Mikrobiologické zkoumání potravin
Zákonitosti růstu mikroorganismů v přírodním prostředí, vliv fyzikálních faktorů na růst mikroorganismů
Potravinářská mikrobiologie - historie • • • • • • • • • • • • • • • • • •
3 miliardy let – vývoj prvních bakterií 3 miliony let – první lidé 20 000 let – zemědělské společnosti NaCl a kouř konzervační prostředky 2 000 let – omezení výživy s ohledem na náboženské zákazy a zákony víno, olej a med jako konzervační prostředky _________________________________________________________ 1810 – ve Francii patentováno konzervování 1859 – isolace kyseliny sorbové z oleje plodů jeřábu 1860 – Pasteur definoval základy tepelných procesů 1861 – patent na mražené ryby 1880 – v Německu zavedena pasterizace mléka 1885 – popsána E.coli 1888 – isolována Salmonella 1892 – E.coli jako indikátor fekálního znečištění vody 1896 – bakterie Clostridium botulinum popsána 1960 – popsán aflatoxin 1981 – propuknutí listeriosy v USA 1983 – popsán toxin Campylobacter jejuni 2007 – epidemie Listeria monocytogenes
Bezpečnost potravin „Nemoci způsobené potravinami jsou pravděpodobně nejrozšířenějším zdravotním problémem v současném světě a jsou vyznamnou příčinou ekonomických ztrát“ WHO
Potraviny nejsou sterilní !!!! Vzduch, půda, voda Kontaminace člověkem
Potraviny Nakládání a příprava potravin konzumenty Výroba, zpracování, marketing
Definice růstu • Růstem myslíme jednak zvyšování počtu jednotlivých mikroorganismů, případně zbytnění jednotlivých organel, a tím i zvětšování jednotlivého mikrobu. • Když je mikroorganismus v uzavřeném prostoru, po několik málo generací roste počet živých buněk exponencionálně, brzy nastává stacionární fáze pro omezení nedostatkem výživy a prostoru. • V otevřeném systému s nepřetržitým přísunem živin je exponenciální růst po delší dobu. Pro růst mikrorganismů je možné použít mnoho technik, kterými se mění nejen životaschopnost, ale i počet buněk včetně buněčné hmoty.
Růst u jednobuněčných organismů • Pro jednobuněčné organizmy jako jsou bakterie, růst může být měřen jako dva různé parametry: změna (přírůstek) buněčné hmoty a změna počtu buněk. • Metody měření buněčné hmoty (cell mass) • Metody pro měření buněčné hmoty jsou jak přímé, tak nepřímé techniky. 1. Přímé fyzikální měření sušiny (dry weight) mokré hmoty (wet weight),nebo objem buněk po centrifugaci. • 2. Přímé chemické měření některých chemických složek buněk, jako je celkový N, celkový protein, nebo celkový obsah DNA. • 3. Nepřímé měření chemické aktivity jako je rychlost produkce nebo spotřeby kyslíku (O2 ) produkce nebo spotřeba oxidu uhličitého - CO2
Standardní růstová křivka Růstová křivka mikrobů v uzavřenémsystému
Počet živých buněk (log)
Stacionární fáze
Degradační fáze
Fáze exponenciálního růstu
Lag-fáze
Čas
Log vynesení růstu
Výpočet růstové rychlosti • Je-li počáteční počet buněk x0, pak po uplynutí generační doby je počet buněk 2x0 a po uplynutí n generačních dob je • x = 2n.x0 • Z toho lze vypočítat počet generačních dob nebo řečeno jinak počet generací :
Výpočet růstové rychlosti • Z průměrné rychlosti dělení vypočítáme závislost počtu vzniklých buněk na čase :
x = x0.2r.t • • Tato závislost ukazuje, že počet vzniklých buněk je exponenciální funkcí času
Výpočet růstové rychlosti log x − log x 0 • n= log 2
Růstová rychlost r, v našem případě počet generací v určitém časovém úseku t je r = n/t
Výpočet růstové rychlosti • Z průměrné rychlosti dělení můžeme také vypočítat střední generační dobu, což je doba nutná pro vytvoření jedné generace: • Τ = 1/r = Τ . log2 / log x/x0 • Derivací závislosti počtu vzniklých buněk podle časového úseku (=okamžitý přírůstek buněk) dostáváme :
dx dt
Výpočet růstové rychlosti • dx/dt = x0.2rt.r.ln2 = x.r.ln2 • Jestliže si definujeme specifickou rychlost růstu jako : μ = r.ln2 , dostáváme jednoduchou diferenciální rovnici : • dx/dt = μ.x
Výpočet růstové rychlosti • μ = lnx2 – lnx1 / t2 - t1
• ln - logaritmus naturalis
Výpočet růstové rychlosti • Dobu zvojení T získáme ze vztahu • ln 2 = μ . T • T = ln 2 / μ = 0,693 / μ
Výpočet růstové rychlosti
Obsah živin • Koncentrace klíčových živin může do určité míry ovlivnit rychlost růstu mikroorganismů. • Vztah mezi rychlostí růstu a koncentrací živiny je znám jako Monodova rovnice , je matematicky identický rovnicí Michaelis-Menten (enzymová kinetika) • Odráží závislost mikrobiálního růstu na rychlost limitující enzymové reakci.
Monodova rovnice • μ = μmS / S +Ks • μ specifická růstová rychlost • μm maximální specifická růstová rychlost • S koncentrace limitujícího substrátu • Ks saturační konstanta
Výskyt mikroorganismů • • • • •
Půda Voda Atmosféra Rostliny Živé organismy (zvířata, lidé)
Mikroorganismy ve vodě • Psychrofilní a psychrotrofní druhy Manipulační mikroflora Enterobacteriaceae Staphylococcus Kontaminace sladké a mořské vody
Bakterie ve vzduchu • Gram pozitivní tyčinky a koky Bacillus, Micrococcus, Corynebacterium, Streptomyces • Kvantitativní stanovení • Význam pigmentů • Souvislosti s kažením potravin
Plísně ve vzduchu • Penicillium, Aspergillus (nesmáčenlivé spory) • Fusarium (smáčenlivé spory) • Cladosporium herbarum Aktivní šíření spor
Mikroorganismy v půdě • Nejbohatší výskyt všech typů mikroorganismů • bakterie, kvasinky, plísně, protozoa, řasy • Clostridium, Bacillus, Enterobacter, Escherichia, Micrococcus, Alcaligenes, Pseudomonas, Actinomycetes, Streptococcus, Leuconostoc, Flavobacterium, Proteus
Mikroorganismy rostlin • Běžně se vyskytující mikroorganismy: • Cladosporium, Botrytis cinerea (plíseň), Aureobasidium pullulans („černá“ kvasinka) • Sporobolomyces, Bullera, Kloeckera apiculata, Pichia membranofaciens • G- tyčinky: Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Micrococcus • G+bakterie: Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Bacillus
Člověk jako zdroj mikroorganismů • Kůže • Trávicí ústrojí • Výkaly
Faktory ovlivňující růst mikroorganismů v potravinách Vnitřní : živiny, pH, redox potenciál, vodní aktivita,antimikrobiální aktivity Vnější: vlhkost, teplota, atmosféra Implicitní: specifická růstová rychlost, synergismus, antagonismus, komensalismus Technologické: krájení, mytí, balení, záření, pasteurizace
Vnitřní faktory I • Limitace substrátem – potraviny slouží jako zdroj živin a energie. Využití substrátu závisí na příslušných enzymech • Koncentrace klíčových živin – určuje rychlost růstu (Monod) • pH a pufrační kapacita. Optimum většiny bakterií je mezi 6,0 – 8,0 pH, kvasinky 4,5 – 6,0, vláknité houby 3,5 – 4,0. • Jiné bakterie rozkládají zeleninu a jiné ovoce
pH Bakterie – slabě kyselé až slabě alkalické pH Kvasinky – preferují kyselé prostředí Plísně – tolerují velmi široké rozmezí
Vnitřní faktory II • Redox potenciál, Eh [oxidant] + H+ + ne = [ reduktant] n - počet elektronů, e – přenesených Živé organismy mají jasný řád přenosu elektronů a vodíku v elektrotransportním řetězci. Schopnost přijímat nebo darovat elektrony, t.j. oxidovat nebo redukovat je vyjádřena redox potenciálem Eh .
Vnitřní faktory III Redox potenciál se měří inertní kovovou elektrodou, obvykle Pt, proti referenční externí elektrodě. Je-li rovnováha různých přítomných redox párů posunuta do oxidovaného stavu, pak bude tendence elektrony přijímat a tvořit pozitivní potenciál což znamená oxidační prostředí. Naopak, jestli systém bude elektrony vysílat jde o redukční prostředí. Tendence molekuly přijímat nebo vysílat elektrony je vyjádřena standardním redox potenciálem E0.
Vnitřní faktory IV • • • • • • • • •
E (mV) Syrové maso (po porážce) -200 Mleté syrové maso +255 Vařené párky a konzerv. maso -20 až -150 Pšenice, celá zrna -320 až -360 Ječmen, šrot + 225 Bramborová hlíza - 150 Hruška + 436 Citron + 383
pH 5,7 5,9 6,5 6,6 7,0 6,0 4,2 2,2
Redox potenciál - Eh
Vnitřní faktory V • Vodní aktivita aw • Vyjadřuje poměr parciálního tlaku vodních par nad subtrátem, vztaženým ke tlaku vodních par nad destilovanou vodou. • aw = 0.93 dolní hrańice bakterií • 0.88 dolní hranice kvasinek • 0,80 dolní hranice vláknitých hub • 0,61 xerofilní houby
Aktivita vody - aw Snížení aktivity vody: • odstranění využitelné odpařením, mražením
vody
sušením,
uzením,
• zvýšení obsahu tuku • zvýšení koncentrace rozpuštěných látek v prostředí (cukry - sacharosa, NaCl) → zvýšení osmotického tlaku (hypertonické prostředí) → difuze vody z buňky do prostředí → zastavení metabolizmu až smrt buňky
Aktivita vody - aw
Vnější faktory • Relativní vlhkost – množství vody v atmosféře • Teplota – • Složení atmosféry – kyslík 21% , inhibiční účinek oxidu uhličitého, ochranné balení do dusíku • Čas
Složení atmosféry Skladování potravin v řízené atmosféře plynů má ochranný účinek • Vakuově balené potraviny (v obalech nepropustných pro kyslík) • CO2 brání růstu aerobní mikroflóry, používá se při skladování ovoce a zeleniny, nesmí se používat pro potraviny s vysokým obsahem tuku, protože má silné oxidační účinky a způsobuje žluknutí tuků
Čas Čím delší je doba expozice, tím výraznější je účinek
Vnitřní faktory
Vnější faktory
Technologie překážek Kombinací různých faktorů vzniká řada překážek, které musí mikroorganizmy překonat. I když jednotlivé faktory nejsou dostatečné k zabránění růstu MO, jejich kombinací dochází k zesílení účinku. Čím nepříznivější překážka, tím vyšší úsilí musí mikroorganizmy vyvinout.
Prediktivní mikrobiologie Vychází ze znalostí vnitřních a vnějších faktorů • Predikce růstu • Pravděpodobnostní modely • Kinetické modelování
Predikce růstu – modelování typ zákusek
Počáteční počet LM 104 CFU pH 7
Teplota 20/10°C aw 0,997
Mechanické vlivy Vysoká odolnost mikroorganizmů je způsobena pevnou buněčnou stěnou a malými rozměry K destrukci buněk dochází: • opakovaným pomalým zamrazováním a roztáváním (odolnost enzymů) • ošetření vysokým tlakem • třepání s abrazivním materiálem
Technologické faktory krájení, mytí, balení, záření, pasteurizace
