Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2011 – ISBN : 978-979-028-378-7 Surabaya, 19 Pebruari 2011 Isolasi Enzim Selulase dan Hemiselulase Asal Bakteri Rumen sebagai Bahan Bioaktivator Pakan Ternak Ruminansia Mirni Lamid Departemen Peternakan Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga E-mail :
[email protected] Abstrak - Selulosa dan hemiselulosa merupakan polisakarida struktural sel tanaman terbanyak di dalam dinding sel tanaman. Beberapa bakteri penghasil enzim selulase dan hemiselulase yang mampu memecah selulosa dan hemiselulosa menjadi glukosa dan hemiselulosa diantaranya adalah bakteri fibrolitik yang hidup di dalam rumen ruminansia. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi dan mengukur aktivitas enzim selulase dan hemiselulase produksi bakteri rumen ternak sapi potong yang dapat digunakan sebagai bahan bioaktivator dalam pakan ternak ruminansia. Uji aktivitas enzim selulase dan hemiselulase dilakukan dengan cara menentukan jumlah gula pereduksi yang terbentuk, yaitu dengan menggunakan metode DNS (asam 3,5dinitrosalisilat) sebagai substrat spesifik. Hasil yang diperoleh dari penelitian adalah bakteri BR2 mampu menghasilkan enzim selulase dengan aktivitas sebesar 0,28 (U/ml), sedangkan bakteri BR1, BR2, BR3, BR4, BR5 mampu menghasilkan enzim hemiselulase dangan aktivitas masing-masing sebesar 10,50, 22,63, 22,63, 8,75, 9,41 (U/ml). Kanta kunci : selulase, hemiselulase, bakteri fibrolitik, ruminansia
PENDAHULUAN Indonesia selain dikenal sebagai negara yang memiliki keanekaragaman hayati yang tinggi juga dikenal sebagai negara penghasil ternak unggas maupun ruminansia. Berkembangnya usaha peternakan ruminansia di Indonesia seperti sapi, kerbau, kambing dan domba, menyebabkan angka pencemaran lingkungan meningkat akibat limbah ternak yang dihasilkan. Limbah ternak tersebut meliputi manure (feses dan urine), darah, tulang, tanduk, isi rumen dan lain-lain (Sihombing, 2000). Berdasarkan hasil penelitian Wibowomoekti (1997), salah satu akibat dari pencemaran air oleh limbah ternak ruminansia yang dialirkan ke Sungai Buaran Jakarta ialah menurunnya kualitas air. Hal ini disebabkan oleh meningkatnya kandungan sulfida dan amoniak bebas
di atas kadar maksimum kriteria kualitas air. Selain itu, limbah ternak masih mengandung nutrisi atau zat padat yang potensial untuk mendorong kehidupan jasad renik, salah satu diantaranya adalah isi rumen (Nurtjahya et al, 2003). Rumen merupakan lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan sejumlah mikroorganisme. Di dalam rumen terdapat sekitar 1010-1012 bakteri pada tiap gram isi rumen (Ogimoto, 1981). Bakteri rumen merupakan bakteri anaerob (tanpa oksigen) dan fakultatif anaerob (ada dan tanpa oksigen) meskipun dalam jumlah kecil. Selulosa adalah komponen terbesar dari tanaman. Selulosa merupakan suatu homopolisakarida linier yang tersusun atas 100-4000 unit monosakarida β-glukosa melalui ikatan β-1,4-glikosidik (Tillman et al, 1991 dan Mc Donald et al, 1995).
B - 456
Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2011 – ISBN : 978-979-028-378-7 Surabaya, 19 Pebruari 2011 Hemiselulosa merupakan polimer bakteri fibrolitik dalam rumen. karbohidrat kompleks yang Beberapa bakteri penghasil enzim mempunyai berat molekul lebih rendah selulase dan hemiselulase yang mampu dari selulosa. Monomer-monomer memecah ikatan lignin dengan selulosa penyusun hemiselulosa adalah xilosa, dan hemiselulosa diantaranya adalah mannosa, galaktosa, glukosa, bakteri yang hidup di dalam rumen arabinosa, glukoronic, galakturonic (Mathews et al, 1990). Ruminansia dan glukoronic acids (Perez et al., (sapi, kambing, kerbau dan domba) 2002). Hemiselulosa memiliki mampu memanfaatkan rumput dan kesamaan dengan selulosa yaitu limbah pertanian sebagai sumber merupakan polimer dari unit-unit gula energi dari hasil pemecahan selulosa yang terikat oleh ikatan glikosidik, dan hemiselulosa oleh enzim selulase tetapi hemiselulosa berbeda dengan dan hemiselulase yang dihasilkan oleh selulosa dilihat dari segi komponen mikroba fibrolitik di dalam rumen unit gula yang menyusunnya, panjang ruminansia. Van Soest (1994) rantai molekul dan percabangan rantai menyatakan bahwa selulosa dan molekul. Sebagian besar hemiselulosa hemiselulosa dalam rumen ternak berbentuk amorf dengan rantai ruminansia mengalami proses bercabang pendek. Derajat fermentasi yang menghasilkan Volatile polimerisasinya hanya 200 sehingga Fatty Acid (VFA) yang dapat lebih mudah mengalami reaksi memenuhi 50 – 60 % kebutuhan oksidasi dan degradasi dibandingkan energi. Bahan limbah serat khususnya selulosa (Sjostrom, 1995). limbah pertanian akan menjadi bahan Kelimpahan selulosa dan bernilai tinggi apabila disamping hemiselulosa di alam menjadikan tingginya kandungan selulosa dan peranan enzim selulase dan hemiselulosa, juga diwaktu yang sama hemiselulase sangat penting untuk kedua komponen tersebut harus dapat proses hidrolisis selulosa dan dihidrolisis menjadi senyawa yang hemiselulosa (Campbell, 1995). mudah terfermentasi. Hidrolisis Pengembangan proses hidrolisis secara hemiselulosa akan menghasilkan xilosa enzimatis merupakan prospek baru 50 – 70 %, arabinosa 5 – 15 % dan untuk penanganan limbah hidrolisis selulosa akan menghasilkan lignoselulosa dan lignohemiselulosa glukosa (Pessoa et al., 1997). yang akan dimanfaatkan untuk Berdasarkan uraian tersebut berbagai aplikasi. Proses tersebut akan diatas maka tujuan penelitian ini sekaligus melestarikan lingkungan dari adalah untuk mengisolasi enzim limbah-limbah lignoselulosa dan selulase dan hemiselulase yang lignohemiselulosa yang berasal dari diproduksi dari rumen sapi potong, limbah pertanian dan industri pertanian yang berpotensi sebagai bahan yang sangat melimpah di Indonesia bioaktivator dalam mendegrasi bahan yang berpotensi sebagai pakan ternak pakan ternak khususnya limbah ruminansia dan unggas. Biodegradasi pertanian yang berserat tinggi. selulosa dan hemiselulosa secara enzimatis dilakukan oleh enzim Metode Penelitian selulase dan hemiselulase yang Sampel Penelitian diproduksi oleh berbagai Sampel yang digunakan adalah mikroorganisme seperti jamur, bakteri lima isolat bakteri fibrolitik hasil dari rumen ternak ruminansia isolasi dari cairan rumen sapi potong (Campbell, 1995). Selulase dan (BR1, BR2, BR3, BR4, BR5) yang hemiselulase banyak dihasilkan oleh merupakan stok dari koleksi B - 457
Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2011 – ISBN : 978-979-028-378-7 Surabaya, 19 Pebruari 2011 Laboratorium Makanan Ternak Uji aktivitas enzim selulase dengan Universitas Airlangga. metode asam 3,5dinitrosalisilat (DNS) Aktivitas selulase dilakukan Prosedur Penelitian dengan cara menentukan jumlah gula Pembuatan media cair Media cair terdiri dari 0,2 g pereduksi yang terbentuk, yaitu dengan trypton; 0,1 g yeast ekstrak; 0,2 g menggunakan metode DNS (asam 3,5NaCl. Semua bahan dilarutkan dalam dinitrosalisilat) menggunakan labu Erlenmeyer 100 ml dengan 20 ml Carboxymethyl cellulose (CMC) akuades. Kemudian ditutup dengan sebagai substrat spesifik. Aktivitas kapas dan aluminium foil. Larutan ini endo-1,4-β-D-glucanase diuji dengan disterilkan dengan autoklaf selama 45 mencampurkan 100 l enzim dan 100 o menit pada suhu 121 C dan tekanan 1 l substrat (1% CMC dalam 0,1 M atm. bufer fosfat sitrat pH 7) dimasukkan dalam tabung Ependorf, diinkubasi dalam penangas air pada 50oC selama Pembuatan media padat 30 menit. Sejumlah gula pereduksi Media cair terdiri dari 0,2 g yang terbentuk diukur aktivitas trypton; 0,1 g yeast ekstrak; 0,2 g enzimnya menggunakan metode asam NaCl; 0,3 g bacto agar. Semua bahan 3,5-dinitrosalisilat (DNS) yaitu dengan dilarutkan dalam labu Erlenmeyer 100 menambahkan 600 µl DNS ke dalam ml dengan 20 ml akuades. Kemudian tabung, lalu dimasukkan dalam ditutup dengan kapas dan aluminium penangas air mendidih selama 15 foil. Larutan ini disterilkan dengan menit bersama-sama dengan kontrol autoklaf selama 45 menit pada suhu (mengandung 100 µl enzim ditambah 121oC dan tekanan 1 atm. 600 µl DNS dan 100 µl substrat tetapi Selanjutnya setelah dikeluarkan tanpa inkubasi) kemudian didinginkan dan sterilisator campuran atau medium dalam air es selama 20 menit. Volume ditunggu sampai suam-suam kuku. total uji aktivitas enzim dengan metode Lalu medium dituang ke dasar cawan DNS dalam penelitian ini sebanyak petri dan dibiarkan sampai menjadi 800 µl, sehingga pengukuran dingin dan padat. absorbansi dilakukan menggunakan cuvet plastik. Selanjutnya, absorbansi Produksi enzim selulase dibaca dengan Spektrofotometer pada Produksi enzim selulase λ 550 nm. Satu unit aktivitas enzim dilakukan dengan menginokulasikan telah didefinisikan sebagai banyaknya 1% inokulum ke dalam 100 ml media enzim yang diperlukan untuk cair yang mengandung Carboxymethyl membentuk 1mol produk per satuan Cellulose (CMC) dalam erlenmeyer waktu untuk setiap ml enzim (Miller, 500 ml dan diinkubasi pada suhu 39oC 1960; Puspaningsih, 2004). selama 16 jam dengan penggoyangan 150 rpm. Hasil inkubasi kemudian Produksi Enzim Hemiselulase disentrifugasi dengan kecepatan 8000 Sebanyak satu ose koloni rpm selama 15 menit dan diambil tunggal lima isolat bakteri fibrolitik supernatannya untuk diuji aktivitas dimasukkan ke dalam 20 ml media enzim selulasenya. Ekstrak kasar cair, diinkubasi dalam shaker enzim selulase adalah supernatan inkubator selama 16 jam pada suhu sedangkan pelet selnya dibuang. 39 0C. Kultur selanjutnya disentrifuge dengan kecepatan 6000 rpm pada suhu 39 0C selama 15 menit. Pelet dibuang, B - 458
Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2011 – ISBN : 978-979-028-378-7 Surabaya, 19 Pebruari 2011 sedangkan supernatan yang unit enzim dibagi kadar protein mengandung enzim hemiselulase (Miller, 1960). diambil untuk digunakan analisis selanjutnya. Hasil dan Pembahasan Uji Aktivitas Hemiselulase dengan Hasil seleksi 5 isolat bakteri metode asam 3,5-dinitrosalisilat fibrolitik masing-masing menggunakan (DNS) Masing-masing sebanyak 100 carboxyl methyl cellulase (CMC) dan oat splet xilan sebagai substrat. l enzim dan substrat hemiselulase Aktivitas selulase dan hemiselulase dimasukkan ke dalam tabung ekstraseluler menunjukkan hasil positif Eppendorf kemudian diinkubasi pada 0 yang ditandai halo (pembentukan zona suhu 39 C dalam penangas air selama bening disekeliling koloni sel) pada 1 jam. Untuk kontrol campurannya media padat. Dari 5 isolat bakteri yang sama seperti sampel tetapi tidak digunakan terdapat 1 bakteri isolat diinkubasi. Sampel dan kontrol lalu BR2 yang memberikan indeks halo ditambahkan 600 l DNS, Selanjutnya terbesar yaitu 1,5 cm pada media CMC dipanaskan dalam air mendidih selama dan 1,4 cm pada media oat splet xylan. 15 menit, lalu diinkubasi dalam Berdasarkan hasil seleksi pada 5 isolat icebath selama 20 menit. Absorbansi bakteri lignoselulolitik yaitu BR1, dibaca pada panjang gelombang 550 BR2, BR3, BR4, BR5 diperoleh isolat nm. 1 Unit aktivitas enzim BR2 yang mempunyai aktivitas didefinisikan sebagai jumlah enzim tertinggi, masing-masing aktivitas yang menghasilkan 1 mol xilosa per selulase sebesar 0,28 U/ml dan menit untuk setiap ml enzim, aktivitas hemiselulase sebesar 8,75sedangkan aktivitas spesifik adalah 22,63 U/ml. Tabel 1. Data Aktivitas Isolat Penghasil Enzim Selulase dan Hemiselulase Asal Bakteri Rumen Aktivitas enzim selulase
Aktivitas enzim hemiselulase
(U/ml)
(U/ml)
BR1
-
10,50
BR2
0,28
22,63
BR3
-
22,63
BR4
-
8,75
BR5
-
9,41
Isolat
B - 459
Aktivitas enzim hemiselulase (U/ml)
Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2011 – ISBN : 978-979-028-378-7 Surabaya, 19 Pebruari 2011 25 20 15 Series1 10 5 0 1
2
3
4
5
Isolat bakteri
Gambar 1. Aktivitas enzim hemiselulase (U/ml) Uji aktivitas enzim selulase dan hemiselulase dilakukan dengan metode DNS yang bertujuan untuk mengetahui adanya gugus aldehid pada gula pereduksi yang selanjutnya dioksidasi menjadi karboksil. Asam 3,5dinitrosalisilat direduksi menjadi asam 3-amino-5-nitrosalisilat dalam kondisi basa. Perubahan warna kuning asam 3,5-dinitrosalisilat menjadi kecoklatan dari asam 3-amino-5nitrosalisilat. Adanya gugus aldehid ditandai dengan perubahan warna kuning menjadi kecoklatan. Gugus aldehid ini berasal dari selulo-oligosakarida hasil hidrolisis selulosa oleh enzim selulase dan xilo-oligosakarida hasil hidrolisis hemiselulosa oleh enzim hemiselulase (Miller, 1950). Menurut la Granga et al. (1996) beberapa spesies bakteri dan jamur dapat menggunakan selulosa dan hemiselulosa sebagai sumber karbon karena mampu menghasilkan selulase dan hemiselulase. Dikatakan oleh Kulkarni et al. (1999) sebagian besar bakteri dan jamur mensekresikan selulase dan hemiselulase ektraseluler yang akan memecah selulosa menjadi glukosa, dan hemiselulosa menjadi xilosa dan glukosa sehingga mikroorganisme tersebut dapat menggunakan glukosa dan xilosa untuk pertumbuhannya.
Hidrolisis selulase dan hemiselulase membutuhkan aktivitas sinergisme dari berbagai enzim selulase dan hemiselulase dengan spesifikasi yang berbeda-beda menghasilkan sistem multienzim. Struktur kimia selulosa dan hemiselulosa yang sangat bervariasi selaras dengan bervariasinya selulase dan hemiselulase yang mempunyai aktivitas selulolitik dan hemiselulolitik yang berbeda-beda. Sistem multienzim dari selulase dan hemiselulase adalah suatu strategi dari mikroorganisme untuk meningkatkan efektivitas hidrolisis selulosa dan hemiselulosa, dimana setiap enzim mempunyai fungsi spesifik (Beg et al., 2001). Selulosa dan hemiselulosa merupakan polisakarida terbesar dalam penyusunan dinding sel tanaman. Hidrolisis hemiselulosa akan menghasilkan xilosa 50 – 70 %, arabinosa 5 – 15 % dan hidrolisis selulosa akan menghasilkan glukosa (Pessoa et al., 1997). Keberadaan selulosa dan hemiselulosa yang bersifat dapat diperbaharuhi (renewable resources) menjadi produk yang mempunyai potensi berguna sebagai sumber energi bagi ternak ruminansia.
B - 460
Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2011 – ISBN : 978-979-028-378-7 Surabaya, 19 Pebruari 2011 Enviromental Microbiology Kesimpulan Dari hasil penelitian yang telah 67:5512-5519. dilakukan dapat diambil kesimpulan Mathews, C.K., Van Holde, K.E., sebagai berikut: Kelima isolat 1990, Biochemistry, fibrolitik dipilih 1 isolat terpilih BR2 Benjamin/Cummings yang memiliki indeks halo masingPublishing Company lnc : masing 1,5 cm dan 1,4 cm, aktivitas USA. Pp 282-285. enzim selulase sebesar 0,28 U/ml dan Mc Donald, P., R.A. Edwards and aktivitas enzim hemiselulase tertinggi J.F.D. Greenhalgh, 1995, sebesar 22,63 U/ml, sehingga Animal Nutrition, Third membuktikan bahwa isolat BR2 Edition, Logman, London and memiliki aktivitas positif terhadap New York. selulase dan hemiselulase. Enzim Miller, Gail Lorenz, 1960, Use of selulase dan hemiselulase berpotensi Dinitrosalicylic Acid Reagent sebagai bioaktivator untuk for Determination of mendegradasi bahan limbah pertanian Reducing Sugar, Analytical yang berserat tinggi sebagai sumber Chemistry., 31 : 426-428. energi bagi ternak ruminansia. Nurtjahya, E., Rumetor, S.D., Salamena, J.F., 2003, Pemanfataan Limbah Ternak Ruminansia untuk DAFTAR PUSTAKA Mengurangi Pencemaran Beg QKM, Kapoor L, Mahajan G, Lingkungan, Makalah Hoondal S., 2001, Microbial Pengantar Falsafah Sains, Xylanase from The Newly Program Pasca Sarjana S-3, Isolated Bacillus sp. Strain Institut Pertanian Bogor. BP-23, Can J Microbial 39 : Ogimoto, 1981., Size Fractination of a 1162-1166. Rumen Microbial Population Campbell, Mary K., 1995, by Counter Centrifugal, Biochemistry, Second Journal of Microbiological Edition, Mount Holyoke Method, Volume 67, Issue 3. College, Saunders College Pessoa, A.JR., I.M. Mancilha and Publishing : United States of S.Sato. 1997. Acid hydrolysis America. Pp 330-332. of hemicellulose from Kulkarni., A. Shendye, and M. Rao. Surgacane Bagasse. Braz. J. 1999, Molecular and Chem. Eng. Vol 14 No.3. Sao Biotechnological a Spects of Paolo. Xylanases, FEMs Microbial. Sihombing, D.T.H., 2000, Teknik Rev. 23:411-456. Pengolahan Limbah La Grange, D.C., Pretorius I.S.., Kegiatan/Usaha Peternakan, Glaeyssens M., Van Zhyl Pusat Penelitian Lingkungan W.H. 2001. Degradation of Hidup Lembaga Penelitian, xylan to D-xylose by Institut Pertanian Bogor. recombinant Saccromyces Sjostrom, E. 1995. Kimia Kayu, cerevisiae coexpressing the Dasar-dasar dan Aspergillus niger ßPenggunaannya xylosidase (XylO) and the diterjemahkan oleh Hardjono Trichoderma resei xylanase Sastrohamidjoyo), Cetakan (Xyn 2) genes. Applied and pertama. Penerbit UGM Press, Yogyakarta. B - 461
Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2011 – ISBN : 978-979-028-378-7 Surabaya, 19 Pebruari 2011 Tillman, A.D.H. Hartadi, S. ed. Cornell University Press Reksohadiprodjo, S. Ithaca and London. Prawirokusumo dan S. Wibowomoekti P.S., 1997, Labdosukojo, 1991, Ilmu Kandungan Salmonella spp. Makanan Ternak Dasar, dari Limbah Cair Rumah Cetakan kelima, Gajah Mada Potong Hewan (Studi Kasus University Press, Yogyakarta. RPH Cakung, Jakarta), Tesis Van Soest, P.J. 1994. Nutritional Program Pascasarjana Institut nd Ecology of the Ruminant, 2 Pertanian Bogor, Bogor.
B - 462
