (diperolehh dari berbagaai sumber yangg terbarukan) dan tinggi nilai pembak energi yaitu y 122 KJ/g, atau 2.42 kalii lebih besar daaripada bahan bakar b hidrokarrbon metana (R Ruggeri, 2008).. D berbagai metode Dari m produkksi hidrogen, pproses fermentaasi merupakan proses yang paling p murah dan d mudah,, karena dapat dilakukan pad da suhu dan teekanan ambiennt (Chen dkk., 2006). Materrial lignoseluloose memegang peranan penting sebagai material substrat untuk k produksi bbiohidrogen kh hususnya dalaam mbangan biofueel karena dapaat diperbaharuui dan keberad daannya berlim mpah. Jerami padi merupakkan perkem salah saatu material liggnoselulose daari limbah pert rtanian yang daapat dimanfaattkan sebagai material m substrrat. Jerami padi p mengandu ung 43.38% seelulosa; 24.73% % hemiselulosaa dan 9.67% liggnin (Anwar,20010). Fermentaasi secara langsung l jeram mi padi tidak efisien e karena selulosa dan hemiselulosa h tidak dapat lang gsung dikonverrsi oleh baakteri penghasil energi secaraa instan. Oleh kkarena itu akann lebih feasiblee menggunakaan 2 tahap prosses produkssi, pertama yaaitu material berselulosa dihhidrolisis melallui metode fisika-kimia atauu biologi, diikuuti langkah h konversi enerrgi secara ferm mentasi (Ren, 20009). D Dewasa ini pen nelitian tentangg produksi hidrrogen dengan menggunakan m proses fermenntasi berkembanng dengan pesat. Hidrogen dapat diperroleh dengan caara fermentasi dengan yield 1,36–3,02 moll H2/mol glukoosa d 2003; Moorimoto dkk., 2004; Ogino dkkk., 2005; Kotaay dan Das, 20006; Zhang dkkk., 2006), 1,3–44,8 (Chin dkk., mol H2/mol / sukrosa (Sung ( dkk., 20002; Lin dan Laay, 2004a; Ogino dkk., 2005)); 0,73–2,19 mol m H2/mol xiloosa (Lin dk kk., 2008; Lo dkk., d 2008; Reen dkk., 2009); 1,1–1,5 mol H2/mol heksosa (Mahakhann dkk., 2005; L Lin dkk., 2008) masing-m masing dari gllukosa, sukrossa, xilosa atau u pati ubi kayyu. Mempertim mbangkan bahw wa
D.3-1
SEMINAR NASIONAL L TEKNIK KIIMIA SOEBA ARDJO BROTOHARDJO ONO IX Program Stu udi Teknik Kimia UPN “V Veteran” Jawaa Timur Surabayya, 21 Juni 20012 selulosaa utamanya dissusun oleh gluukosa dan hem miselulosa disussun oleh xilosaa dan sejumlahh kecil gula laiin, maka sangat s potensial jika keduuanya dikonveersi menjadi hidrogen h melaalui hidrolisis enzimatik dan d fermenttasi. P Penelitian ini bertujuan b mem mpelajari hidrollisis enzimatikk jerami padi m menggunakan crude c enzim dan d commerrcial enzim dan d memproduuksi hidrogen dari hidrolissat jerami paddi menggunak kan Enterobactter aerogen nes NBRC 135534 secara ferm mentatif. II. ME ETODOLOGII Penyiap pan Jerami Jerami padi dijemurr 4 hari, dipo otong kurang lebih 2 mm m menggunakaan pemotong kertas, digilinng mengguunakan penggiiling biji-bijiaan kemudian diayak d 100 -1120 mesh. Jerrami kemudian n didelignifikaasi mengguunakan NaOH 1% pada tem mperatur 60 oC selama 8 jaam dalam labuu Erlenmeyer yang dilengkaapi dengan kondensor reffluks, kemudiaan dicuci dengaan air kran sam mpai netral dann terakhir dicu uci menggunakkan aquadess. Jerami dipisahkan mengguunakan penyariing kain kemudian dikeringkkan pada 100 oC selama kuranng lebih 8 jam. j Analisa selulosa, s hemisselulosa dan liggnin menggunaakan metoda Ch Chesson. Penyiap pan Campuraan Crude Enzyyme Jamur yang y digunakann untuk memp produksi selulaase pada peneliitian adalah T. reesei dan A. niger. Keduannya dikembbangbiakkan paada media potaato dextrose aagar (PDA) miring m selama tuujuh hari. Enzzim dipersiapkkan dengan cara menginkkubasi T. reesei maupun A. nniger dalam meedia padat jeraami padi dengaan larutan nutrrisi NH4)2SO4; 2,0 g yang diigunakan menngandung 1,0 g ekstrak ragii; 1,5 g bacterrioogical pepttone); 1,4 g (N KH2PO O4; 0,005 g FeS SO4·7H2O; 5 mL m larutan CMC C 1% dalam tiaap liter larutann buffer sitrat 0,1 0 M dengan pH p 5,5. Lim ma gram serbuuk jerami padi dimasukkan kke dalam labu Erlenmeyer 2550 mL kemudian ditambahkkan 25 mL larutan nutrissi. Campuran tersebut t disterrilisasi pada tem mperatur 121 oC selama 155 menit. Bibit A. d T. reesei daalam agar miriing diinokulasikan secara aseptik ke mediuum dalam labuu Erlenmeyer. T. niger dan reesei diinkubasi d selaama 6 hari sed dangkan A. nigger diinkubasi selama 8 hari. Enzim dipaneen menggunakkan 100 mL L larutan Tweeen 80 1% dalam m buffer sitratt 0,1 M dengann pH 5,5 dan ddishaker pada 175 rpm selam ma 135 meenit. Campurann enzim kemud dian disentrifuugasi pada 10.0000 rpm selam ma 30 menit daan disaring untuuk mendap patkan crude enzym (supern natan). Aktifittas enzim diujji berdasarkann aktifitas CM MCase, satu unnit aktivitaas (U) dedefiniisikan sebagai 1 µmol glukoosa yang dihaasilkan dari degradasi CMC tiap menit paada temperaatur pengujian 35 oC. Jumlah h glukosa yang dihasilkan ditentukan d mennggunakan diniitrosalicylic accid (DNS), diukur meng ggunakan spekktrofotometer ppada panjang gelombang 5440 nm. Crude enzyme dari T. Reesei dicampur den ngan crude en nzyme dari A. Niger dengann perbandingann 2 : 1 U/U. Pada saat tiddak digunakkan, enzim disiimpan pada suh hu 4 oC. Penyiap pan Commerccial Enzyme Enzim komersial yanng digunakan sebagai pembbanding pada percobaan p ini adalah selulase dari A. nigger berlabel Fluka Biochhemika dan T.rreesei berlabel Sigma Aldrich. Enzim ini dilarutkan d dalam m 100 ml bufffer H = 5,5 sehinggga diperoleh aaktivitas enzim masing- masinng 2,0 dan 2,6 U/mL. sitrat 0,,1 M dengan pH Hidroliisis Hidrolisis dilakukan dalam erlenm meyer dan di reefluks. Lima gram g jerami ppadi yang telah h didelignifikaasi dicampur dengan enzzim pada konsentrasi 93U/5ggr jerami dan volume cairann 250 ml. Hidrrolisis dilakukkan pada 60 00C, pH 3, selaama 48 jam. Diiaduk menggunnakan magnetiik stirer. Sampel diambil 0,2 mL setiap 3 jaam selama 48 jam, kemuudian dianalisiis kandungan ggula reduksiny ya menggunakkan DNS (dinitrosalisilic aciid) dan diuukur absorbansiinya menggunaakan spektrofootometer pada panjang p gelomb mbang 540 nm. Fermen ntasi Fermen ntasi dilakukan dalam reaktorr batch pada suuhu 300C, pH dijaga d rentang 5,5-6,0 mengggunakan NaOH H4 M. Bakkteri yang digu unakan yaitu Enterobacter E a aerogenes NBR RC 13534 (hibbah dari Prof. Hirayasu Oginno, Osaka Perfecture P University Jepang g). Bibit yangg akan digunak kan, ditumbuhkkan kembali selama s satu haari. Enterobbacter aerogen nes diaklimatissasi dengan voolume 100 mll. medium yanng digunakan adalah a hidrolissat jerami padi p yang menngandung 5 g//L ekstrak ragii dan ferrosulffat 0,35 g/L. Gas G yang dihassilkan ditampunng dalam sampling bagss (CEL Scienttific Tedlar gaas sampling ba ags). Setiap selang waktu 6 jam dilakukkan mbilan sampel untuk mengukkur konsentrassi gula reduksii dan sel. Anaalisis kadar gula menggunakkan pengam metode DNS sedangkkan konsentrasii sel menggunaakan spektrofotometer, volum me hidrogen daalam bags diukkur m pemindahan n air dan perrsen H2 dihituung dengan ccara membandingkan samppel mengguunakan sistem biohidroogen dan stanndart hidrogen n murni mengggunakan Gass Chromatogrraphy GC-2010A Shimadzuu , detektor TCD (Therm mal Conductivity ty Detector).
D.3-2
SEMINAR NASIONAL L TEKNIK KIIMIA SOEBA ARDJO BROTOHARDJO ONO IX Program Stu udi Teknik Kimia UPN “V Veteran” Jawaa Timur Surabayya, 21 Juni 20012 III. HA ASIL DAN PE EMBAHASAN N Hidroliisis enzimatik S Sebelum dilakuukan hidrolisiss enzimatik, teerlebih dulu dillakukan pretreeatment pada jerami padi yanng meliputti pretreatmennt secara fisika (mereduksi ukuran jeram mi hingga 100--120 mesh) dan d pretreatmeent kimiaw wi (menggunak kan NaOH 1%)). Tujuan prettreatment fisikka untuk memppermudah degrradasi enzimattik oleh ennzim selulase, karena ukurann yang kecil aakan memperluuas permukaann kontak antarra enzim denggan substratt sehingga mem mpermudah en nzim dalam m mendegradasi jeerami padi menjadi gula redduksi. Sedangkkan pretreatment kimiawii untuk merussak lignin, sehhingga enzim yang y digunakaan untuk meng ghidrolisis dappat wa mencappai rantai yang diinginkan yaitu hemiselulosa dan selulosaa. Dari analisa chesson diperooleh hasil bahw terjadi penurunan kaandungan ligniin jerami paddi setelah penggolahan awal dari 16,84% menjadi 9,43% %, kan kandungann hemiselulosaa dan selulosaa masing- massing naik dari 32,69% menjjadi 36,23% dan d sedangk 45,94% % menjadi 54,133%. J Jerami padi haasil pretreatmennt digunakan ssebagai substraat untuk hidrollisis. Hidrolisiss dilakukan paada kondisi pH 3 dan su uhu 600C, sepeerti yang dilakkukan pada pennelitian kami sebelumnya bahwa b ini adallah kondisi optimum untuuk hidrolisis jeerami padi. Padda hidrolisis ini, hemiselulosaa dan selulosa didegradasi olleh enzim selulase s dan xylanase yang dihasilkan d A. niger n maupun T. reesei mennjadi glukosa dan d xylosa (guula reduksi). Hidrolisis seelulosa terdiri dari dua tahapp, yaitu degrad dasi selulosa menjadi m selobioosa oleh endo--β1,4-gluk kanase dan ekkso-β-1,4 glukkanase kemuddian dilanjutkaan dengan pem mecahan selobbiosa oleh β-11,4 glukosidase menjadi glukosa. Gam mbar 1 menunj njukkan konsen ntrasi gula redduksi hasil hidrrolisis enzimattik padi meenggunakan beeberapa macam m enzim. Dapat dilihat bahw wa hidrolisis m menggunakan enzim e komersial A.nigerr menghasilkan n gula reduksi paling p baik, koonsentrasi gula reduksi yang ttertinggi yaitu 13,02 g/L dalaam waktu 42 jam. Perollehan gula red duksi ini lebihh baik dari ennzim atau cam mpuran enzim m yang lain juuga bkan adanya aktivitas a yang tinggi dari A..niger, sehinggga makin tingggi pula gula yang y dihasilkaan. disebab Ditunju ukkan pula pad da gambar terseebut bahwa konnsentasi gula reduksi yang diihasilkan pada hidrolisis jeram mi padi oleeh tiap enzim berbeda meskkipun konsentraasi enzim dalaam larutan sam ma, yaitu 93 U// 5g jerami paddi. Hal ini dapat disebbabkan kompoosisi masing-m masing dari 3 komponen enzim, yaitu eksoglukanasse, endogluukanase, selobiiohidrolase dan n β glukosidase berbeda. Karrena strainnya juga j berbeda. O Oleh karena enzim e komersiial dari A.nigeer menghasilkaan konsentrasii gula reduksi tertinggi, maaka untuk proses p fermenntasi selanjutnyya dipakai hiddrolisat jeramii padi menggunakan enzim m komersial daari A.nigerr dan didapatkaan yield 0,39 g gula reduksi/ g jerami padi.
1 Konsentrasi glukosa oleh bberbagai jenis enzim e pada hiddrolisis jerami padi p ntasi Gambar 1. Fermen K Konsentrasi subbstrat awal (guula reduksi) yaang digunakan untuk fermentasi sebesar 6 g/L. g Gula redukksi ini merrupakan hasil hidrolisis h jeram mi padi oleh ennzim komersiaal A. niger. Ferrmentasi hidro ogen oleh bakteeri E.aeroggenes NBRC 15354 1 dilakukaan pada kondissi pH 6 dan temperatur 300C. C Bakteri E.aaerogenes NBR RC 15354 merupakan m bakkteri anaerob fakultatif, f olehh karena itu seebelum diinokuulasikan bakterri, substrat perrlu diflushiing menggunakkan N2 untuk menghilangkaan oksigen yan ng terlarut dalaam substrat maupun m yang ada a pada heeadspace reakttor. pH meruppakan faktor peenting dalam proses p fermenttasi. pH memp pengaruhi prosses metabolisme sel daalam mempro oduksi hidrogeen. pH 6 baik b untuk peertumbuhan sel s E.aerogennes
D.3-3
SEMINAR NASIONAL L TEKNIK KIIMIA SOEBA ARDJO BROTOHARDJO ONO IX Program Stu udi Teknik Kimia UPN “V Veteran” Jawaa Timur Surabayya, 21 Juni 20012 (Converti,2002). pH 6 dijaga dengaan menggunakkan larutan bufffer sitrat dalaam substrat serrta di tambahkkan NaOH 4 M jika terjad di sedikit penurrunan pH selam ma fermentasi berlangsung. b H Hidrogen oleh bakteri E.aeroogenes NBRC 15354 dihasilk kan melalui duua jalur (pathwa ay) yaitu NAD DH pathwayy dan format pathway. Gluukosa yang terrkandung di dalam d substrat diubah menjaadi asam piruvvat melaluii proses glikoliisis menghasilk kan 2 NADH ddan 2 ATP. Dallam kondisi annaerob, sebagiaan piruvat diubah oleh ennzim piruvatte format lyasse (PFL) mennghasilkan asaam format dann asetil coenzzym-A (AcCoaa). Selanjuutnya AcCoa diubah d menjadii asam asetat dan d etanol. Sebbagian piruvatt yang lainnyaa diubah menjaadi asam laaktat. Selain itu u, sel juga memproduksi asaam suksinat. Seelanjutnya form mat dapat diubbah menjadi gas g hidrogeen dan CO2. Hal H tersebut dikkenal dengan sebutan formaat pathway. Paada NADH paathway, hidroggen dapat dievolusi d dari NADH yang telah t mengalaami proses okssidasi dengan melepaskan proton H+ . Yieeld maksim mum yang bisaa diperoleh denngan bakteri faakultatif adalahh 2 mol H2/mool glukosa dari format pathw way dan 2 mol m H2/mol glu ukosa dari NAD DH pathway (M Mathews dan Wang., W 2009). Gambar 2 meenunjukkan terrjadinya penurrunan konsentrrasi gula redukksi seiring deng gan penambahhan mbat sampai jaam jumlah kumulatif hidrrogen yang dihhasilkan. Ditunnjukkan pula baahwa produksii gas sangat lam k terjaddinya kenaikan n secara tajam jjumlah hidrogeen dari jam 24 ke jam 30. Hal ini dikarenakkan ke 24 kemudian pada aw wal fermentasi gas masih terjjebak dalam laarutan, dapat dilihat d dari geleembung gas yaang terakumulaasi dalam fermentor. Keemudian dapat terlepas padaa jam 24. Gam mbar 3 menuunjukkan terjaddinya penurunnan me sel menyebaabkan penurunnan konsenttrasi gula reduuksi seiring denngan penambaahan jumlah seel. Metabolism konsenttrasi substrat.
Gambar 2. Perubahan P konnsentrasi gula reduksi r dan konnsentrasi H2 terrhadap waktu fermentasi f
Gambar 3. 3 Perubahan konsentrasi k gulaa reduksi dan jumlah sel terhaadap waktu ferrmentasi IV.
KESIMPULA K AN D penelitiann yang dilakukkan dapat disim Dari mpulkan bahwaa produksi hidrrogen dari jeraami padi melallui h hidrolisis enzim matik dan ferm mentasi dapat dilakukan mellalui pengembangan metode yang sederhaana d dengan yield gula reduksi sebbesar 0,39 g guula reduksi/g jerami padi serrta yield hidrogen sebesar 0,226 m mmol H2/ mm mol gula reduksii.
D.3-4
SEMINAR NASIONAL L TEKNIK KIIMIA SOEBA ARDJO BROTOHARDJO ONO IX Program Stu udi Teknik Kimia UPN “V Veteran” Jawaa Timur Surabayya, 21 Juni 20012 D DAFTAR PUS SATAKA 11. Anwar, N.., Widjaja, A., Winardi, S., ““Study of The Enzymatic Hyydrolysis of Allkaline Pretrietted Rice Strow w Using Cellu ulase of Varioous Sources annd Compositioons”, Internatiional Review of Chemical Engineering E V 3.N.2. Marrch 2011 Vol. 2 Chen, W.H 2. H., S.Y. Chenn, S.K. Khanaal, S.Sung (200 06), “Kinetic S Study of Biolo ogical Hydroggen Production n by Anaerobicc Fermentationn”, Internation nal Journal of Hydrogen H enerrgy, Vol. 31, pp. p 2170-21788. 3 Converti,A 3. A., P.Parego (2 2002), “Use of Carbon and En nergy Balancess in the Study of o the Anaerobbic Metabolism m of Enterobbacter aerogennes at Variable Starting G Glucose Conceentrations” Apppl Microbiol Biotechnol, Vol.59, pp.303––309 4 Kotay, S.M 4. M., D. Das (22006), “Microbbial hydrogen production wiith Bacillus cooagulans IIT-B BT S1isolated d from anaerobiic sewage sluddge”, Bioresourrce Technologyy, Elsevier. 5 Kumar, N.., D. Dass (20000), “Enhancem 5. ment of Hydroogen Production by Enterobaacter cloacae IIITBT 08”, Prrocess Biochem mistry 35, 589––593. 6 Lin, C.Y.,, C.H Hung, C.H Chen, (22006),” Effects of initial cuultivation pH on fermentatiive 6. hydrogen production p froom xylose usinng natural mixeed cultures”, P Process Biocheemistry, Vol. 41, 4 pp. 1383–1 1390. 7 Matthews,,J., G,Wang (2009),” 7. ( Metaabolic pathwaay engineeringg for enhanced biohydroggen productionn”, Internationaa Journal of Hyydrogen Energy y, Vol 34, pp 7404 7 – 7416. 8 Nakashimaada, Y., M.A.. Rachman, T. Kakizono, N. 8. N Nishio (20002), “Hydrogeen Production of Enterobactter Aerogenes Altered by E Extracellular annd Intracellulaar Redox Statees”, Internationnal Journal of Hydrogen Eneergy 27 (2002) 1399 – 1405. 9 Nath, K, . D. Das (2004), “Improvvement of Feermentative Hydrogen 9. H Prodduction: Varioous Approachees”, Appl Micrrobiol Biotechnnol, 65: 520–5229. 1 Ogino, H.,, T. Miura, K. Ishimi, 10. I M. Sekki, H. Yoshida (2005), “Hydrrogen Productio on from Glucoose by Anaero obes”, Biotechnnology Proggreess, Vol. 21, ppp. 1786–1788. 1 Prakasham 11. m, R., P. Brahm maiah (2009), “ Fermentativ ve biohydrogenn production by mix anaerobbic consortia: Impact of gluccose to xylose rratio”, Hydroggen Energy 34, 9354-9361. 1 Ren, Yun 12. nli., Jianji Waang, “Hydrogeen production from monom meric sugar hydrolyzed h froom hemicellulloses by Enteroobacter aerogeenes,Int Journaal of Renewablee Energy 2009 9;34: 2774-2779. 1 Ruggeri, B. 13. B (2008), “Expperimental kinnetics and dynaamics of hydroogen productio on on glucose by b hydrogen forming bacterria (HFB) cutuure”, Internatioonal journal off Hydrogen Ennergy, vol.34, pp p 753-763 1 Thauer, R.. (1977), “Lim 14. mitation of micrrobial H2 form mation via ferm mentation” .In H.G. H Schlegel, & J. Barnea (Eds.), ( Microbiial energy convversion, (pp. 201–204). New York: Pergam mon Press. 1 Widjaja, Arief 15. A (2009), “A Aplikasi Biotekknologi pada Inndustri Pulp daan Kertas”, itsppress, Surabayaa. 1 Yokoi, H. A. Saitsu , H. Uchida, J. Hrrose, S. Hayashhi, Y. Takasakki (2001) “Miccrobial Hydroggen 16. n from Sweet Potato P Starch Residue”, Journal of Bioscieence and Bioeengineering, Vool. Production 91, No. 1, 58-63. 1 Zhang, H., M.A. Bruns,, B.E. Logan (2006), “Biolo 17. ogical Hydroggen Productionn by Clostridiuum asetobutyliicum in an Unssaturated Flow w Reactor”, Waater Research, Vol. V 40, pp 7288 – 734.
D.3-5
