Model Peroksidasi Lipid dan Kerusakan Membran Eritrosit Akibat Pajanan Organofosfat In Vitro

Model Peroksidasi Lipid dan Kerusakan Membran Eritrosit Akibat Pajanan Organofosfat In Vitro

Nur Eliyati1, Elly Rachmawaty2, Desy Puspita A.S.2, Eko Suhartono3,4 Pengajar Kimia SMAN 4, Samarinda Studi Kesehatan Masyarakat, Fakultas Kedokteran, Universitas Lambung Mangkurat 3Bag. Kimia/Biokimia, Fakultas Kedokteran, Universitas Lambung Mangkurat 4Kelompok Studi Radikal Bebas dan Pemanfaatan Bahan Alam, Fakultas Kedokteran, Universitas Lambung Mangkurat 2Program

1Staf

Abstrak Organofosfat merupakan senyawa reaktif yang dapat menyebabkan kerusakan membran eritrosit. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui kerusakan membran eritrosit dan peroksidasi lipid yang disebabkan oleh pajanan organofosfat secara in vitro. Penelitian ini menggunakan rancangan penelitian eksperimental semu dengan tujuh kelompok perlakuan, yaitu P0: kelompok eritrosit yang diinkubasi tanpa organofosfat; P 1: diinkubasi dengan organofosfat 0,0125 mg/L; P2: eritrosit yang diinkubasi dengan organofosfat 0,025 mg/L; P3: eritrosit yang diinkubasi dengan organofosfat 0,05 mg/L; P4: eritrosit yang diinkubasi dengan organofosfat 0,1 mg/L; P5: eritrosit yang diinkubasi dengan organofosfat 0,2 mg/L, P6: eritrosit yang diinkubasi dengan organofosfat 0,4 mg/L. Kerusakan membran eritrosit merupakan Hb bebas yang diukur dengan spektrofotometer =546 nm dengan parameter kadar Hb bebas, yang diukur dengan spektrofotometer pada =546 nm. Peroksidasi lipid merupakan kadar diena terkonyugasi. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis korelasi regresi. Hasil penelitian menunjukkan persamaan regresi antara konsentrasi organofosfat dan kerusakan membran eritrosit adalah y = 4,2844 Ln(x) + 22,897 (EC50 = 5,373 g/L) dan hubungan konsentrasi organofosfat dan peroksidasi lipid y = 4,2844 Ln(x) + 22,897 (EC50=1,481 g/L). Kata kunci: organofosfat, peroksidasi lipid, hemoglobin, diena terkonyugasi

Korespondensi: Drs. Eko Suhartono, M.Si Bag. Kimia/Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Lambung Mangkurat, Jl. A. Yani Km 36 Banjarbaru 70712 Indonesia. Email: [email protected].

24

Model Peroksidasi Lipid dan Kerusakan Membran Eritrosit Akibat Pajanan Organofosfat In Vitro (Nur Eliyati, Elly Rachmawaty, Desy Puspita A.S., Eko Suhartono)

Lipid Peroxidation and Erythrocyte Membrane Lysis Model Caused by Organophosphate Exposure In Vitro

Abstract Organophosphate is a reactive compound which causes erythrocyte membrane lysis. This research was conducted to evaluate the erythrocyte membrane lysis and lipid peroxidation caused by organophosphate. This research was a pseudo-experimental research that used seven treatment, i.e P0: erythrocyte incubated without rganophosphate, P1: erythrocyte incubated with organophosphate 0,0125 mg/L; P2: erythrocyte incubated with organophosphate 0,025 mg/L; P3: erythrocyte incubated with organophosphate 0,05 mg/L; P4: erythrocyte incubated with organophosphate 0,2 mg/L; P 5: erythrocyte incubated with organophosphate 0,2 mg/L; P6: erythrocyte incubated with organophosphate 0,4 mg/L. Erythrocyte membrane lysis was free hemoglobin omit measured specthrophotometrically in λ = 546 nm. Omit peroxidation lipid was diena conjugation concentration. The data was analysed using correlation regression. Research findings showed that the regression equation between organophosphate concentration and erythrocyte membrane lysis was y = 4,2844 Ln(x) + 22,897 (EC50 = 5,373 g/L) and the correlation between organophosphate and lipid peroxidation was y = 4,2844 Ln(x) + 22,897 (EC50=1,481 g/L). Keywords: organophospate, lipid peroxidation, haemoglobine, diena conjugation

Pendahuluan Organofosfat merupakan senyawa yang dihasilkan oleh reaksi antara alkohol dengan asam fosfat (phosphoric acid). Senyawa ini disintesis pertama kali pada tahun 1820. Setelah 62 tahun, seorang ahli kimia Jerman yang bernama Bayer AG menemukan kegunaan organofosfat sebagai insektisida. Sejak itu, penggunan organofosfat sebagai pestisida mulai diperkenalkan ke seluruh dunia.1 Organofosfat adalah insektisida yang paling sering digunakan di seluruh dunia sebagai pengontrol serangga tanaman. Organofosfat digunakan secara luas di bidang pertanian, industri, rumah tangga, perkebunan dan peternakan. Selain bermanfaat, organofosfat juga memiliki sifat hematotoksik yang dapat menyebabkan kesakitan dan kematian.1 Pajanan organofosfat secara signifikan dapat menyebabkan penurunan jumlah eritrosit, hemoglobin, hematokrit, dan

trombosit tikus.2 Dosis organofosfat 0,0125 mg/L sudah dapat menyebabkan terjadinya hemolisis.3 Selain itu, organofosfat juga berperan sebagai inhibitor enzim kolinesterase dan menginduksi peningkatan stres oksidatif, yakni ketidakseimbangan antara antioksidan dan radikal bebas.4 Stres oksidatif tersebut dapat menyebabkan pembentukan peroksidasi lipid yang selanjutnya dapat mengakibatkan kerusakan membran sel. Apabila sel tersebut adalah eritrosit, maka dapat menyebabkan keluarnya Hb dari eritrosit. Hal ini akan berakibat pada peningkatan kadar Hb bebas.5 Untuk itu perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui apakah pajanan organofosfat dapat menyebabkan terjadinya lisis membran eritrosit dan stres oksidatif.

25

JKM. Vol.10 No.1 Juli 2010:24-29

Bahan dan Cara Penelitian ini adalah penelitian eksperimental semu. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia/Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Lambung Mangkurat, Banjarbaru. Sampel yang digunakan berasal adalah sel darah merah yang diperoleh dari PMI Cabang Martapura. Bahan yang digunakan antara lain eritrosit, organofosfat (Dursban*20EC), larutan drabkin (Bioanalitaka), kloroform/metanol (Merck), HCl pH 2,5 (Merck), akuades, larutan heptana (Merck), dan bufer fosfat (Merck). Sementara itu, alat yang digunakan meliputi alat gelas (Pyrex®), alat sentrifuga (Centurion®), spektrofotometer (Genesys 20®), mikropipet ® (Transferpette ), inkubator, dan waterbath, stopwach (Hanhart stopstar®). Penelitian ini terbagi 7 kelompok perlakuan dengan 4 pengulangan. Po = tabung berisi 25 μL eritrosit. P1 = tabung berisi 25 μL eritrosit, diberi 25 μL organofosfat 0,0125 mg/L. P2 = tabung berisi 25 μL eritrosit, diberi 25 μL organofosfat 0,025 mg/L. P3 = tabung berisi 25 μL eritrosit, diberi 25 μL organofosfat 0,05 mg/L. P4 = tabung berisi 25 μL eritrosit, diberi 25 μL organofosfat 0,1 mg/L. P5 = tabung berisi 25 μL eritrosit, diberi 25 μL organofosfat 0,2 mg/L. P6 = tabung berisi 25 μL eritrosit, diberi 25 μL organofosfat 0,4 mg/L.

spektrofotometer (semua pekerjaan dilakukan pada tempat gelap). Kelompok perlakuan: berbagai konsentrasi organofosfat (0,0125 mg/L; 0,025 mg/L; 0,05 mg/L; 0,1 mg/L; 0,2 mg/L; 0,4 mg/L) yang akan diuji dimasukkan ke dalam tabung yang berisi eritrosit 25 L dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37oC. Pengukuran Peroksida Lipid Diena terkonjugasi ditentukan dengan cara: sebanyak 0,5 mL eritrosit dicampur dengan 1 mL buffer fosfat dan kloroform/metanol (1:2 v/v) kemudian diiinkubasi selama 2 jam pada suhu 37oC. Selanjutnya dikocok selama 2 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 5 menit. Sebanyak 5 mL larutan pada lapisan bawah dicampur dengan 2 mL akuades yang diasamkan dengan HCl pH 2,5. Kemudian larutan dikocok lagi selama 2 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 5 menit. Lapisan kloroform diambil dan diuapkan hingga kering. Residu dilarutkan dengan 2 mL heptana dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 233 nm dengan larutan heptana sebagai blanko. Perlakuan hematotoksik (P1) : eritrosit sebanyak 0,5 ml dicampur dengan 1 ml organofosfat berbagai konsentrasi dan 7 mL kloroform/metanol (1:2 v/v), diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37oC. Selanjutnya, dikocok selama 2 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 5 menit.

Pengukuran Lisis Membran Eritrosit sebanyak 25 L dimasukkan ke dalam tabung kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37C sambil dikocok pelan-pelan, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 2600 rpm selama 10 menit. Kemudian, supernatan dicampurkan dengan 4,5 mL larutan drabkin. Serapan diukur pada =546 nm dengan menggunakan

Analisis data Data yang diperoleh kemudian diuji korelasi regresi dengan bantuan program Microsoft Excell. Setelah itu, dihitung nilai Efektivitas Concentration 50% EC50, yaitu kosentrasi efektif yang dapat menyebabkan kerusakan

26


membran eritrosit atau peroksidasi lipid sebesar 50% yang ditentukan dengan menggunakan persamaan garis.

adalah y = 4,2844 Ln(x) + 22,897 dengan koefisien korelasi R2 = 0,9427. Dari persamaan tersebut dapat diketahui EC50 sebesar 5,373 g/L, yaitu konsentrasi efektif yang menunjukkan kerusakan membran eritrosit sebesar 50%. Korelasi antara konsentrasi organofosfat dan kerusakan membran eritrosit akibat pajanan organofosfat disajikan pada Gambar 2.

Rasio absorbansi diena terkonyugasi

Hasil dan Pembahasan Korelasi antara konsentrasi organofosfat dengan rasio rerata absorbansi diena terkonjugasi disajikan pada Gambar 1. Persamaan regresi logaritmik antara konsentrasi organofosfat dengan rerata ratio diena terkonjugasi pada eritrosit

25

y = 4.2844Ln(x) + 22.897 R2 = 0.9427

20 15

13.8

10.37

10

20.84

12.83 6.54 4.9

5 0 0

0.1

0.2

0.3

0.4

Konsentrasi organofosfat (mg/L)

Gambar 1. Hubungan Konsentrasi Organofosfat dengan Rasio Absorbansi Diena Terkonyugasi

Rasio absorbansi hemoglobin

60

y = 9.1162Ln(x) + 59.094 R2 = 0.935

50 35.66

40

52.84

40.68 38.23

30 21.8 20.45

20 10 0 0

0.1

0.2

0.3

Konsentrasi organofosfat (mg/L)

Gambar 2. Hubungan Konsentrasi Organofosfat dengan Rasio Absorbansi Hemoglobin

27

0.4

JKM. Vol.10 No.1 Juli 2010:24-29

Persamaan regresi logaritmik antara konsentrasi organofosfat dengan rerata ratio absorbansi hemoglobin adalah y = 9,1162 Ln(x) + 59,094 dengan koefisien korelasi R2 = 0,9350. Dari persamaan tersebut dapat diketahui EC50 sebesar 1,481 g/L, yaitu konsentrasi efektif yang menyebabkan peroksidasi lipid sebesar 50%. Organofosfat dikenal memiliki kemampuan yang sangat tinggi membentuk radikal bebas pada sistem biologis.9 Radikal bebas yang dihasilkan organofosfat antara lain adalah anion superoksida dan radikal hidroksil.4 Paparan organofosfat menyebabkan terganggunya metabolisme berbagai biomolekul.9 Seluruh biomolekul seperti lipid, protein, dan asam lemak dapat diserang oleh radikal bebas. Dari ketiga biomolekul tersebut, lipid adalah yang paling sensitif terhadap serangan radikal bebas. Serangan radikal bebas terhadap lipid, dapat mengakibatkan terbentuknya peroksida. Kerusakan oksidatif lipid tersebut, dinamakan peroksidasi lipid.10,11 Lipid peroksida selanjutnya dapat menyebabkan kerusakan membran sel, salah satunya adalah membran eritrosit. Hal ini disebabkan komponen utama membran sel adalah asam lemak tak jenuh ganda yang sangat rentan terhadap radikal bebas. Kalau membran sel tersebut terserang, maka struktur dan fungsi membran eritrosit akan berubah, yang dalam keadaan ekstrim akhirnya merusak atau mematikan membran eritrosit tersebut. Residu organofosfat dalam tubuh dapat menghambat biosintesis heme, memperpendek masa hidup dan sirkulasi eritrosit, dan meningkatkan kasus anemia. Hasil observasi menjelaskan bahwa terdapat penurunan Hb di dalam eritrosit secara signifikan pada kelompok yang terpajan

organofosfat, dibandingkan dengan kelompok kontrol.4 Salah satu senyawa kompleks yang sangat rentan mengalami peroksidasi lipid adalah lipoprotein. Senyawa ini diketahui merupakan komponen utama penyusun membran sel termasuk eritrosit. Selain adalah pengatur transpor oksigen, sehingga adanya perubahan pada komposisinya dapat menginduksi hipoksia seluler. Lebih jauh lagi, karena ukuran, bentuk, dan kapasitas difusi eritrosit bergantung pada struktur membrannya, maka perubahan pada struktur eritrosit juga menyebabkan penurunan oksigenasi jaringan terutama pada daerah mikrosirkulasi.12 Hasil penelitian ditemukan bahwa peroksidasi lipid menyebabkan kerusakan membran eritrosit akibat paparan organofosfat.3,13 Pada penelitian tersebut organofosfat yang digunakan adalah golongan senyawa diazinon yang direaksikan secara in vitro pada eritrosit tikus. Pada penelitian tersebut yang diukur adalah MDA, yang merupakan produk akhir peroksidasi lipid pada berbagai waktu inkubasi. Simpulan Organofosfat golongan senyawa klorofirifos dapat mengakibatkan kerusakan membran eritrosit dengan nilai EC50 sebesar 5,373 g/L. Organofosfat dapat menyebabkan peningkatan peroksidasi lipid dengan nilai EC50 sebesar 1,481 g/L. Daftar Pustaka 1.

2.

28

Chambers JE and Oppenheimert SF. Toxicological highlight: organophosphate, serine esterase inhibition, and modeling of organophosphate toxicity. Toxicol Sci 2004; 77: 185-7. Kalender Y, Uzunhisarcikli M, Ogutcu A, Acikgoz F, Kalender S. Effects of


3.

4.

5.

6.

7.

diazinon on pseudocholinestrase activity and haematological indices in rats: the protective role of vitamin E. Environ Toxicol and Pharmacol 2006; 22: 46-51. Cindah AC, Sikoki FD, Vincent A, Ijeoma. Toxicity of an organophosphat pesticide (chloropyrifos) on a common Niger Delta Wetland Fish-Tilapia guineesis. J Aplication Sci Environt 2004; 8(2):11-17. Patil JA, Arun J, Govindwar SP. Biochemical eff£ect of various pesticides on sprayers of grape gardens. Indian J Biochem 2003; 18(2):16-22. Guilhermino L, Soares AMVM, Carvalho AP, and Lopes MC. Effectcs of cadmium and parathion exposure on hematology and blood biochemistry of adult male rats. Bulletin of Environ Contamination and Toxicol.1998; 60: 52-9. Stuhlmeier KM, Kao JJ, Wallbrandt P et al. Antioxidant protein 2 prevents methemoglobin formationmin erythrocyte hemolysates. Eur J Biochem. 2003; 270:334-41. Lautan J. Radikal bebas pada eritrosit dan leukosit. Cermin Dunia Kedokteran 1997; 166:49-52.

8. 9.

10.

11.

12.

13.

29

Prchal JT. Diagnosis and treatment of methemoglobinemia. J Biol Chem. 2006; 143:248-55. Poovala VS, Huang H, and Salahudeen AK. Role of oxygen metabolites in organophosphate-bidrin-induced renal tubular cytotoxicity. J Am Society Nephrol. 1999; 10:1746-52. Banerjee BD, Seth V, Bhattacharya A, Charaborty AK, Pasha ST. Oxidatives stress in human poisoning cases following malathion and propuxur ingestion. Toxicology Letters 1998; 95(1): 27-52. Schafer FQ, Yue Qian S, Buettner GR. Iron and free radical oxidations in cell membranes. Cell Mol Biol. 2000; 46(3):657-62. Cazzola R, Rondanelli M, Russo-Volpe S, Ferrari E, Cestaro B. Decreased membrane fluidity and altered susceptibility to peroxidation and lipid composition in overweight and obese female erythrocytes. J Lipid Res. 2004; 45: 1846-51. Altuntas I, Ibrahim K, Hikmet O, Reha D, Halis K and Namik D. The effects of diazinin on lipid peroxidation and antioxidant enzyms in erythrocytes in vitro. Hum Exp Toxicol J. 2004; 23:9-13.

Model Peroksidasi Lipid dan Kerusakan Membran Eritrosit Akibat Pajanan Organofosfat In Vitro

Recommend Documents