-1-
MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY: POKROČILÉ PRAKTICKÉ VZDĚLÁVÁNÍ V EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGII Operační program Vzdělávání pro konkurenceschopnost Číslo projektu: CZ.1.07/2.3.00/09.0046
Praktický kurz základních metod experimentální biologie
konaný na Katedře biologie a ekologie Přírodovědecké fakulty Ostravské univerzity v Ostravě v termínu 28. 5. – 1. 6. 2012
-2-
Program praktického kurzu 28. 5. – 1. 6. 2012
9 - 10
dopoledne
odpoledne
Pondělí 28. 5
Úterý 29. 5.
Přednáška - mikrobiologie
Přednáška – transformace Přednáška – bakterií plasmidovou DNA. elektrochemie nukleových kyselin
Mikrobiologie: Disimilační Mikrobiologie: aktivita mikrooorganismů. vyhodnocení výsledků. Specifické metody barvení . mikroorganismů.
Izolace DNA pomocí kolonek. Spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty.
Středa 30. 5.
Elektroaktivita a povrchová aktivita NK, vliv struktury NK; denaturace DNA v roztoku a na povrchu elektrody, předdenaturační přechody. Analýza poškození DNA pomocí elektrochemických metod.
Transformace buněk Detekce poškození DNA. plasmidovou DNA. Selekce buněk s rekombinantním plasmidem.
Čtvrtek 31. 5.
Pátek 1. 6.
Přednáška – restrikční štěpení
Přednáška + praktické ukázky – zásady správného pipetování
Restrikční štěpení plasmidové DNA, elektroforéza restrikčních fragmentů.
Imunodetekce proteinů na membránách.
Polyakrylamidová gelová elektroforéza proteinů Barvení gelu Elektroforetický přenos proteinů z gelu na membránu.
Vyhodnocení výsledků, hodnocení kurzu účastníky.
-3-
Téma: Disimilační aktivita mikroorganismů Metabolismus (látková přeměna) představuje soubor vzájemně na sebe navazujících oxidoredukčních reakcí, které probíhají v určitém prostoru buňky a v konkrétním čase. Termín „metabolismus“ byl prvně uveden v roce 1839 německým přírodovědcem Theodorem Schwannem (1810-1882). Metabolismus mikroorganismů se podobně jako u všech ostatních živých jedinců rozděluje na dvě základní větve: anabolismus (zahrnující procesy biosyntézy za spotřeby energie) a katabolismus (rozkládání, degradace složitějších sloučenin v buňce na látky jednodušší za tvorby energie ). Metabolická dráha představuje řetězec enzymaticky katalyzovaných chemických reakcí, ve kterých buď dochází k výstavbě složitějších molekul z jednodušších látek, nebo naopak k jejich rozkládání. Následující experimentální úlohy jsou zaměřeny na praktické osvojení si některých základních biochemických testů, jimiž je zjišťována schopnost mikroorganismů syntetizovat určité enzymy.
Úkol č. 1: Fermentace sacharidů Princip: Fermentací sacharidů testovaným mikroorganismem vznikají různé organické látky. Důsledkem metabolické činnosti dochází k hromadění kyselin v kultivačním médiu, což se projeví posunem hodnoty pH do kyselé oblasti a dojde ke změně barvy indikátoru přidaného do média. Rozklad cukrů může probíhat za tvorby plynu nebo bez tvorby plynu. Tvorba plynu se obvykle prokazuje přidáním malých plynovek (Durhamovy zkumavky) do tekutého média, v nichž se během kultivace shromažďují bublinky CO2. Materiál a pomůcky: A. Mikroorganismy: Escherichia coli, Alcaligenes faecalis, Enterobacter aerogenes, Proteus vulgaris B. Média a chemikálie: tekutá živná média pro fermentaci sacharidů (s glukózou, sacharózou, fruktózou, laktózou a manózou, indikátor – bromthymolová modř) C. Laboratorní vybavení: Pipety, očkovací klička, plynovky, zkumavky, stojany na zkumavky, termostat, kahan
Obr. Fermentace sacharidů (fenolová červeň jako indikátor) (převzato z Harley-Prescott 2002). Pozn. V našem testu bude jako barevný indikátor použita bromthymolova modř a změna zbarvení bude z modré na žlutou
-4-
Postup: 1. Fermentační zkumavky s tekutým médiem a plynovkami zaočkujte pomocí kličky čistou 24 hod. kulturou testovaného mikroorganismu. Jednu zkumavku ponechte nezaočkovanou. 2. Naočkované zkumavky kultivujte 24 hodin při 35 °C. 3. Po kultivaci zhodnoťte růst kultur, změnu zbarvení média a tvorbu plynu. Naočkované zkumavky porovnejte s nezaočkovanou fermentační zkumavkou. 4. V případě pozitivního výsledku dojde ke změně modrozeleného zbarvení média na žluté. U negativních výsledků nedochází ke změně zbarvení média. Hodnocení výsledků: 1. Všechny zkumavky vyhodnoťte a na základě zjištěných výsledků doplňte následující tabulku.
Růst Escherichia coli
24 hod. 48 hod.
Enterobacter aerogenes
24 hod. 48 hod.
Alcaligenes faecalis
24 hod. 48 hod.
Proteus vulgaris
24 hod. 48 hod.
Sacharidy Laktóza
Glukóza
Mikroorganismus
Barva
Zbarvení nezaočkovaného média:
Kys.
Plyn
Růst
Barva
Kys.
Sacharóza Plyn
Růst
Barva
Kys.
Plyn
-5-
Úkol č. 2: Test tvorby sirovodíku (TSI TEST) Princip: Mikroorganismy mohou tvořit sirovodík z různých zdrojů. Mohou to být aminokyseliny (cystein) i anorganické látky obsahující síru (sulfáty, thiosulfáty, sulfity). Reakce na H2S z organických látek je většinou málo průkazná, neboť běžné komponenty kultivačních médií jsou na síru chudé a proto vzniká i málo H2S. Proto se používají pro diferenciaci mikroorganismů kultivační média obsahující sirné anorganické látky. Bylo prokázáno, že mechanismus tvorby H2S z organických látek je zcela odlišný od procesu tvorby H2S z anorganických komponent, je proto důležité výsledky testů srovnávat pouze za podmínky použití stejného kultivačního média. Jako kultivační médium se používá médium TSI (tvorba sirovodíku je indikována železnatými solemi, které vytvářejí po reakci se sirovodíkem černé sulfidy železa).
Obr. TSI test (převzato z Harley-Prescott 2002) a-nezaočkovaná zkumavka, b-žluté zbarvení povrchu i agaru živného média (tvorba kyselin), tvorba plynu, absence tvorby sirovodíku, c-červené zbarvení povrchu i agaru média (alkalické prostředí), tvorba sirovodíku, absence plynu, d- červené zbarvení povrchu média (alkalické prostředí), žluté zbarvení média (tvorba kyselin), tvorba sirovodíku, absence plynu
Materiál a pomůcky: A. Mikroorganismy: Escherichia coli, Alcaligenes faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris B. Média a chemikálie: Triple-Sugar-Iron agar (TSI) C. Laboratorní vybavení: Očkovací klička, zkumavky, stojany na zkumavky, termostat, kahan Postup: 1. Čistá kultura testovaného mikroorganismu se naočkuje na připravený šikmý agar (vpichem podél stěny zkumavky, nátěrem na šikmý agar). Jednu nezaočkovanou zkumavku se šikmým agarem použijte jako kontrolu.
-62. Zkumavky se kultivují při teplotě 35 °C 18-24 hodin (případně až 48 hodin pro tvorbu sirovodíku). 3. V případě pozitivního výsledku dojde jednak k tvorbě černého sirovodíku (tvoří se kolem vpichu, případně u dna zkumavky), jednak ke změně barvy živného média na žlutou. Také je sledována tvorba plynu. 4. U negativního výsledku nedojde u kultivačního média po kultivaci k žádným změnám. Hodnocení výsledků: 1. Zkumavky vyhodnoťte a na základě zjištěných výsledků doplňte následující tabulku. Při pozorování zkumavek si všimněte zbarvení agaru, přítomnosti či absence černého zbarvení kultivačního média, přítomnosti či nepřítomnosti tvorby plynu. Fermentace cukrů Mikroorganismus
Zbarvení agaru
Tvorba plynu (+/-)
Produkce sirovodíku Zbarvení (+/-)
Escherichia coli Alcaligenes faecalis Pseudomonas aeruginosa Proteus vulgaris Zbarvení nezaočkovaného média: Poznámka: Zežloutnutí média pouze kolem vpichu bývá s největší pravděpodobností způsobeno štěpením glukózy. Vzhledem k jejímu malému obsahu v médiu jsou kyseliny, vznikající štěpením glukózy u povrchu média , dále vlivem vzdušného kyslíku odbourávány, takže zde nemůže dojít ke změně hodnoty pH. V případě, že je organismus schopen štěpit i laktózu, které je v médiu 10x více, nestačí se kyseliny u povrchu média odbourávat a proto dojde k poklesu hodnoty pH i u povrchu média. Výsledkem je zežloutnutí média i zde.
-7-
Úkol č. 3: Hydrolýza škrobu Princip: Amylolytické bakterie vytvářejí amylolytické extracelulární enzymy – amylázy, kterými ve vnějším prostředí katalyzují hydrolýzu škrobu a substrátů s vyšším obsahem škrobu. Škroby jsou významnými polysacharidy. Skládají se obvykle asi z 20 % amylózy a 80 % amylopektinu. Amylolytické bakterie stanovujeme na tzv. škrobovém agaru. Po naočkování a příslušné inkubaci se miska přelije roztokem Lugolova činidla z jodu a jodidu draselného. Kolem kolonií produkujících amylázy se vytváří bezbarvá průhledná zóna. Amylázy tvoří zejména zástupci rodů Bacillus a Clostridium a rovněž některé plísně. Materiál a pomůcky: A. Mikroorganismy: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Proteus vulgaris B. Média a chemikálie: Škrobový agar Lugolův roztok C: Laboratorní vybavení: Petriho misky, pipety, očkovací klička, zkumavky, stojany na zkumavky, termostat, kahan Postup: 1. Na Petriho misku se škrobovým agarem si na spodní straně fixem vyznačte tři vodorovné čáry. 2. Každou část misky zaočkujte rovnou čárkou testovanou bakteriální kulturu. 3. Misku inkubujte 24 až 48 hodin při 35 °C. 4. Po inkubaci zakapejte povrch živné půdy s narostlou kulturou Lugolovým roztokem. 5. Pozorujte, zda dochází k hydrolýze škrobu, což se projeví vznikem nezbarvených zón kolem rostoucí kultury – test je pozitivní. Půda s nerozloženým škrobem se zbarví modře – test je negativní. 6. Pozor: Modré zbarvení škrobu po určité době mizí, proto výsledky odečítejte okamžitě. Hodnocení výsledků: 1. Petriho misku vyhodnoťte a na základě zjištěných výsledků doplňte následující tabulku. Hydrolýza škrobu Zbarvení média okolo kolonií Mikroorganismus Růst po přidání Lugolova roztoku (+/-) Bacillus subtilis Proteus vulgaris
-8-
Escherichia coli
Téma: Mikroskopování kvasinek Úkol č. 1: Test vitality Princip: Test využívá semipermeability cytoplazmatické membrány. Živé buňky mají zbarvenu pouze buněčnou stěnu, proto se jeví jako světle modré. Mrtvé buňky jsou zbarveny intenzívně modře, neboť jejich membránový systém je narušen. Pro kontrolu vybarvení mrtvých buněk připravujeme vedle vitálně barveného preparátu také preparát barvený po fixaci plamenem. Materiál: Podložní a krycí sklo, methylenová modř, klička, pipety, filtrační papír, mikroskop. Kultury: Saccharomyces cerevisiae Postup: 1. Z pekařských kvasnic připravíme ve zkumavce se sterilní destilovanou vodou řídkou suspenzi. 2. Pipetou přeneseme kapku methylenové modři na podložní sklíčko. 3. Kápneme malou kapku kultury. 4. Ihned přikryjeme krycím sklem. Pokud se nám zdá preparát málo zbarven, lze k hraně krycího skla přikapávat barvivo, přičemž z druhé strany jej odsáváme proužkem filtračního papíru. 5. V 10 zorných polích spočítáme počet živých a mrtvých buněk. POZOR! Pracujte rychle, celková doba barvení by měla trvat jen 3 minuty. Přesáhne-li 5 minut, barvivo působí toxicky a všechny buňky budou sytě modré. 6. Připravíme ze suspenze kvasinek ještě jeden preparát. Mikroorganismy v nátěru fixujeme v plameni poněkud déle, aby došlo k úhynu buněk (pozitivní kontrola). 7. Barvíme a mikroskopujeme stejně jako v předchozím případě. Hodnocení výsledků:
Zakreslete obraz pozorovaný v jednom zorném poli.
Vypočítejte % mrtvých kvasinek.
-9-
Úkol č. 2: Měření velikosti buněk kvasinek Princip: Velikost mikroorganismů, tj. šířka a délka buněk, fruktifikačních orgánů, spór a některých buněčných organel, patří k diagnostickým znakům mikroorganismů. Jestliže za stejných podmínek zjistíme, že velikost buněk téže kultury kolísá, stanovíme maximální a minimální hodnoty a jako výsledek uvedeme variační rozpětí (např. 0,4 – 1,2 µm x 3,0 – 6,5 µm). K přesnému zhodnocení velikosti bychom museli proměřit 100 až 200 buněk příslušné kultury. Materiál: Mikroskop, objektivový a okulárový mikrometr, podložní a krycí sklo, methylenová modř, klička, filtrační papír. Kultury: kultura Saccharomyces cerevisiae Postup: 1. Připravíme preparát dle úlohy č. 1. 2. Měření provádíme pomocí objektivového a okulárového mikrometru. Postupujeme tak, že před vlastním měřením seřídíme stupnice objektivového a okulárového mikrometru tak, aby obě stupnice ležely v zorném poli rovnoběžně a jejich počátky se ztotožnily. Pak zjistíme, kolik dílků objektivového mikrometru odpovídá dílkům okulárového mikrometru. Odpovídající dílky se musí přesně krýt.
Okulárový mikrometr
Objektivový mikrometr
3. Vypočteme hodnotu okulárového dílku (H) pro dané zvětšení podle vzorce:
H=
dílky objektivové x 10 dílky okulárové
- 10 4. Při vlastním měření se objektivový mikrometr nepoužívá. Tzn., že ho musíme vyjmout a místo něj umístíme připravený preparát. Pozor! S mikrometrem manipulujte velmi opatrně, ihned jej řádně uložte, aby se nepodřel, neztratil nebo nerozbil! 5. Jednotlivé buňky umístíme do středu zorného pole a natočíme na ně okulárový mikrometr tak, aby bylo možné odečíst délku v dílcích (desetiny dílku odhadujeme). 6. Otáčením okuláru o 90° lze pak stejným způsobem odečíst šířku buňky. 7. Proměříme větší počet buněk a průměrné hodnoty v dílcích se pronásobí zjištěnou hodnotou dílku (H) pro určité zvětšení a výsledky se převedou na µm. Hodnocení výsledků: Proveďte měření velikosti buněk kvasinek. Změřte 10 buněk v daném preparátu. Hodnoty zapisujte do tabulky. Dílky přepočtěte na µm. Buňka 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Variační rozpětí
Délka buňky (µm)
Šířka buňky (µm)
V závěru se zkuste zamyslet nad příčinami možných rozdílů ve velikosti buněk jedné kultury. Uveďte, čím mohou být způsobeny.
Úkol č. 3: Barvení glykogenu a bílkovin Princip: Glykogen je důležitá rezervní látka v buňkách mikroorganismů. Buňky v optimálních podmínkách růstu mohou obsahovat až 20 % glykogenu. Rychlost tvorby glykogenu je závislá na podmínkách prostředí a jeho obsah v buňce je v určitém poměru k bílkovinám. Množství glykogenu je nepřímo úměrné množství bílkovin v buňce. Podle množství glykogenu posuzujeme fyziologický stav kultury. Materiál: Mikroskop, podložní a krycí sklo, Lugolův roztok, pipety, filtrační papír. Kultury: třídenní kultura Saccharomyces cerevisiae
- 11 -
Postup: 1. Na čisté a suché podložní sklíčko přeneseme malou kapku suspenze kvasinek. 2. Přikápneme kapku Lugolova roztoku, promícháme a přikryjeme krycím sklíčkem. 3. Mikroskopujeme za použití imerze. Hodnocení výsledků:
Obraz preparátu zakreslete:
Zhodnoťte množství glykogenu v kultuře: Žlutě zbarvené části plazmy dokazují přítomnost bílkovin, hnědé a hnědočervené zbarvení nasvědčuje přítomnosti glykogenu. Všimněte si pučících buněk, v pupenech se glykogen nevyskytuje - starší buňky obsahují poměrně velké množství glykogenu.
Proveďte důkaz rozpustnosti glykogenu: Podložní sklíčko se zbarveným preparátem zahřejte nad plamenem – hnědé zbarvení zmizí, po opětovném zchlazení se znovu objeví (je potřeba pracovat co nejrychleji – po zahřátí sklíčka ihned pozorovat s imerzí).
- 12 -
Téma: Barvení buněčných organel a struktur Úkol č. 1: Barvení pouzder Materiál: Podložní sklo, klička, pipety, mikroskop, pinzety, filtrační papír, Kongo červeň, roztok Maneval´s. Kultury: 24 hod. kultury Enterobacter aerogenes, E. coli, Proteus vulgaris Postup práce: 1.
Na konec podložního sklíčka umístíme kapku Kongo červeně.
2.
Kličkou přeneseme inokulum a rozmícháme.
3. Hranou dalšího podložního skla rozetřeme kapku do tenkého filmu po celé ploše podložního skla. 4.
Nátěr necháme zaschnout na vzduchu (nefixujeme teplem).
5.
Nátěr převrstvíme Maneval´s roztokem, necháme působit 1 min.
6.
Opláchneme tekoucí vodou a osušíme.
7.
Mikroskopujeme za použití imerze.
Hodnocení výsledků:
Vegetativní buňky jsou zbarveny modře (červeně)
Pouzdra vytvářejí bílé prstence kolem buněk.
Zakreslete pozorovaná pouzdra. Srovnejte vzájemně všechny kmeny.
- 13 -
Úkol č.2: Barvení spor Bakteriální spory se vyznačují velmi špatnou barvitelností. K jejich obarvení je proto nutné použít metod agresivního barvení založeného na barvení koncentrovanými barvivy za horka. Materiál: Podložní sklo, klička, pipety, mikroskop, pinzety, filtrační papír, malachitová zeleň, mafranin. Kultury: 24 hod. a 1 týdenní kultury Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus cereus. Postup: 1. Připravíme si nátěry z 24 hod. a z 1 týdenní kultury a bez fixace je usušíme. 2. Na nátěr umístíme filtrační papír a nakapeme na něj roztok malachitové zeleně. 3. Sklíčko opatrně zahříváme 10 minut až do odpařování barviva, ale barvivo nesmí vřít, přitom však barvivo průběžně doplňujeme. 4. Po skončení barvení filtrační papír odstraníme a preparát opláchneme tekoucí vodou. 5. Převrstvíme vodným roztokem safraninu a barvíme 30 sekund. 6. Znovu opláchneme a po zaschnutí pozorujeme imerzním objektivem. Hodnocení výsledků: Spory pozorujeme zbarvené zeleně, vegetativní buňky červeně.
Zakreslete mikroskopický obraz.
Stanovte typ pozorovaných spor.
Stanovte % sporulujících buněk v 10 zorných polích.
- 14 -
Rozlišení jedno a dvouřetězcové DNA pomocí AC voltametrie , detekce hybridizace oligonukleotidů na uhlíkové elektrodě Princip metody AC voltametrie (ACV) patří mezi voltametrické metody se střídavou složkou potenciálu. U této metody se na elektrodu vkládá lineárně se měnící potenciálová rampa. Na ni je superponováno střídavé napětí sinusového průběhu o malé amplitudě (10 mV) a nízké frekvenci (desítky až stovky Hz). Měří se závislost střídavého proudu procházejícího elektrodou na jejím potenciálu. DNA poskytuje v ACV řadu signálů. Některé z nich jsou citlivé ke změnám struktury DNA. Dvouřetězcová (ds) a jednořetězcová (ss) DNA poskytují pík 1, který je způsoben adsorpcí/desorpcí cukrfosfátové kostry. Ds DNA dále poskytuje pík 2 v důsledku adsorpce/desorpce zdeformovaných ds úseků. Ss DNA poskytuje pík 3, který je způsoben adsorpcí/desorpcí zbytků bází v jednořetězcových úsecích. Rozdílů v ACV záznamech lze využít pro rychlé rozlišení ss a ds DNA. Adsorptivní rozpouštěcí voltametrie je založena na užití adsorptivního nahromadění analytu z roztoku na povrchu pracovní elektrody. Naadsorbovaný analyt je pak v dalším kroku – voltametrickém scanu – rozpuštěn zpět do roztoku základního elektrolytu. Tím se o několik řádů zvýší detekční limit. Při adsorptivní přenosové rozpouštěcí voltametrii je analyt nahromaděn na povrchu elektrody (analyt se musí adsorbovat ireverzibilně) z malé kapky vzorku (3-5 l), poté je elektroda s naadsorbovanou vrstvou omyta a přenesena do roztoku základního elektrolytu. Zde pak probíhá samotné elektrochemické měření. Díky aplikaci této metody se sníží potřebný objem vzorku o tři řády (jednotky ml – jednotky l). Navíc lze tímto způsobem analyzovat vzorky DNA obsahující nízkomolekulární látky, které by mohly rušit elektrochemické měření. Další možností pro posouzení stavu DNA je možnost využít oxidačních signálů bazí. K oxidaci adeninu a guaninu dochází v místech (na atomech), které se účastní párování bazí vodíkovými můstky. V dvouřtězcovém stavu jsou tedy báze od elektrody stéricky izolovány a svůj oxidační signál poskytují jen v jednořetězcovém stavu. Tohoto lze využít například při detekci hybridizace. Pracovní postup – A: nativní a denaturovaná DNA - Denaturace DNA. DNA rozpuštěná ve vodě o koncentraci maximálně 150 g/ml se zahřeje na 6 minut na 99 oC a poté se rychle ochladí v nádobě s ledem. - Připravená denaturovaná DNA i původní nativní DNA se naředí 0,2 M NaCl na koncentraci 30 g/ml (připravovaný objem 30 l) - Měření AC voltametrie – do měřící nádobky nalijeme 3 – 5 ml základního elektrolytu (roztok 0,3 M NaCl a 50 mM Na2HPO4 ze zásobních roztoků 3M NaCl a 0,5 M Na2HPO4). Provedeme voltametrické měření v potenciálovám rozsahu -0,6 až -1,6 V. Jako pracovní elektrodu používáme visící rtuťovou kapku. Měříme nejdříve základní elektrolyt a potom postupně oba vzorky DNA. Měření DNA probíhá pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí voltametrie (AdTSV).
- 15 -
Pracovní postup – B: Signály bazí DNA na uhlíkové elektrodě -
-
-
Hybridizace oligonukleotidů – do mikrozkumavky 1 smíchejte k sobě komplementární oligonukleotidy a doplňte 0.2M NaCl tak, aby výsledná koncentrace nukleotidů byla cca 30µg/ml, ve výsledném objemu 20µl. Zkumavky zahřejte na 99ºC a nechte pomalu chladnout. Na uhlíkové elektrodě v SWV módu změřte signály bází za podmínek: základní elektrolyt 0.2M acetát sodný, počáteční potenciál -0.1V, koncový 1.5V, frekvence 200Hz, amplituda 50mV Mezi jednotlivými měřeními je potřeba povrch elektrody obnovit – nastavte na 30s potenciál 1.8V (condition potential) a pak obnovte povrch elektrody pomocí lepící pásky
Materiál a pomůcky - potenciostat (Autolab) - elektrodový systém (663 VA-stand) - tlaková láhev s argonem - základní elektrolyty, 0,2M acetát sodný, 0,3 M NaCl, 50 mM Na2HPO4 - roztok 0,2 M NaCl - DNA
- 16 -
Analýza nukleotidových sekvencí pomocí magnetických kuliček a hybridizace se sondou značenou enzymem Princip úlohy: Přítomnost určité sekvence nukleotidů v cílové DNA lze dokázat pomocí vhodně navržené sondy - krátkého úseku DNA, která s hledanou sekvencí hybridizuje, tj. vytvoří duplex DNA. Vznik duplexu detekujeme. V této práci bude cílová DNA s (dA)30-koncem nejprve navázána na magnetické kuličky modifikované (dT)25 řetězci. Bude-li v této DNA úsek komplementární k navržené sondě nesoucí biotin, dojde k hybridizaci. Na biotin bude poté navázán konjugát streptavidinu s enzymem, alkalickou fosfatázou, která přemění elektroneaktivní substrát 1-naftylfosfát na 1naftol, jehož oxidace bude detekována pomocí lineární voltametrie.
Postup: 1) napipetujeme 40 μl kuliček DB-(dT)25 do eppendorfky, pomocí magnetu odebereme skladovací pufr a 3x promyjeme 100 μl 0,3M NaCl/ 10mM TRIS (tj. resuspendujeme na vortexu a pomocí magnetu odebereme promývací roztok a přidáme čistý) 2) před posledním odebráním promývacího pufru kuličky rozdělíme do 2 eppendorfek po 50 μl 3) do jedné eppendorfky napipetujeme 20 μl cílové DNA I (5 μg/ml) v roztoku 0,3M NaCl, do druhé totéž ale s cílovou DNA II 4) necháme inkubovat v termomixeru 12 min, 20 °C, 900 rpm 5) 3x promyjeme 100 μl 0,3M NaCl/ 10mM TRIS 6) do obou eppendorfek napipetujeme 20 μl biotinylované sondy (5 μg/ml) 7) viz 4) 8) viz 5) 9) přidáme 50 μl mléka (2,5 g sušeného mléka + 50 ml PBS) - necháme inkubovat 10 min, 20 °C, 900 rpm
- 17 10) po odebrání mléka přidáme 50 μl konjugátu streptavidinu s alkalickou fosfatázou 100x ředěného v mléce 11) viz 4) 12) promyjeme - 3x 100 μl PBST (fosfátový pufr + 0,2 % TWEEN) a 3x 100 μl 0,3M NaCl/ 10mM TRIS 13) přidáme 50 μl 100mM 1-naftylfosfátu v uhličitanovém pufru 14) viz 4) 15) odebereme roztok od kuliček a přeneseme ho do 1 ml uhličitanového pufru Elektrochemická detekce: metoda: LSV - lineární voltametrie pracovní elektroda: PGE - elektroda z pyrolytického grafitu roztok připravený v bodě 15) přeneseme do elektrochemické měřící nádobky, vložíme do ní elektrody, spustíme měření, vyhodnotíme
- 18 -
Značení DNA komplexy oxidu osmičelého Komplexy oxidu osmičelého s bidentátními dusíkatými ligandy poskytují s pyrimidinovými zbytky bází v DNA kovalentní adukty. Thymin je asi 10x reaktivnější než cytosin. Pokud je jako ligand použit 2,2’-bipyridin (Os,bipy) je tato reakce specifická pouze pro jednořetězcovou DNA. Tato vlastnost byla použita pro detekci některých sekundárních struktur DNA. Tyto adukty jsou elektroaktivní a na rtuťových a uhlíkových elektrodách poskytují celou řadu elektrochemických signálů. Na rtuťových a uhlíkových elektrodách jsou to faradaické signály způsobené postupnou redukcí nebo oxidací atomu osmia v molekule aduktu. Pouze na rtuťových elektrodách pak lze získat signál katalytického vylučování vodíku v důsledku přítomnosti aduktu na povrchu pracovní elektrody. Tento katalytický signál může sloužit pro velmi citlivé stanovení modifikované DNA. Naproti tomu elektrodu z pyrolytického grafitu lze použít pro přímou analýzu reakční směsi, kdy je nezreagovaný komplex separován z povrchu pracovní elektrody extrakcí organickým rozpouštědlem (chloroform, isopropylalkohol). Pracovní postup: 1) Odpipetujte 20 μl CT-DNA (120 μg/ml) a nechte 10 min inkubovat při 95 stupních, prudce zchlaďte v ledové lázni 2) Připravte si 10 μl komplexu OsO4 s bipyridinem (20 mM ekvimolární) 3) Napipetujte: a) 2 μl komplexu, 5 μl ssDNA, 2 μl Tris-Cl pH 8, 11 μl H20 b) 2 μl komplexu, 5 μl dsDNA, 2 μl Tris-Cl pH 8, 11 μl H20 4) Obě zkumavky nechte inkubovat 30 min při 37 ˚C, sledujte čas 5) Připravte si analogickým způsobem dvě zkumavky s nemodifikovanou DNA (ss a ds) o koncentraci 30 μg/ml 6) Připravte si základní elektrolyt – 200 mM acetát sodný pH 5 7) Na uhlíkové elektrodě změřte signál ssDNA a dsDNA 8) Na uhlíkové elektrodě změřte signál DNA modifikované osmiem Elektrochemické měření: Do měřící nádobky napipetujeme 2 ml základního elektrolytu (0,2 M acetátový pufr, pH 5) provedeme záznam SWV s počátečním potenciálem -1, konečným potenciálem +1,5 V, frekvence 200 Hz amplituda 50 mV. Poté obnovíme povrch pracovní elektrody lepící páskou, naneseme vzorek (7 l) a 60 s akumulujeme. Pak elektrodu opláchneme v destilované vodě, ethanolu a isopropylalkoholu (60 s). Po omytí provedeme měření. Po naměření provedeme elektrochemickou úpravu povrchu elektrody (30 s 1,8 V) a opět obnovíme povrch lepící páskou. Seznam potřebného vybavení a chemikálií: potenciostat (PalmSens) elektrodový systém (663 VA-stand), pracovní elektroda: PGE, referentní elektroda: Ag/AgCl/3M KCl, pomocná elektroda: platinový drát termomixér 0,2 M acetátový pufr, pH 5 roztok OsO4 roztok 2,2’-bipyridinu isopropylalkohol, ethanol
- 19 -
Izolace plasmidové DNA
Izolace plasmidové DNA pomocí kolonek od firmy QIAGEN Princip: V současné době je izolace plasmidové DNA velice usnadněna díky dostupnosti komerčních kitů, které umožňují zkrátit dobu nutnou pro izolaci, vyhnout se práci s některými chemikáliemi (fenol, chloroform) a získat plasmidovou DNA v požadované kvalitě. Na našem trhu jsou k dispozici izolační kity od několika firem (Qiagen, Macherey-Nagel, Sigma), které fungují na podobném principu a liší se pouze v detailech. K dostání jsou kolony o různé kapacitě, kolony, kterými nanesený lyzát protéká pouze za pomoci gravitační síly nebo kolony, u nichž je průtok lyzátu urychlen centrifugací. Posledně jmenované kolony zkracují čas potřebný pro izolaci, používají se hlavně při přípravě malých množství DNA, protože jejich kapacita je omezená. Poslední novinkou na trhu jsou kolony vybavené speciálním filtrem, které umožňují oddělit rozpustnou frakci lyzátu od nerozpustné bez použití centrifugace.
A
B
Obr. 5.1: (A) Znázornění kolony od firmy Qiagen a její upevnění ve zkumavce. (B) Aniontové výměnné kolony firmy Qiagen o kapacitě 20-10 000 g.
Podstatou izolace DNA je alkalická lýze a oddělení nerozpustné buněčné frakce s chromozomální DNA od vodné frakce, ve které je rozpuštěna plasmidová DNA. Vodná
- 20 frakce je nanesena na kolonu, jejíž náplň je tvořena chemicky upravenou pryskyřicí a při pH 7 obsahuje kladně nabité konce tvořené dietylaminoetanolem (DEAE). Kladné náboje interagují se záporně nabitými nukleovými kyselinami (obr. 5.2A) a zadrží je na koloně. Z kolony jsou nežádoucí biomakromolekuly vymyty pufrem, který obsahuje dostatečnou koncentraci solí pro uvolnění krátkých oligomerů, tRNA, rRNA a ssDNA, zatímco plasmidová DNA zůstane navázána. Eluce DNA je provedena pufrem o vyšší iontové síle než je promývací pufr (obr. 5.2B)
A
B
Obr. 5.2: (A) Interakce DEAE se záporně nabitými fosfátovými skupinami DNA. (B) Separace jednotlivých druhů nukleových kyselin při neutrálním pH na aniontové výměnné koloně
Pro úspěšnou izolaci čisté plasmidové DNA je kritickým krokem lýze buněk. Pokud lýzi buněk provedeme příliš drasticky, ať už prodloužením času nebo příliš intenzivním protřepáním směsi po přidání lyzačního pufru, fragmenty chromozomální DNA se uvolní do rozpustné frakce a v dalších krocích se při izolaci chová jako plasmidová DNA. Přečištění takto znehodnocené DNA je možné pouze za použití centrifugace v gradientu chloridu cesného, nicméně musíme počítat s nižším výtěžkem, protože chromozomální DNA na koloně kompetuje o vazebná místa s plasmidovou DNA.
Pracovní postup: Tab.: Objemy bakteriální kultury a pufrů pro izolaci plasmidové DNA na aniontových výměnných kolonách Qiagen podle kapacity použité kolony. Kapacita kolony (g)
Objem kultury (l)
Objem pufru P1 (ml)
Objem pufru P2 (ml)
Objem pufru P3 (ml)
Objem pufru QBT (ml)
Objem pufru QC (ml)
Objem pufru QF (ml)
Objem isopropanolu (ml)
Objem etanolu (ml)
Mini (20)
0,003
0,3
0,3
0,3
1
2x2
0,8
0,56
1
Midi (100)
0,025 (0,1)
4
4
4
4
2 x 10
5
3,5
2
Maxi (500)
0,1 (0,5)
10
10
10
10
2 x 30
15
10,5
5
Mega (2 500)
0,5 (2 ,5 )
50
50
50
35
2 x 100
35
24,5
7
Giga (10 000)
2,5 (5 )
125
125
125
75
2 x 300
75
52,5
10
Pozn. : Optimální objem kultury pro jednotlivé izolace je uveden pro plasmidy, které v bakteriálních buňkách vytvářejí velký počet kopií (řádově stovky až tisíce) nebo pro plasmidy nízkým počtem kopií (10-20) jejichž počet byl zvýšen amplifikací v důsledku kultivace v přítomnosti chloramfenikolu. V závorce je uveden objem bakteriální kultury pro plasmidy s nízkým počtem kopií, které nebyly amplifikovány.
- 21 -
1. Dobře rostlou a centrifugovanou bakteriální kulturu suspendujeme v pufru P1 tak, aby bakterie byly kompletně rozsuspendovány a nevytvářely žádné shluky. 2. Přidáme pufr P2, jemně ale důkladně zamícháme několikanásobným (4-6 x) obrácením zkumavky dnem vzhůru a inkubujeme 5 minut při pokojové teplotě. 3. Přidáme vychlazený pufr P3, jemně zamícháme (bod 2) a necháme inkubovat 15 minut v ledové lázni. 4. Centrifugujeme 30 minut při 4°C a RCF minimálně 20 000 x g. Supernatant, obsahující plasmidovou DNA, slejeme přes složenou gázu do připravené zkumavky. Odebereme 250 l vyčištěného lyzátového supernatantu a uchováme pro nanesení na analytický gel (kontrolní vzorek 1).
5. Během centrifugace ekvilibrujeme kolonu QIAGEN-tip ekvilibračním pufrem QBT. Necháme kolonu vyprázdnit působením gravitace. 6. Na ekvilibrovanou kolonu naneseme supernatant (krok 4) a počkáme, než se kolona působením gravitace vyprázdní. Odebereme 250 l vzorku prošlého kolonou a uchováme pro nanesení na analytický gel (kontrolní vzorek 2).
7. Promyjeme kolonu promývacím pufrem QC. Tímto krokem se zbavíme všech nečistot, jejichž vazba vůči kationtům v náplni kolony je slabší než vazba dsDNA (proteiny, RNA, ssDNA) Odebereme po 500 l z promývacích frakcí a uchováme pro nanesení na analytický gel (kontrolní vzorky 3 a 4).
8. Eluujeme DNA elučním pufrem QF. Odebereme 100 l eluátu a uchováme pro nanesení na analytický gel (kontrolní vzorek 5).
9. Získanou plasmidovou DNA vysrážíme přidáním isopropanolu (0,7 objemu). Zamícháme a okamžitě centrifugujeme 30 minut při 15 000 x g a teplotě 4°C. Opatrně slijeme supernatant. 10. Vysráženou DNA promyjeme 70% etanolem a centrifugujeme 10 minut při 15 000 x g a teplotě 4°C. Opatrně slijeme supernatant, abychom neporušili pelet. 11. Pelet vysušíme při sníženém tlaku po dobu 5-10 minut a DNA rozpustíme v TE pufru, pH 8.0. 12. Kontrolní vzorky 1-5 přesrážíme přidáním 0.7 objemu isopropanolu, centrifugujeme, promyjeme 80% etanolem a vysušíme. Rozpustíme v 50 l TE pufru, pH 8.0. Na gel nanášíme po 10 l přesrážených kontrolních vzorků. Tento krok provádíme souběžně se srážením izolované DNA. Během srážení si také připravíme 1% agarosový gel (krok 14).
13. Stanovení výtěžku a čistoty DNA provedeme UV spektrofotometrií při 260 a 280 nm a kvantitativní analýzou na agarosovém gelu. 14. Do Erlenmayerovy baňky navážíme 1 g agarosy, přidáme 100 ml 1 x TAE pufru, zamícháme a v mikrovlnné troubě vaříme 3 minuty při 500 W. Protože během varu dochází k odpaření vody, poznačíme si původní úroveň hladiny. Destilovanou vodou doplníme úbytek vody. Pod tekoucí vodou zchladíme agarosu na cca 60°C a naléváme na připravený nosič. Po ztuhnutí agarosy zalijeme gel 1 x TAE pufrem (400-500 ml), ke vzorkům (10 l ) přidáme 2 l 6 x koncentrovaného nanášecího pufru a vzorky naneseme na gel. 15. Elektroforézu provádíme při 80 V po dobu 60 minut. Gel vyjmeme z aparatury, vložíme do roztoku ethidiumbromidu (1 g/ml) necháme 15 minut barvit. Poté gel vyjmeme a zobrazíme pod UV světlem. POZOR!!! S roztokem ethidiumbromidu a gely, které jsou jím obarveny manipulujeme zásadně v rukavicích!! ! 16. Z intenzity zbarvení standardů a izolované DNA stanovíme výtěžek izolace. 17. Změřením absorbance při 260 nm a 280 nm provedeme nezávislé stanovení výtěžku DNA a její čistoty. Dvoušroubovicová DNA o koncentraci 50 g/ml dává v kyvetě o
- 22 tloušťce 1 cm hodnotu absorbance při 260 nm 1. Poměr absorbancí při 260 a 280 nm by měl činit minimálně 1.8. 1
2 3 4
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Obr. 5.3: Kontroly izolace plasmidů pBSK(dráhy 1,5,9,13), pPGM1 (2,6,10,14), pPGM2 (3,7,11,15) a pPGM3 (4,8,12,16). V drahách 1-4 jsou kontroly buněčného lyzátu před nanesením na aniontovou výměnnou kolonu (kontroly 1), dráhy 5-8 představují kontroly 2 – lyzát prošlý kolonou, dráhy 9-12 představují spojené frakce kontrolních vzorků 3 a 4 – promývací frakce, v drahách 13-16 jsou vzorky eluované z kolony.
- 23 -
Izolace plasmidové DNA pomocí centrifugačních kolonek Princip: Pro izolaci plasmidové DNA je možné použít nejen kolonky, u kterých je k přečištění a uvolnění zachycené plasmidové DNA využíváno přirozené gravitační pole. Na trhu jsou k dispozici izolační kity, které využívají odstředivou sílu vznikají při centrifugami. Princip izolace je obdobný jako v případě gravitačních kolonek. Použití vyššího přetížení nám však umožňuje zkrátit čas potřebný pro izolaci na 20-30min. Na druhé straně centrifugační kolonky mají nižší kapacitu, izolací proto získáme menší množství DNA.
Pracovní postup: 1. V centrifuze stočíme 1-5 ml bakteriální kultury kultivované v LB médiu. Centrifugami provádíme 30 sekund při 11 000 x g. Odstraníme supernatant, pokud možno kompletně. 2. Přidáme 250 l pufru A1. Resuspendujeme buněčný pelet na vortexu. Pro účinnou izolaci je nutné, aby v suspenzi nezůstaly viditelné shluky buněk. Přidáme 250 l pufru A2. Promícháme přvrácením zkumavky dnem vzhůru a zpět 68x. Nevortexujeme! Inkubujeme při pokojové teplotě 5 min. Přidáme 300 ml pufru A3. Opět jemně zamícháme převrácením zkumavky (6-8x). Nevortexujeme! 3. Centrifugujeme 5 – 10 min při 11 000 x g při pokojové teplotě. 4. Vložíme NucleoSpin®Plasmid kolonu do 2 ml sběrné zkumavky a naneseme supernatant z bodu 3 na kolonu. Centrifugujeme 1 min při 11 000 x g. Odstraníme proteklý roztok. 5. Vložíme NucleoSpin®Plasmid kolonu zpět do sběrné zkumavky a přidáme 600 l pufru A4. Centrifugujeme 1 min při 11 000 x g. Roztok prošlý kolonou odstraníme. 6. Abychom dostatečně vysušili membránu, na které je plasmidová DNA navázána, vložíme NucleoSpin®Plasmid kolonu zpět do prázdné sběrné zkumavky a centrifugujeme další 2 min při 11 000 x g. Tento krok zabezpečí odstranění zbytků etanolu, který je součástí promývacího pufru A4. Etanol může inhibovat enzymatické reakce, ke kterým může být izolovaná DNA použita. 7. Vložíme NucleoSpin®Plasmid kolonu do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky a přidáme 50 l pufru AE. Inkubujeme 1 min při pokojové teplotě. Centrifugujeme 1 min při 11 000 x g. Opakováním tohoto kroku můžeme dosáhnout zvýšení výtěžku o 15-20%. Eluce může být prováděna destilovanou vodou nebo TE pufrem.
- 24 -
- 25 -
Kontrola čistoty a koncentrace izolované DNA Po izolaci DNA (plasmidové, chromozomální) je nutné zjistit její koncentraci a čistotu. Pro další aplikace izolovaných DNA je naprosto nezbytné zajistit, aby do reakcí (sekvenování, PCR apod.) bylo bráno alespoň přibližně stejné množství DNA. Rovněž izolované vzorky nesmějí být kontaminovány jinými molekulami, např. proteiny nebo látkami typu fenolů. Ke stanovení čistoty a druhu nukleové kyseliny ve vzorku se používá výpočet poměru hodnot absorbancí při 260 a 280nm. Nukleové kyseliny mají absorpční maximum při 260 nm, absorpční maximum proteinů a aromatických látek je kolem 280 nm. Pro přesné stanovení čistoty a koncentrace je třeba vzít v úvahu možný vliv pufrů s vysokou absorbancí, zákal vzorku, či použití kyvet se zúženou štěrbinou. Protože ani nukleové kyseliny ani proteiny neabsorbují při 320 nm, používá se tato vlnová délka pro kompenzaci vlivu absorbance pozadí. Index čistoty DNA je dán poměrem absorbancí při 260 a 280 nm, sníženým o rozptyl světla při 320 nm. Čistá DNA má tento poměr minimálně 1,8; čistá RNA 2,0. Hodnoty významně nižší signalizují přítomnost nečistot ve vzorku a nutnost dalšího přečištění. Také zvýšená absorbance při 230 nm může být způsobena nečistotami. Vlnová délka 230 nm je blízká absorpčnímu maximu peptidových vazeb, také Tris, EDTA a jiné pufry absorbují při této vlnové délce. Absorbance 260nm se používá pro kvantifikaci čistých nukleových kyselin: roztok s absorbancí 1,0 v kyvetě s optickou dráhou 10 mm odpovídá koncentraci 50 g/ml u dvouřetězcové DNA, 40 g/ml u ssDNA a RNA, a 33 g/ml u oligonukleotidů (může se měnit v zavislosti na složení bází). U vzorků s příměsí proteinů lze přibližnou koncentraci vypočítat dle Warburgovy-Christianovy rovnice: Cprotein = (1552,0 *A280) – (757,3*A260) Cnukleová kys. = (62,9 *A260) – (36,0*A280)
- 26 -
Příprava kompetentních buněk a transformace plasmidové DNA do bakterií Princip: V laboratoři často nastává situace, kdy je třeba rekombinantní DNA (většinou plasmid s ligovaným úsekem DNA) vpravit do bakteriálních buněk, kde se pomnoží. Bylo vypracováno několik technik, které se liší použitými pufry, způsobem přenosu DNA do buněk a v neposlední řadě i účinností. Nejčastěji používanou technikou je transformace. Ta vyžaduje tzv. kompetentní buňky (schopné přijmout cizorodou DNA), které se připravují inkubací bakteriálních buněk v přítomnosti např. vápenatých iontů při 0°C. Při tomto procesu se podstatně zvýší prostupnost buněčné stěny pro molekuly plasmidu. Po krátkém zahřátí na 42°C plasmidová DNA vstupuje do bakterií. Další metodou je elektroporace, při které je roztok, v němž jsou bakterie spolu s plasmidovou DNA, vystaven krátkému elektrickému impulsu o vysokém napětí. Impuls vytvoří v bakteriální stěně póry, kterými se DNA dostane dovnitř buněk. Materiál: - agarová plotna s narostlými koloniemi bakteriálního kmene, který chceme použít k transformaci - plasmidová DNA - 0,1 M CaCl2 - MgCl2-CaCl2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2) - LB médium (případně SOB) - SOC médium - agarové plotny s SOB médiem, 20 mM MgSO4, selekčním antibiotikem - centrifuga - sterilní polypropylenové kyvety 50 ml - sterilní mikrozkumavky - vodní lázeň 42°C - termostat 37°C - pipety - rukavice - sterilní špičky Pracovní postup: a) příprava kompetentních buněk kalciovou metodou 1) Z agarové plotny setřeme oddělenou, dobře narostlou kolonii a přeneseme ji do 100 ml LB média. Inkubujeme kulturu při 37°C do dobu 2-3 hodin za intenzivního třepání. Nádoba, ve které kultivace probíhá, má mít objem minimálně 5 x větší než je objem média. 2) Přelijeme bakteriální kulturu do sterilních vychlazených 50 ml polypropylenových zkumavek. Uložením kultury do ledové lázně na 10 minut ji vychladíme na 0°C. 3) Centrifugací při 4000 rpm při 4°C po dobu 10 minut shromáždíme bakteriální buňky na dně centrifugační kyvety. 4) Opatrně slijeme supernatant. Postavíme kyvety dnem vzhůru na filtrační papír nebo buničinu a necháme je v této poloze 1 minutu, abychom se zbavili posledních zbytků kultivačního média.
- 27 5) Bakterie v každé 50 ml kyvetě resuspendujeme jemným třepáním v 30 ml vychlazeného (0°C) roztoku MgCl2-CaCl2. 6) Zkumavky vložíme na 10 minut do ledové lázně. 7) Centrifugujeme při 4000 rpm, 4°C, po dobu 10 minut. 8) Slijeme supernatant z kyvet. Obrátíme zkumavky dnem vzhůru a postavíme je na filtrační papír nebo buničinu. V této poloze je necháme 1 minutu, aby vytekly zbytky supernatantu. 9) Pelet v každé kyvetě resuspendujeme ve 2 ml 0,1 M CaCl2 vychlazeného v ledové lázni. 10) Bakterie v CaCl2 rozdělíme po 50-200 l do sterilních mikrozkumavek. Jednotlivé alikvoty můžeme použít přímo k transformaci nebo je můžeme zamrazit na –70°C. Pokud s buňkami nemůžeme pracovat ihned, můžeme je v tomto stadiu 1-2 dny uchovávat při 4°C. Účinnost transformace u těchto buněk během 12-24 hodin vzroste 4-6 x, potom se vrací na svou původní hodnotu. b) transformace bakterií plasmidovou DNA 1) K 200 l kompetentních buněk ve vychlazeném 0,1 M CaCl2 přidáme DNA (maximálně 50 ng v objemu 10 l nebo menším). Jemně zamícháme a inkubujeme 30 minut v ledu. 2) Přeneseme zkumavky do vodní lázně temperované na 42°C. Ponecháme je v lázni přesně 90 sekund. Pozn.: Teplotní šok je kritický krok celého postupu. Pro účinnou transformaci je třeba dodržet co možná přesně teplotu i čas. Při kratších časech je účinnost transformace snížená, při delších časech nastává odumírání bakterií.
3) Rychle přeneseme zkumavky zpět do ledové lázně na 1-2 minuty. 4) Do každé mikrozkumavky přidáme 800 l SOB média. Vzorky inkubujeme 45 minut při 37°C, abychom bakteriím umožnili se vzpamatovat a obnovit svou bakteriální stěnu. 5) Na agarovou plotnu obsahující SOB médium s 20 mM MgCl2 a antibiotikem, proti němuž transformované bakterie získaly resistenci, vysejeme 100-200 l buněčné suspenze. Kulturu pomocí sterilní, zahnuté skleněné tyčinky rovnoměrně rozetřeme po celém povrchu plotny. 6) Plotny ponecháme při pokojové teplotě, dokud není veškerá kapalina absorbována. 7) Obrátíme plotny dnem vzhůru a inkubujeme při 37°C. Kolonie transformovaných bakterií se objeví za 12-16 hodin. Pozn.: Jak příprava kompetentních buněk, tak transformace musí probíhat sterilním způsobem, aby nedošlo ke kontaminaci.
- 28 -
Štěpení plasmidové DNA restrikčními endonukleázami, sestavení restrikční mapy
Princip: Prudký rozvoj metod molekulární biologie přímo souvisí s objevem restrikčních endonukleáz, které umožňují sekvenčně specifickou fragmentaci DNA. Restrikční endonukleázy jsou součástí tzv. restrikčně modifikačních mechanismů bakterií. Tento systém je zajišťován dvěma druhy enzymových aktivit – metylační a restrikční. Enzymy s metylační aktivitou specificky modifikují (metylují) vlastní buněčnou DNA, čímž ji chrání před degradací restrikčními enzymy. Restrikční endonukleázy jsou bakteriemi využívány ke štěpení cizorodé DNA, která není v příslušných sekvencích metylována. Pro účely klonování v molekulární biologii se proto zpravidla používají buňky zbavené restrikční aktivity. Restrikční endonukleázy rozpoznávají krátké sekvence dvouřetězcové DNA a štěpí ji ve specifických místech nebo poblíž nich. Jsou známy tři typy restrikčních endonukleáz. Typy I. a III. třídy vykazují zároveň modifikační i ATP–dependentní restrikční aktivitu. Enzymy skupiny I. se vážou na specifickou rozpoznávací sekvenci, ale štěpí DNA v nedefinované oblasti mimo rozpoznávanou sekvenci. Enzymy této skupiny nemají praktické využití při genových manipulacích. Uplatnění nenašly ani enzymy III. skupiny, neboť ke štěpení DNA dochází opět mimo rozpoznávací oblast. Nejvhodnější pro využití v molekulární biologii jsou enzymy II. skupiny, které nevyžadují ATP, jsou striktně specifické a rozpoznávají tzv. palindromové sekvence, tj. dvouvláknové úseky DNA, které mají v obou vláknech opačně orientovanou sekvenci bází. Délka těchto rozpoznávacích sekvencí se pohybuje nejčastěji mezi 4 – 6 páry bází, existují ale restrikční endonukleázy rozpoznávající sekvence o 15 párech bází. Tento parametr je rozhodující pro četnost, se kterou enzym bude štěpit molekulu DNA. Volbou restrikční endonukleázy lze tedy ovlivnit délku vznikajících úseků. Enzymy II. skupiny lze dále rozdělit podle způsobu, jakým DNA štěpí, na tři podskupiny:
a/ poskytující jednovláknové úseky na 5‘ koncích EcoRI 5‘.........GAATTC.............3 3‘.........CTTAAG.............5‘
5‘.....G3‘ 3‘.....CTTAA5‘
5‘AATTC.......3‘ 3‘G.......5‘
b/ poskytující jednovláknové úseky na 3‘ koncích PvuI
5‘.........CGATCG.............3
5‘.....CGAT3‘
3‘.........GCTAGC.............5‘
3‘.....GC5‘
5‘CG.......3‘ 3‘TAGC.......5‘
- 29 -
c/ poskytující tupé konce StuI
5‘.........AGGCCT.............3‘
5‘.....AGC3‘
5‘CCT.......3‘
3‘.........TCCGGA.............5‘
3‘.....TCC5‘
3‘GGA.......5‘
Materiál a chemikálie: - Plasmidová DNA - Restrikční endonukleázy + pufry - 96% a 80% etanol (-20°C) - 3 M octan sodný pH 5,0 - Hlubokomrazící box –80°C - Stolní centrifuga - Pipety, špičky - Rukavice - Mikrozkumavky 1,5 ml - Vortex - Aparatura pro agarosový gel - Agarosa - Termostat na 37°C - Elektroforetický pufr (TAE, TBE) - Zdroj napětí - Ethidiumbromid (1 g/ml) - Dokumentační systém Pracovní postup: 1) Připravíme si sadu označených mikrozkumavek. Do nich podle pokynů vedoucího cvičení napipetujeme vzorky jedné z variant uvedených v tabulce. Při přípravě vzorků pipetujeme podle následujícího schématu DNA, pufr, destilovanou vodu a restrikční endonukleázu, v případě dvojnásobných štěpení první enzym. DNA (1 g) 4-5 l pufr (10 x koncentrovaný) 2 l restrikční endonukleáza (2-3 U) 1 l destilovaná voda do 20 l Vzorky zamícháme a vložíme do termostatu na 37°C. Necháme inkubovat 30 minut Číslo vzorku
1
2
3
skupina
4
5
6
Použité restrikční endonukleázy
A
EcoRI
ScaI
BglI
EcoRI + ScaI
EcoRI + BglI
ScaI + BglI
B
BamHI
XmnI
PvuII
BamHI + XmnI
BamHI + PvuII
XmnI + PvuII
C
EcoRI
SmaI
AvaII
EcoRI + SmaI
EcoRI + AvaII
SmaI + AvaII
- 30 -
D
HindIII
ScaI
RsaI
HindIII + ScaI
HindIII + RsaI
ScaI + RsaI
. 2) Ke vzorkům přidáme 2 l 3 M octanu sodného, pH 5.0, zamícháme a přidáme 70 l vychlazeného 96% etanolu. Zamícháme a necháme 10 minut při -80°C. 3) Vzorky centrifugujeme při 14 000 x g po dobu 10 minut. Slijeme supernatant a k peletu DNA přidáme 500 l vychlazeného (-20°C) 80% etanolu. Zamícháme a centrifugujeme 10 minut při 14 000 x g. Odebereme supernatant a zkumavky s vysráženou a promytou plastidovou DNA vložíme do exsikátoru a sušíme 5-10 za sníženého tlaku. 4) Vysušenou DNA rozpustíme v 17 l destilované vody, přidáme pufr pro druhou restriktázu (2 l), restrikční endonukleázu (2-3 U, tj. 1 l) a necháme inkubovat při 37°C po dobu 30 minut. (U vzorků štěpených pouze jedním enzymem rozpustíme DNA ve 20 l TE pufru, pH 8.0. Vzorky necháme při laboratorní teplotě do doby než je společně s ostatními vzorky naneseme na agarosový gel.) 5) Během inkubace si připravíme 100 ml 1% agarosový gel v 1 x TAE pufru (100 ml) a 500 ml 1 x TAE pufru. 6) Ke vzorkům přidáme 4 l 6 x koncentrovaného nanášecího pufru a nanášíme na agarosový gel. 7) Elektroforézu provádíme při 80 V po dobu 60 minut. Gel vyjmeme z aparatury, vložíme do roztoku ethidiumbromidu (1 g/ml) a necháme 15 minut barvit. Poté gel vyjmeme a zobrazíme pod UV světlem. POZOR!!! S roztokem ethidiumbromidu a gely, které jsou jím obarveny manipulujeme zásadně v rukavicích!!! 8) Na gelu porovnáme mobilitu jednotlivých fragmentů s velikostí fragmentů markerové DNA a odhadneme velikost fragmentů získaných restrikčním štěpením. Z počtu získaných fragmentů zjistíme, kolik rozpoznávacích míst pro jednotlivé restrikční endonukleázy plasmidová DNA obsahuje, a pokusíme se určit jejich vzájemnou polohu. Výsledkem je restrikční mapa plasmidové molekuly DNA. 9) Výsledky porovnáme s teoretickými hodnotami, získanými ze známých restrikčních míst v plasmidu pBluescript II SK(-) a jeho délky (2961 pb): a. AvaII 2184, 2406 b. BamHI 719 c. BglI 466, 2160 d. EcoRI 701 e. HindIII 689 f. PvuII 529, 977 g. RsaI 654, 2525 h. ScaI 2526 i. SmaI 713 j. XmnI 2645
- 31 -
Současné štěpení DNA dvěma nebo více restriktázami Princip: Při štěpení DNA restrikčními endonukleázami lze v některých případech použít více restriktáz současně. Tento postup šetří čas a také odpadá riziko ztráty DNA při nedokonalém přesrážení vzorku. Při zvažování, zda můžeme štěpit zároveň více restriktázami, je nezbytné porovnat prostředí, v nichž jsou dané restriktázy aktivní. Jako každé enzymy, i restrikční endonukleázy vyžadují pro svou aktivitu optimální pH, přítomnost iontů (obvykle Mg2+) a iontovou sílu. Většina restrikčních endonukleáz má optimální teplotu štěpení 37°C, ale najdou se i takové, u nichž je optimální teplota nižší (30°C) nebo naopak vyšší (50-65°C) Všechny tyto parametry musíme důkladně prozkoumat než se rozhodneme pro současné štěpení. BglI: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 při 37°C), 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1 mg/ml BSA; 37°C. EcoRI: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 při 37°C), 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,02% Triton X100, 0,1 mg/ml BSA; 37°C. ScaI: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5 při 37°C), 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT; 37°C. Porovnáním reakčních pufrů dospějeme k závěru, že u uvedených enzymmů lze provést současné štěpení. Pro jednotlivé kombinace jsme vybrali: EcoRI + ScaI: pufr pro ScaI ScaI + BglI: pufr pro ScaI BglI + EcoRI: pufr pro BglI Při rozhodování, který z pufrů vybrat hraje roli stabilita enzymu, jeho cena. Užitečným vodítkem při volbě pufru jsou tabulky v katalozích firem dodávajících enzymy. Z tabulek lze vyčíst, které kombinace restriktáz jsou možné a jaký pufr je pro danou kombinaci vhodný.
- 32 -
- 33 -
- 34 -
Pracovní postup: 1) Připravíme si sadu označených mikrozkumavek. Do nich podle níže uvedené tabulky napipetujeme DNA, vhodný pufr a uvedenou kombinaci restrikčních endonukleáz. Vzorky zamícháme a vložíme do termostatu na 37°C. Necháme inkubovat 60 minut Číslo vzorku (RE)
1 -
2 EcoRI
3 ScaI
4 BglI
5 EcoRI + ScaI
6 ScaI + BglI
7 EcoRI + BglI
DNA
1
1
1
1
1
1
1
Pufr E
2
2
-
-
-
-
-
Pufr S
-
-
2
-
2
2
-
Pufr B
-
-
-
2
-
-
2
EcoRI
-
5
-
-
5
-
5
ScaI
-
-
5
-
5
5
-
BglI
-
-
-
5
-
5
5
H2O
17
12
12
12
7
7
7
. 2) Během inkubace si připravíme 100 ml 1% agarosový gel v 1 x TAE pufru a 500 ml 1 x TAE pufru 3) Ke vzorkům přidáme 4 l 6 x koncentrovaného nanášecího pufru a nanášíme na agarosový gel. 4) Elektroforézu provádíme při 80 V po dobu 60 minut. Gel vyjmeme z aparatury, vložíme do roztoku ethidiumbromidu (1 g/ml) a necháme 15 minut barvit. Poté gel vyjmeme a zobrazíme pod UV světlem. POZOR!!! S roztokem ethidiumbromidu a gely, které jsou jím obarveny manipulujeme zásadně v rukavicích!!! 5) Na gelu porovnáme mobilitu jednotlivých fragmentů s velikostí fragmentů markerové DNA a odhadneme velikost fragmentů získaných restrikčním štěpením. Z počtu získaných fragmentů zjistíme, kolik rozpoznávacích míst pro jednotlivé restrikční endonukleázy plasmidová DNA obsahuje, a pokusíme se určit jejich vzájemnou polohu. Výsledkem je restrikční mapa plasmidové molekuly DNA. 6) Výsledky porovnáme s teoretickými hodnotami, získanými ze známých restrikčních míst v plasmidu pBluescript II SK(-) a jeho délky (2961 pb): a. BglI b. EcoRI c. ScaI
466, 2160 701 2526
- 35 -
Obr.: Mapa plasmidu pBluscript II SK(-), který byl použit pro přípravu plasmidů řady pPGM vložením vazebné sekvence pro protein p53 do HindIII místa.
1
2
3
4
5
6
7
8
Obr.: Výsledek štěpení plasmidu pB II SK (-) restrikčními endonukleázami. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
scDNA; 2961 pb pBS/EcoRI; lin. 2961 pBS/ScaI; lin. 2961 pBS/BglI; lin. 1267 a 1694 pb (2160 – 466 = 1694; 2961 – 1694 = 1267) pBS/(EcoRI + ScaI); lin. 1136 a 1825 pb (2526 – 701 = 1825; 2961 – 1825 = 1136) pBS/(BglI + ScaI); lin. 366, 901 a 1694 pb (2526 – 2160 = 366; 2160 – 466 = 1694; 2961 – 1694 – 366 = 901) pBS/(BglI + EcoRI); lin. 235, 1267 a 1459 pb (701 – 466 = 235; 2160 – 701 = 1459; 2961 – 235 – 1459 = 1267) Standardy: (odspodu nahoru) 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 pb.
- 36 -
Detekce poškození DNA - detekce jednořetězcových zlomů v plasmidové DNA, detekce modifikace bazí DNA, jako nositelka genetické informace, je v buňce vystavena častým interakcím s látkami, které ji mohou negativně ovlivnit. Tyto látky, které mohou pocházet z buněčného metabolismu nebo z vnějšího prostředí, můžeme zjednodušeně rozdělit do dvou základních skupin: 1) Látky štěpící cukr-fosfátovou kostru 2) Látky modifikující báze Do první skupiny látek, řadíme především radikály a také oxidační činidla. Reakce těchto látek s DNA vede většinou k jedno nebo dvou-řetězcovým zlomům. Radikály jsou „vedlejším produktem“ metabolismu a jsou v buňce velmi časté. Jsou to velmi reaktivní sloučeniny a s DNA v buňce reagují poměrně často. Proto je v poslední době často zmiňována důležitost antioxidantů, které s radikály a jim podobnými látkami v buňce reagují a chrání tak nejen DNA před často ireverzibilním poškozením. Zlomy v DNA jsou snadno detekovatelné pomocí gelové elektroforézy. Přerušení řetězce DNA vede ke změně její elektroforetické mobility. Plasmidová DNA je totiž ve své nativní formě v tzv. superhelikální – nadšroubovicové konformaci (scDNA). Tato forma se vyznačuje velkou kompaktností (molekula DNA zaujímá při stejné hmotnosti menší objem oproti tzv. otevřené kružnicové ocDNA), proto migruje agarozovým gelem rychleji. Při přerušení jednoho z řetězců dvoušroubovice dojde k přechodu z kompaktní scDNA do rozměrnější ocDNA. Změnu si můžeme představit jako rozmotání klubka s bavlnkou a snahu protáhnout kompaktní klubko, nebo nekompaktní shluk stejně velkým otvorem malých rozměrů. Do látek poškozujících (modifikujících) báze spadá poměrně velká a různorodá skupina chemikálií. Nejčastější modifikace vyvolávají látky s oxidačním, případně alkylačním mechanismem působení. Zvláště v případě methylací mohou být fyziologické důsledky velmi vážne, protože nativní methylace DNA hraje významnou úlohu v epigenetických regulačních procesech. Buňky mají pro opravu poškozené DNA vyvinut poměrně rozsáhlý aparát enzymů. Proces opravy probíhá zpravidla podle schématu rozpoznání modifikace –> vystřižení modifikované báze (nukleotidu) -> doplnění chybějící báze (nukleotidu) podle komplementárního řetězce -> ligace přerušeného řetězce (pokud k přerušení došlo). Chceme-li využít reparačních enzymů pro detekci poškození DNA, vynecháváme poslední dva kroky. Vystřižení modifikovaného nukleotidu vede zpravidla k přerušení cukrfosfátové páteře DNA a tedy k přechodu do ocDNA. Pro vytvoření volných radikálů v laboratorních podmínkách nejčastěji využíváme tzv. Fentonovy reakce: Men+ + H2O2 -> Fen+1 + OH- + OH • Ve cvičení bude ke štěpení DNA použit roztok manganistanu draselného, jako druhé štěpící agens použijeme hydroxylové radikály, generované měďnatými ionty (analogie klasické Fentonovy reakce). Pro detekci modifikace bází DNA využijeme dimethylsulfát (methylace guaninu) a reparační enzym Endonukleáza III.
- 37 -
Materiál:
Roztok měďnatých iontů (50mM) Zásobní roztok KMnO4 (0,1M) Fosfátový pufr pH 7,4 (0,2M) Plasmidová DNA (pBluesktript (SK-)) TAE (50x) Peroxid vodíku (H2O2) Dimethyl sulfát 1% (DMS) Endonukleáza III + pufr 3M octan sodný 96%, 70% ethanol Agaróza Nanášecí pufr Minicentrifuga Termostat Aparatura pro gelovou elektroforézu Chemické sklo Mikrozkumavky Automatické pipety, špičky Destilovaná voda
Pracovní postup: A) Vliv oxidačních činidel 1) Připravíme si koncentrační řadu roztoku manganistanu draselného v koncentracích: 100mM, 50mM a 10mM. 2) Do mikrozkumavek 1-4 napipetujeme dle tabulky 3) Krátce zcentrifugujeme (5 s, pomocí tlačítka „shortspin“) 4) Vše necháme inkubovat na 37˚C po dobu 30 min. 5) Do všech mikrozkumavek napipetujeme 5 µl nanášecího pufru. 6) Celý objem reakční směsi naneseme na připravený agarozový gel.
Tab. 1 – Rozpis pipetování pro KMnO4 Zkumavka 1 Zkumavka 2
Zkumavka 3
Zkumavka 4 (kontrola) 1 µl
DNA (200ng/µl)
1 µl
1 µl
1 µl
Fosfátový pufr (200 mM) KMnO4
5 µl
5 µl
5 µl
5 µl
2 µl (100 mM)
2 µl (50 mM)
2 µl (10 mM)
-
12 µl
12 µl
12 µl
14 µl
H2O
- 38 -
B) Vliv volných radikálů 1) Připravený roztok měďnatých iontů zředíme na 10 mM. 2) Roztok peroxidu zředíme na 0.3% 3) V mikrozkumavce smícháme: Zkumavka 5
Zkumavka 6
Zkumavka 7
1 µl
1 µl
1 µl
Cu
2 µl
2 µl
-
H2O2
2 µl
-
2 µl
H2O
15 µl
17µl
17µl
DNA (200ng/µl) 2+
4) 5) 6) 7) 8)
Krátce zcentrifugujeme (5 s, pomocí tlačítka „shortspin“) Inkubujeme po dobu 30 minut při 37°C. Do všech mikrozkumavek napipetujeme 5µl nanášecího pufru Naneseme na připravený agarozový gel. Do osmého startu naneseme 3 µl standardu (generuler) 1
2
3
4
5
6
7
8
Obr.1: Poškození plasmidové DNA působením manganistanu draselného. (1) Kontrola DNA, (2) DNA + 12 mM KMnO4, (3) DNA + 6 mM KMnO4, (4) DNA + 3 mM KMnO4, (5) DNA + 2 mM KMnO4, (6) DNA + 1 mM KMnO4, (7) DNA + 0,1 mM KMnO4, (8) DNA + 0,01 mM KMnO 4.
C) Detekce modifikace bází 1) V mikrozkumavce smícháme 5µl DNA 2µl fosfátového pufru 2µl 1% DMS 11µl H2O 2) Pro negativní kontrolu připravíme stejnou směs, roztok DMS nahradíme dest. vodou 3) Směs necháme inkubovat 30min při 37°C 4) Do obou zkumavek přidáme 5µl 3M octanu sodného a 80 µl 96% ethanolu 5) Zkumavky necháme inkubovat 20min na -80°C 6) Centrifugujeme 30min při 14500 x g 7) Odpipetujeme obsah zkumavky a necháme minutu schnout dnem vzhůru na filtračním papíru (ubrousku) 8) Přidáme 80 µl 70% ethanolu a centrifugujeme 15min při 14500 x g
- 39 9) Odpipetujeme obsah zkumavky, necháme minutu schnout dnem vzhůru a vložíme na 5min do exikátoru 10) Do obou zkumavek přidáme 30 µl dest. vody, chvíli protřepeme na vortexu Body 4-10 slouží k tzv. srážení DNA, pomocí tohoto postupu se DNA v organickém prostředí usadí jako sraženina na dně zkumavky a zbytek reakční směsi je odstraněn. V tomto případě provádíme srážení, abychom si byli jisti, že z reakční směsi odstraníme nezreagovaný DMS, který by mohl inhibovat činnost reparačních enzymů, které použijeme v dalším kroku. 11) Z obou zkumavek odebereme 15 µl směsi a přeneseme do dvou čistých eppendorfek 12) K oběma novým zkumavkám přidáme 2 µl pufru pro Endo III a 3 µl roztoku enzymu (naředěného na koncentraci 1u/µl) 13) Směs necháme inkubovat 30min při 37°C 14) Připravíme si 1% agarozový gel 15) Ke směsím přidáme vždy 1/6 objemu nanášecího pufru 16) Naneseme tak, aby dvojice vzorků (s enzymem a bez enzymu) byly na gelu vedle sebe. 1 2 3 4 5 6
Obr.2: Detekce modifikace bazí za využití Endo III – dráhy 1) Kontrolní DNA 2) DNA + 0.1%DMS 3) DNA + 0.1%DMS + 1u EndoIII 4) DNA + 0.1%DMS+3u EndoIII 5) DNA + 0.1%DMS + 5u Endo III 6) DNA + 5u Endo III
- 40 -
Separace proteinů vertikální elektroforézou Princip: Gelová elektroforéza je velmi účinná metoda pro dělení biomakromolekul – nukleových kyselin a proteinů. Dělení proteinů probíhá v polyakrylamidovém gelu ve vertikálním uspořádání. Vhodnou volbou koncentrace gelu zajistíme účinné dělení proteinů v požadovaném rozmezí molekulových hmotností. Proteiny o vysoké molekulové hmotnosti dělíme v řidším gelu (5%), menší proteiny a peptidy v koncentrovanějším polyakrylamidu (20%). Ve srovnání s nukleovými kyselinami jsou proteiny mnohem rozmanitější jak tvarem, tak i celkovým nábojem, který se může měnit i při poměrně malých změnách pH. To vše ovlivňuje mobilitu proteinů. Výsledná mobilita proteinů při elektroforéze je dána jejich molekulovou hmotností a „hustotou náboje“ (poměr velikosti elektrického náboje k molekulové hmotnosti). Na rozdíl od nukleových kyselin, u nichž je „hustota náboje“ konstantní (každý nukleotid obsahuje zbytek kyseliny fosforečné), u proteinů je elektrický náboj veličina, která nijak nezávisí na jejich molekulové hmotnosti. Abychom mohli výsledky polyakrylamidové gelové elektroforézy proteinů snáze interpretovat, využíváme její modifikace, tzv. denaturační SDS-PAGE. Při této variantě elektroforézy analyzované proteiny před nanesením na gel denaturujeme pomocí dodecylsulfátu (dodecylsíranu, laurylsíranu) sodného a -merkaptoetanolu. Účinek merkaptoetanolu spočívá v eliminaci případných disulfidových vazeb, takže se rozpadnou proteinové komplexy složené z více řetězců. Dodecylsulfát sodný obklopí molekulu proteinu a v důsledku elektrostatického odpuzování dojde k denaturaci proteinů. Protože dodecylsulfát sodný se váže na proteiny přímo úměrně k jejich molekulové hmotnosti, původní náboj proteinu je překryt a výsledkem je vytvoření molekul s konstantní hustotou náboje bez ohledu na velikost molekul. Denaturace je dokončena krátkým varem těsně před nanesením vzorků na gel. U takto připravených proteinů je eliminován náboj a původní tvar a jediným faktorem, který bude určovat mobilitu proteinů v polyakrylamidovém gelu, bude velikost molekuly (molekulová hmotnost).
Obr. 1: Ukázka efektivního rozdělení proteinů v polyakrylamidových gelech lišících se koncentrací akrylamidu a elektroforetickým pufrem. Zeleně je zobrazeno dělení v kontinuálním systému (bez zaostřovacího gelu), modře dělení při použití diskontinuálního provedení (se zaostřovacím gelem). Koncentrace gelu je uvedena v záhlaví jednotlivých drah. Zdroj: katalog firmy Bio-Rad
- 41 Materiál a chemikálie: - Zásobní roztok pro přípravu separačního gelu: (10% akrylamid:bisakrylamid 19:1; 0,375 M Tris-HCl, pH 8,8; 0,1% SDS) - Zásobní roztok pro přípravu zaostřovacího gelu: (2,5% akrylamid:bisakrylamid 19:1; 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8; 0,1% SDS) - 10% persíran amonný (APS) - TEMED (N,N,N´,N´-tetrametyletylendiamin) - Elektrodový pufr: 25 mM Tris; 0,192 M glycin; 0,1% SDS, pH 8,3 - Izolovaný protein - Proteinové standardy - Proteinové vzorky: mléko, sušené mléko, syrovátka, kasein, lysozym, BSA, p53 - 2 x CSB: 50 mM Tris-HCl, pH 6,8; 100 mM -merkaptoetanol; 2% SDS; 0,1% bromfenolová modř; 10% glycerol - Roztok Coomassie Briliant Blue R-250: 0,25% Coomassie Briliant Blue R-250; 45% (v/v) metanol; 10% (v/v) kyselina octová - Odbarvovací roztok: 25% (v/v) metanol; 10% (v/v) kyselina octová - Pipety - Špičky - Mikrozkumavky - Vodní lázeň - Elektroforetická aparatura - Zdroj napětí - Třepačka - Dokumentační systém Pracovní postup:
Obr. 2: Součásti a skládání aparatury pro polyakrylamidovou vertikální elektroforézu proteinů Mini-PROTEAN Tetra cell.
- 42 -
a) Příprava polyakrylamidového gelu: 1) Destilovanou vodou a etanolem důkladně očistíme a poté vysušíme skla elektroforetické aparatury. Skla se „spacery“ přiložíme k sobě a sestavíme aparaturu.
Obr. 3: Skládání sestavy pro nalévání gelu
2) K 10 ml zásobního roztoku 10% akrylamidu pro separační gel (10% akrylamid:bisakrylamid 19:1; 0,375 M Tris-HCl, pH 8,8; 0,1% SDS) přidáme 100 l 10% persíranu amonného a 10 l TEMEDu. Směs opatrně zamícháme a naléváme do formy vymezené skly. Polymerizační směs naléváme asi 2-2,5 cm pod úroveň nižšího skla. Povrch opatrně převrstvíme slabou vrstvou butanolu (20-30 l) – vyrovná případné nerovnosti. Necháme 10-15 min polymerovat. Jako kontrolu pro správnou polymeraci použijeme zbytky polymerační směsi. 3) Po ztuhnutí separačního gelu odsajeme vrstvu butanolu a na separační gel naneseme 2,5% zaostřovací gel (připravíme přidáním 40 l 10% persíranu amonného a 15 l TEMEDu ke 4 ml zásobního roztoku zaostřovacího gelu), vložíme hřeben a necháme polymerovat. V tabulce jsou uvedeny poměry jednotlivých složek pro přípravu gelů o různých koncentracích. 4) Poté, co zaostřovací gel zpolymeruje (zkontrolujeme opět podle polymerizace nepoužitých zbytků směsi v kádince), opatrně vyjmeme hřeben a starty promyjeme elektrodovým pufrem, abychom se zbavili zbytků nezpolymerovaného akrylamidu. 5) Gel se skly vložíme do aparatury a zalijeme elektrodovým pufrem (25 mM Tris; 192 mM glycin; 0,1% SDS, pH 8,3).
- 43 -
Obr. 4: Postup při sestavování aparatury
Tab.: Rozpis pro přípravu SDS-PAGE se zaostřovacím a separačním gelem. Zásobní roztok
Akrylamidbisakrylamid (29:1) Zásobní pufr pro zaostřovací gel Zásobní pufr pro separační gel Zásobní elektrodový pufr (10 x konc.)
Zaostřovací gel
Finální koncentrace akrylamidu v separačním gelu (%) 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0
Elektrodový pufr
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
17,5
20,0
-
5,0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3,75
3,75
3,75
3,75
3,75
3,75
3,75
-
-
-
-
-
-
-
-
-
100
10% SDS
0,2
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
-
10% APS
0,15
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
-
voda
12,15
20,7
18,2
15,7
13,2
10,7
8,2
5,7
900
TEMED
0,015
0,015
0,015
0,015
0,015
0,015
0,015
0,015
-
- 44 Hodnoty jsou udány v ml a jsou vypočteny pro přípravu 20 ml zaostřovacího gelu, 30 ml separačního gelu a 1000 ml elektrodového pufru. Finální koncentrace pufrů: v zaostřovacím gelu: 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8 v separačním gelu: 0,375 M Tris-HCl, pH 8,8 elektrodový pufr: 0,025 M Tris, 0,192 M glycin, pH 8,3
b) Příprava vzorků: 1) Do 1,5 ml zkumavek navážíme přibližně 10 mg proteinů. Vzorky rozpustíme v pufru tak, aby jejich koncentrace byla 10 mg/ml. (Navážíme sušené mléko, syrovátku, kasein, BSA, lysozym. Ke stanovení bílkovin v polotučném mléku odebereme 50 l mléka. Protein p53 naředíme 10 x ze zásobního roztoku.) 2) Do čistých zkumavek přeneseme 50 l vzorků a přidáme 50 l 2 x CSB. 3) Směs povaříme na vodní lázni po dobu 3-5 min. 4) Do jednotlivých startů na gelu nanášíme vzorky podle tabulky. Číslo vzorku
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
protein
mléko
sušené mléko
syrovátka
kasein
BSA
lysozym
p53
p53
p53
p53
10
10
10
10
10
10
5
10
15
20
Objem (l)
c) Elektroforéza: 1) Elektroforetickou aparaturu s nanesenými vzorky uzavřeme víkem s konektory a připojíme na zdroj napětí. 2) Doporučené parametry pro separaci bílkovin jsou uvedeny v následující tabulce: Čas [min] 15 15 60
Elektrické napětí [V] 50 100 150
Poznámka pro zakoncentrování vzorku indikační barva opouští koncentrační gel indikační barva na kraji separačního gelu
Uvedené časy jsou pouze orientační, které se musí přizpůsobit daným podmínkám analýzy (závisí např. na koncentraci gelu) a na průběh separace je nutno dohlížet. Indikační barva nesmí přesáhnout spodní okraj separačního gelu. 3) Vypneme zdroj, vyjmeme gel a opatrně oddělíme skla. Na gelu odřízneme pravý horní roh – tímto označíme orientaci gelu a zabráníme záměně levé strany za pravou. d) Barvení gelu a dokumentace: 1) Gel vložíme do roztoku Coomassie Briliant Blue R-250 a za mírného třepání necháme barvit asi 20 min. 2) Barvící roztok slijeme zpět do láhve (opatrně, abychom se nepotřísnili – barvící schopnosti jsou značné a skvrny na rukou nebo oděvu lze odstranit velmi obtížně) a gel přelijeme odbarvovacím roztokem. Za mírného třepání při laboratorní teplotě necháme gel odbarvovat. 3) Po zmodrání odbarvovacího roztoku jej vyměníme a necháme třepat do úplného vymizení modrého pozadí – podle potřeby několikrát vyměníme odbarvovací roztok. 4) Gel zdokumentujeme.
- 45 -
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Obr. 5: Polyakrylamidová gelová elektroforéza proteinů. 1. kasein (5 mg/ml); 5 l 2. kasein (5 mg/ml); 10 l 3. sušené mléko (5 mg/ml); 5 l 4. sušené mléko (5 mg/ml); 10 l 5. – 6. – 7. syrovátka (5 mg/ml); 5 l 8. syrovátka (5 mg/ml); 10 l 9. p53; 5 l (pod detekčním limitem) 10. p53; 10 l (pod detekčním limitem)
10
- 46 -
Přenos biomakromolekul na membránu (blotting) Princip: Při izolaci a separaci biomakromolekul gelovou elektroforézou často stojíme před problémem, který ze změti fragmentů nukleových kyselin obsahuje hledanou sekvenci nebo v kterém proužku se ukrývá konkrétní protein. Tyto potíže jsou způsobeny nespecifickým značením elektroforeticky rozdělených molekul nukleových kyselin nebo proteinů v gelu. Řešení představuje přenos (blotting) biomakromolekul na membránu, na které jsou specifickými metodami identifikovány hledané molekuly. Podle toho, který typ makromolekuly přenášíme, rozeznáváme: - Southernův přenos: jde o přenos DNA; - northernový přenos: z gelu na membránu jsou přenášeny ribonukleové kyseliny; - westernový přenos neboli přenos proteinů. Dalším kritériem pro dělení metody může být způsob, kterým je makromolekula na membránu přenášena. Potom mluvíme o: - elektroforetickém přenosu, u kterého je využito elektrického pole; - vakuovém přenosu: gel je položen na membránu, která je umístěna na porézní podložce, a přelit pufrem. Pufr je nasáván pumpou a vzniklý podtlak společně s pufrem zprostředkují přenos; - kapilárním přenosu: je využito kapilárních sil, které prostupují gelem a membránou a strhávají s sebou nukleové kyseliny nebo proteiny. Vzlínání pufru je zajištěno navrstvením savého materiálu na membránu. Po přenesení biomakromolekul na membránu je identifikace provedena specifickými metodami, které se liší podle toho, o jaký typ biomakromolekul se jedná: u nukleových kyselin vyhledáváme zkoumanou sekvenci zpravidla pomocí hybridizační sondy, u proteinů často využíváme imunochemických metod.
Vakuový přenos biomakromolekul na membránu
Obr.: Aparatura pro vakuový přenos proteinů nebo nukleových kyselin z gelu na membránu
- 47 Materiál a chemikálie: - Gel s přenášeným proteinem - Blotovací aparatura - Filtrační papír - Nitrocelulosová membrána - Rukavice - Přenosový pufr (10 x SSC: 87,65 g NaCl, 44,1 g citrátu sodného v 1000 ml roztoku; pH 7,0) Pracovní postup: 1. Sestavíme blotovací aparaturu: Na porézní podložku do prostoru vymezeného otvorem v igelitu umístíme 3-4 vrstvy filtračního papíru navlhčeného přenášecím pufrem (10 x SSC), na filtrační papíry položíme nitrocelulosovou membránu zastřiženou na rozměry odpovídající rozměrům gelu. Vždy po položení jednotlivých vrstev pečlivě skleněnou pipetou nebo tyčinkou odstraníme případné bubliny, které by mohly narušit přenos. Orientaci membrány označíme zastřižením pravého horního rohu. Na membránu položíme gel v odpovídající orientaci tak, aby jeho kraje přečnívaly přes otvor v igelitové masce. Pečlivě zkontrolujeme a odstraníme případné netěsnosti. 2. Gel zalijeme blotovacím pufrem a zapneme vakuovou pumpu. Na manometru nastavíme požadovaný podtlak. Přenos probíhá asi 1,5 hodiny. Během této doby kontrolujeme průběh přenosu, zda nedošlo k narušení vakua, v případě, že byl vyčerpán veškerý blotovací pufr, nalijeme na gel ze zásobního roztoku. 3. Po skončení přenosu zrušíme vakuum, z blotovací aparatury vyjmeme membránu a imunochemicky detekujeme proteiny.
Elektroforetický přenos biomakromolekul na membránu („elektroblotting“) Při tomto způsobu přenosu je využito elektrického pole. Používá se pro přenos biomakromolekul z polyakrylamidových gelů. Pro přenos z agarózových gelů není vhodny, protože se vlivem elektrického pole vyvíjí značné množství tepla, v důsledku čehož by při nedostatečném chlazení mohlo dojít k roztavení agarózového gelu.
- 48 -
Obr.: Aparatura pro elektroforetický přenos biomakromolekul na membránu Materiál a chemikálie: - Gel s přenášeným proteinem - Aparatura pro elektroforetický přenos - Filtrační papír - Nitrocelulosová membrána - Rukavice - Přenosový pufr (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glycin, 0,1% SDS) Pracovní postup: 1. Ustřihneme membránu a filtrační papír podle velikosti gelu. Při práci s membránou pracujeme zásadně v rukavicích, abychom se vyvarovali případné kontaminace membrány. Zastřižením jednoho rohu membrány si označíme orientaci gelu. 2. Gel, membránu, filtrační papíry a vláknité podložky ekvilibrujeme 15 minut v přenosovém pufru. 3. Jednotlivé části „sendvičové“ sestavy uspořádáme v kazetě následujícím způsobem: a. Kazetu umístíme na čistý povrch, šedou deskou dolů. b. Vložíme navlhčenou vláknitou podložku na šedou stranu kazety. c. Na vláknitou podložku položíme zvlhčený filtrační papír. d. Na filtrační papír dáme ekvilibrovaný gel, na který ve zvolené orientaci umístíme připravenou membránu.
- 49 e. Sestavu zkompletujeme položením navlhčeného filtračního papíru na membránu a následným vložením vláknité podložky. f. Kazetu uzavřeme přiklopením průhledné desky a sepnutím obou desek klipsnou (viz. obr.)
Pozn.: Jednotlivé vrstvy musí k sobě těsně přiléhat, případné bubliny se negativně projeví na účinnosti přenosu. Bubliny mezi vrstvami odstraníme rolováním skleněnou tyčinkou. 4. Uzavřenou kazetu s gelem a membránou umístíme do elektrodové jednotky.
5. Elektrodovou jednotku vložíme do rezervoáru pufru. Při vkládání dbáme správné orientace vzhledem ke směru elektrického pole. (Pro studenty se slabšími znalostmi fyzikálních procesů – dodržovat barevné značení na aparatuře: červená k červené a černá k černé).
- 50 -
6. Přidáme chladicí blok vymražený na -20°C a rezervoár zcela naplníme vychlazeným přenosovým pufrem.
7. Do rezervoáru vložíme magnetické míchadélko a aparaturu postavíme na el.-mag. plotnu. Rychlost míchání nastavíme tak, aby vyvíjející se teplo a migrující ionty byly rovnoměrně distribuovány.
8. Aparaturu uzavřeme nasazením víka s kably a připojíme ke zdroji napětí. Na zdroji nastavíme limitní parametry pro přenos na 30 V a 90 mA. Nastavením limitů zajistíme, že během přenosu nedojde k přehřátí aparatury. Přenos necháme probíhat přes noc.
- 51 -
9. Po ukončení přenosu rozebereme blotovací „sendvičovou“ sestavu a proteiny na membráně detekujeme pomocí protilátek.
„Dot blot“ („slot blot“) Uvedené termíny slouží k označení postupů, při kterých nejsou biomakromolekuly přenášeny za použití některé z výše zmíněných technik z gelu na membránu, ale jsou na membránu jednoduše naneseny pomocí mikropipety. Nanesené vzorky se do membrány vsáknou ve tvaru teček (dot) nebo čárek (slot). Tato technika se používá např. při analýze frakcí získaných chromatografickou separací pro zjištění, ve kterých frakcích je hledaný protein přítomen nebo jako zkušební test pro zjištění, jaká koncentrace izolovaného proteinu či jaké ředění primární nebo sekundární protilátky jsou vhodné k dostatečně citlivé imunodetekci. Detekce naneseného proteinu probíhá stejně jako u vzorků přenesených na membránu z gelu. Materiál a chemikálie: - Nitrocelulosová membrána - Protein p53 - Pipety - Špičky, mikrozkumavky - Rukavice - Pufr na ředění proteinu p53 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8) Pracovní postup: 1. Ze zásobního roztoku proteinu p53 připravíme postupným ředěním koncentrační řadu vzorků tak, abychom měli protein 1 x (původní koncentrace), 10 x, 100 x a 1000 x zžeděný. 2. Na nitrocelulosovou membránu naneseme mikropipetou po 0,5 l připravených vzorků ve formě kapek. Nanesené vzorky necháme vsáknout a zaschnout. 3. Detekci naneseného proteinu provádíme stejným způsobem jako u vzorků přenesených na membránu z gelu (viz. protokol „Imunochemická detekce proteinů“).
- 52 -
Imunochemická detekce proteinů Princip: Detekci proteinů provádíme často imunochemickými metodami. O něco delší procedura ve srovnání s klasickým barvením proteinů např. Coomassie Briliant Blue R-250 nebo stříbrem je vykoupena vyšší citlivostí a možností detekovat konkrétní bílkovinu pomocí specifické protilátky ve směsi proteinů. Po přenosu na membránu následuje vysycení volných vazebných míst na membráně albuminem nebo mléčnými bílkovinami. Potom membránu inkubujeme v roztoku, který obsahuje protilátku proti hledanému proteinu. Tato tzv. primární protilátka je připravena tak, aby vykazovala silnou specifitu vůči sledovanému proteinu. V dalším kroku se použije sekundární protilátka konjugovaná s enzymem (alkalická fosfatáza, peroxidáza, luciferáza apod.). Sekundární protilátka je druhově specifická, to znamená, že rozeznává primární protilátku podle druhu organizmu, v kterém byla primární protilátka produkována. Pro úspěšnou detekci je nezbytné použít sekundární protilátku se specifitou odpovídající protilátce primární. Samotná detekce je založena na reakci enzymu konjugovaného se sekundární protilátkou. Do inkubační směsi je přidán specifický substrát zvolený tak, aby při jeho přeměně na produkt došlo k barevné reakci nebo emisi světelných kvant. Protože komplex protein-Ab1-Ab2-enzym je ukotven na membráně, k reakci dojde pouze v místech, kde je komplex navázán. Jeho pozice na membráně je indikována zbarvením membrány, případně pozitivním signálem na rentgenovém filmu. Z intenzity zbarvení můžeme odhadnout přibližné množství proteinu v daném místě.
Imunochemická detekce proteinu p53 Materiál a chemikálie: - Nitrocelulosová membrána s přeneseným proteinem p53 - 1 x PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 v 1 000 ml roztoku) - 5% odtučněné mléko v 1 x PBS - Primární protilátka - Sekundární protilátka s konjugovaným detekčním enzymem (ALP) - 1 x PBST (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, 0,5 ml Tween-20 v 1 000 ml roztoku) - Třepačka - Pufr pro ALP (100 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, pH 9,8). - BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolylfosfát); 50 mg/ml ve 100% dimetylformamidu - NBT (nitrobluetetrazolium chlorid); 50 mg/ml v 70% dimetylformamidu - Pipety, špičky - Rukavice Pracovní postup: 1. Membránu s přeneseným proteinem inkubujeme 30 minut v 5% roztoku odtučněného mléka rozpuštěného v 1 x PBS. Inkubaci provádíme při pokojové teplotě za mírného třepání. Tímto krokem zablokujeme volná vazebná místa na membráně. 2. Do misky s membránou přidáme primární protilátku ředěnou v poměru 1:50 - 1:150. Inkubujeme 45 minut při pokojové teplotě za mírného třepání.
- 53 Pozn.: V případě potřeby můžeme inkubaci provádět přes noc. V takovém případě se doporučuje misku s membránou a primární protilátkou vložit do chlazené místnosti s teplotou kolem 4°C.
3. Roztok s primární protilátkou vylijeme a membránu promyjeme 3 x po 5 minutách v roztoku 1 x PBST. 4. Přidáme sekundární protilátku konjugovanou s alkalickou fosfatázou (detekční enzym) v 5% roztoku mléka v 1 x PBS. Ředění sekundární protilátky záleží na množství detekovaného proteinu, pohybuje se v poměrech 1:1000 - 1:10 000. Inkubujeme 45 minut při pokojové teplotě. 5. Membránu promyjeme 3 x po 5 minutách v roztoku 1 x PBST. 6. Po promytí inkubujeme membránu v alkalickém pufru, nutném pro funkci alkalické fosfatázy (100 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, pH 9,8). 7. Přidáme 5-bromo-4-chloro-3-indolylfosfát (BCIP) spolu s nitrobluetetrazolium chloridem (NBT). Na 10 ml inkubačního pufru přidáme 100 l směsi BCIP a NBT získané smícháním zásobních roztoků v poměru 1:2. 8. Alkalická fosfatáza odštěpuje fosfátovou skupinu z BCIP, zbytek sloučeniny vytváří s NBT červenofialové zbarvení membrány v místě navázaného proteinu.
A
B
1
1
2
3
2
4
5
3
6
4
Obr.: Imunochemické stanovení proteinu p53. (A) elektroblot provedený po rozdělení proteinu p53 v polyakrylamidovém gelu. Starty obsahují postupně se zvyšující množství proteinu p53: (1) 2 l; (2) 4 l; (3) 6 l; (4) 8 l; (5) 10 l; (6) 12 l. (B) „Dot blot“ proteinu p53. Na membránu bylo naneseno po 0,5 l neředěného (1); 10 x ředěného (2); 100 x ředěného (3) a 1000 x ředěného (4) proteinu p53.
