mikrobiální rozklad polymerů

Extracelulární enzymy ve vodě a mikrobiální rozklad polymerů p y Jaroslav Vrba • EKOTECH (CZ.1.07/2.3.00/09.0200 – BC AVČR Č. Budějovice)

molekuly polymerů nemohou být do buněk přenášeny membránovým transportem (ale mohou být pohlceny do vakuol! - fagocytoza) živé mikroorganismy g y vylučují y j na buněčný ýp povrch aktivní enzymy (hydrolázy), jež hydrolyzují polymery na jednotlivé monomery, které mohou být transportovány přes buněčnou membránu fagocytující i holozoické mikroorganismy vylučují hydrolázy do trávicích vakuol, kde probíhá hydrolýza polymerů u mnohobuněčných organismů plní analogickou funkci trávicí enzymy, vylučované do trávicího traktu

intracelulární enzymy 

ektoenzymy

extracelulární

(exoenzymy)

extracelulární enzymy (volné, rozpuštěné)

trávicí enzymy  volně rozpuštěné svlékací enzymy  volně rozpuštěné

intracelulární enzymy 

extracelulární

ektoenzymy

extracelulární enzymy (volné, rozpuštěné)

trávicí enzymy  volně rozpuštěné svlékací enzymy  volně rozpuštěné

EXTRACELULÁRNÍ ENZYMY VE VODNÍCH EKOSYSTÉMECH aktivita extracelulárního enzymu bývá vázána na částice sestonu = ektoenzymy bakterií nebo řas kromě primárně extracelulárních enzymů jsou do vody uvolňovány vnitrobuněčné enzymy při lyzi buněk, resp. somatické enzymy mnohobuněčných organismů (svlékání čl členovců, ů poranění ě í apod.) d) aktivita rozpuštěného (volného) enzymu bývá nízká (může být druhotně adsorbován na částice!) extracelulární enzymy mají někdy překvapivě dlouhou životnost, jsou různě chráněny před působením volných proteáz t á

endoenzymy

HYDROLÁZY polymery

oligomery

exoenzymy y y

monomery

umělé fluorogenní substráty

O

O

O

CH2OH O OH OH β-D-glukosidáza

CH3

O

O

OH

umělý (nefluorescenční) substrát 4-methylumbelliferyl 4 methylumbelliferyl β-D-glukosid β D glukosid 4-methylumbelliferyl fosfát

O

O

O — PO4

CH3 4-methylubelliferon y

fosfatáza CH3

(fosfomonoesteráza)

Princip funkce a regulace ektoenzymů (Ch ó t 1991) (Chróst

HMW ~ >1000 Da

LMW ~ <700 Da

Princip funkce EEA v planktonu (H (Hoppe 1991)

DEA (EEA)

2 různé enzymy štěpící MUF-GlcNAc

Princip metody stanovení EEA MUF fluorescence

(filtrace) inkubace



(in situ pH & teplota)

vzorek

(+ pufr) + HgCl2 (blank)

MUF substrát

alkalizace

+ HgCl2 + 2M NaOH & EDTA (blank)

Časový průběh hydrolýzy substrátu – časová kinetika 14000

Relative F R F.U. (cps s)

12000 5 µM

10000

Ohyb závislosti signalizuje vyčerpávání substrátu

8000 6000 4000 2000 0

0

10

20

30

40

50

60

70

time (min)

80

90

100 110 120

Časový průběh hydrolýzy substrátu – časová kinetika 14000


12000 5 µM

10000 8000 6000

Sklon regresní přímky v oblasti lineární závislosti udává rychlost hydrolýzy substrátu

4000 2000 0

0

10

20

30

40

50

60

70

time (min)

80

90

100 110 120

Časový průběh hydrolýzy substrátu – časová kinetika 0.1 µM 0.5 µM 1 µM 2 µM 5 µM

14000


12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

0

10

20

30

40

50

60

70

time (min)

80

90

100 110 120

Časový průběh hydrolýzy substrátu – časová kinetika 0.1 µM 0.5 µM 1 µM 2 µM 5 µM

14000


12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

0

10

20

30

40

50

60

70

time (min)

80

90

100 110 120

Rychlost hydrolýzy při různé koncentraci substrátu – saturační kinetika

Rovnice Michaelise-Mentenové: v = Vmax × [S] / (KM + [S])

v (µ µmol l-11 h-1)

7 6 5 4 3 2 1 0

0

100

200

300

[S] (µmol l-1)

400

500




7 6 5 4 3 2 1 0

0

100

200

300

[S] (µmol l-1)

400

500




7 6

Vmax = 6.942 µmol l-1 h-1

5 4 3 2 1 0

0

100

200

300

[S] (µmol l-1)

400

500




7 6

Vmax = 6.942 µmol l-1 h-1

5 4 v = 1/2 Vmax

3 2

KM = 3.898 3 898 µmol l-1

1 0

0

100

200

300

[S] (µmol l-1)

400

500

Wolf (Hobie-Wright)

Lineweaver-Burk 1/v = 1/Vmax + (KM/Vmax) (1/[S])

70 60

y = 0.6272 x – 0.2932

60

50

S//v

1/v v

y = 0.1398 x + 0.7464

50

40 30

40 30

20

20

10 0 -10

[S]/v = KM/Vmax + (1/V max) × [S]

70

10

1/Vmax

0

–KM

50

0

100

0

1/[S]

KM/Vmax

100 200 300 400 500

[S]

v

7 6

Transformace –

5

– lineární regrese:

Michaelis-Mentenová

4

v = Vmax × [S] / (KM + [S])

3 2 1 0

0

100

200

300

[S]

400

500

Vmax

KM

(µmol l-1 h-1) (µmol l-1)

Wolf (Hobie-Wright)

Lineweaver-Burk

Eadie

1/v = 1/Vmax + (KM/Vmax) (1/[S])

v = Vmax – KM (v/[S])

7

y = 0.2674 0 2674 x + 0 0.1710 1710

5

0.6

4

02 0.2

1/Vmax

0

1

20

Vmax/KM

10

1 2

3

0

4

40 30

2

–1/KM

-1

y = –1.937 x + 6.245

3

0.4

y = 0.1398 x + 0.7464

50

S//v

0.8

60

1/Vmax

6

v

1/v v

1.0

[S]/v = KM/Vmax + (1/Vmax) × [S]

70

–KM

0

1

1/[S]

2

3

4

0

0

v/[S] /[S]

KM/Vmax

100 200 300 400 500

[S]

v

7 6

Transformace –

5



4

v = Vmax × [S] / (KM + [S])

3

Lineweaver-Burk

2 1 0

0

100

200

300

[S]

400

500

Vmax

KM


5.8

1.7

Wolf (Hobie-Wright)

Lineweaver-Burk

Eadie

1/v = 1/Vmax + (KM/Vmax) (1/[S])


7

y = 0.2674 0 2674 x + 0 0.1710 1710

5

0.6

4

02 0.2

1/Vmax

0

1

20

Vmax/KM

10

1 2

3

0

4

40 30

2

–1/KM

-1

y = –1.937 x + 6.245

3

0.4

y = 0.1398 x + 0.7464

50

S//v

0.8

60

Vmax

6

v

1/v v

1.0


70

–KM

0

1

1/[S]

2

3

4

0

v/[S] /[S]

0

KM/Vmax

100 200 300 400 500

[S]

v

7 6

Transformace –

5



4

v = Vmax × [S] / (KM + [S])

3

Lineweaver-Burk Eadie

2 1 0

0

100

200

300

[S]

400

500

Vmax

KM


5.8 6.2

1.7 1.9

Wolf (Hobie-Wright)

Lineweaver-Burk

Eadie

1/v = 1/Vmax + (KM/Vmax) (1/[S])


7

y = 0.2674 0 2674 x + 0 0.1710 1710

5

0.6

4

02 0.2

1/Vmax

0

1

20

Vmax/KM

10

1 2

3

0

4

40 30

2

–1/KM

-1

y = –1.937 x + 6.245

3

0.4

y = 0.1398 x + 0.7464

50

S//v

0.8

60

Vmax

6

v

1/v v

1.0


70

–KM

0

1

1/[S]

2

3

4

0

KM/Vmax

0

v/[S] /[S]

100 200 300 400 500

[S]

v

7 6

Transformace –

5



4

v = Vmax × [S] / (KM + [S])

3 2

Lineweaver-Burk Eadie Wolf (Hobie-Wright)

1 0

0

100

200

300

[S]

400

500

Vmax

KM


5.8 6.2 7.2

1.7 1.9 5.3

Wolf (Hobie-Wright)

Lineweaver-Burk

Eadie

1/v = 1/Vmax + (KM/Vmax) (1/[S])


7

y = 0.2674 0 2674 x + 0 0.1710 1710

5

0.6

4

02 0.2

1/Vmax

0

1

20

Vmax/KM

10

1 2

3

0

4

40 30

2

–1/KM

-1

y = –1.937 x + 6.245

3

0.4

y = 0.1398 x + 0.7464

50

S//v

0.8

60

Vmax

6

v

1/v v

1.0


70

–KM

0

1

1/[S]

2

3

4

0

KM/Vmax

0

100 200 300 400 500

v/[S] /[S]

[S]

v

7 6

Transformace –

5



4

v = Vmax × [S] / (KM + [S])

3 2

(µmol l-1 h-1)

KM (µmol l-1)

5.8 6.2 7.2

1.7 1.9 5.3

6.9

3.9

Nelineární regrese:

1 0

Lineweaver-Burk Eadie Wolf (Hobie-Wright)

Vmax

Michaelis-Mentenová 0

100

200

300

[S]

400

500

Vmax – potenciální rychlost hydrolýzy substrátu ~ množství enzymových jednotek ve vzorku, ale l závisí á i í též na reakčních kč í h podmínkách d í ká h (teplotě, (t l tě pH H aj.)! j )!

Vmax = 16 Vmax = 8

KM – polosaturační (Michaelisova) konstanta nepřímo úměrná afinitě enzymu k substrátu Vmax = 6.942 µmol l-1 h-1

7

v (µmol l-1 h-1)

6 5 4

v = 1/2 Vmax

3

KM = 100 µmol l-1

2

KM = 38.98 38 98 µmol l-1

1 0

KM = 3.898 µmol l-1 0

100

200

300

[S] (µmol l-1)

400

500

Vliv kompetetivní p inhibice na afinitu enzymu y k substrátu pH = 4.5 45

AccPA (µm mol l-1 h-1)

5 4

KM = 10.1 µ µmol l-1

3 2

cAl = 0 (control)

1 0

0

10

20

30

40

50

60

MUFP (µmol l-1)

70

80

90

100



5 4

KM = 10.1 µ µmol l-1 KM = 11.5 µmol l-1

3 2

cAl = 0 (control) cAl = 100 µg l-11

1 0

0

10

20

30

40

50

60

MUFP (µmol l-1)

70

80

90

100



5 4


3 KM = 21.2 µmol l-1

2

cAl = 0 (control) cAl = 100 µg l-11 cAl = 300 µg l-1

1 0

0

10

20

30

40

50

60

MUFP (µmol l-1)

70

80

90

100



5 4


3 KM = 21.2 µmol l-1

2

cAl = 0 (control) cAl = 100 µg l-11 cAl = 300 µg l-1 cAl = 1000 µg l-1

KM = 30.4 µmol l-1

1 0

0

10

20

30

40

50

60

MUFP (µmol l-1)

70

80

90

100

Analýza dat saturační kinetiky Aeromonas hydrophila xosaminid dase activ ity  -hex (µmol l-11 h-1)

5

T r = Vmax /KM = 0.1824 h-1

4

3

2

1

0

0

100

EGME

Model 1:

200

300

MUF-GlcNAc (µmol l-1)

v = Tr × [S]

při KM >> [S]

Analýza dat saturační kinetiky Aeromonas hydrophila xosaminid dase activ ity  -hex (µmol l-11 h-1)

5

T r = Vmax /KM = 0.1824 h-1

4

3

2

Vmax = 5.248 µ µmol l-1 h-1 KM = 171 µmol l-1

1

0

0

100

EGME

200


300

DMSO

Model 1:

v = Tr × [S]

při KM > [S]

M d l 2: Model 2

v = Vmax × [S] / (KM + [S])

Analýza dat komplexní saturační kinetiky

osaminida ase activity y  -hexo (µmol l-1 h-1)

Aeromonas hydrophila & Cyclidium glaucoma 12 10 8 6 4 2 0

0

100

200

300


Model 3:

v = Vmax(H)×[S]/(KM(H)+[S]) + Tr(L)×[S]




0

100

200

300


Model 3:


Model 4:

v = Vmax(H)×[S]/(KM(H)+ S]) + Vmax(L)×[S]/(KM(L)+[S])




0

100

200

300


Model 3:


Model 4:




Aeromonas hydrophila & Cyclidium glaucoma 12 10 8 6

Vmax(L) = 16.61 µmol l-1 h-1 -1 KM((L) (( ) = 241.0 µmol l

4 2 0

0

100

200

300


Model 4:




Aeromonas hydrophila & Cyclidium glaucoma 12 10 8 6

Vmax(L) = 16.61 µmol l-1 h-1 -1 KM((L) (( ) = 241.0 µmol l

4

Vmax(H) = 3.399 µmol l-1 h-1 KM(H) = 0.1436 µmol l-1

2 0

0

100

200

300


Model 4:


1. den 0.14

Bodo saltans -hexosaminidase (µm mol/l h)

-hexosaminidase (µm mol/l h)

0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00

0

20

40

60

80

0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00

100

Bodo saltans

0

MUF-GlcNAc (µM)

hexosaminiidase -h (µmol/l h)


0.04 0 02 0.02

0

20

40

60

MUF-GlcNAc (µM)

6

8

10 12

0.08 Cyclidium glaucoma

0.06

0.00

4

TGR (10 9 bact./l h)

Cyclidium glaucoma

0.08

2

80

100

0.06 0.04 0 02 0.02 0.00

0

1

2

3

4

5


6

2. den 0.14



0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00

0

20

40

60

80

0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00

100

Bodo saltans

0

MUF-GlcNAc (µM)



0.04 0 02 0.02

0

20

40

60

MUF-GlcNAc (µM)

6

8

10 12


0.06

0.00

4


Cyclidium glaucoma

0.08

2

80

100

0.06 0.04 0 02 0.02 0.00

0

1

2

3

4

5


6

4. den 0.14



0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00

0

20

40

60

80

0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00

100

Bodo saltans

0

MUF-GlcNAc (µM)



0.04 0 02 0.02

0

20

40

60

MUF-GlcNAc (µM)

6

8

10 12


0.06

0.00

4


Cyclidium glaucoma

0.08

2

80

100

0.06 0.04 0 02 0.02 0.00

0

1

2

3

4

5


6

7. den 0.14



0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00

0

20

40

60

80

0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00

100

Bodo saltans

0

MUF-GlcNAc (µM)



0.04 0 02 0.02

0

20

40

60

MUF-GlcNAc (µM)

6

8

10 12


0.06

0.00

4


Cyclidium glaucoma

0.08

2

80

100

0.06 0.04 0 02 0.02 0.00

0

1

2

3

4

5


6

9. den 0.14



0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00

0

20

40

60

80

0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00

100

Bodo saltans

0

MUF-GlcNAc (µM)



0.04 0 02 0.02

0

20

40

60

MUF-GlcNAc (µM)

6

8

10 12


0.06

0.00

4


Cyclidium glaucoma

0.08

2

80

100

0.06 0.04 0 02 0.02 0.00

0

1

2

3

4

5


6

11. den 0.14



0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00

0

20

40

60

80

0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00

100

Bodo saltans

0

MUF-GlcNAc (µM)



0.04 0 02 0.02

0

20

40

60

MUF-GlcNAc (µM)

6

8

10 12


0.06

0.00

4


Cyclidium glaucoma

0.08

2

80

100

0.06 0.04 0 02 0.02 0.00

0

1

2

3

4

5


6

Vysokoafinní β-N-acetylhexosaminidázy (KM < 1 µM) ~ trávicí enzymy bakterivorních prvoků

100

1000

González et al.1993 MUF-(GlcNAc)3 MUF-GlcNAc Vmax

100

10

10

1

1

01 0.1

01 0.1

0.01

0.01

0.001 0.0001

0.001

0.01

0.1

1

Total bacterivory

10

0.001 100

MUF-GlcN M NAc hydro olysis

MUF-(G GlcNAc)3 hydrolys sis

1000

Vysokoafinní trávicí enzym bakterivorních prvoků? ~ lysozym nebo β-N-acetylhexosaminidáza?

MUF-(G GlcNAc)3 hydrolysis

MUF-GlcNAc

32

MUF-(GlcNAc) ( )3

28

1:3

8

24 20 16

4

12 8 4

0

4

5

6

7

pH

8

9

0

MUF-GlcNAc hydrolysis M

1:3

36

12

Hydrolýza MUF-N-acetyl-β-D-glukosaminidu epilimnion – Římov, 10.9.1993 – metalimnion

-1

-1

Enzyme e activity [µ µmol l h ]

0.007

0.0008

Vmax(H) A

0.006 0.0004

2

Vmax(R)

0.005 0.004

1

B

0.0004

0 0

0.0008

0.006

Vmax(R)

0.005 0.004

0.007

3

0 0

0.003

0.003

0.002

0.002

0.001

0.001

0

1

2

3

0 0

10

20

30

40

50

60

70

80 -1

Substrate [µmol l ]

90 100

0

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 -1

Substrate [µmol] l

Vysokoafinní trávicí enzym bakterivorních prvoků Piburger See - 1994

0.6 0.4 0.2

3

1.5

2

1.0

1

0.5

0 4

0.0 2.0

3

1.5 5

2

1.0

1

0.5

0

0.0

2

Epilimnion

1

-1

0.0 1.0

Metalimnion

0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 14

21 28 August

4

11 18 25 September

0 2

Metalimnion

1

0 1

8

15 22 May

29

5 June

-1

08 0.8

2.0

-1 1

Epilimnion

4

Pico oplanktivo ory [µg C l h ]

1.0

-1

Enzym me activity y [nmol l h ]:

Vmaax(H);

Vmaax(R)

Rímov Reservoir - 1993

20 µm

Hydrolýza MUF-N-acetyl-β-D-glukosaminidu Římov, 23.8.1993 – metalimnion 0.0006

0.020

Vmax(R)

0.0003

-1

-1

Enzyme e activity [µ µmol l h ]

0.025

0 015 0.015

0 0000 0.0000 0

1

2

3 LEA

0.010

0.005 Vmax(R) 0.000 0

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 -1

Substrate [µmol l ]

LEA = low-affinityy enzyme activity (KM(L) ( )>100 µM) (celková – Vmax(R))

Piburger See - 1994

Epilimnion

200 15

15

150

10

100

5

50

0 20

Metalimnion

150

10

100

5

50

0

0 14

21 28 August

4

11 18 25 September

10

100

5

50

0 0 200 15

15

150

Epilimnion

-1

20

Crusta acean zoo oplankton n [ind. l ]

Rímov Reservoir - 1993

-1

-1

En nzyme ac ctivity [nm mol l h ];

-1

Diatom biomass [mg l ]

Nízkoafinní enzymy rozsivek a perlooček

0 150

Metalimnion

10

100

5

50

0

0 1

8

15 22 May

29

5 June

Nízkoafinní enzymy rozsivek a perlooček 5

PIB

12

3

LEA

LEA

4

RIM rs= 0.578 *

2

8 4

1 0

0 0

1

2

3

20 30 40 50 60 70

Crustacean abundance

Diatom biomass 20

12

LEA

15 5

LEA

rs= 0.850 0 850 *

10 5

rs= 0.483

0 0

3

6

9 12 15

Diatom biomass

rs= 0.862 *

8 4 0 0

1

2

3

Diatom biomass

minidase -N-acetyylhexosam activityy [nmol l -11 h-1]

100

A

rs = 0.3529 ***

10

1

0.1 0.01

0.1

1

10

Diatom biomass [mm 3 l-11]

100

minidase, -N-acetyllhexosam Vmax(L) [nmol l-11 h-1]

Nízkoafinní ektoenzymy rozsivek (KM>150 µM) 20

B

r2 = 0.9870 15

pennate diatoms centric diatoms

10

r 2 = 0.9923

5

0

0

3

6

9

12

15

Di Diatom bi biomass [[mm 3 l-11]

18

ylhexosam minidase a activity  -N-acety (nmol l-11 h-1 )

Svlékací enzym perlooček 3.5

0.8316 3.0

A

2.5 20 2.0

3

1.5

2

1.0

1

0.5 0.0 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Body y length g ((mm))

• KM ~ 60 µmol l-1 • rozpuštěný (po svléknutí) • stabilní (> 2,5 dne

2.5

3.0

Příklad vyhodnocení saturační kinetiky extracelulárních β β-N-acetylhexosaminidáz N acetylhexosaminidáz v různých velikostních frakcích planktonu hexosaminidase  --N-acetylh activity y [µmol l-1 h -1]

0 025 0.025

<100 µm <10 µm <4 µm, <0.2 µm

0.020 0.015 0.010 0 005 0.005 0.000 0

50

100

150

200

250

Substrate [µmol l-1]

St ý Vrbenský Starý V b ký ryb., b 11 11.4.1995: 4 1995 nálevníci, HNF, rozsivky, korýši, chitinolitické bakterie

300

Někdy lze v povrchových vodách odlišit různé enzymy y y štěpící p MUF–GlcNAc kineticky (0,01–300 µmol l-1) a frakcionačně • "Extracelulární" aktivita trávicího enzymu y bakterivorních p prvoků jje vždy y vázána na částice a vyznačuje se vysokou afinitou (KM<0.5 µmol l-1). • Ektoenzymy chitinolytických bakterií mají nízkou afinitu k substrátu (KM>100 µmol l-1), tyto bakterie velmi často přisedají na částice chitinu. • Chitinolytická aktivita s nízkou afinitou k substrátu je často vázána na výskyt rozsivek, kromě ektoenzymů přisedlých chitinolytických bakterií jde zřejmě j o ektoenzymy y y rozsivek ((KM>150 µ µmol l-1)). • Zvýšená aktivita rozpuštěných svlékacích enzymů korýšů (členovců) ve vodě je charakteristická pro období rychle rostoucích populací korýšů (KM~60 µmol l-1), a zřejmě také např. pro období výletu vodního hmyzu? • Ke zvýšené aktivitě rozpuštěných enzymů mohou přispívat trávicí enzymy mnohobuněčných živočichů (chitinázy – korýši, hmyz, ryby)? • Podílí se na hydrolýze MUF–GlcNAc virové lysozymy?

CHITIN = polymer N-acetyl-β-D-glukosaminu (GlcNAc–GlcNAc)n: členovci houby, členovci, houby měkkýši, měkkýši červi, červi nálevníci nálevníci, rozsivky rozsivky...

O

CH2OH O OH

O

CH2OH O OH

NH–CO–CH NH CO CH3

O

CH2OH O OH


O


chitinázy, y chitobiázy, y β β-N-acetylhexosaminidázy... y y

PEPTIDOGLYKAN = polymer kyseliny N-acetyl-β-D-muramové a N-acetyl-β-D-glukosaminu N t lβD l k i (MurNAc–GlcNAc) (M NA Gl NA )n: Prokaryota (bakterie, sinice)

CH2OH O

CH2OH O OH

O

O O

NH–CO–CH CO C 3

CH3CH–CONH–CH–COOH

CH2OH O O

O

NH–CO–CH CO C 3 O

NH–CO–CH CO C 3

CH3CH–COOH

CH3 lysozymy y y y ((muramidázy) y)

umělý (nefluorescenční) substrát 4-methylumbelliferyl 4 methylumbelliferyl N N-acetyl-β-D-glukosaminidid acetyl β D glukosaminidid

O

O

O

CH2OH O OH

O

NH–CO–CH NH CO CH3 CH3 ((extracelulární)) β β-N-acetylhexosaminidázy y y

Příjem fosfátu řasovými buňkami

Pi

Porg

Snížená dostupnost P pro fytoplankton

P limitace fytoplanktonu

Indukce extracelulárních alkalických fosfatáz fytoplanktonu Římov reservoir

60

SRP Chl a

50

2.5

40

2.0

30

15 1.5

20

1.0

10

0.5

0

0.0 J

F

M

A

M

J

J

2000

A

S

O

N

D

M UF [µmo ol l-1 h-1]

SRP & Chl a [µg l-1] S

3.0

Indukce extracelulárních alkalických fosfatáz fytoplanktonu Římov reservoir

60

SRP Chl a

50 40

2.5 2.0

MUF MUF > 2µm

30

15 1.5

20

1.0

10

0.5

0

0.0 J

F

M

A

M

J

J

2000

A

S

O

N

D

M UF [µmo ol l-1 h-1]

SRP & Chl a [µg l-1] S

3.0

P limitace fytoplanktonu: lokalizace aktivní extracelulární fosfatázy (ELF®97 fosfát) autofluorescence fytoplanktonu (LUCIA)

Eudorina

10µm 20µm

2000 © A. Štrojsová

Římov 31.5.00

O Cl

Jak ELFP funguje?

NH

Cl

N

HO O Cl

NH

pH < 8 (?)

Cl

N O -O

O Cl

O-

NH Cl

N H

P

O

rozpustný? (při nízkých koncentracích?)

O

O

O Cl

pH > 8 (?)

NH

Cl

NH

Cl

N

Cl

N

-O

HO O Cl

NH

pH < 8 (?)

Cl

N O -O

O Cl

O Cl

O

P

Cl O

O-

NH

NH O

Cl

NH O

Cl

N H

Cl

N

O

rozpustný? (při nízkých koncentracích?)

Cl

NNH

N NH Cl H O

H

H

Cl

O

N

Cl O O

NH

Cl

Cl

N

H O

H O

silně fluoreskující, nerozpustná sraženina

Plešné jezero (9.10.00)

50µm 2000 © A. Štrojsová

Autofluorescence fytoplanktonu, aktivní extracel. fosfatázy

Různé extracelulární fosfatázy planktonních mikrobů Lake Čertovo

Lake Plešné

20

1000

16 18

14

ELFP-fluorimeter

13

MUFP-fluorimeter

12 8 7 6

small bacteria vibrio-shaped filaments

5 4

Activity ((µmol l-1 h-11)

Activity ((µmol l-1 h-11)

15

ELFP on filter MUFP-fluorimeter

16 12

Monoraphidium

100

10 8 6

10

4

3 2

2

1

1

0

0

May Jun Jul Aug Sep Oct Nov

2003

May

Jun

Jul

Aug

Sep

2003

celoroční P limitace planktonu v šumavských jezerech (SRP < 1 µg/l)

Oct

Specific a activity (fmo ol Monorap phidium-1 h-1)

17

Diurnální změny fosfatáz v jednorázové kultuře Chlamydomonas y reinhardtii

7000

Relativ ve fluorrescenc ce

6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 12

18

24

6

12

18

day time (hours)

24

6

12

Detekce jiných ektoenzymů v planktonu Fosfatázy

ß-Hexosaminiddázy

(ELF phosphate)

(ELF N-acetyl-ß-D-glucosaminide)

C ti Ceratium hi hirundinella di ll

Ankyra

Rhodomonas

Lipázy

(ELF palmiate)

A t i Asterionella ll fformosa

Hetero- & Mixotrofní bičíkovci

Planktonní vířníci: detekce & lokalizace enzymatických ý aktivit u různých ů ý druhů ů Trichocerca similis

K. cochlearis

K. cochlearis Synchaeta pectinata  korona  fosfatázy mastax 

lipáza

ß-hexosaminidáza (v žaludku) trávení prokaryt?

12 druhů: Keratella spp., Polyarthra spp., Synchaeta spp., Kellicottia, Trichocerca, etc.)

mikrobiální rozklad polymerů

Recommend Documents