MikroRNS-ek expressziós mintázatának és patogenetikai szerepének vizsgálata a mellékvese daganataiban

MikroRNS-ek expressziós mintázatának és patogenetikai szerepének vizsgálata a mellékvese daganataiban Doktori értekezés Dr. Tömböl Zsófia Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

Programvezető: Prof. Dr. Rácz Károly, egyetemi tanár, MTA doktora Témavezető: Dr. Igaz Péter PhD, egyetemi adjunktus Hivatalos bírálók: Dr. Buzás Edit, egyetemi docens, MTA doktora Dr. Orbán Tamás PhD, tudományos főmunkatárs Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Kovalszky Ilona, egyetemi tanár, MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Fekete Csaba, tudományos tanácsadó, MTA doktora Dr. Beke Artúr PhD, egyetemi adjunktus

Budapest 2011

TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE.................................................................................................... 5 GYAKRABBAN HASZNÁLT GÉNSZIMBÓLUMOK (GENE SYMBOL) ÉS FEHÉRJE RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE.................................................................................................... 7 I. BEVEZETÉS ........................................................................................................................... 9 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ............................................................................................... 11 II.1. A miRNS-ek biológiája................................................................................................. 11 II.1.1. A miRNS-ek bioszintézise ................................................................................ 11 II.1.2. Nevezéktan ...................................................................................................... 15 II.1.3. A miRNS-eken keresztül megvalósuló poszttranszkripciós szabályozás mechanizmusa ........................................................................................................... 15 II.1.4. A miRNS-ek potenciális célmolekuláinak azonosítása bioinformatikai módszerekkel ............................................................................................................. 18 II.1.4.1. A target predikció elvi alapjai: a miRNS-ek kötődését befolyásoló tényezők... 18 II.1.4.2. A leggyakrabban használt target predikciós algoritmusok összehasonlítása .. 22 II.1.4.3. A target predikciós algoritmusok használata során felmerülő problémák....... 23 II.1.5. A bioinformatikai módszerekkel prediktált targetek kísérletes validálása .............. 24 II.1.6. A miRNS-ek élettani funkciói és patogenetikai szerepe ....................................... 25 II.1.6.1. A miRNS-ek daganatképződésben betöltött szerepe ......................................... 26 II.2 A sporadikus mellékvesekéreg daganatok előfordulása és molekuláris patomechanizmusa................................................................................................................ 29 II.2.1. Sporadikus mellékvesekéreg daganatok ............................................................. 29 II.2.2. Sporadikus mellékvesekéreg daganatokban leggyakrabban észlelt génexpressziós és kromoszomális eltérések ............................................................................................. 30 II.3. A phaeochromocytomák előfordulása és molekuláris patomechanizmusa ............. 35 II.3.1. A phaeochromocytomák előfordulása és gyakorisága.......................................... 35 II.3.2. Öröklődő daganatszindrómákhoz társuló phaeochromocytomák molekuláris patomechanizmusa ..................................................................................................... 36 II.3.3. Malignus phaeochromocytomákra jellemző molekuláris eltérések ....................... 39 II.3.4. Phaeochromocytomák esetében észlelt legfontosabb génexpressziós és kromoszomális eltérések ............................................................................................. 40 III. CÉLKITŰZÉSEK .............................................................................................................. 46 IV. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK......................................................................................... 47 IV.1. Betegek és szövetminták.............................................................................................. 47 IV.2. RNS izolálás ................................................................................................................. 50

2

IV.3. miRNS expressziós profil meghatározása nagy áteresztőképességű technikákkal 51 IV.3.1. miRNS expressziós mintázat vizsgálata mellékvesekéreg daganatokban TaqMan Human miRNS Panel segítségével............................................................................... 51 IV.3.2. miRNS expressziós profil microarray vizsgálata phaeochromocytomákban ......... 52 IV.4. miRNS expressziós eredmények validálása qRT-PCR módszerrel ........................ 54 IV.4.1. qRT-PCR eredmények normalizálása és statisztikai elemzése ............................ 56 IV.5. miRNS biomarkerek azonosítása ............................................................................... 56 IV.6. Teljes génexpressziós microarray vizsgálatok mellékvesekéreg daganatokban .... 57 IV.7. A TOP2A microarray során észlelt expressziós eltéréseinek validálása qRT-PCR módszerrel ............................................................................................................................. 58 IV.8. A szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek potenciális cél mRNS-einek azonosítása bioinformatikai módszerekkel......................................................................... 59 IV.9. Biológiailag releváns cél mRNS-ek bioinformatikai módszerekkel történő azonosítása mellékvesekéreg daganatokban....................................................................... 60 IV.9.1. Mellékvesekéreg daganatokban expresszálódó szövetspecifikus targetek azonosítása ................................................................................................................ 60 IV.9.2. Ellentétes expressziós változást mutató targetek azonosítása (Gene Set Enrichment Analysis) ................................................................................................................... 61 IV.10. Útvonal analízis.......................................................................................................... 65 V. EREDMÉNYEK................................................................................................................... 68 V.1. A miRNS-ek expressziós mintázatának és patogenetikai szerepének vizsgálata mellékvesekéreg daganatokban ........................................................................................... 68 V.1.1. miRNS expressziós mintázat vizsgálata mellékvesekéreg daganatokban .............. 68 V.1.2. Mellékvesekéreg carcinomák azonosítására alkalmas miRNS biomarkerek .......... 73 V.1.3. Teljes génexpressziós (mRNS) microarray vizsgálatok mellékvesekéreg daganatokban ............................................................................................................. 74 V.1.4. A TOP2A expressziós eltéréseinek validálása qRT-PCR módszerrel .................... 75 V.1.5. A szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek összes prediktált és szövetspecifikus targetjeinek azonosítása mellékvesekéreg daganatokban ...................... 76 V.1.6. A szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek ellentétes irányban változó expressziójú (szövetspecifikus) targetjeinek azonosítása (Gene Set Enrichment Analysis)

................................................................................................................................. 79 V.1.7. Mellékvesekéreg daganatok patomechanizmusában szerepet játszó útvonalak azonosítása (Ingenuity Pathway Analysis).................................................................... 80

3

V.2. A miRNS-ek expressziós mintázatának és patogenetikai szerepének vizsgálata phaeochromocytomákban .................................................................................................... 84 V.2.1. FFPE blokkokból izolált RNS minták minősége és alkalmazhatósága phaeochromocytomák miRNS expressziós profiljának meghatározására ........................ 84 V.2.2. miRNS expressziós mintázat vizsgálata különböző típusú öröklődő és sporadikus phaeochromocytomákban ........................................................................................... 86 V.2.3. Sporadikus recidíváló phaeochromocytomák azonosítására alkalmas miRNS biomarkerek ............................................................................................................... 92 V.2.4. A szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek prediktált targetjeinek azonosítása phaeochromocytomákban ......................................................................... 92 V.2.5. Phaeochromocytomák patomechanizmusában szerepet játszó útvonalak azonosítása (Ingenuity Pathway Analysis) ..................................................................................... 93 VI. MEGBESZÉLÉS ................................................................................................................ 95 VI.1. miRNS expressziós mintázat és a miRNS-ek patogenetikai szerepének vizsgálata mellékvesekéreg daganatokban ........................................................................................... 95 VI.2. miRNS expressziós mintázat és a miRNS-ek patogenetikai szerepének vizsgálata phaeochromocytomákban .................................................................................................. 113 VII. KÖVETKEZTETÉSEK ................................................................................................. 124 VIII. ÖSSZEFOGLALÁS ...................................................................................................... 126 IX. SUMMARY ....................................................................................................................... 127 X. IRODALOMJEGYZÉK .................................................................................................... 128 XI. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁHOZ KAPCSOLÓDÓ KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE ................................................................................................................................................... 146 XII. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁHOZ SZOROSAN NEM KAPCSOLÓDÓ KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE ............................................................................................ 147 XIII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS....................................................................................... 148

4

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE A: adenin ACA: mellékvesekéreg (adrenocorticalis) adenoma ACC: mellékvesekéreg (adrenocorticalis) carcinoma ACTH: adrenocorticotrop hormon ANOVA: variancia-analízis (Analysis of Variance) AUC: görbe alatti terület (Area Under the Curve) bp: bázispár C: citozin cAMP: ciklikus adenozin-monofoszfát cDNS: komplementer dezoxiribonukleinsav CGH: komparatív genom hibridizáció CPA: kortizol-termelő mellékvesekéreg adenoma (Cushing-adenoma) CT: cycle threshold dCT: normalizált cycle threshold (delta cycle threshold) DNS: dezoxiribonukleinsav dsRNS: kettős szálú RNS (double stranded RNA) FFPE: formalin-fixált paraffinba ágyazott (formalin-fixed praffin-embedded) G: guanin GEO: Gene Expression Omnibus GO: Gene Ontology GSEA: Gene Set Enrichment Analysis IA: hormonálisan inaktív mellékvesekéreg adenoma IPA: Ingenuity Pathway Analysis LOH: heterozigócia elvesztése (loss of heterozigosity) MEN1: multiplex endokrin neoplasia 1-es típusa MEN2: multiplex endokrin neoplasia 2-es típusa mRNS: hírvivő ribonukleinsav (messenger RNA) miRNP: mikro-ribonukleoprotein komplex miRNS, miR: mikroRNS MTC: medulláris pajzsmirigy carcinoma NA: normális (ép) mellékvese ncRNS: fehérjét nem kódoló RNS (non-protein-coding RNA) NF1: 1-es típusú neurofibromatosis nt: nukleotid

5

PGL: paraganglioma PGL1-4: familiáris paraganglioma szindróma 1-4 típus pSILAC: pulzatilis SILAC (pulsed stable isotope labeling with amino acids in cell culture) qRT-PCR: kvantitatív valós idejű (real-time) reverz transzkripciós polimeráz láncreakció (quantitative reverse transcription polimerase chain reaction) RIN: RNS integritás szám (RNA Integrity Number) RISC: RNS-indukált csendesítő komplex (RNA induced silencing complex) RNS: ribonukleinsav RNSi: RNS interferencia ROC: Receiver Operating Characteristics Analysis RT: reverz transzkripció SB: sporadikus benignus phaeochromocytoma SD: standard deviáció SEM: átlag szórása (standard error of mean) SILAC: stable isotope labeling with amino acids in cell culture siRNS: kis interferáló RNS (small interfering RNA) snRNS: kis magi RNS (small nuclear RNA) snoRNS: kis nukleoláris RNS (small nucleolar RNA) SR: sporadikus recidíváló phaeochromocytoma ssRNS: egyszálú RNS (single stranded RNA) TGS: Total Gene Signal TLDA: TaqMan Low Density Array U: uracil 3' UTR: 3' nem transzlálódó régió (3' untranslated region) 5' UTR: 5' nem transzlálódó régió (5' untranslated region) VHL: von Hippel-Lindau szindróma WHO: World Health Organization

6

GYAKRABBAN

HASZNÁLT

GÉNSZIMBÓLUMOK

(GENE

SYMBOL) ÉS FEHÉRJE RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE AGO1-4: Argonaute 1-4 (Argonauta fehérje 1-4) AKT2: v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 2, protein kinase B beta CDKN1C, 1B: cyclin-dependent kinase inhibitor 1C, 1B (ciklin dependens kináz inhibitor 1C (p57kip2), 1B (p27kip1)) CCNB1, B2, D1, E: cyclin B1, B2, D1, E (ciklin B1, B2, D1, E) CDC2, 25A, 25B, 25C, 73: cell division cycle 2, 25A, 25B, 25C, 73 CDK1, 2, 4: cyclin-dependent kinase 1, 2, 4 (ciklin-dependens kináz 1, 2, 4) C-MYC: v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog COX1, 2: cytochrome c oxidase subunit 1, 2 (ciklooxigenáz-1, 2) H19: H19, imprinted maternally expressed transcript (anyai imprinting alatt álló transzkriptum (fehérjét nem kódol)) HIF1α, 2α: hypoxia inducible factor 1, 2 alpha subunit (hipoxia-indukált faktor 1α, 2α) HIF1AN: hypoxia inducible factor 1, alpha subunit inhibitor (hipoxia-indukált faktor 1, alfa alegység inhibitor) IGF-1R: insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1 receptor) IGF-2: insulin-like growth factor 2 (somatomedin A) (inzulinszerű növekedési faktor 2) IGFBP-2, 5: IGF-binding protein 2, 5 (IGF-kötő fehérje 2-es, 5-ös típus) mTOR: mammalian target of rapamycin MTPN: myotrophin MYCN: v-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived NF1: neurofibromin 1 POL2, POL3: RNA polymerase 2, 3 (RNS-polimeráz-2, -3) PRKA: protein kinase A, cAMP-dependent (cAMP-dependens protein kináz) PRKAR1A: protein kinase, cAMP-dependent, regulatory, type I, alpha (tissue specific extinguisher 1) (cAMP-dependens protein-kináz RIα inhibitor alegység) pVHL: von Hippel-Lindau tumor suppressor protein (von Hippel-Lindau fehérje) RET: rearranged during transfection SDHB, C, D: succinate dehydrogenase complex, subunit B, C, D iron sulfur (szukcinát dehidrogenáz B, C, D alegység) SDH5 (SDHAF2): succinate dehydrogenase complex assembly factor 2 TOP2A: topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa (topoizomeráz 2A) TP53: tumor protein p53 (p53)

7

TRBP: TAR RNA binding protein (TAR RNS-kötő fehérje) VEGF: vascular endothelial growth factor (vascularis endotheliális növekedési faktor) VEGF-2R: vascular endothelial growth factor receptor-2 (vascularis endotheliális növekedési faktor receptor 2) VHL: von Hippel-Lindau tumor suppressor (von Hippel-Lindau gén) WNT: wingless-type MMTV integration site family

8

I. BEVEZETÉS Az elmúlt két évtizedben az egyre korszerűbb, nagy áteresztőképességű (highthroughput) molekuláris vizsgálati technikák általánossá válásának köszönhetően a molekuláris biológiai kutatások robbanásszerű fejlődésnek indultak. Az ezzel együtt járó hatalmas nyers adathalmaz feldolgozására a tudomány egy új határterülete, a bioinformatika fejlődött ki. Az elmúlt években mind a kísérleti alapokon nyugvó molekuláris biológiai, mind pedig az annak eredményeit feldolgozó "in silico" kutatások érdeklődésének egyik középpontjába az újonnan felfedezett mikroRNS-ek (miRNS, miR) kerültek. A miRNS-ek rövid, körülbelül 20-24 nukleotid hosszúságú, fehérjét nem kódoló, egyszálú RNS molekulák, melyek az RNS interferencia (RNSi) endogén mediátorainak tekinthetők {1}. Az RNSi jelenségét először kívülről bejuttatott kétszálú (double stranded) RNS-ek (dsRNS) nyomán jelentkező RNS lebomlásként írták le {2}. Az exogén RNS-ekből ún. rövid interferáló (short interfering) RNS-ek (siRNS) képződnek, amelyek komplementer szekvenciájú cél mRNS-eikhez kötődve, azokat rendkívül specifikusan

képesek

gátolni,

ezáltal

a

génexpresszió

poszttranszkripciós

szabályozásának egyik alapvető mechanizmusát képviselik. Az siRNS-eket a molekuláris

biológiai

kutatásokban

kiterjedten

használják

a

génexpresszió

befolyásolására. A későbbi kutatások során kiderült, hogy az RNSi jelensége nemcsak exogén RNS-ek útján, hanem a genomban kódolt endogén RNS-ek révén is megvalósul {3-4}. A miRNS-eket kódoló gének megtalálhatóak a legkülönbözőbb fajok, így az ember genomjában is, kifejeződésük (expressziójuk) egy adott szervezeten belül sejtilletve szövetspecifikus {5}. A máig azonosított humán miRNS szekvenciák száma meghaladja az ezret (miRBase adatbázis, Release 17, 2011. április; www.mirbase.org). A miRNS-ek velük részlegesen komplementer nukleotid szekvenciájú hírvivő RNSekhez (mRNS) képesek kapcsolódni, ezáltal a célmolekulák poszttranszkripciós gátlását eredményezik {4-5}. Egy miRNS molekula akár több száz komplementer szekvenciájú mRNS-t gátolhat, ugyanakkor egy mRNS molekula több miRNS szabályozása alatt is állhat {5-6}. A miRNS-ek nagyszámú potenciális célmolekuláinak azonosítása jelenleg bioinformatikai módszerek segítségével történik {1, 7}.

9

A miRNS-ek az epigenetikai szabályozás résztvevőiként fontos szerepet töltenek be a sejtek működéséhez elengedhetetlen gének expressziójának finom szabályozásában. Ezáltal élettani körülmények között befolyásolják a jelátvitel, a sejtosztódás, az apoptózis és a sejtdifferenciálódás folyamatait, részt vesznek az intermedier anyagcsere szabályozásában, kulcsfontosságú szabályozó szerepet töltenek be az embriogenezis egyes szakaszaiban, valamint részt vesznek a szervezet homeosztázisának fenntartásában is {8-9}. A miRNS-ek célmolekuláinak sokszínű funkcióját figyelembe véve érthető, hogy a megváltozott expressziójú miRNS-ek számos kórkép kialakulásában patogenetikai szerepet játszhatnak {9}. A legtöbb irodalmi adat a miRNS-ek daganatképződésben betöltött kóroki szerepéről áll rendelkezésünkre. Máig számos szolid és haematológiai daganat esetében írtak le jellemző miRNS expressziós mintázatot, amelynek vizsgálata bizonytalan diagnózis esetén a daganatok osztályozását, valamint sok esetben a dignitás megállapítását és a prognózis előrejelzését is lehetővé teszi {6, 10}. Az endokrin rendszer daganatai közül korábban az agyalapi mirigy {11-12}, a pajzsmirigy {13-14}, a mellékpajzsmirigy {15}, az endokrin pancreas {16} valamint a petefészek {17} különböző eredetű tumorai esetében tanulmányozták a miRNS-ek kifejeződését. A miRNS-ek mellékvese daganatok kialakulásában betöltött szerepéről eddig nem álltak rendelkezésre adatok, ezért munkám során a mellékvese kéreg és velő eredetű daganatainak miRNS expressziós mintázatát vizsgáltam, és olyan miRNS biomarkereket kerestem, amelyek alkalmasak lehetnek az említett daganatok egyes alcsoportjainak

elkülönítésére

és

a

malignitás

eldöntésére.

Bioinformatikai

módszerekkel azt is vizsgáltam, hogy a megváltozott expressziójú miRNS-ek mely biológiai útvonalak poszttranszkripciós befolyásolásán keresztül játszhatnak szerepet az említett daganatok kialakulásában. Az így azonosított patogenetikai útvonalak egyes tagjai a jövőben a mellékvese daganatok hatékony gyógyszeres kezelésének célpontjai lehetnek.

10

II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS II.1. A miRNS-ek biológiája II.1.1. A miRNS-ek bioszintézise A teljes humán genom 3.2 milliárd bázispárból áll, amelyből a fehérjét kódoló körülbelül 30 ezer annotált gén csupán 1-3 %-ot tesz ki {18-19}. Bár a genomban hordozott információ csak kis százalékban transzlálódik, egyes Expressed Sequence Tag (EST) adatok alapján a DNS mintegy 60-70%-a transzkripcióra kerül egyik vagy másik szálról {20}. A transzkripciós és transzlációs arányok közötti jelentős különbség vezetett a fehérjét nem-kódoló RNS-ek (ncRNS), köztük a miRNS-eket kódoló gének azonosításához, és a korábbi "junk" ("szemét") DNS koncepció megváltozásához. A miRNS-eket kódoló gének lokalizációjuk szerint lehetnek intra- vagy intergénikusak {21-22}. Leggyakrabban (70%-ban) annotált, fehérjét kódoló gének intronikus (és/vagy exonikus, bár ennek előfordulása jóval ritkább) szakaszaira lokalizálódnak, amelyek a transzkripció folyamata során kivágásra kerülnek az első lépésben szintetizált prekurzor mRNS-ből. Az intronikus (és/vagy exonikus) miRNS gének a fehérjét kódoló exonokkal azonos orientációjú, szenz DNS szálon helyezkednek el, így az annotált "host" ("gazda") gén részeként kerülnek átírásra, önálló promóterrel nem rendelkeznek {21}. További 30%-uk {21} fehérjét nem kódoló, intergénikus régiókban található, távol a fehérjét kódoló génektől, így független transzkripciós egységet alkotnak {20-26}. A miRNS-eket kódoló gének kis hányada önálló szabályozási egységként, annotált gének antiszenz szálának intronikus illetve exonikus régióiban, pszeudogéneken vagy transzpozonokon belül található {20-21}. A miRNSgének a genomban előfordulhatnak egymástól különállóan (> 50 kilobázis távolság), önálló transzkripciós egységet képezve, valamint egymás közelében, klasztereket alkotva {21, 27}. A

miRNS-eket

kódoló

régiók

azonosítása

napjainkban

elsősorban

bioinformatikai módszerekkel, "in silico" klónozással történik. Számos algoritmus (pl.: miRScan, miRAlign) létezik, amelyek segítségével az emlős genomban előforduló miRNS-gének számát 200-1000-re becsülik. Ez alapján a miRNS-t kódoló gének az ismert gének 1-3%-át teszik ki, de ez a szám folyamatosan növekszik {21}. A humán

11

genomban a miRNS-gének száma akár az ezret is elérheti {28-29}. Bár a miRNS-gének genomiális elhelyezkedéséről egyre több ismerettel rendelkezünk, a transzkripciójukat szabályozó mechanizmusokról csak nagyon keveset tudunk. Annak ellenére, hogy a miRNS-eket kódoló genetikai információ összessége egy adott szervezet valamennyi sejttípusában megtalálható, a miRNS-ek (a fehérjét kódoló génekhez hasonlóan) különböző sejttípusokban eltérő mértékben fejeződnek ki, expressziójukra sejt- és szövetspecifikusság jellemző {5}. A miRNS-ek az élővilágban széleskörűen elterjedt szabályozó molekulák, amelyek az evolúció során nagyfokú konzerváltságot mutatnak. Bár egymástól rendszertanilag távol álló fajokban egyaránt megtalálhatók, a miRNS bioszintézis főbb lépései jelen ismereteink szerint univerzálisak az élővilágban {30} (1. ábra). A miRNSek az őket kódoló génekről RNS-polimeráz segítségével íródnak át {26, 31-32}. Transzkripciójukért főként az RNS-polimerázok közül legmagasabb szintű szabályozást biztosítani képes enzim, az RNS-polimeráz-2 (POL2) felelős, hasonlóan az mRNS és egyes ncRNS (snoRNS és snRNS) molekulákhoz, emellett felmerült az RNS-polimeráz3 (POL3) szerepe is. {30-32}. A transzkripció során keletkező prekurzor molekula a megközelítőleg 1 kilobázis hosszúságú, "hajtűkanyar" szerkezetű, kettősszálú primer miRNS (pri-miRNS). A "hajtűkanyar" bázisánál elhelyezkedő, körülbelül 10 bázispár (bp) hosszúságú hélix szerkezet a további érés folyamatában nélkülözhetetlen. Ezt ismeri fel a sejtmagban található, RNáz III aktivitású Drosha enzimből és RNS-kötő fehérjékből (emlősökben: DGCR8 = DiGeorge syndrome critical region gene 8; Drosophilában: Pasha = Partner of Drosha) álló komplex, amely a pri-miRNS-t a bázisánál hasítja, így egy körülbelül 60-70 nukleotid hosszúságú, "hajtűkanyar" szerkezetű miRNS prekurzor (pre-miRNS) molekulát szabadít fel {9, 26, 31, 33}. A hasítást követően a pre-miRNS-ek aktív transzporttal a sejtmagból a citoplazmába jutnak a Ran-GTPáz aktivitású Exportin-5 közreműködésével {9, 26, 31, 33}. A citoplazmába kijutott pre-miRNS-t egy másik RNáz III aktivitású enzim, a Dicer és annak kofaktora (TAR RNA binding protein = TRBP) hasítja, kivágva belőle a terminális hurkot. Az így keletkező miRNS duplex egy úgynevezett effektor mikroribonukleoprotein komplexbe (miRNP), más néven miRNS indukált csendesítő komplexbe (miRISC) épül be. A miRISC felépülése a Dicer komplexből dinamikusan történik, ám ennek mechanizmusai egyelőre kevéssé ismertek {33}. A miRISC-ben a

12

miRNS duplex helikáz aktivitású enzimek hatására kicsavarodik, szétválik, az általában 5'-3' irányú vezérszál stabilizálódik, míg a vele komplementer 3'-5' irányú szál (miRNS*) lebomlik. Az így kialakult, miRISC-ben stabilizálódó, 20-24 nukleotid hosszúságú RNS molekulát nevezzük érett miRNS-nek {26, 31}. Újabb megfigyelések szerint azonban az is előfordulhat, hogy mindkét típusú szál akkumulálódik a sejten belül, és egymással párhuzamosan, saját célmolekuláik hatékony poszttranszkripciós gátlását idézik elő {9, 34-35}. Fontos megjegyezni, hogy a miRNS-ek és a kis interferáló RNS-ek (siRNS) érési folyamatai részben átfedéseket mutatnak, alapvetően közös hatásuk az RNSi molekuláris mechanizmusán alapul {3-4}. Emberben máig összesen 1424 különböző érett miRNS létezését igazolták kísérletes úton (miRBase Release 17, 2011. április; www.mirbase.org). A miRNS Regiszter (The miRNA Registry) az eddig tanulmányozott fajokban azonosított miRNS szekvenciák gyűjteménye, emellett az újonnan felfedezett miRNS-ek gyors és egységes annotációját teszi lehetővé.

13

1. ábra: A miRNS-ek bioszintézise és érése A folyamat főbb lépéseinek részletezése a szövegben olvasható. POL2: RNS-polimeráz-2; primiRNS: primer miRNS; DGCR8: DiGeorge syndrome critical region gene 8; pre-miRNS: prekurzor miRNS; TRBP: TAR RNA binding protein; AGO 1-4: Argonauta fehérjék; miRISC: miRNS indukált csendesítő komplex; mRNS: hírvivő RNS; 3' UTR: 3' nem transzlálódó régió.

14

II.1.2. Nevezéktan Az egymástól szekvenciájukban különböző, érett miRNS-eket a "miR-" (miRNS-t kódoló gén és prekurzor megjelölése esetén "mir-") előtag után feltüntetett sorszámmal különítjük el egymástól. Ezért fordulhat elő, hogy szekvencia azonosság esetén különböző, akár egymástól fejlődéstanilag távol eső fajokban azonos számmal jelölt miRNS-ekkel találkozhatunk, amelyeket csak a "miR-" előtag előtt feltüntetett, hárombetűs, adott fajra utaló egyezményes rövidítéssel különböztetünk meg egymástól (pl.: hsa-miR-: H. sapiens; mmu-miR: M.musculus, cel-miR: C. elegans). Amennyiben a genom különböző lókuszairól átíródó, azonos szekvenciájú érett miRNS-eket azonosítanak egy fajon belül, azok a miRNS sorszáma után kötőjellel feltüntetett újabb sorszámozással (pl.: miR-6-1, miR-6-2), míg egy-két nukleotidban eltérő miRNS-ek esetén azok a sorszám után alkalmazott betűvel (pl.: miR-181a, miR-181b) különíthetők el egymástól. Egyes "hajtűszerkezetű" prekurzorok lehetővé teszik, hogy mindkét szálról érett, stabil miRNS szintetizálódjon. Amennyiben az egyik karról szintetizált miRNS túlsúlyban van, a kevésbé domináns miRNS-t csillaggal jelölik (pl.: miR-56, miR-56*). Ha egy adott miRNS a prekurzor 5' karjáról kerül kihasításra a miRNS sorszáma után feltüntetett -5p, míg 3' vég esetén a -3p megjelölés alkalmazandó (pl.: miR-485-5p, miR-485-3p) {36-37}. II.1.3. A miRNS-eken keresztül megvalósuló poszttranszkripciós szabályozás mechanizmusa A miRNS-ek az RNSi endogén mediátoraiként célmolekuláikhoz (mRNS) kapcsolódva azok specifikus, poszttranszkripciós gátlását eredményezik. Ahogy az a fentiekből is kiderült, az érett miRNS-ek a miRISC-kel képeznek működési egységet. A dinamikusan felépülő miRISC az érett miRNS szálon és a korábban részletezett fehérjéken (Dicer, TRBP, helikáz) kívül tartalmazza még a működés szempontjából elengedhetetlen Argonauta fehérjéket (AGO), amelyeknek emlősökben négy altípusa (AGO1-4) ismert. Ezek mindegyikéről feltételezik, hogy szerepet játszhatnak a miRNS-ek által kiváltott poszttranszkripcionális gátlás folyamataiban, ám az RNSi során bekövetkező RNS degradációban eddig csupán az AGO2 részvételét tudták igazolni {33}.

15

Egyelőre csak homályos elképzeléseink vannak arról, hogy a miRNS-ek hogyan ismerik fel célmolekuláikat. A miRNS-kötőhelyek ("site") magasabbrendű fajok esetén általában az mRNS molekulák 3' UTR (3' nem transzlálódó) régiójában találhatók, ahol általában több "site" is előfordul. Ritka esetekben kötőhelyek fordulhatnak elő az 5' UTR-n és a fehérjét kódoló régiókban is, ezek szerepe azonban kevéssé ismert {33}. E szekvenciákat ismerik fel és kötik meg specifikusan a miRISC-ben integrált miRNS-ek, amennyiben azok teljes vagy részleges komplementaritást mutatnak az adott érett miRNS-sel. Növényekben ez a komplementaritás közel tökéletes, amely az mRNS hasításával végződő, RNSi-hoz hasonló mechanizmust eredményez {33}. Ezzel szemben állatokban és emberben általában csak részleges komplementaritás áll fenn a miRNS-t kötő régiók és a miRNS-ek között. A humán genom bioinformatikai vizsgálatán alapuló becslések szerint a fehérjét kódoló gének körülbelül egyharmada állhat miRNS szabályozás alatt, sőt egy miRNS molekula több száz, komplementer szekvenciát hordozó cél mRNS-t szabályozhat, valamint fordítva, egy mRNS molekula több miRNS célpontja is lehet. {38-39}. Állatokban és emberben a miRISC specifikus kötődése következtében megvalósuló poszttranszkripciós géncsendesítés a cél mRNS degradációján vagy a transzláció gátlásán keresztül is végbemehet. Az mRNS molekula miRNS hatásra bekövetkező lebomlásának jelenleg két fő modellje ismert. 1.) A miRNS kötődése az mRNS 3' UTR-n a poly-A farok deadenilációját és szabad 3' véggel rendelkező mRNS kialakulását eredményezi. 2.) A miRISC a transzláció iniciáló lépését gátolja vagy az 5' sapka

felismerésének

vagy

a

riboszomális

60S

alegység

kapcsolódásának

megakadályozásával. Mindkét mechanizmus az mRNS P-testekben történő raktározását és lebomlását okozza. A miRNS-ek által kiváltott posztiniciációs transzláció gátlás mechanizmusát illetően szintén többféle elmélet létezik. 1.) A miRNS kötődése az elongáció lépését lassítja, vagy a riboszóma leválását eredményezi. 2.) Egy eddig ismeretlen proteáz enzim aktiválásán keresztül a transzláció során születő polipeptid lebomlását okozza {33} (2. ábra).

16

2. ábra A miRNS-eken keresztül megvalósuló poszttranszkripciós géncsendesítés lehetséges mechanizmusai A miRNP komplex mRNS 3' UTR-hez való kötődése négyféle feltételezett mechanizmussal idézhet elő poszttranszkripciós gátlást: deadeniláció, iniciációs lépés gátlása, proteolízis, elongáció gátlása. A piros kör a 7-metilguanozin sapkát jelöli. AAAAA: poly-A farok; ORF: nyitott leolvasási keret (open reading frame); miRNP: mikro-ribonukleoprotein komplex; CCR4-NOT: deadenilácós komplex; eIF4E: eukarióta iniciációs faktor 4E; X: ismeretlen proteáz. Filipowicz és mtsai. ábrája alapján {33}.

Korábbi elképzelések szerint állatokban és emberben a miRNS-ek lehetséges hatását a komplementaritás mértéke határozza meg. Ennek megfelelően tökéletes bázispárosodás esetén - hasonlóan a növényekhez - a cél mRNS-ek lebomlása dominál, míg a jóval gyakrabban előforduló részleges komplementaritás esetén transzláció gátlás következik be {4}. Ezt a szemléletet mára jelentősen megváltoztatták a miRNS-ek hatását transzkriptom- és fehérjeszinten párhuzamosan vizsgáló tanulmányok {40-42}. Ezek eredményei szerint ugyanis a miRNS-ek által emlős sejtekben előidézett fehérjeszint-csökkenés erős korrelációt mutat az mRNS expressziós változásokkal. A nagyfokú fehérje expressziós változások hátterében ennek alapján elsősorban az mRNS degradáció elsődleges szerepe feltételezhető, míg a transzláció posztiniciációs szinten

17

megvalósuló gátlása viszonylag csekély mértékű, járulékos tényező {41-43}. Ez az új felismerés az elmúlt két évben jelentős mértékben megváltoztatta a miRNS-ek funkcionális vizsgálatát célzó kutatások szemléletét. II.1.4. A miRNS-ek potenciális célmolekuláinak azonosítása bioinformatikai módszerekkel A

miRNS-ek

biológiai

funkciójának

megértéséhez

elengedhetetlen

azok

célmolekuláinak azonosítása. Mint az eddigiekből is kiderült, egy miRNS több száz, akár ezer mRNS molekulát (target) szabályozhat, így a biológiailag releváns cél mRNSek kísérletes úton történő megismerése rendkívül időigényes és költséges folyamat. Ezért a targetek azonosítása első lépésben általában "in silico" történik. Fontos hangsúlyozni, hogy a bioinformatikai módszerekkel felismert cél mRNS-ek csak prediktált ("jósolt") targetek, ezért az így azonosított miRNS-target interakciók biológiai meglétének és jelentőségének további kísérletes alátámasztása (validálása) szükséges. Az "in silico" target predikció során különböző matematikai algoritmusok segítségével teljes/részleges bázis komplementaritást mutató, evolúciós szempontból különböző konzerváltsági fokú miRNS-kötő "site"-okat keresnek a genom teljes területén. A miRNS-target interakcióra vonatkozó, folyamatosan bővülő ismereteink eredményeképpen jelenleg egyre több, a miRNS-ek kötődését befolyásoló fő- és járulékos tényezőket eltérő mértékben súlyozó target predikciós algoritmus áll rendelkezésünkre. II.1.4.1. A target predikció elvi alapjai: a miRNS-ek kötődését befolyásoló tényezők Növényekben a target predikció viszonylag egyszerű folyamat. Ennek elsődleges oka, hogy növényekben a miRNS-target interakció az esetek jelentős részében közel tökéletes bázispárosodás nyomán jön létre a miRNS és az mRNS fehérje kódoló régiójában található miRNS-kötő "site" között {44}. A növényi miRNS-ek potenciális célpontjainak azonosítása így viszonylag egyszerűen, szekvencia illesztésen alapuló algoritmusok

(pl.:

BLAST

=

Basic

Local

Alignment

Search

Tool,

www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) segítségével történhet {44}. Állatokban és emberben ugyanakkor a miRNS-target kötődés ennél sokkal összetettebb folyamat, amely megnehezíti a target predikciós algoritmusok fejlesztését.

18

Emberben a miRNS-ek a cél mRNS molekulák 3' UTR-n található miRNS-kötő "site"hoz a Watson-Crick bázispárosodás általános szabályai szerint kapcsolódnak. Szemben a növényekkel, ez a kötődés részleges komplementaritás esetén is kialakul {4}. A miRNS-mRNS kötődés megértéséhez szükséges a Lewis és mtsai. által bevezetett, miRNS-t alkotó nukleotidok egységes nómenklatúrájának ismertetése. A miRNS nukleotidok számozása 5'-3' irányban történik (m1, m2, m3...), míg a kötésben velük szemben elhelyezkedő target mRNS-t alkotó nukleotidok a t1, t2, t3... elnevezést kapják {45}. A miRNS gátló hatásának mértékét jelentősen befolyásolja a miRNS 5' vége és az mRNS között kialakuló bázis kötődések száma (1mer, 2mer, 3mer...). Ebből a szempontból a miRNS m1-m8 "seed" ("mag") régiójának és a t1-t8 régiók közötti bázispárosodásnak van elsődleges jelentősége. A "seed" régió több típusát különíthetjük el egymástól (3. ábra), amelyek eltérő mértékű miRNS-hatást közvetíthetnek (azaz a "seed"-ek hierarchikusak). A "seed"-ek hierarchiája a következő: m8-A1 8mer (m2-m8 és t2-t8 között kialakuló 7mer, a t1 pozícióban adeninnal, amely esetén a Watson-Crick bázispárosodás nem feltétlen követelmény) > m8 7mer (m2-m8 és t2-t8 között kialakuló 7mer, ahol a t1 pozícióban adenintől eltérő nukleotid található) > A1 7mer (m2-m7 és t2-t7 között kialakuló 6mer, a t1 pozícióban adenin nukleotiddal, amely esetében a Watson-Crick bázispárosodás nem feltétlen követelmény) > m1 7mer (m1-m7 és t1-t7 között létrejövő 7mer, a t1 pozícióban nem adenin található) > 6mer (m2-m7 és t2-t7 között kialakuló 6mer, ahol a t1 pozícióban nem adenin található){46} (3. ábra). A poszttranszkripciós gátlás mértékét elsődlegesen meghatározó "seed"-ek mellett számos járulékos tényező, így a "seed" régióhoz közeli szekvenciák is módosíthatják a miRNS-ek hatásait. Ezek közül a legjelentősebb a lokális AU (adeninuracil) tartalom és a "seed"-en kívüli nukleotid mismatch-ek (hibás nukleotid párosodás) jelenléte. Az mRNS molekulák "seed" közeli (körülbelül 30 nt mindkét irányban) régiójában előforduló magas adenin- és uraciltartalom a miRNS hatást erősíti {39}. Szintén fokozza a hatást a "seed" régión kívül eső mismatchek jelenléte, amelyek érinthetnek egy vagy akár több nukleotidot is {39}. Az egy nukleotidra kiterjedő mismatch tipikus, miRNS-mRNS interakció esetén gyakran előforduló formája a "G:Ulötyögés" (wobble), amely a guanin és uracil nukleotidok irreguláris Watson-Crick párosodását jelenti, és fokozza a miRNS-ek által kiváltott gátlást {47}. Jelentősnek bizonyult az a megfigyelés is, hogy a miRNS-hatás kialakulásához elengedhetetlen az

19

m9-től az m11-12-ig terjedő szakaszon előforduló, hurok kialakulását eredményező nukleotid mismatch-ek jelenléte, amelyet aztán az m12-13-tól az m17-ig terjedő szakaszon ismét tökéletes komplementaritás (3' bázispárosodás) követ {39}. A mismatch-ek teljes hiánya az m9-m11 régióban a miRNS-hatás elmaradását eredményezi {42} (3. ábra). Szintén befolyásolja az mRNS-hez kötődő miRNS-ek hatékonyságát a kötőhely 3' UTR-n belüli elhelyezkedése. Amennyiben a "site" a 3' UTR bármely végéhez (Stop kodon vagy poly-A farok) közel helyezkedik el (de a Stop kodontól minimum 15 nt távolságra), az erősíti a miRNS hatását (ezek általában az evolúció során konzervált kötőhelyek) {39}. Egy adott mRNS 3' UTR-n belül általában több miRNS-kötőhely is előfordulhat, ezek tartozhatnak egy miRNS-hez, de gyakran előfordul, hogy egy adott mRNS több különböző miRNS-t kötő "site"-ot hordoz. Amennyiben ezek a "site"-ok egymáshoz viszonyítva ~30 nt távolságon belül helyezkednek el, az azonos, de akár a különböző miRNS-ek kötődése is egymás hatását erősítheti {48} (3. ábra).

20

3. ábra: A miRNS-ek kötődését befolyásoló legfontosabb tényezők A: A miRNS kötődés hatékonyságát elsősorban a "seed", a"seed" közeli régiók és a miRNS-kötő "site"-ok 3' UTR-n belüli elhelyezkedése befolyásolja. B: A "seed"-ek típusai és hierarchiája. A: adenin; U: uracil; N-N: Watson-Crick bázispárok; N: tetszőleges nukleotid. m8-A1 8mer és A1 7mer esetén a t1 pozícióban adenin található, azonban az m1-t1(adenin) között kialakuló Watson-Crick bázispárosodás nem feltétlen követelmény, hiánya nem befolyásolja a hierarchiát. Ebben az esetben az m8-A1 8mer valamint az A1 7mer valójában 7mer és 6mer "seed"-ek.

21

II.1.4.2. A leggyakrabban használt target predikciós algoritmusok összehasonlítása A jelenleg létező target predikciós algoritmusok többsége a fent említett tényezőket különböző súlyozással veszi figyelembe. A legszélesebb körben használt algoritmusok a TargetScan (www.targetscan.org) {38-39, 45}, PicTar (www.pictar.org) {49-52} és a miRBase

(www.mirbase.org),

amely

jelenleg

MicroCosm

néven

ismert

(http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/) {36-37, 53-54}. A target predikciós szoftverek száma napról-napra bővül. További algoritmusok a miRanda (www.microrna.org), a miBridge (http://sitemaker.umich.edu/mibridge/home) és

a

PITA

(http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_prediction.html).

Az

algoritmusok általában szabadon hozzáférhető, webes alkalmazás formájában érhetők el, segítségükkel egy adott miRNS potenciális célpontjainak listája az algoritmus alapján kalkulált valószínűségi "score" értékekkel együtt lekérdezhető. Az alábbi táblázat a három leggyakrabban alkalmazott algoritmus által a target predikció során figyelembe vett szempontokat hasonlítja össze (1. táblázat).

"Seed" régió

Egyéb jellegzetességek

Algoritmus Tökéletes Konzerváltsági miRNS 3’UTR Többszörös "Seed" m9-m11 AU filter bázis3' bázispozíció kötőhely hierarchia "mismatch" tartalom párosodás párosodás miRBase v5

Nem

Nem

Nem

Nem

Nem

Nem

Nem

Igen

PicTar

Igen

Részben

Nem

Nem

Nem

Nem

Nem

Igen

TargetScan v4.2

Igen

Igen

Igen

Nem

Igen

Igen

Igen

Igen

1. táblázat: A három leggyakrabban használt target predikciós algoritmus (miRBase, PicTar, TargetScan) által figyelembe vett szempontok összehasonlítása AU tartalom: adenin-uracil tartalom; 3' UTR: 3' nem transzlálódó régió.

22

II.1.4.3. A target predikciós algoritmusok használata során felmerülő problémák Jelenleg nincsen egyértelmű állásfoglalás az egyes target predikciós algoritmusok hatékonyságát illetően, ezért a vizsgáló vagy szubjektív szempontok alapján választ, vagy több algoritmus által adott predikciót vizsgál párhuzamosan, és a specificitás növelése érdekében a listák közötti átfedéseket keresi. Az egyes szoftverek különböző miRNS készlettel, 3' UTR adatbázisokkal és eltérő matematikai algoritmusokkal dolgoznak, így a prediktált célpontok listái, ezzel együtt a targetekhez rendelt valószínűségi "score" értékek jelentős mértékben eltérhetnek egymástól. A TargetScan, a PicTar és a miRBase eltérő összetételű miRNS készletet használ, így előfordulhat, hogy egy adott miRNS szekvenciát nem vizsgál minden algoritmus. Szintén különbözőek lehetnek a vizsgált 3' UTR adatbázisok. Míg a PicTar RefSeq azonosítókat használ a 3' UTR szekvenciák annotálására, a miRBase Ensembl transzkriptum azonosítókat alkalmaz. Bár a harmadik leggyakrabban alkalmazott algoritmus, a TargetScan szintén RefSeq azonosítókkal annotált 3' UTR adatbázisokat elemez, az általa prediktált célpontokat a világhálón génszimbólumokkal megjelölve

teszi

különbözősége

közzé. jelentősen

A

fenti

algoritmusok

megnehezíti

az

által

alkalmazott

azonosítók

prediktált

targetlisták

általuk

összehasonlítását. Ahhoz, hogy az eredmények összevethetők legyenek, egy külső annotációs adatbázis alkalmazása szükséges, amelynek segítségével az egyes azonosítók egymásnak megfeleltethetők. Tovább bonyolítja az eredmények összehasonlítását, hogy az Ensembl és RefSeq azonosítók nem minden esetben feleltethetők meg egymásnak egyértelműen. A target predikciós adatbázisok nagymértékű eltéréseinek hátterében álló másik fontos tényező a korábban már részletezett, eltérő matematikai algoritmusok és evolúciós konzerváltsági szűrők alkalmazása. A target predikció során felmerülő problémák feloldását a jövőben egységes beviteli adatbázisok ("input") és annotációk alkalmazása, illetve az egyes algoritmusok eredményeinek

("output")

kereszt-predikciója

(azaz

eredményeinek vizsgálata más algoritmusokkal) jelentheti.

23

az

egyes

algoritmusok

II.1.5. A bioinformatikai módszerekkel prediktált targetek kísérletes validálása Egy adott miRNS funkciójának megismeréséhez az első lépést a fent ismertetett target predikció jelentheti. Az "in silico" azonosított miRNS-mRNS interakció biológiai relevanciájának alátámasztására azonban további kísérletes megfigyelések szükségesek. A target validálás jelenleg ismert és általánosan alkalmazott aranystandard módszerét a luciferáz-kísérletek jelentik. Ennek során egy konkrét miRNS-target mRNS interakció "in vitro" vizsgálatára nyílik lehetőség. A módszer lényege, hogy egy riporter plazmidba szentjánosbogár luciferázt kódoló gént, közvetlenül utána pedig a validálni kívánt célpont 3' UTR-ét vagy annak miRNS-kötő régióját ültetik be {55-56}. Az így megtervezett plazmidot a vizsgálni kívánt miRNS prekurzorával (pre-miRNS) vagy az endogén miRNS-t csendesítő siRNS molekulával (antagomiR) párhuzamosan juttatják be a kísérleti közegként kiválasztott sejtbe. Ezt követően luminométerrel mérik a bejuttatott luciferáz génről szintetizálódó luciferáz enzim aktivitását. Amennyiben a bejuttatott pre-miRNS-ből szintetizálódó (vagy az endogén) miRNS nem kötődik a vizsgált target 3' UTR-éhez, a luciferáz aktivitása mérhető, ha azonban a vizsgált miRNS-mRNS interakció kialakul, a luciferáz fehérje nem expresszálódik, így a várt színreakció elmarad. A kísérleti rendszer körültekintő megtervezésével és az eredmények korrekt értelmezésével egy adott miRNS-mRNS interakció direkt módon vizsgálható és validálható. A módszer hátránya azonban, hogy egyszerre nem teszi lehetővé nagyszámú célpont vizsgálatát, emellett rendkívül költséges. Ezért joggal fogalmazódott meg az igény olyan nagy áteresztőképességű módszerek iránt, amelyek segítségével egy adott miRNS számos célmolekulája validálható. Ezt az igényt látszik kielégíteni a SILAC ("stable isotope labeling with amino acids in cell culture") és a nemrégiben Selbach és mtsai. által kifejlesztett pSILAC

(pulzatilis

SILAC)

módszer,

amelyek

génexpressziós

microarray

vizsgálatokkal párhuzamosan végezve egyaránt alkalmasak egy adott miRNS célpontjainak transzkriptom- és fehérjeszintű validálására {41-42}. A fent részletezett technikák nehéz kivitelezhetősége és magas költsége, valamint a SILAC és pSILAC módszerek esetén a korlátozott elérhetőség egyaránt hozzájárul ahhoz, hogy a nagyszámú "in silico" prediktált target közül máig csak keveset sikerült kísérletes körülmények között validálni. A különböző fajokban, különböző módszerekkel eddig igazolt miRNS-mRNS interakciók irodalmi adatok

24

alapján

létrehozott

gyűjteménye

a

TarBase

v.5c

adatbázis

(http://diana.cslab.ece.ntua.gr/tarbase/), amely jelenleg 1094 validált humán miRNS célpontról szolgáltat információt {57}. II.1.6. A miRNS-ek élettani funkciói és patogenetikai szerepe A prediktált és validált cél mRNS-ek ismert funkciói alapján a miRNS-ek számos élettani folyamat szabályozásában vehetnek részt, mint például az egyedfejlődés, a differenciálódás, az apoptózis, a sejtosztódás, a vérképzés, különböző endokrin funkciók, stb. {8-9}. A Caenorhabditis elegansban elsőként felfedezett miRNS-ek, a lin-4 valamint a let-7 a fejlődés időzítéséért, a lárvaállapot egyes stádiumai közötti átmenetért {9, 5859}, míg más miRNS-ek a bal-jobb aszimmetria kialakításáért felelősek {8}. Számos Dicer-mutációs és knock-out kísérlet (egér, zebrahal) támasztja alá az érett miRNS-ek korai és késői embriogenezisben valamint sejtdifferenciálódásban betöltött szerepét. Bár az elégtelen Dicer funkcióval rendelkező őssejtek életképesnek bizonyultak, differenciálódásuk mind "in vitro", mind pedig "in vivo" elmaradt {8-9}. A miRNS-ek egyedfejlődésben betöltött szerepének vizsgálata vezetett el a felismeréshez, hogy a miRNS-ek nemcsak térben (a különböző szövetekben), hanem időben is változó, specifikus expressziós mintázatot mutatnak {8}. Szintén kulcsfontosságú szerepet játszanak a miRNS-ek a késői egyedfejlődés során a cardiomyocyták proliferációsdifferenciációs egyensúlyának fenntartásában (miR-1) {8, 60}, az egér haematopoetikus őssejtek B-lymphocyta irányú differenciálódásában (miR-181) {8, 61}, a neuronális differenciálódásban {8}, míg a miR-143 a humán adipocyták érését szabályozza {8, 6263}. A miRNS-ek fejlődéstani szerepük mellett számos egyéb élettani folyamatot is szabályoznak. Egyértelműen bizonyított a miRNS-ek szerepe a hasnyálmirigy inzulin szekréciójának szabályozásában. A miR-375 a myotrophin (MTPN) gén gátlásán keresztül ellenőrzi a glükóz-indukálta inzulin exocitózist {64}. A miR-375 fokozott expresszióját az agyalapi mirigyben is kimutatták, így felvetődik, hogy a miR-375 egyéb hormonok szekréciójának szabályozásában is szerepet játszhat {8, 63}. A miRNS-ek sokoldalú szabályozó szerepét támasztja alá az a tény is, hogy az őket kódoló gének egyes vírusok genomjában szintén megtalálhatók, és ezek elsődleges szerepe a fertőzött

25

sejt védekező mechanizmusainak gátlása lehet {65}. A fent említetteken kívül számos miRNS-ről beigazolódott, hogy kulcsfontosságú szerepet játszik a sejtosztódás és az apoptózis kényes egyensúlyának fenntartásában {66}. Fontos azonban hangsúlyozni e szabályozó funkció szövetspecifikus jellegét, azaz egy adott miRNS egyes szövetekben proapoptotikus, míg máshol anti-apoptotikus szerepet tölthet be {66-67}. A fentiek alapján könnyen belátható, hogy a fiziológiástól eltérő expressziójú miRNS-ek a poszttranszkripciós szabályozó mechanizmusok károsodásán keresztül számos kórélettani folyamat kialakulásában szerepet játszhatnak. A miRNS-ek patogenetikai szerepét eddig több betegség, így neurodegeneratív kórképek {68} és autoimmun betegségek {69-71} esetében is igazolták. Szintén bizonyítottnak látszik a kóroki kapcsolat a megváltozott expressziójú miRNS-ek és az atherosclerosis {72}, a diabetes mellitus {73} valamint számos vírusfertőzés {8, 74} kialakulása között. A fent említett kórképek mellett a legtöbb ismeret jelenleg a miRNS-ek daganatképződésben betöltött patogenetikai szerepéről áll rendelkezésünkre. II.1.6.1. A miRNS-ek daganatképződésben betöltött szerepe A

miRNS-ek

tumorszuppresszor

és

protoonkogén

funkciójú

célmolekulák

poszttranszkripciós gátlásán keresztül szabályozzák a jelátvitel és a sejtciklus bonyolult folyamatait. Expressziójuk kóros változása egy adott sejtben ebből kifolyólag a sejtosztódás és az apoptózis kényes egyensúlyának megbomlásához, fokozott sejtproliferációhoz és daganatképződéshez vezethet. A miRNS-ek tumorigenezisben betöltött szerepére utalhat az a megfigyelés is, hogy a miRNS-t kódoló gének körülbelül fele olyan sérülékeny kromoszomális régiókban található, amelyek aberrációja (transzlokáció, deléció, amplifikáció) gyakran megfigyelhető egyes daganatokban {75}. Az elmúlt két évtizedben a nagy áteresztőképességű microarray technikák elterjedésével

és

a

bioinformatika

rohamos

fejlődésével

párhuzamosan

a

daganatbiológiai kutatások is fellendültek. Egyre több tumor transzkriptomikai vizsgálatát végezték el, és az mRNS expressziós mintázat segítségével számos esetben sikeresen különítették el egymástól az ép és daganatos szöveteket, illetve a különböző szövettani típusú tumorok osztályozására is lehetőség nyílt. Fontos azonban hangsúlyozni, hogy bizonyos szövettani szempontok alapján azonos csoportba sorolt daganatok esetén az egyes minták mRNS expressziós mintázata nagy eltéréseket is

26

mutathat. Emlőtumorok esetében például egy adott betegből a citosztatikus kezelést megelőzően vett primer daganatminta mRNS expressziós mintázata nagyobb mértékben korrelált a kezelés hatására kialakuló génexpressziós profillal, mint a szövettanilag azonos csoportba sorolt többi beteg primer daganatának expressziós mintázatával {76}. Szemben az mRNS expressziós profil vizsgálatával a miRNS-ek az egyes daganattípusok megbízhatóbb klasszifikációját tehetik lehetővé. Ennek hátterében az állhat, hogy egy miRNS molekula több száz cél mRNS-t szabályozhat, így az mRNSekhez képest már jóval kisebb számú miRNS marker vizsgálatával lehetőség nyílik egymástól jól elkülöníthető csoportok felállítására {77}. A miRNS-ek felfedezése óta eltelt évtizedben számos szolid és haematológiai daganat miRNS expressziós mintázatát vizsgálták. Haematológiai daganatok közül a miRNS-ek patogenetikai szerepét elsőként a B-sejtes krónikus lymphoid leukémia esetén igazolták, de ismertek a miRNS expressziós profil eltérései akut myeloid és lymphoid leukémia, primer mediastinalis és diffúz nagy B-sejtes lymphoma, Hodgkinlymphoma és gyermekkori manifesztációjú Burkitt-lymphoma esetében is {78-79}. Szolid tumorok közül is számos daganat esetében írtak le eddig jellegzetes miRNS expressziós mintázatot. A leggyakrabban tanulmányozott tumorok közé a tüdő, a gyomor, a vastagbél, a máj, az emlő, a prosztata és különböző központi idegrendszeri daganatok (glioblastoma multiforme, neuroblastoma, medulloblastoma) tartoznak {10, 78, 80}. Ezek mellett ismertek a miRNS expressziós mintázat eltérései egyes endokrin szervek (agyalapi mirigy, pajzsmirigy, mellékpajzsmirigy, endokrin pancreas, petefészek) daganataiban is {11-17}. Daganatokban az ép szövethez képest megváltozott expressziójú miRNS-ek a klasszikus tumorszuppresszor-onkogén dichotómia mentén osztályozhatók. Ennek alapján a daganatszövetben fokozott expressziót mutató miRNS-ek onkogén ("onkomiR"), míg a csökkent expressziójúak tumorszuppresszor tulajdonságúnak tekinthetők {5}. Az eddigi kísérletes tapasztalatok alapján azonban fontos hangsúlyozni, hogy egy adott miRNS expressziója különböző daganatokban ellentétes irányban is változhat, így ugyanaz a miRNS a szövetspecifikus kontextusnak megfelelően egyaránt lehet tumorszuppresszor vagy onkogén tulajdonságú {5}. Mivel egyes "in silico" becslések alapján a miRNS-ek akár több száz tumorszuppresszor és protoonkogén tulajdonságú célmolekulát is szabályozhatnak (szintén szövetspecifikusan), a miRNS-ek

27

daganatképződésben betöltött szerepének megismeréséhez expressziójuk vizsgálatán kívül elengedhetetlen célpontjaik, és azok biológiai funkcióinak azonosítása. A miRNS-ek expressziós mintázatának tanulmányozása különböző tumorok esetében tehát több szempontból is nagy jelentőségű. Közelebb vihetnek az egyes daganatok patogenezisének pontosabb megértéséhez, valamint a miRNS expressziós mintázat vizsgálatával olyan biomarkerek azonosíthatók, amelyek segítségével egyes daganatok felismerhetők, és egymástól elkülöníthetők. A miRNS-ek biomarkerként történő alkalmazásának egyik gyakorlati megvalósulása a follicularis pajzsmirigyrákok példája. E rosszindulatú daganat follicularis adenomától való kórszövettani elkülönítése nagy gyakorlatot igényel, kétes esetekben azonban négy miRNS marker expressziós eltéréseinek vizsgálata a diagnózist és a későbbi terápia megválasztását segítheti {14}. Szintén fontos biomarkerek lehetnek a miRNS-ek (miR-146, miR-221, miR-222) papilláris pajzsmirigy carcinoma estében is. A miR-221 fokozott expresszióját azonban nemcsak

papillaris

pajzsmirigy

carcinoma

szövetekben,

hanem

a

környező,

szövettanilag még ép területeken is kimutatták. Ez a megfigyelés felveti annak a lehetőségét, hogy a miRNS expresszió megváltozása a daganatképződés kezdeti jele, és segítségével a tumorok akár már korai stádiumban is felismerhetők {13}. Az előző két tényezőn kívül a miRNS expresszió vizsgálata a prognózis megállapítása szempontjából is jelentős lehet, ugyanis egyes daganatok esetében a jellegzetes miRNS profil a tumor agresszivitásával, fokozott áttétképződéssel és a betegek rövidebb túlélésével hozható összefüggésbe {81-82}. Végül, de nem utolsósorban, a különféle tumorokban megváltozott expressziót mutató miRNS-ek és az általuk szabályozott targetek a jövőben a daganatterápia új célpontjait jelenthetik.

Ahogy a fentiekből is kiderül, máig különböző eredetű, köztük endokrin daganatok miRNS expressziós mintázatát vizsgálták, és több esetben kísérletek történtek a megváltozott expressziójú miRNS-ek patogenetikai szerepének felderítésére is. Vizsgálataink kezdetekor még nem voltak ismereteink mellékvesekéreg és mellékvesevelő daganatokban a miRNS-ek kifejeződéséről és a patomechanizmusban játszott szerepéről.

28

II.2 A sporadikus mellékvesekéreg daganatok előfordulása és molekuláris patomechanizmusa II.2.1. Sporadikus mellékvesekéreg daganatok A mellékvesekéreg daganatai gyakoriak, egyes kórbonctani adatok szerint a populáció 3-9%-ában fordulnak elő {83-84}. Ezek többsége sporadikus daganat, az öröklődő tumorszindrómák

(Li

Fraumeni-szindróma,

Beckwith-Wiedemann-szindróma,

familiáris adenomatosus polyposis coli, 1-es típusú multiplex endokrin neoplasia, Carney-komplex, McCune-Albright-szindróma) részeként előforduló kéregdaganatok rendkívül ritkák. A mellékvesekéreg tumorok legnagyobb részét az egyéb okból elvégzett hasi képalkotó vizsgálatok (ultrahang, CT) során véletlenszerűen felfedezett, klinikai tüneteket általában nem okozó, hormonálisan inaktív incidentalómák teszik ki. Ezzel szemben a ritka, jóindulatú, hormontermelő kéregdaganatok kortizol (Cushingadenoma) és aldoszteron (Conn-adenoma) termelésük következtében súlyos klinikai tünetegyüttes kialakulását eredményezhetik {84-85}. Szemben a gyakori előfordulású, hormonálisan inaktív, benignus daganatokkal, a mellékvesekéreg carcinoma (ACC) a ritka tumorok közé tartozik, incidenciája 0.5-2 beteg/millió fő/év {86}. Ritka előfordulása ellenére hangsúlyozni kell rendkívül rossz prognózisát, esetében ugyanis az ötéves túlélés nem haladja meg a 30%-ot {86}. A mellékvesekéreg carcinoma kifejezetten agresszív tumor, gyakori a műtétet követő lokális recidíva, regionális nyirokcsomó valamint távoli áttétek (máj, tüdő, csont) kialakulása, illetve hormonálisan aktív carcinomák esetén a hormontermelés is súlyosbíthatja a klinikai képet. A mellékvesekéreg daganatok klinikai differenciáldiagnózisa és szövettani osztályozása komoly gyakorlati felkészültséget igényel, különösen nagy nehézséget jelent egyes esetekben a mellékvesekéreg carcinomák felismerése. Egyes tanulmányok szerint a 60 mm-nél nagyobb átmérő és az 50 gramm feletti súly felveti a carcinoma gyanúját {87-88}, de a méret és tömeg alapján történő elkülönítés nem minden esetben megbízható. Jelenleg a mellékvesekéreg daganatok hisztológiai osztályozására a módosított Weiss-score-t alkalmazzák széles körben. A pontozás során összesen kilenc kritériumot (magas mitotikus aktivitás, atípusos mitózis, magas nukleáris "grade", világos citoplazmájú sejtek alacsony aránya, nekrózis, diffúz tumor architektúra, tok

29

áttörése, szinuszoidalis és vénás invázió) vesznek figyelembe, amelyek alapján a vizsgált tumor a pontozási rendszerben 0-9 pontot kaphat. Két pont alatt általában adenoma diagnózist állítanak fel, míg a négy vagy annál magasabb pontot elérő daganatok mellékvesekéreg carcinomára gyanúsak {89}. A pontrendszer hátránya, hogy az eredménybe nagymértékben beleszól a vizsgáló szubjektivitása, valamint a kezdetben adenomának minősített daganatok a későbbiek folyamán malignus átalakuláson mehetnek keresztül {89}. A Weiss-pontozási rendszeren kívül a malignitás eldöntésére az immunhisztokémiai gyakorlatban jelenleg elsősorban a Ki-67 proliferációs markert és a ciklin E-t (CCNE) alkalmazzák, de az elkülönítésre javasolt "cut-off" értékeket illetően az irodalomban megoszlanak a vélemények.{86, 88}. Mivel jelenleg nem áll rendelkezésünkre a malignitás egyértelmű eldöntésére alkalmas, gyakorlatban is széleskörűen alkalmazott immunhisztokémiai marker, különösen nagy jelentőségűek e daganatok esetében elvégzett génexpressziós microarray vizsgálatok, amelyek a molekuláris biomarker kutatás alapját képezik, emellett

a

máig

kevéssé

ismert

etiológiájú

mellékvesekéreg

daganatok

patomechanizmusának jobb megértését is segíthetik. II.2.2.

Sporadikus

mellékvesekéreg

daganatokban

leggyakrabban

észlelt

génexpressziós és kromoszomális eltérések A

fentiekben

felsorolt,

öröklődő

daganatszindrómák

részeként

előforduló

mellékvesekéreg daganatok hátterében álló molekuláris tényezők viszonylag jól ismertek. Bár ritka kórképekről van szó, patomechanizmusuk vizsgálata mégis fontosnak bizonyult a náluk sokkal gyakoribb előfordulású, sporadikus mellékvesekéreg daganatok hátterében álló patogenetikai tényezők megismerése szempontjából. A mellékvesekéreg sporadikus daganataiban eddig ugyanis több, az öröklődő daganatok esetén már kimutatott molekuláris eltérést sikerült azonosítani, amely a jövőben e daganatok komplex patomechanizmusának pontosabb megértéséhez vezethet. A Li-Fraumeni-szindróma hátterében, amely az esetek körülbelül 5%-ában társul elsősorban fiatalkorban manifesztálódó mellékvesekéreg carcinomával, a TP53 (tumor protein 53) tumorszuppresszor gén csírasejtes mutációit igazolták. A TP53 szomatikus mutációi a sporadikus mellékvesekéreg carcinomák 25-30%-ában (elsősorban a nagyobb méretű daganatokban) azonosíthatóak, ezzel szemben a gént hordozó 17p15-ös

30

kromoszóma-régió alléllvesztése (loss of heterozigosity, LOH) a mellékvesekéreg carcinomák körülbelül 85%-ában kimutatható. A két gyakoriság közötti eltérés magyarázata feltehetően az, hogy a sporadikus mellékvesekéreg carcinomák kialakulásában a TP53 gén (melynek mutációi rossz prognosztikai markernek bizonyultak)

mellett

más,

a

17p15

kromoszóma-régióban

elhelyezkedő

tumorszuppresszor gének is szerepet játszhatnak {89-91}. A rosszindulatú mellékvesekéreg daganattal csak ritkán társuló vastagbél familiáris adenomatosus polyposisának kialakulásáért az APC (axin adenomatosus polyposis coli) gén csírasejtes mutációi és a WNT-β-katenin útvonal következményes aktivációja tehető felelőssé. Az útvonal fiziológiás aktiválódása az embriogenezis során fontos

szerepet

mellékvesekéreg

játszik

a

carcinomák

mellékvesekéreg többségében

fejlődésében,

míg

immunhisztokémiai

a

sporadikus

vizsgálattal

-a

tumorsejtek citoplazmájában és a sejtmagban- észlelt diffúz β-katenin festődés az útvonal kórosan fokozott működését jelzi. A β-katenin transzkripciós faktort kódoló gén aktiváló mutációját azonban csak az adrenocorticalis carcinomák egyharmadában tudták kimutatni, a többi esetben a WNT-β-katenin útvonal aktiválódásának hátterében álló tényezők egyelőre ismeretlenek {91-92}. Az útvonal jelentőségét támasztja alá több microarray vizsgálat eredménye is, ahol számos β-katenin által szabályozott gén expresszióját fokozottnak találták {93-96}. A Beckwith-Wiedemann-szindrómában macrosomia, fejlődési rendellenességek, különböző daganatok, köztük mellékvesekéreg carcinomák fordulnak elő. Hátterében leggyakrabban a 11p15 lókusz imprintingjének különböző szabályozási zavarai, és az ennek következtében kialakuló fokozott IGF-2 (inzulinszerű növekedési faktor 2) valamint csökkent H19 és CDKN1C (ciklin dependens kináz inhibitor 1C, p57kip2) expresszió állnak A H19 gén nem transzlálódik, feltehetően egy az IGF-2 expresszióját szabályozó miRNS-t kódol, melynek azonban a pontos funkciója még nem ismert {91}. Az említett gének expressziós eltéréseit sporadikus mellékvesekéreg carcinomákban is leírták. Az IGF-2 expressziós eltérései az adrenocorticalis carcinomák 90%-ában kimutathatók, összehasonlítva az adenomákkal és az ép kéregszövettel egyaránt az egyik legmarkánsabb expressziós növekedést mutató gén {85, 91, 97}. Az IGF-2 szerepe a magzati mellékvesekéreg fejlődésében ismert tény {98}. Mitogén hatását a mellékvesekéregben főként az IGF-1 receptoron (IGF-1R) fejti ki. Az IGF-1R fokozott

31

expressziója szintén jellemzője a malignus mellékvesekéreg daganatoknak {99}, emellett az IGF-2 hatását különböző módon szabályozó kötőfehérjék közül az IGFBP-2 megnövekedett szöveti expresszióját is kimutatták, ami rosszabb prognózissal volt összefüggésbe

hozható

{100}.

Az

IGFBP-2

plazmakoncentrációját

szintén

emelkedettnek találták előrehaladott, metasztatizáló mellékvesekéreg carcinomás betegek esetében, azonban ez a marker nem bizonyult kellően érzékenynek, hogy sor kerüljön a klinikai diagnosztikába történő bevezetésére {101}. Az IGF-2 expressziós eltérései mellett a H19 és a CDKN1C gének csökkent expresszióját is leírták sporadikus mellékvesekéreg carcinomákban {102}. A fenti géneket kódoló 11p15 kromoszómarégió allélvesztése (LOH) a rosszindulatú mellékvesekéreg carcinomák körülbelül 70%ában, míg az adenomák alig több mint 10%-ában volt kimutatható {83, 91}. A multiplex endokrin neoplasia 1-es típusának (MEN1) (hyperparathyreosis, endokrin pancreas és hypophysis tumorok, az esetek 25-40%-ában mellékvesekéreg adenoma vagy hyperplasia, extrém ritkán carcinoma társulása) kialakulásáért felelős MEN1

gén

szomatikus

mutációi

sporadikus

mellékvesekéreg

carcinomákban

meglehetősen ritkák. Ezzel szemben az őt kódoló 11q13-as kromoszóma-régiót érintő LOH a carcinomák körülbelül 90%-ában (gyakran teljes 11q vesztés), míg az adenomák 20%-ában mutatható ki. Ahogy a TP53 esetében is, a kromoszóma aberráció és a mutáció gyakorisága közti aránytalanság a MEN1 gén mellett a 11-es kromoszóma hosszú karján található, egyéb tumorszuppresszor gének funkciókiesésének szerepét veti fel a mellékvesekéreg daganatok kialakulásában {91}. A Carney-komplexhez és a McCune-Albright-szindrómához társuló, gyakran Cushing-szindrómát

előidéző

jóindulatú

mellékvesekéreg

daganatokban

és

hyperplasiában igazolt ACTH-PRKA-cAMP jelátviteli út aktiválódás a sporadikus mellékvesekéreg adenomák kialakulásában is szerepet játszhat, azonban ez az összefüggés nem egyértelmű carcinomák esetében. Sem a PRKAR1A (protein-kináz-A RIα inhibitor alegység), sem pedig a GNAS (Gs fehérje α-alegység) mutációit nem sikerült kimutatni mellékvesekéreg carcinomákban, míg az adenomák körülbelül 10%ában megtalálhatók voltak a PRKAR1A mutációk. A PRKAR1A-t hordozó 17q22-24 lókusz allélvesztése azonban az adrenocorticalis carcinomák 50%-ára jellemzőnek bizonyult, így a malignus daganatok esetében felmerül az említett régióban elhelyezkedő egyéb tumorszuppresszor gének patogenetikai szerepe is {86; 89}.

32

A

sporadikus

mellékvesekéreg

daganatok

molekuláris

osztályozásának

elősegítése és a patomechanizmusuk tisztázása céljából az elmúlt évtizedben számos génexpressziós microarray vizsgálatot végeztek. Ezek eredményeiből kitűnik, hogy az IGF-2 jelentősen megnövekedett expressziója mellett a mellékvesekéreg carcinomák másik legjellemzőbb eltérése a DNS replikációjában szerepet játszó enzim, a TOP2A (topoizomeráz 2A) fokozott kifejeződése {97}. A megfigyelés a jövőben terápiás szempontból is jelentős lehet, a TOP2A ugyanis több topoizomeráz-gátló citosztatikum (doxorubicin, etopozid) célmolekulája. A sejtciklus mellékvesekéreg carcinomákban fokozott aktiválódását jelzik továbbá egyes ciklinek, ciklin-dependens-kinázok expressziós változásai is {85, 95, 96-97}. A mellékvesekéreg carcinomák benignus adenomáktól történő elkülönítését segítheti a szteroid bioszintézis enzimeit kódoló gének expressziójának vizsgálata. Ezek közül a HSD3B1 (3β-hidroxiszteroid dehidrogenáz), a CYP11A (koleszterin oldallánc hasító enzim), a CYP11B (11β-hidroxiláz), a CYP21A2 (21-hidroxiláz), a CYP17 (17αhidroxiláz-17,20-liáz) {103} valamint az AKR1B1 (aldo-keto reduktáz család 1/B1) {95} adenomákhoz viszonyított csökkent expresszióját mutatták ki carcinomákban, amely a malignus átalakulás során bekövetkező dedifferenciálódásra utalhat {91}. A csökkent kifejeződésű szteroidogenikus klaszter mellett az IGF-2 klaszter (a már említett IGF-2-hoz kapcsolódó gének mellett egyéb növekedési faktorok és receptoraik tartoznak

ide:

pl.: FGFR (fibroblaszt növekedési faktor receptor), TGFβR

(transzformáló növekedési faktor béta receptor), EGFR (epidermális növekedési faktor receptor))

ellentétes

irányú

expressziós

változása

szintén

a

rosszindulatú

mellékvesekéreg tumorok jellegzetessége lehet {103}. Az előzőekben részletezett, öröklődő és sporadikus mellékvesekéreg daganatok patomechanizmusában

szerepet

játszó

kromoszóma

aberrációk,

mutációk

és

génexpressziós változások mellett komparatív genom hibridizációs technikával (CGH) számos

további

kromoszómaeltérést

azonosítottak

a mellékvesekéreg

jó- és

rosszindulatú daganataiban. Ezek közül leggyakrabban az 1p21-31, 2q, 3p, 6q, 9p, 11q14-qter, 17p, és 22-es kromoszómák elvesztését, míg az 5q12, 9q32-qter, 11q, 12q, 14q, 16, 17q, 19, 20q és 22q régiók amplifikációját írták le {85, 104-105}. A mellékvesekéreg daganatok patomechanizmusának megértését nehezíti, hogy az eddig közlésre került microarray és CGH vizsgálatok eredményei között jelentős

33

különbségek mutatkoznak. Ennek hátterében elsősorban az alacsony csoportonkénti mintaszám, az eltérő csoportosítási szempontok, különböző vizsgálati platformok és statisztikai

kiértékelés

eltérései

állhatnak.

E

problémák

kiküszöbölésére

munkacsoportunk az elérhető microarray és CGH eredmények valamint saját eredményeink felhasználásával metaanalízist végzett, amely során a mellékvesekéreg carcinomák patomechanizmusában három fő útvonalat sikerült azonosítani: 1.) sejtciklus károsodása, 2.) retinoid jelátvitel érintettsége, 3.) komplement- és immunrendszer eltérései {106}. Ezek közül a sejtciklus és az immunrendszer eltérései már korábbról ismertek voltak {103}, a retinoid receptorokhoz kapcsolódó jelátvitel károsodásának lehetséges patogenetikai szerepe azonban eddig még nem merült fel, így e bioinformatikai eredmények kísérletes alátámasztása a továbbiakban szükséges. E

kérdések

további

tisztázásához,

a

mellékvesekéreg

daganatok

patomechanizmusának átfogó megértéséhez valamint a mellékvesekéreg carcinomák terápiájában

alkalmazható

új

gyógyszeres

célpontok

azonosításához

vizsgálatok, és a rendelkezésre álló ismeretek szintetizálása nélkülözhetetlen.

34

további

II.3.

A

phaeochromocytomák

előfordulása

és

molekuláris

patomechanizmusa II.3.1. A phaeochromocytomák előfordulása és gyakorisága A phaeochromocytomák a szimpatoadrenalis rendszer daganatai, melyek kiindulhatnak a mellékvesevelő chromaffin sejtjeiből valamint a velük fejlődéstanilag megegyező eredetű, főként hasi, medencei vagy mellkasi lokalizációjú szimpatikus ganglionokból. Utóbbi

esetben

szimpatikus

paragangliomákról

(PGL)

beszélünk,

amelyek

extraadrenalis phaeochromocytomáknak is tekinthetők. A PGL-k másik csoportját az elsősorban fej-nyaki erek közelében elhelyezkedő, paraszimpatikus ganglionokból kiinduló paraszimpatikus PGL-k teszik ki, melyek típusos példája a glomus caroticum és a ganglion jugulare tumora {107}. A phaeochromocytomák katekolamin (adrenalin, noradrenalin) termelésük következtében

jellegzetes

klinikai

tünetegyüttes

kialakulását

eredményezhetik,

amelynek tüneteit elsősorban a termelt hormonok minősége, mennyisége és az egyén katekolamin érzékenysége határoz meg. A mellékvese eredetű phaeochromocytomára elsősorban adrenalin, míg az extraadrenalis lokalizációjú tumorokra főként noradrenalin termelése jellemző. Vezető tünetek általában a nehezen kezelhető, gyakran paroxizmális, ritkábban perzisztáló vérnyomás emelkedés, fejfájás, palpitáció, izzadás, elsápadás,

tremor,

szorongás,

mellkasi

fájdalom,

egyes

esetekben

pedig

emésztőrendszeri tünetek is előfordulhatnak. Az esetek egy részében (főként extraadrenalis phaeochromocytomák esetén) a tünetek atípusosak, míg körülbelül 8%ban akár teljes tünetmentesség is előfordulhat. Az említett tünetek következményei a diagnózis felállításának és a sebészi kezelésnek a késlekedése esetén súlyosak is lehetnek a hipertenzív krízis, myocardialis infarktus és stroke gyakori kialakulása, illetve a jelentős mortalitás miatt {107-108}. A phaeochromocytomák gyakoriságára utaló irodalmi adatok nagy eltéréseket mutatnak. A véletlenszerűen felfedezett mellékvese daganatok 4%-a bizonyul phaeochromocytomának hormontermelése alapján, míg az adrenalectomiára kerülő esetek

11%-ában

állítható

fel

phaeochromocytoma

diagnózis

{109}.

A

phaeochromocytoma incidenciája 1-20 beteg/millió fő/év {110-111}. Fontos azonban

35

hangsúlyozni, hogy mivel a betegek egy részében a tünetek atípusosak vagy teljesen hiányozhatnak, a kórkép gyakorisága nagy valószínűséggel alábecsült {107}. Phaeochromocytomák szempontjából korábban az úgynevezett "10-es szabályt" tartották elfogadottnak, amely szerint 10-10%-ban kétoldaliak, extraadrenalisak, malignusak illetve öröklődők. A legújabb irodalmi adatok alapján a "10-es szabályt" részben elavultnak tartják. A bilaterális phaeochromocytomák aránya 11-19% {112113}, 9-23%-ban extraadrenalis lokalizációjúak {110, 114}, míg egyes tanulmányok szerint a malignus phaeochromocytomák előfordulása a 9-15%-ot is elérheti adrenalis tumorok esetén {112, 115-116}. Szemben az öröklődő daganatszindrómák részeként előforduló ritka mellékvesekéreg daganatokkal, az öröklődő phaeochromocytomák aránya egyedülállóan magas. A legújabb irodalmi adatok alapján a familiáris formák a látszólag sporadikus phaeochromocytomák 25-30%-át teszik ki {113, 117}. Öröklődő

II.3.2.

daganatszindrómákhoz

társuló

phaeochromocytomák

molekuláris patomechanizmusa Phaeochromocytomák elsősorban multiplex endokrin neoplasia 2-es típusában (MEN2), von Hippel-Lindau-szindrómában (VHL), 1-es típusú neurofibromatosisban (NF1) és a familiáris paraganglioma szindróma (PGL1-4) különböző típusaiban fordulnak elő. E daganatszindrómák hátterében a RET (rearranged during transfection) (MEN2), VHL, NF1, SDH (szukcinát-dehidrogenáz) B (PGL-4), C (PGL-3) és D (PGL-1) gének csírasejtes mutációit azonosították {117}. Újabban a familiáris PGL szindróma 2-es típusának hátterében az SDHAF2 (SDH5) gén csírasejtes mutációjának patogenetikai szerepe merült fel {118}. A MEN2 autoszomális-domináns öröklődésű tumorszindróma, amelynek három altípusát

különítjük

el.

A

MEN2A-ra

medulláris

pajzsmirigy

carcinoma,

hyperparathyreosis és phaeochromocytoma kialakulása jellemző, míg a MEN2B szindrómában a medulláris pajzsmirigyrák és phaeochromocytoma mellé nyálkahártya ganglioneuromák és marfanoid külső társulnak. A harmadik formában (FMTC = familiáris medulláris pajzsmirigyrák) kizárólag medulláris pajzsmirigy carcinoma fordul elő. Phaeochromocytomák az igazolt MEN2-es esetek körülbelül 50%-ában kialakulnak. A MEN2-ben előforduló phaeochromcytomák csaknem mindig adrenális lokalizációjúak, gyakran kétoldaliak, és a malignus tumorok gyakorisága < 5%. A

36

kórkép hátterében a 10q11.2 lókuszon elhelyezkedő RET protoonkogén csírasejtes aktiváló mutációi állnak {107, 113}. A RET protoonkogén egy transzmembrán receptor tirozin-kinázt kódol, amely elsősorban a sejtproliferáció és apoptózis folyamatait szabályozó jeleket közvetít a sejt belseje felé (ligandumai a gliasejt eredetű neurotrophicus faktor család tagjai). Pontmutációi közül a 634-es, ciszteint kódoló kodon mutációi a leggyakoribbak {107, 113}. A RET gén mutációi a látszólag sporadikus phaeochromoctomás esetek 3-5%-ában mutathatók ki {119}. Az NF1 (von Recklinghausen-kór) az egyik leggyakoribb előfordulású neurocutan

szindróma

(prevalenciája

1:5000),

melynek

hátterében

az

NF1

tumorszuppresszor gén (17q11.2) autoszomális-domináns módon öröklődő, csírasejtes mutációi állnak {113}. Ennek következtében inaktív neurofibromin (GTPáz aktiváló protein)

termelődik,

amely

a

RAS

konstitutív

aktivációjához

és

fokozott

sejtproliferációhoz vezet. Az NF1 gén 60 exonból áll (> 350 kilobázis), mutációs "hot spot"-jai nem ismertek, így molekuláris genetikai vizsgálata a rutin diagnosztikában nem terjedt el. Az NF1 diagnózisának felállítása jelenleg klinikai szempontok alapján történik. NF1 az esetek 0.1-5.7%-ában társul phaeochromocytomával, míg a hypertoniás NF1-es betegek esetén gyakorisága akár a 20-50%-ot is elérheti. Az NF1-hez társult phaeochromocytomák 90%-ban benignus viselkedésűek, és körülbelül 85%-ban egyoldaliak {107}. A VHL szindróma szintén autoszomális-domináns öröklésmenetet követő daganatszindróma, melynek prevalenciája 1:36000 {113}. Leggyakrabban retina és központi

idegrendszeri

haemangioblastomák,

világossejtes

veserák,

pancreas

szigetsejtes daganatok, pancreas és vese cysták, cystadenomák fordulnak elő. Az említett daganatokhoz körülbelül 20%-ban társulhat phaeochromocytoma, amely főként a második életévtizedben manifesztálódik {107}. A VHL szindróma kialakulásáért a 3p25-26 kromoszóma-régión elhelyezkedő VHL tumorszuppresszor gén csírasejtes mutációi felelősek, amelyek az említett daganatok kialakulására prediszponálnak. A gén terméke a pVHL fehérje, amely a HIF1α (hypoxia-indukált faktor 1α) szabályozásán keresztül az érképződésben játszik fontos szerepet. Normális oxigén ellátottság mellett a pVHL felelős a HIF1α ubiquitinációjáért és lebomlásáért, így megakadályozza, hogy további hypoxia-indukált gének (pl.: vascularis endotheliális növekedési faktor (VEGF))

aktiválódjanak.

Funkcióvesztéssel

37

járó

mutációja

esetén

a

HIF1α

ubiquitinációja szenved zavart, így az angiogenetikus faktorok expressziója fokozódik, amely az érképződés aktiválódásához és többszervi tumorok kialakulásához vezethet {107, 120}. A phaeochromocytoma hiánya vagy jelenléte alapján a VHL szindróma 1es illetve 2-es típusát különböztethetjük meg. A 2-es típust attól függően, hogy mekkora a világossejtes veserák kialakulásának kockázata, alacsony (2A) és magas rizikójú (2B) csoportra bonthatjuk. VHL 2C típus esetén a phaeochromocytoma csak önállóan, egyéb tumorok nélkül manifesztálódik. E ritka típus esetén a VHL gén funkciónyeréssel járó, csírasejtes missense mutációi mutathatók ki, amelyek azonban nem befolyásolják jelentősen

a

HIF1α

degradációját

{107}.

A

VHL

szindrómához

társuló

phaeochromocytomák a látszólag sporadikus phaeochromocytomák 2-9%-át teszik ki (ez a leggyakoribb öröklődő tumorszindrómához társuló phaeochromocytoma), az esetek 90%-ában adrenális lokalizációjúak, extraadrenális PGL-k csak ritkán fordulnak elő. Az esetek körülbelül felében kétoldali előfordulásúak lehetnek, míg a malignus daganatok aránya kevesebb, mint 10% {119}. A szukcinát-dehidrogenáz B, D és C alegységét kódoló gének valamint az SDHAF2 gének autoszomális-domináns öröklődésű csírasejtes mutációi döntően extraadrenális

lokalizációjú

phaeochromocytomák

(PGL-k)

kialakulására

hajlamosítanak. E monogénes daganatszindrómák az első betegségek, amelyek hátterében a mitokondriális légzési lánc felépítésében szereplő fehérjéket kódoló gének mutációit igazolták. E mutációk a mitokondriális komplex II destabilizációjához és a hypoxia/angiogenezis útvonal aktiválódásához vezetnek {85}. SDHB mutáció fennállása esetén a betegek fokozott követése javasolt a malignitás magas kockázata (35%) miatt {119}. Az SDHD gén mutációja esetén főként fej-nyaki paraszimpatikus PGL-k alakulnak ki, amelyek gyakran multifokálisak, azonban a malignitás kockázata esetükben viszonylag alacsony {119}. Ki kell emelni, hogy az SDHD gén anyai imprinting alatt áll, így az anyától örökölt mutáns allél hordozásakor a betegség nem alakul ki, de az utódokban ismételten megjelenhet apai transzmisszió esetén {107}. Az SDHC mutációi a familiáris PGL szindrómák csak kis százalékáért felelősek, elsősorban fej-nyaki paraszimpatikus PGL-k kialakulását eredményezik {107}. Az öröklődő daganatszindrómákhoz társuló phaeochromocytomák mellett ismertek olyan "nem-szindrómás" familiáris esetek is, ahol a phaeochromocytoma megjelenése az egyetlen tünet (a VHL 2C típushoz hasonlóan). Ezekben az esetekben

38

azonban nem sikerült kimutatni a fent részletezett phaeochromocytoma kandidáns gének csírasejtes mutációt, így felvetődik annak a lehetősége, hogy más, jelenleg még ismeretlen gének mutációi is szerepet játszhatnak családi halmozódást mutató phaeochromocytomák

kialakulásában

{113,

121}.

Nemrégiben

a

TMEM127

(transzmembrán protein 127) gén mutációit azonosították néhány betegben, de ennek patomechanizmusa még nem tisztázott {122}. Szemben

az

öröklődő

phaeochromocytomákkal,

a

sporadikus

phaeochromocytomák patomechanizmusában szerepet játszó molekuláris tényezők jelenleg kevéssé ismertek. A későbbiekben részletezendő génexpressziós vizsgálatok eredményei

alapján

azonban

úgy

tűnik,

hogy

az

öröklődő

és

sporadikus

phaeochromocytomák génexpressziós mintázata egyazon skálán helyezkedik el, ami arra utal, hogy patogenetikai hátterük – legalábbis részben – átfedő {123}. Ahhoz, hogy e daganatok kialakulását jobban meg tudjuk érteni, további, teljes genomot érintő, funkcionális szemléletű vizsgálatok szükségesek. II.3.3. Malignus phaeochromocytomákra jellemző molekuláris eltérések A klinikai és szövettani kép alapján a phaeochromocytomák biológiai viselkedésének előrejelzése nehéz. A WHO definíciója szerint a malignus phaeochromocytoma diagnózisa csak távoli áttét (máj, tüdő, csont, nyirokcsomó) megjelenésekor állítható fel, amely a primer tumor eltávolítását követően akár évekkel később is kialakulhat {107, 124}. Jelenleg nincs a kezünkben olyan megbízható diagnosztikai marker, amellyel a primer daganat viselkedése előrejelezhető. Korábban a nagy tumorméretet (> 5 cm), ér és tokinváziót valamint a tumor DNS kópiaszám változásait (aneuploid, tetraploid) tartották a malignus viselkedésre gyanús jeleknek {125}. Más tanulmányok a neuropeptid-Y (NPY) mRNS {126} és az inhibin/activin βB-alegység {127} csökkent kifejeződését, a tumorsejtek fokozott ciklooxigenáz-2 (COX2) {128} és a stróma kifejezett tenascin C {129} expresszióját találták a malignus phaeochromocytomára jellemző molekuláris/immunhisztokémiai markernek. Felmerült továbbá a hősokkfehérje 90 (HSP90), a secretogranin II-derived peptid (EM66), a VEGF, a VEGF receptor 2 (VEGF-2R), a hypoxia-indukált faktor 2α (HIF2α), az N-kadherin és a humán telomeráz reverz transzkriptáz (TERT) expressziós vizsgálatának lehetősége is

39

{130-131}. A TP53 szomatikus mutációit is sikerült azonosítani malignus phaeochromocytomákban {132}. Immunhisztokémiai gyakorlatban elsősorban a Ki-67 és az S-100 markerek diagnosztikai alkalmazására történtek próbálkozások, de ezek megbízhatósága elsősorban az eltérő kvantifikálási szempontok miatt szintén kérdéses {133-135}. Továbbra is fennáll tehát az igény olyan biológiai markerek vagy marker kombinációk iránt, amelyek alkalmasak lehetnek a malignitás eldöntésére. Ehhez elengedhetetlen a phaeochromocytomák korrekt csoportosításon (hormontermelés, lokalizáció,

csírasejtes

mutációk

megléte)

alapuló

nagy

áteresztőképességű

génexpressziós, proteomikai és CGH vizsgálata, ezek eredményeinek szintetizálása a már meglévő (hisztopatológiai, immunhisztokémiai) ismeretekkel, és az érintett betegek hosszútávú klinikai követése {130}. II.3.4. Phaeochromocytomák esetében észlelt legfontosabb génexpressziós és kromoszomális eltérések Az

elmúlt

évtizedben

a

mellékvesekéreg

daganatokhoz

hasonlóan

phaeochromocytomák esetén is több microarray vizsgálat történt a daganatok osztályozása és a patogenezis felderítése céljából. Az eredmények összehasonlítását itt is nehezíti, hogy az egyes tanulmányok különböző csoportosítási szempontok alapján (öröklődés, dignitás, lokalizáció) vizsgálják az említett daganatok génexpressziós mintázatát. Dahia és mtsai. 76 öröklődő (VHL, MEN2, NF1 és familiáris PGL szindróma) és sporadikus phaeochromocytoma minta génexpressziós profilját hasonlították össze. A klaszter analízis során két fő csoport különült el egymástól. Az első csoportot a VHL és SDHB/SDHD mutáció talaján kialakuló familiáris PGL szindrómához, míg a második klasztert a MEN2 és NF1-hez társuló daganatok alkották. A VHL és PGL szindrómához társuló phaeochromocytoma mintákra a hypoxia-angiogenezis útvonalban szerepet játszó gének fokozott, míg az oxidatív válaszban és az adrenerg metabolizmusban résztvevő gének csökkent expresszióját találták jellemzőnek a MEN2 klaszterrel való összehasonlítás során. Ez alapján a VHL/PGL valamint a MEN2/NF1 szindrómához társuló phaeochromocytomák kialakulásában két egymástól lényegesen eltérő patogenetikai útvonal szerepét tételezték fel. Ezt támasztja alá az is, hogy az SDHB gén

40

expressziójának

csökkenését

mind

az

SDHB/SDHD

mind

pedig

a

VHL

phaeochromocytomákban kimutatták. Ezek alapján Dahia és mtsai. azt feltételezték, hogy a VHL és SDH tumorok patogenezise közötti funkcionális kapcsolatot a HIF1α jelenti. VHL szindrómában a pVHL funkciójának csökkenése a HIF1α csökkent degradációjához vezet, amely a HIF1α célgénjeinek fokozott expresszióján keresztül a hypoxia-angiogenezis útvonal aktiválódását eredményezi. Emellett a HIF1α az SDHB kifejeződését is gátolja, amely a familiáris PGL szindrómához hasonlóan a mitokondriális komplex II elégtelen működéséhez vezet VHL-ben. A mitokondriális komplex II diszfunkciója mindkét esetben az oxidoredukciós funkciók károsodásához, a szukcinát-fumarát átalakulás elmaradásához és a szukcinát koncentráció emelkedéséhez vezet. Az intracellulárisan felhalmozódó szukcinát a HIF1α hidroxilálásában szerepet játszó prolil-hidroxiláz enzim funkcióját gátolja, a hidroxiláció elmaradása pedig rezisztenssé teszi a HIF1α-t a pVHL mediált degradációval szemben. Ez alapján mind a VHL gén mutációja, mind pedig az SDH alegységeit kódoló gének mutációja a hypoxiaangiogenezis útvonal fokozott aktiválódását eredményezi {123}. A 2-es klaszterbe sorolt MEN2 és NF1 phaeochromocytomák patomechanizmusának közös eleme a RAS jelátviteli útvonal fokozott működése, amely fokozott sejtproliferációhoz vezet {85} (4. ábra). Számos daganat esetében leírták korábban, hogy az oxidatív foszforiláció és a mitokondriális légzési lánc károsodásával az anaerob energiatermelő folyamatok kerülnek előtérbe, a glikolízis fokozódik (Warburg-effektus). Favier és mtsai. az oxidatív foszforiláció és a glikolízis folyamataiban szerepet játszó gének expresszióját vizsgálták

öröklődő

phaeochromocytomák

esetén.

Míg

a

mitokondriális

elektrontranszportban szerepet játszó gének expressziója a VHL és SDH mutáció talaján kialakuló tumorok esetén egyaránt alacsonyabbnak bizonyult a MEN2 és NF1 tumorokhoz képest, addig a glikolízis fokozódását főként VHL daganatok esetén észlelték. Ennek hátterében a VHL inaktiváló mutációjának hatását feltételezték. Működőképes pVHL hiányában a TP53 nem képes stabilizálódni, funkciójának (TP53TIGAR útvonal) kiesését pedig már korábban a fokozott glikolízissel kapcsolták össze {136} (4. ábra).

41

4. ábra: Az öröklődő phaeochromocytomák patogenezisének lehetséges két fő mechanizmusa A VHL és SDH mutáció talaján kialakuló phaeochromocytomákra megnövekedett HIF1α aktivitás, ennek következtében fokozott angiogenezis és csökkent oxidoreduktáz aktivitás jellemző (A). Ezzel szemben RET és NF1 mutációk esetén a RAS jelátviteli útvonal aktiválódik, amely fokozott sejtproliferációhoz vezet (B).

A hypoxia-angiogenezis útvonal számos tagjának (VEGF, VEGF-2R, europilin1, HIF2α, COX1, COX2, angiopoietin 2, tie-1, mátrix metalloproteáz 1, tenascin C, stb.) fokozott expresszióját Eisenhofer és mtsai. korábban már szintén leírták noradrenalin termelő, öröklődő (VHL) phaeochromocytomákban, emellett noradrenerg, sporadikus phaeochromocytomákban is azonosítottak fokozott kifejeződést mutató angiogenetikus géneket {137}. Más szerzők {128-129, 138-139} az említett gének megnövekedett expresszióját malignus phaeochromocytomákban észlelték. Mindezeket összevetve hangsúlyozni kell, hogy a malignus viselkedésű phaeochromocytomák előfordulása VHL szindrómában viszonylag ritka, így a VHL és a malignus

42

phaeochromocytomák génexpressziós mintázatában észlelt részleges hasonlóság hátterében a fenti daganatok hormontermelő profiljának (noradrenalin) egyezése állhat {130}. A fentiek mellett ismertek a biokémiai profiljuk alapján egymástól eltérő VHL (noradrenerg) és MEN2 (adrenerg) szindrómához társuló phaeochromocytomák esetén a katekolaminok szekréciós mechanizmusában szerepet játszó gének expressziós különbségei is. Az adrenerg MEN2 tumorokra a szabályozott katekolamin exocitózisban résztvevő gének (syntaxin, rabphilin 3A, chromogranin A, B, stb.) fokozott expressziója jellemző {140}. Az elmúlt években elsősorban a rosszindulatúság előrejelzésére alkalmas biomarkerek azonosítása céljából malignus phaeochromocytomák génexpressziós mintázatát is vizsgálták. Anouar és mtsai. egy körülbelül 100 génből álló készletet azonosítottak, amelyek segítségével hatékonyan tudták elkülöníteni a sporadikus benignus és malignus daganatokat (n = 9). E gének többsége (> 80%) csökkent kifejeződést mutatott malignus phaeochromocytomákban, és a génontológiai (Gene Ontology = GO) elemzés során olyan biológiai funkciókat jelöltek ki, mint a katekolamin metabolizmus, peptid érés, vezikuláris transzport. Ezek alapján kitűnik, hogy malignus daganatokban a chromaffin-sejteket jellemző fenotípus elvesztése dominál. Emellett a sejtadhézióban résztvevő gének (astrotactin, plexin C1, occludin) csökkent expresszióját is kimutatták malignus phaeochromocytomákban. A néhány felülexpresszált gén közül említést érdemel a γ-tubulin, amelynek fokozott kifejeződését több daganatban leírták, és amely a mitotikus orsó aberráns szerveződését eredményezi. {141-142}. Brouwers és kollégái több csoportosítási szempont (öröklődés, hormontermelés, lokalizáció, dignitás) és ezek kombinációi szerint vetették össze phaeochromocytoma minták génexpressziós profilját. Munkájuk során nagy elemszámú malignus (n = 20) és benignus (n = 70) phaeochromocytoma csoport transzkripciós mintázatát is vizsgálták. A szignifikáns expressziós eltérést mutató gének körülbelül 90%-a csökkent kifejeződést mutatott malignus phaeochromocytomák esetében {143}. Waldmann és mtsai. szintén hasonló tendenciát tapasztaltak. Az általuk vizsgált benignus és malignus csoportokat (n = 5) elkülönítő 132 gén közül 113 expressziója (85%) bizonyult alacsonyabbnak a malignus mintákban {144}. Az említett microarray vizsgálatok

43

eredményeiből látszik, hogy a malignus phaeochromocytomákra általánosságban csökkent génexpresszió jellemző, amely e rossz prognózisú tumorok alacsony differenciáltsági fokára utalhat {143}. Malignus phaeochromocytomákon elvégzett további microarray vizsgálatok eredményei alapján felmerült különböző neuropeptid hormon receptorok (GHRH-R, GHRH-R SV1) {145} és a stathmin (STMN1) {146} malignitást jelző markerként való alkalmazásának lehetősége. Suh és mtsai. 13 malignus és 45 benignus phaeochromocytoma szövet (sporadikus és öröklődő) génexpressziós microarray vizsgálatát végezték el elsősorban biomarker kutatás céljából. Szigorú szűrési feltételeket alkalmazva, 109 kiválasztott gén expressziójának vizsgálatával a jó- és rosszindulatú phaeochromocytoma mintákat jó hatékonysággal sikerült elkülöníteniük. A szerzők hat gén (CFC1 (cripto, FRL-1, cryptic family 1), FAM62B (family with sequence similarity 62 member B), HOMER1 (homer homolog 1), LRRN3 (leucine rich repeat neuronal 3), TBX3 (T-box 3), ADAMTS (ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1)) kombinációjából álló biomarker készlet

segítségével

phaeochromocytomákat.

megbízhatóan A

tudták

prognózis

felismerni

megállapítása

mellett,

a

malignus a

malignus

transzformációban szerepet játszó patogenetikai tényezők azonosítása céljából a microarray eredményeket bioinformatikai módszerekkel is vizsgálták. A szignifikáns expressziós eltérést mutató gének GO elemzése 8 biológiai funkció érintettségét jelezte malignus daganatokban: jelátvitel, transzkripció, fehérjeszintézis, fehérjetranszport, simaizom kontrakció, iontranszport, kemotaxis és elektrontranszport. A microarray eredmények további funkcionális vizsgálata (Gene Set Enrichment Analysis = GSEA) során számos daganatképződéssel korábban már kapcsolatba hozott molekuláris útvonal ("C-MYC (v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog)-" és "RAS aktiváció", "sejtciklus

gének

aktiválódása",

stb.)

és

génkészlet

("rezisztens

gyomor

adenocarcinoma", "differenciálatlan ductalis emlő carcinoma", "hepatocelluláris carcinoma", stb.) tagjainak fokozott kifejeződését azonosították malignus daganatokban. Jóindulatú

phaeochromocytomákban

a

"foszfoinozitol-trifoszfát-",

a

"retinsav

receptor/retinoid X receptor (RAR/RXR)-", a "Gα-12 útvonal" valamint a "Notch jelátvitel" fokozott aktivitását találták {147}.

44

A fent részletezett génexpressziós változások mellett több tanulmány vizsgálta a benignus és malignus phaeochromocytomákra jellemző kromoszóma-eltéréseket is. A phaeochromocytomákban leggyakrabban észlelt kromoszomális eltérések az 1p, 3p, 3q, 6q, 11q, 17p, 22q elvesztésével valamint a 9q és 17q kromoszóma-régiók többletével járó állapotok voltak {148-151}. Ezek közül az 1p és 3q elvesztése a korai tumorképződés fázisában következik be, míg a malignus progressziót főként a 6q és 17p szakaszok deléciója jelzi {148}. August és mtsai. leggyakoribb eltérésként az 1p (75%) és 3q (45%) kromoszómakarok hiányát azonos előfordulással észlelték metasztatizáló és nem metasztatizáló phaeochromocytomák esetén, a 17q, 12q és 20q szakaszok többletével járó eltérések pedig főként malignus phaeochromocytomákra voltak jellemzők. Hasonlóan a mellékvesekéreg daganataihoz, a kromoszóma aberrációk száma malignus daganatokban itt is magasabbnak bizonyult a benignus tumorokhoz képest {152}. Összességében elmondható, hogy az elmúlt évtizedben jelentős erőfeszítések történtek, hogy elősegítsék a phaeochromocytomák elsősorban benignus/malignus tengely

mentén

történő

molekuláris

osztályozását,

a

különböző

alcsoportok

patogenezisének pontosabb megértését és esetleges gyógyszeres támadáspontok azonosítását. Bár a fent említett eredmények egyenként közelebb vittek e célokhoz, e heterogén daganatok patomechanizmusának átfogó megértéséhez további funkcionális genomikai szemléletű molekuláris vizsgálatokra, azok eredményeinek validálására és szintetizálására lenne szükség.

45

III. CÉLKITŰZÉSEK Mivel számos más daganattal ellentétben a miRNS-ek expressziós mintázata és lehetséges patogenetikai szerepe mellékvese tumorokban eddig nem volt ismert, kísérleteinkkel e hiányt próbáltuk pótolni. Munkám alapvetően két részből tevődik össze. Első felében sporadikus mellékvesekéreg daganatok (kortizol-termelő adenoma, inaktív adenoma, mellékvesekéreg carcinoma) és ép mellékvesekéreg, másodsorban pedig különböző típusú sporadikus és öröklődő phaeochromocytomák miRNS expressziós profilját vizsgáltuk, és hasonlítottuk össze. Munkánk során az alábbi szempontokra helyeztük a hangsúlyt: 1. A miRNS expressziós mintázat vizsgálata ép mellékvesekéreg szövetben és sporadikus mellékvesekéreg daganatokban (hormonálisan inaktív, kortizoltermelő benignus és kortizol-termelő malignus). 2. A miRNS expressziós mintázat vizsgálata sporadikus benignus, öröklődő daganatszindrómák keretében kialakuló benignus és sporadikus recidíváló phaeochromocytomákban. 3. A

formalin-fixált

paraffinba

ágyazott

szövetblokkok

(FFPE)

alkalmazhatóságának vizsgálata phaeochromocytomák miRNS expressziós mintázatának feltérképezésére. 4. miRNS biomarkerek azonosításának megkísérlése, amelyek alkalmasak lehetnek a malignus mellékvesekéreg daganatok és a recidíváló phaeochromocytomák többi daganattól történő elkülönítésére. 5. A miRNS-ek szövetspecifikus cél mRNS molekuláinak predikciójára alkalmas, új módszer kidolgozása a mellékvesekéreg daganatok esetén párhuzamosan elvégzett mRNS expressziós microarray eredmények felhasználásával. 6. A

mellékvese

daganatok

patogenezisében

alapvető,

miRNS-ek

által

poszttranszkripciós szinten szabályozott útvonalak azonosításának megkísérlése bioinformatikai módszerekkel.

46

IV. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK IV.1. Betegek és szövetminták Munkám első részében a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinikájának beteganyagában mellékvesekéreg daganatos betegektől származó tumormintákat és ép mellékvese

szöveteket

vizsgáltunk.

A

mellékvesekéreg

daganatos

betegek

tumorszöveteit a Semmelweis Egyetem I. sz. Sebészeti Klinikáján gyűjtöttük 1993 és 2009 között, míg az ép mellékvese szöveteket az Urológiai Klinikáról szereztük be (ETT engedély száma: 230-1 5/2006-1018EKU). A szövetek felhasználása minden esetben a betegek tájékozott beleegyezésével történt. Mellékvesekéreg daganat miatt operált betegek esetén a mintavételt a tumor reprezentatív területéről végeztük, míg az ép mellékvese szövetek elsősorban rosszindulatú vesetumor miatt operált betegek műtéti preparátumaiból származtak. A mintavétel a műtéti resectiót követően minden esetben 15 percen belül megtörtént, majd a mintákat folyékony nitrogénben fagyasztottuk, és további felhasználásig -80oC-on tároltuk. Összesen 36 fagyasztott szövetmintát vizsgáltunk: 10 ép mellékvesét (férfi/nő: 2/8; átlag életkor a műtét idején ± SD: 53.4 ± 10.6 év), 10 hormonálisan inaktív adenomát (0/10; 50.4 ± 5.9 év), 9 kortizol-termelő adenomát (2/7; 40.16 ± 10.6 év) valamint 7 adrenocorticalis carcinomát (2/5; 54.9 ± 14.6 év). A diagnózis felállítása minden esetben az érvényben lévő szakmai protokollok szerint, a klinikai tünetek, képalkotó vizsgálatok és hormonvizsgálatok eredményeinek birtokában történt, amelyet a kórszövettani lelet is megerősített. A vizsgált mellékvesekéreg carcinoma minták mindegyike kortizol-termelő daganatnak bizonyult. A kísérletbe bevont betegek családi anamnézise minden esetben negatív volt. Munkám

második

részében

főként

a

Semmelweis

Egyetem

II.

sz.

Belgyógyászati Klinikáján kezelt 33 phaeochromocytomás beteg tumorszöveteit vizsgáltuk: 8 MEN2-hoz, 6 VHL-hoz, 5 NF1-hoz társuló phaeochromocytomát, 9 sporadikus

benignus

valamint

5

sporadikus

tanulmányoztunk (2. táblázat).

47

recidíváló

phaeochromocytomát

SB

SR

MEN2

VHL

NF1

Betegek száma

9

5

8

6

5

Nemek aránya (nő/férfi)

6/3

2/3

6/2

3/3

4/1

Életkor a műtét idején (év) (átlag ± SD)

44.8 ± 18.1

46.0 ± 15.3

38.8 ± 10.2

44.8 ± 20.8

38.7 ± 16.6

5.2 ± 1.2 (n = 6)

6.7 ± 4.1 (n = 5)

4.8 ± 2.1 (n = 7)

4.1 ± 2.4 (n = 5)

5.3 ± 1.5 (n = 3)

-

4.25 ± 2.8

-

-

-

Legnagyobb tumor átmérő (cm) (átlag ± SD) Recidíváig eltelt időtartam (év) (átlag ± SD)

2. táblázat: A vizsgált phaeochromocytomás betegek jellemzői SB: sporadikus benignus; SR: sporadikus recidíváló; MEN2: multiplex endokrin neoplasia 2-es típusához társuló; VHL: von Hippel-Lindau szindrómához társuló; NF1: 1-es típusú neurofibromatosisban előforduló phaeochromocytoma; SD: standard deviáció.

A phaeochromocytoma diagnózis itt is az érvényben lévő szakmai protokollok alapján, minden esetben szövettani diagnózis birtokában került felállításra. Az alcsoportokba történő pontos besorolás érdekében az öröklődő phaeochromocytomák kialakulásáért felelős kandidáns gének (RET, VHL, SDHB, SDHC és SDHD) direkt DNS szekvenálással történő mutáció analízisét az összes beteg esetében elvégeztük {153-154}. Az SDH gének mutációi a vizsgált betegek körében nem fordultak elő. Az NF1 diagnózisának felállítása az aktuális protokollok szerint, a klinikai tünetek megléte alapján történt. Az igazolt VHL és MEN2 szindrómás betegek azonosított mutációit a 3. táblázat tartalmazza. A vizsgált öröklődő phaeochromocytomás betegek nem álltak egymással rokoni kapcsolatban.

48

Betegek

RET mutáció

VHL mutáció

MEN2_1

Cys634Arg

-

MEN2_2

Cys634Arg

-

MEN2_3

Cys634Tyr

-

MEN2_4

Cys611Tyr

-

MEN2_5

Cys634Trp

-

MEN2_6

Cys611Tyr

-

MEN2_7

Cys634Arg

-

MEN2_8

Cys609Ser

-

VHL_1

-

Ser80Ile

VHL_2

-

Arg167Gln

VHL_3

-

Leu63Pro

VHL_4

-

Tyr156Cys

VHL_5

-

Tyr156Cys

VHL_6

-

Arg167Gln

3. táblázat: MEN2 és VHL szindrómához társuló phaeochromocytomás betegekben azonosított csírasejtes mutációk

A betegeket a sporadikus phaeochromocytoma csoportba csak a fent említett gének csírasejtes mutációinak és az NF1 fennállásának kizárása esetén soroltuk be. A páciensek klinikai követését a tumor műtéti eltávolítását követően még 5-7 évig végeztük. Egyes esetekben, rövidebb követési idő esetén egy tumort akkor minősítettünk benignusnak, ha az átmérője nem haladta meg az 5 cm-t {131}, a műtét idején vagy azt követően képalkotó vizsgálattal metasztázist nem találtunk, nem alakult ki recidíva, és a Ki-67 immunhisztokémia nem vetette fel a malignitás lehetőségét (a Ki67+ sejtek aránya < 1%). A recidíváló phaeochromocytoma diagnózisát azokban az esetekben állítottuk fel, ha a primer phaeochromocytoma eltávolítását követően az azonos oldali mellékvesében a tumor kiújulását tudtuk igazolni. Munkánk során a primer daganatokat vizsgáltuk. Mivel phaeochromocytomák esetében nem rendelkeztünk megfelelő számú fagyasztott mintával, formalin-fixált paraffinba ágyazott (FFPE) szövetblokkokat alkalmaztunk vizsgálatainkhoz. Az FFPE blokkok gyűjtését a Semmelweis Egyetem I. sz. és II. sz. Pathológiai Intézetében valamint az Állami Egészségügyi Központ Pathológiai Osztályán végeztük az Egyészségügyi Tudományos Tanács Kutatásetikai

49

Bizottságának engedélyével (8-258/2009-1018EKU). A blokkok életkora 0.2-14.6 év között mozgott. Három tumor (1 sporadikus benignus, 1 sporadikus recidíváló, 1 MEN2) esetében fagyasztott minta is rendelkezésünkre állt. A párosított FFPEfagyasztott minták miRNS expressziós mintázatának összehasonlításával az FFPE minták alkalmazhatóságát kívántuk alátámasztani.

IV.2. RNS izolálás A fagyasztott mellékvesekéreg tumorszövetekből és az ép mellékvese mintákból a miRNS expressziós mintázat nagy áteresztőképességű vizsgálatához valamint további miRNS és mRNS kvantitatív valós idejű (real-time) reverz transzkripciós polimeráz láncreakció (qRT-PCR) mérésekhez TriReagent (Molecular Research Center Inc., Cincinatti, OH, USA) segítségével izoláltunk teljes RNS-t. Az említett mellékvesekéreg minták közül 16 esetben (csoportonként 4-4 minta) a miRNS expressziós profil meghatározásával párhuzamosan teljes genomszintű mRNS microarray vizsgálatokat is végeztünk. Az ehhez szükséges RNS kivonását a szövetek homogenizálását követően RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Németország) felhasználásával, oszlopos technikával végeztük a gyártó utasításai szerint. A

kinyert

RNS

koncentrációjának

mérése

NanoDrop

ND-1000

Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA), míg az RNS integritásának meghatározása Agilent 2100 Bioanalyzer System (Agilent Tech. Inc., Santa Clara, CA, USA) segítségével történt. Az RNS minták csak abban az esetben kerültek további microarray és qRT-PCR vizsgálatokban alkalmazásra, amennyiben az RNS integritás szám (RIN) meghaladta a 7.0-et, DNS kontaminációtól mentesek voltak, és az A260/280 valamint az A260/230 arányuk elérte az 1.8-at. Phaeochromocytoma minták esetén az FFPE blokkokból 5x15 mikrométer (µm) vastagságú szeleteket metszettünk, majd 100%-os xilénnel végzett deparaffinálás után a teljes RNS izolálás Ambion RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit (Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX, USA) felhasználásával történt a gyártó instrukcióinak megfelelően.

Szükség

esetén

a

protokollban

javasolttól

eltérően,

hosszabb

deparaffinálási időt alkalmaztunk, és az 50 oC-on történő proteáz emésztés idejét is megnyújtottuk.

50

A három fagyasztott phaeochromocytoma mintából homogenizálást követően Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen GmbH) segítségével nyertünk ki teljes RNS-t. Mivel a minták a továbbiakban microarray vizsgálatban kerültek felhasználásra, RNaseFree DNase Set (Qiagen GmbH) segítségével kivitelezett, oszlopos DNáz emésztéssel egészítettük ki a protokollt. Az RNS izolátumok mennyiségi és minőségi ellenőrzése a fent részletezett módon zajlott. Az A260/280 valamint az A260/230 arány mind a fagyasztott, mind az FFPE minták esetén elérte az 1.6-ot. Fagyasztott phaeochromocytomákból izolált RNS mintákat akkor bocsátottuk további alkalmazásra, ha a RIN érték meghaladta a 7.0-t, míg az archivált FFPE blokkokból nyert RNS esetén nem támasztottunk ilyen feltételeket.

IV.3.

miRNS

expressziós

profil

meghatározása

nagy

áteresztőképességű technikákkal A miRNS expressziós mintázat vizsgálatát első lépésben mind a mellékvesekéreg daganatok és ép mellékvese, mind pedig a különböző típusú öröklődő és sporadikus phaeochromocytomák

esetén

nagy

áteresztőképességű

módszerek

segítségével

végeztük. IV.3.1. miRNS expressziós mintázat vizsgálata mellékvesekéreg daganatokban TaqMan Human miRNS Panel segítségével Összesen 16 fagyasztott mellékvesekéreg tumor (4 inaktív adenoma, 4 kortizol-termelő adenoma, 4 carcinoma) és ép mellékvese (n = 4) minta párhuzamos miRNS és teljes mRNS expressziós vizsgálatát végeztük el. A miRNS expressziós profil meghatározása TaqMan Low Density Array (TLDA) Human MicroRNA Panel v1.0 (Applied Biosystems, Foster City CA, USA) segítségével történt. Ehhez első lépésben 100 nanogram (ng) teljes RNS-t komplementer DNS-sé (cDNS) írtunk át. A reverz transzkripcióhoz (RT) TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kitet és reverz transzkripciós primer "pool"-okat tartalmazó Multiplex RT for TaqMan MicroRNA Assays (Applied Biosystems) kiteket használtunk a gyártó által ajánlott protokollnak megfelelően. Ezt követően a TLDA Human MicroRNA Panel v1.0

51

segítségével párhuzamosan 365 humán miRNS (és két endogén kontroll) expresszióját vizsgáltuk 7900 HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) készüléken a gyártó instrukcióinak megfelelően. Az amplifikációs görbék elemzését, a nyers CT (cycle threshold) értékek meghatározását és exportálását SDS Program (Applied Biosystems) segítségével végeztük. A CT értékek minták közötti szórásvizsgálata alapján „housekeeping” miRNS-nek az RNU48-at választottuk (átlag CTRNU48 ± SD: 23.24 ± 0.8). A normalizált szignálértékeket összehasonlító CT (dCT) módszerrel {155} az RNU48-hoz viszonyítva határoztuk meg. A dCT értékeket az array-k mediánjára normalizáltuk BRB Array Tools Version 3.6.0 Stable Release programmal (fejlesztők: Dr. Richard Simon és Amy Peng Lam). A kísérleti csoportok között szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek azonosítására egyutas variancia-analízist (Analysis of Variance, ANOVA) végeztünk (p < 0.05). Annak meghatározására, hogy a szignifikáns miRNS-ek mely kísérleti csoportok között mutatnak eltérést, Scheffé és Tukey Honestly Significant Difference (HSD) post hoc tesztet (többszörös összehasonlítás) alkalmaztunk. A statisztikai próbákhoz SPSS 15.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) statisztikai szoftvert használtunk. A szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek közül, abban az esetben, ha az adott miRNS a vizsgált 16 mintából kevesebb, mint 9-ben expresszálódott, csak azokat vizsgáltuk tovább, amelyek egy adott csoport összes mintjában expresszálódtak. A statisztikai elemzést követően BRB Array Tools program segítségével elvégeztük a 16 vizsgált minta miRNS expresziós mintázaton alapuló hierarchikus klaszter analízisét. Ennek során a szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek esetén kalkulált -(dCT) értékeket mind az adott miRNS 16 mintában számított expressziós átlagához, mind pedig az összes szignifikáns miRNS mintánkénti expressziós átlagához centralizáltuk, majd hierarchikus klaszter elemzésnek vetettük alá. A klaszter analízis során a csoportok egymástól való távolságának számításakor a súlypontok távolságát vizsgáló metodikát (centroid linkage) alkalmaztuk. IV.3.2. miRNS expressziós profil microarray vizsgálata phaeochromocytomákban Munkánk során összesen 21 paraffinos (6 sporadikus benignus, 5 sporadikus recidíváló, 5 MEN2, 5 VHL) és 3 fagyasztott phaeochromocytoma (1 sporadikus benignus, 1

52

sporadikus recidíváló, 1 MEN2) minta miRNS expessziós mintázatát vizsgáltuk 8x15k Agilent Human miRNA Microarray Rel12.0 (Agilent Tech. Inc.) lemezek segítségével, amelyek összesen 955 miRNS expressziójának párhuzamos tanulmányozását teszik lehetővé. A miRNS microarray rendszer esetén egyszínű fluoreszcens festékkel (Cyanine 3, Cy 3) jelölt célmolekulákat alkalmaztunk az expresszió detektálására. 100 ng teljes RNS defoszforilálását és denaturálását követően az RNS minták 3' végéhez Cyanine3-pCp molekulát kapcsoltunk miRNA Complete Labeling and Hyb Kit (Agilent Tech. Inc.) segítségével. A miRNS molekulák jelölése a gyártó által javasolt protokollnak megfelelően történt. Ezt követően a jelölt RNS mintákat Micro Bio-Spin P-6 Column (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) oszlopok akalmazásával tisztítottuk, majd a fent említett miRNA Complete Labeling and Hyb Kit segítségével a protokollnak megfelelően hibridizációs mixet készítettünk. A minták Agilent Human miRNA Microarray Rel12.0 lemezekre történő hibridizálását 55 oC-on, 20 órán keresztül végeztük. A hibridizációt követően az array lemezeket Triton X-102-t tartalmazó pufferekkel mostuk, és Agilent DNA Microarray Scanner (Agilent Tech. Inc.) segítségével olvastuk le. Az eredményeket Feature Extraction 9.5.3 (Agilent Tech. Inc.) szoftverrel elemeztük és exportáltuk. A továbbiakban GeneSpring Software 10.1 (Agilent Tech. Inc.) alkalmazásával a "Total Gene Signal" ("Teljes Gén Szignál", TGS) értékeket a "raw" ("nyers") szignál értékek 75. percentilisére normalizáltuk, és az alapvonalat ("baseline") az egyes array-k mediánjára transzformáltuk, követve a gyártó miRNS microarray platformok kiértékelésre vonatkozó javaslatait. A miRNS microarray eredmények további elemzése során különböző szűrési feltételeket állítottunk fel. 1.) A szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek azonosítását megelőzően a microarray vizsgálatok kiértékelésénél általánosan elfogadott szűrési kritériumokat alkalmaztuk: 100% "Present" vagy "marginális flag" legalább egy vizsgált csoportban és a "fold change" (expressziós változás mértéke) > 2. 2.) A normalizált microarray adatokat "housekeeping" miRNS kiválasztására is felhasználtuk, ehhez szigorú "flag" (100% "present" vagy "marginal" minden csoportban) szűrési kritériumot alkalmaztunk. 3.) Az azonos betegektől származó 3-3 párosított fagyasztott és paraffinos minta miRNS expressziós mintázatának korrelációs vizsgálatához Zhang és munkatársainak javaslatát követve {156} nem végeztünk interarray normalizálást és szűrést.

53

A párosított FFPE és fagyasztott minták miRNS tartalmának összehasonlítására a nyers (raw) TGS értékek korreláció vizsgálatát SPSS 15 for Windows programmal végeztük el. A Spearman és Kendall tau non-parametrikus korrelációs koefficienseket a 3-3 párosított minta esetén egyenként valamint az FFPE és fagyasztott csoportátlagok között is meghatároztuk. A párosított FFPE és fagyasztott minták "raw" TGS értékeit GeneSpring Software 10.1 segítségével "scatter plot" formájában grafikusan ábrázoltuk. A miRNS-ek normalizált szignálintenzitás értékeit a vizsgált 4 csoport esetén a fent részletezett "flag" és "fold change" szűrést követően GeneSpring Software 10.1 (Agilent Tech. Inc.) segítségével hierarchikus klaszter elemzésnek vetettük alá. A miRNS-ek normalizált intenzitás-adatait mind az adott miRNS 4 vizsgálati csoportban számított intenzitás-átlagához, mind pedig a 309 miRNS csoportonkénti intenzitásátlagához centralizáltuk, majd a mellékvesekéreg daganatoknál leírtakhoz hasonlóan, a miRNS-eket és a vizsgálati csoportokat egyaránt "centroid linkage" metodikát alkalmazva, hierarchikus klaszter analízisnek vetettük alá, amely során euklidészi távolságokkal számoltunk. A kísérleti csoportok között szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek kijelölésére egyutas ANOVA-t alkalmaztunk (p < 0.01) Tukey HSD post hoc teszttel kiegészítve. A statisztikai elemzést GeneSpring Software 10.1 (Agilent Inc.) és STATISTICA 8.0 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA) programok segítségével végeztük. A további qRT-PCR validálás során alkalmazható, az egyes minták között legalacsonyabb standard deviációt (SD) mutató "housekeeping" miRNS-ek azonosítása Microsoft Office Excel 2003 (Microsoft Corp., Redmond, WA, USA) segítségével történt.

IV.4. miRNS expressziós eredmények validálása qRT-PCR módszerrel Mind a mellékvesekéreg daganatok, mind pedig a phaeochromocytomák esetében a nagy áteresztőképességű miRNS expressziós vizsgálatok eredményeinek validálása a csoportonkénti esetszám növelését követően qRT-PCR módszerrel történt. A mellékvesekéreg daganatok miRNS expressziós profiljának vizsgálata során 14 szignifikáns expressziós eltérést (p < 0.05) mutató miRNS-t választottunk ki további validálás és esetszám növelés céljából. A kiválasztási szempontok a következők voltak:

54

a statisztikailag legerősebb 10 miRNS-re (p < 0.01) valamint olyan további négy miRNS-re (p < 0.05) esett a választás, amelyek esetén az expresszióban észlelt különbségeket (fold change) több mint háromszorosnak találtuk. A TLDA-kártya eredményeinek megerősítését összesen 36 ép és tumoros mellékvesekéreg szöveten végeztük el (10 ép mellékvese, 10 inaktív adenoma, 9 kortizol-termelő adenoma, 7 carcinoma). Az egyedi miRNS-ekre specifikus RT és real-time PCR primereket tartalmazó TaqMan MicroRNA Assay-k a következők voltak: hsa-miR-181b (4373116), hsa-miR-181d (4373180), hsa-miR-184 (4373113), hsa-miR-196b (4395326), hsa-miR210 (4373089), hsa-miR-214 (4395417), hsa-miR-215 (4373084), hsa-miR-222 (4395387), hsa-miR-375 (4373027), hsa-miR-424 (4373201), hsa-miR-503 (4373228), hsa-miR-506 (4373231), hsa-miR-511 (4373236) és hsa-miR-615 (4380991) (Applied Biosystems). "Housekeeping" miRNS-nek az RNU48-at (4373383) használtuk (Applied Biosystems). Phaeochromocytoma minták esetén a statisztikailag legerősebb szignifikanciát valamint a kísérleti csoportok között legnagyobb mértékű expressziós eltérést (fold change) mutató öt miRNS-t választottuk ki további qRT-PCR validálás céljából. A kiválasztott miRNS-ekre specifikus RT és real-time PCR primereket tartalmazó TaqMan MicroRNA Assay-k a következők voltak: hsa-miR-139-3p (002313), hsa-miR541 (002201), hsa-miR-765 (002643), hsa-miR-885-5p (002296) és hsa-miR-1225-3p (002766) (Applied Biosystems). A microarray mérések eredményei alapján belső kontrollnak a hsa-miR-324-3p (002161) (átlag normalizált TGShsa-miR-324-3p ± SD: 0.10 ± 0.42) és a hsa-miR-320b (002844) (átlag normalizált TGShsa-miR-320b ± SD: 0.12 ± 0.63) miRNS-eket választottuk, emellett az RNU48 (001006) alkalmazhatóságát is vizsgáltuk (Applied Biosystems). A validálást itt is a csoportonkénti elemszám növelésével végeztük (9 sporadikus benignus, 5 sporadikus recidíváló, 8 MEN2, 6 VHL), illetve a vizsgálatba bevontuk az NF1 csoportot is (n = 5). A qRT-PCR vizsgálatokhoz mindkét kísérlet esetén első lépésben 10 ng teljes RNS-ből MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) segítségével 15 µl végtérfogatban cDNS-t szintetizáltunk a gyártó által megadott protokollnak megfelelően. A reakcióelegy a teljes RNS-en kívül a következőket tartalmazta: 100mM dNTP, 50 U/µl MultiScribe Reverse Transcriptase, 10x-es RT puffer, 20 U/µl RNáz inhibitor, nukleáz-mentes víz. A reverz transzkripciós reakció során alkalmazott

55

hőmérsékletek és inkubációs idők a következők voltak: 16 oC-on 30 perc, 42 oC-on 30 perc, végül 85 oC-on 5 perc. Ezt követően a qRT-PCR reakciót TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) felhasználásával, 20 µl végtérfogatban állítottuk össze a gyártó által adott előírásoknak megfelelően. A mintákat 96-lyukú plate-n, 7500 Fast Real-Time PCR System készüléken amplifikáltuk a megadott hőmérsékletértékek és időtartamok mellett. Minden egyes minta esetén három párhuzamos mérést végeztünk. Az amplifikációs görbék elemzésére SDS Programot (Applied Biosystems) használtunk. IV.4.1. qRT-PCR eredmények normalizálása és statisztikai elemzése Mellékvesekéreg daganatok esetén a vizsgált miRNS-ek relatív expresszióját (dCT) RNU48 (átlag CTRNU48 ± SD: 22.16 ± 0.66) belső kontrollhoz, míg phaeochromocytoma minták esetében a hsa-miR-324-3p (átlag CThsa-miR-324-3p ± SD: 28.15 ± 1.45) és hsamiR-320b (átlag CThsa-miR-320b ± SD: 27.78 ± 1.5) miRNS-ek CT értékeinek átlagához viszonyítottuk. Az egyes csoportok közötti expressziós eltérések kimutatása és grafikus ábrázolása összehasonlító ddCT módszer segítségével történt {155}. A különböző típusú mellékvesekéreg daganatok és ép mellékveseszövet között szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek azonosítását egyutas ANOVA módszerrel végeztük (p < 0.05), amelyet Scheffé post hoc teszttel egészítettünk ki (SPSS 15 for Windows szoftver). Phaeochromocytomák qRT-PCR vizsgálata esetén az öt vizsgált csoport (sporadikus benignus, sporadikus recidíváló, MEN2, VHL, NF1) között szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek azonosítására STATISTICA 8.0 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA) szoftver segítségével szintén egyutas ANOVA próbát végeztünk (p < 0.05). Annak konkretizálására, hogy a szignifikáns expressziós eltérések mely csoportok között állnak fenn, Fisher Least Significant Difference (LSD) valamint Scheffé post hoc teszteket alkalmaztunk.

IV.5. miRNS biomarkerek azonosítása Munkánk során a továbbiakban olyan miRNS biomarkerek azonosítására törekedtünk, amelyek segítségével a mellékvesekéreg daganatok malignus viselkedése előrejelezhető,

56

valamint alkalmasak lehetnek a recidíváló phaeochromocytomák elkülönítésére. A potenciális biomarkerek azonosítására és hatékonyságának vizsgálatára SPSS 15 for Windows szoftver segítségével Receiver Operating Characteristics (ROC) analízist alkalmaztunk.

IV.6. Teljes génexpressziós microarray vizsgálatok mellékvesekéreg daganatokban A fent említett 16 mellékvese eredetű szövetben (csoportonként 4-4 ép mellékvese, inaktív adenoma, kortizol-termelő adenoma és carcinoma) a nagy áteresztőképességű miRNS expressziós profil meghatározása mellett teljes mRNS expressziós microarray vizsgálatokat is végeztünk Agilent 4x44 k Whole Human Genome Oligo Microarray lemezek (Agilent Tech. Inc.) segítségével. A mérés nagyobb pontossága érdekében kétszínű fluoreszcens jelölést alkalmaztunk, melynek során az egyes minták intenzitását egységes háttér referenciához hasonlítottuk. Jelen esetben a háttér referenciát a vizsgált 16 mintából "pool"-ozott RNS keverék jelentette. A reverz transzkripcióhoz mind az egyes RNS minták, mind pedig a referencia minta esetében 1 µg minőségellenőrzött teljes RNS-t használtunk kiindulási anyagnak, amelyet RNA Spike-In Kittel (Agilent Tech. Inc.) kevertünk össze. Az egyes minták megszintetizált cDNS-éből "in vitro" transzkripciós reakcióban fluoreszcens cyanine 5 (Cy 5)-, a referencia minta cDNS-éből pedig cyanine 3 (Cy 3)-CTP-vel (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) jelölt cRNS-t készítettünk. A reverz transzkripciós reakcióhoz és a jelölt cRNS-ek szintézéséhez egyaránt Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification Kit-et (Agilent Tech. Inc.) használtunk a gyártó által ajánlott Dual Color Expression Microarray Protocol 5.5 verziója szerint. Az így szintetizált cRNS mintákat Qiagen RNeasy Mini Spin Column (Qiagen GmbH) oszlopok felhasználásával tisztítottuk. A cRNS mennyiségét, tisztaságát valamint a festék beépülésének hatékonyságát Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific) segítségével ellenőriztük. Ezt követően 825 ng cyanine 5-tel jelölt cRNS mintát és azonos mennyiségű cyanine 3-mal jelölt referencia mintát összekevertünk az Agilent Gene Expression Hybridization Kit (Agilent Tech. Inc.) hibridizációs reakcióhoz szükséges komponenseivel, majd a mintákat a gyártó utasításainak megfelelően a microarray

57

lemezekhez hibridizáltattuk. Az array lemezek leolvasása mosást követően Agilent DNA Microarray Scanner (Agilent Tech. Inc.) segítségével történt, majd az eredmények kicsomagolását és normalizálását a két színnel jelölt Agilent 4x44 k-s lemezekhez ajánlott paraméterek szerint a Feature Extraction szoftver 8.5-ös verziójával (Agilent Tech. Inc.) kiviteleztük. A microarray eredmények további, protokoll szerinti normalizálását és statisztikai feldolgozását GeneSpring GX 9.0 szoftver (Agilent Tech. Inc.) segítségével végeztük. A szignifikáns expressziós eltérést mutató gének (fold change > 2) azonosítása egyutas ANOVA módszerrel történt, amelyet az elsőfajú hiba csökkentése céljából Benjamini-Hochberg többszörös hipotézis korrekcióval egészítettünk ki. A korrigált p-értékeket 0.05 alatt fogadtuk el szignifikánsnak. Post hoc tesztként Tukeyféle HSD tesztet alkalmaztunk.

IV.7. A TOP2A microarray során észlelt expressziós eltéréseinek validálása qRT-PCR-rel A szignifikáns expressziós eltérést mutató mRNS microarray eredmények közül a TOP2A gént választottuk ki validálásra, melynek fokozott expressziója az irodalmi adatok alapján a mellékvesekéreg carcinomák egyik legjellemzőbb eltérése. A qRTPCR validálást 10 ép mellékvese, 10 inaktív adenoma, 9 kortizol-termelő adenoma és 6 mellékvesekéreg carcinoma esetében végeztük el. A qRT-PCR vizsgálatokhoz első lépésben mintánként 1 µg teljes RNS felhasználásával, High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit-tel (Applied Biosystems) reverz transzkripciót végeztünk a gyártó által mellékelt protokollnak megfelelően. Ezt követően a qRT-PCR reakciókhoz TaqMan Fast Universal PCR Master Mix-et valamint a TOP2A-ra specifikus TaqMan Gene Expression Assay-t használtunk (Hs00172214_m1, Applied Biosystems). A cDNS minták amplifikációját 7500 Fast Real-Time PCR System készüléken végeztük (Applied Biosystems) a megadott hőmérsékletértékek és időtartamok mellett. Minden egyes minta esetén három párhuzamos mérést végeztünk. Az amplifikációs görbék elemzésére SDS Programot (Applied Biosystems) használtunk. Referencia génnek a glicerinaldehid-3 foszfát dehidrogenázt (GAPDH) (Hs99999905_m1) választottuk (Applied Biosystems). Az

58

egyes csoportok közötti eltérések kimutatására összehasonlító ddCT módszert alkalmaztunk {155}. A különböző típusú mellékvesekéreg daganatok és ép mellékveseszövet között fennálló szignifikáns génexpressziós eltérések azonosítására egyutas ANOVA-t végeztünk (p < 0.05), amelyet Scheffé post hoc teszttel egészítettünk ki.

IV.8. A szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek potenciális cél mRNS-einek azonosítása bioinformatikai módszerekkel A mellékvesekéreg daganatok valamint a különböző típusú sporadikus és öröklődő phaeochromocytomák között szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek lehetséges célmolekuláit különböző számítógépes target predikciós algoritmusok segítségével azonosítottuk. Ahogy az már az irodalmi áttekintésből is kiderült, az egyes algoritmusok különböző szempontokat eltérő súllyal vesznek figyelembe a predikció során. Jelenleg nincsen egyértelmű állásfoglalás az egyes target predikciós adatbázisok preferenciáját illetően, ezért munkánk során a legszélesebb körben alkalmazott algoritmusok eredményeit vettük figyelembe. A mellékvesekéreg daganatok között szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek

potenciális

targetjeinek

azonosítására

a

TargetScan

4.2

(www.targetscan.org), PicTar (www.pictar.org) és miRBase Targets Version 5 (www.mirbase.org) algoritmusokat használtuk. Munkánk második részében, a phaeochromocytomák vizsgálata során a TargetScan egy újabb verzióját (Release 5.1) és

a

korábban

miRBase

néven

ismert,

MicroCosm

Targets

Version

5

(www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm) internetes adatbázisokat használtuk. A PicTar algoritmus (utolsó frissítése 2007-ben történt) a különböző phaeochromocytomák között szignifikáns

expressziós

eltérést

mutató

miRNS-eket

nem

vizsgálja,

így

phaeochromocytomák esetén csak az említett két algoritmus predikciói álltak rendelkezésünkre. Az említett target predikciós algoritmusok eredményeinek összevetésére létrehoztunk egy Microsoft Visual FoxPro 9.0 (Microsoft Inc., Redmond, WA, USA) segítségével írt programalkalmazást. Ez az adatbáziskezelő szoftver alkalmas a fenti algoritmusok által publikált különböző target azonosítók (HUGO Gene ID, Ensembl

59

Transcript ID, RefSeq ID) egymásnak történő kölcsönös megfeleltetésére, amelyet egy külső annotációs szótár segítségével végez (www.ensembl.org). Az általunk létrehozott szoftver használatával azonosítani tudjuk egy adott miRNS (vagy miRNS készlet) fenti algoritmusok által prediktált összes potenciális célmolekuláját, a targetekhez hozzá tudjuk rendelni az algoritmusok által kalkulált valószínűségi "score" értékeket, a "site"okra vonatkozó egyéb rendelkezésre álló adatokat, illetve lehetőségünk nyílik a két vagy három adatbázis között átfedő célpontok azonosítására.

IV.9. Biológiailag releváns cél mRNS-ek bioinformatikai módszerekkel történő azonosítása mellékvesekéreg daganatokban Mellékvesekéreg eredetű szövetek esetén a miRNS expressziós eltérések mellett a vizsgált mintákra jellemző teljes mRNS expressziós adatok is rendelkezésünkre álltak, így

lehetőségünk

nyílt

a

bioinformatikai

módszerekkel

prediktált

célpontok

szövetspecifikus kontextusban történő vizsgálatára. IV.9.1. Mellékvesekéreg daganatokban expresszálódó szövetspecifikus targetek azonosítása A különböző számítógépes algoritmusok által prediktált célpontok közül csak azok állhatnak valóban miRNS szabályozás alatt mellékvesekéreg eredetű szövetekben, amelyek az adott miRNS-sel ko-expresszálódnak. Így az általunk vizsgált szövetekben nem expresszálódó mRNS-eket a potenciális targetek listájából kiszűrtük. A szűrés elvégzéséhez Microsoft Visual Foxpro 9.0 (Microsoft Inc.) adatbáziskezelő alkalmazást használtunk. A vizsgált szövettípusban (ép mellékvese, inaktív adenoma, kortizol-termelő adenoma, mellékvesekéreg carcinoma) az mRNS expresszió hiányát az alábbi szubjektív szűrési kritériumok esetén állítottuk fel: 1.) A vizsgálati csoportban (n = 4) háromnál kevesebb minta kapott "Present flag" minősítést. 2.) Az adott gén nyers ("raw") szignál intenzitás értéke a csoporton (n = 4) belül kevesebb, mint három minta esetében haladta meg az 50-es percentilist (az adott mintában mért összes próbához tartozó nyers ("raw") szignál intenzitás értékek 50-es percentilise). A 16 vizsgált minta

60

esetében számított 50-es percentilisek átlaga jelentősen meghaladta a háttér ("background") intenzitást. IV.9.2. Ellentétes expressziós változást mutató targetek azonosítása (Gene Set Enrichment Analysis) Újabb megfigyelések szerint a miRNS-ek által előidézett jelentősebb mértékű fehérjeszint-csökkenés

emlős

sejtekben

is

elsősorban

az

mRNS

degradáció

következményeként valósul meg, így a biológiailag releváns célpontok azonosítását segíthetik a párhuzamosan elvégzett nagy áteresztőképességű miRNS és mRNS expressziós mérések. A vizsgált szövetben emelkedett expressziójú miRNS-ek targetjei ennek értelmében csökkent kifejeződést mutatnak, míg a csökkent expressziójú miRNSek targetjei fokozott mértékben expresszálódnak. Ezek alapján, a szignifikáns expressziós

eltérést

mutató

miRNS-ek

biológiailag

releváns

célmolekuláinak

azonosítása érdekében, az adott miRNS-sel ellentétes irányban változó expressziójú célpontok

azonosítására

törekedtünk.

Ehhez

Gene

Set

Enrichment

Analysis

("géncsoport dúsulás vizsgálat") (GSEA) szoftvert használtunk {157}. A

génexpressziós

vizsgálatok

eredményeit

feldolgozó

hagyományos

bioinformatikai és statisztikai elemzések elsősorban a szignifikáns eltérések azonosítására helyezik a hangsúlyt, ezáltal elfedik a kisebb mértékű, patomehanizmus szempontjából lényeges változásokat. Ezzel szemben a GSEA előzetes szűrési prekoncepciótól mentesen tanulmányozza az egyes csoportok génexpressziójában mutatkozó különbségeket, így finomabb eltérések azonosítására is alkalmas. A GSEA azt vizsgálja, hogy az egyes csoportokban fokozott vagy csökkent kifejeződésű gének mutatnak-e szignifikáns dúsulást a készítők által előre definiált (funkcionális egységet alkotó, azonos kromoszomális lokalizációjú gének, stb.) vagy felhasználó által tetszőlegesen létrehozott génlistákban. A GSEA első lépésben a nyers microarray adatokat rangsorolja aszerint, hogy az egyes gének milyen mértékű expressziós eltérést mutatnak a két kísérleti csoport között, majd azt vizsgálja, hogy az említett génlistákban a fokozott vagy csökkent expressziót mutató gének dúsulnak-e fel nagyobb számban {157}. Munkánk során a GSEA-t új megközelítésben alkalmaztuk. Ennek során a két vizsgált csoport között szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek előzőleg

61

azonosított, szövetspecifikus targetlistáit az adott összehasonlítás szerint rangsorolt mRNS microarray adatokkal vetettük össze. E módszerrel olyan szövetspecifikus célpontokat kerestünk, amelyek expressziója az őket potenciálisan szabályozó miRNSekkel ellentétes irányban változik. Az elemzéshez a GSEA Software v 2.0-t (www.broad.mit.edu) használtuk. A GSEA-t a kísérleti csoportok összes lehetséges párosítása mellett elvégeztük, amely összehasonlítások esetén szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-eket azonosítottunk (ép mellékvese vs. mellékvesekéreg carcinoma, kortizol-termelő adenoma vs. carcinoma, inaktív adenoma vs. carcinoma, ép mellékvese vs. kortizoltermelő adenoma). A vizsgálathoz minden párosítás esetén saját génlistákat hoztunk létre, amelyek az adott két kísérleti csoport között szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek előzőleg szövetspecifikusan szűrt, potenciális targetjeit tartalmazták. A hamis negatív célpontok számának csökkentése érdekében a szövetspecifikus listák azokat a targeteket tartalmazták, amelyek az adott összehasonlításban résztvevő legalább egyik csoportban expresszálódtak. Az előzőek alapján az ép mellékvese vs. carcinoma összehasonlításban 5, az inaktív adenoma vs. carcinoma valamint a kortizoltermelő adenoma vs. carcinoma párosításban 4-4, az ép mellékvese vs. kortizol-termelő adenoma összehasonlításban pedig 1 génlistát hoztunk létre. A GSEA szoftver segítségével rangsorolt microarray eredmények alapján lehetőségünk nyílt a vizsgált miRNS-sel ellentétes irányban változó szövetspecifikus célpontok azonosítására. Amennyiben egy miRNS az adott szövetben felülexpresszált, az inverz expressziós eltérést mutató targeteket a rangsorolt lista alján kerestük (alulexpresszált gének), olyan módszerrel, hogy a "Running Enrichment Score" értékek 0-tól való maximális negatív eltérésénél húztuk meg a "cut-off" értéket (5. ábra)

62

5. ábra: A szignifikánsan fokozott expressziójú miRNS-sel ellentétes irányban változó targetek azonosítása Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) szoftver segítségével A kortizol-termelő adenoma csoportban a carcinomákhoz viszonyítva szignifikánsan fokozott expressziós eltérést mutató miRNS (hsa-miR-511) ellentétes irányban változó cél mRNS-einek kiválasztása. A módszer részletei a szövegben olvashatók. CPA: kortizol-termelő mellékvesekéreg adenoma; ACC: mellékvesekéreg carcinoma; NA: ép mellékvese; IA: hormonálisan inaktív mellékvesekéreg adenoma.

Alulexpresszált miRNS-ek esetén a potenciális célpontok kifejeződése fokozott, így a "Running Enrichment Score" értékek 0-tól való legnagyobb mértékű pozitív eltérésénél húztuk meg a "cut-off" értéket, ilyen módon a rangsorolt lista tetején elhelyezkedő, fokozott expressziójú targeteket azonosítottuk (6. ábra).

63

6. ábra: A szignifikánsan csökkent expressziójú miRNS-sel ellentétes irányban változó targetek azonosítása Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) szoftver segítségével A kortizol-termelő adenoma csoportban a carcinomákhoz viszonyítva szignifikánsan csökkent expressziós eltérést mutató miRNS (hsa-miR-184) ellentétes irányban változó cél mRNS-einek kiválasztása. A módszer részletei a szövegben olvashatók. CPA: kortizol-termelő mellékvesekéreg adenoma; ACC: mellékvesekéreg carcinoma; NA: ép mellékvese; IA: hormonálisan inaktív mellékvesekéreg adenoma.

64

IV.10. Útvonal analízis A szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek mellékvesekéreg daganatok és phaeochromocytomák patogenezisében játszott szerepének tisztázására a miRNS célpontok útvonal analízisét végeztük el. Mellékvesekéreg daganatok esetén, a kísérleti csoportok összes olyan lehetséges párosításában, ahol szignifikáns miRNS eltérés adódott (ép mellékvesekéreg vs. mellékvesekéreg carcinoma, inaktív adenoma vs. carcinoma, kortizol-termelő adenoma vs. carcinoma, ép mellékvese vs. kortizol-termelő adenoma), a fent részletezett módon szűrt (szövetspecifikus, ellentétesen változó expressziójú) miRNS targetek biológiai funkcióit Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 7.1 szoftver (Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA; www.ingenuity.com) segítségével elemeztük. Mivel phaeochromocytomák esetében a vizsgált szövetek párhuzamos mRNS expressziós mintázatáról nem rendelkeztünk adatokkal, e tumorok esetében csak a target predikciós algoritmusok segítségével azonosított, tisztán bioinformatikai módszerekkel prediktált célpontok útvonal analízisét végeztük el a különböző csoportonkénti összehasonlításokban (VHL vs. sporadikus benignus, VHL vs. sporadikus recidíváló, VHL vs. NF1, MEN2 vs. VHL, MEN2 vs. sporadikus benignus, MEN2 vs. sporadikus recidíváló, MEN2 vs. NF1, sporadikus recidíváló vs. sporadikus benignus). Útvonal elemzésre az IPA 8.5 szoftvert használtuk. A miRNS targetek funkcionális vizsgálata mellett, a különböző típusú mellékvesekéreg daganatok között szignifikáns expressziós eltérést mutató gének (mRNS microarray eredmények) útvonal elemzését is elvégeztük IPA 7.1 szoftver segítségével. A mellékvesekéreg daganatok és phaeochromocytomák molekuláris és bioinformatikai vizsgálatára kidolgozott munkafolyamatok főbb lépéseit mutatja a 7. és 8. ábra.

65

7. ábra: A mellékvesekéreg daganatok integratív molekuláris (miRNS, mRNS) és bioinformatikai vizsgálatára kidolgozott módszer főbb lépései IA: inaktív adenoma; CPA: kortizol-termelő adenoma; ACC: adrenocorticalis carcinoma; GSEA: Gene Set Enrichment Analysis; qRT-PCR: kvantitatív reverz transzkripciós PCR.

66

8. ábra: A phaeochromocytomák esetében elvégzett miRNS expressziós vizsgálatok és bioinformatikai elemzések főbb lépései SR: sporadikus recidíváló; SB: sporadikus benignus; VHL: von Hippel-Lindau-szindrómához társuló; MEN2: multiplex endokrin neoplasia 2-es típusához társuló; NF1: 1-es típusú neurofibromatosishoz társuló phaeochromocytoma; FFPE: formalinnal-fixált, paraffinba ágyazott szövet; qRT-PCR: kvantitatív reverz transzkripciós PCR.

67

V. EREDMÉNYEK V.1.

A

miRNS-ek

expressziós

mintázatának

és

patogenetikai

szerepének vizsgálata mellékvesekéreg daganatokban V.1.1. miRNS expressziós mintázat vizsgálata mellékvesekéreg daganatokban A különböző típusú mellékvesekéreg daganatok (inaktív adenoma, kortizol-termelő adenoma, adrenocorticalis carcinoma) és ép mellékvese minták miRNS expressziós profiljának TaqMan-kártyás vizsgálata 365 miRNS és két "housekeeping"(RNU44 és RNU48) expressziójának párhuzamos mérését tette lehetővé. A négy vizsgálati csoportban csoportonként 4-4, összesen 16 mintát vizsgáltunk. A CT értékek minták közötti szórásvizsgálata alapján a két vizsgált "housekeeping" közül az RNU48 mutatott kisebb szórást (átlag CTRNU48 ± SD: 23.24 ± 0.8; átlag CTRNU44 ± SD: 26.89 ± 1.25), így mind a TaqMan-kártya segítségével mért miRNS intenzitások normalizálásához, mind pedig a további qRT-PCR validáláshoz belső kontrollnak az RNU48-at választottuk. A normalizálást követően elvégzett statisztikai elemzés során összesen 26 miRNS expressziója mutatott szignifikáns eltérést (ANOVA, p < 0.05) a kísérleti csoportok között. E szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek közül négy miRNS (hsa-miR-129, hsa-miR-153, hsa-miR-596, hsa-miR-649) a vizsgált 16 mintából kevesebb, mint 9-ben expresszálódott, és mivel e négy miRNS a csoportok (n = 4) közül egyik csoportban sem volt minden mintában kimutatható, így ezeket a további vizsgálatainkból kizártuk (e négy miRNS esetében a statisztikai szoftver nem tudott post hoc tesztet készíteni). Összesen tehát 22 miRNS-t azonosítottunk, amelyek szignifikáns expressziós eltérést mutattak (ANOVA, p < 0.05) a vizsgálati csoportok között, és amelyek megfeleltek a fenti szűrési kritériumainknak (9. ábra). A 22 szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-t és a vizsgált 16 mintát a normalizált miRNS expressziós eredmények alapján egyaránt hierarchikus klaszter elemzésnek vetettük alá, amely során az azonos csoportba tartozó minták együtt klasztereződtek. A klaszter analízis eredményét mutatja be a 9. ábrán látható miRNS expressziós hőtérkép ("heat map").

68

9. ábra: A vizsgálati csoportok között szignifikánsan eltérő kifejeződést mutató miRNS-ek listája (A) és expressziós hőtérképe (B) A 22 szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-t és a vizsgált 16 (csoportonként 4-4) mintát a normalizált miRNS expressziós eredmények (-dCT) alapján egyaránt hierarchikus klaszter analízisnek vetettük alá. Ennek során az azonos csoportba tartozó minták egymás mellé kerültek. NA: ép mellékvese; IA: inaktív adenoma; CPA: kortizol-termelő adenoma; ACC: kortizol-termelő mellékvesekéreg carcinoma. A piros szín az expresszió fokozódását, a zöld az expresszió csökkenését, a szürke pedig a nem kimutatható miRNS-eket jelöli.

69

Annak kijelölésére, hogy a variancia-analízis során azonosított miRNS-ek mely csoportok között mutatnak szignifikáns expressziós eltérést, Tukey és Scheffé post hoc teszteket végeztünk. Az ép mellékvese és a mellékvesekéreg carcinoma minták között Scheffé-teszttel 9 (hsa-miR-181b, hsa-miR-181d, hsa-miR-196b, hsa-miR-210, hsa-miR214, hsa-miR-375, hsa-miR-424, hsa-miR-506, hsa-miR-511), Tukey-féle HSD teszttel pedig 10 miRNS-t (hsa-miR-181b, hsa-miR-181d, hsa-miR-196b, hsa-miR-210, hsamiR-214, hsa-miR-375, hsa-miR-424, hsa-miR-491, hsa-miR-506, hsa-miR-511) azonosítottunk. Az inaktív adenomák és mellékvesekéreg carcinomák között Schefféteszttel 9 (hsa-miR-181b, hsa-miR-181d, hsa-miR-210, hsa-miR-215, hsa-miR-299-5p, hsa-miR-424, hsa-miR-503, hsa-miR-511, hsa-miR-615), míg a kevésbé szigorú Tukeyteszttel az említett 9 miRNS-en kívül további 7 (hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-192, hsamiR-196b, hsa-miR-214, hsa-miR-342, hsa-miR-365, hsa-miR-485-5p), összesen 16 miRNS mutatott szignifikáns expressziós eltérést. A kortizol-termelő adenoma vs. mellékvesekéreg carcinoma összehasonlításban a szigorúbb Scheffé post hoc teszttel 8 miRNS (hsa-miR-181b, hsa-miR-181d, hsa-miR-196b, hsa-miR-210, hsa-miR-214, hsamiR-222, hsa-miR-376a, hsa-miR-511) expressziós eltérése bizonyult szignifikánsnak, ezek mellett Tukey-teszttel egy további szignifikánsan változó kifejeződésű miRNS-t (hsa-miR-299-5p) tudtunk azonosítani. Az ép mellékvese minták és az inaktív adenomák között két miRNS (hsa-miR-375, hsa-miR-615) mutatott szignifikáns expressziós eltérést (Tukey- és Scheffé-teszttel egyaránt), hasonlóan az inaktív vs. kortizol-termelő

adenoma

összehasonlításhoz

(hsa-miR-424,

hsa-miR-615).

Ép

mellékvese minták és kortizol-termelő adenomák között Tukey-teszttel két miRNS-t (hsa-miR-375, hsa-miR-424) azonosítottunk, amelyek közül a hsa-miR-375 Scheffé post hoc teszttel is szignifikánsnak bizonyult. A variancia-analízis során szignifikáns expressziós eltérést mutató hsa-miR-184 kizárólag mellékvesekéreg carcinomákban fejeződött ki. A szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek közül qRT-PCR módszerrel történő validálás és az esetszám növelése céljából 14 miRNS-t (hsa-miR181b, hsa-miR-181d, hsa-miR-184, hsa-miR-196b, hsa-miR-210, hsa-miR-214, hsamiR-215, hsa-miR-222, hsa-miR-375, hsa-miR-424, hsa-miR-503, hsa-miR-506, hsamiR-511, hsa-miR-615) választottunk ki. A kiválasztási szempontok a következők voltak: a statisztikailag legerősebb 10 miRNS-re (p < 0.01) valamint olyan további négy

70

miRNS-re (p < 0.05) esett a választás, amelyek esetén az expresszióban észlelt különbségeket (fold change) több, mint háromszorosnak találtuk. A qRT-PCR vizsgálatok során normalizálásra -a TLDA Human miRNA Panel eredményei alapján alkalmas "housekeeping"-nek bizonyuló- RNU48-at (átlag CTRNU48 ± SD: 23.24 ± 0.8) választottuk. A qRT-PCR validálást összesen 36 ép és tumoros mellékvesekéreg szöveten végeztük el (10 ép mellékvese, 10 inaktív adenoma, 9 kortizol-termelő adenoma, 7 kortizol-termelő carcinoma). A kiválasztott 14 miRNS közül 6 esetben (hsa-miR-184, hsa-miR-210, hsa-miR-214, hsa-miR-375, hsa-miR-503, hsa-miR-511) sikerült szignifikáns expressziós eltérést igazolni a vizsgált csoportok között (10. ábra). A hsa-miR-184 és hsa-miR-503 szignifikáns expressziós növekedést mutatott malignus

mellékvesekéreg

carcinomákban

összehasonlítva

az

ép

mellékvese

szövetekkel valamint a benignus mellékvesekéreg adenomákkal (inaktív adenoma, kortizol-termelő adenoma). A hsa-miR-210 expressziója kortizol-termelő malignus daganatokban szignifikánsan magasabbnak bizonyult a kortizol-termelő benignus adenomákhoz képest (10. ábra A). Ezzel szemben a hsa-miR-511 expressziója szignifikánsan alacsonyabbnak bizonyult mellékvesekéreg carcinomákban az összes többi vizsgált csoporthoz képest (ép mellékvese, inaktív adenoma, kortizol-termelő adenoma), míg a hsa-miR-214 expressziója malignus mellékvesekéreg daganatokban az ép szövethez és az inaktív adenomákhoz képest mutatott szignifikáns csökkenést. A hsa-miR-375 normális mellékvesében észlelt fokozott expresszióját a kortizol-termelő benignus és kortizoltermelő malignus daganatokkal történő összevetés során találtuk szignifikáns mértékűnek (10. ábra B).

71

10. ábra: A validált miRNS-ek expressziós változásai mellékvesekéreg daganatokban Az ábra az ép mellékvese szövetekhez viszonyított relatív miRNS expressziós változásokat (ddCT) mutatja az egyes csoportokban (átlag ± SEM). NA: ép mellékvese; IA: inaktív adenoma; CPA: kortizol-termelő adenoma; ACC: mellékvesekéreg carcinoma. *: egyutas ANOVA, p < 0.05, post hoc teszt: Scheffé. (A) ACC-ban fokozott (B) ACC-ban csökkent expressziójú miRNS-ek.

72

V.1.2. Mellékvesekéreg carcinomák azonosítására alkalmas miRNS biomarkerek Munkánk során a mellékvesekéreg daganatok malignus viselkedésének előrejelzésére alkalmas miRNS biomarkereket is kerestünk. E célból a qRT-PCR vizsgálatok során validált, mellékvesekéreg carcinomákban legnagyobb mértékű, szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-eket (dCThsa-miR-184, dCThsa-miR-503, dCThsa-miR-511) és azok kombinációit (dCThsa-miR-511-dCThsa-miR-503, dCThsa-miR-511-dCThsa-miR-184) vizsgáltuk ROC analízissel. A görbe alatti területek (Area Under the Curve = AUC) meghatározása során a dCThsa-miR-511 (AUC = 0.985), a dCThsa-miR-511-dCThsa-miR-503 (AUC = 0.995) valamint a dCThsa-miR-511-dCThsa-miR-184 (AUC = 0.970) bizonyult alkalmas biomarkernek a malignitás eldöntésére (11. ábra).

11. ábra: A mellékvesekéreg carcinomák elkülönítésére legalkalmasabbnak talált miRNS biomarkerek Receiver Operating Characteristics (ROC) görbéi dCT: delta cycle threshold (RNU48-ra normalizált CT érték); AUC: ROC görbe alatti terület (Area Under the Curve).

A dCThsa-miR-511-dCThsa-miR-503 különbségének vizsgálatakor a diagnosztikai döntési szintet 1.4-re beállítva (mellékvesekéreg carcinoma a diagnózis, ha az adott mintában a dCThsa-miR-511-dCThsa-miR-503 ≥ 1.4) 100%-os szenzitivitással és 97%-os specificitással tudtuk felismerni vizsgálati mintáink (10 ép mellékvese, 10 inaktív adenoma, 9 kortizol-termelő adenoma, 7 adrenocorticalis carcinoma) között a mellékvesekéreg carcinomákat. A dCThsa-miR-511 esetén a "cut-off" értéket 8.5-nél meghúzva (mellékvesekéreg carcinoma a diagnózis, ha az adott mintában a dCThsa-miR511

≥ 8.5) a szenzitivitás 100%-nak, a specificitás 93%-nak adódott. A dCThsa-miR-511-

73

dCThsa-miR-184 különbségének vizsgálatakor a diagnosztikai határértéket -6.45-nél beállítva (mellékvesekéreg carcinoma a diagnózis, ha az adott mintában a dCThsa-miR-511dCThsa-miR-184 ≥ -6.45) 100%-os szenzitivitással és 80%-os specificitással tudtuk elkülöníteni a mellékvesekéreg carcinomákat a többi vizsgált mintától. V.1.3. Teljes génexpressziós (mRNS) microarray vizsgálatok mellékvesekéreg daganatokban A nagy áteresztőképességű miRNS expressziós mérések mellett a fent említett 16 mellékvesekéreg eredetű minta (csoportonként 4-4 ép mellékvese, inaktív adenoma, kortizol-termelő adenoma, mellékvesekéreg carcinoma) párhuzamos transzkriptomikai vizsgálatát is elvégeztük. A nyers és normalizált mRNS expressziós microarray adatok elérhetők a Gene Expression Omnibuson (GEO; www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) a GSE14922 azonosító alatt. A microarray eredmények kiértékelése és statisztikai elemzése (egyutas ANOVA, p < 0.05, Benjamini-Hochberg korrekció) során összesen 614 gén expressziója mutatott szignifikáns expressziós eltérést (fold change > 2) a vizsgált csoportok között. A szignifikáns expressziós eltérések kijelölésére Tukey post hoc tesztet alkalmaztunk. Az ép mellékvese minták és mellékvesekéreg carcinomák között összesen 603 gén expressziója (302 gén fokozott, 301 gén pedig csökkent expressziójú carcinomákban) mutatott szignifikáns expressziós eltérést. Az ép szövet vs. inaktív adenoma összehasonlításban 48 gén (2 gén fokozott, 46 pedig csökkent kifejeződésű inaktív adenomákban), az ép szövet vs. kortizol-termelő adenoma összevetésben pedig 118 gén (47 gén felülregulált, 71 pedig alulexpresszált kortizol-termelő adenomákban) expressziós eltéréseit találtuk szignifikánsnak. Az inaktív és kortizol-termelő adenomák között 92 gén (57 gén felülexpresszált, 35 alulexpresszált kortizol-termelő adenomákban) mutatott szignifikáns expressziós eltérést. Az inaktív adenomák és a mellékvesekéreg carcinomák között 575 (308 felülexpreszált, 267 alulexpresszált carcinomákban), a kortizol-termelő adenoma és mellékvesekéreg carcinoma csoportok között pedig 467 (245 fokozott, 222 csökkent kifejeződésű) szignifikáns expressziós eltérést mutató gént azonosítottunk. A mellékvesekéreg carcinomákra legjellemzőbb génexpressziós eltéréseket saját mintáinkon is azonosítani tudtuk. A TOP2A expressziója ugyanis az általunk vizsgált

74

mellékvesekéreg carcinomákban az ép szövethez, inaktív és kortizol-termelő adenomákhoz képest 14-szeres, 9-szeres és 10-szeres emelkedést mutatott. Az IGF-2 expresszióját a carcinomákban közel 7-szer magasabbnak találtuk az inaktív adenomákhoz képest, míg a normális mellékvese szövetekhez és a kortizol-termelő adenoma csoporthoz viszonyítva ez az expresszió fokozódás körülbelül 3-szorosnak adódott. A sejtciklusban kulcsfontosságú szerepet játszó ciklin B2 (CCNB2) kifejeződését mellékvesekéreg carcinomákban több mint 14-szeresnek találtuk a másik három vizsgált csoporttal összevetve. További sejtciklus gének, köztük a cell division cycle 2 és 25C (CDC2 és CDC25C) expressziója szintén szignifikánsan magasabbnak adódott

mellékvesekéreg

carcinomákban

az

ép

mellékveséhez

és

benignus

adenomákhoz képest, ezzel szemben a CDKN1C szignifikáns expresszió csökkenést mutatott a carcinoma csoportban. V.1.4. A TOP2A expressziós eltéréseinek validálása qRT-PCR módszerrel Az mRNS microarray vizsgálatok során szignifikáns expressziós eltérést mutató gének közül qRT-PCR módszerrel történő validálás és az esetszám növelése (n = 35) céljából a TOP2A-t választottuk ki. A validálás során a TOP2A expressziója szignifikánsan magasabbnak bizonyult mellékvesekéreg carcinomákban az ép mellékvese (9-szeres expresszió emelkedés) valamint a kortizol-termelő adenoma (3-szoros expresszió növekedés) csoporthoz képest. Emellett a TOP2A kifejeződése inaktív adenomákban is több mint 7-szeres mértékben meghaladta a normál szövetekben mért értéket (12. ábra).

75

12. ábra: A topoizomeráz 2A (TOP2A) validált expressziós eltérései mellékvesekéreg daganatokban Az ábra az ép mellékvese szövetekhez viszonyított relatív génexpressziós változásokat (ddCT) mutatja az egyes csoportokban (átlag ± SEM). NA: ép mellékvese; IA: inaktív adenoma; CPA: kortizol-termelő adenoma; ACC: adrenocorticalis carcinoma. *: egyutas ANOVA, p < 0.05, post hoc teszt: Scheffé.

V.1.5. A szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek összes prediktált és szövetspecifikus targetjének azonosítása mellékvesekéreg daganatokban A mellékvesekéreg daganatokban szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek patogenetikai szerepének megismeréséhez elengedhetetlen célmolekuláik azonosítása. A potenciális cél mRNS-ek prediktálására napjainkban egyre több, különböző matematikai algoritmusok alapján működő szoftver áll rendelkezésünkre. Jelenleg a szakirodalomban nincsen egyértelmű állásfoglalás az egyes target predikciós algoritmusok hatékonyságát és megbízhatóságát illetően, ezért munkánk során a három leggyakrabban alkalmazott algoritmus (miRBase, PicTar, TargetScan) humán predikciós eredményeit integráltuk. Ennek kivitelezésére munkacsoportunk létrehozott egy saját adatbáziskezelő szoftvert, amely alkalmas arra, hogy az említett predikciós algoritmusok által a targetek megjelölésére használt különböző gén és mRNS azonosítókat egy külső kódszótár segítségével egymásnak kölcsönösen megfeleltesse. Az adatbázis kezelő szoftver alkalmazásával lehetőségünk nyílt továbbá arra is, hogy az

76

így azonosított targetekhez hozzárendeljük az egyes algoritmusok által kalkulált valószínűségi "score" értékeket valamint a célpontok 3' UTR-n található "site"-ok számára és konzerváltsági fokára vonatkozó információkat. A saját program segítségével azonosítani tudtuk egy tetszőleges miRNS vagy miRNS készlet összes (három adatbázis valamelyike által) prediktált targetjét (alkalmazott szűrési feltételek nélkül) valamint a két vagy több algoritmus eredményei között átfedő cél mRNS-eket. A saját szoftver által azonosított összes, illetve az algoritmusok között átfedő módon prediktált miRNS-mRNS interakciók számát mutatja a 13. ábra.

55 963 5 041

TargetScan: nem-konzervált

364 962 miRBase

TargetScan: konzervált

3 901 Pic Tar

833 917

142 1 114

61 475 1 569

20 025 29 617

13. ábra: A három leggyakrabban használt target predikciós algoritmus által külön-külön és átfedő módon prediktált miRNS-mRNS interakciók száma

A miRBase, a PicTar és a TargetScan (konzervált és nem-konzervált "site"-okat tartalmazó adatbázisokra osztható) algoritmusok által együttesen prediktált nagyszámú (~1350000) miRNS-mRNS interakció ellenére saját szoftverünk segítségével csupán 3901 interakciót sikerült azonosítanunk, amelyet mindhárom vizsgált algoritmus egyaránt kimutatott (a kismértékű átfedés lehetséges okaira az "Irodalmi áttekintés" című fejezetben utaltam). A legnagyobb arányú átfedést a PicTar és a konzervált

77

TargetScan adatbázisok között találtuk (a PicTar predikcióinak 53%-a). Viszonylag nagymértékű átfedés mutatkozott a miRBase és a nem-konzervált TargetScan adatbázisok predikciói között is. A mellékvesekéreg daganatok között szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek (hsa-miR-184, hsa-miR-210, hsa-miR-214, hsa-miR-375, hsa-miR-503, hsamiR-511) prediktált célpontjait az általunk létrehozott adatbáziskezelő szoftver segítségével vizsgáltuk. A három algoritmus eredményei alapján, a hat miRNS tekintetében

összesen

17868

különböző

prediktált

miRNS-mRNS

interakciót

azonosítottunk. Mivel egy adott mRNS-t a hat miRNS közül több is szabályozhat, ez összesen 13147 különböző cél (target) mRNS-t jelent. A hat miRNS-nek a miRBase összesen 7140, a TargetScan 11336, a PicTar pedig 667 target mRNS-t prediktált. A prediktált targetek közül 1275 mutatott átfedést legalább két algoritmus között, ez az összes prediktált célpont 7%-át teszi ki (4. táblázat). Az így azonosított potenciális célpontok listájának szűkítése, a hamisan pozitív predikciók számának csökkentése valamint az általunk vizsgált mellékvesekéreg eredetű szövetekben biológiailag releváns targetek azonosítása érdekében kidolgoztunk egy új, szövetspecifikus target predikciós módszert. Ennek során a három miRNS target predikciós algoritmus "in silico" eredményeit és a kísérleti mintáinkon elvégzett teljes mRNS expressziós microarray vizsgálatok eredményeit integratív bioinformatikai megközelítéssel elemeztük. Azok az mRNS-ek, amelyek nem ko-expresszálódnak az őket potenciálisan reguláló miRNS-ekkel, az általunk vizsgált mellékvesekéreg szövetekben nem állhatnak miRNS szabályozás alatt, így ezeket az mRNS-eket az általunk létrehozott adatbáziskezelő szoftver segítségével a potenciális célpontok listájából kiszűrtük. E módszerrel a prediktált targetek listáját jelentősen szűkíteni tudtuk, és a négy vizsgálati csoportnak megfelelően szövetspecifikus cél mRNS listákat tudtunk létrehozni (4. táblázat).

78

miRNS

TargetScan

PicTar

miRBase

Összes

Összes prediktált szövetspecifikus

prediktált

célpont

célpont

NA

IA

CPA

ACC

miR-184

609

17

1164

1683

771

906

905

909

miR-503

1547

NP

1225

2617

1359

1642

1635

1573

miR-511

3045

NP

1064

3945

2295

2615

2658

2536

miR-214

3874

528

1427

5252

2870

3463

3470

3367

miR-375

1790

107

1158

2871

1537

1781

1804

1744

miR-210

471

15

1102

1500

687

793

807

784

4. táblázat: A mellékvesekéreg daganatokban szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNSek TargetScan, miRBase és PicTar algoritmusok által prediktált célpontjainak valamint a négy vizsgálati csoportban expresszálódó, szövetspecifikus targetjeinek száma NA: ép mellékvese; IA: inaktív adenoma; CPA: kortizol-termelő adenoma; ACC: adrenocorticalis carcinoma; NP: nem prediktált (= nem vizsgált).

V.1.6. A szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek ellentétes irányban változó expressziójú (szövetspecifikus) célpontjainak azonosítása (Gene Set Enrichment Analysis) Mivel a legújabb ismeretek szerint a miRNS-ek fehérje expressziót befolyásoló hatásának közvetítésében a cél mRNS-ek lebomlása jelentős, a miRNS-ek jellegzetes, szövetspecifikus

hatásai

az

adott

szövetben

transzkriptom

(mRNS)

szinten

"ujjlenyomatszerűen" tükröződnek. Így a vizsgált szöveteken párhuzamosan elvégzett, nagy áteresztőképességű miRNS és mRNS expressziós mérések eredményeinek integratív értékelésével lehetőség nyílik a biológiailag releváns célpontok azonosítására. Ezért munkánk során a továbbiakban a szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ekkel ellentétes irányban változó expressziójú, szövetspecifikus targeteket kerestük Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) szoftver segítségével. A GSEA-t a négy vizsgálati csoport összes párosított összehasonlításában elvégeztük, ahol szignifikáns miRNS expressziós eltérést tudtunk azonosítani. Az ép mellékvese vs. mellékvesekéreg carcinoma összehasonlításban a szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek összesen 1306 ellentétes irányban változó, szövetspecifikus

79

célpontját tudtuk azonosítani. Az inaktív adenoma vs. carcinoma összehasonlításban 647, a kortizol-termelő adenoma vs. carcinoma összehasonlításban 570, míg az ép mellékvese vs. kortizol-termelő adenoma párosítás esetén 451 ellentétes irányban változó, szövetspecifikus targetet tartalmazó listákat kaptunk. Mellékvesekéreg

V.1.7.

daganatok

patomechanizmusában

szerepet

játszó

útvonalak azonosítása (Ingenuity Pathway Analysis) A vizsgálati csoportok között szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek biológiai

funkciójának

elemzése

céljából

a

GSEA

segítségével

azonosított,

szövetspecifikus, ellentétes irányban változó expressziójú célpontokat útvonal analízisnek vetettük alá. Így olyan miRNS-ek által regulált útvonalak azonosítására nyílt lehetőségünk, amelyek a megváltozott poszttranszkripciós szintű szabályozás révén szerepet játszhatnak a mellékvesekéreg daganatok patomechanizmusában (5. táblázat). A biológiailag releváns miRNS célpontok mellett a vizsgálati csoportjaink között szignifikáns expressziós eltérést mutató gének (mRNS microarray eredmények) útvonal elemzését is elvégeztük, amely transzkripciós szinten érintett patogenetikai útvonalak felderítését tette lehetővé (6. táblázat). A mellékvesekéreg carcinoma és ép mellékvese csoportok összehasonlítása során mind transzkripciós (mRNS), mind pedig poszttranszkripciós (miRNS target) szinten a sejtciklus G2/M ellenőrzőpontjának károsodását találtuk a mellékvesekéreg carcinomákra legjellemzőbb patogenetikai eltérésnek (14. ábra).

80

Összehasonlítás (szignifikáns miRNS-ek) ACC vs. NA (hsa-miR-184, hsa-miR-214, hsa-miR-375, hsa-miR-503, hsa-miR-511)

ACC vs. IA (hsa-miR-184, hsa-miR-214, hsa-miR-503, hsa-miR-511)

ACC vs. CPA (hsa-miR-184, hsa-miR-210, hsa-miR-503, hsa-miR-511)

CPA vs. NA (hsa-miR-375)

Fokozott kifejeződésű célpontok BRCA1, CDC25B, CDC25C, GADD45, MYT1, SKP1

Csökkent kifejeződésű célpontok

"Top Kanonikus Útvonalak"

P-érték

Sejtciklus: G2/M ellenőrzőpont szabályozása

0.0022

Fenilalanin metabolizmus

0.0033

GOT2, MAOA, PRDX6

ALDH1A3, DHCR24, FAAH, GOT1

Kemokin szignál

0.0110

CALM1, CAMK2B, GNAI3, KRAS, MAPK8, MAPK14, NOX1, PLCG2

MYL2, PPP1R12B

Fenilalanin metabolizmus

0.0051

GOT2, MAOA, SMOX

ALDH1A3, DHCR24

Lizin degradáció

0.0241

OGDHL, PLOD1, PLOD3

ACAA1, ALDH1A3, TPP1

Komplement rendszer

0.0258

CD59

C2, C1QB, SERPING1

PTEN szignál

0.0003

AKT2, INSR, RAC1

Klatrin-mediált endocitózis

0.0027

ARPC1A, FGF13, ITGB8, LDLR, RAC1

NF-κB szignál

0.0034

AKT2, HDAC1, INSR, UBE2V1

Klatrin-mediált endocitózis

0.0023

Pirimidin metabolizmus

0.0050

PKR szerepe az interferon indukcióban és az antivirális válasz szabályozásában

0.0217

RPRM

BAD, BCL2, BMPR2, GHR, IKBKB, INPPL1, NGFR AP2M1, CD2AP, FGF2, FGF7, HSPA8, IGF1, ITGB5 BMPR2, GHR, IKBKB, NGFR, TLR1, TLR4, TRAF5

CD2AP, CLTC, CSNK2A1, FGF2, FGF7, ITGB8, MYO6, PDGFC, PPP3R2, SH3GLB1, USP9X DPYD, DPYSL3, NME5, NT5E, POLH, RFC3, RP2, RRM2B, TRUB1, TYMS, EIF2S1, MAP3K7, MAPK14, RNASEL

5. táblázat: A szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek szövetspecifikus, ellentétes irányban változó célpontjainak útvonal elemzése Az egyes összehasonlítások esetén a három legnagyobb mértékű statisztikai szignifikanciát mutató útvonalat tüntettük fel. NA: ép mellékvese; IA: inaktív adenoma; CPA: kortizol-termelő adenoma; ACC: mellékvesekéreg carcinoma.

81

Összehasonlítás

ACC vs. NA

ACC vs. IA

ACC vs. CPA

CPA vs. NA

CPA vs. IA IA vs. NA

"Top Kanonikus Útvonalak"

P-érték

Sejtciklus: G2/M ellenőrzőpont szabályozása

0.0000

LXR/RXR aktiváció

0.0000

BRCA1 szerepe a DNS károsodásra adott válaszban Sejtciklus: G2/M ellenőrzőpont szabályozása BRCA1 szerepe a DNS károsodásra adott válaszban

0.0004 0.0000 0.0003

Fokozott kifejeződésű gének

Csökkent kifejeződésű gének

CCNB1, CCNB2, CDC2, CDC25C, CUL1, PLK1, TOP2A ABCG1, APOC1, APOE, CD14, NGFR, NR1H3, PLTP, RXRA, SREBF1 BARD1, BLM, E2F2, FANCA, FANCD2, PLK1, RAD51 CCNB1, CCNB2, CDC2, CDC25C, CUL1, PLK1, TOP2A BARD1, BLM, E2F2, FANCA, FANCD2, PLK1, RAD51 ABCG1, APOC1, APOE, CD14, NGFR, NR1H3, PLTP, RXRA, SREBF1

LXR/RXR aktiváció

0.0004

Sejtciklus: G2/M ellenőrzőpont szabályozása

0.0000

CCNB1, CCNB2, CDC2, CDC25C, CUL1, PLK1, TOP2A

BRCA1 szerepe a DNS károsodásra adott válaszban

0.0001

BARD1, BLM, E2F2, FANCA, FANCD2, PLK1, RAD51

LXR/RXR aktiváció

0.0009

LXR/RXR aktiváció Kalcium szignál PPAR szignál LXR/RXR aktiváció TR/RXR aktiváció Glicerolipid metabolizmus Májfibrózis/Máj csillagsejt aktiváció Epesav bioszintézis Akut fázis reakció szignál

0.0330 0.0333 0.0515 0.0024 0.0042 0.0048 0.0023 0.0034 0.0051

DIO3 ADH1A, ADH1B

ABCG1, APOE, CD14, NGFR, NR1H3, PLTP, RXRA APOC1, NR1H3 MYH11, TNNC1, TNNT2 NR1H3, STAT5A APOC1, APOE, SREBF1 PIK3CD, SREBF1 DGAT1 IGFBP-5, MYH11, NGFR ADH1A, ADH1B NGFR, RBP4, SERPING1

6. táblázat: A teljes génexpressziós microarray vizsgálatok során azonosított, szignifikáns expressziós eltérést mutató mRNS-ek útvonal elemzése Az egyes összehasonlítások esetén a három legnagyobb mértékű statisztikai szignifikanciát mutató útvonalat tüntettük fel. NA: ép mellékvese; IA: inaktív adenoma; CPA: kortizol-termelő adenoma; ACC: mellékvesekéreg carcinoma.

82

14. ábra: A sejtciklus G2/M ellenőrzőpontjának károsodása mellékvesekéreg carcinomákban Az egyes fehérjék közötti vonalak és nyilak ismert molekuláris interakciókat mutatnak. A háromszögek a mellékvesekéreg carcinoma és ép mellékvese minták között szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-eket jelölik. Piros: szignifikáns expresszió növekedés; rózsaszín: nem szignifikáns mértékű expresszió fokozódás; sötétzöld: szignifikáns expresszió csökkenés; világoszöld: nem szignifikáns mértékű expresszió csökkenés.

83

V.2.

A

miRNS-ek

expressziós

mintázatának

és

patogenetikai

szerepének vizsgálata phaeochromocytomákban V.2.1. FFPE blokkokból izolált RNS minták minősége és alkalmazhatósága phaeochromocytomák miRNS expressziós profiljának meghatározására Munkánk során összesen 33 phaeochromocytomás beteg FFPE tumorszövet mintáját tanulmányoztuk. Három beteg esetében (1 MEN2, 1 sporadikus benignus, 1 sporadikus recidíváló) frissen fagyasztott tumorminták is rendelkezésünkre álltak. A fagyasztott szövetekből izolált teljes RNS minősége (RIN: 7.7-9.0) a vártnak megfelelően, messze meghaladta az FFPE mintákból nyert RNS minőségét. A phaeochromocytoma FFPE blokkokból szeparált RNS esetén észlelt degradáció mértéke megegyezett más szöveteken végzett vizsgálatok irodalmi adataival (RIN: 2.0-4.0) {156, 158} (15. ábra). Az A260/280 valamint az A260/230 arány mind a fagyasztott, mind az FFPE minták esetén meghaladta az 1.6-ot.

15. ábra: Fagyasztott (A) és FFPE (B) phaeochromocytoma szövetekből izolált teljes RNS minták minőségének összehasonlítása az Agilent Nano 6000 RNA chip (Agilent Tech. Inc.) gélképe (electropherogram) alapján

A phaeochromocytoma FFPE szövetekből izolált RNS minták miRNS expressziós microarray vizsgálatokra történő alkalmazhatóságának igazolására három beteg párosított FFPE és fagyasztott tumormintájának microarray platformon meghatározott miRNS tartalmát hasonlítottuk össze. Az egyes betegek mintapárjaiban mért miRNS expressziós értékeket valamint az FFPE és fagyasztott csoportok (n = 3)

84

miRNS expressziós átlagait non-parametrikus korrelációval vetettük össze. A Spearman koefficiens 0.7-0.93, míg a Kendall tau korrelációs koefficiens 0.58-0.85 közötti tartományban mozgott. A három beteg fagyasztott és FFPE mintapárjainak miRNS expressziós adatait valamint az FFPE és fagyasztott csoportok miRNS expressziós átlagát "scatter plot" formájában ábrázoltuk (16. ábra).

16. ábra: Azonos betegekből származó, párosított FFPE és fagyasztott phaeochromocytoma minták miRNS expressziós microarray eredményeinek korrelációja A "scatter plot-ok" egy sporadikus benignus (A), sporadikus recidíváló (B), multiplex endokrin neoplasia 2-es típusához társuló (MEN2) (C) phaeochromocytomás beteg FFPE és fagyasztott mintáinak miRNS expressziós adatait, valamint az FFPE és fagyasztott csoportok (n = 3) miRNS expressziós átlagait (D) ábrázolják.

85

V.2.2. miRNS expressziós mintázat vizsgálata különböző típusú öröklődő és sporadikus phaeochromocytomákban A phaeochromocytoma FFPE blokkokból izolált teljes RNS miRNS microarray vizsgálatokra

történő

alkalmazhatóságának

igazolását

követően

összesen

21

phaeochromocytoma FFPE minta (beleértve az előzőleg korrelációs vizsgálatok során felhasznált három FFPE mintát is) miRNS expressziós mintázatát tanulmányoztuk nagy áteresztőképességű microarray platform segítségével. Összesen 6 sporadikus benignus, 5 sporadikus recidíváló, 5 MEN2 és 5 VHL phaeochromocytoma mintát vizsgáltunk. A nyers és normalizált miRNS expresziós microarray eredmények elérhetők a Gene Expression Omnibuson (GEO; www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) a GSE21767 azonosító alatt. A microarray eredmények normalizálását és "flag" szűrését követően 478 miRNS-t (a microarray-n vizsgált miRNS-ek 50%-a) azonosítottunk, amelyek legalább az egyik vizsgálati csoportunkban 100%-ban kimutathatóak (100% "Present" vagy "Marginal" a csoport összes mintájában) voltak. Ezt a listát tovább szűrve, összesen 309 miRNS-t találtunk, amelyek expressziós eltérései a vizsgált csoportok között meghaladták a kétszeres mértéket (fold change > 2). Ezt követően a négy kísérleti csoportunkat a 309 miRNS normalizált intenzitás adatai alapján hierarchikus klaszter analízisnek vetettük alá. A klaszter elemzés eredményei szerint a sporadikus recidíváló tumorok tértek el legnagyobb mértékben a többi vizsgált csoporttól (17. ábra).

86

17. ábra: Különböző típusú phaeochromocytomák miRNS expressziós mintázaton alapuló hierarchikus klaszter analízise SR: sporadikus recidíváló; SB: sporadikus benignus; VHL: von Hippel-Lindau-szindrómához társuló; MEN2: multiplex endokrin neoplasia 2-es típusához társuló phaeochromocytoma. A fokozott expressziót piros, a csökkent expressziót kék szín jelöli.

87

A normalizált és szűrt ("flag", fold change) microarray eredmények statisztikai elemzését két különböző szoftver segítségével is elvégeztük. A GeneSpring szoftverrel történő statisztikai elemzés (egyutas ANOVA, p < 0.01; Tukey HSD post hoc teszt) során összesen 14 miRNS mutatott szignifikáns eltérést a vizsgált csoportok között, míg a STATISTICA 8.0 szoftver azonos paraméterek mellett 16 miRNS expressziós különbségeit találta szignifikánsnak. A két szignifikáns lista között 11 miRNS átfedését találtuk (7. táblázat).

GeneSpring szoftverrel azonosított

STATISTICA szoftverrel

szignifikáns miRNS-ek

azonosított szignifikáns miRNS-ek

miRNS hsa-miR-885-5p hcmv-miR-UL70-3p hsa-miR-1225-3p hsa-miR-940 hsa-let-7b* hsa-miR-663 hsa-miR-541 hsa-miR-765 hsa-miR-1228 hsa-miR-631 hsa-miR-636 hsa-miR-33b* hsa-miR-132* hsv1-miR-H6

P-érték

miRNS

0.0014 0.0015 0.0018 0.0028 0.0033 0.0036 0.0047 0.0065 0.0071 0.0076 0.0079 0.0083 0.0085 0.0089

hcmv-miR-UL70-3p hsa-miR-885-5p hsa-miR-940 hsa-miR-1225-3p hsa-miR-541 hsa-miR-663 hsa-miR-636 hsa-miR-631 hsa-miR-33b* hsa-miR-766 hsa-miR-583 hsa-miR-212 hsa-miR-139-3p hsa-miR-1228 hsa-miR-1300_v13.0 hsa-miR-765

P-érték 0.0018 0.0022 0.0022 0.0029 0.0044 0.0055 0.0055 0.0059 0.0072 0.0082 0.0084 0.009 0.0092 0.0095 0.0095 0.0096

7. táblázat: Különböző típusú phaeochromocytoma minták microarray vizsgálata során szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek A statisztikai elemzést (egyutas ANOVA, p < 0.01; Tukey HSD post hoc teszt) GeneSpring Software 10.1 és STATISTICA 8.0 segítségével végeztük.

A sporadikus benignus vs. VHL összehasonlításban 2 miRNS, a sporadikus benignus vs. sporadikus recidíválóban 1, a VHL vs. MEN2-ben 1, a sporadikus recidíváló vs. VHL-ben 11, míg a sporadikus recidíváló vs. MEN2 összehasonlításban 5 miRNS expressziója mutatott szignifikáns eltérést (STATISTICA 8.0). A sporadikus

88

recidíváló primer tumorokban 12 miRNS expressziója tért el szignifikánsan az összes többi, nem-recidíváló daganathoz képest. A fenti elemzések mellett a miRNS microarray eredményeket a további qRTPCR validálás során alkalmazható "housekeeping" miRNS-ek azonosítására is felhasználtuk. A megfelelő "housekeeping" kiválasztásakor a minták között legkisebb normalizált intenzitásbeli szórást mutató miRNS-eket kerestük. Ezek alapján választásunk a hsa-miR-324-3p (átlag normalizált TGShsa-miR-324-3p ± SD: 0.10 ± 0.42) és a hsa-miR-320b (átlag normalizált TGShsa-miR-320b ± SD: 0.12 ± 0.63) miRNS-ekre esett, amelyek "housekeeping"-ként történő alkalmazásának lehetőségét egy egészséges humán szövetek miRNS expressziós mintázatát vizsgáló, robusztus tanulmány korábban már felvetette {159}. A szignifikáns microarray eredmények közül öt miRNS-t (hsa-miR-139-3p, hsamiR-541, hsa-miR-765, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-1225-3p) választottunk ki további validálás céljából. qRT-PCR-rel a statisztikailag legnagyobb mértékű szignifikanciát, illetve a csoportok között legnagyobb arányú expressziós különbséget ("fold change") mutató miRNS-eket vizsgáltuk. A hsa-miR-940 és a hsa-miR-663 egyike volt a legnagyobb mértékű statisztikai szignifikanciát mutató miRNS-eknek, de esetükben a jellegzetes nukleotid szekvencia (magas G-C tartalom) miatt nem állt rendelkezésre megfelelő egyedi TaqMan-próba (ahogy a hcmv-miR-UL70-3p és a hsa-miR33b* esetében sem). "Housekeeping" miRNS-nek a hsa-miR-324-3p-t és a hsa-miR-320b-t használtuk, továbbá vizsgáltuk a mellékvesekéreg daganatoknál választott RNU48 alkalmazhatóságát is. Mivel a CT értékek alapján a minták közötti legkisebb szórást a hsa-miR-324-3p (átlag CThsa-miR-324-3p ± SD: 28.15 ± 1.45) és a hsa-miR-320b (átlag CThsa-miR-320b ± SD: 27.78 ± 1.5) mutatta, a továbbiakban normalizáláshoz e két miRNS CT értékének átlagát használtuk. A qRT-PCR-rel történő validálás során esetszám növelést is végrehajtottunk (9 sporadikus benignus, 5 sporadikus recidíváló, 8 MEN2, 6 VHL)

valamint

a

vizsgálati

csoportokat

kiegészítve,

phaeochromocytoma mintákat (n = 5) is vizsgáltunk (18. ábra).

89

NF1-hez

társuló

18. ábra: A validált miRNS-ek expressziós változásai phaeochromocytomákban Az ábra a sporadikus benignus (A) valamint a nem-recidíváló (B) phaeochromocytomákhoz viszonyított relatív miRNS expressziós változásokat (ddCT) mutatja az egyes csoportokban (átlag ± SEM). SB: sporadikus benignus; SR: sporadikus recidíváló; MEN2: multiplex endokrin neoplasia 2-es típusához társuló; VHL: von Hippel-Lindau-szindrómához társuló; NF1: 1-es típusú neurofibromatosishoz társuló phaeochromocytoma. *: egyutas ANOVA, p < 0.05 ( post hoc teszt: Fisher LSD; 1: Fisher LSD + Scheffé) .

90

VHL phaeochromocytomákban a hsa-miR-139-3p, a hsa-miR-541 és a hsa-miR765

szignifikáns

expresszió

fokozódását

találtuk

sporadikus

benignus

phaeochromocytomákhoz képest. Ezen kívül a hsa-miR-139-3p szignifikáns expressziós eltérést mutatott a VHL és NF1 phaeochromocytomák között is. A hsa-miR-885-5p expressziója MEN2 phaeochromocytomákban bizonyult magasabbnak az összes többi vizsgált csoporthoz képest. A hsa-miR-1225-3p pedig sporadikus recidíváló phaeochromocytomákban mutatott szignifikánsan fokozott expressziót a sporadikus benignus

valamint

a

nem-recidíváló

phaeochromocytomákkal

összehasonlítva.

Sporadikus recidíváló tumorokban a hsa-miR-541 csökkent mértékben expresszálódott a VHL phaeochromocytomákhoz képest (18. ábra). A számos szövetben "housekeeping"ként alkalmazott RNU48 a MEN2 és NF1 phaeochromocytomák között szignifikáns expressziós eltérést mutatott (19. ábra), így az általunk vizsgált phaeochromocytoma szövetekben belső konrollként nem alkalmazható.

19. ábra: Az RNU48 expressziója különböző típusú phaeochromocytoma szövetekben Az ábra az RNU48 sporadikus benignus phaeochromocytomákhoz viszonyított relatív expressziós változásait (ddCT) mutatja az egyes csoportokban (átlag ± SEM). SB: sporadikus benignus; SR: sporadikus recidíváló; MEN2: multiplex endokrin neoplasia 2-es típusához társuló;

VHL:

von

Hippel-Lindau-szindrómához

neurofibromatosishoz társuló phaeochromocytoma. *: egyutas ANOVA, p < 0.05 ( post hoc teszt: Fisher LSD).

91

társuló;

NF1:

1-es

típusú

V.2.3. Sporadikus recidíváló phaeochromocytomák azonosítására alkalmas miRNS biomarkerek A sporadikus recidíváló phaeochromocytomákban szignifikáns expressziós emelkedést mutató hsa-miR-1225-3p alkalmazhatóságát a recidíva hajlam előrejelzésére ROC analízissel vizsgáltuk. A hsa-miR-1225-3p dCT értékének diagnosztikai határértékét 1.16-nál meghúzva (nem-recidíváló phaeochromocytoma a diagnózis, ha a dCThsa-miR1225-3p

≥ 1.16) 80%-os specificitással és 61%-os szenzitivitással tudtuk kizárni egy adott

phaeochromocytoma minta potenciális recidív hajlamát. V.2.4.

A

szignifikáns

expressziós

eltérést

mutató

miRNS-ek

prediktált

célpontjainak azonosítása phaeochromocytomákban A különböző típusú phaeochromocytomák között szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek (hsa-miR-139-3p, hsa-miR-541, hsa-miR-765, hsa-miR-885-5p, hsamiR-1225-5p)

biológiai

funkciójának

megismerése

céljából

bioinformatikai

módszerekkel prediktált célpontjaikat vizsgáltuk. A potenciális cél mRNS-ek azonosításához a három leggyakrabban alkalmazott algoritmus közül a TargetScan v5.1 és a MicroCosm Targets Version 5 (korábban miRBase) eredményeit használtuk fel, a PicTar algoritmus ugyanis az említett miRNS-eket nem vizsgálta. A hsa-miR-1225-3p esetében kizárólag a TargetScan predikciói álltak rendelkezésünkre. A két algoritmus eredményeit egy saját adatbáziskezelő szoftver segítségével integráltuk és hasonlítottuk össze. "Score" és konzerváltsági szűrők alkalmazása nélkül, a két adatbázist különkülön vizsgálva a TargetScan 10511, a MicroCosm pedig 4323 predikciót adott az öt szignifikáns miRNS tekintetében. A két algoritmus eredményeinek összeillesztése során összesen 13530 különböző miRNS-mRNS interakciót sikerült azonosítanunk, amelyek közül 638 miRNS-mRNS kapcsolatot prediktált mindkét algoritmus.

92

V.2.5. Phaeochromocytomák patomechanizmusában szerepet játszó útvonalak azonosítása (Ingenuity Pathway Analysis) A phaeochromocytomák patomechanizmusában szerepet játszó, miRNS-ek által poszttranszkripcionális szinten szabályozott útvonalak azonosítására a szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek prediktált célpontjait útvonal analízisnek vetettük alá valamennyi csoportonkénti párosított összehasonlításban, ahol szignifikáns miRNS expressziós különbségeket találtunk. Az útvonal elemzés eredményeit a 8. táblázat mutatja be. Összehasonlítás (szignifikáns miRNS-ek)

"Top Kanonikus Útvonalak"

WNT-β-katenin szignál VHL vs. SB Axonalis ingerületvezetési szignál (hsa-miR-139-3p, hsa-miR-541, hsa-miR-765) Carcinoma molekuláris patomechanizmusa MEN2 vs. VHL/SB/SR/NF1 (hsa-miR-885-5p) SR vs. SB (hsa-miR-1225-3p)

SR vs. VHL (hsa-miR-541)

NF1 vs. VHL (hsa-miR-139-3p)

P-érték 8.89E-08 6.49E-06 8.26E-06

StathminI által szabályozott emlőrák

1.28E-03

Carcinoma molekuláris patomechanizmusa

1.16E-02

MYC-mediált apoptózis szignál

1.35E-02

Vastagbél carcinoma metasztázis szignál

2.64E-05

Notch szignál

3.12E-05

G-fehérjéhez kapcsolt receptor szignál

5.14E-05

Basalsejtes carcinoma szignál

1.76E-05

Természetes ölő (Natural Killer = NK) sejt szignál Humán embrionális őssejt pluripotencia

1.16E-04 1.14E-03

Apoptózis szignál

4.52E-05

HGF szignál

2.88E-04

PTEN szignál

3.19E-04

8. táblázat: Különböző típusú phaeochromocytomák között szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek bioinformatikai módszerekkel prediktált cél mRNS-einek útvonal analízise (Ingenuity Pathway Analysis) Az első három legnagyobb mértékű statisztikai szignifikanciát mutató útvonalat tüntettük fel. SB: sporadikus benignus; SR: sporadikus recidíváló; MEN2: multiplex endokrin neoplasia 2-es típusához társuló; VHL: von Hippel-Lindau-szindrómához társuló; NF1: 1-es típusú neurofibromatosishoz társuló phaeochromocytoma.

93

Phaeochromocytoma eredményei

alapján

a

mintákon

sporadikus

korábban benignus

elvégzett vs.

VHL

tanulmányok

{147}

phaeochromocytoma

összehasonlításban a "WNT-β-katenin szignál", a MEN2 tumorokban pedig a "MYCmediált apoptózis szignál" változásait érdemes kiemelni. Sporadikus recidíváló phaeochromocytomákban a "Notch szignál" (20. ábra) valamint a "G-fehérjéhez kapcsolt receptor szignál" eltéréseit találtuk.

20. ábra: Sporadikus recidíváló phaeochromocytomákban a Notch-jelátviteli útvonal miRNSek által regulált poszttranszkripciós gátlását találtuk az egyik legjellemzőbb patogenetikai eltérésnek Az egyes fehérjék közötti vonalak és nyilak ismert molekuláris interakciókat mutatnak. A piros négyszögek a sporadikus recidíváló és benignus phaeochromocytoma minták között szignifikáns expressziós eltérést mutató hsa-miR-1225-3p-t jelölik. Piros: szignifikáns expresszió növekedés; zöld: a hsa-miR-1225-3p potenciálisan gátolt cél mRNS molekulái.

94

VI. MEGBESZÉLÉS VI.1. miRNS expressziós mintázat és a miRNS-ek patogenetikai szerepének vizsgálata mellékvesekéreg daganatokban A miRNS-ek daganatképződésben betöltött patogenetikai szerepéről egyre több irodalmi

adat

áll

tumorszövetekben

rendelkezésünkre észlelt

{6,

kifejeződésük

10,

67}.

alapján

a

A

miRNS-ek

malignus

tumorszuppresszor-onkogén

dichotomia mentén osztályozhatók {5}. Eszerint a malignus daganatokban fokozott expressziót mutató miRNS-eket onkogén, míg a csökkent kifejeződést mutató miRNSeket tumorszuppresszor tulajdonságúnak tartjuk. Bár számos daganat kialakulásának hátterében igazolták a miRNS-ek patogenetikai szerepét, ez az összefüggés munkám kezdetekor még nem volt ismert a mellékvese tumorok esetében. Munkánk során elsők között tanulmányoztuk különböző

típusú

mellékvesekéreg

daganatok

miRNS

expressziós mintázatát. A miRNS TaqMan-kártyás mérések nagyszámú (365) különböző humán miRNS expressziójának

párhuzamos

vizsgálatát

tették

lehetővé.

Az

eredmények

normalizálásához a két reprezentált "housekeeping" közül a széles körben alkalmazott RNU48-at választottuk {160-161}, melynek expressziós értékei a különböző csoportok között alacsonyabb szórást mutattak, így mellékvesekéreg szövetekben az RNU44-nél alkalmasabb "housekeeping"-nek bizonyult. A statisztikai elemzés során 22 miRNS mutatott szignifikáns expressziós eltérést a kísérleti csoportok között. Ezek közül a legtöbb különbséget a mellékvesekéreg carcinoma szövetekben találtuk az ép mellékveséhez és a jóindulatú kéreg adenomákhoz (inaktív-, kortizol-termelő adenoma) viszonyítva. A hsa-miR-184 kizárólag rosszindulatú mellékvesekéreg daganatokban expresszálódott. A TLDA panel segítségével azonosított, szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek közül további validálás és az esetszám növelése céljából 14 miRNS-t választottunk ki. A választásnál a statisztikai szignifikancia (p < 0.01) és az expressziós eltérés mértéke (fold change > 3) jelentették a fő szempontokat. A 14 vizsgált miRNS közül csupán 6 esetben (hsa-miR-503, hsa-miR-184, hsa-miR-210, hsamiR-511, hsa-miR-214, hsa-miR-375) sikerült a szignifikáns expressziós eltéréseket qRT-PCR módszer segítségével megerősítenünk. A nagy áteresztőképességű miRNS TLDA-kártya eredményeit Resnick és mtsai. {162} hasonlóan alacsony arányban tudták

95

validálni. Ennek hátterében saját gyakorlati tapasztalataink szerint a TLDA Human MicroRNA Panel 1-es verziójának alkalmazása során felmerülő technikai problémák állhatnak. Ilyenek például egy adott panelen belül az egyes csatornákba ("pool" 1-8) történő minta betöltés pontatlansága és a centrifugálás egyenetlensége valamint a kártyán belüli technikai párhuzamosok hiánya. Egy adott TLDA panelen belül a párhuzamos próbák hiányából adódó mérési pontatlanságok kiküszöbölésére a megoldást

a

minták

ismételt

lemérése

jelentheti.

Munkánk

során

azonban

költséghatékonysági okokból validálására az expressziós vizsgálatok arany-standard módszerének

számító

valós-idejű

qRT-PCR-t

{163-164}

egyedi

assay-k

felhasználásával, technikai párhuzamosok mérésével, a csoportok esetszámának növelése mellett alkalmaztuk. Valós-idejű qRT-PCR módszerrel a hsa-miR-503 és a hsa-miR-184 expressziója szignifikánsan magasabbnak bizonyult mellékvesekéreg carcinoma szövetekben az ép mellékveséhez és a két vizsgált adenoma csoporthoz képest. A hsa-miR-210 kifejeződését a kortizol-termelő malignus tumorokban találtuk szignifikánsan emelkedettnek a benignus kortizol-termelő adenomákhoz viszonyítva. Expressziós változásaik alapján tehát a hsa-miR-503, a hsa-miR-184 és a hsa-miR-210 a mellékvesekéreg carcinoma kialakulásában onkogénnek tekinthetők. A hsa-miR-511 expresszióját szignifikánsan alacsonyabbnak találtuk mellékvesekéreg carcinomákban az összes többi vizsgált csoporthoz képest, míg a hsa-miR-214 csökkent kifejeződését a malignus tumorokban az ép mellékveséhez és az inaktív adenomákhoz képest tudtuk igazolni. A hsa-miR-375 szignifikánsan fokozott expressziót mutatott az ép mellékvesében összehasonlítva a kortizol-termelő benignus és malignus daganatokkal. A hsa-miR-511, a hsa-miR-214 és a hsa-miR-375 tehát egyaránt csökkent kifejeződésű adrenocorticalis carcinomákban, így a fenti miRNS-ek tumorszuppresszor szerepe tételezhető fel a mellékvesekéregben. Az említett miRNS-ek különböző fajokban betöltött élettani és patogenetikai szerepéről rendelkezésünkre álló irodalmi adatok száma napról napra egyre bővül. Az egér embrionális fejlődése során a hsa-miR-214, a hsa-miR-503 és a hsa-miR-375 a hasnyálmirigy differenciálódásában játszik kulcsfontosságú szerepet {165}. A humán pancreas fejlődésében ezek közül eddig a hsa-miR-375 szerepét igazolták {166}, amely élettani körülmények között több miRNS mellett (pl.: hsa-miR-184) az inzulin

96

bioszintézis és a glükóz által stimulált inzulin szekréció szabályozásában vesz részt {167}. A hsa-miR-375 kifejeződése a szigetsejtekben fiziológiásan glükóz-szenzitív, a glükóz koncentráció emelkedésére expresszió csökkenés a válasz, amely az inzulin szekréció

növekedéséhez

vezet.

A

hsa-miR-375

fokozott

expressziója

a

"foszfatidilinozitol-3-kináz (PI3K) útvonal" egyik tagjának, a foszfoinozitid–függő protein kináz 1-nek (PDK1) a poszttranszkripciós gátlásán keresztül a protein kináz B (PKB) és a glikogén-szintáz kináz 3 (GSK3) csökkent foszforilációját eredményezi, amely egérben az inzulin bioszintézis gátlásához, valamint a pancreas β-sejtek számának és méretének csökkenése következtében diabetes kialakulásához vezet {168}. A hsa-miR-375 antiproliferatív hatásának lehetősége más szövetekben is felmerül, amit alátámaszhatnak azon megfigyelések is, hogy az általunk vizsgált kortizol-termelő mellékvesekéreg tumorokhoz (kortizol-termelő adenoma, adrenocorticalis carcinoma) hasonlóan pancreas ductális adenocarcinomában {169} és gyomor carcinomában {170} is csökkent expresszióját írták le. Gyomor szövetben ez a proapoptotikus hatás a hasnyálmirigyhez hasonlóan, a PDK1 (és a 14-3-3 zeta) poszttranszkripciós gátlása következtében kialakuló kaszpáz aktiváció révén valósul meg {170}. A hsa-miR-375 kifejeződését fej-nyaki squamosus sejtes carcinomákban, köztük squamosus sejtes nyelőcső carcinomában szintén szignifikánsan alacsonyabbnak találták az ép szövethez viszonyítva {171-172}. Ezeken felül a hsa-miR-375 csökkent expressziója nyelőcső adenocarcinomák esetében kedvezőtlen prognosztikai markernek bizonyult {171}. Ezzel szemben a hsa-miR-375 prosztata carcinomában fokozott, míg a hsa-miR-184 csökkent kifejeződést mutatott, szemben a mellékvesekéreg carcinomákban észlelt különbségekkel {173}. Ezen eltérések a miRNS-ek szövetspecifikus hatását támasztják alá, amennyiben ugyanazon miRNS onkogén, illetve tumorszuppresszor hatású is lehet különböző szövetekben. A hsa-miR-375 lokális DNS hipometiláció következtében kialakuló megváltozott expresszióját ösztrogén receptor α (ERα) pozitív emlő daganatokban is kimutatták. A hsa-miR-375 a RASD1 (RAS, dexamethasone-induced 1) poszttranszkripciós géncsendesítésén keresztül a tumorsejtek ERα expressziójának fokozódását eredményezi, amely abnormális sejtproliferációhoz vezet {174}. A hsamiR-375 szérumban mért fokozott expressziója a hepatitis B vírus infekció, valamint az annak talaján kialakuló hepatocelluláris carcinoma diagnosztikai markere lehet a jövőben {175}. Ki kell emelni Ladeiro és munkatársainak megfigyelését is, amely

97

szerint a hsa-miR-375 expressziója szignifikánsan alacsonyabbnak bizonyult β-catenin mutáció talaján kialakuló benignus és malignus hepatocelluláris carcinomákban a vad típusú daganatokhoz viszonyítva. A β-catenin és a hsa-miR-375 között direkt interakciót feltételeztek {176}, ami a WNT-β-catenin útvonal mellékvesekéreg daganatok patomechanizmusában játszott szerepére tekintettel {91} e miRNS patogenetikai jelentőségét támaszthatja alá kortizol-termelő mellékvesekéreg daganatokban. A hsamiR-375 a 2q35-ös lókuszon helyezkedik el, amely kromoszóma-régió elvesztését korábban leírták mellékvesekéreg carcinomákban {104-105}, így az expresszió csökkenés hátterében felmerül a kromoszomális eltérések szerepe. A mellékvesekéreg carcinomákban eredményeink szerint tumorszuppresszorként viselkedő hsa-miR-511 kismértékű expresszió csökkenését a petefészek serosus carcinomáiban is kimutatták a serosus benignus daganatokhoz képest. A serosus carcinomák mellett a hsa-miR-511 csökkent kifejeződésének tendenciája figyelhető meg endometroid carcinomákban is összehasonlítva mucinosus és világos sejtes ovarium carcinomákkal {177}. A hsa-miR-214 az 1-es kromoszóma hosszú karjának 24.3-as lókuszán helyezkedik el, amely régió funkciótöbblettel járó eltéréseit és elvesztését egyaránt észlelték mellékvesekéreg carcinomákban {104-105}. Ez alapján felmerül, hogy a hsamiR-214 csökkent kifejeződésének hátterében kromoszóma aberráció állhat. A hsa-miR214

csökkent

expresszióját

cervix

carcinomában

is

igazolták.

E

miRNS

tumorszuppresszor funkciója a plexin-B1 gátlása révén valósul meg. A plexin-B1 emelkedett expressziója méhnyakrákban a tumorsejtek fokozott inváziójával és áttétképzéssel társult, a HeLa sejteknek pedig gyorsult proliferációját és migrációját eredményezte {178}. A hsa-miR-214 onkogén tulajdonságú célmolekulái lehetnek cervix carcinomában a MEK3 (mitogen-activated protein kinase kinase 3) és a JNK1 (MAPK8, mitogen-activated protein kinase 8) molekulák is {179}. Ellentétben a cervix carcinomákban és az általunk vizsgált mellékvesekéreg carcinomákban észlelt expresszió csökkenéssel, számos daganatban a hsa-miR-214 onkogén szerepét feltételezik, ami ismételten a miRNS-ek szövetspecifikus viselkedését jelzi. Pancreas carcinomában a hsa-miR-214 megnövekedett expressziója csökkentette a tumorsejtek gemcitabin iránti érzékenységét {180}. Szájüregi squamosus sejtes carcinomákban számos miRNS mellett a hsa-miR-214 és a hsa-miR-210 is fokozott kifejeződést

98

mutatott {181}. A hsa-miR-214 emelkedett expresszióját petefészek {182} és gyomor {183} carcinomában valamint liposarcomában {184} is leírták. Gyermekkorban manifesztálódó hepatoblastoma szöveteket összehasonlítva felnőttkori hepatocelluláris carcinomákkal szintén a hsa-miR-214 fokozott expresszióját találták {185}. A hepatocelluláris carcinomák kialakulásában a β-catenin mutáció következtében aktiválódó WNT-szignál, valamint a fokozott IGF-2 expresszió patogenetikai szerepét hasonlóan az adrenocorticalis carcinomákhoz- korábban már igazolták {91-92}. E két malignus daganat patogenezisének közös elemét képezheti továbbá a hsa-miR-214 csökkent expressziója is. A valós-idejű qRT-PCR módszerrel történő validálás során a hsa-miR-503, a hsa-miR-184 és a hsa-miR-210 fokozott expresszióját igazoltuk mellékvesekéreg carcinomákban,

ez

alapján

e

miRNS-ek

onkogén

szerepe

feltételezhető

a

mellékvesekéreg rosszindulatú daganataiban. A hsa-miR-503 és a hsa-miR-424 szekvencia paralógok, bázissorendjük az 5' régióban csupán egy nukleotidban különbözik, így a két miRNS bioinformatikai úton prediktált targetjei nagymértékben átfednek. Mindkét miRNS az X kromoszóma azonos lókuszáról (Xq26.3), policisztronos formában íródik át, transzkripciójuk közös promóter-szabályozás alatt áll {186}. Mellékvesekéreg carcinomákban a hsa-miR-503 mellett a hsa-miR-424 expressziója is szignifikánsan magasabbnak bizonyult a TLDA miRNS Panel eredményei alapján, e két miRNS a klaszter analízis során egymás mellé került. Bár az esetszám növelése mellett elvégzett validálás során statisztikailag szignifikáns különbséget a hsa-miR-424 esetében nem sikerült igazolni, e miRNS kifejeződése a hsa-miR-503-éval megegyező irányban változott mellékvesekéreg carcinomákban az ép szövethez viszonyítva. E két miRNS-t hordozó kromoszomális régió funkciótöbblettel járó eltéréseit korábban kimutatták a mellékvesekéreg rosszindulatú daganataiban {105}. Colon carcinoma (HCT116) és osteosarcoma (U2OS) sejtvonalakon végzett "in vitro"

transzfekciós

kísérletekben

a

hsa-miR-503

és

hsa-miR-424

a

G1/S

ellenőrzőponton a ciklin-dependens kináz 2 (CDK2) ativálásához szükséges CDC25A foszfatáz poszttranszkripciós gátlásával a sejtciklus blokkját idézte elő {187}. Az említett mechanizmussal a mmu-miR-503 és a mmu-miR-322 (a hsa-miR-424 orthológja) az egér myoblast sejtek differenciálódását {187}, míg a hsa-miR-503 és a hsa-miR-424 a THP-1 humán leukaemia sejtvonal monocyta irányú differenciálódását

99

{188} eredményezte. Jiang és mtsai. szisztematikus "in vitro" target validálási kísérleteik során luciferáz assay segítségével igazolták a hsa-miR-503 és a ciklin D1 (CCND1) között fennálló direkt interakciót. Humán fej-nyak carcinoma (UMSCC10B) és vese epitheliális (293T) sejtvonalon a hsa-miR-503 mRNS- és fehérjeszinten egyaránt gátolta a CCND1-et, amely az S fázisban levő sejtek számának csökkenéséhez és a növekedés gátlásához vezetett {189}. Az említett kísérletek mind a hsa-miR-503 tumorszuppresszor funkcióját támasztják alá, szemben a mellékvesekéreg carcinomában vizsgálataink

eredménye

alapján

feltételezett

onkogén

tulajdonsággal.

Saját

eredményeink mellett egyéb irodalmi adatok is felvetik a hsa-miR-503 onkogén szerepét. A gyermekkorban gyakori előfordulású retinoblastoma tumorokban a hsamiR-503 több mint négyszeres expresszió fokozódást mutatott az ép retina szövetekhez képest {190}. Corbetta és mtsai. az általunk is alkalmazott TLDA Panel segítségével vizsgálták

CDC73

inaktiváló

mutációit

hordozó,

parafibromin

negatív

mellékpajzsmirigy carcinomák miRNS expressziós mintázatát. A mellékpajzsmirigy carcinomákban fokozott expressziót mutató hsa-miR-503 alkalmas biomarkernek bizonyult a rosszindulatú daganatok mellékpajzsmirigy adenomáktól valamint ép mellékpajzsmirigy szövettől történő elkülönítésére {15}. Hasonlóan a mellékvesekéreg carcinomákhoz a hsa-miR-184 jelentősen emelkedett expressziót mutatott a nyelv squamosus sejtes carcinomájában az ép szövethez viszonyítva, amely alapján a hsa-miR-184 onkogén szerepe feltételezhető az említett tumorokban. A hsa-miR-184 fokozott jelenléte a primer daganat sebészi eltávolítását megelőzően a betegek vérplazmájában már korai stádiumban is kimutatható volt, így felmerült e miRNS biomarkerként történő alkalmazásának lehetősége. A hsa-miR-184 gátlása nyelv squamosus sejtes carcinoma sejtvonalon a CMYC protoonkogén indirekt gátlásán keresztül az apoptózis fokozódásához és csökkent proliferációhoz vezetett {191}. Lin és mtsai. microarray vizsgálattal "high-grade" hormon refrakter prosztata carcinomákban a hsa-miR-184 fokozott expresszióját találták {192}, míg Schaefer és mtsai. microarray eredményeiket qRT-PCR-rel validálva csökkent kifejeződést írtak le prosztata carcinomákban {173}, ami további vizsgálatok szükségességét jelzi. A hsa-miR-184 tumorszuppresszor hatásait jelezhetik a következő eredmények is. Világos sejtes veserákban a hsa-miR-184 mutatta a legnagyobb mértékű expresszió csökkenést az ép szövethez viszonyítva {193}. Chen és Stallings a hsa-miR-

100

184 proapoptotikus szerepét vetették fel neuroblastomában, ugyanis az említett miRNS prekurzorát neuroblastoma sejtekbe transzfektálva az apoptózis fokozódását és a sejtciklus G1 fázisának blokkját észlelték. A MYCN (v-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived) amplifikált neuroblastoma sejtek retinsavas kezelése a miR-184 expressziójának fokozódása révén fejtett ki antiproliferatív hatást, és idézte elő a tumorsejtek differenciálódását {194}. A MYCN amplifikációja következtében létrejövő alacsony miR-184 expresszió neuroblastomában a "PI3K útvonal" tagjának, az AKT2-nek (v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 2) a poszttranszkripciós gátlás alól történő felszabadulását eredményezi, így elősegítve a tumorsejtek túlélését {195}. Glioma tumorok progressziója során a hsa-miR-184 kifejeződése csökkent, ennek következtében a protoonkogén AKT2 a neuroblastomában leírt mechanizmushoz hasonlóan felszabadulhat a poszttranszkripciós gátlás alól. A miR-184 prekurzorának transzfekciója a vad típusú A172 és TP53 mutációt hordozó T98G glioma sejtek proliferációját és viabilitását egyaránt csökkentette. Érdekes azonban, hogy míg a vad típusú sejtekben a transzfekció hatására az apoptózis fokozódott, addig a TP53 mutációt hordozó sejtekben az apoptózis mértéke csökkent {196}. A sporadikus mellékvesekéreg carcinomák előrehaladott stádiumában a szomatikus TP53 mutációk gyakori eltérések {91}, így eredményeink alapján felvetődik annak a lehetősége, hogy a hsa-miR-184 fokozott expressziója mellékvesekéreg carcinoma sejtekben csökkent mértékű apoptózist eredményez. A hsa-miR-184 fokozott kifejeződésében szerepet játszhatnak a miRNS-t kódoló kromoszóma-régió (15q25.1) mellékvesekéreg carcinomákban észlelt funkciótöbblettel járó eltérései {197}. A hsa-miR-210 az általunk vizsgált kortizol-termelő malignus mellévesekéreg daganatokban szignifikánsan magasabb expressziót mutatott a kortizol-termelő adenomákkal összehasonlítva. A hsa-miR-210 kifejeződése szoros összefüggésben áll a különböző hypoxiás állapotokkal, amely a mellékvesekéreg carcinomák sajátossága is {198}. Expresszióját a HIF1α (és HIF2α) szabályozza a miRNS-t hordozó AK123483 lókusz promóter régiójában elhelyezedő, nagymértékben konzervált hypoxia reszponzív elemhez (HRE) kapcsolódva. A promóter szakaszon egyéb transzkripciós faktorok (E2F1, OCT4 (octamer-binding protein 4, POU5F1) és a PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma)) kötőhelyei is megtalálhatók {199}. Ennek alapján felmerül annak a lehetősége, hogy a hsa-miR-210 számos folyamat, mint az

101

angiogenezis, a sejtciklus, az őssejt differenciálódás, az energia metabolizmus szabályozásában részt vehet, amelyek összefüggésben állnak az oxigénhiányos állapotokkal. A szolid daganatok többsége tartalmaz hypoxiás területeket, amelyek az angiogenezis fokozódását, ezáltal agresszív tumor növekedést idéznek elő {199}. Ismert, hogy mellékvesekéreg carcinomában a VEGF expressziója fokozott {200}. A hsa-miR-210 expressziója emlő daganatokban korrelált a VEGF expresszióval, valamint a hypoxia és az angiogenezis mértékével {199}. A miRNS egyik legszélesebb körben validált célmolekulája, a tirozin kináz receptor ligand EFNA3 (ephrin A3), amelynek gátlása a humán köldökvéna endothel sejtek differenciálódásához és kapilláris képződéshez vezet {199}. A hsa-miR-210 az E2F3 transzkripciós faktor és a MYCantagonista MNT (MAX binding protein) poszttranszkripciós gátlásán keresztül a sejtciklus szabályozásában is szerepet játszhat {199}. A hsa-miR-210 fontos szerepet játszik a tumorsejtekben hypoxia hatására létrejövő genetikai instabilitás kialakulásában is, a DNS hibajavításban résztvevő RAD52 fehérje transzlációjának gátlása révén {199}. A hsa-miR-210 emellett elősegíti a tumorsejtekre jellemző anaerob anyagcserére történő átállást is. A mitokondriális akonitáz enzim katalizátorának, az ISCU1/2-nek (ironsulfur cluster scaffold protein) a poszttranszkripciós gátlásával a Szentgyörgyi-Krebsciklusban a citrát sztereospecifikus izomerizációja szenved zavart, emellett károsodik a mitokondriális komplex I elektrontranszport aktivitása is. Az aerob anyagcsere helyét tumorsejtekben normoxiás körülmények között is az anaerob energiatermelő folyamat, a glikolízis veszi át. A Warburg-effektus kialakulásában számos gén mellett a hsa-miR210 szerepe is feltételezhető {199}. E fenti funkciók alapján a hsa-miR-210 kórosan megváltozott expressziója több különböző mechanizmussal segítheti a daganatok kialakulását. A hsa-miR-210 "in vitro" gátlása HeLa sejteken az apoptózis fokozódásához, míg a mellékvesekéreg carcinoma mintáinkban tumorszuppresszorként viselkedő hsa-miR-214 gátlása az apoptózis csökkenéséhez vezetett {66}. Ez alapján a hsa-miR-210 fokozott, míg a hsa-miR-214 csökkent expressziója az általunk vizsgált mellékvesekéreg carcinomákban az apoptotikus folyamatok gátlását eredményezheti. A hsa-miR-210 fokozott kifejeződését számos tumorban, többek között glioblastomában, melanomában, világossejtes veserákban és tüdőrákban is észlelték, emelkedett expressziója emlő és pancreas carcinomában szignifikánsan korrelált a kedvezőtlen prognózissal {199}. Felvetődik a kérdés, hogy a hsa-miR-210 fokozott kifejeződése e

102

daganatokban csupán a hypoxia következménye, vagy onkogénként szerepet játszik a tumorok patomechanizmusában. Nehezíti a kérdés megválaszolását a hsa-miR-210 szövetspecifikus hatása is, mivel petefészek daganatokban több tanulmány a hsa-miR210 csökkent kifejeződését írta le, valamint fokozott expressziója humán pancreas és fej-nyak carcinoma sejtvonalon a tumorsejtek növekedésének gátlását eredményezte, mely adatok a hsa-miR-210 tumorszuppresszor szerepére utalnak {199}. A hsa-miR-210 a 11p15.5-ös lókuszon helyezkedik el, amely kromoszóma-régió kitüntetett szerepet játszik a mellékvesekéreg carcinomák patomechanizmusában. Az itt található IGF-2 klaszter imprintingjének zavara a mellékvesekéreg carcinomát is magába foglaló Beckwith-Wiedemann-szindróma kialakulásához vezet. Az IGF-2 fokozott expressziója a sporadikus mellékvesekéreg carcinomák egyik legjellemzőbb sajátossága is, az adott kromoszóma szakaszra kiterjedő heterozigócia vesztést (LOH) pedig a sporadikus carcinomák 70%-ában igazoltak {91}. E kromoszóma aberrációk és a hsa-miR-210 expressziójának fokozódása között fennálló összefüggés, illetve ezek együttes szerepe a mellékvesekéreg carcinoma kialakulásában egyelőre nem ismert, de mindenképpen felvetik a 11p15.5 lókusz patogenetikai szerepét. A fenti példákból tisztán látszik, hogy egy adott miRNS egyes szövetekben tumorszuppresszor, máshol pedig onkogén szerepet tölthet be. Ezt szem előtt tartva, egy miRNS adott szövetben betöltött funkciójának megítélése csak az expresszió vizsgálatával, szigorú szövetspecifikus kontextusban lehetséges. A mellékvesekéreg daganatok miRNS expressziós mintázatának tanulmányozása során nyert eredményeink alapján a hsa-miR-214, hsa-miR-511 és hsa-miR-375 tumorszuppresszor, a hsa-miR184, hsa-miR-511 és hsa-miR-210 onkogén szerepe feltételezhető. Fontos azonban hangsúlyozni, hogy egy adott miRNS-nek ugyanabban a szövetben számos célmolekulája lehet, amelyek között egyaránt előfordulhatnak protoonkogén és tumorszuppresszor tulajdonságú molekulák, tehát a poszttranszkripciós szabályozás összetett szerepet játszhat egyes tumorok kialakulásában. A miRNS-ek egy konkrét daganat patomechanizmusában betöltött szerepének pontos megismeréséhez ezért elengedhetetlen a szövetspecifikus targetek azonosítása. Mivel a mellékvesekéreg carcinomák klinikai és szövettani diagnózisa sok esetben nehéz, felmerül az igény olyan molekuláris markerek iránt, amelyek segítségével a malignitás jelezhető. Ennek ismeretében a primer tumor műtéti

103

eltávolítását követően lehetővé válik a szükséges adekvát posztoperatív irradiációs vagy gyógyszeres terápia megválasztása. A miRNS expresszió vizsgálata az mRNS expressziós profil meghatározásához képest egyes daganattípusok megbízhatóbb klasszifikációját teszi lehetővé. Mivel egy miRNS molekula több száz cél mRNS-t szabályozhat, így az mRNS-ekhez képest már jóval kisebb számú miRNS marker vizsgálatával lehetőség nyílik egymástól jól elkülöníthető csoportok felállítására {77}. Munkánk során olyan miRNS biomarkereket kerestünk, amelyek alkalmasak lehetnek az általunk vizsgált malignus kéregdaganatok elkülönítésére. ROC analízis segítségével a qRT-PCR-rel validált, szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-eket és azok kombinációit vizsgáltuk. A dCThsa-miR-511-dCThsa-miR-184 és a dCThsa-miR-511-dCThsa-miR-503 kombinációja, valamint a dCThsa-miR-511 önmagában is alkalmas biomarkernek bizonyult a malignitás eldöntésére. A dCThsa-miR-511-dCThsa-miR-503 diagnosztikai határértékét 1.4nél meghúzva az adrenocorticalis carcinomákat 100%-os szenzitivitással és 97%-os specificitással tudtuk azonosítani. Figyelembe véve, hogy a kifejezetten rossz prognózisú mellékvesekéreg carcinomák szövettani diagnózisa sok esetben nehéz, és a posztoperatív terápia helyes megválasztása a betegek túlélése szempontjából kiemelkedő jelentőségű, a miRNS expresszió vizsgálata a jövőben e daganatok felismerését nagyban segítheti. Ki kell azonban emelni, hogy a miRNS biomarkerek diagnosztikai alkalmazhatóságának megállapításához a jövőben nagyobb számú szövetminta vizsgálata szükséges. Eredményeinkkel

közel

egyidőben

és

azt

követően

további

négy

a

mellékvesekéreg daganatok miRNS expresszióját vizsgáló tanulmány látott napvilágot {201-204}. Ezek közül három felnőttkori, egy pedig gyermekkorban manifesztálódó daganatokat vizsgált. Soon és mtsai. 27 sporadikus mellékvesekéreg adenoma, 22 sporadikus carcinoma és 6 ép mellékvesekéreg szövet miRNS expressziós profilját határozták meg microarray technikával. 23 miRNS expressziója mutatott szignifikáns eltérést a benignus és malignus daganatok között. 14 miRNS felül-, 9 pedig alulexpresszált carcinoma mintákban. E lista és az általunk leírt, TaqMan-kártyás vizsgálatok során azonosított 22 miRNS-t tartalmazó lista között összesen két miRNS fedett át. A hsa-miR-503 és a hsa-miR-181b mindkét vizsgálat során szignifikáns expresszió fokozódást mutatott mellékvesekéreg carcinomákban az adenoma csoporthoz viszonyítva. Bár Soon és mtsai. a hsa-miR-485-5p és a hsa-miR-214 expressziós

104

eltéréseit nem találták szignifikánsnak microarray vizsgálataik során, e két miRNS náluk is csökkent mértékben fejeződött ki a carcinoma mintákban. A mellékvesekéreg tumorok ép kéreggel történő összehasonlítása során csupán két miRNS expressziója különbözött szignifikánsan: a hsa-miR-7 és a hsa-miR-129-3p egyaránt csökkent mértékben fejeződött ki az általuk vizsgált daganatokban az ép szövetekhez képest. Munkájuk során összesen négy szignifikáns miRNS (hsa-miR-335, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-195, hsa-miR-7) validálását végezték el qRT-PCR-rel, melynek során belső kontrollnak hozzánk hasonlóan az RNU48-at alkalmazták. A hsa-miR-195 és a hsa-miR335

expressziója

szignifikánsan

alacsonyabbnak

bizonyult

mellékvesekéreg

carcinomákban az adenomákhoz viszonyítva. A hsa-miR-7 a qRT-PCR vizsgálatok eredményei alapján nemcsak a daganat és ép kéreg minták között mutatott szignifikáns expressziós eltérést, hanem a benignus és malignus összehasonlításban is. A hsa-miR195 csökkent, míg a hsa-miR-483-5p fokozott expressziója mellékvesekéreg carcinomákban kedvezőtlen kimenetellel társult {201}. A két munkacsoport eredményeiben mutatkozó különbségek hátterében több tényező állhat. Bár Soon és mtsai. vizsgálati csoportjaikban nagyobb elemszámot alkalmaztak, az egyes daganatok hormontermelő képességét figyelmen kívül hagyták. Saját vizsgálatainkban a mellékvesekéreg

adenomákon

belül

hormonálisan

inaktív

és

kortizol-termelő

daganatokat különböztettünk meg, míg az összes általunk vizsgált adrenocorticalis carcinoma kortizol-termelő daganat volt. A mellékvesekéreg adenomák és carcinomák egyaránt expresszálnak glükokortikoid receptorokat, amelyek fokozott kifejeződését korábban

leírták

mellékvesekéreg

carcinomákban

{205}.

Szintén

ismert

a

glükokortikoidok miRNS expressziót befolyásoló hatása {Butz és mtsai., közlemény előkészületben}. Ezek alapján a különböző típusú mellékvesekéreg tumorok miRNS expressziós mintázatának tanulmányozása során a hormontermelő tulajdonság nem hagyható figyelmen kívül. Szintén ki kell hangsúlyozni, hogy az általunk kontrollként használt ép mellékvese minták malignus vesetumor miatt operált betegektől származtak, míg a Soon-tanulmányban mellékvesekéreg adenoma mellől izoláltak ép kéreg szövetet. Korábban papilláris pajzsmirigy carcinomák esetében igazolták, hogy a carcinomával szomszédos még ép szövetben a hsa-miR-221 a tumorszövethez hasonlóan fokozott expressziót mutatott {13}. A Soon és mtsai. által ép és tumoros mellékvesekéreg

105

szövetek miRNS expressziós profilja között észlelt csekély különbség felveti annak lehetőségét, hogy ez a jelenség mellékvesekéreg daganatok esetében is létezik. Patterson és mtsai. 26 benignus és 10 primer malignus mellékvesekéreg daganat (hormonálisan inaktív és kortizol-termelő) miRNS expressziós mintázatát hasonlították össze egészséges donorokból származó ép mellékvesekéreg szövetekkel {203}. A benignus csoportban 82, a malignusban pedig 71 miRNS expressziója mutatott szignifikáns eltérést az ép szövetekhez képest. A két listából összesen 17 átfedő miRNS-t azonosítottak. A malignus és benignus kéregdaganatok miRNS mintázata egymáshoz képest jelentős eltérést mutatott. A 23 szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS közül 18 alul- (köztük a hsa-miR-214), 5 pedig felülexpresszált mellékvesekéreg carcinomákban. qRT-PCR módszerrel történő validálás céljából 13 miRNS-t választottak ki. Ennek során megerősítették a hsa-miR-483-5p fokozott, valamint a hsa-miR-195 csökkent expresszióját mellékvesekéreg carcinomákban, amelyek megváltozott kifejeződését Soon és mtsai. korábban leírták {201}. A hsa-miR100 és a hsa-miR-125b szintén csökkent kifejeződést mutatott adrenocorticalis carcinomákban az adenoma csoporthoz képest. A hsa-miR-483-5p expressziójának vizsgálata 100%-os pozitív és 92%-os negatív prediktív értékkel bírt (80%-os szenzitivtás és 100%-os specificitás), így alkalmas molekuláris markernek bizonyult a malignus

adrenocorticalis

carcinomák

elkülönítésére.

A

hsa-miR-483-5p

az

adrenocorticalis carcinomákban fokozott expressziót mutató IGF-2-t kódoló gén 2-es intronján helyezkedik el, ennek alapján felvetődik a két gén közös szabályozásának lehetősége {203}. A legfrissebb közleményben Schmitz és mtsai. négy egészséges mellékvese, kilenc mellékvesekéreg adenoma, négy carcinoma és három távoli áttét miRNS expressziós mintázatát vizsgálták TaqMan-kártya segítségével. Az expressziós vizsgálatokhoz FFPE blokkokat használtak. Összesen 146 miRNS expressziós eltéréseit találták szignifikánsnak a vizsgálati csoportok között. Ezek közül egy 38 miRNS-ből álló készlet segítségével a mellékvesekéreg carcinomákat sikeresen különítették el az adenomáktól. E miRNS készlet tartalmazta az általunk is azonosított hsa-miR-511, hsamiR-503, hsa-miR-214 és hsa-miR-215 molekulákat, amelyek expressziója a mi eredményeinkkel azonos módon változott. A három legnagyobb expressziós eltérést mutató miRNS qRT-PCR validálását végezték el. Ez alapján a hsa-miR-139-3p, a hsa-

106

miR-675

és

a

hsa-miR-335

csökkent

kifejeződését

találták

rosszindulatú

mellékvesekéreg daganatokban {204}. Doghman és mtsai. gyermekkorban manifesztálódó mellékvesekéreg tumorok (adenoma és carcinoma) és ép mellékvese szövet miRNS expressziós profilját vetették össze microarray segítségével {202}. Összesen 26 miRNS expressziója mutatott szignifikáns eltérést a mellékvesekéreg tumorokban (6 felül-, 20 alulexpresszált). A hsamiR-195 kifejeződése szignifikánsan csökkent, ezzel szemben a hsa-miR-483-3p fokozott kifejeződésű a daganatokban {202}, amely alátámasztja Soon illetve Patterson korábbi felvetését, hogy a hsa-miR-483 prekurzor 5' karjáról szintetizálódó hsa-miR483-5p és annak "host" génje, az IGF-2 fokozott expressziója egyaránt a rossz prognózisú mellékvesekéreg carcinomák sajátossága {201, 203}. Az általunk vizsgált mellékvesekéreg carcinomákban észlelt expressziós eltérésekhez hasonlóan a hsa-miR375 és a hsa-miR-214 csökkent, a hsa-miR-503 pedig fokozott kifejeződést mutatott a gyermekkori mellékvesekéreg tumorokban. A daganatokban csökkent mértékben kifejeződő hsa-miR-99a és a hsa-miR-100 azonos "seed" szekvenciával rendelkeznek, így targetjeik is azonosak. E két miRNS expressziójának csökkenése az IGF-1R - mTOR (mammalian target of rapamycin) útvonal működésébe több ponton szólhat bele (IGF1R, mTOR, raptor), ezáltal a mellékvesekéreg tumorsejtek fokozott proliferációját és növekedését eredményezheti {202}. Ezek alapján a rapamycin mellett felvetődik mTOR antagonista miRNS-ek terápiás alkalmazásának lehetősége is mellékvesekéreg carcinomákban. A mellékvesekéreg daganatok miRNS expresszióját vizsgáló négy tanulmány qRT-PCR

módszerrel

validált

eredményeit

összevetve

egymással

és

saját

eredményeinkkel viszonylag kevés átfedést találunk. Mindössze öt olyan miRNS-t (hsamiR-483-5p, hsa-miR-195, hsa-miR-100, hsa-miR-125b, hsa-miR-214, hsa-miR-375, hsa-miR-503) tudunk azonosítani, amelyek patogenetikai szerepe legalább két tanulmányban felvetődött. A különbségek hátterében elsősorban az eltérő csoportosítási szempontok és az alacsony mintaszám állhatnak, de az eredményeket befolyásolhatja a miRNS expressziós profil meghatározásához használt platformok különbözősége, valamint az alkalmazott statisztikai próbák és a miRNS-ek validálásra történő kiválasztásának szempontjai. Az eltérő eredményeket figyelembe véve, a miRNS-ek mellékvesekéreg daganatok diagnosztikájában való alkalmazhatóságának igazolására

107

további, nagy beteganyagot vizsgáló tanulmányok és azok eredményeinek rendszerbe foglalása szükséges. Munkánk során a továbbiakban arra törekedtünk, hogy a szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek mellékvesekéreg daganatok kialakulásában játszott patogenetikai szerepét megismerjük. A miRNS-ek funkciójának megértéséhez első lépésben elengedhetetlen a potenciális cél mRNS-ek bioinformatikai módszerekkel történő azonosítása. A target predikcióhoz a három legszélesebb körben alkalmazott algoritmus, a TargetScan, a PicTar és a miRBase eredményeit használtuk. Mivel jelenleg nincsen egyértelmű állásfoglalás az egyes algoritmusok hatékonyságát illetően, ezért nem részesítettük előnyben egyik szoftvert sem, a három algoritmus eredményét integráltuk. Ehhez Microsoft Visual FoxPro 9.0 adatbáziskezelő fejlesztőrendszer segítségével létrehoztunk egy saját alkalmazást. A saját szoftver segítségével lehetővé vált a három algoritmus eltérő módon annotált predikcióinak összevetése, így az egyes algoritmusok által vizsgált miRNS-ek összes prediktált targetjének, valamint két vagy több algoritmus eredményei között átfedő cél mRNS-ek azonosítása. A három algoritmus által együttesen prediktált nagyszámú miRNS-mRNS interakció ellenére a targetek kevesebb, mint 0.5%-a fedett át mindhárom szoftver eredményei között. A legnagyobb arányú átfedést a PicTar és a konzervált TargetScan adatbázisok között találtuk, a két algoritmus által alkalmazott "seed"-központú target predikciós megközelítés eredményeképpen. Viszonylag nagymértékű az átfedés az algoritmusba konzerváltsági szűrőt beépítő miRBase és a nem-konzervált TargetScan adatbázisok predikciói között is, mely az alkalmazott konzerváltsági szűrők jelentős eltéréseire hívja fel a figyelmet. A saját szoftver segítségével a mellékvesekéreg daganatok között szignifikáns expressziós eltérést mutató hat miRNS TargetScan, miRBase és PicTar által prediktált összes potenciális cél mRNS-ét azonosítottuk. A predikció során valószínűségi "score" szűrőt nem alkalmaztunk, így a legszélesebb körű targetlista állt rendelkezésünkre. A továbbiakban ezt a targetlistát szövetspecifikusan szűkítettük. Ehhez a miRNS expressziós profil meghatározása mellett ugyanazon mintákon elvégzett teljes mRNS expressziós microarray vizsgálatok eredményeit használtuk fel. Mivel az általunk vizsgált szövetekben egyáltalán nem expresszálódó targetek nem állhatnak a mellékvesekéregben miRNS szabályozás alatt, ezeket az mRNS-eket a célpontok listájából kiszűrtük, és a továbbiakban nem vizsgáltuk. E szövetspecifikus

108

megközelítéssel a cél mRNS-ek számát a négy vizsgálati csoport mindegyikében jelentős mértékben tudtuk csökkenteni. Mivel a legújabb irodalmi adatok alapján a miRNS-ek hatása nagy mértékben a cél mRNS-ek lebomlásán keresztül érvényesül {4143}, a miRNS-ek expressziós változásai a vizsgált szövetben transzkriptom (mRNS) szinten "ujjlenyomatszerűen" tükröződnek. Munkánk során ezért a ko-expresszálódó targetek közül az adott szignifikáns kifejeződést mutató miRNS-sel ellentétes irányban változó expressziójú, biológiailag releváns cél mRNS-eket választottuk ki GSEA segítségével. A prediktált targetek számát így még tovább tudtuk szűkíteni. Az általunk alkalmazott szövetspecifikus targetszűrés módszeréhez hasonló target predikciós megközelítéseket nemrégiben közöltek az irodalomban. A miRNS-eket kódoló régiók a genomban gyakran fehérjét kódoló gének intronikus szakaszaira esnek, így ezek a miRNS-ek az őket hordozó "host" gének részeként kerülnek átírásra. Ezt használták ki Gennarino és mtsai. a HOCTAR (Host Gene Oppositely Correlated Targets) szoftver megalkotása során, amikor azt feltételezték, hogy a miRNS "host" gének és a miRNS targetek expressziója ellentétes irányban változik. A szoftver génexpressziós microarray vizsgálatok eredményeit felhasználva intronikus lokalizációjú miRNS-ek ellentétes irányban változó expressziójú cél mRNS-eit keresi. A HOCTAR az eddig használatban levő target predikciós algoritmusokkal szemben megbízhatóbban teljesített a már korábban validált miRNS-mRNS interakciók azonosítása során, segítségével a csupán target szekvencia vizsgálaton alapuló bioinformatikai módszerekkel prediktált targetek száma csökkenthető, továbbá új, biológiailag releváns miRNS célmolekulák azonosítására is lehetőség nyílik {206}. A módszer hátránya az általunk kidolgozott szövetspecifikus target predikcióhoz képest, hogy az adott szövetben nem közvetlenül vizsgálja a miRNS expressziós mintázatot, így segítségével csak az intronikus lokalizációjú miRNS-ek célpontjainak azonosítására nyílik lehetőség. A Huang és mtsai. által kidolgozott GenMiR++ (Generative Model for miRNA Regulation) algoritmus különböző szövetekben párhuzamosan elvégzett mRNS és miRNS expressziós microarray vizsgálatok eredményei alapján ellentétes expressziós eltérést mutató miRNS-mRNS interakciókat keres {207}. Míg azonban a GenMiR++ szoftver kiindulási adatbázisként csak a TargetScanS algoritmus predikcióit használja fel, az általunk kidolgozott szövetspecifikus target predikció során három "in silico" algoritmus eredményeit integráltuk. Ezen felül a mellékvesekéreg daganatokban

109

alkalmazott szövetspecifikus target predikciós megközelítéssel nem csupán az ellentétes irányban változó expressziójú miRNS-mRNS interakciókat sikerült azonosítanunk, hanem a lehetséges targetek listájából kiszűrtük az általunk vizsgált szövetekben nem expresszálódó mRNS-eket is, így a biológiailag releváns célpontok körét tovább szűkítettük. A továbbiakban a mellékvesekéreg daganatok kialakulásában szerepet játszó patogenetikai útvonalak azonosítására törekedtünk. Ezért mind a szövetspecifikusan szűrt, ellentétes irányú expressziós változást mutató miRNS célpontokat, mind pedig a szignifikáns microarray eredményeket az összes csoportonkénti összehasonlításban útvonal analízisnek vetettük alá. Mindkét elemzés során a sejtciklus G2/M ellenőrzőpontjának károsodását találtuk a legmarkánsabb eltérésnek rosszindulatú mellékvesekéreg daganatokban az ép mellékvese szövetekkel összehasonlítva. A G2/M ellenőrzőpont károsodása számos tumor patogenezisében kulcsfontosságú szerepet játszik {208}. A sejtciklus fokozott aktiválódását a mellékvesekéreg daganataiban szintén leírták. A G1/S átmenet szabályozásának zavara, a fokozott CCND1 expresszió, a CDKN1C-t kódoló gén funkcióvesztése, és az ennek következtében kialakuló fokozott CCNE és G1-specifikus ciklin dependens kináz (CDK2, CDK4) kifejeződés sporadikus mellékvesekéreg carcinomákban a sejtciklus progresszióját eredményezik {209-210}. Saját mRNS microarray eredményeink alapján a G2/M ellenőrzőpont szabályozásában résztvevő protoonkogén molekulák közül mellékvesekéreg carcinomákban a ciklin B (CCNB1, CCNB2), a CDC2, a CDC25B, a CDC25C és a TOP2A emelkedett expresszióját találtuk az ép szövetekhez viszonyítva. Ezek közül a CCNB2 és a TOP2A fokozott kifejeződését génexpressziós vizsgálatokkal előzőleg már kimutatták mellékvesekéreg carcinomákban {96}. A CCNB/CDC2 komplex aktivitásának fokozódását korábban számos daganatban igazolták {211}, ám a komplex megváltozott működésének patogenetikai szerepét adrenocorticalis carcinomákban eddig nem vizsgálták. A sejtciklus mellékvesekéreg daganatokban károsodott szabályozására hívja fel a figyelmet, hogy SW-13 mellékvesekéreg carcinoma sejtvonal 17β-ösztradiol illetve progeszteron kezelése a G2/M ellenőrzőpontban a sejtciklus blokkját és a tumorsejtek apoptózisát idézte elő. A progeszteronkezelés önmagában és 17βösztradiollal kombinálva a CCNB1 és a CCND1 expressziójának csökkenésén keresztül vezetett az SW-13 sejtek osztódásának zavarához {212}. A főként hormontermelő

110

mellékvesekéreg carcinoma adjuváns terápiájában használt, adrenolitikus tulajdonságú mitotán (o,p'-DDD) besugárzással együtt alkalmazva a hormonálisan inaktív SW-13 és kortizol-termelő H295R sejtvonalak növekedését egyaránt gátolta. A kombinált kezelés a G2/M ellenőrzőpont irreverzibilis blokkját eredményezte, amelyhez H295R sejtekben a CCNB1 emelkedett expressziója, a CCNB1/CDC2 komplex kialakulása, és fokozott CDK2 aktivitás társult {213}. A fenti megfigyelések alapján felmerült a progeszteron mellékvesekéreg carcinomák adjuváns terápiájában történő alkalmazásának lehetősége {212}, továbbá, hogy az ismeretlen hatásmechanizmusú mitotán e daganatok esetében növeli a posztoperatív radioterápia hatékonyságát {213}. Az általunk vizsgált rosszindulatú mellékvesekéreg daganatokban fokozott expressziót mutató CDC25B ciklin-dependens kináz molekulák aktiválását előidézve számos daganat, többek között hepatocelluláris carcinomák kialakulásában szerepet játszik {214}. A sejtciklusban szabályozó funkciót betöltő SCF (SKP1/CUL1/F-box protein) komplex egyes tagjai, az SKP1 (S-phase kinase-associated protein 1), CUL1 (Cullin 1), és BTRC (betatransducin repeat containing protein) molekulák szintén fokozott kifejeződést mutattak az általunk vizsgált adrenocorticalis carcinomákban. Az SCF ubiquitin ligáz komplex elsődleges feladata különböző ciklin-dependens kináz inhibitorok, mint például a CDKN1B (p27kip1) gátlása azok ubiquitinációján és proteolízisén keresztül. Az SCF komplex aktivitásának fokozódását számos daganat kialakulásával összefüggésbe hozták {215}. Az mRNS microarray eredményeink alapján a carcinoma sejtekben szignifikáns expresszió csökkenést mutató, TP53 által szabályozott Reprimo (RPRM) a sejtek DNS károsodásra adott válaszában játszik szerepet. Megnövekedett expressziója ismeretlen mechanizmussal inaktív, foszforilált CDC2 kialakulásához vezet {216}. Az RPRM fokozott kifejeződése a sejtciklus G2 fázisban kialakuló blokkját eredményezi {216}, így az általunk észlelt expresszió csökkenés megerősíti a G2/M elenőrzőpont károsodott szabályozásának szerepét az adrenocorticalis carcinomák kialakulásában. Az RPRM promóterének kóros hipermetilációja következtében kialakuló expresszió csökkenését korábban több daganat esetében igazolták {217}. A fent említett sejtciklus szabályozásában résztvevő gének miRNS-ek által megvalósuló poszttranszkripciós szabályozását egyéb, mellékvesétől különböző eredetű sejtvonalakon már igazolták. A validált miRNS-mRNS interakciókat a TarBase adatbázis gyűjti össze. A CCND1 mRNS degradációjáért nem-kissejtes tüdő carcinoma

111

sejtvonalon a hsa-miR-34a {218}, fej-nyak carcinoma és vese epitheliális sejtvonalon pedig a hsa-miR-503 prekurzor transzfekciója volt felelős {189}. A miRNS expressziós vizsgálatok eredményei alapján fokozott expressziót mutató hsa-miR-503 és a protoonkogén CCND1 között fennálló direkt interakció sem az általunk vizsgált mellékvesekéreg carcinomákban, sem pedig mellékpajzsmirigy carcinomákban nem feltételezhető {15}. Az előzőeken kívül a CCND1 transzlációs gátlásában malignus melanoma sejtvonalon a hsa-let-7b transzfekciója is szerepet játszott {219}. A mellékvesekéreg carcinomában csökkent kifejeződést mutató CDKN1C a hsa-miR-221 révén megvalósuló transzláció gátlás alatt áll glioblastoma sejtekben {220}. A hsa-miR124 a CDK4 poszttranszkripciós szabályozásában vesz részt {40}. A G2/M ellenőrzőpontot kontrolláló MYT1 (Myelin transcription factor 1) és PLK1 (polo-like kinase 1) szintén miRNS szabályozás alatt állnak. Emlő carcinoma sejtvonalon a hsamiR-27 a MYT1 {221}, a hsa-miR-16 HeLa sejtekben pedig a PLK1 {42} poszttranszkripciós szabályozásáért felelős. Eredményeink alapján felvetődik annak a lehetősége, hogy mellékvese szövetekben a sejtciklus G2/M ellenőrzőpontja miRNS-ek által regulált, ugyanakkor a szabályozásban résztvevő miRNS-ek eltérnek a más eredetű szöveteken és sejtvonalakon validált miRNS-ektől. Fontos azonban hangsúlyozni, hogy az általunk azonosított miRNS-mRNS interakciók csupán bioinformatikai módszerekkel prediktált kapcsolatok, amelyek kísérletes validálása a továbbiakban szükséges. Az általunk alkalmazott "in silico" megközelítés relevanciáját támasztja alá azonban az a tény, hogy az útvonal elemzés eredményei mellékvesekéreg carcinomákban mind transzkripciós, mind pedig poszttranszkripciós szinten a G2/M ellenőrzőpont károsodásának patogenetikai szerepét vetik fel. Munkacsoportunk a mellékvesekéreg daganatok funkcionális genomikai metaanaalízise során a sejtciklus károsodását a mellékvesekéreg carcinoma fő molekuláris patogenetikai útvonalaként azonosította {106}.

112

VI.2. miRNS expressziós mintázat és a miRNS-ek patogenetikai szerepének vizsgálata phaeochromocytomákban Hasonlóan

a

mellékvesekéreg

phaeochromocytomák

esetében

daganatokhoz,

vizsgálataink

sem rendelkeztünk

ismeretekkel

kezdetekor a

a

miRNS-ek

patogenetikai szerepét illetően. Munkánk második felében ezért különböző típusú sporadikus

és

öröklődő

phaeochromocytomák

miRNS

expressziós

mintázatát

vizsgáltuk. Mivel a mellékvese különböző típusú velő eredetű daganatai ritka tumorok, esetükben a vizsgálatokhoz szükséges megfelelő számú friss illetve fagyasztott szövetminta gyűjtése nehezen volt kivitelezhető. Munkánk során ezért a miRNS expressziós mintázat tanulmányozásához patológiai archívumban tárolt, formalin-fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) szövetblokkokból izolált teljes RNS-t alkalmaztunk. A génexpressziós vizsgálatok aranystandard kiindulási anyagának tartott friss és fagyasztott szövetmintákkal ellentétben, az FFPE blokkok felhasználásával végzett mRNS expressziós vizsgálatok jelenleg technikailag nagy kihívást jelentenek. Az FFPE blokkokból kivont RNS mintáknak ugyanis sem a minősége, sem pedig a mennyisége nem éri el a fagyasztott szövetekből nyert RNS izolátumokét. Ennek hátterében a nukleinsavak formalin fixáció, alkoholsorral végzett dehidrálás és tárolás következtében létrejövő kémiai módosulásai, a nukleinsavak fehérjékkel képzett keresztkötései, a bázisok (főként az adenin) metilálása, továbbá az enzimatikus és kémiai RNS fragmentáció állnak {156, 222-223}. A kémiai módosulások és a degradáció elsősorban a hosszabb mRNS molekulákat érintik, a 100 nukleotidnál rövidebb RNS molekulák, köztük a 20-23 nukleotid hosszúságú miRNS-ek és RNS fragmentek intaktak maradnak. Az FFPE blokkokból izolált RNS mintákban a miRNS frakció jelen van, amelyhez kis molekulasúlyuk mellett hozzájárulhat a miRNS-ek hosszabb életideje, valamint a polyA farok hiánya is {156}. Ez alapján az archivált paraffinos blokkokból izolált RNS minták a génexpressziós vizsgálatokkal szemben elsősorban a miRNS kifejeződés retrospektív vizsgálatára lehetnek alkalmasak a jövőben {156, 222-223}. Egyes vizsgálatok szerint hét évnél fiatalabb blokkokból izolált RNS mintákban a miRNS frakció minősége és mennyisége lehetővé teszi a további expressziós vizsgálatokra történő alkalmazást, azonban az ezt meghaladó tárolás a környező levegőn végbemenő

113

oxidatív károsodás révén a kis molekulasúlyú RNS frakció részleges elvesztéséhez vezethet {224}. Az FFPE blokkok miRNS expressziós vizsgálatokra (microarray, qRTPCR) történő alkalmazhatóságát több szövet esetében már sikeresen igazolták {156, 225-226}, azonban phaeochromocytoma blokkok esetén nem rendelkeztünk hasonló adatokkal. Munkánk során ezért elsőként az FFPE blokkok alkalmazhatóságát vizsgáltuk a mellékvese velő eredetű daganatai esetében. A phaeochromocytoma FFPE blokkokból izolált RNS minősége a vártnak megfelelően messze alulmaradt az azonos beteg fagyasztott tumormintájából származó RNS-éhez képest. Az FFPE RNS minták alacsony mértékű integritásának jele a 18S és 28S csúcsok hiánya, valamint az elektroforézis görbék eltolódása a 100 nukleotidnál rövidebb RNS frakció irányába. A phaeochromocytoma FFPE blokkokból szeparált RNS minták esetében a degradáció mértéke megegyezett más szöveteken végzett vizsgálatok irodalmi adataival {156}. A paraffinos phaeochromocytoma blokkok miRNS expressziós microarray vizsgálatra történő alkalmazhatóságának megítélésére azonos tumorszövetből származó FFPE blokk és fagyasztott szövet miRNS expressziós profilját hasonlítottuk össze. Az általunk vizsgált három párosított phaeochromocytoma FFPE és fagyasztott minta microarray vizsgálattal meghatározott miRNS expressziós profilja nagymértékben korrelált egymással (Spearman koefficiens 0.7-0.93), amelynek mértéke megegyezett egyéb szövetekben talált korrelációval {156, 225-226}. Ez alapján az FFPE blokkok phaeocromocytomák esetében is alkalmas kiindulási anyagnak bizonyultak a további miRNS expressziós microarray vizsgálatokhoz. Összesen 21 különböző eredetű paraffinos phaeochromocytoma minta miRNS expressziós mintázatát vizsgáltuk nagy áteresztőképességű microarray platformon. Sporadikus eredetű benignus és recidíváló phaeochromocytomák, valamint öröklődő VHL és MEN2-szindróma talaján kialakuló phaeochromocytomák miRNS expressziós profilját hasonlítottuk össze. A klaszter analízis során a sporadikus recidíváló daganatok csoportja különült el legélesebben a többi vizsgált csoporttól. Ez alapján feltételezhetjük, hogy a miRNS-ek alkalmas molekuláris markerek lehetnek phaeochromocytomák esetében a recidív hajlam megállapítására, továbbá felmerül, hogy a sporadikus recidíváló phaeochromocytomák patomechanizmusában a többi daganattól eltérő miRNS-szabályozás alatt álló patogenetikai útvonalak játszhatnak szerepet. A microarray eredmények alapján összesen 16 miRNS expressziója mutatott

114

szignifikáns különbséget a vizsgált csoportok között. Ezek közül a szignifikancia szintek és az expressziós eltérések figyelembe vételével öt miRNS-t (hsa-miR-139-3p, hsa-miR-541, hsa-miR-765, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-1225-3p) választottunk ki további qRT-PCR-rel történő validálás céljából. A qRT-PCR mérések során növeltük a csoportonkénti

esetszámot,

valamint

öröklődő

NF1

részeként

kialakuló

phaeochromocytoma mintákat is bevontunk a vizsgálatba. A miRNS microarray eredmények alapján a qRT-PCR eredmények normalizálásához két miRNS-t, a hsamiR-320b-t valamint a hsa-miR-324-3p-t választottuk, amelyek alacsony szórást mutattak a kísérleti csoportok között. E két miRNS "housekeeping"-ként történő alkalmazhatóságát különböző szövetekben Liang és mtsai. korábban robusztus tanulmányukban már igazolták {159}. A validálás során mind az öt kiválasztott miRNS esetében sikerült szignifikáns expressziós eltéréseket kimutatnunk a vizsgálati csoportok között. A hsa-miR-139-3p, a hsa-miR-541 és a hsa-miR-765 expressziója szignifikánsan magasabbnak bizonyult VHL-szindrómához társuló phaeochromocytomák esetében összehasonlítva a sporadikus benignus daganatokkal. E mellett a hsa-miR-139-3p kifejeződését VHL phaeochromocytomákban az NF1 csoporttal összehasonlítva is szignifikánsan magasabbnak találtuk. A prekurzor miRNS 3' karjáról szintetizálódó hsamiR-139-3p fokozott expressziója colorectalis carcinomákban májáttétek kialakulásával hozható összefüggésbe {227}, míg Schmitz és mtsai. a hsa-miR-139-3p szignifikánsan alacsonyabb kifejeződését találták a mellékvese kéreg eredetű rosszindulatú daganataiban {204}. A hsa-miR-139 (a prekurzor 5' karjáról szintetizálódó, később azonosított hsa-miR-139-5p homológja) csökkent kifejeződését észlelték korábban qRTPCR vizsgálatokkal primer squamosus sejtes nyelv carcinomában az ép szövetekhez képest {228}, valamint szájüregi squamosus sejtes carcinoma sejtvonalakon összevetve RT7 immortalizált szájüregi keratinocyta sejtvonallal {229}. A hsa-miR-139 expressziója szignifikáns eltérést mutatott a humán bronchus carcinoma szekvenciális kialakulása folyamán is, amelynek során a metaplasia-dysplasia-"in situ" carcinomasquamosus sejtes carcinoma állapotokban kifejeződése progresszív módon csökkent {230}. A hsa-miR-139 expresszióját szintén alacsonyabbnak találták parafibromin negatív, CDC73 inaktiváló mutációit hordozó mellékpajzsmirigy carcinomák valamint mellékpajzsmirigy adenomák esetében az ép szövetekhez képest {15}. A hsa-miR-139

115

csökkent expressziója kedvezőtlen prognózissal és fokozott áttétképző képességgel társult hepatocelluláris carcinomákban, ahol a tumorszuppresszor funkció kiesése a hepatocelluláris carcinoma sejtek migrációjában fontos szerepet játszó Rho kináz 2 (ROCK2) aktiválódását eredményezte {231}. Az előzőekhez hasonlóan a hsa-miR-1395p szignifikánsan alacsonyabb expressziót mutatott gyomor carcinomákban az ép mucosával

{232},

összehasonlítva

valamint

{233},

míg

epehólyag csökkent

carcinomában kifejeződése

az

az

ép

epitheliummal

endometrium

serosus

adenocarcinomáiban kedvezőtlen prognózissal és rövidebb túléléssel társult {234}. A hsa-miR-139-5p expressziójának vizsgálata a vese oncocytomák és chromophob tumorok elkülönítését segítheti {235}. Bár a hsa-miR-139-5p (és hsa-miR-139) csökkent kifejeződését több daganat esetében is kimutatták, valamint a hsa-miR-139-3p expressziója a sporadikus benignus és VHL phaeochromocytomák között is szignifikáns eltérést mutat, e miRNS-ek tumorképződésben játszott szerepe egyelőre kevéssé ismert. Egér hepatocyta sejtekben a miR-139 a FOXO1 (forkhead box O1) 3' UTR-hez kapcsolódva annak transzlációs gátlását eredményezi {236}. A FOXO1 transzkripciós faktor számos növekedési faktor és hormon által regulált jelátviteli út fontos mediátoraként szerepet játszik a sejtek megfelelő válaszreakciójában és a fiziológiás inzulin

szignálban,

megváltozott

expressziója

tumorképződéshez

és

diabetes

kialakulásához vezethet {236}. Egyelőre azonban nem ismert funkcionális kapcsolat a miR-139-3p és a FOXO1 között. A hsa-miR-541 és a hsa-miR-765 kifejeződését szintén fokozottnak találtuk VHL phaeochromocytomákban összehasonlítva a sporadikus benignus daganatokkal. Ezen felül a hsa-miR-541 expressziója szignifikáns különbséget mutatott a VHLszindrómához társuló daganatok és a sporadikus recidíváló phaeochromocytomák között is. E két miRNS élettani funkciójáról és daganatképződésben betöltött esetleges patogenetikai szerepéről jelenleg szintén keveset tudunk. Az egér hasnyálmirigy embrionális fejlődése során a ductalis sejtekben a hsa-miR-541 expressziója időben változik {165}, de a hsa-miR-541 humán pancreas organogenezisében betöltött funkciójáról egyelőre nincsenek adataink. Traumás agysérülésre adott válasz részeként a hsa-miR-541 csökkent expresszióját mérték hippocampus szövetekben {237}, míg a hsa-miR-765 expressziójának fokozódása a traumás agysérülésen átesett betegek plazmájában a sérülés súlyosságát jelezte {238}.

116

Szorongásos kórképekben szenvedő betegek neurotrophin-3 receptorának (NTRK3, TRKC) rövid izoformáján végzett polimorfizmus vizsgálatok felvetették a hsamiR-765 által megvalósuló poszttranszkripciós szabályozás lehetőségét. A hsa-miR-765 és a NTRK3 között fennálló direkt interakciót HeLa sejteken transzfekciós kísérletekkel igazolták {239}. A tirozin kináz receptor NTRK3-t stabilan expresszáló PC12 patkány phaeochromocytoma sejtvonal neurotrophin-3 (NTF3) kezelése a PC12 sejtek mérsékelt neurit képzését és neuronális irányba történő differenciálódását eredményezte {240}. E megfigyelések és saját miRNS expressziós vizsgálataink alapján felvetődik annak lehetősége, hogy a VHL phaeochromocytomákban fokozott kifejeződést mutató hsamiR-765 a NTRK3 poszttranszkripciós gátlásával szerepet játszhat e daganatok patogenezisében. Ennek megerősítése azonban további funkcionális vizsgálatokat igényel. A validált miRNS-ek közül a hsa-miR-885-5p expressziója az öröklődő MEN2 phaeochromocytomák esetében szignifikánsan magasabbnak bizonyult a sporadikus benignus, sporadikus recidíváló, valamint a VHL és NF1 szindrómákhoz társuló daganatokhoz viszonyítva. Ez alapján felmerül, hogy a hsa-miR-885-5p fokozott kifejeződése a RET protoonkogén mutációinak talaján kialakuló phaeochromocytomák sajátossága lehet. A hsa-miR-885-5p szignifikánsan emelkedett expresszióját találták hepatocelluláris carcinomában, májcirrhosisban és krónikus hepatitis B fertőzésben szenvedő betegek szérum mintáiban egészséges kontroll csoporttal összevetve. Felvetődik annak a lehetősége, hogy az intracelluláris hsa-miR-885-5p a májsejtek károsodása során jut a szérumba, így alkalmas marker lehet a máj patológiás állapotainak jelzésére {241}. A pre-hsa-miR-885 3' karjáról szintetizálódó hsa-miR885-3p emelkedett expresszióját malignus mesotheliomákban írták le {242}. Ezzel szemben neuroblastoma szövetekben a hsa-miR-885-5p csökkent expresszióját találták, melynek kialakulásához a miRNS-t kódoló 3p25.3 régió említett tumorokban gyakori deléciója vezet. A hsa-miR-885-5p transzfekciója neuroblastoma sejtekbe a CDK2 és a mini-chromosome maintenance protein (MCM5) poszttranszkripciós gátlásán keresztül a sejtek proliferációjának csökkenését és a TP53 útvonal aktiválódását eredményezte {243}. Ez alapján a hsa-miR-885-5p tumorszuppresszor/protoonkogén funkciója a korábbiakhoz

hasonlóan

szintén

szövetspecifikus.

A

hsa-miR-885-5p

VHL

szindrómához társuló phaeochromocytomákban észlelt csökkent expressziójának

117

hátterében a neuroblastomákhoz hasonlóan a 3p25.3 kromoszóma-régió elvesztése állhat. A hármas kromoszóma rövid karjának vagy a teljes kromoszómának a deléciója ugyanis a VHL phaeochromocytomák 94%-ában kimutatható {244}. Ez alapján felvetődik a VHL szindrómához társuló phaeochromocytomák és a neuroblastoma tumorok hasonló patomechanizmusának lehetősége. Az általunk vizsgált MEN2 phaeochromocytomákban felülexpresszált hsa-miR-885-5p "in silico" prediktált targetjei között a hypoxia-angiogenezis útvonal több tagja is megtalálható (LAMB4, LAMA5, LAMC2 (laminin alegységek), COL4A5 (kollagén IV), P4HA1 (proline 4hydroxilase α-1 prekurzor)), amelyek csökkent kifejeződését korábban leírták ezekben a daganatokban {123}. Ezt figyelembe véve felmerül, hogy a hsa-miR-885-5p poszttranszkripciós szinten részt vesz a phaeochromocytoma sejtek hypoxiára adott válaszának kialakításában, így a MEN2 és VHL tumorok eltérő patomechanizmusában a miRNS szabályozás különbségei is szerepet játszhatnak. A VHL szindrómához társuló phaeochromocytomákban szignifikáns expressziós növekedést

mutató

miRNS-ek

(hsa-miR-139-3p,

hsa-miR-541,

hsa-miR-765)

célpontjainak "in silico" azonosítása során szintén számos olyan molekulát találtunk, amelyek

funkcionálisan

a

VHL

phaeochromocytomákban

aktiválódó

hypoxia/angiogenezis útvonalhoz kapcsolódnak. Ezek közül érdemes kiemelni a VHL tumorszuppresszor gént, a HIF1AN (HIF1α alegység inhibitor), a HIF2α és a VEGF molekulákat. A VHL és HIF1AN molekulák poszttranszkripciós gátlása VHL phaeochromocytomákban hypoxia-indukált gének aktiválódását eredményezheti, míg a HIF2α és a VEGF gének gátlása antagonista funkciót tölthet be. Mivel azonban az említett célmolekulák csak "in silico" prediktált targetek, a továbbiakban a phaeochromocytomákban megváltozott miRNS szabályozás lehetséges patogenetikai szerepének igazolására a prediktált miRNS-mRNS interakciók kísérletes validálása szükséges. Munkánk elsődleges gyakorlati jelentőségét a recidíváló phaeochromocytomák elkülönítésére alkalmas miRNS biomarkerek azonosítása jelenti. Az általunk vizsgált recidíváló phaeochromocytoma mintákban a hsa-miR-1225-3p szignifikáns expresszió emelkedést mutatott a benignus daganatokhoz képest. Segítségével az egyes phaeochromocytoma mintákat 80%-os specificitással és 61%-os szenzitivitással tudtuk besorolni a nem-recidíváló csoportba. A recidíváló phaeochromocytomák esetében

118

kapott eredményekkel ellentétben a hsa-miR-1225-3p csökkent kifejeződését írták le nemrégiben androgén receptor pozitív (AR+) prosztata carcinoma sejtvonal dihidrotesztoszteron kezelését követően {245}. A hsa-miR-1225-3p-t kódoló gén a 16p13.3 kromoszóma

lókuszon

helyezkedik

el

a

hsa-miR-940

kódoló

régiójának

szomszédságában, melynek kifejeződését a miRNS microarray vizsgálatok eredménye alapján szintén szignifikánsan magasabbnak találtuk a sporadikus recidíváló tumorokban. Mivel a hsa-miR-940 jellegzetes nukleotid összetételének (magas G-C bázis tartalom) következtében nem áll rendelkezésre megfelelő TaqMan próba, ezért esetében a qRT-PCR validálást nem tudtuk elvégezni. A két miRNS-t hordozó 16p kromoszóma-régió funkciótöbblettel járó eltéréseit korábban leírták malignus phaeochromocytomákban {149}. Mivel phaeochromocytomák esetében az egyes daganatok malignus viselkedésének és recidív hajlamának megállapítása a szövettani kép alapján nem megbízható, a hsa-miR-1225-3p expressziójának vizsgálata a recidív potenciállal rendelkező daganatok klinikai diagnózisát a jövőben segítheti. A hsa-miR1225-3p-t a tumorszövetben fokozott mértékben expresszáló phaeochromocytomás betegek recidíva hajlama fokozott, ezért a betegek folyamatos posztoperatív követése indokolt. Mivel azonban az általunk tanulmányozott recidíváló phaeochromocytoma csoport elemszáma viszonylag alacsony, további vizsgálatok szükségesek a hsa-miR1225-3p biomarkerként történő alkalmazhatóságának megerősítésére. A miRNS microarray eredmények validálása mellett qRT-PCR-rel vizsgáltuk a miRNS expressziós vizsgálatok során széleskörben normalizálásra használt RNU48 "housekeeping"-ként

történő

alkalmazásának

lehetőségét

phaeochromocytoma

mintákban. Ennek során az RNU48 szignifikáns expressziós eltérését találtuk a MEN2 és NF1 csoportok között. Ez alapján az RNU48, ellentétben a mellékvesekéreg daganatokkal, a phaeochromocytomák miRNS expressziós mintázatának vizsgálata során nem alkalmas "housekeeping"-nek. Phaeochromocytomák esetében ezért a qRTPCR mérésekhez használt "housekeeping" molekulákat (hsa-miR-320b, hsa-miR-3243p) a nagy áteresztőképességű microarray vizsgálatok eredményei alapján választottuk. A két normalizálásra használt miRNS "housekeeping"-ként történő alkalmazásának lehetőségét egy számos szövetet lefedő, robusztus tanulmányban korábban már igazolták {159}.

119

Munkánk során elsőként hasonlítottuk össze és írtuk le különböző típusú öröklődő endokrin tumorszindrómákhoz társuló, valamint sporadikus benignus és recidíváló

mellékvesevelő

daganatok

miRNS

expressziós

mintázatát.

Munkacsoportunkkal közel azonos időben publikálták eredményeiket Meyer-Rochow és mtsai., akik 12 benignus és 12 malignus phaeochromocytoma miRNS expressziós profilját vizsgálták microarray segítségével {246}. A két csoport között összesen 18 miRNS expressziója mutatott statisztikailag szignifikáns különbséget. Eredményeiket 10-10 benignus és malignus daganatból álló független mintacsoporton qRT-PCR-rel validálták. A hsa-miR-15a és a hsa-miR-16 expressziója szignifikánsan csökkent, míg az IGF-2 intronikus régiójáról átíródó hsa-miR-483-5p és "host" génjének kifejeződése szignifikáns mértékben fokozódott malignus phaeochromocytomákban. Az IGF-2 és a hsa-miR-15a expressziójának együttes vizsgálata alkalmas biomarkernek bizonyult a primer tumor eltávolítását követően a malignus viselkedés előrejelzésére, míg a hsamiR-483-5p fokozott expressziója csökkent betegségmentes túléléssel korrelált. A hsamiR-15a és a hsa-miR-16 malignus phaeochromocytomák patomechanizmusában betöltött szerepét "in vitro", patkány PC12 sejtvonalon modellezték. Az említett miRNS-ek prekurzorának transzfekciója a CCND1 szabályozásán keresztül a sejtproliferáció gátlását és az apoptózis fokozódását eredményezte {246}. Saját eredményeink és a Meyer-Rochow tanulmány eredményeinek összevetését nehezíti az a tény, hogy a két munkacsoport különböző eredetű és dignitású phaeochromocytomák miRNS expressziós mintázatát vizsgálta. Míg saját munkánk során sporadikus recidíváló phaeochromocytomák miRNS profilját határoztuk meg, addig MeyerRochow és mtsai. áttétképző malignus phaeochromocytomák miRNS expressziós adatait hasonlították össze benignus daganatokkal. Ki kell emelni azt is, hogy velünk ellentétben

Meyer-Rochow

és

mtsai.

nem

vizsgáltak

öröklődő

endokrin

tumorszindrómák részeként, csírasejtes mutációk talaján kialakuló phaeochromocytoma mintákat. A molekuláris markerekek azonosításán kívül munkánk során a miRNS-ek phaeochromocytomák patomechanizmusában játszott kóroki szerepére is próbáltunk rávilágítani. Az egyes daganattípusokban potenciálisan miRNS szabályozás alatt álló patogenetikai útvonalak azonosítása érdekében a qRT-PCR-rel validált, szignifikáns expessziós eltérést mutató öt miRNS (hsa-miR-139-3p, hsa-miR-541, hsa-miR-765, hsa-

120

miR-885-5p,

hsa-miR-1225-3p)

MicroCosm)

prediktált

bioinformatikai

célpontjait

az

összes

módszerekkel lehetséges

(TargetScan, csoportonkénti

összehasonlításban útvonal analízisnek (IPA) vetettük alá. A sporadikus recidíváló és sporadikus benignus phaeochromocytomák összevetése során a három legmagasabb statisztikai szignifikanciát mutató útvonal között azonosítottuk a "Notch-szignált", valamint a "G-fehérjéhez kapcsolt jelátvitelt" is, amely útvonalak eredményeink alapján, recidíváló daganatokban a hsa-miR-1225-3p poszttranszkripciós gátlása alatt állhatnak. A miRNS-szabályozás pontos megértéséhez és korrekt interpretálásához elengedhetetlenek

a

tanulmányozott

szöveteken

végzett,

miRNS-ek

hatását

"ujjlenyomatszerűen" tükröző nagy áteresztőképességű transzkriptomikai vizsgálatok. Jelenlegi ismereteink szerint recidíváló phaeochromocytomák génexpressziós mintázata eddig nem került közlésre, míg összesen hat olyan tanulmányról van tudomásunk, amelyben malignus phaeochromocytomák mRNS expressziós profilját is vizsgálták. Dahia és mtsai. {123} két, Björklund és mtsai. három {146}, Waldmann és mtsai. {144} pedig öt malignus phaeochromocytoma mintát tanulmányoztak. Brouwers és mtsai. 20 malignus phaeochromocytoma (primer tumor és metasztázis egyaránt) génexpressziós mintázatát hasonlították össze 70 sporadikus és öröklődő

endokrin

tumorszindrómák

részeként

kialakuló

benignus

phaeochromocytomával. A primer/metasztatizáló malignus és benignus tumorok között szignifikáns expressziós eltérést mutató gének az ontológiai (Gene Ontology = GO) elemzés során az "angiogenezis" és a "transzláció" folyamatokhoz kapcsolódtak, míg a primer malignus daganatokat a benignus phaeochromocytomákkal összehasonlítva a "szignál transzdukció" eltéréseit találták {143}. A benignus és malignus phaeochromocytomák között szignifikáns expressziós különbséget mutató gének jelentős mértékben eltértek a Thouënnon- {142} és Suhtanulmányban {147}, amely további nagy áteresztőképességű mRNS expressziós vizsgálatok

szükségességét

jelzi.

Suh

és

mtsai.

a

malignus

és

benignus

phaeochromocytomák génexpressziós profiljának Gene Set Enrichment Analízis (GSEA) szoftverrel történő összehasonlítása során a sporadikus benignus daganatokban fokozott kifejeződésű gének szignifikáns dúsulását találták a "Notch1-jelátviteli út" és a "Gα-12 útvonal" tagjai között {147}. A "Notch-szignál" aktiválódásának biológiai

121

hatása szövetenként eltérő lehet. Bizonyos sejtek differenciálódásának gátlásával szerepet játszhat különböző daganatok kialakulásában, míg a központi idegrendszerben az oligodendrocyták érését és a myelinizáció fokozódását eredményezi {247}. A "Notch-jelátviteli útvonal" hiszton-deacetiláz gátló valproinsavval történő aktiválása PC12 patkány phaeochromocytoma sejtvonalon a tumor növekedésének gátlását és a sejtek differenciálódását eredményezte {248}. Ez alapján és saját eredményeinket figyelembe

véve

felmerül,

hogy

a

"Notch-jelátviteli

út"

hiszton-deacetiláz

inhibitorokkal történő aktiválása a jövőben esetleg sikeresen alkalmazható lehet a phaeochromocytomák terápiájában. A "G-fehérjéhez kapcsolt jelátvitel" szintén sejtspecifikus módon vesz részt a sejtek működésének szabályozásában. Befolyásolja azok növekedését, differenciálódását, a sejtmigrációt, továbbá szerepet játszik a hormonszekréció

és

hormonhatások,

valamint

a

szinaptikus

transzmisszió

szabályozásában {249}. Suh és mtsai. GSEA segítségével a "C-MYC szignál" aktiválódását

is

kimutatták

malignus

phaeochromocytomákban

{147}.

Saját

bioinformatikai elemzésünk szintén azonosította a "C-MYC útvonal" poszttranszkripciós szabályozásának

zavarát

a

sporadikus

recidíváló

tumorokban

a

MEN2

phaeochromocytomákhoz viszonyítva. A Suh-tanulmány és az általunk elvégzett útvonal analízis átfedő eredményei azt jelezhetik, hogy a tumorrecidíva kialakulása és az áttétképzés hasonló mechanizmussal megy végbe phaeochromocytomák esetében. Érdekesnek bizonyultak Thouënnon és munkatársainak megfigyelései, amely szerint a vizsgált gének többsége (a Brouwers-tanulmányban {143} közölt eredményekhez

hasonlóan)

phaeochromocytomákban

a

csökkent benignus

kifejeződést

daganatokkal

mutatott

összehasonlítva

malignus {142}.

A

génexpressziós profilban mutatkozó különbségek a malignus daganatok csökkent differenciáltsági állapotát jelezhetik {143}. Az alacsony expressziójú gének között megtalálhatók a recidív phaeochromocytomákban felülexpresszált hsa-miR-1225-3p bioinformatikai módszerekkel prediktált célmolekulái is, mint például az ANK1 (ankyrin-1), a PRKCE (protein kináz C-ε) és az NRIP2 (nuclear receptor interacting protein 2). Hangsúlyozni kell azonban, hogy a különböző típusú phaeochromocytomák esetében általunk leírt, megváltozott miRNS-szabályozás alatt álló útvonalak csupán bioinformatikai módszerekkel kerültek azonosításra. Így ezek patogenetikai szerepének

122

kísérletes validálása a továbbiakban nélkülözhetetlen. A miRNS-ek révén megvalósuló patológiás poszttranszkripciós szabályozás igazolására phaeochromocytoma mintákon párhuzamosan elvégzett miRNS-mRNS expressziós vizsgálatok, valamint a fehérje szintű validálás elengedhetetlenek. Emellett a direkt miRNS-mRNS interakció létrejöttének alátámasztására "in vitro" transzfekciós kísérletek is szükségesek. Sajnos az általunk kiindulási anyagként alkalmazott FFPE minták a korábban részletezett okok miatt nem teszik lehetővé a felsorolt alkalmazások mindegyikét, így az eredmények génexpressziós szintű validálásához elsősorban fagyasztott tumorszövetek alkalmazása javasolható. A miRNS-hatásra direkt módon bekövetkező mRNS és fehérje expressziós változások igazolását szintén nehezíti az a tény, hogy jelenleg nem áll rendelkezésünkre az "in vitro" kísérletekhez optimálisan felhasználható humán phaeochromocytoma sejtvonal.

E

megszorítások

ellenére

kijelenthetjük,

hogy

az

általunk

phaeochromocytomák esetében elsőként leírt miRNS expressziós mintázat lehetővé teszi a különböző típusú sporadikus és öröklődő tumorok klasszifikációját, valamint az általunk azonosított miRNS biomarker a jövőben hozzájárulhat a recidíváló phaeochromocytomák

megbízhatóbb

elkülönítéséhez.

Ezentúl

bioinformatikai

megközelítéssel felvetettük, hogy a "Notch-jelátviteli út" kórosan megváltozott poszttranszkripciós szabályozása szerepet játszhat a phaeochromocytomák recidív jellegének kialakításában.

123

VII. KÖVETKEZTETÉSEK Munkánk során az elsők között vizsgáltuk és írtuk le a mellékvese különböző típusú kéreg és velő eredetű daganatainak miRNS expressziós mintázatát. Ennek során olyan miRNS markereket azonosítottunk, amelyek a szövettani szempontból sokszor kihívást jelentő mellékvesekéreg carcinomák és recidíváló phaeochromocytomák diagnózisának felállítását segíthetik. A miRNS-ek biológiai hatásának pontosabb megértése céljából egy új, szövetspecifikus target predikciós módszert dolgoztunk ki. A miRNS célmolekulák bioinformatikai vizsgálatával olyan patogenetikai útvonalakat tártunk fel, amelyek a megváltozott poszttranszkripciós szabályozás révén szerepet játszhatnak az említett daganatok kialakulásában, így a jövőben terápiás célpontot jelenthetnek. Eredményeinket az alábbi főbb pontokban foglalhatjuk össze: 1. Mellékvesekéreg daganatok nagy áteresztőképességű TaqMan-technikával történő vizsgálata során összesen 22 miRNS expressziója mutatott szignifikáns eltérést a kísérleti csoportok (ép, kortizol-termelő, hormonálisan inaktív adenoma és carcinoma) között. A klaszter analízis során a mellékvesekéreg carcinomák különültek el legélesebben a többi vizsgált csoporttól. 2. A mellékvesekéreg daganatokban 6 miRNS-t sikerült validálnunk qRT-PCR módszerrel. Ezek expressziós eltérései alapján a hsa-miR-503, a hsa-miR-184 és a hsamiR-210 onkogén szerepet tölthet be a mellékvesekéregben, míg a hsa-miR-214, a hsamiR-511 és a hsa-miR-375 miRNS-ek tumorszuppresszor szerepe feltételezhető. 3. A dCThsa-miR-511-dCThsa-miR-503 alkalmas molekuláris markernek bizonyult a mellékvesekéreg carcinomák elkülönítésére. Segítségével 100%-os szenzitivitással és 97%-os specificitással tudtuk azonosítani a malignus daganatokat, amely alapján felmerül a miRNS-ek alkalmazásának lehetősége a mellékvesekéreg carcinomák diagnosztikájában. 4. A szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek mellékvesekéreg daganatokban expresszálódó, szövetspecifikus célmolekuláinak azonosítására a párhuzamos miRNSmRNS expressziós vizsgálatok és különböző target predikciós algoritmusok eredményeit egységes rendszerben értelmező, integratív bioinformatikai módszert dolgoztunk ki.

124

5. A szövetspecifikus targetek és a szignifikáns expressziós eltérést mutató génlisták útvonal elemzése során a sejtciklus G2/M ellenőrzőpontjának transzkripciós és poszttranszkripciós szintű szabályozási zavarát találtuk a legjelentősebb patogenetikai tényezőnek mellékvesekéreg carcinomákban. 6. A fagyasztott és formalin-fixált paraffinba ágyazott (FFPE) phaeochromocytoma minták nagyfokú korrelációja alapján megállapítottuk, hogy a FFPE blokkokból izolált RNS minták más szövetekhez hasonlóan phaeochromocytomák esetében is alkalmasak a miRNS expressziós microarray vizsgálatokra. 7. miRNS expressziós mintázatuk alapján a sporadikus recidíváló phaeochromocytomák különültek el legélesebben a többi vizsgált csoporttól (sporadikus benignus, MEN2 és VHL phaeochromocytomáktól), így felmerül a miRNS-ek biomarkerként történő alkalmazásának lehetősége a recidíváló daganatok diagnosztikájában. 16 miRNS expressziója mutatott szignifikáns eltérést a négy csoport összehasonlítása során. 8. qRT-PCR módszerrel öt miRNS szignifikáns expressziós eltéréseit validáltuk az esetszám növelése mellett. A vizsgálatba NF1-hoz társuló phaeochromocytomákat is bevontunk. A hsa-miR-139-3p, a hsa-miR-541 és a hsa-miR-765 miRNS-ek emelkedett expresszióját daganatokhoz

találtuk

VHL

képest.

A

phaeochromocytomákban hsa-miR-885-5p

fokozott

a

sporadikus

kifejeződése

benignus a

MEN2

phaeochromocytomák jellegzetessége. 9. A hsa-miR-1225-3p expressziójának vizsgálata hozzájárulhat a recidívára hajlamos phaeochromocytomák azonosításához. 10. A szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek célpontjainak útvonal analízise

során

poszttranszkripciós

a

"Notch-jelátvitel" szabályozásának

hsa-miR-1225-3p zavarát

által

azonosítottuk

megvalósuló a

recidíváló

phaeochromocytomák fő patogenetikai útvonalaként, melynek mRNS expressziós szintű eltéréseit korábban malignus phaeochromocytomákban is leírták. Mindazonáltal hangsúlyozni kell, hogy az általunk azonosított patogenetikai útvonalak bioinformatikai módszerrel kerültek azonosításra, így a továbbiakban kísérletes validálásuk elengedhetetlen.

125

VIII. ÖSSZEFOGLALÁS A mikroRNS-ek (miRNS) megváltozott expresszióját és patogenetikai szerepét számos daganat esetében igazolták, azonban a diagnosztikai és terápiás szempontból gyakran kihívást jelentő mellékvese daganatok kialakulásában betöltött szerepükről keveset tudunk. Joggal merül fel annak lehetősége, hogy a miRNS-ek segíthetik az említett daganatok megbízhatóbb osztályozását, diagnózisát és a patomechanizmus pontosabb megértését. Munkánk során ezért célul tűztük ki különböző típusú mellékvesekéreg tumorok és phaeochromocytomák miRNS expressziós mintázatának vizsgálatát, és a lehetséges célmolekulák azonosításán keresztül, patogenetikai útvonalak felderítését. A miRNS expressziós profilt mellékvesekéreg daganatok és ép mellékvesék (n=36) esetében TaqMan-kártyával, a sporadikus és öröklődő phaeochromocytoma minták (n=33) esetében pedig miRNS microarray technikával (Agilent) vizsgáltuk. Eredményeinket mindkét esetben qRT-PCR módszerrel validáltuk. A szignifikáns expressziós eltérést mutató miRNS-ek cél mRNS-einek azonosításához különböző számítógépes algoritmusokat használtunk. A prediktált célpontok listáját mellékvesekéreg daganatok esetében a párhuzamosan elvégzett miRNS-mRNS expressziós vizsgálatok eredményeinek integratív elemzésével, szövetspecifikus target predikciós megközelítéssel szűkítettük. A miRNS célmolekulák útvonal analízisével olyan patogenetikai útvonalakat azonosítottunk, amelyek megváltozott poszttranszkripciós szabályozása szerepet játszhat e daganatok kialakulásában. A különböző típusú mellékvesekéreg daganatokban hat, míg phaeochromocytomák esetében összesen öt miRNS szignifikáns expressziós eltéréseit találtuk. A dCThsa-miR-511-dCThsa-miR-503 alkalmas molekuláris markernek bizonyult a mellékvesekéreg carcinomák, a hsa-miR-1225-3p expressziójának vizsgálata pedig a recidíváló phaeochromocytomák elkülönítésére. Az "in silico" azonosított célmolekulák útvonal analízise a mellékvesekéreg carcinomák patomechanizmusában a sejtciklus "G2/M ellenőrzőpontjának", míg recidíváló phaeochromocytomák esetében a "Notchjelátvitel" megváltozott poszttranszkripciós szabályozásának szerepét vetette fel. A bioinformatikai módszerekkel azonosított útvonalak patogenetikai szerepének igazolásához azonban további kísérletes vizsgálatok szükségesek. Megfigyeléseink hozzájárulhatnak a mellékvese daganatainak megbízhatóbb osztályozásához és diagnózisához, patogenezisük jobb megértéséhez, emellett a jövőben új terápiás célpontok azonosításának alapját képezhetik. 1.

Tömböl Z, Szabó PM., Molnár V, Wiener Z, Tölgyesi G, Horányi J, Riesz P, Reismann P, Patócs A, Likó I, Gaillard RC, Falus A, Rácz K, Igaz P. Integrative molecular bioinformatics study of human adrenocortical tumors: microRNA, tissue-specific target prediction, and pathway analysis. EndocrineRelated Cancer, 2009, 16: 895-906. IF: 4.282

2.

Tömböl Z, Éder K, Kovács A, Szabó PM, Kulka J, Likó I, Zalatnai A, Rácz G, Tóth M, Patócs A, Falus A, Rácz K, Igaz P. MicroRNA expression profiling in benign (sporadic and hereditary) and recurring adrenal pheochromocytomas. Modern Pathology, 2010, 23: 1583-1595. IF (2009): 4.406

3.

Szabó PM, Tömböl Z, Molnár V, Falus A, Rácz K, Igaz P. MicroRNA Target Prediction: Problems and possible solutions. Current Bioinformatics, 2010, 5: 81-88. IF (2009): 1.688. Megosztott elsőszerzős cikk.

126

IX. SUMMARY The different expression and pathogenic role of microRNAs (miRNAs) has been previously reported in several neoplastic diseases, however, there has been only a few data on their pathogenic relevance in tumors of the adrenal gland often representing diagnostic and therapeutic challenges. Therefore, it could be hypothesized that miRNAs can contribute to the classification and better diagnostics of these tumors and can help to elucidate their pathogenesis. Our aims were to study the miRNA expression patterns of different subgroups of adrenocortical tumors and phaeochromocytomas, and to explore pathogenic pathways affected by altered posttranscriptional regulation. miRNA expression profiling of adrenocortical tumors (n=36) and pheochromocytomas (sporadic and hereditary, n=33) has been performed by TaqMan Human miRNA Panel and miRNA microarray (Agilent), respectively. Results of these high-throughput methods were validated by qRT-PCR. Potential target mRNAs of the miRNAs with significant expression differences were identified by various computational target prediction algorithms. In our study on adrenocortical tumors, the number of predicted targets was reduced by an own tissue-specific target prediction approach integrating the results of the parallelly performed miRNA and mRNA expression profiling methods. Pathway analysis of the miRNA targets was carried out to reveal major pathogenic pathways in adrenal tumors affected by altered posttranscriptional regulation. Six miRNAs among the different subgroups of adrenocortical tumours and five miRNAs in phaeochromocytomas were found to be significantly differentially expressed. dCThsa-miR-511-dCThsa-miR-503 turned out to be the most appropriate biomarker for adrenocortical malignancy, while hsa-miR-1225-3p has been identified as a useful marker for the recurrence of phaeochromocytomas. Pathway analysis of the "in silico" predicted target mRNAs revealed the "Cell Cycle: G2/M checkpoint regulation" and the "Notch signaling" as major pathogenic pathways in adrenocortical cancer and recurring phaeochromocytomas, respectively. These "in silico" identified pathways should be further experimentally validated. Our result may contribute to the reliable classification and better diagnostics of adrenal tumors, and to a deeper understanding of their pathogenesis and may help the identification of new therapeutic targets. 1.

Tömböl Z, Szabó PM., Molnár V, Wiener Z, Tölgyesi G, Horányi J, Riesz P, Reismann P, Patócs A, Likó I, Gaillard RC, Falus A, Rácz K, Igaz P. Integrative molecular bioinformatics study of human adrenocortical tumors: microRNA, tissue-specific target prediction, and pathway analysis. EndocrineRelated Cancer, 2009, 16: 895-906. IF: 4.282

2.

Tömböl Z, Éder K, Kovács A, Szabó PM, Kulka J, Likó I, Zalatnai A, Rácz G, Tóth M, Patócs A, Falus A, Rácz K, Igaz P. MicroRNA expression profiling in benign (sporadic and hereditary) and recurring adrenal pheochromocytomas. Modern Pathology, 2010, 23: 1583-1595. IF (2009): 4.406

3.

Szabó PM, Tömböl Z, Molnár V, Falus A, Rácz K, Igaz P. MicroRNA Target Prediction: Problems and possible solutions. Current Bioinformatics, 2010, 5: 81-88. IF (2009): 1.688. Co-first author article.

127

X. IRODALOMJEGYZÉK 1.

Bartel DP. (2009) MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell, 136: 215-233.

2.

Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 391: 806-811.

3.

Hammond SM, Caudy AA, Hannon GJ. (2001) Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nat Rev Genet, 2: 110-119.

4.

He L, Hannon GJ. (2004) MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nat Rev Genet, 5: 522-531.

5.

Chen CZ. (2005) MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors. N Engl J Med, 353: 1768-1771.

6.

Molnár V, Bakos B, Hegyesi H, Falus A. (2008) Nem kódoló genom és mikro-RNS-ek: új fejezet a genetika történetében. LAM, 18: 591-597.

7.

Ambros V, Chen X. (2007) The regulation of genes and genomes by small RNAs. Development, 134: 1635-1641.

8.

Wienholds E, Plasterk RH. (2005) MicroRNA function in animal development. FEBS Lett, 579: 59115922.

9.

Singh SK, Pal Bhadra M, Girschick HJ, Bhadra U. (2008) MicroRNAs-micro in size but macro in function. FEBS J, 275: 4929-4944.

10.

Barbarotto E, Schmittgen TD, Calin GA. (2008) MicroRNAs and cancer: profile, profile, profile. Int J Cancer, 122: 969-977.

11.

Bottoni A, Zatelli MC, Ferracin M, Tagliati F, Piccin D, Vignali C, Calin GA, Negrini M, Croce CM, Degli Uberti EC. (2007) Identification of differentially expressed microRNAs by microarray: a possible role for microRNA genes in pituitary adenomas. J Cell Physiol, 210: 370-377.

12.

Butz H, Likó I, Czirják S, Igaz P, Khan MM, Zivkovic V, Bálint K, Korbonits M, Rácz K, Patócs A. (2010) Down-regulation of Wee1 kinase by a specific subset of microRNA in human sporadic pituitary adenomas. J Clin Endocrinol Metab, 95: E181-191.

13.

He H, Jazdzewski K, Li W, Liyanarachchi S, Nagy R, Volinia S, Calin GA, Liu CG, Franssila K, Suster S, Kloos RT, Croce CM, de la Chapelle A. (2005) The role of microRNA genes in papillary thyroid carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A, 102: 19075-19080.

14.

Weber F, Teresi RE, Broelsch CE, Frilling A, Eng C. (2006) A limited set of human MicroRNA is deregulated in follicular thyroid carcinoma. J Clin Endocrinol Metab, 91: 3584-3591.

15.

Corbetta S, Vaira V, Guarnieri V, Scillitani A, Eller-Vainicher C, Ferrero S, Vicentini L, Chiodini I, Bisceglia M, Beck-Peccoz P, Bosari S, Spada A. (2010) Differential expression of microRNAs in human parathyroid carcinomas compared with normal parathyroid tissue. Endocr Relat Cancer, 17:135-146.

16.

Roldo C, Missiaglia E, Hagan JP, Falconi M, Capelli P, Bersani S, Calin GA, Volinia S, Liu CG, Scarpa A, Croce CM. (2006) MicroRNA expression abnormalities in pancreatic endocrine and acinar tumors are associated with distinctive pathologic features and clinical behavior. J Clin Oncol, 24: 4677-4684.

128

17.

Dahiya N, Morin PJ. (2010) MicroRNAs in ovarian carcinomas. Endocr Relat Cancer, 17: F77-89.

18.

Mattick JS. (2003) Challenging the dogma: the hidden layer of non-protein-coding RNAs in complex organisms. BioEssays, 25: 930-939.

19.

Tefferi A, Wieben ED, Dewald GW, Whiteman DA, Bernard ME, Spelsberg TC. (2002) Primer on medical genomics part II: Background principles and methods in molecular genetics. Mayo Clin Proc, 77: 785-808.

20.

Mattick JS, Makunin IV. (2006) Non-coding RNA. Hum Mol Genet, 15 Spec No 1: R17-29.

21.

Sevignani C, Calin GA, Siracusa LD, Croce CM. (2006) Mammalian microRNAs: a small world for finetuning gene expression. Mamm Genome, 17: 189-202.

22.

Maselli V, Di Bernardo D, Banfi S. (2008) CoGemiR: a comparative genomics microRNA database. BMC Genomics, 9: 457.

23.

Lau NC, Lim LP, Weinstein EG, Bartel DP. (2001) An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science, 294: 858-862.

24.

Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, Tuschl T. (2001) Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science, 294: 853-858.

25.

Lee RC, Ambros V. (2001) An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science, 294: 862-864.

26.

Bartel DP. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell, 116: 281-297.

27.

Baskerville S, Bartel DP. (2005) Microarray profiling of microRNAs reveals frequent coexpression with neighboring miRNAs and host genes. RNA, 11: 241-247.

28.

Bentwich I, Avniel A, Karov Y, Aharonov R, Gilad S, Barad O, Barzilai A, Einat P, Einav U, Meiri E, Sharon E, Spector Y, Bentwich Z. (2005) Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet, 37: 766-770.

29.

Berezikov E, van Tetering G, Verheul M, van de Belt J, van Laake L, Vos J, Verloop R, van de Wetering M, Guryev V, Takada S, van Zonneveld AJ, Mano H, Plasterk R, Cuppen E. (2006) Many novel mammalian microRNA candidates identified by extensive cloning and RAKE analysis. Genome Res, 16: 1289-1298.

30.

Pasquinelli AE, Reinhart BJ, Slack F, Martindale MQ, Kuroda MI, Maller B, Hayward DC, Ball EE, Degnan B, Müller P, Spring J, Srinivasan A, Fishman M, Finnerty J, Corbo J, Levine M, Leahy P, Davidson E, Ruvkun G. (2000) Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature, 408: 86-89.

31.

Faller M, Guo F. (2008) MicroRNA biogenesis: there's more than one way to skin a cat. Biochim Biophys Acta, 1779: 663-667.

32.

Borchert GM, Lanier W, Davidson BL. (2006) RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol, 13: 1097-1101.

33.

Filipowicz W, Bhattacharyya SN, Sonenberg N. (2008) Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? Nat Rev Genet, 9: 102-114.

129

34.

Ro S, Park C, Young D, Sanders KM, Yan W. Tissue-dependent paired expression of miRNAs. (2007) Nucleic Acids Res, 35: 5944-5953.

35.

Okamura K, Phillips MD, Tyler DM, Duan H, Chou YT, Lai EC. (2008) The regulatory activity of microRNA* species has substantial influence on microRNA and 3' UTR evolution. Nat Struct Mol Biol, 15: 354-63.

36.

Ambros V, Bartel B, Bartel DP, Burge CB, Carrington JC, Chen X, Dreyfuss G, Eddy SR, Griffiths-Jones S, Marshall M, Matzke M, Ruvkun G, Tuschl T. (2003) A uniform system for microRNA annotation. RNA, 9: 277-279.

37.

Griffiths-Jones S. (2004) The microRNA Registry. Nucleic Acids Res , 32: D109-111.

38.

Lewis BP, Burge CB, Bartel DP. (2005) Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell, 120: 15-20.

39.

Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP. (2007) MicroRNA targeting specificity in mammals: determinants beyond seed pairing. Mol Cell, 27: 91-105.

40.

Lim LP, Lau NC, Garrett-Engele P, Grimson A, Schelter JM, Castle J, Bartel DP, Linsley PS, Johnson JM. (2005) Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature, 433: 769-773.

41.

Baek D, Villén J, Shin C, Camargo FD, Gygi SP, Bartel DP. (2008) The impact of microRNAs on protein output. Nature, 455: 64-71.

42.

Selbach M, Schwanhäusser B, Thierfelder N, Fang Z, Khanin R, Rajewsky N. (2008) Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature, 455: 58-63.

43.

Grosshans H, Filipowicz W. (2008) Proteomics joins the search for microRNA targets. Cell, 134:560-562.

44.

Rhoades MW, Reinhart BJ, Lim LP, Burge CB, Bartel B, Bartel DP. (2002) Prediction of plant microRNA targets. Cell, 110: 513-520.

45.

Lewis BP, Shih IH, Jones-Rhoades MW, Bartel DP, Burge CB. (2003) Prediction of mammalian microRNA targets. Cell, 115: 787-798.

46.

Nielsen CB, Shomron N, Sandberg R, Hornstein E, Kitzman J, Burge CB. (2007) Determinants of targeting by endogenous and exogenous microRNAs and siRNAs. RNA, 13: 1894-1910.

47.

Miranda KC, Huynh T, Tay Y, Ang YS, Tam WL, Thomson AM, Lim B, Rigoutsos I. (2006) A patternbased method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes. Cell, 126: 1203-1217.

48.

Hon LS, Zhang Z. (2007) The roles of binding site arrangement and combinatorial targeting in microRNA repression of gene expression. Genome Biol, 8: R166.

49.

Krek A, Grün D, Poy MN, Wolf R, Rosenberg L, Epstein EJ, MacMenamin P, da Piedade I, Gunsalus KC, Stoffel M, Rajewsky N. (2005) Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet, 37: 495-500.

50.

Grün D, Wang YL, Langenberger D, Gunsalus KC, Rajewsky N. (2005) microRNA target predictions across seven Drosophila species and comparison to mammalian targets. PLoS Comput Biol, 1: e13.

130

51.

Lall S, Grün D, Krek A, Chen K, Wang YL, Dewey CN, Sood P, Colombo T, Bray N, Macmenamin P, Kao HL, Gunsalus KC, Pachter L, Piano F, Rajewsky N. (2006) A genome-wide map of conserved microRNA targets in C. elegans. Curr Biol, 16: 460-471.

52.

Chen K, Rajewsky N. (2006) Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data. Nat Genet, 38: 1452-1456.

53.

Griffiths-Jones S. (2006) miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol, 342: 129-138.

54.

Griffiths-Jones S, Saini HK, van Dongen S, Enright AJ. (2008) miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res, 36: D154-158.

55.

Wang B, Love TM, Call ME, Doench JG, Novina CD. (2006) Recapitulation of short RNA-directed translational gene silencing in vitro. Mol Cell, 22: 553-560.

56.

Clancy JL, Nousch M, Humphreys DT, Westman BJ, Beilharz TH, Preiss T. (2007) Methods to analyze microRNA-mediated control of mRNA translation. Methods Enzymol, 431: 83-111.

57.

Papadopoulos GL, Reczko M, Simossis VA, Sethupathy P, Hatzigeorgiou AG. (2009) The database of experimentally supported targets: a functional update of TarBase. Nucleic Acids Res, 37: D155-158.

58.

Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. (1993) The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell, 75: 843-854.

59.

Reinhart BJ, Slack FJ, Basson M, Pasquinelli AE, Bettinger JC, Rougvie AE, Horvitz HR, Ruvkun G. (2000) The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature, 403: 901-906.

60.

Zhao Y, Samal E, Srivastava D. (2005) Serum response factor regulates a muscle-specific microRNA that targets Hand2 during cardiogenesis. Nature, 436: 214-220.

61.

Chen CZ, Li L, Lodish HF, Bartel DP. (2004) MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation. Science, 303: 83-86.

62.

Esau C, Kang X, Peralta E, Hanson E, Marcusson EG, Ravichandran LV, Sun Y, Koo S, Perera RJ, Jain R, Dean NM, Freier SM, Bennett CF, Lollo B, Griffey R. (2004) MicroRNA-143 regulates adipocyte differentiation. J Biol Chem, 279: 52361-52365.

63.

Cuellar TL, McManus MT. (2005) MicroRNAs and endocrine biology. J Endocrinol, 187: 327-332.

64.

Poy MN, Eliasson L, Krutzfeldt J, Kuwajima S, Ma X, Macdonald PE, Pfeffer S, Tuschl T, Rajewsky N, Rorsman P, Stoffel M. (2004) A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature, 432: 226-230.

65.

Pfeffer S, Zavolan M, Grässer FA, Chien M, Russo JJ, Ju J, John B, Enright AJ, Marks D, Sander C, Tuschl T. (2005) Identification of virus-encoded microRNAs. Science, 304: 734-736.

66.

Cheng AM, Byrom MW, Shelton J, Ford LP. (2005) Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis. Nucleic Acids Res, 33: 1290-1297.

67.

Calin GA, Croce CM. (2006) MicroRNA signatures in human cancers. Nat Rev Cancer, 6: 857-866.

68.

Provost P. (2010) MicroRNAs as a molecular basis for mental retardation, Alzheimer's and prion diseases. Brain Res, 1338: 58-66.

131

69.

Luo X, Tsai LM, Shen N, Yu D. (2010) Evidence for microRNA-mediated regulation in rheumatic diseases. Ann Rheum Dis, 69: i30-36.

70.

Alevizos I, Illei GG. (2010) MicroRNAs as biomarkers in rheumatic diseases. Nat Rev Rheumatol, 6: 391398.

71.

O'Connell RM, Rao DS, Chaudhuri AA, Baltimore D. (2010) Physiological and pathological roles for microRNAs in the immune system. Nat Rev Immunol, 10: 111-122.

72.

Urbich C, Kuehbacher A, Dimmeler S. (2008) Role of microRNAs in vascular diseases, inflammation, and angiogenesis. Cardiovasc Res, 79: 581-588.

73.

Pandey AK, Agarwal P, Kaur K, Datta M. (2009) MicroRNAs in diabetes: tiny players in big disease. Cell Physiol Biochem, 23: 221-232.

74.

Chen XM. MicroRNA signatures in liver diseases. (2009) World J Gastroenterol, 15: 1665-1672.

75.

Calin GA, Sevignani C, Dumitru CD, Hyslop T, Noch E, Yendamuri S, Shimizu M, Rattan S, Bullrich F, Negrini M, Croce CM. (2004) Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc Natl Acad Sci U S A, 101: 2999-3004.

76.

Perou CM, Sørlie T, Eisen MB, van de Rijn M, Jeffrey SS, Rees CA, Pollack JR, Ross DT, Johnsen H, Akslen LA, Fluge O, Pergamenschikov A, Williams C, Zhu SX, Lønning PE, Børresen-Dale AL, Brown PO, Botstein D. (2000) Molecular portraits of human breast tumours. Nature, 406: 747-752.

77.

Lu J, Getz G, Miska EA, Alvarez-Saavedra E, Lamb J, Peck D, Sweet-Cordero A, Ebert BL, Mak RH, Ferrando AA, Downing JR, Jacks T, Horvitz HR, Golub TR. (2005) MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature, 435: 834-838.

78.

Garzon R, Fabbri M, Cimmino A, Calin GA, Croce CM. (2006) MicroRNA expression and function in cancer. Trends Mol Med, 12: 580-587.

79.

Zhao H, Wang D, Du W, Gu D, Yang R. (2010) MicroRNA and leukemia: tiny molecule, great function. Crit Rev Oncol Hematol, 74: 149-155.

80.

Wijnhoven BP, Michael MZ, Watson DI. (2007) MicroRNAs and cancer. Br J Surg, 94: 23-30.

81.

Takamizawa J, Konishi H, Yanagisawa K, Tomida S, Osada H, Endoh H, Harano T, Yatabe Y, Nagino M, Nimura Y, Mitsudomi T, Takahashi T. (2004) Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival. Cancer Res, 64: 3753-3756.

82.

Calin GA, Ferracin M, Cimmino A, Di Leva G, Shimizu M, Wojcik SE, Iorio MV, Visone R, Sever NI, Fabbri M, Iuliano R, Palumbo T, Pichiorri F, Roldo C, Garzon R, Sevignani C, Rassenti L, Alder H, Volinia S, Liu CG, Kipps TJ, Negrini M, Croce CM. (2005) A MicroRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med, 353: 1793-1801.

83.

Koch CA, Pacak K, Chrousos GP. (2002) The molecular pathogenesis of hereditary and sporadic adrenocortical and adrenomedullary tumors. J Clin Endocrinol Metab, 87: 5367-5384.

84.

Libé R, Bertherat J. (2005) Molecular genetics of adrenocortical tumours, from familial to sporadic diseases. Eur J Endocrinol, 153: 477-487.

132

85.

Igaz P, Wiener Z, Szabó P, Falus A, Gaillard RC, Horányi J, Rácz K, Tulassay Z. (2006) Functional genomics approaches for the study of sporadic adrenal tumor pathogenesis: clinical implications. J Steroid Biochem Mol Biol, 101: 87-96.

86.

Libè R, Fratticci A, Bertherat J. (2007) Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocr Relat Cancer, 14: 13-28.

87.

Luton JP, Martinez M, Coste J, Bertherat J. (2000) Outcome in patients with adrenal incidentaloma selected for surgery: an analysis of 88 cases investigated in a single clinical center. Eur J Endocrinol, 143: 111-117.

88.

Volante M, Buttigliero C, Greco E, Berruti A, Papotti M. (2008) Pathological and molecular features of adrenocortical carcinoma: an update. J Clin Pathol, 61: 787-793.

89.

Soon PS, McDonald KL, Robinson BG, Sidhu SB. (2008) Molecular markers and the pathogenesis of adrenocortical cancer. Oncologist, 13: 548-561.

90.

Libè R, Groussin L, Tissier F, Elie C, René-Corail F, Fratticci A, Jullian E, Beck-Peccoz P, Bertagna X, Gicquel C, Bertherat J. (2007) Somatic TP53 mutations are relatively rare among adrenocortical cancers with the frequent 17p13 loss of heterozygosity. Clin Cancer Res, 13: 844-850.

91.

Bertherat J, Bertagna X. (2009) Pathogenesis of adrenocortical cancer. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab, 23: 261-271.

92.

Berthon A, Sahut-Barnola I, Lambert-Langlais S, de Joussineau C, Damon-Soubeyrand C, Louiset E, Taketo MM, Tissier F, Bertherat J, Lefrançois-Martinez AM, Martinez A, Val P. (2010) Constitutive betacatenin activation induces adrenal hyperplasia and promotes adrenal cancer development. Hum Mol Genet, 19: 1561-1576.

93.

Velázquez-Fernández D, Laurell C, Geli J, Höög A, Odeberg J, Kjellman M, Lundeberg J, Hamberger B, Nilsson P, Bäckdahl M. (2005) Expression profiling of adrenocortical neoplasms suggests a molecular signature of malignancy. Surgery. 138: 1087-1094.

94.

Slater EP, Diehl SM, Langer P, Samans B, Ramaswamy A, Zielke A, Bartsch DK. (2006) Analysis by cDNA microarrays of gene expression patterns of human adrenocortical tumors. Eur J Endocrinol, 154: 587-598.

95.

de Reyniès A, Assié G, Rickman DS, Tissier F, Groussin L, René-Corail F, Dousset B, Bertagna X, Clauser E, Bertherat J. (2009) Gene expression profiling reveals a new classification of adrenocortical tumors and identifies molecular predictors of malignancy and survival. J Clin Oncol, 27: 1108-1115.

96.

Giordano TJ, Kuick R, Else T, Gauger PG, Vinco M, Bauersfeld J, Sanders D, Thomas DG, Doherty G, Hammer G. (2009) Molecular classification and prognostication of adrenocortical tumors by transcriptome profiling. Clin Cancer Res, 15: 668-676.

97.

Giordano TJ, Thomas DG, Kuick R, Lizyness M, Misek DE, Smith AL, Sanders D, Aljundi RT, Gauger PG, Thompson NW, Taylor JM, Hanash SM. (2003) Distinct transcriptional profiles of adrenocortical tumors uncovered by DNA microarray analysis. Am J Pathol, 162: 521-531.

98.

Coulter CL. (2005) Fetal adrenal development: insight gained from adrenal tumors. Trends Endocrinol Metab, 16: 235-242.

133

99.

Weber MM, Auernhammer CJ, Kiess W, Engelhardt D. (1997) Insulin like growth factor receptors in normal and tumorous adult human adrenocortical glands. Eur J Endocrinol, 136: 296-303.

100.

Boulle N, Logié A, Gicquel C, Perin L, Le Bouc Y. (1998) Increased levels of insulin-like growth factor II (IGF-II) and IGF-binding protein-2 are associated with malignancy in sporadic adrenocortical tumors. J Clin Endocrinol Metab, 83: 1713-1720.

101.

Boulle N, Baudin E, Gicquel C, Logié A, Bertherat J, Penfornis A, Bertagna X, Luton JP, Schlumberger M, Le Bouc Y. (2001) Evaluation of plasma insulin-like growth factor binding protein-2 as a marker for adrenocortical tumors. Eur J Endocrinol, 144: 29-36.

102.

Liu J, Kahri AI, Heikkilä P, Voutilainen R. (1997) Ribonucleic acid expression of the clustered imprinted genes, p57KIP2, insulin-like growth factor II, and H19, in adrenal tumors and cultured adrenal cells. J Clin Endocrinol Metab, 82: 1766-1771.

103.

de Fraipont F, El Atifi M, Cherradi N, Le Moigne G, Defaye G, Houlgatte R, Bertherat J, Bertagna X, Plouin PF, Baudin E, Berger F, Gicquel C, Chabre O, Feige JJ. (2005) Gene expression profiling of human adrenocortical tumors using complementary deoxyribonucleic Acid microarrays identifies several candidate genes as markers of malignancy. J Clin Endocrinol Metab, 90: 1819-1829.

104.

Zhao J, Speel EJ, Muletta-Feurer S, Rütimann K, Saremaslani P, Roth J, Heitz PU, Komminoth P. (1999) Analysis of genomic alterations in sporadic adrenocortical lesions. Gain of chromosome 17 is an early event in adrenocortical tumorigenesis. Am J Pathol, 155: 1039-1045.

105.

Sidhu S, Marsh DJ, Theodosopoulos G, Philips J, Bambach CP, Campbell P, Magarey CJ, Russell CF, Schulte KM, Röher HD, Delbridge L, Robinson BG. (2002) Comparative genomic hybridization analysis of adrenocortical tumors. J Clin Endocrinol Metab, 87: 3467-3474.

106.

Szabó PM, Tamási V, Molnár V, Andrásfalvy M, Tömböl Z, Farkas R, Kövesdi K, Patócs A, Tóth M, Szalai C, Falus A, Rácz K, Igaz P. (2010) Meta-analysis of adrenocortical tumour genomics data: novel pathogenic pathways revealed. Oncogene, 29: 3163-3172.

107.

Karagiannis A, Mikhailidis DP, Athyros VG, Harsoulis F. (2007) Pheochromocytoma: an update on genetics and management. Endocr Relat Cancer, 14: 935-956.

108.

Lendvai N, Szabó I, Butz H, Beko G, Horányi J, Tarjányi M, Alföldi S, Szabó I, Rácz K, Patócs A. (2009). SDHD génmutációhoz társult extraadrenalis phaeochromocytoma. Orv Hetil, 150: 645-649.

109.

Mantero F, Terzolo M, Arnaldi G, Osella G, Masini AM, Alì A, Giovagnetti M, Opocher G, Angeli A. (2000) A survey on adrenal incidentaloma in Italy. Study Group on Adrenal Tumors of the Italian Society of Endocrinology. J Clin Endocrinol Metab, 85: 637-644.

110.

Bravo EL, Tagle R. (2003) Pheochromocytoma: state-of-the-art and future prospects. Endocr Rev, 24: 539553.

111.

Scholz T, Eisenhofer G, Pacak K, Dralle H, Lehnert H. (2007) Clinical review: Current treatment of malignant pheochromocytoma. J Clin Endocrinol Metab, 92: 1217-1225.

112.

Mannelli M, Ianni L, Cilotti A, Conti A. (1999) Pheochromocytoma in Italy: a multicentric retrospective study. Eur J Endocrinol, 141: 619-624.

134

113.

Opocher G, Schiavi F, Conton P, Scaroni C, Mantero F. (2003) Clinical and genetic aspects of phaeochromocytoma. Horm Res, 59 Suppl 1: 56-61.

114.

Sibal L, Jovanovic A, Agarwal SC, Peaston RT, James RA, Lennard TW, Bliss R, Batchelor A, Perros P. (2006) Phaeochromocytomas presenting as acute crises after beta blockade therapy. Clin Endocrinol (Oxf), 65: 186-190.

115.

Goldstein RE, O'Neill JA Jr, Holcomb GW 3rd, Morgan WM 3rd, Neblett WW 3rd, Oates JA, Brown N, Nadeau J, Smith B, Page DL, Abumrad NN, Scott HW Jr. (1999) Clinical experience over 48 years with pheochromocytoma. Ann Surg, 229: 755-766.

116.

Plouin PF, Duclos JM, Soppelsa F, Boublil G, Chatellier G. (2001) Factors associated with perioperative morbidity and mortality in patients with pheochromocytoma: analysis of 165 operations at a single center. J Clin Endocrinol Metab, 86: 1480-1486.

117.

Neumann HP, Bausch B, McWhinney SR, Bender BU, Gimm O, Franke G, Schipper J, Klisch J, Altehoefer C, Zerres K, Januszewicz A, Eng C, Smith WM, Munk R, Manz T, Glaesker S, Apel TW, Treier M, Reineke M, Walz MK, Hoang-Vu C, Brauckhoff M, Klein-Franke A, Klose P, Schmidt H, MaierWoelfle M, Peçzkowska M, Szmigielski C, Eng C; Freiburg-Warsaw-Columbus Pheochromocytoma Study Group. (2002) Germ-line mutations in nonsyndromic pheochromocytoma. N Engl J Med, 346: 1459-1466.

118.

Hao HX, Khalimonchuk O, Schraders M, Dephoure N, Bayley JP, Kunst H, Devilee P, Cremers CW, Schiffman JD, Bentz BG, Gygi SP, Winge DR, Kremer H, Rutter J. (2009) SDH5, a gene required for flavination of succinate dehydrogenase, is mutated in paraganglioma. Science, 325: 1139-1142.

119.

Adler JT, Meyer-Rochow GY, Chen H, Benn DE, Robinson BG, Sippel RS, Sidhu SB. (2008) Pheochromocytoma: current approaches and future directions. Oncologist, 13: 779-793.

120.

Kaelin WG Jr. (2002) Molecular basis of the VHL hereditary cancer syndrome. Nat Rev Cancer, 2: 673682.

121.

Dahia PL, Hao K, Rogus J, Colin C, Pujana MA, Ross K, Magoffin D, Aronin N, Cascon A, Hayashida CY, Li C, Toledo SP, Stiles CD; Familial Pheochromocytoma Consortium. (2005) Novel pheochromocytoma susceptibility loci identified by integrative genomics. Cancer Res, 65: 9651-9658.

122.

Qin Y, Yao L, King EE, Buddavarapu K, Lenci RE, Chocron ES, Lechleiter JD, Sass M, Aronin N, Schiavi F, Boaretto F, Opocher G, Toledo RA, Toledo SP, Stiles C, Aguiar RC, Dahia PL. (2010) Germline mutations in TMEM127 confer susceptibility to pheochromocytoma. Nat Genet, 42: 229-233.

123.

Dahia PL, Ross KN, Wright ME, Hayashida CY, Santagata S, Barontini M, Kung AL, Sanso G, Powers JF, Tischler AS, Hodin R, Heitritter S, Moore F, Dluhy R, Sosa JA, Ocal IT, Benn DE, Marsh DJ, Robinson BG, Schneider K, Garber J, Arum SM, Korbonits M, Grossman A, Pigny P, Toledo SP, Nosé V, Li C, Stiles CD. (2005) A HIF1alpha regulatory loop links hypoxia and mitochondrial signals in pheochromocytomas. PLoS Genet, 1: 72-80.

124.

Petri BJ, van Eijck CH, de Herder WW, Wagner A, de Krijger RR. (2009) Phaeochromocytomas and sympathetic paragangliomas. Br J Surg, 96: 1381-1392.

135

125.

Nativ O, Grant CS, Sheps SG, O'Fallon JR, Farrow GM, van Heerden JA, Lieber MM. (1992) Prognostic profile for patients with pheochromocytoma derived from clinical and pathological factors and DNA ploidy pattern. J Surg Oncol, 50: 258-262.

126.

Helman LJ, Cohen PS, Averbuch SD, Cooper MJ, Keiser HR, Israel MA. (1989) Neuropeptide Y expression distinguishes malignant from benign pheochromocytoma. J Clin Oncol, 7: 1720-1725.

127.

Salmenkivi K, Arola J, Voutilainen R, Ilvesmäki V, Haglund C, Kahri AI, Heikkilä P, Liu J. (2001) Inhibin/activin betaB-subunit expression in pheochromocytomas favors benign diagnosis. J Clin Endocrinol Metab, 86: 2231-2235.

128.

Salmenkivi K, Haglund C, Ristimäki A, Arola J, Heikkilä P. (2001) Increased expression of cyclooxygenase-2 in malignant pheochromocytomas. J Clin Endocrinol Metab, 86: 5615-5619.

129.

Salmenkivi K, Haglund C, Arola J, Heikkilä P. (2001) Increased expression of tenascin in pheochromocytomas correlates with malignancy. Am J Surg Pathol, 25: 1419-1423.

130.

Eisenhofer G, Bornstein SR, Brouwers FM, Cheung NK, Dahia PL, de Krijger RR, Giordano TJ, Greene LA, Goldstein DS, Lehnert H, Manger WM, Maris JM, Neumann HP, Pacak K, Shulkin BL, Smith DI, Tischler AS, Young WF Jr. (2004) Malignant pheochromocytoma: current status and initiatives for future progress. Endocr Relat Cancer, 11: 423-436.

131.

Chrisoulidou A, Kaltsas G, Ilias I, Grossman AB. (2007) The diagnosis and management of malignant phaeochromocytoma and paraganglioma. Endocr Relat Cancer, 14: 569-585.

132.

Yoshimoto T, Naruse M, Zeng Z, Nishikawa T, Kasajima T, Toma H, Yamamori S, Matsumoto H, Tanabe A, Naruse K, Demura H. (1998) The relatively high frequency of p53 gene mutations in multiple and malignant phaeochromocytomas. J Endocrinol. 159: 247-255.

133.

van der Harst E, Bruining HA, Jaap Bonjer H, van der Ham F, Dinjens WN, Lamberts SW, de Herder WW, Koper JW, Stijnen T, Proye C, Lecomte-Houcke M, Bosman FT, de Krijger RR. (2000) Proliferative index in phaeochromocytomas: does it predict the occurrence of metastases? J Pathol, 191: 175-180.

134.

Babinska A, Sworczak K, Wisniewski P, Nałecz A, Jaskiewicz K. (2008) The role of immunohistochemistry in histopathological diagnostics of clinically "silent" incidentally detected adrenal masses. Exp Clin Endocrinol Diabetes, 116: 246-251.

135.

Strong VE, Kennedy T, Al-Ahmadie H, Tang L, Coleman J, Fong Y, Brennan M, Ghossein RA. (2008) Prognostic indicators of malignancy in adrenal pheochromocytomas: clinical, histopathologic, and cell cycle/apoptosis gene expression analysis. Surgery, 143: 759-768.

136.

Favier J, Brière JJ, Burnichon N, Rivière J, Vescovo L, Benit P, Giscos-Douriez I, De Reyniès A, Bertherat J, Badoual C, Tissier F, Amar L, Libé R, Plouin PF, Jeunemaitre X, Rustin P, Gimenez-Roqueplo AP. (2009) The Warburg effect is genetically determined in inherited pheochromocytomas. PLoS One, 4: e7094.

137.

Eisenhofer G, Huynh TT, Pacak K, Brouwers FM, Walther MM, Linehan WM, Munson PJ, Mannelli M, Goldstein DS, Elkahloun AG. (2004) Distinct gene expression profiles in norepinephrine- and epinephrineproducing hereditary and sporadic pheochromocytomas: activation of hypoxia-driven angiogenic pathways in von Hippel-Lindau syndrome. Endocr Relat Cancer, 11: 897-911.

136

138.

Favier J, Plouin PF, Corvol P, Gasc JM. (2002) Angiogenesis and vascular architecture in pheochromocytomas: distinctive traits in malignant tumors. Am J Pathol, 161: 1235-1246.

139.

Salmenkivi K, Heikkilä P, Liu J, Haglund C, Arola J. (2003) VEGF in 105 pheochromocytomas: enhanced expression correlates with malignant outcome. APMIS, 111: 458-464.

140.

Eisenhofer G, Huynh TT, Elkahloun A, Morris JC, Bratslavsky G, Linehan WM, Zhuang Z, Balgley BM, Lee CS, Mannelli M, Lenders JW, Bornstein SR, Pacak K. (2008) Differential expression of the regulated catecholamine secretory pathway in different hereditary forms of pheochromocytoma. Am J Physiol Endocrinol Metab, 295: E1223-1233.

141.

Anouar Y, Yon L, Guillemot J, Thouënnon E, Barbier L, Gimenez-Roqueplo AP, Bertherat J, Lefebvre H, Klein M, Muresan M, Grouzmann E, Plouin PF, Vaudry H, Elkahloun AG. (2006) Development of novel tools for the diagnosis and prognosis of pheochromocytoma using peptide marker immunoassay and gene expression profiling approaches. Ann N Y Acad Sci, 1073: 533-540.

142.

Thouënnon E, Elkahloun AG, Guillemot J, Gimenez-Roqueplo AP, Bertherat J, Pierre A, Ghzili H, Grumolato L, Muresan M, Klein M, Lefebvre H, Ouafik L, Vaudry H, Plouin PF, Yon L, Anouar Y. (2007) Identification of potential gene markers and insights into the pathophysiology of pheochromocytoma malignancy. J Clin Endocrinol Metab, 92: 4865-4872.

143.

Brouwers FM, Elkahloun AG, Munson PJ, Eisenhofer G, Barb J, Linehan WM, Lenders JW, De Krijger R, Mannelli M, Udelsman R, Ocal IT, Shulkin BL, Bornstein SR, Breza J, Ksinantova L, Pacak K. (2006) Gene expression profiling of benign and malignant pheochromocytoma. Ann N Y Acad Sci, 1073: 541-556.

144.

Waldmann J, Fendrich V, Holler J, Buchholz M, Heinmöller E, Langer P, Ramaswamy A, Samans B, Walz MK, Rothmund M, Bartsch DK, Slater EP. (2010) Microarray analysis reveals differential expression of benign and malignant pheochromocytoma. Endocr Relat Cancer, 17: 743-756.

145.

Ziegler CG, Brown JW, Schally AV, Erler A, Gebauer L, Treszl A, Young L, Fishman LM, Engel JB, Willenberg HS, Petersenn S, Eisenhofer G, Ehrhart-Bornstein M, Bornstein SR. (2009) Expression of neuropeptide hormone receptors in human adrenal tumors and cell lines: antiproliferative effects of peptide analogues. Proc Natl Acad Sci U S A, 106: 15879-15884.

146.

Björklund P, Cupisti K, Fryknäs M, Isaksson A, Willenberg HS, Akerström G, Hellman P, Westin G. (2010) Stathmin as a marker for malignancy in pheochromocytomas. Exp Clin Endocrinol Diabetes, 118: 27-30.

147.

Suh I, Shibru D, Eisenhofer G, Pacak K, Duh QY, Clark OH, Kebebew E. (2009) Candidate genes associated with malignant pheochromocytomas by genome-wide expression profiling. Ann Surg, 250: 983990.

148.

Dannenberg H, Speel EJ, Zhao J, Saremaslani P, van Der Harst E, Roth J, Heitz PU, Bonjer HJ, Dinjens WN, Mooi WJ, Komminoth P, de Krijger RR. (2000) Losses of chromosomes 1p and 3q are early genetic events in the development of sporadic pheochromocytomas. Am J Pathol, 157: 353-359.

149.

Edström E, Mahlamäki E, Nord B, Kjellman M, Karhu R, Höög A, Goncharov N, Teh BT, Bäckdahl M, Larsson C. (2000) Comparative genomic hybridization reveals frequent losses of chromosomes 1p and 3q in pheochromocytomas and abdominal paragangliomas, suggesting a common genetic etiology. Am J Pathol, 156: 651-659.

137

150.

Benn DE, Dwight T, Richardson AL, Delbridge L, Bambach CP, Stowasser M, Gordon RD, Marsh DJ, Robinson BG. (2000) Sporadic and familial pheochromocytomas are associated with loss of at least two discrete intervals on chromosome 1p. Cancer Res, 60: 7048-7051.

151.

Kino M, Suzuki H, Naya Y, Komiya A, Imamoto T, Ichikawa T, Tatsuno I, Ishida H, Shindo T, Seki N. (2007) Comparative genomic hybridization reveals frequent losses of 1p and 3q in benign pheochromocytomas of Japanese patients. Cancer Genet Cytogenet, 175: 169-172.

152.

August C, August K, Schroeder S, Bahn H, Hinze R, Baba HA, Kersting C, Buerger H. (2004) CGH and CD 44/MIB-1 immunohistochemistry are helpful to distinguish metastasized from nonmetastasized sporadic pheochromocytomas. Mod Pathol, 17: 1119-1128.

153.

Patócs A, Karádi E, Tóth M, Varga I, Szűcs N, Balogh K, Majnik J, Gláz E, Rácz K. (2004) Clinical and biochemical features of sporadic and hereditary phaeochromocytomas: an analysis of 41 cases investigated in a single endocrine centre. Eur J Cancer Prev, 13: 403-409.

154.

Gergics P, Patócs A, Tóth M, Igaz P, Szűcs N, Likó I, Fazekas F, Szabó I, Kovács B, Gláz E, Rácz K. (2009) Germline VHL gene mutations in Hungarian families with von Hippel-Lindau disease and patients with apparently sporadic unilateral pheochromocytomas. Eur J Endocrinol, 161: 495-502.

155.

Livak KJ, Schmittgen TD. (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-∆∆CT Method. Methods, 25: 402-408.

156.

Zhang X, Chen J, Radcliffe T, Lebrun DP, Tron VA, Feilotter H. (2008) An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples. J Mol Diagn, 10: 513-519.

157.

Subramanian A, Tamayo P, Mootha VK, Mukherjee S, Ebert BL, Gillette MA, Paulovich A, Pomeroy SL, Golub TR, Lander ES, Mesirov JP. (2005) Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A, 102: 15545-15550.

158.

Ribeiro-Silva A, Zhang H, Jeffrey SS. (2007) RNA extraction from ten year old formalin-fixed paraffinembedded breast cancer samples: a comparison of column purification and magnetic bead-based technologies. BMC Mol Biol, 8: 118.

159.

Liang Y, Ridzon D, Wong L, Chen C. (2007) Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics, 8: 166.

160.

Davoren PA, McNeill RE, Lowery AJ, Kerin MJ, Miller N. (2008) Identification of suitable endogenous control genes for microRNA gene expression analysis in human breast cancer. BMC Mol Biol, 9: 76.

161.

Gee HE, Buffa FM, Camps C, Ramachandran A, Leek R, Taylor M, Patil M, Sheldon H, Betts G, Homer J, West C, Ragoussis J, Harris AL. (2011) The small-nucleolar RNAs commonly used for microRNA normalisation correlate with tumour pathology and prognosis. Br J Cancer, 104: 1168-1177.

162.

Resnick KE, Alder H, Hagan JP, Richardson DL, Croce CM, Cohn DE. (2009) The detection of differentially expressed microRNAs from the serum of ovarian cancer patients using a novel real-time PCR platform. Gynecologic Oncology, 112: 55-59.

163.

Mackay IM, Arden KE, Nitsche A. (2002) Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Research, 30: 12921305.

138

164.

Wang Y, Barbacioru C, Hyland F, Xiao W, Hunkapiller KL, Blake J, Chan F, Gonzalez C, Zhang L, Samaha RR. (2006) Large scale real-time PCR validation on gene expression measurements from two commercial long-oligonucleotide microarrays. BMC Genomics, 7: 59.

165.

Joglekar MV, Parekh VS, Hardikar AA. (2007) New pancreas from old: microregulators of pancreas regeneration. Trends Endocrinol Metab, 18: 393-400.

166.

Joglekar MV, Joglekar VM, Hardikar AA. (2009) Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development. Gene Expr Patterns, 9: 109-113.

167.

Bolmeson C, Esguerra JL, Salehi A, Speidel D, Eliasson L, Cilio CM. (2011) Differences in islet-enriched miRNAs in healthy and glucose intolerant human subjects. Biochem Biophys Res Commun, 404: 16-22.

168.

El Ouaamari A, Baroukh N, Martens GA, Lebrun P, Pipeleers D, van Obberghen E. (2008) miR-375 targets 3'-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 and regulates glucose-induced biological responses in pancreatic beta-cells. Diabetes, 57: 2708-2717.

169.

Szafranska AE, Davison TS, John J, Cannon T, Sipos B, Maghnouj A, Labourier E, Hahn SA. (2007) MicroRNA expression alterations are linked to tumorigenesis and non-neoplastic processes in pancreatic ductal adenocarcinoma. Oncogene, 26: 4442-4452.

170.

Tsukamoto Y, Nakada C, Noguchi T, Tanigawa M, Nguyen LT, Uchida T, Hijiya N, Matsuura K, Fujioka T, Seto M, Moriyama M. (2010) MicroRNA-375 is downregulated in gastric carcinomas and regulates cell survival by targeting PDK1 and 14-3-3zeta. Cancer Res, 70: 2339-2349.

171.

Mathé EA, Nguyen GH, Bowman ED, Zhao Y, Budhu A, Schetter AJ, Braun R, Reimers M, Kumamoto K, Hughes D, Altorki NK, Casson AG, Liu CG, Wang XW, Yanaihara N, Hagiwara N, Dannenberg AJ, Miyashita M, Croce CM, Harris CC. (2009) MicroRNA expression in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the esophagus: associations with survival. Clin Cancer Res, 15: 6192-6200.

172.

Hui AB, Lenarduzzi M, Krushel T, Waldron L, Pintilie M, Shi W, Perez-Ordonez B, Jurisica I, O'Sullivan B, Waldron J, Gullane P, Cummings B, Liu FF. (2010) Comprehensive MicroRNA profiling for head and neck squamous cell carcinomas. Clin Cancer Res, 16: 1129-1139.

173.

Schaefer A, Jung M, Mollenkopf HJ, Wagner I, Stephan C, Jentzmik F, Miller K, Lein M, Kristiansen G, Jung K. (2010) Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer, 126: 1166-1176.

174.

de Souza Rocha Simonini P, Breiling A, Gupta N, Malekpour M, Youns M, Omranipour R, Malekpour F, Volinia S, Croce CM, Najmabadi H, Diederichs S, Sahin O, Mayer D, Lyko F, Hoheisel JD, Riazalhosseini Y. (2010) Epigenetically deregulated microRNA-375 is involved in a positive feedback loop with estrogen receptor alpha in breast cancer cells. Cancer Res, 70: 9175-9184.

175.

Li LM, Hu ZB, Zhou ZX, Chen X, Liu FY, Zhang JF, Shen HB, Zhang CY, Zen K. (2010) Serum microRNA profiles serve as novel biomarkers for HBV infection and diagnosis of HBV-positive hepatocarcinoma. Cancer Res, 70: 9798-9807.

176.

Ladeiro Y, Couchy G, Balabaud C, Bioulac-Sage P, Pelletier L, Rebouissou S, Zucman-Rossi J. (2008) MicroRNA profiling in hepatocellular tumors is associated with clinical features and oncogene/tumor suppressor gene mutations. Hepatology, 47: 1955-1963.

139

177.

Kim TH, Kim YK, Kwon Y, Heo JH, Kang H, Kim G, An HJ. (2010) Deregulation of miR-519a, 153, and 485-5p and its clinicopathological relevance in ovarian epithelial tumours. Histopathology, 57: 734-743.

178.

Qiang R, Wang F, Shi LY, Liu M, Chen S, Wan HY, Li YX, Li X, Gao SY, Sun BC, Tang H. (2011) Plexin-B1 is a target of miR-214 in cervical cancer and promotes the growth and invasion of HeLa cells. Int J Biochem Cell Biol. 2011 Jan 7. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 21216304.

179.

Yang Z, Chen S, Luan X, Li Y, Liu M, Li X, Liu T, Tang H. (2009) MicroRNA-214 is aberrantly expressed in cervical cancers and inhibits the growth of HeLa cells. IUBMB Life. 61: 1075-1082.

180.

Zhang XJ, Ye H, Zeng CW, He B, Zhang H, Chen YQ. (2010) Dysregulation of miR-15a and miR-214 in human pancreatic cancer. J Hematol Oncol, 3: 46.

181.

Scapoli L, Palmieri A, Lo Muzio L, Pezzetti F, Rubini C, Girardi A, Farinella F, Mazzotta M, Carinci F. (2010) MicroRNA expression profiling of oral carcinoma identifies new markers of tumor progression. Int J Immunopathol Pharmacol, 23: 1229-1234.

182.

Yang H, Kong W, He L, Zhao JJ, O'Donnell JD, Wang J, Wenham RM, Coppola D, Kruk PA, Nicosia SV, Cheng JQ. (2008) MicroRNA expression profiling in human ovarian cancer: miR-214 induces cell survival and cisplatin resistance by targeting PTEN. Cancer Res, 68: 425-433.

183.

Ueda T, Volinia S, Okumura H, Shimizu M, Taccioli C, Rossi S, Alder H, Liu CG, Oue N, Yasui W, Yoshida K, Sasaki H, Nomura S, Seto Y, Kaminishi M, Calin GA, Croce CM. (2010) Relation between microRNA expression and progression and prognosis of gastric cancer: a microRNA expression analysis. Lancet Oncol, 11: 136-146.

184.

Tap WD, Eilber FC, Ginther C, Dry SM, Reese N, Barzan-Smith K, Chen HW, Wu H, Eilber FR, Slamon DJ, Anderson L. (2011) Evaluation of well-differentiated/de-differentiated liposarcomas by high-resolution oligonucleotide array-based comparative genomic hybridization. Genes Chromosomes Cancer, 50: 95-112.

185.

Magrelli A, Azzalin G, Salvatore M, Viganotti M, Tosto F, Colombo T, Devito R, Di Masi A, Antoccia A, Lorenzetti S, Maranghi F, Mantovani A, Tanzarella C, Macino G, Taruscio D. (2009) Altered microRNA Expression Patterns in Hepatoblastoma Patients. Transl Oncol, 2: 157-163.

186.

Finnerty JR, Wang WX, Hébert SS, Wilfred BR, Mao G, Nelson PT. The miR-15/107 group of microRNA genes: evolutionary biology, cellular functions, and roles in human diseases. (2010) J Mol Biol, 402: 491509.

187.

Sarkar S, Dey BK, Dutta A. (2010) MiR-322/424 and -503 are induced during muscle differentiation and promote cell cycle quiescence and differentiation by down-regulation of Cdc25A. Mol Biol Cell, 21: 21382149.

188.

Forrest AR, Kanamori-Katayama M, Tomaru Y, Lassmann T, Ninomiya N, Takahashi Y, de Hoon MJ, Kubosaki A, Kaiho A, Suzuki M, Yasuda J, Kawai J, Hayashizaki Y, Hume DA, Suzuki H. (2010) Induction of microRNAs, mir-155, mir-222, mir-424 and mir-503, promotes monocytic differentiation through combinatorial regulation. Leukemia, 24: 460-466.

189.

Jiang Q, Feng MG, Mo YY. (2009) Systematic validation of predicted microRNAs for cyclin D1. BMC Cancer, 9: 194.

140

190.

Zhao JJ, Yang J, Lin J, Yao N, Zhu Y, Zheng J, Xu J, Cheng JQ, Lin JY, Ma X. (2009) Identification of miRNAs associated with tumorigenesis of retinoblastoma by miRNA microarray analysis. Childs Nerv Syst, 25: 13-20.

191.

Wong TS, Liu XB, Wong BY, Ng RW, Yuen AP, Wei WI. (2008) Mature miR-184 as Potential Oncogenic microRNA of Squamous Cell Carcinoma of Tongue. Clin Cancer Res, 14: 2588-2592.

192.

Lin SL, Chiang A, Chang D, Ying SY. (2008) Loss of mir-146a function in hormone-refractory prostate cancer. RNA, 14: 417-424.

193.

Zhou L, Chen J, Li Z, Li X, Hu X, Huang Y, Zhao X, Liang C, Wang Y, Sun L, Shi M, Xu X, Shen F, Chen M, Han Z, Peng Z, Zhai Q, Chen J, Zhang Z, Yang R, Ye J, Guan Z, Yang H, Gui Y, Wang J, Cai Z, Zhang X. (2010) Integrated profiling of microRNAs and mRNAs: microRNAs located on Xq27.3 associate with clear cell renal cell carcinoma. PLoS One, 5: e15224.

194.

Chen Y, Stallings RL. (2007) Differential patterns of microRNA expression in neuroblastoma are correlated with prognosis, differentiation, and apoptosis. Cancer Res, 67: 976-983.

195.

Foley NH, Bray IM, Tivnan A, Bryan K, Murphy DM, Buckley PG, Ryan J, O'Meara A, O'Sullivan M, Stallings RL. (2010) MicroRNA-184 inhibits neuroblastoma cell survival through targeting the serine/threonine kinase AKT2. Mol Cancer, 9: 83.

196.

Malzkorn B, Wolter M, Liesenberg F, Grzendowski M, Stühler K, Meyer HE, Reifenberger G. (2010) Identification and functional characterization of microRNAs involved in the malignant progression of gliomas. Brain Pathol, 20: 539-550.

197.

Kjellman M, Kallioniemi OP, Karhu R, Höög A, Farnebo LO, Auer G, Larsson C, Bäckdahl M. (1996) Genetic aberrations in adrenocortical tumors detected using comparative genomic hybridization correlate with tumor size and malignancy. Cancer Res, 56: 4219-4223.

198.

Bernini GP, Moretti A, Bonadio AG, Menicagli M, Viacava P, Naccarato AG, Iacconi P, Miccoli P, Salvetti A. (2002) Angiogenesis in human normal and pathologic adrenal cortex. J Clin Endocrinol Meta, 87: 4961-4965.

199.

Huang X, Le QT, Giaccia AJ. (2010) MiR-210-micromanager of the hypoxia pathway. Trends Mol Med, 16: 230-237.

200.

Roman S. (2006) Adrenocortical carcinoma. Curr Opin Oncol, 18: 36-42.

201.

Soon PS, Tacon LJ, Gill AJ, Bambach CP, Sywak MS, Campbell PR, Yeh MW, Wong SG, Clifton-Bligh RJ, Robinson BG, Sidhu SB. (2009) MiR-195 and miR-483-5p identified as predictors of poor prognosis in adrenocortical cancer. Clin Cancer Res, 15: 7684-7692.

202.

Doghman M, El Wakil A, Cardinaud B, Thomas E, Wang J, Zhao W, Peralta-Del Valle MHC, Figueiredo BC, Zambetti GP, Lalli E. (2010) Regulation of insulin-like growth factor–mammalian target of rapamycin signaling by microRNA in childhood adrenocortical tumors. Cancer Res, 70: 4666–4675.

203.

Patterson EE, Holloway AK, Weng J, Fojo T, Kebebew E. (2011) MicroRNA profiling of adrenocortical tumors reveals miR-483 as a marker of malignancy. Cancer, DOI: 10.1002/cncr.25724.

141

204.

Schmitz KJ, Helwig J, Bertram S, Sheu SY, Suttorp AC, Seggewiß J, Willscher E, Walz MK, Worm K, Schmid KW. (2011) Differential expression of microRNA-675, microRNA-139-3p and microRNA-335 in benign and malignant adrenocortical tumours. J Clin Pathol. 2011 Apr 6. , PubMed PMID: 21471143.

205.

Tacon LJ, Soon PS, Gill AJ, Chou AS, Clarkson A, Botling J, Stalberg PL, Skogseid BM, Robinson BG, Sidhu SB, Clifton-Bligh RJ. (2009) The glucocorticoid receptor is overexpressed in malignant adrenocortical tumors. J Clin Endocrinol Metab, 94: 4591-4599.

206.

Gennarino VA, Sardiello M, Avellino R, Meola N, Maselli V, Anand S, Cutillo L, Ballabio A, Banfi S. (2009) MicroRNA target prediction by expression analysis of host genes. Genome Res, 19: 481-490.

207.

Huang JC, Babak T, Corson TW, Chua G, Khan S, Gallie BL, Hughes TR, Blencowe BJ, Frey BJ, Morris QD. (2007) Using expression profiling data to identify human microRNA targets. Nat Methods, 4: 10451049.

208.

Molinari M. (2000) Cell cycle checkpoints and their inactivation in human cancer. Cell Prolif, 33: 261-274.

209.

Bourcigaux N, Gaston V, Logié A, Bertagna X, Le Bouc Y, Gicquel C. (2000) High expression of cyclin E and G1 CDK and loss of function of p57KIP2 are involved in proliferation of malignant sporadic adrenocortical tumors. J Clin Endocrinol Metab, 85: 322-330.

210.

Lombardi CP, Raffaelli M, Pani G, Maffione A, Princi P, Traini E, Galeotti T, Rossi ED, Fadda G, Bellantone R. (2006) Gene expression profiling of adrenal cortical tumors by cDNA macroarray analysis. Results of a preliminary study. Biomed Pharmacother, 60: 186-190.

211.

Egloff AM, Vella LA, Finn OJ. (2006) Cyclin B1 and other cyclins as tumor antigens in immunosurveillance and immunotherapy of cancer. Cancer Res, 66: 6-9.

212.

Brown JW, Prieto LM, Perez-Stable C, Montoya M, Cappell S, Fishman LM. (2008) Estrogen and progesterone lower cyclin B1 and D1 expression, block cell cycle in G2/M, and trigger apoptosis in human adrenal carcinoma cell cultures. Horm Metab Res, 40: 306-310.

213.

Cerquetti L, Bucci B, Marchese R, Misiti S, De Paula U, Miceli R, Muleti A, Amendola D, Piergrossi P, Brunetti E, Toscano V, Stigliano A. (2008) Mitotane increases the radiotherapy inhibitory effect and induces G2-arrest in combined treatment on both H295R and SW13 adrenocortical cell lines. Endocr Relat Cancer, 15: 623-634.

214.

Yan X, Chua MS, He J, So SK. (2008) Small interfering RNA targeting CDC25B inhibits liver tumor growth in vitro and in vivo. Mol Cancer, 7: 19.

215.

Mani A, Gelmann EP (2005) The ubiquitin-proteasome pathway and its role in cancer. J Clin Oncol, 23: 4776-4789.

216.

Taylor WR, Stark GR. (2001) Regulation of the G2/M transition by p53. Oncogene, 20: 1803-1815.

217.

Takahashi T, Suzuki M, Shigematsu H, Shivapurkar N, Echebiri C, Nomura M, Stastny V, Augustus M, Wu CW, Wistuba II, Meltzer SJ, Gazdar AF. (2005) Aberrant methylation of Reprimo in human malignancies. Int J Cancer, 115: 503-510.

218.

Sun F, Fu H, Liu Q, Tie Y, Zhu J, Xing R, Sun Z, Zheng X. (2008) Downregulation of CCND1 and CDK6 by miR-34a induces cell cycle arrest. FEBS Lett, 582: 1564-1568.

142

219.

Schultz J, Lorenz P, Gross G, Ibrahim S, Kunz M. (2008) MicroRNA let-7b targets important cell cycle molecules in malignant melanoma cells and interferes with anchorage-independent growth. Cell Res, 18: 549-557.

220.

Medina R, Zaidi SK, Liu CG, Stein JL, van Wijnen AJ, Croce CM, Stein GS. (2008) MicroRNAs 221 and 222 bypass quiescence and compromise cell survival. Cancer Res, 68: 2773-2780.

221.

Mertens-Talcott SU, Chintharlapalli S, Li X, Safe S. (2007) The oncogenic microRNA-27a targets genes that regulate specificity protein transcription factors and the G2-M checkpoint in MDA-MB-231 breast cancer cells. Cancer Res, 67: 11001-11011.

222.

Doleshal M, Magotra AA, Choudhury B, Cannon BD, Labourier E, Szafranska AE. (2008) Evaluation and validation of total RNA extraction methods for microRNA expression analyses in formalin-fixed, paraffinembedded tissues. J Mol Diagn, 10: 203-211.

223.

Szafranska AE, Davison TS, Shingara J, Doleshal M, Riggenbach JA, Morrison CD, Jewell S, Labourier E. (2008) Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling. J Mol Diagn, 10: 415-423.

224.

Siebolts U, Varnholt H, Drebber U, Dienes HP, Wickenhauser C, Odenthal M. (2009) Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR. J Clin Pathol, 62: 84-88.

225.

Glud M, Klausen M, Gniadecki R, Rossing M, Hastrup N, Nielsen FC, Drzewiecki KT. (2009) MicroRNA expression in melanocytic nevi: the usefulness of formalin-fixed, paraffin-embedded material for miRNA microarray profiling. J Invest Dermatol, 129: 1219-1224.

226.

Nonn L, Vaishnav A, Gallagher L, Gann PH. (2010) mRNA and micro-RNA expression analysis in lasercapture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials. Exp Mol Pathol, 88: 45-51.

227.

Lin M, Chen W, Huang J, Gao H, Ye Y, Song Z, Shen X. (2011) MicroRNA expression profiles in human colorectal cancers with liver metastases. Oncol Rep, 25: 739-747.

228.

Wong TS, Liu XB, Wong BY, Ng RW, Yuen AP, Wei WI. (2008) Mature miR-184 as Potential Oncogenic microRNA of Squamous Cell Carcinoma of Tongue. Clin Cancer Res, 14: 2588-2592.

229.

Liu X, Chen Z, Yu J, Xia J, Zhou X (2009) MicroRNA Profiling and Head and Neck Cancer. Comp Funct Genomics, 2009: 837514.

230.

Mascaux C, Laes JF, Anthoine G, Haller A, Ninane V, Burny A, Sculier JP (2009) Evolution of microRNA expression during human bronchial squamous carcinogenesis. Eur Respir J, 33: 352-359.

231.

Wong CC, Wong CM, Tung EK, Au SL, Lee JM, Poon RT, Man K, Ng IO. (2011) The microRNA miR139 suppresses metastasis and progression of hepatocellular carcinoma by down-regulating Rho-kinase 2. Gastroenterology, 140: 322-331.

232.

Guo J, Miao Y, Xiao B, Huan R, Jiang Z, Meng D, Wang Y (2008) Differential expression of microRNA species in human gastric cancer versus non-tumorous tissues. J Gastroenterol Hepatol, 24: 652-657.

233.

Yoshino H, Chiyomaru T, Enokida H, Kawakami K, Tatarano S, Nishiyama K, Nohata N, Seki N, Nakagawa M. (2011) The tumour-suppressive function of miR-1 and miR-133a targeting TAGLN2 in bladder cancer. Br J Cancer, 104: 808-818.

143

234.

Hiroki E, Akahira J, Suzuki F, Nagase S, Ito K, Suzuki T, Sasano H, Yaegashi N (2010) Changes in microRNA expression levels correlate with clinicopathological features and prognoses in endometrial serous adenocarcinomas. Cancer Sci, 101: 241-249.

235.

Fridman E, Dotan Z, Barshack I, David MB, Dov A, Tabak S, Zion O, Benjamin S, Benjamin H, Kuker H, Avivi C, Rosenblatt K, Polak-Charcon S, Ramon J, Rosenfeld N, Spector Y. (2010) Accurate molecular classification of renal tumors using microRNA expression. J Mol Diagn, 12: 687-696.

236.

Hasseine LK, Hinault C, Lebrun P, Gautier N, Paul-Bellon R, Van Obberghen E. (2009) miR-139 impacts FoxO1 action by decreasing FoxO1 protein in mouse hepatocytes. Biochem Biophys Res Commun, 390: 1278-1282.

237.

Redell JB, Liu Y, Dash PK. (2009) Traumatic brain injury alters expression of hippocampal microRNAs: potential regulators of multiple pathophysiological processes. J Neurosci Res, 87: 1435-1448.

238.

Redell JB, Moore AN, Ward NH 3rd, Hergenroeder GW, Dash PK. (2010) Human traumatic brain injury alters plasma microRNA levels. J Neurotrauma, 27: 2147-2156.

239.

Muiños-Gimeno M, Guidi M, Kagerbauer B, Martín-Santos R, Navinés R, Alonso P, Menchón JM, Gratacòs M, Estivill X, Espinosa-Parrilla Y. (2009) Allele variants in functional MicroRNA target sites of the neurotrophin-3 receptor gene (NTRK3) as susceptibility factors for anxiety disorders. Hum Mutat, 30: 1062-1071.

240.

Fanger GR, Jones JR, Maue RA. (1995) Differential regulation of neuronal sodium channel expression by endogenous and exogenous tyrosine kinase receptors expressed in rat pheochromocytoma cells. J Neurosci, 15: 202-213.

241.

Gui J, Tian Y, Wen X, Zhang W, Zhang P, Gao J, Run W, Tian L, Jia X, Gao Y. (2011) Serum microRNA characterization identifies miR-885-5p as a potential marker for detecting liver pathologies. Clin Sci (Lond), 120: 183-193.

242.

Guled M, Lahti L, Lindholm PM, Salmenkivi K, Bagwan I, Nicholson AG, Knuutila S. (2009) CDKN2A, NF2, and JUN are dysregulated among other genes by miRNAs in malignant mesothelioma -A miRNA microarray analysis. Genes Chromosomes Cancer, 48: 615-623.

243.

Afanasyeva EA, Mestdagh P, Kumps C, Vandesompele J, Ehemann V, Theissen J, Fischer M, Zapatka M, Brors B, Savelyeva L, Sagulenko V, Speleman F, Schwab M, Westermann F. (2011) MicroRNA miR-8855p targets CDK2 and MCM5, activates p53 and inhibits proliferation and survival. Cell Death Differ. 2011 Jan 14. PubMed PMID: 21233845.

244.

Lui WO, Chen J, Gläsker S, Bender BU, Madura C, Khoo SK, Kort E, Larsson C, Neumann HP, Teh BT. (2002) Selective loss of chromosome 11 in pheochromocytomas associated with the VHL syndrome. Oncogene, 21: 1117-1122.

245.

Waltering KK, Porkka KP, Jalava SE, Urbanucci A, Kohonen PJ, Latonen LM, Kallioniemi OP, Jenster G, Visakorpi T. (2011) Androgen regulation of micro-RNAs in prostate cancer. Prostate, 71: 604-614. doi: 10.1002/pros.21276.

144

246.

Meyer-Rochow GY, Jackson NE, Conaglen JV, Whittle DE, Kunnimalaiyaan M, Chen H, Westin G, Sandgren J, Stålberg P, Khanafshar E, Shibru D, Duh QY, Clark OH, Kebebew E, Gill AJ, Clifton-Bligh R, Robinson BG, Benn DE, Sidhu SB. (2010) MicroRNA profiling of benign and malignant pheochromocytomas identifies novel diagnostic and therapeutic targets. Endocr Relat Cancer, 17: 835-846.

247.

Juryńczyk M, Selmaj K. (2010) Notch: a new player in MS mechanisms. J Neuroimmunol, 218: 3-11.

248.

Adler JT, Hottinger DG, Kunnimalaiyaan M, Chen H. (2008) Histone deacetylase inhibitors upregulate Notch-1 and inhibit growth in pheochromocytoma cells. Surgery, 144: 956-961.

249.

Yanamadala V, Negoro H, Denker BM. (2009) Heterotrimeric G proteins and apoptosis: intersecting signaling pathways leading to context dependent phenotypes. Curr Mol Med, 9: 527-545.

145

XI.

AZ

ÉRTEKEZÉS

TÉMÁJÁHOZ

KAPCSOLÓDÓ

KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE 1. Tömböl Z, Szabó P, Rácz K, Tulassay Z, Igaz P. A mikroRNS-ek jelentősége daganatos betegségekben. Orvosi Hetilap, 2007, 148: 1135-1141. 2. Tömböl Z, Szabó PM., Molnár V, Wiener Z, Tölgyesi G, Horányi J, Riesz P, Reismann P, Patócs A, Likó I, Gaillard RC, Falus A, Rácz K, Igaz P. Integrative molecular bioinformatics study of human adrenocortical tumors: microRNA, tissue-specific target prediction, and pathway analysis. Endocrine-Related Cancer, 2009, 16: 895-906. IF: 4.282 3. Tömböl Z, Éder K, Kovács A, Szabó PM, Kulka J, Likó I, Zalatnai A, Rácz G, Tóth M, Patócs A, Falus A, Rácz K, Igaz P. MicroRNA expression profiling in benign (sporadic and hereditary) and recurring adrenal pheochromocytomas. Modern Pathology, 2010, 23: 1583-1595. IF (2009): 4.406 4. Szabó PM, Tömböl Z, Molnár V, Falus A, Rácz K, Igaz P. MicroRNA Target Prediction: Problems and possible solutions. Current Bioinformatics, 2010, 5: 81-88. IF (2009): 1.688. Megosztott elsőszerzős cikk. 5. Tömböl Z, Szabó PM, Patócs A, Rácz K, Igaz P. Differences in MicroRNA expression profiles of adrenocortical tumors (Letter). Clinical Cancer Research, 2010, 16: 2915. (IF (2009): 6.747)

146

XII.

AZ

ÉRTEKEZÉS

TÉMÁJÁHOZ

SZOROSAN

NEM

KAPCSOLÓDÓ KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE 1. Halász Z, Tőke J, Patócs A, Bertalan R, Tömböl Z, Sallai Á, Hosszú É, Muzsnai Á, Kovács L, Sólyom J, Fekete G, Rácz K. High prevalence of PROP1 gene mutations in Hungarian patients with childhood onset combined anterior pituitary hormone deficiency. Endocrine, 2006, 30: 255-260. IF: 1.805 2. Halász Z, Bertalan R, Tőke J, Tömböl Z, Losonczi L, Patócs A, Sólyom J, Fekete G, Rácz K. A többszörös hypophysishormon-hiány genetikai okai. A hypophysis transzkripciós faktorok szerepe. Magyar Belorvosi Archívum, 2007, 60: 419-424. 3.

Igaz P, Müllner K, Hargitai B, Igaz I, Tömböl Z, Rácz K, Tulassay Z. Marked chromogranin A elevation in a patient with bilateral adrenal incidentalomas, and its rapid normalization after discontinuation of proton pump inhibitor therapy - letter. Clinical Endocrinology, 2007, 67: 805-806. (IF: 3.370)

4. Igaz P, Tömböl Z, Szabó PM, Likó I, Rácz K. Steroid biosynthesis inhibitors in the therapy of hypercortisolism: theory and practice (Review). Current Medicinal Chemistry, 2008, 15: 2734-2747. IF: 4.823 5. Szabó PM, Wiener Z, Tömböl Z, Kovács A, Pócza P, Horányi J, Kulka J, Riesz P, Tóth M, Patócs A, Gaillard RC, Falus A, Rácz K, Igaz P. Differences in the expression of histamine-related genes and proteins in normal human adrenal cortex and adrenocortical tumors. Virchows Archiv, 2009, 455: 133-142. IF: 2.305 6. Szabó PM, Tamási V, Molnár V, Andrásfalvy M, Tömböl Z, Farkas R, Kövesdi K, Patócs A, Tóth M, Szalai C, Falus A, Rácz K, Igaz P. Meta-analysis of adrenocortical tumour genomics data: novel pathogenic pathways revealed. Oncogene, 2010, 29: 31633172. IF (2009): 7.135 7. Szabó D, Zsippai A, Bendes M, Tömböl Z, Szabó PM, Rácz K, Igaz P. A mellékvesekéreg carcinoma molekuláris patogenezise. Orvosi Hetilap, 2010, 51: 11631170.

147

XIII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Munkám elkészítéséhez nyújtott segítségükért köszönetemet szeretném kifejezni: • Programvezetőmnek, Prof. Dr. Rácz Károlynak, aki harmadéves orvostanhallgató koromtól kezdve lehetővé tette, hogy bekapcsolódjak a II. sz. Belgyógyászati Klinika Molekuláris Biológiai Laboratóriumában folyó tudományos kutatómunkába, és aki mindvégig figyelemmel kísérte és támogatta tudományos diákköri és PhD hallgatói tevékenységemet. • Témavezetőmnek, Dr. Igaz Péter egyetemi adjunktusnak, aki töretlen lelkesedésével és magas színvonalú szakmai tapasztalatával irányította és segítette munkámat. • Prof. Dr. Falus Andrásnak, aki lehetővé tette, hogy kísérletes munkámat a Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézetében végezzem. • Dr. Patócs Attila PhD tudományos munkatársnak, aki TDK hallgató koromtól kezdve mindvégig hasznos szakmai tanácsokkal látott el. • Dr. Szabó Péter Márton, valamint a Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézetéből Dr. Molnár Viktor PhD hallgatóknak, akik elsősorban a statisztikai elemzések és bioinformatikai módszerek kidolgozásában nyújtottak segítséget. • Édesapámnak, Tömböl Tamás okleveles villamosmérnöknek, aki az adatbáziskezelő szoftver létrehozásával munkám bioinformatikai részét nagy mértékben megkönnyítette. • Dr. Likó Istvánnak, aki biztosította a TaqMan-kártyás mérések elvégzéséhez szükséges feltételeket. • Dr. Éder Katalinnak, Dr. Tölgyesi Gergelynek és Pálóczi Krisztinának a microarray vizsgálatok kivitelezéséért és statisztikai elemzéséért. • Dr. Horányi Jánosnak, Dr. Riesz Péternek, Dr. Kovács Attilának, Prof. Dr. Kulka Janinának, Dr. Zalatnai Attilának, Dr. Rácz Gergelynek valamint a II. sz. Belgyógyászati Klinika endokrinológus szakorvosainak, akik a sebészeti, patológiai és klinikai hátteret biztosították. • Krauszné Vaczula Mária asszisztensnek, aki megismertetett az alapvető molekuláris technikákkal. A II. sz. Belgyógyászati Klinika Molekuláris Biológiai Laboratóriumában dolgozó valamennyi PhD és TDK hallgatónak, akik segítségükkel megkönnyítették munkámat, továbbá a Klinika összes munkatársának, akik barátsággal vettek körül. Vőlegényemnek, Kisfiamnak, Szüleimnek és Testvéremnek a sok szeretetért, türelemért és biztatásért, amivel munkám során mindvégig támogattak.

148