Módszer az ASEA-ban™ található reaktív molekulák ellenőrzésére
Az ASEA-ban™ található reaktív molekulák egy komplex szabadalmaztatott elektrokémiai folyamat, mely csökkenti és oxidálja az alap sóoldatot, melynek eredménye számos ismert reaktív molekula egyensúlyi helyzete. Ezek a reaktív molekulák stabilak és standard analitikai módszerekkel mérhetők az ASEA-ban™. Az ilyen reaktív molekulák azonosak az élő sejtekben természetes úton termelődő ilyen molekulákkal, melyek jelenlétét sikeresen mérték az elmúlt 30 évben bizonyos fluoreszcens színezékek, mint indikátorok használatával. Az ASEA-ban™ található reaktív molekulák ellenőrzése rendszeresen történik három standard fluoreszcens indikátor használatával, név szerint Rphycoerithrin (RPE), Aminophenyl fluorescein (APF) és Hydroxyphenil fluorescein (HPF). Ezek a fluoreszcens molekulák fizikailag megváltoztatják alakjukat (és fényességüket, amikor érintkezésbe
lépnek specifikus reaktív molekulákkal. Ezek a konform változások erősítik vagy csökkentik az indikátorok fluoreszcenciáját bizonyos meghatározott fényfrekvencián. A fluoreszcenciának ezt a változását mérik fluorospektrométerrel, ami az indikátorok által kibocsátott fényspektrum intenzitását méri. Az indikátorok leírása A két új eredeti szonda, az Aminophenyl fluorescein (APF) és Hydroxyphenil fluorescein (HPF) melyeket Tetsuo Nagano et al (1) fejlesztett ki, szelektívek az erősen reaktív oxigén fajok (hROS) detektálásában. Mind a két szonda alacsony reaktivitást mutat a ROS egyéb formáival szemben. A vizsgálat alapelve: konform változások az APF-ben és HPF-ben molekulák fluoreszcens tulajdonság változások.
alig fluoreszcens erősen fluoreszcens Phycobiliprotein fluoreszcens színezék színkép jellemzői
Fluor
Molekulatömeg
Gerjesztés max
Kibocsátás max
(nm)
(nm)
R-Phycoerytrin (RPE)
240,000
480, 545, 565
578
1. ábra A három, az ASEA-ban™ található reaktív molekulák koncentrációjának mérésére szolgáló indikátor leírása. Az alul található táblázat az R-PE alapvető tulajdonságait sorolja fel. Az indikátorokban bekövetkező változások a reaktív molekuláknak történő expozíció előtt és után, jelzik az ilyen reaktív molekulák létezését. A három indikátor mindegyike egy-egy specifikus reaktív molekulára érzékeny. Ezek az indikátor színezékek mindegyike nagyon rezisztens a hibás pozitív jelzésekre, és ezt nagy mélységekig tanulmányozták.
Az ASEA, LLC a Thermo Fischer Scientific által gyártott Nanodrop™ 3300 fluorospektrométert és magasan képzett analitikusokat alkalmaz, hogy rutinszerűen mérhessék az egyes tétel ASEA-ban™ található reaktív molekulák mennyiségét. Egy a helyszínen működő független laboratórium majdnem mindennapos rutin alapján használja az ASEA™ expozíciónak kitett fluoreszcens indikátorok valamelyikét, így mérve az ASEA-ban™ található reaktív molekulák koncentrációját.
A Minőségbiztosítási folyamat részeként, az ASEA™ „Gold Standardban” a reaktív molekulák koncentrációját folyamatosan mérik mindegyik mintában. Azok a tételek, melyekben nincs meg a Gold Standardnak megfelelő reaktív molekula koncentráció, azok megsemmisítésre kerülnek. Ezzel szemben a kiindulási alapnak tekintett sósoldat soha nem mutatott mérhető reaktív molekula koncentrációt, a szabadalmaztatott elektrokémiai folyamat végrehajtása előtt.
A 2. ábra egy Nanodrop 3300 kalibrációjáról készült screen-shot, mely mutatja az R-PE indikátor reakcióját a különböző ASEA koncentrációkra. A különbségek a reaktív molekula koncentrációknál egyértelműen láthatók a görbéken. Három mérést végeznek mindegyik mintakoncentráción a megfelelő konzisztencia biztosítása érdekében. A kontroll alap kiindulási sósoldat nem mutat semmiféle fluoreszcenciát, jelezve, hogy reaktív molekulák nincsenek az alap sósoldatban. Ahogy (a kiindulási sósoldatban oldott) ASEA™ koncentrációja emelkedik, a fluoreszenciában történő változás is egyre nagyobb.
2. ábra: Screenshot, mely bemutatja az R-PE indikátor reakcióját az ASEA™ különböző koncentrációjánál, 15 önálló mérés (mintánként 3 mérés) eredményei lettek egymásra vetítve. A screenshot 2008 áprilisában egy
tesztmérésen készült. A sósoldat nem vált ki reakciót és az öt különböző ASEA koncentráció egyértelműen meghatározott eredményeket mutat. A 2. ábrán bemutatott görbék magassága jelzi az egyes mintákban található reaktív molekulák mennyiségét. Mindenegyes tételt a „Gold Standardnak” megfelelően mérnek. Így az ASEA™ mindegyik tétele garantáltan tartalmazza a reaktív molekulák megfelelő mennyiségét és egyensúlyát. A Minőség Ellenőrző laboratóriumban a legmagasabb tudományos kiválóságnak
