Humán megbetegedéseket okozó Escherichia coli törzsek patogenetikai jellemzése Doktori (Ph.D.) értekezés
Mag Tünde Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola
Témavezetők: Dr. Rozgonyi Ferenc egyetemi tanár, az orvostudományok doktora Dr. Szabó Dóra, egyetemi adjunktus, Ph.D.
Hivatalos bírálók: Dr. Kocsis Béla, egyetemi docens, az orvostudományok kandidátusa Dr. Miheller Pál, egyetemi adjunktus, Ph.D
Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Rácz Károly, egyetemi tanár, az orvostudományok doktora
Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Emődy Levente professzor emeritus, az orvostudományok doktora Dr. Veres Gábor egyetemi adjunktus, Ph.D.
Budapest 2009
1.
TARTALOMJEGYZÉK
1.
TARTALOMJEGYZÉK .......................................................................................... 2
2.
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE................................................................................... 5
3.
BEVEZETÉS............................................................................................................ 7
3.1. Általános bevezető............................................................................................ 7 3.2. Biokémiai tulajdonságok .................................................................................. 7 3.2.1. Szerotipizálás............................................................................................ 8 3.3. Escherichia coli szerepe a humán megbetegedésekben ................................... 8 3.4. A patogén E. coli törzsek csoportosítása ........................................................ 10 3.5. Hasmenést okozó enterovirulens E. coli csoportok kimutatása, a diagnosztika nehézségei................................................................................................................... 11 3.5.1. Virulencia jegyeken alapuló fenotípusos vizsgálatok ............................ 11 3.5.2. Molekuláris kimutatási lehetőségek ....................................................... 12 3.5.3. Genotipizálás .......................................................................................... 13 3.5.4. Általánosságok az enterális megbetegdést okozó E. coli törzsek virulenciájával kapcsolatban................................................................................... 13 3.5.5. Enterohemorrágiás és verotoxin termelő E. coli (EHEC, VTEC).......... 15 3.5.5.1. Járványügyi jelentőség ................................................................... 16 3.5.5.2. Klinikai vonatkozások .................................................................... 18 3.5.5.3. Patogenezis, virulencia markerek ................................................... 19 3.5.5.4. Diagnózis és laboratóriumi detektálás............................................ 21 3.5.5.5. Molekuláris kimutatási lehetőségek ............................................... 22 3.5.5.6. Szerodiagnózis................................................................................ 23 3.5.6. Enterotoxikus E. coli (ETEC)................................................................. 23 3.5.6.1. Klinikai vonatkozások .................................................................... 24 3.5.6.2. Patogenezis ..................................................................................... 24 3.5.6.3. Detektálás és diagnózis................................................................... 25 3.5.7. Enteropatogén E. coli (EPEC) ................................................................ 26 3.5.7.1. Klinikai vonatkozások .................................................................... 26 3.5.7.2. Patogenezis ..................................................................................... 27 3.5.7.3. Detektálás és diagnózis................................................................... 28 3.5.8. Enteroinvazív E. coli (EIEC).................................................................. 28 3.5.8.1. Patogenezis ..................................................................................... 29 3.5.8.2. Detektálás és diagnózis................................................................... 29 3.5.9. Enteroaggregatív E. coli (EaggEC) ........................................................ 30 3.5.9.1. Patogenezis ..................................................................................... 30 3.5.9.2. Detektálás és diagnózis................................................................... 31 3.5.10. Diffúzan adheráló E. coli (DAEC) ......................................................... 31 3.5.10.1. Patogenezis ..................................................................................... 32 3.5.10.2. Detektálás és diagnózis................................................................... 32 3.5.11. Az extraintesztinális fertőzést okozó E. coli törzsek (ExPEC) .............. 32 3.5.11.1. Meningitis asszociált E. coli törzsek (MAEC) ............................... 32 3.5.11.2. Húgyúti megbetegedéseket E. coli törzsek (UPEC)....................... 33 3.6. ESBL-termelő E. coli törzsek......................................................................... 33 4. CÉLKITŰZÉSEK................................................................................................... 35
2
5.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK............................................................................. 37
5.1. Baktériumtörzsek............................................................................................ 37 5.2. Baktériumtörzsek fenotípusos vizsgálata ....................................................... 38 5.2.1. Tárgylemezagglutináció ......................................................................... 39 5.2.2. Csőagglutináció ...................................................................................... 39 5.2.3. Verotoxin ELISA.................................................................................... 40 5.2.4. VTEC reverz passzív latex agglutináció (VTEC-RPLA)....................... 41 5.3. Mikroplate módszer O szerocsoport meghatározására................................... 41 5.4. Antibiotikum érzékenységi vizsgálat.............................................................. 42 5.5. ESBL-termelő E. coli törzsek vizsgálata........................................................ 42 5.6. Polimeráz lánc reakció (polymerase chain reaction - PCR) ........................... 44 5.6.1. Intimin típus meghatározás..................................................................... 45 5.7. PCR-RFLP...................................................................................................... 48 5.7.1. vtx2c és vtx2d-O118 elkülönítése ............................................................. 48 5.7.2. A flagelláris H antigén tipizálás ............................................................. 49 5.8. Pulsed-field gélelektroforézis (PFGE)............................................................ 50 6. EREDMÉNYEK..................................................................................................... 51 6.1. Molekuláris (PCR) módszerek a patogén E. coli törzsek virulenciamarkereinek kimutatásában ........................................................................................ 51 6.1.1. IpaH PCR ............................................................................................... 51 6.1.2. Keratoconjuctivitis teszt eredménye....................................................... 52 6.1.3. ehlyA PCR beállítása .............................................................................. 53 6.1.4. vtx1 és vtx2 kimutatása PCR-el .............................................................. 54 6.1.5. Intimintípus meghatározás...................................................................... 55 6.2. Mikroplate agglutinációs módszer az O antigén meghatározásához.............. 55 6.3. A verotoxin termelő törzsek antibiotikum rezisztenciája ............................... 56 6.4. ESBL-termelő Escherichia coli törzsek vizsgálata ........................................ 56 6.5. PCR-RFLP módszerek ................................................................................... 58 6.5.1. H antigén tipizálás .................................................................................. 58 6.5.2. vtx2c és a vtx2d-O118 elkülönítése .......................................................... 59 6.6. A 2000-2006 között izolált verotoxin termelő E. coli törzsek patogenitási vizsgálata .................................................................................................................... 60 6.6.1. Antibiotikum érzékenység...................................................................... 62 6.6.2. PFGE típusok.......................................................................................... 62 7. MEGBESZÉLÉS .................................................................................................... 64 7.1. A 2000-2006 között izolált VTEC törzsek jellemzése ................................... 65 7.1.1. Korcsoport eloszlás, és a megbetegedések jellegének kapcsolata.......... 67 7.1.2. Az eredmények összevetése más országok adataival ............................. 68 7.1.3. Patotípusok ............................................................................................. 70 7.1.4. vtx2c,d elkülönítése ................................................................................ 70 7.1.5. PFGE vizsgálat ....................................................................................... 71 7.1.6. Antibiotikum érzékenység vizsgálata..................................................... 72 7.2. Mikroplate agglutinációs módszer ................................................................. 73 7.3. ESBL-termelő Escherichia coli törzsek tipizálása ......................................... 74 7.4. H antigén genotipizálása................................................................................. 77 8. ZÁRÓKÖVETKEZTETÉSEK, ÚJ EREDMÉNYEK............................................ 78
3
8.1. Molekuláris patogén marker vizsgálatok........................................................ 79 8.2. 2000-2006 között diagnosztizált VTEC törzsek molekuláris jellemzése....... 79 8.3. ESBL termelő E. coli törzsek szerotipizálása................................................. 80 9. ÖSSZEFOGLALÁS ............................................................................................... 81 10.
SUMMARY ....................................................................................................... 82
11.
IRODALOMJEGYZÉK ..................................................................................... 83
12.
SAJÁT PUBIKÁCIÓK JEGYZÉKE ............................................................... 100
12.1. A disszertációval kapcsolatos közlemények jegyzéke ............................. 100 12.2. A disszertáció témájával kapcsolodó előadások jegyzéke ....................... 100 12.3. A disszertáció témájával nem kapcsolatos publikációk jegyzéke ............ 101 12.4. A disszertáció témájával nem kapcsolatos előadások jegyzéke ............... 101 13. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS .......................................................................... 102
4
2. A/E AA CDC CNF DA DAEC DNS E. coli eae EAF EAggEC EAST EHEC ehly EIEC ELISA ENRL EPEC ESBL ETEC H HC HEp-2 HNCMB HUS inv Ipa K LA LEE LPS LT MAEC NM NT O OEK PCR PFGE RFLP
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE attaching / effacing (mikroboholy elhalást okozó kapcsolódás) aggregatív adherencia Centers for Disease Control and Prevention (USA egészségügyi hatóság) citotoxikus nekrotizáló faktor diffúz adherencia diffúzan adheráló Escherichia coli dezoxyribonukleinsav Escherichia coli az intimin génje EPEC adherens faktor enteroaggregatív Escherichia coli enteroaggregatív E. coli által termelt hőstabil toxin enterohemorrágiás E. coli az enterhemolizin génje enteroinvazív Escherichia coli Enzyme Linked Immunosorbent Assay Enterális megbetegedést okozó Aerob Baktériumok Nemzeti Referencia Laboratóriuma enteropatogén Escherichia coli extended spectrum β-lactamase (kiterjedt spektrumú β-laktamáz) enterotoxikus Escherichia coli flagelláris / csillóantigén hemorrágiás colitis humán epithetium szövettenyészet Orvosi Baktériumok Magyar Nemzeti Gyűjteménye hemolitikus urémiás szindróma az invazin génje invazivitásért felelős fehérjék kapszuláris / tokantigén lokalizált adherencia locus of enterocyte effacement lipopoliszacharid hőlabil enterotoxin meningitis asszociált Escherichia coli non-motile (nem mozgó) non typeable (nem tipizálható) szomatikus, lipopoliszacharid felületi antigén Országos Epidemiológiai Központ polymerase chain reaction (polimeráz láncreakció) pulsed-field gelelektroforesis (pulzáló mezejű gélelektroforézis) restriction fragment length polymorphism (restrikciós fragmenthossz polimorfizmus)
5
RPLA SMAC ST STX UPEC VT VTEC vtx
reverz passzív latex agglutináció D-szorbit tartalmú MacConkey agar hőstabil enterotoxin Shiga-like toxin uropatogén Escherichia coli verocytotoxin verotoxin termelő Escherichia coli a verocytotoxin génje
6
3.
BEVEZETÉS
3.1.
Általános bevezető
Az Escherichia coli (E. coli) a normál emberi aerob bélflóra domináló tagja. 1885ben Theodore Escherich (1857-1911), német gyermekorvos írta le először a baktériumot, amelyet később róla neveztek el. Azóta az Escherichia coli a széles körben végzett, beható vizsgálatok következtében az egyik legalaposabban megismert mikroorganizmusává vált. Az E. coli röviddel a születés után kolonizálja az újszülött béltraktusát. Ezt követően alakul ki egyfajta kölcsönös előnyös kapcsolat a gazdaszervezet és az E. coli baktériumok között, amely azután élethosszig megmarad. A törzsek többsége, melyek szimbiózisban élnek a kolonizált szervezettel; ezzel összhangban nem patogének, és a kofaktorok termelése mellett, akadályozzák a kórokozók
megtelepedését
is.
Bizonyos
esetekben
(a
legyengült,
vagy
immunszupresszált szervezetben, illetve sérült intesztinális barrier esetén) a bélben vagy a bélből kijutva különféle szervekben kóros folyamatok elindítói lehetnek a normál, akár az ún. „nem patogén” E. coli törzsek is.
3.2.
Biokémiai tulajdonságok
Az E. coli az Escherichia genus típus faja, amely az Enterobacteriaceae családon belül főleg mozgó, Gram-negatív baktériumokat foglal magában. Spórát nem képez, fakultatív anaerob, tokkal rendelkezhet. A klinikai mintákból aránylag könnyen kitenyészthető, hiszen 37 °C-on, aerob körülmények között a legtöbb általános és szelektív táptalajon szaporodik. Identifikálása általában biokémiai reakciók segítségével történik. Az E. coli törzsek laktóz-pozitivitásuk alapján sokszor már makroszkóposan is könnyen elkülöníthetőek a többi izolátumtól. Természetesen ezt csak nagy körültekintéssel szabad elfogadni, mert a coli törzseknek csak mintegy 90%-a laktóz pozitív, és vannak olyan hasmenést okozó csoportok is – ide tartoznak például az enteroinvazív E. coli-törzsek -, amelyek tipikusan laktóz negatívak. Az indol-teszt azonban az E. coli törzsek 99%-nál pozitív.
7
3.2.1.
Szerotipizálás
Az E. coli diagnosztika történetében a szerotipizálás a legfontosabb módszer. A specifikus virulencia faktorok kimutatását megelőzően, a hasmenést okozó törzsek szerotípusos vizsgálata volt a legmegfelelőbb eszköz arra, hogy a patogén és apatogén törzseket
elkülönítsék
egymástól.
1933-ban
Adam
gyűjtötte
össze,
az
ún.
„dispepsiecoli” jellemző szerotípusait (Adam 1927). Ez a kórokozónak azon csoportja volt, amely képes hasmenéses megbetegedést okozni gyermekekben. 1944-ben pedig Kauffman javasolt egy olyan sémát a szerológiai osztályozás céljára, amelyet módosításokkal ugyan - a mai napig használunk (Kauffman 1944). A módosított Kauffman táblázat szerint, az E. coli-t az O (szomatikus), H (flagelláris) és a K (kapszuláris) felszíni antigén profilja alapján tipizáljuk (Edwards, Ewing 1972). Jelenleg összesen 186 különböző O antigént ismerünk, melyek mindegyike egy-egy szerocsoportot határoz meg. Az O és a H antigének speciális kombinációja adja az izolátum szerotípusát (Orskov és Orskov 1982), amely asszociálhatnak bizonyos virulencia marker hordozással és meghatározott klinikai tünetegyüttesekkel (1. táblázat).
3.3.
Escherichia coli szerepe a humán megbetegedésekben
Ennek a fajnak bizonyos csoportjai súlyos megbetegedéseket képesek okozni. A humán klinikai mintákból aerob módon kitenyészett Gram-negatív baktériumok közül az E. coli a leggyakoribb izolátum. Az emberen kívül az E. coli fertőzésre leginkább fogékony fajok a szárnyasok, a sertés, a szarvasmarha, a nyúl, valamint a birka. Az infekció során a kórokozó általában csak a nyálkahártya felszínéig jut, de bizonyos esetekben
képes
az
egész
szervezetben
is
szétterjedni.
Az
általa
okozott
megbetegedéseket lokalizációjuk szerint két csoportra lehet osztani: I. enteritises kórképek II. extraintesztinális kórképek Nagyobb jelentőséggel mégis a hasmenést okozó csoport bír, mivel ez olyan súlyos megbetegedéseket/járványokat okozó törzseket is tartalmaz, amelyek világszerte komoly közegészségügyi problémát vetnek fel.
8
1. táblázat Az egyes E. coli patotípusokra jellemző szerocsoportok, és a hozzájuk tartozó legfontosabb virulencia markerek VTEC
EHEC
EPEC
ETEC
EIEC
EAggEC
UPEC
NTEC
O5
O118
2
113
18
125
6
141
28
152
3
85
1
25
1
75
O8
O128
4
116
19
126
8
147
112
164
4
111
2
50
2
76
O22
O145
5
118
55
127
15
148
124
167
6
127
4
75
4
78
O26
O146
6
145
86
128
20
149
135
7
142
6
77
5
83
O75
O153
22
153
111
142
25
153
136
17
162
7
78
6
86
O91
26
156
114
158
27
159
143
44
8
81
8
91
O103
38
157
118
63
167
144
51
9
83
9
117
O111
45
163
68
11
85
12
46
80
78
147
73
12
86
14
82
85
75
14
18
84
101
77
15
21
88
115
78
16
22
914
128
17
24
103
139
18
25
21
29
22
54
104 111 markerek:
markerek:
markerek:
markerek:
markerek:
markerek:
markerek:
markerek:
VT1 VT2
VT1 VT2 Ehly Int
Int
LT ST
Einv
EAST
afa dfa
CNF1,2
9
3.4.
A patogén E. coli törzsek csoportosítása
A humán megbetegedést okozó törzseket patogén tulajdonságaik szerint csoportosítjuk, különösen nagy hangsúlyt fektetve a betegség patomechanizmusára és a virulencia faktorokra, hiszen az utóbbiak kimutatására épülnek a diagnosztikai eljárások. A leginkább vizsgált csoportok a következőek: enteropatogén E. coli (EPEC), enterohemorrágiás E. coli (EHEC), verotoxin termelő E. coli (VTEC), enteroaggregatív E. coli (EAggEC), enterotoxikus E. coli (ETEC), enteroinvazív E. coli (EIEC) és a diffúzan adheráló E. coli (DAEC). Az extraintesztinális körbe tartoznak a már említett húgyúti infekciókért felelős E. coli (UPEC) törzsek és az újszülöttkori sepsist okozó vagy meningitisszel asszociált E. coli (MAEC) törzsek és a nekrotizáló toxint termelő E. coli (NTEC) törzsek (1. ábra).
NTEC ExPEC
MAEC DAEC
UPEC
Atip.EPEC
AEEC
Tip. EPEC
EHEC
EAggEC VTEC
O157:H7
Sh.dysenteriae
ETEC
EIEC
1. ábra Venn diagramm a különböző emberi megbetegedést okozó E. coli patocsoportok közötti komplex kapcsolatrendszer bemutatására (Donnenberg (2002) alapján, kiegészítve).
10
3.5.
Hasmenést okozó enterovirulens E. coli csoportok kimutatása, a diagnosztika nehézségei
Bár a hasmenést okozó E. coli törzsek identifikálásához sokféle teszt áll rendelkezésre, a kórokozó kimutatására irányuló rutin laboratóriumi diagnosztika gyakran mégis kudarcot vall. Mindez több okra is visszavezethető. Egyrészt morfológiai és fenotípusos jegyek alapján a normál bélbaktériumok közé tartozó, valamint a patogén E. coli törzsek nem különíthetőek el. Ráadásul manapság több ezer kilométert is megtehetünk akár néhány óra alatt, így olyan ritka E. coli törzseket is magunkkal hurcolhatunk, melyek az adott országban csak elvétve jelennek meg, ezért a rutin diagnosztikus módszerekkel nem is célozzák meg őket. (Ezek a törzsek gyakran az ETEC vagy az EAggEC csoportba tartoznak). A másik ok pedig, hogy a hasmenésre adott empirikus antibiotikum kezelés, például a fluorokinolonok, sokszor már azelőtt pusztítják el a kórokozót, hogy megtörtént volna annak kimutatása és identifikálása. Így ezek is elvesznek a laboratórium számára (pl. az EIEC törzsek). Hasmenéses beteg székletmintájának tenyésztését egyébként a legtöbb esetben elvégzi a laboratórium, különösen, ha utazók, gyermekek vagy immunszupresszáltak megbetegedéséről van szó. Amennyiben felvetődik valamilyen patogén csoportba tartozó E. coli törzs gyanúja, annak további identifikálása, patogén markereinek kimutatása, szerotipizálása és patocsoportba sorolása az erre kijelölt nemzeti referencia laboratóriumba küldve történik meg.
3.5.1.
Virulencia jegyeken alapuló fenotípusos vizsgálatok
A hasmenést okozó E. coli törzsek virulencia markereinek kimutatása feltétlenül szükséges ahhoz, hogy ezeket a baktériumokat elkülöníthessük a normál flóra apatogén tagjaitól. A fenotípusos tulajdonságok – sokszor nagyon is pontosan – korrelálnak a különböző E. coli patocsoportokkal, ahhoz azonban ritkán elegendőek, hogy pusztán önmagukban biztosan definiálják az adott törzs kóroki szerepét. Egyetlen kivétel ez alól az O157:H7-es szerotípus, amely fenotípusos tulajdonság egyben virulencia marker is. E kórokozók kimutatását a virulencia markereik meghatározására kell alapozni, ami
11
vagy in vitro fenotípusos vizsgálat, vagy a patogén tulajdonságot kódoló gének kimutatása lehet. Az egyik leghasznosabb fenotípusos vizsgálat a hasmenést okozó E. coli törzsek detektálásában a HEp-2 szöveti adherencia kimutatás, amelyet először 1979-ben írtak le (Cravioto és mtsai 1979), és ez egyben az ún. „gold standard” módszer az EAggEC és a DAEC csoport azonosítása során. Segítségével három adherencia mintázat különíthető el: (1) lokalizált adherencia (LA), (2) aggregatív adherencia (AA), valamint (3) diffúz adherencia (DA) (3. ábra).
AA
LA
DA 3. ábra
Lokálisan adheráló (LA), Aggregatívan adheráló (AA), Diffúzan adheráló (DA) E. coli fenotípusok HEp-2 szövettenyészeten. Forrás: Nataro és Kaper 1998.
3.5.2.
Molekuláris kimutatási lehetőségek
A hasmenést okozó E. coli törzsek voltak az első patogének, amelyek kimutatásához molekuláris módszereket fejlesztettek ki. A fejlett országokban a nukleinsav-jelöléses próba technika (hibridizáció), valamint a PCR (polymerase chain reaction- polimeráz lánc reakció) lett a legelterjedtebb és legmegbízhatóbb eljárás a normál flórát alkotó baktériumoktól való elkülönítés során. A magyar Nemzeti Enterális Aerob Baktériumok Referencia Laboratóriumában (ENRL) doktori munkám kapcsán ez idáig a PCR, valamint a PCR RFLP technikát vezettük be a kórokozó E. coli törzsek kimutatása, identifikálása és tipizálása céljából. A PCR technika fejlesztése során számos primerről bizonyosodott be, hogy jól alkalmazhatóak a patocsoportokba sorolásnál. A módszer előnye a magas szenzitivitás, és specificitás. Bár a székletben található különféle
12
összetevők gátolhatják a reakciót, így csökkentve annak érzékenységét, az inhibitorok eltávolításával azonban mindez kiküszöbölhető. Megfelelő feltételek mellett a PCR-rel pontos és gyors eredményt kaphatunk.
3.5.3.
Genotipizálás
Az utóbbi években a járványok felderítésének kapcsán, valamint a kórokozók tipizálásakor egyre nagyobb szerephez jutnak az ún. molekuláris „ujjlenyomat” módszerek. Ilyen a pulsed-field gél elektroforézis (PFGE) is, melynek használatakor kromoszomális restrikciós mintázatot kapunk, ritkán hasító enzimek segítségével, hibridizáció nélkül (Preston 2000). 1995-ben a CDC ezt a módszert jelölte ki az E. coli O157:H7 standard tipizálásához. Egy elektronikus adatbázis segítségével a különböző országokban izolált kórokozók PFGE mintázata is összevethető (CDC 2001, Ribot és mtsai 2006)
3.5.4.
Általánosságok az enterális megbetegdést okozó E. coli törzsek virulenciájával kapcsolatban
Mint a legtöbb nyálkahártya-adherenciát mutató patogén, az E. coli-fertőzés is a következő stratégiát követi: (a) a baktériumok kolonizálják a nyálkahártya felszínét; (b) kikerülik a gazdaszervezet védelmi mechanizmusait; (c) elszaporodnak; majd (d) károsítják a gazdaszervezetet. E törzsek legfontosabb tulajdonsága, hogy a perisztaltika és a normál bélflóra kompetitív hatása ellenére is képesek megtelepedni a bélnyálkahártya felszínén. A felszíni adherens fimbriák gyakorlatilag minden E. coliban jelen vannak (az apatogénekben is), azonban a kórokozó törzsek olyan specifikus fimbriális adhezinekkel is rendelkeznek, amelyek jelentősen megnövelik az intesztinális kolonizációs képességüket, beleértve vékonybél felszíni struktúrákat is, ahol normális esetben nem tudnának megtapadni. A
gazdaszervezet
kolonizálását
követően
az
E.
coli
törzsek
változatos
patomechanizmusok révén: (1) enterotoxin termeléssel (ETEC és EAggEC), (2) invázióval
(EIEC),
és/vagy
szoros,
membrán
szignál
segítségével
létrejött
kapcsolódással (EPEC és EHEC) hasmenést okoznak. A baktérium és a bélhámsejtek
13
között kialakuló interakció minden csoport esetében specifikus, ennek sematizált mintái a 2. ábrán láthatóak. Az E. coli genom sokoldalúságáért felelős gének mobilis genetikai elemeken és/vagy kromoszomális patogenitási szigeteken helyezkedhetnek el. Mindegyik hasmenéses megbetegedésért felelős E. coli csoport legalább egy virulenciával kapcsolatos tulajdonsága kódolt plazmidon. Az EIEC, EHEC, EggEC, és az EPEC törzsek is olyan erősen konzervált plazmidokat hordoznak, amelyek különböző virulencia faktorokat kódolnak. McDaniel és Kaper pedig olyan kromoszómálisan kódolt virulencia géneket mutattak ki az EPEC és az EHEC csoportokban, amelyek ún. patogenitási szigetekbe rendeződve jelennek meg (McDaniel és mtsai 1995). Ilyen szigetet leírtak még az uropatogén (Dobrindt 2001) és a szisztémás megbetegedést okozó E. coli törzsekben (Huang 2001) is. A plazmidok és patogenitási szigetek csoportokba rendezve hordozzák a virulens tulajdonságokért felelős géneket, de ezenkívül bizonyos egyedi tulajdonságokat transzpozon (mint a hőstabil enterotoxint – ST) vagy fág is kódolhat (mint a Shiga toxint) (Plunkett 1999). A következő részben áttekintem a megbetegedéseket okozó E. coli törzsek egyes patocsoportjait, kiemelve a megbetegedés jellegét, patomechanizmust valamint a labordiagnosztikát.
2. ábra A hasmenést okozó E. coli csoportok patomechanizmusainak sémái. A képen a 6 fontosabb kategória és az eukarióta sejt kapcsolata látható, a pontos molekuláris mechanizmusok nélkül. (Nataro és Kaper 1998)
14
3.5.5.
Enterohemorrágiás és verotoxin termelő E. coli (EHEC, VTEC)
A csoport felismeréséhez két kórkép közelebbi vizsgálata vezetett. Riley és mtsai 1983-ban két vizes, majd véres hasmenéssel, abdominális fájdalommal, alacsony lázzal járó megbetegedés vizsgálata kapcsán írták le a hemorrhágiás colitist (HC), amelyet egy gyorsétteremláncban rosszul átsütött hamburgerrel hoztak kapcsolatba. A kórokozó az O157:H7 típusú E. coli volt, amelyet korábban csak ritkán izoláltak. A másik leírás szintén 1983-ban Karmali (Karmali és mtsai 1983) nevéhez fűződik, aki sporadikusan előforduló hemolitikus urémiás szindrómás (HUS) megbetegedéseket vizsgált, melyeket általában véres hasmenés előzött meg. A két kulcsfontosságú klinikai mikrobiológiai megfigyelés rámutatott arra, hogy a vizsgált kórokozó csoport kiemelkedő jelentőségű, súlyos enterális és renális betegségekhez vezethet. Detektálása egyrészt a szerotípus meghatározáson, másrészt a specifikus cytotoxin termelés kimutatásán alapult. A cytotoxin kimutatás, amit Karmali használt, Konowalchuk és kollégái nevéhez fűződik (Konowalchuk és mtsai 1977), de ugyanebben az időben publikálta O’Brian és munkacsoportja (O’Brien és mtsai 1977), hogy egyes E. coli törzsek cytotoxikus hatása a HeLa sejteken semlegesíthető egy bizonyos antitoxinnal, amelyet a Shigella dysenteriae 1 toxin (Shiga-toxin, Stx) ellen állítottak elő. Ez alapján nevezték el az előbbi E. coli törzsek által termelt toxint Shiga-like toxinnak (Slt), amelyről kiderült, hogy ugyanaz, mint az O157:H7-ben leírt verocytotoxin. Így vált egyértelművé, hogy a véres hasmenést, valamint a HUS-t okozó patogén E. coli csoport legfontosabb virulencia-markere a verocytotoxin, amely egyaránt képes károsítani az intesztinális- és a vese szövetet. Később felismerték, hogy a toxin génje bakteriofágon kódolt (O’Brien és mtsai 1984), melyet már akkor több mint 100 különböző E. coli szerotípusból ki lehetett mutatni (Karmali, 1989). Ez a szám mára 400 fölé emelkedett.
A verotoxin nomenklatúra A toxin elnevezésével kapcsolatosan a mai napig nincs egységes álláspont. Konowalchuk munkacsoportja a Vero sejtvonalon mutatott tulajdonságok alapján a „verocytotoxin termelő” (VTEC) csoport elnevezést használta. Az alternatív nevezéktan szerint viszont a „Shiga toxin-termelő E. coli”, STEC (vagyis régebben Shiga toxin-
15
szerű, SLTEC) is helyes. Az érvek és ellenérvek számos publikáció tárgyát képezik, melynek folytán a shiga toxin (STX) és a verotoxin (VT) elnevezés egyenértékűvé vált. Dolgozatomban a továbbiakban a verotoxin elnevezést fogom használni. A toxin altípusok elnevezéseknél Scheutz és mtsai (Scheutz és mtsai 2001) által leírt rövidítéseket alkalmazom.
3.5.5.1.
Járványügyi jelentőség
Az eddig leírtakból kiderül, hogy az EHEC patogén csoport felismerése fontos és igen komplex feladat. A járványok mellett a sporadikus esetek száma is világszerte igen magas (Tozzi és mtsai 2001). A rutin laboratóriumi széklettenyésztés során az E. coli O157:H7 általában a 3. leggyakoribb kórokozó a Salmonella spp. és a Campylobacter spp. után (Park és mtsai 1994), valamint véres székletből a leggyakrabban izolált kórokozó (Slutsker és mtsai 1997). A legtöbb tanulmány szerint az összes EHEC infekciónak 50-80%-át az O157:H7 okozza. Ez talán azzal is magyarázható, hogy a nem-O157-es törzseket a laboratóriumok többségében nem keresik rutinszerűen, így az EHEC fertőzések incidenciáját nem lehet pontosan kiszámolni. Egy európai felmérés szerint a verotoxin termelő izolátumok száma folyamatosan emelkedik, de Európán és az USA-n kívül Japánban, Dél-Amerikában és Dél-Afrikában is jelentős kórokozónak számít az EHEC. A fejlődő országokban azonban alacsonyabb arányban izolálják a betegekből, mivel az EPEC vagy ETEC törzsek mellett háttérbe szorul. VT-termelő E. coli-t kimutatták már szarvasmarha, birka, kecske, sertés, kutya, macska, csirke és sirály székletflórájából (Beutin és mtsai 1993; Makino és mtsai 2000) és tehéntejből is (Kiss és mtsai 2009). Emberi szempontból a legfontosabb reservoir a szarvasmarha. Sok országban jelentős a szarvasmarha állomány átfertőzöttsége (Németország-11%, UK-16%) (Wells és mtsai 1991; Burnens és mtsai 1995). A háztáji állatokban szeroepidemiológiai módszerekkel vizsgálták az EHEC prevalenciáját. A szérumban az emelkedett O157 LPS ellenanyag szint mellett az anti-VT ellenanyag jelzi, hogy a vizsgált állat hordozó-e, illetve átesett-e EHEC fertőzésen (Reymond és mtsai 1996).
16
Mind étellel, mind itallal át lehet vinni a fertőzést, de emberről emberre is terjedhet. A leggyakoribb forrás a nem megfelelően átsütött hús (főleg gyorséttermekben). A legnagyobb ezzel kapcsolatos járvány Japánban zajlott, ahol 6000 ember betegedett meg, közülük 13-an meghaltak egy iskolai ételszállító cég fertőzött ebédje miatt (National institute of health and infectious diseases control division 1996). A másik járványt az USA-ban írták le, ahol egy hamburgert forgalmazó étteremben 1992-1993 között 732 ember betegedett meg, 195 került kórházba és 4-en hunytak el (Bell és mtsai 1994). Az ún. véres, nem megfelelően átsütött steak is komoly fertőzésforrás lehet, ami gyakran okoz sporadikus megbetegedéseket. Természetesen nem csak a nyers marhahús, hanem a nyers tej, valamint más állatok (sertés, bárány) húsa is okozhat fertőzést (Griffin és Tauxe 1991). Ellentétben más patogénekkel az O157:H7 még alacsony pH mellett is képes szaporodni az élelmiszerekben, Sok esetben szarvasmarha trágyával kontaminálódott zöldség vagy gyümölcs közvetíti a kórokozót, és az alacsony infektív dózis, valamint a nyersen fogyasztott étel teszi lehetővé a fertőzés kialakulását. Előbbiekhez hasonlóan a vízhálózatba, medence-, vagy forrásvízbe került kórokozó is járványokat okozhat (Keene és mtsai 1994). Az infektív dózis rendkívül alacsony, már 100-200 patogén baktérium is elegendő a betegség kialakulásához, hasonlóan a Shigella fajokhoz. Ez magyarázza a vízből szerzett és az emberről emberre terjedő megbetegedéseket.
A nem-O157:H7 szerotípusok A megbetegedések nagyobb hányadát az E. coli O157:H7 okozza, ami azt jelenti, hogy ez a szerotípus sokkal virulensebb, és könnyebben átvihető, mint a többi. Azonban a többi VT-termelő típus is képes mind sporadikus, mind járványos megbetegedéseket előidézni, sőt az ilyen izolátumok száma is emelkedőben van (EFSA 2007). E törzsek incidenciáját nagyon nehéz megállapítani, a labordiagnosztika hiányosságai miatt. Az izolátumok ráadásul gyakran szorbit pozitívak (szemben az O157-el), így a detektálásukat a verotoxin, vagy az azt kódoló vtx- gén kimutatására kell alapozni (Tarr és Neill 1996).
17
Az E. coli törzsek közül több mint 400 termel verocytotoxint, és a legtöbb szerotípuson belül vtx-pozitív és vtx-negatív izolátum is található. Közülük legalább 50 kapcsolatba hozható véres hasmenéssel, vagy HUS-al. A leggyakoribb emberi betegséget okozó nem-O157 szerotípusok a következőek: O26:H11, O103:H2, O111:NM, és az O113:H21 (EFSA 2007, Caprioli 1998). E törzsekkel kapcsolatban számos járványt leírtak már Japánban, Németországban, Olaszországban, Ausztráliában, USA-ban stb. (Johnson és mtsai 1996). Sok országban a HUS esetek, valamint a nem véres hasmenések többségért is a nem-O157-es törzsek a felelősek.
3.5.5.2.
Klinikai vonatkozások
A leggyakoribb tünet a hasmenés, a véres hasmenés és a HUS, a szövődmények között pedig a cholecystitis, bélperforáció, vakbélgyulladás, hepatitis, tüdőödéma, myokardiális funkciózavar és idegrendszeri tünetek szerepelnek. A különböző tünetek, gyakoriságukat tekintve: az esetek vezető tünete kb. 10%-ban hasmenés, kb. 90%-ban véres hasmenés, míg a 10 év alatti betegek kb. 10 százalékában HUS, valamint kevesebb, mint 5%-ban extraintersztinális szövődmény kapcsolódik (Tarr 1995). Az EHEC hasmenés inkubációs ideje átlagosan 3-4 nap. Kezdetben jellemző a vizes, nyákos széklet, ami görcsös fájdalommal, ritkán rövid lázas periódussal is járhat. A betegek felénél még a kezdeti szakaszban hányás fordul elő. A véres hasmenés 1-2 napon belül kialakulhat, melyet fokozódó fájdalom kísér. Ez az állapot 4-10 napig tart, és ritkán előfordul, hogy széklet nem is ürül, csak vér (Riley és mtsai 1983). A fertőzés során vérzés, és ödéma alakul ki a lamina propriában (Griffin és mtsai 1990), a vastagbél biopsziában pedig sok esetben fokális nekrózis és neutrofil infiltráció látható. Az esetek többsége minden komolyabb következmény nélkül, spontán gyógyul, csak mintegy 10%-ban, főleg a 10 év alatti betegekben (ritkán idősebbekben) fordul át HUSba. Kialakulásában nagyobb szerepet tulajdonítanak a VT2-nek, mint a VT1-nek. A HUS a hemolitikus anemia, trombocytopenia és a veseelégtelenség triászával jellemezhető. A legtöbb beteg a megfelelő terápia hatására meggyógyul, az érintettek 35%-a meghal, 12-30%-ánál pedig maradandó vesekárosodás, magas vérnyomás vagy központi idegrendszeri károsodás következik be (Pickering és mtsai 1994).
18
A kezelésnél fontos szempont, hogy az EHEC törzsek nagyfokú antibiotikumérzékenységének dacára az antibiotikum-kezelés fokozza a kialakuló szövődmények kockázatát. 1996-ban egy japán járvány során a betegség korai stádiumában (1-3 nap) fosfomycint adtak a betegeknek, amely jelentősen lecsökkentette a HUS kialakulásának esélyét. Az antibiotikum adása egyébként két okból veszélyes: a baktériumok lízise miatt a felszabaduló toxin mennyisége jelentősen megnő, valamint a normál kolonizáló baktériumok kiirtása felerősíti a tüneteket, és megnöveli a toxin adszorpcióját. Ugyanígy a bélmozgást gátló szerek sem javallottak, hiszen a bél kitisztulásának lelassítása szintén a toxin abszorpcióját segíti elő (Cimolai és mtsai 1994).
3.5.5.3.
Patogenezis, virulencia markerek
Az EHEC csoport patogenitási jellemzői a következőek: VT-termelő, attaching and effacing (A/E) léziót okoz és rendelkezik egy kb. 60 MDa-os plazmiddal, amely az enterohemolizint kódoló régiót is hordozza (Levine, 1987). Ez alapján az EHEC a VTEC egy részhalmaza (1. ábra), és további csoportokra osztható. Az O157:H7-hez hasonló, VT pozitív, A/E lézióra képes, és a 60 MDa-os plazmiddal rendelkező izolátumokat „tipikus EHEC”-nek, a 60 MDa-os plazmid vagy az A/E lézió képessége nélkülit pedig „atípusos EHEC”-nek nevezzük. a)
Verotoxin
A verotoxin a legfontosabb virulenciamarker, amelynek struktúrgénjeit egy lysogén lambda bakteriofág kódolja. A verotoxin család két, immunológiailag független (nem keresztreagáló) csoportra osztható: VT1-re és VT2-re. A vtx1 és a vtx2 55% (A alegység) és 57% (B alegység) azonosságot mutat egymással (Jackson és mtsai 1987). A vtx1 erősen konzervatív, a vtx2-n belül azonban nagy a szekvencia-variabilitás. A legsúlyosabb emberi megbetegedésekhez a vtx2 és a vtx2c altípus köthető. Minden verotoxin egy A és egy B alegységből áll. Az A alegység proteolitikusan A1 és A2 peptidre bontható. Az A1 az enzimatikusan aktív régió, az A2 pedig az A1 és a B alegység pentamerje közötti kapcsolatot biztosítja. Ez a B pentamer köti a toxint a specifikus glikolipid receptorhoz (globotriaosylceramid - Gb3), amely általánosan előfordul az eukarióta sejtek felszínén, ám kiemelkedően magas koncentrációban található meg az emberi veseszövetben (Boyd, és Lingwood 1989).
19
A kötődés után a holotoxin endocitózissal jut be a sejtbe, ahol a Golgi-apparátusba, majd az endoplazmatikus retikulumba kerül. Az A alegység transzlokálódik a citoplazmába,
ahol
kapcsolatba
kerül
a
60s
riboszómális
alegységgel,
és
megakadályozza a proteinszintézist, ami végeredményben a sejt elhalásához vezet. A verotoxin először intesztinális folyadékgyülemet idéz elő, amelyet valószínűleg az abszorptív bélsejtek szelektív pusztulása okoz, majd kiterjedt szövetkárosodás következik be. A károsodott sejteken keresztül a toxinnal együtt a bakteriális LPS és különböző gyulladásos mediátorok is a keringésbe jutnak. Ezt támasztja alá, hogy a véres hasmenéses megbetegedésekben gyakrabban alakul ki szövődményként HUS, mint a nem véres hasmenés esetében (Griffin, 1995). b)
Intimin
A legfontosabb adherencia faktor - amely jelentős szerepet játszik a bélhámsejtek kolonizációjában - az intimin, amelynek hatása az A/E lézió kialakulásában nyilvánul meg. Az intimin mellett több adhezint is leírtak már, amelyeknek leginkább a nemO157:H7 és az eae-negatív törzseknél töltenek be kóroki szerepet. Egyes tanulmányok az LPS adherenciában betöltött szerepét vizsgálják (Bilge és mtsai 1996). c)
Enterohemolizin
Az enterohemolizin génjét egy 60 MDa-os plazmid kódolja, melyet többek között az O157:H7 törzsek hordoznak. Feltételezett patogenetikai szerepe, hogy az erytrociták lízise révén felszabadítja a hemet és a hemoglobint, melyek vasforrásként segítik elő az E. coli szaporodását (Bauer és Welch 1996). d)
Vas-transzport rendszer
Az E. coli O157:H7 olyan speciális vas-transzport rendszerrel rendelkezik, amely lehetővé teszi, hogy a hemoglobinból fel tudják venni a vasat (Torres és Payne 1997). Így vért tartalmazó közegben a hemolizint termelő törzs fokozottan képes szaporodni. e)
EAST
Bár ezt a toxint először az EAggEC-k körében írták le, ugyanakkor számos EHEC törzs is jellemezhető vele. Az O157-es törzseken kívül az O26-os törzsekből is többször sikerült kimutatni (Savarino és mtsai 1996).
20
f)
pO157 plazmid
Minden O157-es izolátum hordoz egy erősen konzervált, pO157 jelzésű plazmidot, (Schmidt és mtsai 1994). Ez a legtöbb humán VT-termelő törzsben megtalálható, és az enterohemolizinen kívül hidrogén peroxidázt és további adherencia faktorokat is kódol. g)
További potenciális virulencia faktorok
Az O157 LPS (hasonlóan más bakteriális LPS endotoxinhoz) in vitro megnöveli a törzs citotoxicitását, tehát valószínűleg in vivo is hasonló hatást fejt ki.
3.5.5.4.
Diagnózis és laboratóriumi detektálás
Az alacsony infektív dózis és a toxinhatás miatt, az EHEC izolátumokat BSL3 szintű kórokozóként, azonos módon kell kezelni a Salmonella typhi, vagy a Shigella dysenteriae 1-el. Az azonnali laboratóriumi diagnózis, epidemiológiai vizsgálat és gyors beavatkozás megelőzheti a súlyos járványok kialakulását (Boyce és mtsai 1995). A CDC ajánlása szerint a klinikai mikrobiológiai laboratóriumokban véres hasmenés vagy HUS esetén E. coli O157 kimutatásához szorbitos-McConcey (SMAC) agarra is feldolgozzuk a beteg székletmintáját. Így a D-szorbitolt nem fermentáló O157es törzsek szelektíven tenyészthetőek, amelyek színtelen telepeket képeznek. Figyelembe kell venni, hogy ez a költségkímélő eljárás csak az E. coli O157 elkülönítésére alkalmas. Egyéb nem-O157-es EHEC-törzsek szűrésére verotoxin detektálása szükséges, ami már drágább módszereket igényel. A tenyésztés maximális hatékonyságát biztosítja, ha a mintavétel a hasmenés kezdetét követő 2 napon belül megtörténik. Ha a tenyésztés csak a 3.-6. napon kezdődik, akkor mintegy 90%, a 6. nap után pedig már csak alig. 30% a kórokozó kimutatásának az esélye. Ezért, ha csak a HUS kialakulását követően történik meg a mintavétel, a betegek kétharmadából már nem lehet izolálni a megbetegedést okozó EHEC törzset. A kitenyésztett izolátumok alkalmasak arra, hogy tárgylemez agglutináló savóval meghatározzák az O antigénjüket. Az immunológiai vizsgálatok pedig lehetővé teszik a szerológiai azonosítás mellett a verotoxin kimutatását. A toxin kimutatására alkalmas tesztek előnye, hogy mind az O157, mind a nem-O157 törzsek által termelt verotoxin kimutatható velük. A legáltalánosabb diagnosztikus módszerek:
21
i. Tárgylemez agglutináció: az O és a H antigének kimutatása közvetlenül a SMAC agarról, vagy egyéb tenyészetből is lehetséges. A H antigén jelenlétének kimutatásához a törzsek mozgást elősegítő médiumon történő előzetes passzálása szükséges. ii. ELISA segítségével mind a verotoxin termelő izolátumok, mind a székletben található szabad verotoxin monoklonális ellenanyagokkal mutatható ki (RidaScreen Verotoxin ELISA, R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany). Létezik a pO157 termékeivel reagáló poliklonális ellenanyagra épülő technika is, de az kevésbé terjedt el (Tóth és mtsai 1991). iii. VTEC-RPLA teszt: reverz passzív latex agglutinációs módszer (TD0960, Oxoid Inc, Hampshire, UK), amely külön detektálja a VT1-et és a VT2-t, sőt a titerük is meghatározható. A egyetlen telepből kinyert toxin(ok)hoz latex szemcséhez konjugált ellenanyag kötődik, majd 96 lyukú V-furatú platen vizuálisan is jól detektálható a toxinok jelenlétében kialakuló latex-hálózat. iv. Immunomágneses szeparáció (IMS): a mintákban sokszor csak nagyon alacsony csíraszámban van jelen a verotoxin termelő E. coli, ám ennek a módszernek a segítségével eredményes lehet a kitenyésztése. A teszt specifikus monoklonális ellenanyaggal borított (O157, O111, O26) gyöngyökből áll. A vastartalmú gyöngyöket mágnessel össze lehet gyűjteni, majd a paramagnetikus gyöngybaktérium komplexet SMAC táptalajra oltva kitenyészik a kórokozó (Dynabeads, Invitrogen Co, USA). A verocytotoxin CDC által elfogadott, „gold-standard” kimutatási módszere a cytotoxikus hatás igazolása szövettenyészeten.
3.5.5.5.
Molekuláris kimutatási lehetőségek
A legtöbb molekuláris diagnosztikai módszer - a DNS hibridizációs próba és a PCR - a vtx gének kimutatásán alapul (Cocolin és mtsai 2000). Ez kiemelten fontos lehet a nem-O157 törzsek azonosítása, illetve az élelmiszerből vagy egyéb nem humán eredetű mintából történő vizsgálatok esetén. Ez a csoport mindazonáltal több olyan virulencia kapcsolt faktorral is rendelkezik, amely megfelelő targetek lehetnek: multiplex PCR segítségével akár egyszerre mutatható ki a vtx1, vtx2, eae, hlyA stb. A
22
fliC PCR eredetileg a H7 csillóantigén génjének a kimutatását célozta. Ma már egy tovább fejlesztett PCR RFLP változata lehetővé teszi az összes H antigén meghatározását is (Fields és mtsai 1997). A Southern blot technika olyan DNS alapú gyorsdiagnosztikai módszer (Hain Lifescience GMBH, GenoType, EHEC), melynek segítségével az első tenyészetből DNS-stripen mutathatók ki az eae, ipaH, vtx1 és vtx2 gének (Prère és Fayet 2005). Annak érdekében, hogy azonosítani lehessen egy-egy járvány forrását, illetve igazolni lehessen a sporadikusnak tűnő megbetegedések kapcsolatát, különféle molekuláris tipizálási módszerek állnak a laborok rendelkezésére: multilokusz enzim elektroforézis (MLEE) analízis, plazmid profil analízis, fágtipizálás, ribotipizálás, RAPD-PCR (Random amplified polymorphic DNA PCR) és PFGE (pulsed-field gelelectrophoresis).
3.5.5.6.
Szerodiagnózis
A szérum EHEC ellenanyagszintje értékes információval szolgálhat a fertőzés tényének megállapításához, főleg olyan esetekben (pl. HUS), amikor a kórokozó tenyésztéssel már nem mutatható ki. Különböző nem specifikus neutralizációs folyamatok eredményeként azonban a szérumban túl alacsony a toxin szintje ahhoz, hogy az ellene termelődő ellenanyagok szerológiai mószerekkel detektálhatóak legyenek. A nagy denzitású LPS már jóval nagyobb mennyiségben jut át a keringésbe, így a kétféle ellenanyag együttes szintje, vagy önmagában az anti-LPS informatívabb lehet. Összehasonlító vizsgálatokból kiderült, hogy HUS betegek székletéből kevesebb, mint 30%-ban tenyészett ki a kórokozó, míg a szérum ellenanyagszint (anti-O157 LPS IgM) már a gyógyult betegek több mint kétharmadában emelkedett értéket mutatott (Chart és mtsai 1991).
3.5.6.
Enterotoxikus E. coli (ETEC)
Az ETEC csoport olyan törzseket foglal egybe, amelyek vagy hőstabil-, vagy hőlabil enterotoxint (ST-t, LT-t), vagy mindkettőt termelik (Levine 1987). Az általuk kiváltott két jelentős tünetegyüttes a fejlődő világbeli, gyermekkori hasmenés, valamint az ún. utazók hasmenése. A törzsek infektív dózisa relatív magas, és gyakran fordul elő tünetmentes hordozás is. Az endémiás esetek nagy részét az ST-termelő ETEC törzsek
23
okozzák. A fertőzés leggyakoribb forrása a kontaminált étel vagy ital (víz) (Black és mtsai 1981), a nedves, meleg időjárás miatt az endémiás területeken vett élelmiszer- és vízminták meglepően magas arányban kontamináltak ETEC törzsekkel. Az emberről emberre terjedés nem bizonyított. Bár a megbetegedés főleg a gyermekeket érinti (leginkább a 2 év alattiakat), az immunológiailag felkészületlen felnőtt szervezet is fogékony lehet rá. Ez magyarázza azt, hogy az endémiás fejlődő országokba látogató utazók is gyakran betegszenek meg ETEC infekció következtében.
3.5.6.1.
Klinikai vonatkozások
A betegség rövid inkubációs idő után (átlagosan 15 óra - 2 nap) tör ki, általában vért, nyákot vagy gennyet nem tartalmazó, vizes hasmenés formájában. Láz és hányás is csak a páciensek kis százalékában fordul elő. A kórkép általában enyhe lefolyású, rövid, és
nagyon
hasonló
a
V.
cholerae
által
okozott
fertőzésekhez
(www.cdc.gov/NCIDOD/dbmd/diseaseinfo/etec_g.htm). ETEC fertőzés esetén a legfontosabb teendő a normál vízháztartás fenntartása. A szájon át történő rehidráció gyakran életmentő lehet a beteg kisgyerekek esetében. Szükség esetén a fluorokinolonok (ciprofloxacin, norfloxacin és az ofloxacin) lerövidíthetik a betegség időtartamát, bár a fejlődő országokban a hatékony szerek nem vagy csak nehezen hozzáférhetőek. Léteznek ezen kívül orális vakcinák is, amelyek a megelőzést segítik (Svennerholmés mtsai 1997; Tacket és Levine 1997).
3.5.6.2.
Patogenezis
Az ETEC törzseket általában a következő patogenetikai tulajdonságok jellemzik: képesek kolonizálni a vékonybél nyálkahártyáját, valamint enterotoxin(oka)t termelnek. A törzsek a termelt hőlabil- (LT) és/vagy a hőstabil-enterotoxinnak (ST) tulajdoníthatóan okoznak hasmenést. Az LT 86 kDa-os oligometrikus toxin, amely közeli rokonságban áll a Vibrio cholerae által termelt kolera enterotoxinnal (CT) (Sixma és mtsai 1993). A gazdasejt membránjához való kötődés után a toxin endocitózissal és transzlokációval jut át az eukarióta sejtbe, majd felhasználja a transz-Golgi vezikuláris transzport rendszert (Lencer és mtsai 1995) és fokozza a polarizált bélhámsejt bazolaterális membránjában
24
található adenilát cikláz aktivitását. Ennek következtében megnő a sejtben a cAMP szint, ami a klorid csatornák szupernormális foszforilációja miatt megnövekedett Clszekréciót eredményez. Mindez meggátolja a NaCl felszívódását a bélből, így alakul ki a hasmenés (Sears és Kaper 1996). Az ST (hőstabil toxin) kicsi, monomer szerkezetű. Két, -egymással nem rokonosztályra osztja az irodalom, melyek mind szerkezetükben, mind funkciójukban eltérnek egymástól. A kódoló régiók általában plazmidon helyezkednek el, de néhány gén transzpozonon található. A legfontosabb receptora a guanilát-cikláz C, amelyhez kötődve az intracelluláris cGMP szint megemelkedik, ez pedig stimulálja a Clszekréciót és gátolja a NaCl abszorpciót. Az intracelluláris kálcium szint megemelése pedig az F-aktin átrendeződéséhez vezet (Crane és mtsai 1992). Kolonizációs faktorok: Az ETEC törzsek elsőként a felszíni fimbriák (más néven pilusok) segítségével kapcsolódnak a vékonybél hámsejtjeivel. Ezek a fimbriák határozzák meg a patogén törzsek specifitását. Így például, ha egy ETEC törzs K99-t expresszál, akkor elsősorban borjúk, bárányok és sertések megbetegedését képes okozni, de ha K88-t, akkor csak sertéseket betegít meg. Az emberi megbetegedést okozó izolátumok többnyire kolonizációs faktor antigénekkel (CFA) rendelkeznek. Ezek kódoló régiói általában azon a plazmidon helyezkednek el, amelyen az LT-t és az ST-t kódoló régiók is megtalálhatóak (Gaastra és Svennerholm 1996).
3.5.6.3.
Detektálás és diagnózis
A kórokozó azonosítása sokáig az LT- és/vagy az ST termelés igazolására épült. Számos diagnosztikus immunológiai vizsgálat létezik: ELISA, latex agglutináció és a reverz passzív latex agglutináció (RPLA). A nemzetközi standard módszer a szopósegér vizsgálat (Gianella 1976), melynek során a fiatal egerekbe perkután beadják a tenyészet felülúszóját, majd mérik az intesztinális folyadék CD4 szintjét. Az immunológiai vizsgálatok azonban jóval egyszerűbben kivitelezhetőek a klinikai laboratóriumokban. Az ETEC törzsek esetében valószínűleg az elsők között kerültek alkalmazásra az általános molekuláris diagnosztikus technikák. A legkorábbi módszer a DNS próba volt, 1982-ben (Moseley és mtsai 1982). Jelenleg a leginkább alkalmazott módszer a PCR, és
25
annak a multiplex változata, amellyel az LT-t és az ST-t kódoló génszakasz mutatható ki.
3.5.7.
Enteropatogén E. coli (EPEC)
A hasmenést okozó E. coli-k egyik legjelentősebb csoportja, amely gyakran okoz járványokat a harmadik világbeli gyermekek között. Az EPEC törzsek elsősorban a 2 év alatti gyermekeket fertőzik meg. Magas csíraszámban (108-1010) a felnőtteket is meg tudják betegíteni, főleg azokat a rizikócsoportokat, akiknél a gyomorsavszint is viszonylag alacsony (Levine és Edelman 1984). Az átviteli út lehet feko-orális, valamint élelmiszer- vagy ital közvetített. Az inkubációs idő meglehetősen rövid, kb. 2-11 óra. A fejlett országokban már nincs akkora jelentősége az EPEC fertőzéseknek, mint korábban, az 50-es, 60-as években volt. Néhány nagyobb járványt ennek ellenére feljegyzett a szakirodalom az utóbbi 20 évben az Egyesült Államokban, az Egyesült Királyságban és Finnországban (Viljanen és mtsai 1990). Mindegyik esetben bölcsődében bukkant fel az EPEC törzs, míg egy atípusos minnesotai járványt megelőzően egy gourmet büfében szolgáltak fel fertőzött élelmiszert (Hedberg és mtsai 1997). A fejlődő világban ugyanakkor az EPEC mindmáig a gyermekek hasmenéses megbetegedésének a legfőbb oka. Brazíliában, Mexikóban és Dél-Afrikában született gyerekek hasmenéses kórképeinek 30-40%-át EPEC okozza (Cravioto és mtsai 1988; Gomes mtsai 1991). A beteg állatokból – nyúlból, sertésből, kutyából - izolált szerotípusok általában összefüggésbe hozhatók az emberi megbetegedésekkel.
3.5.7.1.
Klinikai vonatkozások
Az EPEC törzsek elsősorban akut hasmenést okoznak, de sok esetben elhúzódó megbetegedésekről is beszámoltak. Az általános tünetek közé tartozik a hányás, a profúz, vizes hasmenés, és az alacsony láz. Az Egyesült Királyságban és az Amerikai Egyesült Államokban a XX. század közepéig a halálozási arány 25-50% volt, ami jelenleg a fejlődő világban 30%-ra tehető. A fejlett országokban a gyógyszeres kezelésnek köszönhetően a mortalitás napjainkban már igen alacsony. A terápia elsődleges célja a dehidráció megakadályozása, valamint folyadékpótlás révén az elektrolit-egyensúly fenntartása. Az enyhébb esetekben
26
elegendő az orális-, de súlyos megbetegedéseknél szükséges lehet a parenterális rehidrálás. Vakcina még nem létezik ellene. Csecsemők esetében az anyatejes táplálás védelmet nyújt az EPEC fertőzéssel szemben, mert mind a colostrum, mind az anyatej in vitro HEp-2 sejttenyészeten erősen gátolja az EPEC törzsek adhézióját.
3.5.7.2.
Patogenezis
Patogenezisére jellemző az attaching és effacing (A/E) jelenség, amely a betegek biopsziás mintájában és sejttenyészeten egyaránt megfigyelhető (Andrade és mtsai 1989). Fenotípusos jegy, hogy a mikrovillusok eltűnnek, szoros kapcsolat alakul ki a baktérium és az epitéliális sejtmembrán között. Jellegzetes még a bélhámsejten belüli citoszkeletális
változás,
melynek
során
a
polimerizálódott
F-aktin
szálak
felhalmozódnak az odakötődő E. coli alatt. Ezáltal egy kb. 10 μm nagyságú plazmakitüremkedés, az ún. pedesztrál jön létre a bélhámsejten (Moon és mtsai 1983). A mikrovillusok felületének drámai csökkenése felszívódási zavarokhoz vezet. 1992-ben Donnenberg és Kaper (Donnenberg és Kaper. 1992) írták le az EPEC törzsek A/E patogenezisének háromszintű modelljét. Az első lépés a lokalizált adherencia
(LA),
a
következő
a
szignáltranszdukció,
utolsó
pedig
a
közvetlen/adherencia. A lokalizált adherenciát kódoló gének egy ún. EPEC adherens faktor (EAF) plazmidon kódoltak (Nataro és mtsai 1985). A LA létrejöttekor a baktérium ~7 nm átmérőjű fimbriákat képez, amelyek köteget formálnak, innen a nevük is: „bundle forming pili”, azaz BFP. Ezt követően a baktérium speciális adhéziós proteineket, például intimint kezd termelni, melynek a génje (eae) az ún. „locus of enterocyte effacement” (LEE) kromoszomális patogenitási szigeten található (Jerse és mtsai 1990). Az EPEC fertőzés megemeli a sejten belüli kalcium szintet, ami a citoszkeletonban bekövetkező változást indít el (Baldwin és mtsai 1991). Az intimin önmagában azonban nem elegendő az adherencia kialakításához, szükség van egy transzlokált intimin receptorra (Tir) az epitélsejten. Az A/E lézió a baktérium intiminje és a – baktérium által kódolt és transzlokált – Tir receptor fehérje közötti kapcsolat során alakul ki. További potenciális virulenciafaktorok: (i)
I-típusú fimbriák
27
(ii)
alacsony molekulasúlyú hőstabil toxin, az EAST, amelyet általában EAggEC termel, de néhány esetben EPEC törzsekből is kimutatták.
(iii)
Az inváziós faktorok segítségével az EPEC törzsek bejuthatnak az epitélsejtekbe (Donnenberg és mtsai 1989). Nem okoznak azonban vérhast, vagy tífusz-szerű tüneteket, mert a Shigella fajokkal ellentétben nem képesek intracelluláris szaporodásra.
3.5.7.3.
Detektálás és diagnózis
Az EPEC csoportot évekkel ezelőtt még csak az O és H antigének alapján különítették el a többi E. coli-tól. Jelenleg egy 1995-ben meghozott döntés alapján, a következők alapján határozzuk meg (Kaper 1996): a legfontosabb tulajdonság az A/E lézió megléte, melyhez a Shiga toxin hiánya társul. Ennek folytán az O és H antigének jelenléte diagnosztikus szempontból háttérbe szorul, bár vannak jól ismert O:H szerotípusú EPEC törzsek is. Vitatott kérdés, hogy az EAF plazmid-hiányos törzsek kórokozónak számítanak-e. A 2. Nemzetközi EPEC Szimpózium a következő definícót alkotta meg: az A/E pozitív, STX-negatív, EAF plazmidot hordozó törzseket „tipikus EPEC”-eknek hívjuk, míg az EAF plazmidot nem tartalmazó törzseket az „atípusos EPEC” izolátumok közé soroljuk. A laboratóriumi diagnózis a fenotípusos és/vagy a genotípusos megközelítést használja. A fenotípusos módszer sejtkultúrán vagy fluoreszcens mikroszkópos vizsgálaton alapul, a genotípusos pedig DNS hibridizációt vagy PCR-t alkalmaz. A molekuláris módszerek target génje lehet az eae - amelynek a detektálása egyúttal a LEE patogenitási sziget jelenlétét is igazolja -, és az EAF plazmid valamelyik markere, például a bundle forming pili (bfp) génje.
3.5.8.
Enteroinvazív E. coli (EIEC)
Az EIEC törzsek genetikailag, biokémiailag és patogenetikailag igen közeli rokonságban állnak a Shigella fajokkal: általában nem mozgó, laktóz-negatív baktériumok tartoznak ide. A dokumentált EIEC megbetegedések főleg vízből, vagy élelmiszerből indultak ki, de az emberről emberre történő terjedést is leírták már (Harris és mtsai 1985). Az
28
infektív dózisa nagyobb, mint a shigelláké, így kevésbé valószínű, hogy a fertőzés emberről-emberre is terjedne (Taylor és mtsai 1988.). A kórkép általában a felnőtteket érinti. A fejlett országokban az EIEC elterjedtsége elég kicsi, bár éttermi eredetű járványok előfordulhatnak (Gordillo és mtsai 1992). Magyarországon már 1989-ben készült egy összefoglaló az EIEC által okozott megbetegedésekről (Kétyi 1989).
3.5.8.1.
Patogenezis
Az EIEC törzsek patogenezise is nagyon hasonló a shigellákéhoz, mivel mindkét mikroorganizmus képes kolonizálni a vastagbél epitélsejtjeit, enterotoxinokat termelhetnek, és hasmenést okoznak. A patogenezis lépései a következők: - az epitélium károsítása – az endocitózisos vakuolák lízise – intracelluláris osztódás – a citoplazmán való átjutás – a szomszédos epitélium sejtekbe való terjedés (Goldberg és Sansonetti 1993). Mind a Shigella fajokban, mind az EIEC törzsekben egy-egy pInv plazmid hordozza az invazivitáshoz szükséges géneket (IpaA-IpaD), (Sasakawa és mtsai 1992). Nataro és munkacsoportja olyan EIEC törzsekből nyert plazmid géneket klónozott és szekvenált, amelyek egy enterotoxikus fehérjét kódoltak. Pontos etiológiai szerepük még bizonytalan, de jelenlétük összefüggésbe hozható a vizes hasmenés kialakulásával (Nataro és mtsai 1995).
3.5.8.2.
Detektálás és diagnózis
Az EIEC fertőzés általában vizes hasmenéssel jár, de a betegek kis hányadánál dysenteriás tünetek jelentkeznek: nyákot, vért, leukocitákat tartalmazó széklet, valamint láz és tenesmus. A tünetmentes hordozás ritka. Az EIEC törzsek kimutatásakor a Shigella spp-től, valamint a nem patogén E. coli izolátumoktól való elkülönítés jelenthet gondot. Az identifikálás során először igazolni kell, hogy a törzs az E. coli fajba tartozik, majd azonosítani kell a virulens fenotípust. Erre alkalmas módszer a korábban alkalmazott Serény-, vagy más néven tengerimalac keratoconjunctivitis-teszt, amely a baktériumsejtek invazív képességét igazolta (Kopecko 1994). A patogenitásért felelős különböző génekre PCR vizsgálat is tervezhető, amely módszer alkalmazása sürgős esetekben lehet előnyös, ha elődúsítás
29
nélkül kell a kórokozót kimutatni. Pál Tibor és csoportja kifejlesztett egy ELISA rendszert, amely az ipaC gént mutatja ki (Pál és mtsai 1997).
3.5.9.
Enteroaggregatív E. coli (EaggEC) A fejlődő világban észlelt, hasmenést okozó E. coli-k között az EPEC-en kívül
egy másik jelentős csoportot is leírtak. Ez utóbbi is jellegzetes képet mutat a Hep-2 sejttenyészeten, az EPEC-el ellentétben azonban nem adherál típusos mikrokoloniákban (Nataro és mtsai 1985). Ezt a fenotípust aggregatívan adherálóként (AA) írták le (3. ábra). Az AA esetében az egyik legjellemzőbb tulajdonság az autoagglutinációs képesség, amelynek következtében a baktériumok a HEp-2 sejtek felszínén, valamint a sejtmentes üvegfelszínen is ún. téglarakás-szerű alakzatba rendeződnek Definíció szerint az LT-t és ST-t nem termelő, a HEp-2 sejtvonalon aggregatív adherenciával adheráló csoport az enteroaggregatív E. coli, azaz EAggEC elnevezést kapta. Ebbe a csoportba patogén és nem patogén baktériumok is tartoznak, ezért a kutatások ezek elkülönítésére fókuszálnak. Megfigyelték, hogy bizonyos szerotípusai gyakrabban okoznak megbetegedéseket (1. táblázat).
3.5.9.1.
Patogenezis
Az EAggEC fertőzés fokozza a nyálkahártya nyák kiválasztását. Malac-modellen vizsgálva kiderült (Tzipori és mtsai 1992), hogy ez a nagy mennyiségű, sűrű nyák zsúfolásig tele van aggregálódott baktériumokkal, amelyek a mukusz tartalmú biofilmbe ágyazódnak be. A túlzott nyáktermelés szerepe az EAggEC patogenezisében még nem teljesen tisztázott, de ez a biofilm képzés kapcsolatba hozható a hasmenéssel, valamint a kórokozó kolonizáló képességével. Ez a fenotípus az AAF/I- (Nataro és mtsai 1992), és az AAF/II-al (Czeczulin és mtsai 1997) (aggregatív adherens fimbriákkal) jellemezhető. Másik fontos virulencia markerük az enteroaggregatív hőstabil toxin (EAST), amely az ST-hez hasonló, 38 aminosavból álló fehérje, és az EaggEC törzsek 40% termeli. Számos EAggEC törzs hordozza az aggR gént, amely egy ún antiaggregációs fehérjét kódol. Ez feltételezhetően jó immunogén sajátságokkal bír, akár szerológiai kimutatásra is alkalmas lehet.
30
A csoport másik enterotoxinja a nagy molekulasúlyú Pet, amely az autotranszporter szekretált fehérjék közé tartozik. A harmadik EAggEC toxin a Shigella enterotoxin1 (ShET1), amely folyadékkiválasztást indukál, de nincs cytotoxikus hatása. Hatásmechanizmusa nem teljesen tisztázott (Vila és mtsai 2000).
3.5.9.2.
Detektálás és diagnózis
A megbetegedésre jellemző a vizes, zöldes, nyákos széklet, amely vért nem tartalmaz. Esetenként alacsony láz, görcsös fájdalom, és ritkán hányás fordulhat elő (Paul és mtsai 1994). A székletben meglepően magas az IL-8 és IL-1β szint, és leukocyták jelenléte azt jelzi, hogy a fertőzést gyulladásos folyamat kíséri.(Steiner és mtsai 1998). A detektálás szokványos módszere az E. coli törzs izolálása székletből, majd az AA mintázat kimutatása Hep-2 sejttenyészeten, amely vizsgálat egyébként „gold standard” módszernek számít az EaggEC csoportba soroláskor. Ezen kívül alkalmazható DNS próba „colony blot” hibridizáció során, főként azokban az esetekben, amikor a normál flóra tagjaitól kell elkülöníteni a patogén törzset. A betegből izolált EAggEC törzs esetében ugyancsak fontos kérdés, hogy a kitenyészett baktérium felelős-e a tünetekért.
3.5.10.
Diffúzan adheráló E. coli (DAEC)
Olyan hasmenést okozó csoport, amely a HEp-2-höz diffúzan adherál, nem alkot az EPEC-hez hasonló mikrokolóniákat, vagy az EAggEC-re típusos aggregatív adherenciát. A DA-ra a HeP-2 szövettenyészeten szétszórt baktériumok jellemzőek, esetleg minimális aggregáció, míg az üvegfelületen nem észlelhető adherencia. (3. ábra) A DAEC okozta hasmenés sokkal gyakrabban fordul elő idősebb gyermekekben, mint csecsemőkben (Gunzberg és mtsai 1993), a DAEC okozta hasmenés kockázata 1 éves kortól 4-5 éves korig nő (Levine és mtsai 1993). Egy francia kórházi járvány kapcsán DAEC-en kívül nem sikerült más enterális kórokozót kimutatni, ami azt sugallja, hogy ez a csoport a fejlett országokban is szerepet játszhat a hasmenések patogenezisében (Jallat és mtsai 1993).
31
3.5.10.1. Patogenezis Keveset tudunk a DAEC patogenetikai tulajdonságairól. Valószínűleg sejtfelszíni fimbriák (F1845) adják ezt a jellegzetes fenotípust, amelyeket plazmidon hordozott és kromoszomális gének egyaránt kódolnak. A DAEC törzsek 75%-a hordozza ezt a fmbriát, vagy egy ehhez hasonló adhezint (Carnoy és mtsai 1997). Ezeken a faktorokon kívül azonban feltételezhetően további virulencia markerei is lehetnek az enterális megbetegedést okozó DAEC-eknek.
3.5.10.2. Detektálás és diagnózis Csak néhány járványügyi és klinikai tanulmány írja le a pontos tüneteket: vizes hasmenés, mely nem tartalmaz vért vagy leukocitákat (Poitrineau és mtsai 1995). Definíció szerint a DAEC törzsek a HEp-2 szövettenyészeten DA patternt mutatnak, tehát a csoport azonosításához szövettenyésztésre van szükség A F1845-s fimbriát kódoló daaC génre DNS próbát is kidolgoztak, mivel azonban a fimbriák nagyon közeli rokonságban állnak, és magas a homológia az őket kódoló szakaszok között, ez a vizsgálat nem igazán megbízható. (Germani és mtsai 1996).
3.5.11.
Az extraintesztinális fertőzést okozó E. coli törzsek (ExPEC)
A baktérium számos virulencia faktor birtokában képes különféle szervek megbetegítésére. Ilyen például a sejtburok lipopoliszacharid (LPS) összetevője, a felszíni tok antigének (K1, K5), a hemolizin, colicin, aerobactin, toxinok stb. Mindezek mellett különböző tulajdonságok, például az adhezinek hordozása is elősegítheti a kolonizációt.
3.5.11.1. Meningitis asszociált E. coli törzsek (MAEC) Az újszülöttek meningitisében nagy szerepet játszik az E. coli baktériumok K1 antigén hordozása, amelynek kémiai szerkezete (2, 8 szialinsav polimer) igen közeli rokonságot mutat a N. meningitidis B, H. influenzae a és b antigének, valamint az
32
újszülött agysejtek kémiai szerkezetével. Ez a magyarázat arra, hogy az újszülöttek meningitiséből izolált törzsekre leggyakrabban K1 felületi antigén a jellemző. Külön csoportot képeznek az O78-as szerocsoportba tartozó E. coli baktériumok, amelyek baktérium vasfelvételében előnyt jelentő aerobactin termelésükkel tűnnek ki. Az anyai eredetű fertőzés intrapartum – a szülőutakon való áthaladás közben -, jöhet létre, míg az újszülött osztályon az ápolók közvetítésével terjedhet el. (Czirók és Herpay 1999) Az extraintesztinális fertőzések egyik következménye lehet a sepsis, amely általában szervi lokalizációból indul ki (pyelonephritis, cholecystitis, hasűri tályog stb.). Az ilyen fertőzéseket okozó E. coli törzsekre jellemző, hogy a baktérium mannóz rezisztens hemagglutinációs- (MRHA-adhéziós), S- vagy P-fimbria-, hemolizin- és aerobactin termelő képességgel rendelkezik. Ezzel magyarázható, hogy a sepsises betegek hemokultúrájából gyakran hemolizáló, hemagglutináló E. coli törzsek tenyésznek ki.
3.5.11.2. Húgyúti megbetegedéseket E. coli törzsek (UPEC) A húgyúti fertőzések többsége autogén, ascendáló úton jön létre. A nőket érintő húgyúti fertőzések esetén a rövid urethra sokszor fontosabb szerepet tölt be, mint a kórokozó esetleges virulencia faktorai. Az acut pyelonephritises betegek húgyutaiból izolált E. coli törzsek több mint 90%a hordoz P-, illetve S-fimbriákat. Ennek azért van nagy jelentősége, mert a felső húgyutak epitélsejtjein gyakran fordulnak elő e fimbriákra specifikus receptorok (αszialin-β-galaktóz).
3.6.
ESBL-termelő E. coli törzsek
A kiterjedt spektrumú β-laktamázokat (ESBL) termelő baktériumok világszerte súlyos fertőzéseket okoznak. Főleg kórházi járványokat okoznak, de sporadikus esetekből is egyre gyakrabban izolálják őket (Sonnevend és mtsai 2006). Az elmúlt években Magyarországon is jelentősen nőtt az incidenciájuk. A
β-laktámokkal
szembeni
rezisztencia-mechanizmusok
közül
az
egyik
legfontosabb a β-laktamáz enzim termelése, melynek működése során a β-laktám gyűrű felhasad. Ez a folyamat kivédhető, ha az antibiotikumot β-laktamáz inhibitorral
33
kombinálják. Utóbbi vegyület önmagában nem képes elpusztítani a baktériumot, de az enzimműködés gátlásával elősegíti, hogy az antibiotikum kifejtse a hatását (Finch és mtsai 2003). Az
ESBL
termelő
baktériumok
a
bontóenzimek
mutánsának
termelése
következtében széles körben rezisztensek a penicillinekre és cefalosporinokra, illetve esetükben in vivo már a β-laktamáz gátlók (clavulansav, sulbactam, tazobactam) sem hatékonyak (Bush és mtsai 1995). E törzsek ellen a β-laktámok közül egyedül a carbapenemek hatásosak. Az ESBL-eket eleinte a TEM (Temoneira) és SHV (szulfhidril variabilitás) típusba sorolták. Ma már több mint száz ESBL gént ismerünk, és a CTX-M típust is a leggyakoribbak között tartják számon A TEM-1 a legáltalánosabban előforduló, plazmidon kódolt β-laktamáz enzim, amelyet jellemzően Gram-negatív enterális baktériumokból (Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Morganella morganii, Proteus mirabilis, Salmonella spp.) lehet kimutatni. Ezzel szemben az SHV-típusú enzim Klebsiella pneumoniae törzsekből származik. Az ESBL géneket eredetileg valószínűleg egy kromoszómálisan hordozott gén kódolta, ami később plazmidra került ki, és így terjedt szét az Enterobacteriaceae család tagjai között. (Livermore 1995). Az SHV-típusú enzimek száma 80 körül, a TEMvariánsoké pedig 150 körül mozog. 1987-ben felfedeztek egy másik plazmid mediált βlaktamázt, amelyet CTX-M-1-nek neveztek el, ezzel utalva arra a tulajdonságára, hogy in vitro a cefotaximot jobban bontja, mint a ceftazidimet (Brun-Buisson és mtsai 1987). Ma a CTX-M-14, CTX-M-3 és a CTX-M-2 képviselik a legelterjedtebb enzimtípusokat, melyeknek összesen már 53 fajtáját írták le. (www.lahey.org/Studies/webt.htm) Magyarországon 2002 eleje óta működik az ESBL-termelő Gram-negatív kórokozók Nemzeti Referencia Laboratóriuma az Országos Epidemiológiai Központban (OEK). A beküldött izolátumok száma folyamatosan emelkedik: 2002-ben 127, 2003-ban 265, 2004-ben 297, 2005-ben pedig 769 volt az ESBL-pozitív törzsek száma. Ez az emelkedő tendencia is a csoport növekvő jelentőségét támasztja alá, melyek körében a Klebsiella spp. után az E. coli a második leggyakoribb izolátum. Az ESBL pozitív E. coli törzsek 92,1%-a SHV-típusú ESBL-gént hordoz.
34
4.
CÉLKITŰZÉSEK
Az Enterális megbetegedést okozó Aerob Baktériumok Nemzeti Referencia Laboratóriumában (ENRL), valamint a jogelődjében, az Nemzeti Escherichia coli Referencia Laboratóriumban (NERL) 1976 és 2001 között a patogén E. coli diagnosztika hagyományosan a szerotípus meghatározáson alapult, melyet bizonyos szerotípusok esetén fenotípusos virulenciafaktor kimutatása követett (verotoxin kimutatás ELISA-val, latex alapú módszerrel, szövettenyésztéssel, EIEC gyanú esetén Serény-teszt, O78-as törzseknél colV termelés igazolása, ETEC törzsek esetében ELISA-val és latex teszttel). Járványos megbetegedések esetén epidemiológiai vizsgálatként fágtipizálást végeztünk. A patogén E. coli törzsekkel kapcsolatos ismereteink gyarapodásával nyilvánvalóvá vált, hogy új módszerek adaptálására, valamint a diagnosztikus lépések sorrendjének megváltoztatására van szükség. Ennek eleget téve munkám során molekuláris patogén markerek kimutatására alkalmas új módszereket vezettem be (melyek egy részét 2006. óta akkreditált vizsgálatként végezzük) és magát a munkafolyamatot is racionalizáltuk. Reményeim szerint - a surveillance javulásával párhuzamosan - ezek a változtatások elősegítik, hogy az eddiginél nagyobb számban izolálhatjuk a betegek klinikai mintáiból a patogén E. coli-t, mint kórokozó ágenst. A dolgozatomban részletezett célok, és vizsgálatok a következők: 1. A molekuláris módszerek bevezetése a humán patogén Escherichia coli törzsek kimutatásában, virulenciafaktor azonosításának és tipizálásának céljából 2. A hagyományos csőagglutináció helyett mikroplate agglutinációs-módszer bevezetése a szerotipizálás során. 3. A
2007-2008
között
izolált
ESBL-termelő
Escherichia
coli
törzsek
szerotipizálása, és az eredmények összevetése a világszerte elterjedt klónok szerotípusaival.
35
4. A verotoxin2 gén toxin két fontos altípusának meghatározása PCR és PCRRFLP módszerek segítségével. 5. A Magyarországon 2000-2006 között izolált verotoxin termelő Escherichia coli törzsek
feno-,
és
genotípusos
összehasonlítása a külföldi adatokkal.
36
jellemzése,
valamint
az
eredmények
5.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
5.1.
Baktériumtörzsek
A Nemzeti Escherichia coli Referencia Laboratóriumba beküldött és tipizált törzseket 1976-óta törzsgyűjteményünkben tároljuk. A beküldőlapokon található betegadatok (életkor, lakhely, tünetek, diagnózis, stb.), valamint a laborvizsgálati eredmények lehetővé teszik, hogy ezeket a baktériumokat retrospektív tipizáló, valamint epidemiológiai vizsgálatokhoz használjuk fel. A törzsek humán kórképekből lettek izolálva, és részint az illetékes egészségügyi intézményből
közvetlenül,
részint
a
területileg
illetékes
ÁNTSZ
(Állami
Népegészségügyi és Tisztiorvosi Szolgálat) laboratóriumán keresztül kerültek a referencia laboratóriumba. A patogén marker kimutatásokhoz az összegyűjtött törzsekből válogattam ki a megfelelőket: 15 EIEC feno és szerotípusút az ipaH detektáláshoz, 15 enterohemolizin termelőt az ehlyA gén jelenlétének igazolásához, és a verotoxin termelők közül 25 intimin pozitívat az intimin és az intimin-altípusok kimutatásához. A verotoxin vizsgálatot azokon a 2000-2006 között beküldött 33 törzsön végeztem el, melyek verotoxin ELISA-val (RidaScreen Verotoxin ELISA, R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany) korábban pozitív eredményt adtak, és humán megbetegedéshez (hasmenés, véres hasmenés [HC] illetve HUS) voltak köthetőek. Ugyanezekkel a törzsekkel optimalizáltam a verotoxin tipizálást célzó PCR-RFLP módszert is. Az ESBL-termelő E. coli törzsek szerotipizálásához a vizsgált 280 E. coli törzset az OEK ESBL Referencia Laboratóriumából kaptuk, előzetes identifikálás és az ESBLtermelés megerősítését követően. A mikroplate agglutinációs módszerhez a törzsközponti O sorozat 173 tagjából készítettem agglutinációra alkalmas antigéneket, melyeket a csőagglutinációs vizsgálathoz hasonlóan alkalmaztam. A specifikus agglutináló savók is ugyanezen törzsek felhasználásával készültek az Orskov által leírt metodika szerint (1984). A molekuláris beállítások során használt kontroll törzseket az Orvosi Baktériumok Magyar Nemzeti Gyűjteményéből (HNCMB) válogattuk ki, és a 2. táblázatban foglaltam össze.
37
2. táblázat A molekuláris vizsgálatához használt kontroll törzsek
Kontroll törzs jelzése
Alkalmazása
Szerepe
vtx1,2 PCR 30328 (HNCMB)
+ kontroll
eae PCR ehlyA PCR
30008 (HNCMB)
ipa PCR
+ kontroll
M13
ast1 PCR
+ kontroll
10407
hőlabil enterotoxin PCR
+ kontroll
10407 Salmonella Braenderup H9812 HB101
hőstabil enterotoxin
+ kontroll
E. coli O157 PFGE
molekuláris standard
általános
- kontroll
5.2.
Baktériumtörzsek fenotípusos vizsgálata
A vizsgálatokhoz felhasznált táptalajok a következők voltak: 1. Véres lemezagar 2. Eozin-metilénkék lemezagar 3. szorbitos McConcey lemezagar 4. Magas bouillon, tápleves 5. Rajzó lágyagar 6. Rajzó tápleves A beküldött székletmintát, baktériumtörzset vagy tenyészetet - a nemzeti enterális protokoll alapján (Herpay és mtsai 2006) - steril oltókaccsal SMAC, eozin-metilénkék (EM), valamint véres (V) táptalajra (OEK, Táptalajkonyha) szélesztettük, és 37 °C-on, aerob körülmények között 18-24 órán át inkubáltuk. Ezt követően ellenőriztük az egyes izolátumok
tisztaságát,
laktóz-
és
szorbit-felhasználását,
képességét.
38
valamint
hemolizáló
5.2.1.
Tárgylemezagglutináció
Az eozin-metilénkék vagy szorbitos-McConcey táptalajról egy napos inkubáció után elvégezhető a tárgylemez-agglutináció is. A baktériumsejt számos szerkezeti eleme (sejtfal, tok, csilló) antigén tulajdonsággal rendelkezik, így vizes közegben, specifikus ellenanyag jelenlétében szabad szemmel könnyen megfigyelhető durva rögképződés, azaz agglutináció alakul ki. A vizsgálat során steril tárgylemezre cseppentettünk egy csepp specifikus ellenanyag tartalmú agglutináló savót, majd steril kacs segítségével kis mennyiségű baktérium-tenyészetet szuszpendáltunk fel benne. A jól látható agglutináció néhány másodperc múlva alakult ki.
5.2.2.
Csőagglutináció
A tárgylemez–agglutinációs eredményeket csőagglutinációs vizsgálattal erősítettük meg az adott savó kimerített (keresztreakciót már nem adó) monovalens savójával, a nem agglutináló izolátumokat pedig poliklonális polivalens-monovalens-kimerített monovalens agglutináció sorozat segítségével szerotipizáltuk az Orskov által leírt módszert követve (Orskov és Orskov 1984). A vizsgálandó baktériumtörzseket a beoltott tápleves 18-24 órán át 37 ºC-on történő inkubációja után 2 és 1/2 órás 100°C-os hőkezeléssel elöltük, így kaptuk meg az agglutinálásra alkalmas O antigént. A H antigén hőérzékeny, ezért hőkezelés helyett formalinos fixálást alkalmaztunk. Előtte az antigén megerősítése céljából kétszer átpasszáltuk rajzó lágyagaron, majd rajzó táplevesben végeztük el a baktériumok elölését. O antigén: a baktériumsejtek felszínén elhelyezkedő hőrezisztens lipopoliszacharid (LPS) vegyület, mely az ellene termelt immunsavóval reagálva szemcsés típusú agglutinációt ad. H antigén: a csillóban található, fehérjetermészetű hőérzékeny anyag. Élő vagy formalinozott baktériumszuszpenzióval termelt savóban, a fejlett csillóval rendelkező sejtek gyorsan, pelyhesen agglutinálnak. Mindkét esetben egy ún. agglutinoszkóp használata szükséges az eredmények leolvasásához.
39
Előfordulnak azonban olyan defektív LPS struktúrával rendelkező R-es, (ún. rögös [rough] felszínű), lapos és gyakran csipkés szélű telepek, amelyek hajlamosak a spontán agglutinációra, ezért nem szerotipizálhatóak. Azokat a törzseket, amelyek a labor savókészletében nem agglutináltak, és a fiziológiás sóoldatban nem csapódnak össze spontán, Onem tipizálható-ként (ONT) jelöltük. A tárgylemez- és a csőagglutináló savók az OEK Bakteriológia II. osztályán a Savó-és Diagnosztikum Termelő Egységben készültek (ún. specifikus home-made savók) a hagyományos módszer alapján (Orskov és Orskov 1984).
5.2.3.
Verotoxin ELISA
A verotoxin ELISA egy indirekt szendvics immunoassay, amely a verocitotoxinok kvalitatív kimutatására alkalmas, néhány óra alatt kivitelezhető, kevéssé eszközigényes módszer. A vizsgálat lépései: A SMAC-on kinőtt 18-24 órás baktériumtenyészetből steril kacsra felvett kb. gyufafej nagyságú baktériumtömeget 200 μl hígító oldatban elkevertük, majd a verocitotoxin 1 és 2 elleni specifikus ellenanyagokkal bevont mikrotitráló lemez (96 lyukú ELISA lemez) vájulataiban szobahőmérsékleten inkubáltuk. Amennyiben a mintában jelen volt valamelyik toxintípus, kialakult a toxin-antitoxin komplex és a mintában levő toxin lekötődött a szilárd fázishoz. A mosást követően a vájulatokba ellenanyaggal konjugált tormagyökér peroxidázt (horse radish peroxidase-HRP) mértünk (ún. konjugátum). Ha a mintába jelen volt a verocitotoxin, az enzimkapcsolt ellenanyag specifikusan kötődni tudott hozzá. A lekötött enzim mennyisége és az összaktivitása arányos a kialakult immunkomplex mennyiségével. Újabb mosás után az enzimaktivitást ún. kromogén (tetrametilbenzidin) szubsztrátoldat (urea-peroxid) hozzáadásával határoztuk meg, amely az enzim hatására színes termékké alakult. A bemért kontrollok és a minták abszorbanciáját (OD-értékét) 450/620 nm hullámhosszon olvastuk le, majd a tesztleírásnak megfelelően kiértékeltük a kapott eredményeket.
40
5.2.4.
VTEC reverz passzív latex agglutináció (VTEC-RPLA)
A módszer alapja, hogy a tisztított (nyúl) VT1 és VT2 antiszérummal érzékenyített polimer latexrészecskék egyik, vagy mindkét toxin jelenlétében agglutinálnak. Ennek eredményeként rácsos térszerkezet alakul ki, amit szabad szemmel zavaros oldatként észlelünk. Verotoxin hiányában negatív lesz az eredmény, és a latex golyócskák leülepednek a V-furatú lemez vájulataiban. ahol jól látható, éles határú pontot alkotnak. A teszt polymixin-B oldat használatával érzékenyíthető, ami potenciálisan fokozza a vizsgált törzsből a verotoxin felszabadulást. Az előkészületek során a vizsgálandó törzset egy éjszakán keresztül rázó vízfürdőben CA-YE (Casamino Acids-yeast extract)
folyékony táplevesben szaporítottuk.
Centrifugálás után a felülúszó felét polymixinnel kezeltük, és párhuzamosan mindegyik mintából két vizsgálatot végeztünk. A V-furatú lemez vájulataiba 25 μl mintát mértünk, melyből felező hígítási sort készítettünk. Negatív kontrollként hígító oldatot használtunk. Mindegyik lyukba 25 μl, jól felszuszpendált latexet mértünk be. A vt1 és a vt2 ellenanyagokat elkülönített sorokban vizsgáltuk. Pozitív kontrollként mindig a HNCMB 30328-as jelzésű E. coli törzset állítottuk be. A lemezt nedves kamrában 37 °C-on inkubáltuk. Az eredményt 24 és 48 óra elteltével is leolvastuk, mivel 2 nap múlva esetenként típusosabb agglutinációt észlelhetünk.
5.3.
Mikroplate módszer O szerocsoport meghatározására
A csőagglutináció elvén alapuló, de kivitelezését és értékelését tekintve a VTECRPLA-hoz hasonló vizsgálat. A hővel elölt E. coli tenyészetet (O antigént) 0,005 % (w/v)-os kristályibolya vizes oldatával megfestettem, majd 1:1 arányban (50-50 μl) összemértem az agglutináló savóval. 18-24 órás, 37 ˚C-on történő inkubálás után szabad szemmel is leolvasható volt az eredmény (7. ábra). A pozitív agglutinációs tesztet a vájatban egyenletesen zavaros szuszpenzió jelezte. Ha a vájulat aljában összegyűlve leülepedett az antigén, és a negatív VTEC-RPLA-hoz hasonlóan éles határú pontot
41
alkotott, akkor agglutináció nem alakult ki. Az agglutinációs titer meghatározásának céljából felező hígítási sort készítünk a vizsgált antigénre specifikus savóból, és ahhoz adjuk festett antigént (Guinae és mtsai 1972), majd leolvassuk az eredményt.
5.4.
Antibiotikum érzékenységi vizsgálat
Az Escherichia coli antibiotikum érzékenységi vizsgálata a CLSI útmutatása alapján történt (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)). A következő antibiotikumokat alkalmaztuk: ampicillin (Amp-10 μg), streptomycin (S-10 μg), sulphafurazol (Sul-300 μg), tetracyclin (Te-30 μg), sulphamethoxazol +trimetoprim (Sxt-25 μg), chloramphenicol (C-30 μg), ciprofloxacin (Cip-5 μg), gentamicin (Cn-10 μg), kanamycin (K-30 μg), nalidixinsav (Na-30 μg) és cefotaxim (Ctx-30 μg). A vizsgálat során az E. coli ATCC 25922-es kontrolltörzset használtuk.
5.5.
ESBL-termelő E. coli törzsek vizsgálata
Az általunk vizsgált baktériumcsoportot az OEK Bakteriológiai I. osztály, ESBL Referencia Laboratóriumába küldött törzsekből gyűjtöttük ki. Az ESBL termelést a laboratórium protokollja szerint a CLSI ajánlása alapján korongdiffúziós módszerrel vizsgáltuk. A 3. táblázatban szereplő korongdiffúziós értékekkel rendelkező Escherichia coli törzseket tekintettük ESBL-termelésre gyanúsnak. Az ESBL-termelés kimutatása során Müller-Hinton lemezagarra ceftazidim (30 μg) – ceftazidim (30 μg)/clavulansav (10 μg); cefotaxim (30 μg) – cefotaxim (30 μg)/clavulansav (10 μg) és cefpodoxim (30 μg) – cefpodoxim (30 μg)/clavulansav (10 μg) tartalmú korongokat helyeztünk. A korongok középpontjai egymástól minimum 20mm-es távolságban voltak. A tesztet pozitívnak értékeltük, ha legalább egy antibiotikum esetében a clavulansavval kombinált korong gátlási zónája legalább 5 mmel meghaladta a clavulansavat nem tartalmazó korong gátlási zónáját
42
3. táblázat Az ESBL termelésre gyanús E. coli izolátumok korongdiffúziós értékei
Antibiotikum
Zónaátmérő (mm)
Cefpodoxim
≤ 17
Ceftazidim
≤ 22
Aztreonam
≤ 27
Cefotaxim
≤ 27
Ceftriaxon
≤ 25
Az ESBL-termelés megerősítése multiplex PCR reakcióval történt, az SHV tipizálás során pedig a PCR-t RFLP vizsgálattal kombináltuk, amelyet az ESBL Referencia Laboratórium végzett el. Szintén az ESBL Referencia Laboratóriumban határozták meg a vizsgált törzsek filogenetikai csoportjait (A1, B1, B2, C és D), valamint ott végezték a világszerte elterjedt O25b-ST131-es klón specifikus PCR vizsgálatait. A filogenetikai csoport meghatározása azért bír jelentőséggel, mert egy-egy csoportot eltérő virulencia- tulajdonságok és ESBL-típusok jellemeznek. A négy fő csoport eltérő arányban fordul elő az állatokban és az emberekben. A kiemelt jelentőségű O25bST131-es klón a B2 filogenetikai csoport tagja, és CTX-M típusú ESBL-t termel.
43
5.6.
Polimeráz lánc reakció (polymerase chain reaction - PCR)
A vizsgálat célja a patogén Escherichia coli törzsekben megtalálható virulenciamarkerek, illetve egyéb fontos markergének kimutatása. A PCR lehetővé teszi, hogy a vizsgált baktériumból kimutassuk a keresett DNS szakaszt, és igazoljuk az adott tulajdonságért felelős gént, génszakaszt, illetve -régió hordozását. A módszer alkalmazása során a hőstabil DNS polimeráz katalizálja a 2 oligonukleotid primerrel homológ DNSszekvencia által határolt DNS szakasz amplifikálását. A termék mennyisége a reakció során alkalmazott hőmérsékleti ciklusokkal arányosan nő. A vizsgálat specifitását a szekvenciára tervezett primerek adják. A reakció különböző lépései során: 1.
95 °C-on a target DNS denaturálódik;
2.
50-59 °C-on a primerek a komplementer régiókhoz kötődnek (anneláció);
3. 72 °C-on történik az elongáció, azaz a polimeráz enzim a primereket meghosszabbítva felépíti a keresett régió kiegészítő szálát. Ezek a lépések adott számú cikluson keresztül ismétlődnek, mialatt az amplikonok száma
detektálható
gélelektroforézissel
szintre detektáljuk
emelkedik a
(4/B
táblázat).
fragmentumokat,
és
A
ciklusok
után
molekulasúly-markerrel
azonosítjuk a keresett mérettartományokat (4/A táblázat). A vizsgálat első lépése szokványosan a DNS kinyerését célozza. Az Escherichia coli esetében azonban elegendő, ha az egy éjszakán át 37 °C-on, táplevesben növesztett baktérium-szuszpenzió 2 μl-ét használtuk fel mintaként. Ezt követte a PCR-vizsgálat, amelybe reakciónként ugyanolyan összetételű mixet mértem. 18 μl mix tartalma végkoncentrációban: 200 μM dNTP (Eppendorf AG, Hamburg, Germany), 1 μM primerenként (IDT Inc.), 2 μl a 10x koncentrációjú DNS PCR pufferből, amely 1,5 mM MgCl2-t is tartalmaz (ABGene, Surrey, UK) és 0,5 U ThermoprimePlus DNS polimeráz (ABGene, Surrey, UK). A különböző primerpárokat, illetve az annelációs hőprofilokat a 4/a és a 4/b táblázatban tüntettem fel. A reakciót követően a termékeket 1%-os agaróz gélen (0,4 g agaróz [Sigma] + 40 ml Tris-Borsav-EDTA puffer (TBE) + 1 μl Etidium-bromid), 110 V-on, 50 percig futtattam 50 bp-os léptékű molekulasúly markert használva (DirectLoadTM Step Ladder, Sigma).
44
Az eredményt UV lámpa segítségével detektáltam, és minden esetben digitális fényképen rögzítettem.
5.6.1.
Intimin típus meghatározás
Az A/E léziót okozó fehérje, az intimin kromoszómálisan kódolt az ún. LEE patogenitási szigeten. A súlyos megbetegedésekkel asszociált VTEC törzsek általában hordozzák az eae gént. A fehérje C terminális vége a receptorhoz való kötődést segíti, és ez a variábilis régió felelős a különböző szöveti gazdasejt-tropizmusért (Zhang és mtsai 2003). Jelenleg 17 intiminvariánst ismerünk, munkám során azonban csak a két legfontosabbat, az EHEC törzsekben gyakran előforduló γ1-et és az EPEC asszociált β1-et vizsgáltam. Mindkét esetben nagyméretű termékeket vártam (2000 bp <), ezért ún high fidelity Taq polimerázt (Promega) használtam az optimálisabb PCR eredmények érdekében. A többi PCR körülmény a fent leírtakkal megegyezett (4/a és 4/b táblázatok).
45
4/a táblázat A PCR vizsgálatok során használt primerpárok szekvenciái és a referenciái Gén
Név
vtx1
Verotoxin 1
vtx2
Verotoxin 2
ehlyA
Enterohemolizin
eae
Intimin
ast1
Enteroaggregatív hőstabil toxin
vtx1,2
Verotoxin
vtx2
Verotoxin 2 altípus
vtx2d
Verotoxin 2 altípus d
saa
STEC autoagglutinatiós adhezin
st
ETEC hőstabil toxin
lt
ETEC hőlabil toxin
IpaH
Inváziós plazmid
fliC
H antigént kódoló flagellin gén
eae β
intimin β altípus
eae γ
intimin γ altípus
Primer
Oligonukleotid szekvencia (5’-3’)
V1
5’-AGTTAATGTGGTGGCGAA-3’
V5
5’-GACTCTTCCATCTGCCG-3’
V3
5’-TTCGGTATCCTATTCCCG-3’
V4
5’-TCTCTGGTCATTGTATTA-3’
HlyA1
5’-GGTGCAGCAGAAAAAGTTGTAG-3’
HlyA4
5’-TCTCGCCTGATAGTGTTTGGTA-3’
SK1
5’-CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC-3’
SK2
5’-CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG-3’
EAST1
5’-GCCATCAACACAGTATATCC-3’
EAST2
5’-GAGTGACGGCTTTGTAGTCC-3’
MK1
5’-TTTACGATAGACTTCTCGAC-3’
MK2
5’-CACATATAAATTATTTCGCTC-3’
GK3
5’-ATGAAGAAGATGTTTATG-3’
GK4
5’-TCAGTCATTATTAAACTG-3’
VT2cm
5’-AAGAAGATATTTGTAGCGG-3’
VT2f
5’-TAAACTGCACTTCAGCAAAT-3’
SaaDF
5’-CGTGATGAACAGGCTATTGC-3’
SaDR
5’-ATGGACATGCCTGTGGCAAC-3’
est1
5’-GCTAAACCAGTAGGGTCTTCAAAA-3’
est2
5’-CCCGGTACAGGCAGGATTACAACA-3’
elt1
5’-TCTCTATGTGCATACGGAGC-3’
elt2
5’-CCATACTGATTGCCGCAAT-3’
EinF
5’-TGGAAAAACTCAGTGCCTCTGCGG-3’
EinvR
5’-TTCTGATGCCTGATGGACCAGGAG-3’
F-fliC1
5’-ATGGCACAAGTCATTAATACCCAA-3’
R-fliC2
5’-CTAACCCTGCAGCAGAGACA-3’
SK1
5’-CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC-3’
LP3
5’-CCGAATTCTTATTCTACACAAACCG-3’
SK1
5’-CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC-3’
LP4
5’-CCGTGATACCAGTACCAATTACGGT-3’
46
Termék mérete
Referencia
817 bp
Yatsuyanagi (2003)
474 bp
Yatsuyanagi (2003)
1551 bp
Schmidt (1995)
881 bp
Schmidt H (1995)
104 bp
Yatsuyanagi (2003)
224 bp
Karch (1989)
260 bp
Karch (1997)
256 bp
Pierard (1998)
119 bp
Paton (2002)
147 bp
Nguyen (2005)
322 bp
Nguyen (2005)
140 bp
Pass (2000)
5001970 bp
Fields (1997)
2792 bp
Oswald (2000)
2287 bp
Oswald (2000)
4/b táblázat A PCR reakciók hőmérsékleti körülményei
target gén
primerek
ciklusok száma
Kezdő Denaturáció Anneláció denaturáció
Elongáció
Végső elongáció
Hűtés
vtx1 - vtx2
V1-V5 V3-V4
30
95°C 3 min
95°C 20 sec
53 °C 40 sec
72°C 90 sec
72°C 5 min
4°C ∞
eae
SK1-SK2
30
95°C 3 min
95°C 20 sec
59 °C 40 sec
72°C 90 sec
72°C 5 min
4°C ∞
ehlyA
Hlya1Hlya4
30
95°C 3 min
95°C 20 sec
59 °C 40 sec
72°C 90 sec
72°C 5 min
4°C ∞
ast1
EAST1EAST2
30
95°C 3 min
95°C 20 sec
55 °C 30 sec
72°C 1 min
72°C 5 min
4°C ∞
st
est1-est2
35
95°C 3 min
95°C 20 sec
48°C 30 sec
72°C 30 sec
72°C 5 min
4°C ∞
lt
elt1, elt2
35
95°C 3 min
95°C 20 sec
50°C 45 sec
72°C 45 sec
72°C 5 min
4°C ∞
ipaH
EinFEinvR
30
95°C 3 min
95°C 30 sec
55 °C 30 sec
72°C 1 min
72°C 5 min
4°C ∞
fliC
FfliC1RfliC2
35
95°C 3 min
95°C 45 sec
55°C 90 sec
72°C 2 min
72°C 5 min
4°C ∞
vtx1,2
MK1-MK2
30
95°C 3 min
95°C 25 sec
42°C 20 sec
72°C 20 sec
72°C 5 min
4°C ∞
vtx2 altip
GK3-GK4
30
95°C 3 min
95°C 25 sec
52°C 1 min
72°C 40 sec
72°C 5 min
4°C ∞
vtx2d
Vt2cmVt2f
30
94°C 5 min
94°C 25 sec
55°C 50 sec
72°C 25 sec
72°C 5 min
4°C ∞
eae β
SK1-LP3
30
94°C 5 min
94°C 30 sec
60°C 30 sec
72°C 2:30 sec
72°C 5 min
4°C ∞
eae γ
SK1-LP4
5 + 30
94°C 5 min
94°C 30 sec
48+59°C 30 sec
72°C 3:00 sec
72°C 5 min
4°C ∞
47
5.7.
PCR-RFLP
A módszer a detektálást és a molekuláris tipizálást egyszerre teszi lehetővé. Az első lépése egy PCR, melynek során a specifikus primerpárral amplifikálják a target DNS szakaszt. Általában nagy variabilitással bíró régiókra tervezik a reakciót, hiszen a termék restrikciós endonukleázzal való hasítása során kapott különböző mintázatok segítik majd a tipizálást. Az eredmény detektálása ebben az esetben 1,5%-os gélen történik 1,5 órás futtatás után.
5.7.1.
vtx2c és vtx2d-O118 elkülönítése
A verotoxin termelő izolátumokat elsőként az MK1-MK2 primerrel összeállított PCR-el vizsgáltam. Ez az univerzális PCR a vtx1-t, vtx2-t és a klinikailag releváns vtx2 altípusokat is kimutatja. Két fontos feltételnek kell teljesülnie ahhoz, hogy ezt egy PCRen belül, egy primerpárral sikeresen detektálni lehessen. Az egyik a relaxált PCR körülményekre (alacsony annelációs hőmérsékletre) vonatkozik, a másik az ún. lötyögő primerek jelenlétére. Ezek a primerek úgy vannak megtervezve, hogy nem illeszkednek tökéletesen, tehát 1-2 bázis nem egyezik a target DNS szál szekvenciájával (5. ábra). Ennek folytán alacsonyabb hőmérsékletre van szükség ahhoz, hogy a primer be tudjon kötődni a homológ szakaszhoz. Az MK1-MK2 PCR esetében ez 42 °C. Az ezt követő reakcióban a vtx2 B alegység variábilis régióira tervezett GK3-GK4 primerek segítségével amplifikáltam a targetet. Ebben az esetben már csak a vtx2 és altípusai (vtx2c, vtx2d-O118) adtak terméket, amelyet ezután HaeIII és FokI restrikciós endonukleáz (Promega) segítségével hasítottam (2 óra, 37 ˚C) (4. ábra). 1,5%-os gélen 1,5 órán át 70 V-on futtatva tudtam elkülöníteni a vtx2c-re és a vtx2d-O118 -re jellemző hasítási mintázatot. HaeIII: 5’…GG ↓ CC..3’
FokI: 5’...GGATG(N)9↓..3’ 4. ábra A HaeIII és a FokI hasítási helyei
48
Forward primer (MK1): 311 330 vtx1: ······TTT ACC TTA GAC TTC TCG AC····· vtx2: ······TTT ACG ATA GAT TTC TCG AC····· Primer1: 3’ TTT ACG ATA GAC TTC TCG AC 5’ Reverse primer (MK2): 515 535 vtx1: ·······GAA CGA AAT AAT TTA TAT GTG····· vtx2: ·······GAG CAA AAT AAT TTA TAT GTG····· Primer2: 3’CTC GCT TTA TTA AAT ATA CAC 5’ 5. ábra A vtx1,2 kimutatásához használt MK1 és MK2 primerek szekvenciái és illeszkedési hibái
5.7.2.
A flagelláris H antigén tipizálás
A H (flagelláris) antigéncsoportban 57 típust írtak le eddig; melyeket a fliC gén kódol. A flagellin N’ és C’ terminálisa konzervált szerkezetű, de a középső régiója erősen variábilis, ez adja az antigéntulajdonságát. Ennek következtében a gén 5’ és 3’ vége alkalmas arra, hogy primert tervezzünk rájuk (F-fliC1- R-fliC2). A PCR termékek azonban az antigénszerkezettől függően különbözőek lehetnek. A termék RsaI-es hasítása után, majd a fent leírt módon detektálva megkaptuk a H antigénre jellemző specifikus RFLP mintázatot (Fields és mtsai 1997; Moreno és mtsai 2006). A fliC PCR-hez nem használtam kontrollt, mert minden egyes H antigén esetében más méretű terméket kaptunk, a méret azonosításához pedig elegendő a molekulasúly marker (DirectLoadTM Step Ladder, Sigma) használata. A reakciót a törzsközponti H antigén sorozattal állítottam be, majd a termékeket RsaI restrikciós endonukleázzal (Promega) hasítottam (2 óra, 37 ˚C). A detektálás ebben az esetben is 1,5%-os gélben, 1,5 órás futtatás után történt.
49
5.8.
Pulsed-field gélelektroforézis (PFGE)
A törzsekből a teljes DNS kinyerése után, a CDC Pulsenet standardizált Escherichia coli O157:H7 protokollja alapján végeztük el a PFGE vizsgálatot. A vizsgálat lépései: - Baktériumszuszpenzió készítése - Plugkészítéséhez a sejtsűrűségnek 450 nm-en 0,9-1,0 OD tartományba kell esnie - Egy baktériumszuszpenzióból 2-3 plugot is lehet készíteni - Az agaróz plug-ok lízise, majd mosása - Az agaróz plug-ok emésztése restrikciós endonukleázzal - Agaróz gél készítése a futtatáshoz Molekuláris standardként a Salmonella Braenderup H9812 számú törzset használtuk, a kapott DNS profilt pedig a Fingerprinting II Software-el (Bio-Rad Laboratories, Ventura, CA, USA) analizáltuk. A cluster analízis és a dendogram Dice koefficiens felhasználásával UPGMA módszerrel készült.
50
6.
EREDMÉNYEK
6.1.
Molekuláris (PCR) módszerek a patogén E. coli törzsek virulenciamarkereinek kimutatásában
6.1.1.
IpaH PCR
Az EIEC törzsek pInv plazmidja hordozza az invazív fenotípushoz szükséges, ún. Ipa kódoló géneket. Ennek kimutatására állítottam be az IpaH PCR vizsgálatot, amelyet a 2001-ben Serény teszttel (keratoconjunctivitis teszt – KC) pozitív, illetve azzal negatív, ám gyakori EIEC O csoportba tartozó izolátumokkal ellenőriztem (5. táblázat és 6. ábra). 5. táblázat Az IpaH PCR eredményeinek összevetése a KC teszt eredményeivel
törzsek
O antigén
IpaH PCR
1
115/01
(O124)
+
2
198/01
(O152)
-
3
386/01
(O28ac)
-
4
393/01
(O143)
-
5
471/01
(O136)
-
6
479/01
(O144)
-
7
604/01
(O136)
-
8
661/01
(O144)
-
9
687/01
(O164)
+
10
684/01
(O143)
-
11
877/01
(O124)
+
12
878/01
(O124)
+
13
976/01
(O124)
+
14
30008 (+)
(O124)
+
15
HB101 (-)
16
EIEC +
17
dH2O kont
(O124)
+ -
51
6. ábra A 2001-es IpaH pozitív és negatív EIEC szerotípusú törzsek (1-13-ig vizsgált törzsek, 14. és 16. minta pozitav kontroll, 15. és 17. minta negatív kontroll) A termék 140 bp-nál látható.
6.1.2.
Keratoconjuctivitis teszt eredménye
Az invazivitás vizsgálatára hagyományos tengerimalacszemen végzett, Serény–tesztet használtuk. Az így megvizsgált törzsek segítségével állítottam be az ipaH PCR-t. Ennek eredményét a 6. táblázatban foglaltam össze.
52
6. táblázat A keratoconjunctivitis teszt (KC) eredményei
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
6.1.3.
törzsek
O antigén
KC
115/01 198/01 386/01 393/01 471/01 479/01 604/01 661/01 687/01 684/01 877/01 878/01 976/01 30008 (+) HB101 (-) EIEC + dH2O kont
(O124) (O152) (O28ac) (O143) (O136) (O144) (O136) (O144) (O164) (O143) (O124) (O124) (O124) (O124)
+ + + + + + + -
(O124)
ehlyA PCR beállítása
Az enterohemolizin hordozás fontos virulenciajegy az EHEC törzsek között (pl. az O157-es törzsek 100%-a pozitív erre a markerre). A PCR vizsgálatot a Schmidt és munkatársai (1995) által leírt módszerrel állítottam be. A reakció feltételeit optimalizáltam, melynek során a denaturációt 30 s-ról 20 s-ra, az anneláció időtartamát pedig 90 s-ról 40 s-ra csökkentettem, így lerövidítve a ciklusokat; valamint az annelációs hőmérsékletet 57 °C-ról 59 °C-ra növeltem, ezzel javítva a reakció specificitását. Ezt követően az EDL933-as pozitív kontroll törzzsel, és a NERL-ben összegyűjtött,
táptalajon
enterohemolizin
53
termelőnek
bizonyult
törzsekkel
is
beállítottam a tesztet. Az optimalizálás után 100%-os korrelációt figyelhettünk meg a hagyományos fenotípusos kimutatási módszer és a PCR eredményei (7. táblázat) között. 7. táblázat Az enterohemolizin termelés igazolása hagyományos és molekuláris módszerrel
szám/év
6.1.4.
enterohemolizin termelés igazolása szerocsoport táptalajon
PCR-el
326/99
O157
+
+
909/99
O157
+
+
977/99
O157
-
-
762/00
O157
+
+
54/01
O76
+
+
129/01
O76
-
-
230/01
O157
-
-
440/01
ONT
+
+
771/01
O157
+
+
88/02
O98
+
+
146/02
O91
+
+
164/02
ONT
-
-
316/02
O157
-
-
356/02
O157
+
+
405/02
O157
-
-
vtx1 és vtx2 kimutatása PCR-el
A Yatsuyanagi (2003) által leírt duplex PCR módszerrel minden olyan 2000-től 2006 között gyűjtött izolátumot megvizsgáltam, melyek verotoxin ELISA-val gyengén pozitív vagy pozitív eredményt adtak. Az eredmények minden esetben megegyeztek, sőt több információval is szolgáltak, mivel egylépésben kiderült az is, hogy vtx1 vagy vtx2
54
típusú toxin adta a pozitivitást. Ez a hagyományos mikrobiológiai módszerek alkalmazásával csak a VTEC-RPLA vizsgálat után derülne ki. Az EAST, LT, ST és intimin PCR vizsgálatokat a dán Escherichia coli Referencia Laboratórium körkísérletei során kapott törzsek segítségével állítottam be és optimalizáltam, melyek jelenleg is pozitív kontrollként szolgálnak az adott PCR-ekben.
6.1.5.
Intimintípus meghatározás
A 33 VTEC törzs jellemzése során a két leggyakoribb intimintípust kerestem: a γ1et, amelyet általában EHEC törzsekből, főleg O157-esekből lehet kimutatni, és a β1-et, amely inkább a nem-O157-esek között, illetve az EPEC izolátumokban fordul elő (Beutin és mtsai 2004). Az eredmények nálunk is a vártnak megfelelően alakultak (9. táblázat): az O157-es törzsek mindegyike γ1-típusú intimint fejezett ki (100%), a nemO157-esek közül pedig két O26 hordozta az intimin β1-et (66%). Ez megegyezik a Beutin és munkacsoportja által leírt eredményekkel, mint ahogy az a tény is, hogy az intimin negatív VTEC törzsek általában felnőttek megbetegedéséért felelősek. Az eaenegatív izolátumaink 75%-a 18 évnél idősebb emberből származott, a maradék két esetben nem rendelkeztünk az életkorra vonatkozó adattal (2/8).
6.2.
Mikroplate agglutinációs módszer az O antigén meghatározásához
A mikroplaten beállított reakciók eredményei minden esetben megegyeztek a hagyományos csőagglutinációs szerotipizálási eredményekkel. Leolvasásához a 7. ábrán látható sablont használtam.
7. ábra Sablon a VTEC-RPLA és a mikroplate módszer leolvasásához és értékeléséhez
55
6.3.
A verotoxin termelő törzsek antibiotikum rezisztenciája
Az eredmények azt mutatták, hogy az antibiotikum rezisztencia-tartomány az ampicillin-rezisztenstől (30%, 10/33) a 4 különböző antibiotikummal (sulphonamid, streptomycin, tetracyclin, kanamycin) szembeni multirezisztenciáig terjedt. A törzsek túlnyomó többsége (76%, 25/33) legalább egy antibiotikummal szemben rezisztenciát mutatott. Mindegyik izolátum érzékeny volt a kinolonszármazékokra (nalidixinsav, ciprofloxacin), és mindössze egy izolátum volt rezisztens cefotaximra. Egyik VTEC törzs sem bizonyult ESBL-termelőnek (9. táblázat).
6.4.
ESBL-termelő Escherichia coli törzsek vizsgálata
Az ESBL-termelő E. coli törzsek szerotipizálási eredményét a 8. táblázat mutatja. Az eredmények az O15 és az O25 dominanciáját bizonyították, (szürkével kiemelt sorok), ugyanakkor számos törzs bizonyult ONT-nek, vagy OSP-nek.
56
8. táblázat A 2005 és 2007 között izolált ESBL-termelő E. coli törzsek szerocsoport eloszlása
O szerocsoportok
2005 O1 O2 O4 O6 O7 O8 O9 O11 O15 O16 O18ac O19 O22 O25 O60 O75 O85 O90 O104 O106 O127 O135 O142 O143 O153 O156 O162 O166 Osp ONT Σ
2006
2007
1
2008
Σ
3 1
1 1
1
1
2 24
1 1 2 2 19
1 1 2
1 19
6 57
4 1 4 5 1 5 7 3 23 2 1 1 1 70 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 2 2 3 2 11 119
43
71
44
122
280
1 1 3 2
5 1 1 1
4 2
1
1 1
1 3
15
4
2 2
1 1 1 15
12
38
1 1 2 3
1 1
1
1 2 1
57
6.5.
PCR-RFLP módszerek
6.5.1.
H antigén tipizálás
A fliC gén amplifikálása után a PCR terméket RsaI enzimmel hasítottam. A hasítási mintázat segítségével összehasonlítottam a törzsközponti törzsek H antigénjének szerotipizálási eredményeit, és a PCR-RFLP által kapott képet (8. ábra). A hagyományos és a molekuláris tipizálási módszert alkalmazva az antigének általában azonos típusúnak bizonyultak. A diszkrepanciát mutató néhány esetben további vizsgálatok elvégzését tervezzük. Mindezek mellett használható hasítási eredményt kaptunk az ún. nem mozgó (NM), és a nem tipizálható (NT) H antigének esetében is. fliC PCR
A
→
hasítás RsaI-el
→
B
8. ábra A fliC PCR, majd az azt követő hasítás gélelektroforézissel kapott mintázata. Az (A) képen a fliC PCR terméke látszik 10 különböző H antigén esetében. A (B) kép 4 különböző H antigénnel rendelkező E. coli törzs (sorrendben: H1, H2, H4, H7 kétszer) fliC PCR termékének Rsa1 hasítási mintázatát ábrázolja.
58
6.5.2.
vtx2c és a vtx2d-O118 elkülönítése
A vtx2 altípusainak elkülönítése érdekében, újabb PCR-ek bevezetésére volt szükség. Az MK1-MK2 PCR olyan screening módszer, amely a toxin gének jelenlétét hivatott igazolni. A toxintípus meghatározásához egy második PCR (GK3-GK4 primerrel) termékét hasítottam HaeIII és FokI enzimmel. A hasítási mintázatok a 9. ábrán vethetőek össze.
A
B
9. ábra (A) A HaeIII hasítási mintázat 1,5%-os agaróz gélen megfuttatva. A hasított termékek 128 és 142 bp magasságban adnak csíkot (B) A HaeIII és a FokI hasítási mintázata párhuzamos mintákon. Ugyanazt a 4 mintát hasítva HaeIII-al és FokI-el, jól látható, hogy az első hármat csak a HaeIII, a negyediket pedig a FokI hasította.
A két vtx2 altípus a hasítási mintázat alapján az alábbiak szerint különíthető el. Azok a minták, amelyeket a FokI hasított, a vtx2-, azok pedig, amelyeket a HaeIII hasított, a vtx2c-, vagy vtx2d- feno-, illetve genotípusba sorolhatóak. A két hasítási mintázat csak párhuzamosan értelmezhető, mert előfordulhatnak olyan törzsek, amelyek nem csak az
59
egyik toxin típust fejezik ki, hanem mindkettőt. Ebben az esetben mindkét enzim képes hasítani a PCR terméket. A HaeIII esetében a hasított termékek mérete 142 és 128 bp, a FokI-nél pedig 115 és 155 bp.
6.6.
A 2000-2006 között izolált verotoxin termelő E. coli törzsek patogenitási vizsgálata
A megvizsgált VTEC izolátumok jellemzőit a 9. táblázatban foglaltam össze. A 33 vtx pozitív törzset 10 különböző O és 9 H csoportba soroltam. Összesen 14 O:H szerotípust
sikerült
azonosítani,
amelyek
közül
az
O157:NM
bizonyult
a
legelterjedtebbnek (45%). 19/33 O157, 3/33 O26 és 2/33 O146 jelzésű törzs került azonosításra. Az O15, O43, O75, O87, O96, O98 és az O109 1-1 izolátumként jelentkezett. Két törzs O antigénje nem volt tipizálható (NT). A vizsgált izolátumok 57%-a nem mozgott (NM), és 4-nek nem tudtuk a H antigénjét tipizálni (NT). Az izolátumok 30%-a fermentálta a szorbitot, míg az O157-esek egy törzs kivételével nem mutatták ezt a reakciót. Az O157-es törzsek 63%-a gyermekekből került izolálásra, és a fertőzések esetében gyakori tünet volt a véres hasmenés vagy a HC. Szövődményként HUS két esetben alakult ki, mindkettőnél O26: H11 szerotípusú törzs volt a kórokozó. A virulenciafaktor vizsgálatok eredményei: a törzsek 76%-a lett pozitív intiminre (az összes O157-es és O26-os törzs hordozta az intimint kódoló DNS szakaszt). Az intimintipizálás eredménye megfelel az irodalmi adatoknak: az O157-ek γ1 típusú, az O26-ok pedig β1 típusú intiminnel rendelkeztek. A verotoxin típusok alapján hat különböző pato- és genotípus-kombinációt találtam: vtx1 (11/33), vtx1vtx2c (11/33), vtx2c (6/33), vtx1vtx2 (2/33), vtx2d-O118 (2/33) és vtx2 (1/33). Az O157 típusú izolátumok leggyakrabban a vtx1vtx2c toxin génkombinációt hordozták. A nem O157-es törzsek gyakran csak a vtx1-et fejezték ki (64%). HUS pedig azokban a betegekben alakult ki, akik vtx2 termelő O26-os kórokozóval fertőződtek. A törzsek 75%-a, köztük az összes O157-es enterohemolizint termelt. Öt nem-O157 törzsből mutattam ki az ast1 gént, ezek tehát a verotoxinon kívül további toxint is termeltek (Mag és mtsai 2009).
60
9. táblázat A 2000-2006 között izolált VTEC törzsek szero-, patho-, és rezisztenciatípusai Izolálás éve
eredeta
2000
N/55/VH
267/00*
szerotípus Hd Oc 146 28
F/5/VH F/50/VH N/44/H F/2/? N/25/? F/60/HC F/2/? F/74/HC F/75/HC F/61/HC N/1/? F/9/VH F/18/? F/2/HC ?/?/?
408/00 724/00 C83/00 771/01 929/01* 23/02 88/02* 164/02 316/02 356/02 405/02 108/03* 111/03* 133/03* 160/03*
157 157 157 157 146 157 98 15 157 157 157 109 96 157 87
NM NM NM NM NT NM NM NM NM 7 NM 25 NT 7 16
γ1 γ1 γ1 γ1 γ1 + γ1 γ1 γ1 + γ1 -
+ + + + + + + + + -
+ + + + -
-
F/8/HC N/?/HC N/87/VH N/5/HC ?/?/HC N/2/HC N/34/? 2004 F/2/HUS F/3/? F/2/? N/3/? 2005 F/1/HC F/5/? N/65/HC 2006 N/14/HC N/2/HUS N/1/? Magyarázat:
171/03 213/03 236/03 311/03 390/03* 406/03 449/03* 200/04 202/04 205/04 294/04 600/05 773/05 898/05 53/06 209/06* 349/06
157 75 NT 157 43 157 NT 26 157 157 157 157 157 157 157 26 26
7 NM 14 NM 2 NM NT 11 NM NM NT NM NM NM NM 11 NM
γ1 + γ1 γ1 β1 γ1 γ1 γ1 γ1 γ1 γ1 γ1 β1 +
+ + + + + + + + + + +
-
+ -
2001 2002
2003
a
jelzésb
PCR eredményekf eae ehlyA east lt + -
vtx típus
e
vtx2dO118 vtx1 vtx2c vtx1 vtx2c vtx1 vtx2c vtx1 vtx1 vtx1 vtx1 vtx1 vtx1 vtx2c vtx1 vtx2c vtx1 vtx2c vtx1 vtx2 vtx1 vtx1 vtx2c vtx2dO118 vtx1 vtx2c vtx1 vtx1 vtx1 vtx2c vtx1 vtx1 vtx2c vtx1 vtx1 vtx2 vtx1 vtx2c vtx2c vtx2c vtx2c vtx2c vtx2c vtx2c vtx2 vtx1
Amp Amp, Te Amp Amp Amp, S, Sul Amp Amp, S, Sul Amp, S, Sul Ctx Amp Amp Amp, S, Sul, K Amp, S, Sul Amp Amp Amp, S, Te Amp, S, Sul, K Amp Amp, S, Sul Amp, S Amp, S Amp, S Amp, S Gm
Nem (férfi vagy nő) / kor (év) / diagnózis (hasmenés [H], véres hasmenés [VH],
haemorrhagiás colitis [HC], hemolitikus urémiás szindróma [HUS]). ?= ismeretlen b
Antibiotikum érzékenységg Amp
a szorbit-fermentáló törzseket *-gal jelöltem
c,d
NT – nem tipizálható; NM – nem mozgó
61
e
eae-altípusok, +-al vannak jelölve a nem tipizált intimin pozitív törzsek
f
+: gén kimutatható, - : gén nincs jelen a vizsgált törzsben
g
Amp - Ampicillin, S - Streptomycin, Sul - Sulphafurazole, Te - Tetracyclin, C -
Chloramphenicol, Gm - Gentamicin, K - Kanamycin, Ctx – Cefotaxim
6.6.1.
Antibiotikum érzékenység
Egy izolátum sem mutatott ESBL-fenotípust, vagy 5-nél több antibiotikummal szembeni multirezisztenciát. A törzsek túlnyomó többsége legalább 1 antibiotikumra volt rezisztens (76%). A pattern a kizárólagos ampicillin rezisztenciától (30%), a 4 antibiotikumra rezisztensig (sulphonamid, streptomycin, tetracyclin, kanamycin) terjedt. Mindegyik
törzs
érzékeny
volt
a
kinolonszármazékokra
(nalidixinsavra
és
ciprofloxacinra). Egy törzs volt rezisztens cefotaximra.
6.6.2.
PFGE típusok
A kromoszómák makrorestrikciós hasítási mintázata az 10. ábrán látható. Két 2005ös O157:NM törzs mutatott teljesen azonos pulzotípust. Két O157-es törzs (771/01 és 294/04) kivételével az összes O157-es több, mint 80%-os hasonlóságot mutatott, ami arra utal, hogy ugyanabba a genetikai csoportba tartoznak (B). Négy nem O157-es (O43:H2, O26:NM, O26:H11 és O96:NT) izolátum egy kisebb clustert alkotott (A). A többi törzs jól elkülönülő pulzotípusú lett. Járványügyi kapcsolatot nem tudtunk igazolni az izolátumok között.
62
A
B
10. ábra A 33 verotoxin termelő Escherichia coli törzs makro-restrikciós fragment hossz polimorfizmus vizsgálatának eredménye. 80%-os cut-off értéknél két clustert alkottak az izolátumok, amelyet A és B betűkkel jelöltünk.
63
7.
MEGBESZÉLÉS
Az E. coli okozta hasmenéses megbetegedések világszerte jelentős közegészségügyi problémával sújtják elsősorban a fejlődő országokat, ugyanakkor Európában is számolni kell előfordulásukkal. Bár a higiénés viszonyok javulásával utóbbi országokban a morbiditás és a mortalitás jelentősen lecsökkent, de a kórképek járványügyi jelentősége, és a potenciális súlyos szövődmények miatt a hatékony és gyors labordiagnosztikai módszerek fejlesztése változatlan fontossággal bír. Vizsgálataim nagyrészt arra irányultak, hogy a patogén E. coli törzsek kimutatásának lehetőségeit gyors és megbízható módszerek adaptálásával egészítsem ki. Mindezek mellett az általam elvégzett különféle tipizáló eljárások, valamint retrospektív vizsgálatok célja az volt, hogy bővítsük a hazai patogén E. coli törzsekkel kapcsolatos ismereteink körét, felismerjük a járványügyi szempontból jelentős tendenciákat és eredményesebb surveillance-rendszert építsünk ki. A székletmintákból a patogén E. coli törzseket korábban tenyésztéses és szerológiai módszerekkel mutattuk ki, esetenként állatoltással igazoltuk a patogenitásukat. Ezek mind költséges, idő- és munkaigényes módszerek, melyeket a DNS alapú technikák elterjedésével számos területen ki lehetett váltani molekulárbiológiai eljárásokkal. Utóbbiak elvégzéséhez gyakran egy munkanap is elegendő, a gyors eredmény pedig elősegíti a betegek célzott kezelését, és az esetleges járványok megfékezését. Összehasonlító vizsgálataim során kiderült, hogy a PCR megfelelően érzékeny és specifikus módszer a súlyos megbetegedésekért felelős E. coli virulencia-markerek kimutatására, valamint a megbetegedést okozó törzsek és a normál, ún. apatogén flóraalkotók elkülönítésére. Kifejezett előnye, hogy rendkívül gyorsan ad előzetes eredményt a laborba érkezett vegyes tenyészetről vagy színtenyészetről ugyanis akár 5 órán belül megtudhatjuk, hogy hordoz-e patogént markereket. Dolgozatom célkitűzései között szerepelt a molekuláris módszerek bevezetése mellett a különböző patocsoportok részletes vizsgálata és tipizálása is. Utóbbi vizsgálatok eredményeit a globális vagy európai tendenciákkal is összehasonlítottuk.
64
7.1.
A 2000-2006 között izolált VTEC törzsek jellemzése
A VTEC törzseket világszerte jelentős élelmiszer-eredetű kórokozókként tartják számon. Európában 2005-ben 2600 humán megbetegedést okozó VTEC törzset jelentettek, melyek száma 2000 óta folyamatosan emelkedik: 2000 és 2005 között az O157-es törzsek száma 1400-ról 1700-ra, míg a nem O157 izolátumok száma 570-ről 770-re nőtt (The EFSA Journal 2007) (11. ábra, 10. táblázat).
nem tipizált VTEC
nem-O157 VTEC
O157 VTEC
11. ábra A VTEC izolátumok növekvő száma az EU-ban 2000 és 2005 között, az Enter-Net 2005-ös adatai alapján (The EFSA Journal 2007)
65
10. táblázat A leggyakrabban izolált VTEC szerocsoportok az Európai Unió országaiban (The EFSA Journal 2007)
2002
2003
2004
2005
2006
O157
1189 (63%)
1262 (63%)
1283 (66%)
1767 (70%)
1726 (66%)
O26
115 (6%)
143 (7%)
135 (7%)
169 (7%)
170 (7%)
O103
172 (9%)
141 (7%)
55 (3%)
119 (5%)
116 (4%)
O91
96 (5%)
86 (4%)
71 (4%)
82 (3%)
90 (3%)
O145
44 (2%)
58 (3%)
69 (4%)
55 (2%)
86 (3%)
O111
34 (2%)
34 (2%)
23 (1%)
45 (2%)
44 (2%)
O146
29
31
34
29
30
O128
17
21
15
22
18
O55
15
0
17
18
24
egyéb
178
238
247
236
300
Σ
1889
2014
1949
2542
2604
A különböző országokban azonosított, verotoxintermelő izolátumokról már számos közlemény jelent meg (Beutin és mtsai 2004, Caprioli és mtsai 1998, EFSA Journal 2007). Magyarországon 2003 óta nem készült ezzel kapcsolatos részletes vizsgálat, ezért munkám egyik fő célkitűzéséül ezt a feladatot választottam. Vizsgálataim tárgyául a NERL törzsgyűjteményéből származó 33 VTEC törzs szolgált, melyek 2000 és 2006 között kerültek izolálásra. Az VTEC szakirodalomban leírtakkal megegyezően nálunk is az O157 szerocsoport a legelterjedtebb (58%-os prevalencia). A nem O157 törzsek közül a három O26 (9%) és a két O146 (6%) bír még jelentőséggel. Az O26-os szerocsoport (és azon belül is az O26:H11) világszerte kiemelt fontosságú, súlyos megbetegedést okozó patotípusnak számít (WHO 1999). Ezzel összhangban áll, hogy a három izolátumból kettő HUS-t is okozott. Magyarországon már 1977-ben leírtak olyan nozokomiális megbetegedéseket, amelyekért ez a szerocsoport volt a felelős (Caprioli és mtsai 1998). Ezen kívül gyakran kapcsolatba hozzák HUS kialakulásával is (Bielaszewska és mtsai 2007); melynek hátterében az O157 után az O26 bizonyul a második leggyakoribb szerocsoportnak.
66
Két törzs az O146-os szerocsoportba tartozott, amely Németországban is gyakran fordul elő a humán klinikai mintákban (Beutin és mtsai 2004). Ezeken kívül a többi azonosított típus is már ismert verotoxin termelőnek számított. Az izolátumok 30%-a (10/33) fermentálta a D-szorbitot. Érdemes kiemelni, hogy ezek között szerepelt egy O157-es törzs is, holott ezt az irodalom általában szorbitot nem hasznosító szerotípuskéntként különíti el. Németországban, és az utóbbi években Norvégiában, valamint Svédországban azonban egyre gyakrabban fordulnak elő ilyen törzsek. Magyarországon sem egyedülálló ez a jelenség, az elmúlt évtizedben a hazai referencialaboratórium többször izolált ilyen „atípusos biokémiájú” O157-es törzseket (Herpay és mtsai 1997).
7.1.1.
Korcsoport eloszlás, és a megbetegedések jellegének kapcsolata
A magyarországi verotoxin termelő E. coli izolátumok kapcsán 30 esetben volt ismert a beteg életkora, a legfiatalabb 1 éves, a legidősebb 87 éves volt. Az O157-el fertőzött betegekben nagyobb százalékban alakult ki véres hasmenés (63%), mint a nem O157-el fertőzöttek között (46%). Az O157-es törzsek többségét (63%) gyerekekből mutattuk ki, és a két leírt HUS eset is gyerekekben alakult ki, bár mindkettőt O26 okozta. Ez az adat további kérdéseket vet fel, mivel ellentmond mind az európai, mind a világon jellemző tendenciáknak. A 90’es évek végéig Magyarországon is a szakirodalomban leírt adatokhoz megközelítőleg hasonló arányban izoláltuk a különböző szerotípusokat. Jelenleg azonban az EU-val összevetve szembeszökő különbséget észlelhetünk a HUS-t okozó törzsek szerotípuseloszlása tekintetében. Míg az Európai Unióban a HUS esetek hátterében mintegy 70%ban E. coli O157 áll, és csak körülbelül 6-18%-ban az O26, addig Magyarországon 2000 és 2006 között mindkét felderített HUS esetet O26:H11 törzs okozta. Ez nem zárja ki a 2000-2006 közötti időszakban az O157 okozta HUS megbetegedések lehetőségét, pusztán arra hívja fel a figyelmet, hogy a laboratóriumi diagnosztika során nem találták meg a fertőzést okozó törzseket, netán nem is végeztek székletvizsgálatot a HUS-ban szenvedő betegektől. 2000 után az O157-es törzsek száma is szignifikánsan alacsonyabb lett a vártnál, és ez a drasztikus csökkenés megmutatkozik a VTEC izolátumok
67
összesített számában is, amely szintén a hazai surveillance sérülésével magyarázható (2003-2004 utáni időszakban) A jelenség másik magyarázata az lehet, hogy HUS esetében sokszor csak a veseérintettség után kerül vizsgálatra a beteg gyermek székletmintája. Ebben a stádiumban pedig már csak 30% alatti eséllyel tenyészthető ki a kórokozó. Sajnálatos módon olyan esetről is tudunk, amikor a hasmenés antibiotikus kezelése indukálta a HUS kialakulását, ami szintén eredménytelenné tette a patogén ágens kimutatását. Valószínűleg ezen okokra vezethető vissza, hogy a vizsgált 7 év alatt miért nem azonosítottunk egyetlen O157-es törzset sem HUS megbetegedések kapcsán.
7.1.2.
Az eredmények összevetése más országok adataival
A VTEC izolátumok száma hasonló területű és lakosságszámú európai országokkal, például
Ausztriával,
Dániával,
Hollandiával
vagy
Belgiummal
összevetve
Magyarországon szignifikánsan alacsonyabb. A patogén E. coli okozta hazai hasmenéses megbetegedések incidenciája az 1990-es években jóval magasabb volt, mint 2000 után. Ennek egyik lehetséges magyarázata, hogy a 2000-es években kezdődött a magyar laboratóriumi hálózat átalakítása. Ennek során új szabályozások léptek életbe, amelyek miatt meglazult az addigi beküldési fegyelem. Ezen kívül a laboratóriumok egy részének magánkézbe kerülésével megváltoztak a metodikák, és a kevéssé munkaigényes, költségkímélő módszerek kerültek előtérbe. Ez okozhatta, hogy a patogén E. coli törzsek a diagnosztika számára elvesztek, illetve alulreprezentálttá váltak. Reményeink szerint az idei évtől a surveillance javulásával megváltozik a helyzet, és e kórokozó csoport laboratóriumi diagnosztikája is fokozatos fejlődésen megy keresztül. Ha a laboratóriumok együttműködésének eredményeként több esetben vetődik fel a patogén E. coli törzsek etiológiai szerepének gyanúja, akkor a NERL-be beérkező izolátumok száma reprezentálja majd a kórokozó valós incidenciáját és ezzel párhuzamosan a szerológiai diverzitás is szélesebb spektrumot ölelhet fel. Jelenleg a referencia-laboratórium legsürgetőbb feladata tehát a diagnosztika megújítása.
68
Jelenleg Európában a leggyakoribb verotoxintermelő nem-O157-es szerocsoportok az O26, O103, O91, O145 és O111 típusok közül kerülnek ki (10. táblázat). Közülük Magyarországon a vizsgált időszakban csak O26-ot sikerült izolálnunk, mely ugyancsak a hazai diagnosztika hiányosságait példázza. Ezeket a VTEC törzseket, melyek Európában jelentős számban okoznak megbetegedéseket (The EFSA Journal 2007), Magyarországon a rutin szűrés során alkalmazott, hagyományos tárgylemezagglutinációs savókészlettel nem lehet azonosítani. A savókészlet ugyanis nem tartalmazza az O91-es, O103-as valamint az O145-ös savót, mert a fenti patocsoportok korábban nem bírtak klinikai jelentőséggel. A probléma kiküszöbölésére több megoldás is kínálkozik: 1. A tárgylemezagglutinálás rendszerének megújítása, különös tekintettel a klinikai jelentőséggel bíró, közelmúltban felbukkant csoportokra 2. A tünetek, fertőzésforrás stb. alapján gyanúsnak tartott törzsek beküldése a referencia laboratóriumba, még abban az esetben is, ha azok nem agglutinálnak a szokványos savókban 3. A diagnosztika további fejlesztése, melynek során a patogén markerek molekuláris kimutatása prioritást élvez a szerotípus meghatározással szemben Célkitűzésünk, hogy hazai viszonylatban legalább a NERL-ben megteremtsük a molekuláris detektálási módszerek megfelelő hátterét. A vtx1 és vtx2 PCR bevezetését követő gyakorlat azt mutatta, hogy a verotoxin ELISAval szemben a PCR vizsgálat során egy lépésben arra is fény derül, hogy melyik verotoxin-típust termeli a vizsgált törzs. Színtenyészetet vizsgálva erre ugyan a VTECRPLA módszer is megfelelő lehet, a PCR azonban megfelelően érzékeny és specifikus eljárás melynek alkalmazásával a humán beteganyagból (például a vegyes széklettenyészetekből) igen rövid idő alatt kimutathatjuk a verotoxin termelő E. coli törzseket. Mindez elengedhetetlenül fontos az előzetes eredmény gyors kiadásához és a célzott kezelés megkezdéséhez A VTEC-RPLA módszer azonban nem hagyható el teljesen, mivel a toxin-titer meghatározására és a molekuláris módszerek megerősítésére rendkívül alkalmas. A 2002-2007 közötti Enter-Net, valamint az Enter-Net jogutódjaként 2007 után az ECDC FWD Network körvizsgálatok jó eredményei minden esetben igazolták módszereink megfelelő specificitását és szenzitivitását.
69
7.1.3.
Patotípusok
A 33 vizsgált VTEC törzsben a verotoxin-kombinációk és ezek gyakorisága a következőképpen alakult: vtx1 (11/33), vtx1vtx2c (11/33), vtx2c (6/33), vtx1vtx2 (2/33), vtx2d-O118 (2/33) és vtx2 (1/33). Az O157-es törzsek 2000-2004 között leggyakrabban a vtx1 és vtx2c géneket hordozták, főleg vtx1/vtx2c kombinációban (11/19, 58%). 2004 után azonban megváltozott a tendencia, a vtx1 típus eltűnt és a vtx2c önmagában vált dominánssá. A nem O157-es törzsek leggyakrabban vtx1-et (9/14), ritkábban vtx1vtx2 (2/14), vtx2d-O118 (2/14) vagy vtx2 (1/14) géneket hordoztak. A HUS-ért felelős két O26-os törzs a vtx2 mellett intimint és enterohemolizint is termelt. Ez az eredmény egybeesik a külföldi irodalomban leírt HUS-törzsek jellemzőivel. Két nem O157-es törzs (O146:H28 és O87:H1) vtx2d-O118-t termelt és intiminnegatívnak bizonyult (Piérard és mtsai 1998). Hasonlóan a nemzetközi irodalomban leírtakkal, ezt a toxintípust valóban gyakran kíséri intimin-negativitás. Az EAST termelést 5 nem O157-es törzsben sikerült igazolni. A legáltalánosabb patotípus a vtx1vtx2c, eae és ehlyA hordozó O157:NM VTEC törzs volt (24%). Az összes O157-es, és a nem-O157-es izolátumok 25%-a hordozta az intimint kódoló gént, ami az összes izolátum 76%-a. Ez megfelelt Blanco és munkatársai adatainak, akik egy 2004-es spanyolországi VTEC vizsgálat kapcsán írták ezt le (Blanco és mtsai 2004). Az intimin-típusok között az eloszlás a vártnak megfelelően alakult: az O157-ek a γ1-, az O26-ok a β1 altípust hordozták. Vizsgálataink során csak ezt a két -leggyakoribb- intimin típust kerestük, melyek aránya követte az irodalmi adatokat.
7.1.4.
vtx2c,d elkülönítése
A szakirodalom számos PCR módszert közöl, melyek alkalmasak a vtx1 és 2 gének kimutatására. Konszenzus régiók, általános primer szekvenciák azonban nincsenek meghatározva. A toxintípusok és a megbetegedések súlyossága közötti összefüggések
70
ugyanakkor jól ismertek, és sokszorosan bizonyítottak (11. táblázat). A laboratóriumok döntésétől függ, hogy milyen típusú diagnosztikus PCR vizsgálatokat vezetnek be. Megítélésem szerint a kórkép prognózisában nagy jelentőséggel bír a VTEC törzsek vizsgálata során a toxintípus meghatározása. (Részletesen lásd a 7.1.3. fejezetben) 11. táblázat Verotoxin típusok és az általuk okozott megbetegedések és gazdaszervezetek kapcsolata (The EFSA Journal 2007)
Verotoxin
Verotoxin génje
VT1
vtx1
1 aminosav különbség a Shigella dysenteriae toxinjához képest
VT1c
vtx1c
Birkából izolált O128-as törzsből mutatták ki
VT1d
vtx1d
Néhány szarvasmarhából sikerült kimutatni
VT2
vtx2
Súlyos emberi megbetegedéseket képes okozni
VT2c
vtx2c
Súlyos emberi megbetegedéseket képes okozni
VT2d
vtx2d
Mukóza által aktiválható verotoxintípus
VT2e
vtx2e
Sertés ödémás megbetegedéseket okoz
VT2f
vtx2f
Vadgalambokból mutatták ki
VT2g
vtx2e
Néhány szarvasmarhából sikerült kimutatni
7.1.5.
Megjegyzés
PFGE vizsgálat
A magas diszkriminációs képessége miatt a PFGE analízis az O157:H7 törzsek molekuláris tipizálásában az ún. „gold standard” módszernek számít (Preston és mtsai 2000). A CDC PulseNet standardizálta a módszert, hogy a világ bármely részén izolált törzset össze lehessen vetni a korábban már tipizáltakkal (Ribot és mtsai 2006). Vizsgálataink során az O157-es törzsek között nem találtunk közös járványügyi eredetet. A sporadikus eredetet az összes egyéb vizsgálat, valamint az izolátumok további járványügyi vizsgálata is alátámasztotta. Jól ismert tény, hogy egyes VTEC szerotípusok erősen asszociáltak bizonyos állati gazdaszervezetekkel. A magyarországi állatállomány VTEC átfertőzöttségéről aránylag kevés adattal rendelkezünk. Tóth és munkacsoportja 2009-ben arról számolt be, hogy
71
542 szarvasmarha megvizsgálása során 8%-os izolációs gyakorisággal találtak O157-es törzseket a székletmintákban és a nyers tejben (vtx-pozitívat és vtx-negatívat vegyesen). Kiss és munkatársai (2009) pedig 64 nyers tehéntehből izolált E. coli törzsből 6 esetben tudták igazolni a verotoxin termelést. Az átviteli útra, illetve az állati és humán izolátumok közötti kapcsolatra azonban továbbra sem derült fény, ennek igazolásához újabb vizsgálatokra van szükség.
7.1.6.
Antibiotikum érzékenység vizsgálata
A rezisztencia-vizsgálat hasznos epidemiológiai marker lehet a járványok felderítésénél (Izumikawa és mtsai 1998). A 33 törzs rezisztenciatípusa és szerotípusa, valamint a rezisztenciatípus és a virulencia-markerek hordozása között ebben a tanulmányban nem találtunk kapcsolatot. A vizsgálat eredményét több szempontból is értékelnünk kell. Egyszerű hasmenéses megbetegedésből, illetve HC-ból izolált törzsek esetében a beteg antibiotikum-kezelése nem indokolt, sőt a verotoxin termelő E. coli fertőzésekben kifejezetten kontraindikált. Az antibiotikum ugyanis tovább gyengíti a normál bélflórát, valamint a potenciálisan toxintermelő
törzsek
elpusztításával
fokozza
a
sejtfalhoz
kötött
verotoxin
felszabadulását, amely a tünetek felerősödését, valamint súlyos komplikációkat (pl. HUS) idézhet elő (Wong és mtsai 2000, Safdar és mtsai 2002). Súlyos
megbetegedések,
komplikációk
kialakulásakor,
illetve
gyenge
védekezőképességű gazdaszervezetek (csecsemők, immunszupresszált betegek, idősek) esetén szükséges lehet az azonnali antibiotikum-kezelés, ezért a laboratóriumban mindig el kell végezni az érzékenységi vizsgálatot. A rutinszerűen vizsgált antibiotikumok a következők: ampicillin (10 μg), cefotaxim (30 μg), ciprofloxacin (5 μg), nalidixinsav (30 μg), tetracyclin (30 μg), sulphamethoxazol + trimetoprim (25 μg), chloramhenicol (30 μg), gentamicin (10 μg), kanamycin (30 μg), streptomycin (10 μg), sulfonamid (300 μg), trimetoprim (5 μg). Ebből az első 5 a potenciális terápiás szer, míg a többi a nemzetközi jelentésekhez és az esetleges járványügyi felderítésekhez és nemzetközi jelentésekhez szükséges adatokat szolgáltatja.
72
7.2.
Mikroplate agglutinációs módszer
Az E. coli referencia-laboratóriumokban világszerte ezt a módszert használják az O szerocsoport meghatározásához. A beállítások során igazolódott, hogy a módszer ugyanolyan érzékeny, mint a csőagglutináció, ám azzal szemben további előnyei is vannak. Bár az ismeretlen törzsekből az antigénkészítés és a tipizálás ugyanannyi időt vesz igénybe, mint a csőagglutináció esetében, ugyanakkor sokkal kevesebb savó, és antigén szükséges hozzá. Eszközigényként elegendő a 37 °C-os termosztát alkalmazása, nincs szükség vízfürdőre. Mindez olcsóbbá és egyszerűbben kivitelezhetővé teszi a módszert. 24 órás inkubációt követően szabad szemmel, a leolvasási séma alapján (7. ábra) könnyen meghatározhatóak a pozitív és a negatív reakciók. Egy lemezen akár 96 agglutinációs vizsgálatot is el lehet végezni, ami a reakció helyigényét is jelentősen lecsökkenti (12. ábra). A beállítások során kiderült, hogy a kimerített savókból készített hígítási sor több antigén esetében is magasabb agglutinációs titert mutatott a mikroplate módszer, mint a csőagglutináció esetében. Ez valószínűleg annak tudható be, hogy a reakció kisebb térfogatban, jobban kontrollált körülmények között zajlik, és kizárhatók olyan zavaró tényezők, melyek a csőagglutináció során a mosószermaradékot tartalmazó, rosszul elmosott csövekből, mikrorepedésekből, vagy a párolgásból fakadhatnak. A módszer végleges bevezetése előtt szükség van arra, hogy az összes savót az összes antigénnel bevizsgáljuk, valamint újra meg kell állapítani a savók homológ titerét (az a legnagyobb hígítási fok, ahol a saját antigénnel még értékelhető agglutinációt ad) és azok esetleges keresztreakcióit. Ezt követően a módszer már biztonsággal alkalmazható a rutin laboratóriumi diagnosztikában is.
(B)
(A) 12. ábra
Illusztráció hagyományos cső-, és mikroplate agglutinációs módszerhez (A) Widal-típusú csőagglutinációs teszt (B) mikroplate agglutinációs vizsgálat
73
7.3.
ESBL-termelő Escherichia coli törzsek tipizálása
A kiterjedt spektrumú β-laktamázokat termelő Gram-negatív baktériumok okozta infekciók napjainkban komoly közegészségügyi problémát jelentenek. Előfordulásuk jelentős növekedéséről számolnak be a világ minden részén, így Európán kívül Amerikában, a Távol-Keleten (Suzuki és mtsai 2009), valamint az utóbbi években hazánkban is. Az ESBL-termelő törzsek sporadikusan is megjelenhetnek, de gyakoribb, hogy kórházi járványokat okoznak. Nemcsak a rezisztens baktériumok terjedhetnek el egy adott országon belül, vagy az országok között, hanem a rezisztenciáért felelős gének is. Ezek gyakran mobilis genetikai elemeken helyezkednek el, és így könnyen terjednek a különböző törzsek között. A szerocsoport meghatározással, valamint a filogenetikai csoportba sorolással arra kerestük a választ, hogy hazánkban találunk-e olyan E. coli szerocsoportot, amely szignifikánsan nagyobb számban jelenik meg az ESBL-termelő izolátumok között. Nicolas-Chanoine és munkacsoportja megvizsgált 41 CTX-M típusú ESBL-termelő E. coli törzset, melyeket Európában, Ázsiában és Észak-Amerikában izoláltak (NicolasChanoine és mtsai 2007). Meghatározták a filogenetikai csoportukat, O:H szerotípusukat és az antibiotikum érzékenységi mintázatukat. Adataik szerint e válogatott izolátumok 88%-a B2 filogenetikai csoportba tartozott és O25b-ST131:H4 típusúnak bizonyult. Egy japán körvizsgálatban szintén az O25-ös izolátumok száma emelkedett ki (22,3%), mellette pedig az O86 (18,5%) volt a második leggyakoribb szerocsoport (Suzuki és mtsai 2009). Az általunk megvizsgált törzsek 40%-a tartozott az O25-ös csoportba, ami szignifikánsan magasabb arány, mint a többi szerocsoport előfordulása (beleértve az O15-t is). Magyarországon a vizsgált időszakban (2005-2007) az E. coli O15 volt a másik csoport, amely kiemelkedő számban került tipizálásra (8%, 23/280). Az adatokat binomiális teszt segítségével elemezve, az O25 és az O15 szignifikánsan magasabb számban fordult a többi típushoz viszonyítva (12. táblázat, 13. ábra). A filogenetikai csoportba sorolás után, valamint a világszerte elterjedt klónra specifikus, szúrópróbaszerűen elvégzett PCR vizsgálatokkal igazolni tudtuk, hogy a nálunk nagy számban megjelent O25-ös törzsek valóban a magas virulenciájú, B2 filogenetikai
74
csoportba tartozó, CTX-M típusú ESBL-t hordozó, O25b-ST131-es klónba tartoznak, mely közegészségügyi szempontból is jelentős problémákat vet fel. További érdekesség, hogy az O15 és O25 csoport képviselői húgyúti, illetve egyéb extraintesztinális fertőzésekből is gyakran izolálható kórokozók (Cagnacci és mtsai 2008). A jelenség valószínű magyarázata, hogy különböző fimbriális és afimbriális adhezinjeik révén igen jó kolonizációs képességgel bírnak, ami a gazdaszervezet megfertőzésében játszhat jelentős kóroki szerepet. Ennek igazolásához azonban még további vizsgálatok szükségesek. Összegezve azonban kijelenthetjük, hogy Magyarországon is megjelentek a világszerte elterjedt és kiemelten veszélyes ESBL-termelő E. coli klónok.
13. ábra Az ESBL szerocsoport gyakoriságok binomiális eloszlás sűrűségfüggvénye
75
12. táblázat
O szerocsoportok
A tipizált ESBL-termelő törzsek szerotípus gyakorisága Σ
valószínűség
gyakoriság*
O1 O2 O4 O6 O7 O8 O9 O11 O15 O16 O18ac O19 O22 O25 O60 O75 O85 O90 O104 O106 O127 O135 O142 O143 O153 O156 O162 O166 Osp ONT
4 1 4 5 1 5 7 3 23 2 1 1 1 70 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 2 2 3 2 11 119
0.0267 0.0007 0.0267 0.0509 0.0007 0.0509 0.1085 0.0112 0.0001 0.0035 0.0007 0.0007 0.0007 0.0000 0.0007 0.0007 0.0035 0.0007 0.0007 0.0035 0.0007 0.0007 0.0035 0.0007 0.0035 0.0035 0.0112 0.0035 0.1053 0.0000
Túl ritka Túl ritka Túl ritka Véletlenszerű Túl ritka Véletlenszerű Véletlenszerű Túl ritka Túl gyakori Túl ritka Túl ritka Túl ritka Túl ritka Túl gyakori Túl ritka Túl ritka Túl ritka Túl ritka Túl ritka Túl ritka Túl ritka Túl ritka Túl ritka Túl ritka Túl ritka Túl ritka Túl ritka Túl ritka Véletlenszerű Túl gyakori
Σ
280
*: a kapott valószínűségek az alkalmazott sűrűségfüggvény alapján
76
7.4.
H antigén genotipizálása
A vizsgálatot a törzsközponti H antigénsorozat segítségével állítottam be. Első lépésben a fliC PCR-el amplifikáltam az 57 típustörzs flagellin kódoló régióját, majd a termékeket hasítottam. Később olyan törzseket is megvizsgáltam, amelyek korábban NT-nek vagy NM-nek jelöltünk. A PCR-RFLP és a hagyományos szerotipizálási módszer összehasonlításának eredménye azt mutatta, hogy a molekuláris módszer jól alkalmazható azokban az esetekben, amikor nem mozgó, vagy hagyományos eljárással nem tipizálható törzset kell jellemezni. A H antigén meghatározása mellett ez a molekuláris módszer arra is alkalmas, hogy járványos megbetegedések kapcsán vizsgáljuk az izolátumok közötti potenciális kapcsolatot. Összefoglalva, mind a nehezen, vagy egyáltalán nem szerotipizálható törzsek esetében, mind a járványügyi vizsgálatok kapcsán a fliC PCR-RFLP értékes módszernek bizonyult.
77
8.
ZÁRÓKÖVETKEZTETÉSEK, ÚJ EREDMÉNYEK
Az Escherichia coli törzsek túlnyomó többségét nem tekintjük kórokozónak, de bizonyos csoportjai súlyos enterális, illetve extraintesztinális megbetegedéseket képesek előidézni. Az enterális patogén E. coli baktériumok patogenetikai szempontból külön egységeket képeznek. Ezen törzsek egyik legfontosabb közös tulajdonsága, hogy virulenciaspecifikus mobilis genetikai elemeket – plazmidokat, fágokat vagy transzpozonokat – hordoznak. Az így kódolt adhéziós faktorok és toxinok teszik lehetővé, hogy a bélcsatornát az apatogén törzsektől eltérő módon kolonizálják. Ennek eredményeként alakulhat ki az általuk okozott enterális infekció. A
klinikai
tünetek,
a
virulencia-faktorok
és
a
hozzájuk
köthető
patomechanizmusok alapján az enterális megbetegedéseket okozó E. coli törzseket a következő csoportokba soroljuk: enteropatogén E. coli (EPEC), enterohemorrhágiás E. coli (EHEC), verotoxin termelő E. coli (VTEC), enteroaggregatív E. coli (EAggEC), enterotoxikus E. coli (ETEC), enteroinvazív E. coli (EIEC) és a diffúzan adheráló E. coli (DAEC). Az extraintesztinális megbetegedéseket előidéző csoportba a már említett húgyúti
infekciókért
felelős
E.
coli
(UPEC)
törzsek
és
az
újszülöttkori
sepsissel/meningitisszel asszociált E. coli (MAEC) tartoznak. Szinte mindegyik csoportra igaz, hogy bizonyos O antigének hordozásával jellemezhetőek. Mai ismereteink szerint azonban a szerocsoport azonosítás már nem elegendő a patogén tulajdonságok, illetve a kóroki szerep megállapításához, erre inkább a virulenciaspecifikus géneket célzó molekulárbiológiai módszerek alkalmasak. Munkám során a NERL-be beküldött, humán megbetegedéseket okozó E. coli törzsek segítségével olyan PCR alapú molekuláris módszereket állítottam be, melyekkel a különböző virulenciamarkereket kódoló géneket tudjuk kimutatni. Mindezek mellett bevezettem egy PCR-RFLP módszert a H flagelláris antigén tipizálására, valamint a nagyfokú homológiát mutató vtx2 altípusok - a vtx2c és a vtx2 és vtx2d-O118 – elkülönítésére. Az újonnan adaptált módszerek segítségével egy retrospektív vizsgálat keretében jellemeztem a 2000-2006 között izolált hazai VTEC törzseket.
78
Dolgozatom további részében pedig az ESBL-termelő E. coli törzsek szerotípusos besorolását taglaltam. A mikroplate módszer bevezetése ugyanakkor metodikai egyszerűsítést jelentett a hagyományos csőagglutinációs eljáráshoz képest.
8.1.
Molekuláris patogén marker vizsgálatok
Az 1990-es évek végéig Magyarországon a patogén E. coli törzsek vizsgálata nagyobb részt a hagyományos mikrobiológiai módszereken alapult, melyek azonban nem minden esetben alkalmazhatóak, nem elég gyorsak, és bizonyos markerek kimutatását nem is teszik lehetővé. A bevezetett PCR és PCR-RFLP vizsgálatok segítségével ma már gyorsabban és hatékonyabban dolgozhat a referencia laboratórium; egyúttal több információval is szolgálhat a klinikusok számára, ami szükség esetén a korai, célzott terápia megkezdését is elősegíti.
8.2.
2000-2006 között diagnosztizált VTEC törzsek molekuláris jellemzése
A 7 év alatt kimutatott verotoxin termelő törzsek fenotípusos és genotípusos vizsgálata hasonló eredménnyel zárult, mint az európai és a világszerte készült, hasonló témájú tanulmányok. Az O157-es törzs bizonyult a leggyakoribbnak, melyek izolátumai között sem közös eredetű klónt, sem kiemelkedő rezisztencia-típust vagy ESBL-termelést nem észleltünk. A toxintípusok is az irodalmi adatoknak megfelelő arányban fordultak elő, és a súlyosabb megbetegedésekért is az ismert, jellemző szerocsoportok és a hozzájuk kapcsolódó verotoxin-típusok voltak felelősek. A vizsgálatok segítségével viszont fény derült
bizonyos
tendenciákra
(csökkenő
mintaszám
és
csökkenő
diverzitás,
alulreprezentáltság, hiányos protokollok), amelyeken a szakmai fórumok bevonásával mielőbb változtatni szeretnénk.
79
8.3.
ESBL termelő E. coli törzsek szerotipizálása
Az ESBL-termelő E. coli törzsek vizsgálata egy nagyobb tanulmány részét képezi, melynek során e baktériumcsoport átfogó fenotípusos és genotípusos jellemzését tűztük ki célul. A megvizsgált 280 izolátumból két O szerocsoport fordult elő szignifikánsan gyakrabban: 25%-uk O25-ös, és 8%-uk O15-ös szerocsoportúnak bizonyult. Ez részben jelezheti,
hogy
a
világszerte
elterjedt
O25-ös
ESBL
klón
már
megjelent
Magyarországon, sőt azon kívül egy olyan kisebb csoport is növekvő előfordulási gyakoriságot mutat, ami az irodalomban még nem szerepel. Mivel mindkét szerocsoport jelentős uropatogén ágens, további vizsgálatokkal dönthető csak el, hogy van-e kapcsolat a két független patogén tulajdonság között. Kérdés továbbá az is, hogy bizonyos O antigének és virulencia-markerek hordozásának kapcsolata vajon a mobilis genetikai elemek felvételének klonális jellegével, vagy az O antigének kémiai összetételével magyarázható.
80
9.
ÖSSZEFOGLALÁS A patogén E. coli baktériumok világszerte nagyszámú súlyos megbetegedést
okoznak. A hordozott virulencia markerektől függően különböző csoportokba sorolhatjuk őket: az EPEC, VTEC, EHEC, ETEC, EIEC, EAggEC és DAEC a hasmenéses megbetegedésekért felelősek, az UPEC, MAEC pedig az extraintesztinális manifesztációkért. Fő célkitűzésem az volt, hogy a Nemzeti Enterális Referencia Laboratóriumban molekuláris módszerek bevezetésével tegyem hatékonyabbá az E. coli diagnosztikát. Munkám során gyűjtött törzsek segítségével beállítottam és optimalizáltam azokat a PCR vizsgálatokat, amelyek segítségével detektálni tudjuk az intimint (eae), a verotoxint (vtx) és altípusait: az enterohemolizint (ehlyA), az invazint (ipaH), az enteroaggregatív hőstabil toxint (ast1), az ETEC hőlabil toxint (elt) és az ETEC hőstabil toxint (est). A szerotipizálás mellett ezek a vizsgálatok a patocsoportba sorolás hasznos eszközeinek bizonyultak. A labordiagnosztika megreformálásának másik lépésében a csőagglutinációs módszert váltottuk ki mikroplate-agglutinációs vizsgálattal. Ez nemcsak egyszerűbb és érzékenyebb, de gazdaságosabb is, mint a hagyományos Widalcsöves technika. A beállított molekuláris módszerek segítségével egy retrospektív vizsgálat során a 2000-2006 között izolált VTEC törzseket jellemeztük. Mind a szerocsoport eloszlás, mind a kapcsolódó verotoxin altípusokban a vártnak megfelelő eredményt kaptuk. Az O157-es csoport bizonyult a leggyakoribbnak (58%). A vt2 és a vt2c toxintípusokhoz köthetőek a súlyosabb megbetegedések, de meglepő módon az ebben a periódusban leírt két HUS esetet két O26-os, vt2 termelő törzs okozta. Öt nemO157-es törzs termelt EAST-t, amit a szakirodalomban is sokszor leírnak. Közös klonális eredetet, járványügyi kapcsolatot nem találtunk az izolátumok között. Szerotípus eredményeink azt sugallják, hogy jelenleg a verotoxin termelő törzsek alulreprezentáltak Magyarországon. Reményeink szerint a közeljövőben a surveillance javulásával sokkal több esetben derül fény etiológiai szerepükre. Vizsgálataim másik körét az ESBL-termelő E. coli törzsek szerotípusának meghatározása képezte A kapott eredmények azt mutatták, hogy közöttük két csoport, az O25 és az O15 jelent meg szignifikánsan magasabb számban, továbbá PCR-el igazoltuk, hogy az általunk izolált O25-ös törzsek nagy része a világszerte elterjedt O25b-ST131 klónhoz tartozik.
81
10.
SUMMARY
Pathogenic Escherichia coli strains can cause severe illnesses in significant number worldwide. They can be categorized in different groups by the harbouring virulence factors: EPEC, VTEC, EHEC, ETEC, EIEC, EAggEC and DAEC, which are responsible for diarrheal diseases, while the UPEC and MAEC for extraintestinal manifestations. The aim of this study was to introduce molecular methods in the National Reference Laboratory of Enteral Pathogen Bacteria to enhace the efficacy of the diagnostics of pathogenic Escherichia coli. In the course of my work I have adapted and optimized PCR methods using previously collected E. coli strains, so I could detect the genes of intimin (eae), enterohaemolysin (ehlyA), enteroaggregative heat-stable toxin (ast1), ETEC heat-lable enterotoxin (elt), ETEC heat-stable enterotoxin (est) and the invasionrelated plasmid (Ipa). Besides the serotyping these assays seem to be useful tools to classify the isolates into different pathogroups. The next step of the development of laboratory diagnostics was to exchange the tube-agglutination for microplateagglutination. The latter is a simplier, more sensible as well as more economical method than the conventional tube agglutination Widal test. Application of these new molecular methods enabled the characterization of all the VTEC strains isolated from 2000 to 2006 in a retrospective study. Our results reflected expected values in the field of serogroup distribution as well as of related verotoxin subtypes. The most frequent group proved to be the O157 type (58%), while the most severe outbreaks were due to vt2 and vt2c toxintypes producing E. coli strains. Surprisingly the two described HUS cases were not caused by O157 but vt2-producing O26 strains. Five non-O157 isolates harboured ast1 gene often described in the literature. We have observed no association between the temporal and geographical origin and the PFGE patterns among the isolates. The results of the serotyping suggest that the verotoxigenic E. coli strains are underrepresented in Hungary, however we expect to reveal their etiologic role in more cases after improving the surveillance systems. The other purpose of our investigations was to determine the serotypes of ESBLproducing strains. The results showed that two groups: O25 and O15 appeared in significant by high numbers. Much of the O25 isolates were confirmed by PCR to belong to the worldwide- spread O25b-ST131 clone.
82
11.
IRODALOMJEGYZÉK
Adam A. (1927) Dyspepsie-koli. Zur Frage der bakteriellen Aetiologie der sogenannten alimentfiren Intoxikation. Jahrb Kinderheilk, 116: 8-40. Andrade JR, Da Veiga VF, De Santa Rosa MR, Suassuna I. (1989) An endocytic process in HEp-2 cells induced by enteropathogenic Escherichia coli. J Med Microbiol, 28: 49–57. Baldwin TJ, Ward W, Aitken A, Knutton S, Williams PH. (1991) Elevation of intracellular free calcium levels in HEp-2 cells infected with enteropathogenic Escherichia coli. Infect Immun, 59: 1599–1604. Bauer
ME,
Welch
RA.
(1996)
Characterization of an RTX toxin from
enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Infect Immun, 64: 167– 175. Bell BP, M. Goldoft M, P. M. Griffin PM, M. A. Davis MA, D. C. Gordon DC, P. I. Tarr PI, Bartleson CA, Lewis JH, Barrett TJ, Wells JG, Baron R, Kobayashi J. (1994) A multistate outbreak of Escherichia coli O157:H7-associated bloody diarrhea and hemolytic uremic syndrome from hamburgers: the Washington experience. JAMA, 272: 1349–1353. Beutin L, Geier D, Steinrück H, Zimmermann S, Scheutz F. (1993) Prevalence and some properties of verotoxin (Shiga-like toxin)-producing Escherichia coli in seven different species of healthy domestic animals. J Clin Microbiol, 31: 2483–2488. Beutin L, Krause G, Zimmermann S, Kaulfuss S, Gleier K. (2004) Characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli strains isolated from human patients in Germany over a 3-year period. J Clin Microbiol, 42: 1099-1108. Bhatnagar S, Bhan MK, Sommerfelt H, Sazawal S, Kumar R, Saini S. (1993) Enteroaggregative Escherichia coli may be a new pathogen causing acute and persistent diarrhea. Scand J Infect, Dis. 25: 579–583.
83
Bielaszewska M, Köck R, Friedrich AW, Eiff von C, Zimmerhack LB, Karch H, Mellmann A. (2007) Shiga Toxin-Mediated Hemolytic Uremic Syndrome: Time to Change the Diagnostic Paradigm? Plos One, 10: e1024. Bilge SS, Vary JC, Dowell SF, Tarr PI. (1996) Role of the Escherichia coli O157:H7 O side chain in adherence and analysis of an rfb locus. Infect Immun, 64: 4795–4801. Black RE, Merson MH, Rowe B, Taylor PR, Abdul Alim ARM, Gross RJ, Sack DA. (1981) Enterotoxigenic Escherichia coli diarrhoea: acquired immunity and transmission in an endemic area. Bull W. H. O., 59: 263–268. Blanco JE, Blanco M, Alonso MP, Mora A, Dahbi G, Coira MA, Blanco J. (2004) Serotypes, virulence genes, and intimin types of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates from human patients: prevalence in Lugo, Spain, from 1992-1999. J Clin Microbiol, 42: 311-319. Boyce TG, Pemberton AG, Wells JG, Griffin PM. (1995) Screening for Escherichia coli O157:H7—a nationwide survey of clinical laboratories. J Clin Microbiol, 33: 3275– 3277. Boyd B, Lingwood C. (1989) Verotoxin receptor glycolipid in human renal tissue. Nephron, 51: 207–210. Brun-Buisson C, Legrand P, Philippon A, Montravers F, Ansquer M, Duval J. (1987) Transferable enzymatic resistance to third-generation cephalosporins during nosocomial outbreak of multiresistant Klebsiella pneumoniae. Lancet, ii: 302–306. Burnens AP, Frey A, Lior H, Nicolet J. (1995) Prevalence and clinical significance of Vero-toxin-producing Escherichia coli (VTEC) isolated from cattle in herds with and without calf diarrhoea. J Vet Med, 42: 311–318. Bush K, Jacoby GA, Medeiros AA. (1995) A functional classification scheme for betalactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agents Chemother, 39: 1211–1233.
84
Cagnacci S, Gualco L, Debbia E, Schito GC, Marchese A. (2008) European Emergence of Ciprofloxacin-Resistant Escherichia coli Clonal Groups O25:H4-ST 131 and O15:K52:H1 Causing Community-Acquired Uncomplicated Cystitis. J Clin Microbiol, 46: 2605-2612. Caprioli A, Tozzi AE. (1998) Epidemiology of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections in continental Europe. p. 38–48. In J. B. Kaper and A. D. O’Brien (ed.), Escherichia coli O157:H7 and other Shiga toxin-producing E. coli strains. American Society for Microbiology, Washington, D.C. Carnoy C, Moseley SL. (1997) Mutational analysis of receptor binding mediated by the Dr family of Escherichia coli adhesins. Mol Microbiol, 23: 365-379. www.cdc.gov/NCIDOD/dbmd/diseaseinfo/etec_g.htm Centers for Disease Control. (2001) Diagnosis and Management of Foodborne Illnesses: A Primer for Physicians. Morbid Mortal Weekly Rep, 50: 1-69. Chart H, Smith HR, Scotland SM, Rowe B, Milford DV, Taylor CM. (1991) Serological identification of Escherichia coli O157:H7 infection in haemolytic uraemic syndrome. Lancet, 337: 138–140. Cimolai N, Basalyga S, Mah DG, Morrison BJ, Carter JE. (1994) A continuing assessment of risk factors for the development of Escherichia coli O157:H7-associated hemolytic uremic syndrome. Clin Nephrol, 42: 85– 89. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance Standards for antimicrobial susceptibility Testing. Cocolin L, Manzano M, Cantoni C, Comi G. (2000) A multiplex-PCR method to detect enterohemorrhagic (EHEC) and enteropathogenic (EPEC) Escherichia coli in artificially contaminated foods. Int J Hyg Environ Health, 203: 159-164.
85
Crane JK, Wehner MS, Bolen EJ, Sando JJ, Linden J, Guerrant RL, Sears CL. (1992) Regulation of intestinal guanylate cyclase by the heat-stable enterotoxin of Escherichia coli (STa) and protein kinase C. Infect Immun, 60: 5004–5012. Cravioto A, Gross RJ, Scotland SM, Rowe B. (1979) An adhesive factor found in strains of Escherichia coli belonging to the traditional infantile enteropathogenic serotypes. Curr Microbiol, 3: 95-99. Cravioto A, Reyes RE, Ortega R. (1988) Prospective study of diarrhoeal disease in a cohort of rural Mexican children: incidence and isolated pathogens during the first two years of life. Epidemiol Rev, 101: 123. Czeczulin JR, Balepur S, Hicks S, Phillips A, Hall R, Kothary MH, Navarro-Garcia F, Nataro JP. (1997) Aggregative adherence fimbria II, a second fimbrial antigen mediating aggregative adherence in enteroaggregative Escherichia coli. Infect Immun 65: 4135–4145. Czirók É, Herpay M. (1999) Escherichia. In Czirók É (ed.): Klinikai és járványügyi bakteriológia. Melania, Magyarország p. 357-366. Dobrindt U, Blum-Oehler G, Hartsch T, Gottschalk G, Ron EZ, Fünfstück R, Hacker J. (2001) S-Fimbria-Encoding Determinant sfaI Is Located on Pathogenicity Island III536 of Uropathogenic Escherichia coli Strain 536. Infect Immun, 69: 4248–4256. Donnenberg MS, Donohue-Rolfe A, Keusch GT. (1989) Epithelial cell invasion: an overlooked property of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) associated with the EPEC adherence factor. J Infect Dis, 160: 452–459. Donnenberg MS, Kaper JB. (1992) Enteropathogenic Escherichia coli. Infect Immun, 60: 3953–3961. Donnenberg MS. (ed.) (2002) Escherichia coli. Virulence mechanisms of a versatile pathogen. AP, Elsevier Science, USA
86
Edwards PR, Ewing WH. (1972) Identification of Enterobacteriaceae. Burgess Publising Company, Georgia, US. 3rd ed. P. 362. The EFSA Journal (2007) Monitoring of verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) and identification of human pathogenic VTEC types. 579: 1-61. Fang GD, Lima AAM, Martins CV, Nataro JP, Guerrant RL. (1995) Etiology and epidemiology of persistent diarrhea in northeastern Brazil: a hospital-based, prospective, case-control study. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 21: 137–144. Fields PI, Blom K, Hughes HJ, Helsel LO, Feng P, Swaminathan B. (1997) Molecular characterization of the gene encoding H antigen in Escherichia coli and development of a PCR-restriction fragment length polymorphism test for identification of E. coli O157:H7 and O157:NM. J Clin Microbiol, 35: 1066–1070. Finch RG et al. (2003) Antibiotic and chemotherapy, Anti-infective agents and their use in therapy. Churchill, Livingstone, ISBN: 0443071292 Livermore, D. M. (1995) Betalactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev, 8: 557–584. Gaastra W, Svennerholm AM. (1996) Colonization factors of human enterotoxigenic Esherichia coli (ETEC). Trends Microbiol, 4: 444-452. Germani Y, Begaud E, Duval P, Le Bouguenec C. (1996) Prevalence of enteropathogenic, enteroaggregative, and diffusely adherent Escherichia coli among isolates from children with diarrhea in New Caledonia. J Infect Dis, 174: 1124-1126. Gianella RA. (1976) Suckling mouse model for detection of heat-stable Escherichia coli enterotoxin: characteristics of the model. Infect Immun, 14: 95–99. Goldberg MB, Sansonetti PJ. (1993) Shigella subversion of the cellular cytoskeleton: a strategy for epithelial colonization. Infect Immun, 61: 4941–4946. Gomes TAT, Rassi V, Macdonald KL, Ramos SRTS, Trabulsi LR, Vieira MAM, Guth BEC, Candeias JAN, Ivey C, Toledo MRF, Blake PA. (1991) Enteropathogens
87
associated with acute diarrheal disease in urban infants in Sao Paulo, Brazil. J Infect Dis, 164: 331–337. Gordillo ME, Reeve GR, Pappas J, Mathewson JJ, DuPont HL, Murray BE. (1992) Molecular characterization of strains of enteroinvasive Escherichia coli O143, including isolates from a large outbreak in Houston, Texas. J Clin Microbiol, 30: 889–893. Griffin PM, Olmstead LC, Petras RE. (1990) Escherichia coli O157: H7-associated colitis: a clinical and histological study of 11 cases. Gastroenterology, 99: 142–149. Griffin PM, Tauxe RV. (1991) The epidemiology of infections caused by Escherichia coli O157:H7, other enterohemorrhagic E. coli, and the associated hemolytic uremic syndrome. Epidemiol Rev, 13: 60–98. Griffin PM. (1995) Escherichia coli O157:H7 and other enterohemorrhagic Escherichia coli, p. 739–761. In Blaser MJ, Smith PD, Ravdin JI, Greenberg HB, Guerrant RL. (ed.), Infections of the gastrointestinal tract. Raven Press, New York, N.Y. Guinae PAM, Agterberg CM, Jansen WH. (1972) Escherichia coli O Antigen typing by Means of a Mechanized Microtechnique. Appl Microbiol, 24: 127-131. Gunzberg ST, Chang BJ, Elliott SJ, Burke V, Gracey M. (1993) Diffuse and enteroaggregative patterns of adherence of enteric Escherichia coli isolated from aboriginal children from the Kimberley region of western Australia. J Infect Dis, 167: 755–758. Harris JR, Mariano J, Wells JG, Payne BS, Donnel HD, Cohen ML. (1985) Person-toperson transmission in an outbreak of enteroinvasive Escherichia coli. Am J Epidemiol, 122: 245–252. Hedberg CW, Savarino SJ, Besser JM, Paulus CJ, Thelen VM, Myers LJ, Cameron DN, Barrett TJ, Kaper JB, Osterholm MT. (1997) An outbreak of foodborne illness caused by Escherichia coli O39: NM: an agent that does not fit into the existing scheme for classifying diarrheagenic E. coli. J Infect Dis, 176: 1625-1628.
88
Herpay M, Czirók É, Gadó I, Milch H. (1997) Detection of verocytotoxin producing Escherichia coli in Hungary. abstr. V39/VI. p.95. In VTEC ’97: 3rd International Symposium and Workshop on Shiga Toxin (Verocytotoxin)-Producing Escherichia coli Infections. Herpay M, Szikra L, Füzi M, Kálmán M, Bán É, Konkoly-Thege M. (2006) Protocol and Guideline for the bacteriological diagnosis of the enteric pathogens. Infectology and Clinical Microbiology, XIII/3: 75-84. Huang S, Chen Y, Kong G, Chen SHM, Besemer J, Borodovsky M, Jong A. (2001) A novel genetic island of meningitic Escherichia coli K1 containing the ibeA invasion gene (GimA): functional annotation and carbon-source-regulated invasion of human brain microvascular endothelialcells. Funct Integr Genomics, 1: 312–322. Itoh Y, Nagano I, Kunishima M, Ezaki T. (1997) Laboratory investigation of enteroaggregative Escherichia coli O untypeable: H10 associated with a massive outbreak of gastrointestinal illness. J Clin Microbiol, 35: 2546-2550. Izumikawa K, Hirakata Y, Yamaguchi T et al. (1998) Analysis of genetic relationships and antimicrobial susceptibility of Verotoxin-producing Escherichia coli strains isolated in Nagasaki Prefecture, Japan in 1996. Microbiol Immunol, 42: 677-681. Jackson MP, Neill RJ, O’Brien AD, Holmes RK, Newland JW. (1987) Nucleotide sequence analysis and comparison of the structural genes for Shiga-like toxin I and Shiga-like toxin II encoded by bacteriophages from Escherichia coli 933. FEMS Microbiol Lett, 44: 109–114. Jallat C, Livrelli V, Darfeuille-Michaud A, Rich C, Joly B. (1993) Escherichia coli strains involved in diarrhea in France: high prevalence and heterogeneity of diffusely adhering strains. J Clin Microbiol, 31: 2031– 2037. Jerse AE, Yu J, Tall BD, Kaper JB. (1990) A genetic locus of enteropathogenic Escherichia coli necessary for the production of attaching and effacing lesions on tissue culture cells. Proc Natl Acad Sci USA, 87: 7839–7843.
89
Johnson RP, Clarke RC, Wilson JB, Read SC, Rahn K, Renwick SA, Sandhu KA, Alves D, Karmali MA, Lior H, McEwen SA, Spika JS, Gyles CL. (1996) Growing concerns and recent outbreaks involving non-O157:H7 serotypes of verotoxigenic Escherichia coli. J Food Prot, 59: 1112–1122. Kaper JB. (1996) Defining EPEC. Rev Microbiol, Sao Paulo 27: 130–133. Karch H, Meyer T. (1989) Single primer pair for amplifying segments of distinct Shigalike-toxin genes by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 27: 2751–2757. Karch H, Huppertz HI, Bockemühl J, Schmidt H, Schwarzkopf A, Lissner R. (1997) Shiga toxin-producing E. coli infections in Germany. J Food Prot, 60: 1454-1457. Karmali MA, Steele BT, Petric M, Lim C. (1983) Sporadic cases of haemolytic uremic syndrome associated with faecal cytotoxin and cytotoxinproducing Escherichia coli in stools. Lancet, i: 619–620. Karmali MA. (1989) Infection by verocytotoxin-producing Escherichia coli. Clin Microbiol Rev, 2: 15–38. Kauffman F. (1944). Zur serologie der coli-gruppe. Act Pathol Microbiol Scand 21: 20– 45. Keene WE, McAnulty JM, Hoesly FC, Williams LP, Hedberg K, Oxman GL, Barrett TJ, Pfaller MA, Fleming DW. (1994) A swimming-associated outbreak of hemorrhagic colitis caused by Escherichia coli O157:H7 and Shigella sonnei. N Engl J Med, 331: 579–584. Kétyi I. (1989) Epidemiology of the enteroinvasive Escherichia coli. Observations in Hungary. J Hyg Epidemiol Microbiol Immunol, 33: 261–267. Kiss R, Szita G, Herpay M, Csikó Gy, Pászti J, Mag T, Szita J, Bernáth S (2009) The isolation of verocytotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) strains from improperly pasteurised cow's milk samples. Acta Alimentaria (in press)
90
Konowalchuk J, Speirs JI, Stavric S. (1977) Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli. Infect Immun, 18: 775–779. Kopecko DJ. (1994) Experimental keratoconjunctivitis (Sereny) assay. In Clark VL, Bavoil PM (ed.), Bacterial pathogenesis, part A. Academic Press, Inc., San Diego, Calif p. 39–46. Lencer WI, Constable C, Moe S, Jobling MG, Webb HM, Ruston S, Madara JL, Hirst TR, Holmes RK. (1995) Targeting of cholera toxin and Escherichia coli heat labile toxin in polarized epithelia: role of COOH-terminal KDEL. J Cell Biol, 131: 951–962. Levine MM, Edelman R. (1984) Enteropathogenic Escherichia coli of classic serotypes associated with infant diarrhea: epidemiology and pathogenesis. Epidemiol Rev, 6: 31– 51. Levine MM. (1987) Escherichia coli that cause diarrhea: enterotoxigenic, enteropathogenic, enteroinvasive, enterohemorrhagic, and enteroadherent. J Infect Dis, 155: 377-389. Levine MM, Ferreccio C, Prado V, Cayazzo M, Abrego P, Martinez J, Maggi L, Baldini MM, Martin W, Maneval D, Kay B, Guers L, Lior H, Wasserman SS, Nataro JP. (1993) Epidemiologic studies of Escherichia coli diarrheal infections in a low socioeconomic level peri-urban community in Santiago, Chile. Am J Epidemiol, 138: 849–869. Livermore DM. (1995) Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev, 8: 557–584. Mag T, Nógrády N, Herpay M, Tóth I, Rozgonyi F. (2009) Characterization of verotoxin-producing Escherichia coli strains isolated from human patients in Hungary over a 7-year period. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, (in press) Makino S, H Kobori, H Asakura, M Watarai, T Shirahata, T Ikeda, Takeshi K, Tsukamoto T. (2000) Detection and characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli from seagulls. Epidemiol Infect, 125: 55-61.
91
McDaniel TK, Jarvis KG, Donnerberg MS, Kaper JB. (1995) A genetic locus of the enterocyte effecement conserved among diverse enterobacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci, 92: 1664-1668. Moon HW, Whipp SC, Argenzio RA, Levine MM, Giannella RA. (1983) Attaching and effacing activities of rabbit and human enteropathogenic Escherichia coli in pig and rabbit intestines. Infect Immun, 41: 1340–1351. Moreno ACR, Guth BEC, Martinez MB. (2006) Can the fliC PCR-Restriction Fragment Length
Polymorphism
Technique
Replace
Classic
Serotyping
Methods
for
Characterizing the H Antigen of Enterotoxigenic Escherichia coli Strains? J Clin Microbiol, 44: 1453–1458. Moseley SL, Echeverria P, Seriwatana J, Tirapat C, Chaicumpa W, Sakuldaipeara T, Falkow S. (1982) Identification of enterotoxigenic Escherichia coli by colony hybridization using three enterotoxin gene probes. J Infect Dis, 145: 863–869. Nataro JP, Baldini MM, Kaper JB, Black RE, Bravo N, Levine MM. (1985) Detection of an adherence factor of enteropathogenic Escherichia coli with a DNA probe. J Infect Dis, 152: 560–565. Nataro JP, Scaletsky IC, Kaper JB, Levine MM, Trabulsi LR. (1985) Plasmid-mediated factors conferring diffuse and localized adherence of enteropathogenic Escherichia coli. Infect Immun, 48: 378–383. Nataro JP, Kaper JB, (1998) Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev, 11: 142-201. Nataro JP, Seriwatana J, Fasano A, Maneval DR, Guers LD, Noriega F, Dubovsky F, Levine MM, Morris JG. (1995) Identification and cloning of a novel plasmid-encoded enterotoxin of enteroinvasive Escherichia coli and Shigella strains. Infect Immun, 63: 4721–4728.
92
Nataro JP, Deng Y, Maneval DR, German AL, Martin WC, Levine MM. (1992) Aggregative adherence fimbriae I of enteroaggregative Escherichia coli mediate adherence to HEp-2 cells and hemagglutination of human erythrocytes. Infect Immun, 60: 2297–2304. National institute of health and infectious diseases control division, Ministry of health and welfare of Japan. (1996) Outbreaks of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 infection. 1996. Japan. Infectious Ag. Surveillance Report. 17: 180-181. Nguyen TV, Van PL, Huy CL, Gia NK, Weintraub A. (2005) Detection and characterization of diarrheagenic Escherichia coli from young children in Hanoi, Vietnam. J Clin Microbiol, 43: 755-760. Nicolas-Chanoine MH, Blanco J, Leflon-Guibout V, Demarty R, Alonso MP, Caniça MM, Park YJ, Lavigne JP, Pitout J, Johnson JR. (2007) Intercontinental emergence of Escherichia coli clone O25:H4-ST131 producing CTX-M-15. J Antimicrob Chemother, 61: 273-281. O’Brien AD, Thompson MR, Cantey JR, Formal SB. (1977) Production of a Shigella dysenteriae-like toxin by pathogenic Escherichia coli, abstr. B-103. In Abstracts of the 77th Annual Meeting of the American Society for Microbiology 1977. American Society for Microbiology, Washington, D.C. O’Brien AD, Newland JW, Miller SF, Holmes RK, Smith HW, Formal SB. (1984) Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea. Science, 226: 694–696.
Orskov I, Orskov F. (1982) O, K, H and fimbrial antigens in E. coli serotypes assotiated with pyelonephritis and cystitis. Scand J Infect, 33: 18-25. Orskov F, Orskov I. (1984) Serotyping of Escherichia coli. In: Bergan T. (Ed.), Meth Microbiol, 14: 43–112.
93
Oswald E, Schmidt H, Morabito S, Karch H, Marchés O, Caprioli A. (2000) Typing of intimin genes in human and animal enterohaemorrhagic and enteropathogenic Escherichia coli: characterization of a new intimin variant. Infect Immun, 68: 64-71. Pal T, Al-Sweith NA, Herpay M, Chugh TD. (1997) Identification of enteroinvasive Escherichia coli and Shigella strains in pediatric patients by an IpaC-specific enzymelinked immunosorbent assay. J Clin Microbiol, 35: 1757–1760. Park CH, Hixon DL, Morrison WL, Cook CB. (1994) Rapid diagnosis of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 directly from fecal specimens using immunofluorescence stain. Am J Clin Pathol, 101: 91–94. Pass MA, Odedra R, Batt RM. (2000) Multiplex PCRs for Identification of Escherichia coli Virulence Genes. J Clin Microbiol, 38: 2001-2004. Paton AW, Paton JC. (2002) Direct detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by multiplex PCR for stx1, stx2, eae, ehxA, and saa. J Clin Microbiol, 40: 271-274. Paul M, Tsukamoto T, Ghosh AR, Bhattacharya SK, Manna B, Chakrabarti S, Nair GB, D. Sack DA, Sen D, Takeda Y. (1994) The significance of enteroaggregative Escherichia coli in the etiology of hospitalized diarrhoea in Calcutta, India, and the demonstration of a new honeycombed pattern of aggregative adherence. FEMS Microbiol Lett, 117: 319–326. Pickering LK, Obrig TG, Stapleton FB. (1994) Hemolytic-uremic syndrome and enterohemorrhagic Escherichia coli. Pediatr Infect Dis J, 13: 459–476. Piérard D, Muyldermans G, Moriau L, Stevens D, Lauwers S. (1998) Identification of new verocytotoxin type 2 variant B-subunit genes in human and animal Escherichia coli isolates. J Clin Microbiol, 36: 3317–3322. Plunkett G, Ros DJ, Durfee TJ, Blattner FB. (1999) Sequence of Shiga Toxin 2 Phage 933W from Escherichia coli O157:H7: Shiga Toxin as a Phage Late-Gene Product J Bact, 1767–1778.
94
Poitrineau P, Forestier C, Meyer M, Jallat C, Rich C, Malpuech G, De Champs C. (1995) Retrospective case-control study of diffusely adhering Escherichia coli and clinical features in children with diarrhea. J Clin Microbiol, 33: 1961–1962. Preston MA, Johnson W, Khakhria R, Borczyk A. (2000) Epidemiologic subtyping of Escherichia coli serogroup O157 strains isolated in Ontario by phage typing and Pulsed-Field Gel Electrophoresis. J Clin Microbiol, 38: 2366-2368. Prère M-F, Fayet O. (2005) A new genetic test for the rapid identification of shigatoxines producing (STEC), enteropathogenic (EPEC) E. coli isolates from children. Pathol Biol, 53: 466–469. Reymond D, Johnson RP, Karmali MA, Petric M, Winkler M, Johnson S, Rahn K, Renwick S, Wilson J, Clarke RC, Spika J. (1996) Neutralizing antibodies to Escherichia coli vero cytotoxin 1 and antibodies to O157 lipopolysaccharide in healthy farm family members and urban residents. J Clin Microbiol, 34: 2053–2057. Ribot EM, Fair MA, Gautom R, Cameron DN, Hunter SB, Swaminathan B, Barrett TJ. (2006) Standardization of Pulsed-Field Gel Electrophoresis Protocols for the Subtyping of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella for PulseNet. Food Path Dis, 3: 59-67. Riley LW, Remis RS, Helgerson SD, McGee HB, Wells JG, Davis BR, Hebert RJ, Olcott ES, Johnson LM, Hargrett NT, Blake PA, Cohen ML. (1983) Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype. N Engl J Med, 308: 681–685. Safdar N, Said A, Gangnon RE, Maki DG. (2002) Risk of Hemolytic Uremic Syndrome After Antibiotic Treatment of Escherichia coli O157:H7 Enteritis. JAMA, 288: 9961001. Sasakawa C, Buysse JM, Watanabe H. (1992) The large virulence plasmid of Shigella. Curr Top Microbiol Immunol, 180: 21–44.
95
Savarino SJ, McVeigh A, Watson J, Molina J, Cravioto A, Echeverria P, Bhan MK, Levine MM, Fasano A. (1996) Enteroaggregative Echerichia coli heat-stable toxin is not restricted to enteroaggregative Escherichia coli. J Infect Dis, 173:1019-1022. Scheutz F, Beutin L, Pierard D, Smith H (2001) Appendix – Nomenclature of verocytotoxins. p. 447-452. In Duffy G, Garvey P, McDowell DA (szerk.), Verocytotoxigenic E. coli. Food and Nutrition Press, Trumbull, USA. Schmidt H, Karch H, Beutin L. (1994) The large-sized plasmids of enterohemorrhagic Escherichia coli O157 strains encode hemolysins which are presumably members of the E. coli a-hemolysin family. FEMS Microbiol Lett, 117: 189–196. Schmidt H, Beutin L, Karch H (1995) Molecular analysis of the plasmid-encoded haemolysin of Escherichia coli O157:H7 strain EDL 933. Infect Immun 63: 1055-1061 Sears CL, Kaper JB. (1996) Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and linkage to intestinal secretion. Microbiol Rev, 60:167–215. Sixma TK, Kalk KH, van Zanten BA, Dauter Z, Kingma J, Witholt B, Hol WG. (1993) Refined structure of Escherichia coli heatlabile enterotoxin, a close relative of cholera toxin. J Mol Biol, 230: 890–918. Slutsker L, Ries AA, Greene KD, Wells JG, Hutwagener L, Griffin PM. (1997) Escherichia coli O157:H7 diarrhea in the United States: clinical and epidemiologic features. Ann Intern Med, 126: 505–513. Sonnevend Á, Al Dhaheri K, Mag T, Herpay M, Kolodziejek J, Nowotny N, Usmani A, Sheikh FA, Pál T (2006) CTX-M-15-producing multi-drug resistant enteroaggregative Escherichia coli in the United Arab Emirates. Clin Microbiol Infect, 12: 582-585. Steiner TS, Lima AAM, Nataro JP, Guerrant RL. (1998) Enteroaggregative Escherichia coli Produce Intestinal Inflammation and Growth Impairment and Cause Interleukin-8 Release from Intestinal Epithelial Cells. J Infect Dis, 177: 88–96.
96
Svennerholm AM, Åhre´n C, Jertborn M. (1997) Vaccines against enterotoxigenic Escherichia coli infections. I. Oral inactivated vaccines against enterotoxigenic Escherichia coli, p. 865–873. In Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS. (ed.), New generation vaccines, 2nd ed. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Tacket, Suzuki S, Shibata N, Yamane K, Wachino JI, Ito K, Arakawa Y. (2009) Change in prevalence of extended-spectrum-β-lactamese-producing Escherichia coli in Japan by clonal spread. J Antimicrob chemoth, 63: 72-79. Tacket CO, Levine MM. (1997) Vaccines against enterotoxigenic Escherichia coli infections. II. Live oral vaccines and subunit (purified fimbriae and toxin subunit) vaccines, p. 875–883. In Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS. (ed.), New generation vaccines, 2nd ed. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y Tarr PI. (1995) Escherichia coli O157:H7: clinical, diagnostic, and epidemiological aspects of human infection. Clin Infect Dis, 20: 1–10. Tarr PI, Neill MA. (1996) Perspective: The problem of non- O157:H7 Shiga toxin (verocytotoxin)-producing Escherichia coli. J Infect Dis, 174: 1136–1139. Taylor DN, Echeverria P, Sethabutr O, Pitarangi C, Leksomboon U, Blacklow NR, Rowe B, Gross R, Cross J. (1988) Clinical and microbiologic features of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infections detected by DNA hybridization. J Clin Microbiol, 26: 1362–1366. Torres AG, Payne SM. (1997) Haem iron-transport system in enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Mol Microbiol, 23: 825–833. Tóth I, Barrett TJ, Cohen ML, Rumschlag HS, Green JH, Wachsmuth IK. (1991) Enzyme-linked immunosorbent assay for products of the 60-megadalton plasmid of Escherichia coli serotype O157:H7. J Clin Microbiol, 29: 1016–1019. Tóth I, Schmidt H, Kardos G, Lancz Zs, Creuzburg K, Damjanova I, Pászti J, Beutin L, Nagy B. (2009) Virulence genes and molecular typing of different groups of Escherichia coli O157 strains in cattle. Appl Env Microbiol, (in press).
97
Tozzi AE, Gorietti S, Caprioli A. (2001) Epidemiology of human infections by Escherichia coli O157 and other verocytotoxinproducing E. coli, In Duffy G., Garvey P., McDowell D. (Eds.), Verocytotoxigenic Escherichia coli, Food & Nutrition Press INC. p. 161-179. Tzipori S, Montanaro J, Robins-Browne RM, Vial P, Gibson R, Levine MM. (1992) Studies with enteroaggregative Escherichia coli in the gnotobiotic piglet gastroenteritis model. Infect Immun, 60: 5302–5306. Vila J, Vargas M, Henderson IR, Gascón J, Nataro JP. (2000) Enteroaggregative Escherichia coli virulence factors in traveler’s diarrhea strains. J Inf Dis, 182: 17801783. Viljanen MK, Peltola T, Junnila SYT, Olkkonen L, Järvinen H, Kuistila M, Huovinen P. (1990) Outbreak of diarrhoea due to Esherichia coli O11:B4 in schoolchildren and adults: association of Vi antigen reactivity. Lancet, 336: 831-834. Wells JG, Shipman LD, Greene KD, Sowers EG, Green JH, Cameron DN, Downes FP, Martin ML, Griffin PM, Ostroff SM, Potter ME, Tauxe RV, Wachsmuth IK. (1991) Isolation of Escherichia coli serotype O157:H7 and other Shiga-like-toxin-producing E. coli from dairy cattle. J Clin Microbiol, 29: 985–989. Wong CS, MD, Jelacic S, Habeeb RL, Watkins SL, Tarr PI. (2000) The Risk of the Hemolytic–Uremic Syndrome after Antibiotic Treatment of Escherichia coli O157:H7 Infections. NEJM, 342: 1830-1936. World Health Organization. (1999) Zoonotic non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC). W.H.O. Scientific Working Group Meeting, Berlin, Germany. www.lahey.org/Studies/webt.htm Yatsuyanagi J, Saito S, Miyajima Y, Amano KI, Enomoto K. (2003) Characterization of Atypical Enteropathogenic Escherichia coli Strains Harboring the astA Gene That Were Associated with a Waterborne Outbreak of Diarrhea in Japan. J Clin Microbiol, 41: 2033-2039.
98
Zhang WL, Köhler B, Oswald E, Beutin L, Karch H, Morabito S, Caprioli A, Suerbaum S, Schmidt H. (2002) Genetic diversity of intimin genes of attaching and effacing Escherichia coli strains. J Clin Microbiol, 40: 4486-4492.
99
12.
SAJÁT PUBIKÁCIÓK JEGYZÉKE
12.1.
A disszertációval kapcsolatos közlemények jegyzéke
Mag T (2004) A Shiga toxin termelő Escherichia coli törzsek molekuláris tipizálási lehetőségei. Mikrobiológiai Körlevél 2004/4 IV. Sonnevend Á, Al Dhaheri K, Mag T, Herpay M, Kolodziejek J, Nowotny N, Usmani A, Sheikh FA, Pál T (2006) CTX-M-15-producing multi-drug resistant enteroaggregative Escherichia coli in the United Arab Emirates. Clin Microbiol Infect, 12: 582-585. IF: 3,554 Kiss R, Szita G, Herpay M, Csikó Gy, Pászti J, Mag T, Szita J, Bernáth S (2009) The isolation of verocytotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) strains from improperly pasteurised cow's milk samples. Acta Alimentaria (in press) IF: 0,441 Mag T, Nógrády N, Herpay M, Tóth I, Rozgonyi F. (2009) Characterization of verotoxin-producing Escherichia coli strains isolated from human patients in Hungary over a 7-year period. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, (in press) IF: 2,866
12.2.
A disszertáció témájával kapcsolodó előadások jegyzéke
Mag T (2004) A Shiga toxin-termelő Escherichia coli törzsek (STEC) molekuláris tipizálási lehetőségei tekintettel az Stx2 altípusaira. Magyar Mikrobiológiai Társaság Nagygyűlése, Keszthely 2004. 10.
Mag T (2004) A Shiga toxin termelő Escherichia coli törzsek (STEC) molekuláris tipizálási lehetőségei tekintettel az Stx2 altípusaira. SOTE, PhD Napok, Budapest 2005.04.
Mag T (2005) Escherichia coli pathocsoportok. OEK Bakteriológiai főosztály munkaértekezlet, Budapest 2005. 06.
100
Mag T (2005) Escherichia coli, mint kórokozó - molekuláris vizsgálatok, tipizálási lehetőségek. Referáló előadás, SOTE, Mikrobiológiai Intézet 2005. 04.
Pál T, Sonnevend Á, Al-Dhaheri K, Herpay M, Mag T, Usmani A, Kolodziejek J, Nowotny N (2006) Shiga toxin-producing Escherichia coli isolated from one-humped camels (Camelus dromedarius) Europien Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (16. ECCMID), Nizza, 2006.04.01-04. (poszter)
12.3.
A disszertáció témájával nem kapcsolatos publikációk jegyzéke
Lukács J, Bognár Cs, Szántai E, Mag T. (2001) Legionella átfertőzöttség Magyarországon. Focus Medicine. III. évf/2. 31-34. Bognár Cs, Kádár M, Senoner Zs, Lukács J, Szántai E, Mag T, Tarján E (2001) Legionellózis Magyarországon. Focus Medicine. III. évf/ 2. 27-30. old.
12.4.
A disszertáció témájával nem kapcsolatos előadások jegyzéke
Lukács J, Bognár Cs, Szántai E, Mag T. (2001) Legionellózis: szeroepidemiológiai vizsgálatok eredményei. Szeroepidemiológia 2000. OEK Tudományos ülés Budapest, 2001.03.06. Mag T, Herpay M, Hegedűsné Richter Zs (2004) A yersiniák által okozott fertőzések immunszerológiai diagnosztikájának fejlesztése. Biomedica Symposium, Budapest
2004. 03. Mag T (2006) Molekuláris módszerek bevezetése a veszélyes kórokozók kimutatásában. Infektológiai Nagygyűlés, Pécs, 2006.10. Mag T (2007, 2008) Pestis, brucellózis, tularémia és malleus molekuláris biológiai diagnosztikája. Veszélyes kórokozók diagnosztizálása, Továbbképzés, OEK
101
13.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Szeretném megköszönni témavezetőimnek, Prof. Rozgonyi Ferencnek és Dr. Szabó
Dórának, hogy munkámat támogatták. Köszönöm Dr. Herpay Máriának, hogy a labormunkához a feltételeket biztosította és észrevételeivel, tapasztalataival segítette a dolgozat elkészülését. Köszönettel tartozom az Országos Epidemiológiai Központ, Bakteriológiai II. osztály valamennyi dolgozójának, különösen Hegedűsné Richter Zsuzsannának, Szarkáné Pethő Krisztinának, akik asszisztensként mindig kedvesen, segítőkészen álltak rendelkezésemre, valamint Tóth Szilárd kollégámnak, aki szorgalmasan segédkezett minden új vizsgálat beállításában. Köszönöm Tóth Ákosnak, hogy mindig fordulhattam hozzá a kérdéseimmel, és az antibiotikum vizsgálatokban is rendkívül sokat segített. Hálás vagyok Dr. Nógrády Noéminek, hogy önzetlenül és kérés nélkül mindig rendelkezésemre állt, mind a cikkírások során, mind egyéb szakmai kérdések kapcsán. Szeretnék továbbá köszönetet mondani a Brüsszeli Szabad Egyetem mikrobiológiai laboratóriumában dolgozóknak, különösen Dr. Denis Piérardnak, az inspiráló környezetért és a molekuláris munkákban nyújtott értékes segítségért. Köszönettel tartozom Németh Istvánnak a statisztikai problémák gyors és frappáns megoldásáért. Nagyon hálás vagyok Dr. Balla Eszternek, hogy mindig szakított időt rám és a kéréseimre, és mindig jókedvre derített. Köszönöm Laczik Cecíliának az empátiát és kedvességet, amivel az adminisztratív problémákat segített legyőzni. Köszönöm Petrovay Fruzsinának, hogy együtt csinálhattuk végig ezt a hat évet, és leküzdöttük az összes elénk gördülő akadályt azzal, hogy kölcsönösen támogattuk egymást a nehéz időszakokban. Hálával tartozom szüleimnek, és az egész családomnak, akik mindent megtettek, hogy tanulhassak, inspiráltak, mellettem álltak és hittek a munkám sikerében. Végül, de nem utolsó sorban, nem tudok eléggé hálás lenni férjemnek és kisfiamnak, akik türelemmel viselték a dolgozat elkészülését, és mindvégig támogattak.
102
