Klónozási technikák
Mik a „klónok”? Genetikailag azonos élılények, identikus ikrek
Mik a „klónok”? Genetikailag azonos élılények, identikus ikrek: létrejöhetnek természetes úton,
Identikus ikrek keletkezése természetes úton
Mik a „klónok”? Genetikailag azonos élılények, identikus ikrek: vagy mesterséges módon elıállítva. Ivartalan szaporítási módok – a növénytermesztésben évezredek óta
Klon – görög szó – ágacska, dugvány
BIOLÓGIAI KÉRDÉS:
MEDDIG TOTIPOTENS EGY EMBRIONÁLIS SEJT?
TOTIPOTENSSÉ TEHETİ-E EGY DIFFERENCIÁLÓDOTT SEJT?
a.
b.
c.
Embrióosztás
Tetra – embrióosztás, 2000
EMBRIÓFELEZÉS
Hans Spemann „FANTASZTIKUS KÍSÉRLET” 1914 1935 Orvosi Nobel díj
a. a.
b. A.
b. B.
C.
Briggs and King (1952)
D. SEJTMAGÁTÜLTETÉS
A klónozás elsı szakasza
Enukleáció: a petesejt mag DNS eltávolítása
citoplaszt
Donor sejt injektálása a perivitellináris térbe
Sejt fúzió 2 kV/cm 2 x 16 microsec 0.28M Mannitol solution wo Ca ion
donorsejt
citoplaszt
DOGMA
Sejtmag-átültetés
ET
Embrionális sejt
A klónozás második szakasza
1984 – Élı bárány embrionális sejtbıl 1986 – Korai embriósejtekbıl szarvasmarha 1993 – Tenyésztett embrionális sejtekbıl szarvasmarha utódok
Megan 5LL2 és Morag 5LL5
1995 –Megan & Morag, tenyésztett embrionális sejtekbıl (Roslin Intézet) 1996 –Dolly – testi sejtbıl (emlısejt tenyészet) klónozva 1997 – Transzgénikus testi sejtbıl klónozott juh Polly
Dolly
http://www.cnn.com/2001/WORLD/europe/08/06/clone.critics/index.html
Ian Wilmuth
Bill Ritchie
Keith Campbell
Lamb 6LL3
Dolly
Bonnie
1996
2003
A klónozás harmadik szakasza
Yanagimachi
Wakayama
Cumulina, 1998 Hawai, Japan
Transzgénikus klónozott állatok elıállítása
A.
B. DNS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Klónozott állatok elıállításának módszerei Embrió felezés (+ 40-70% utód) Korai embriók több részre bontása Sejtmagátültetéses klónozás Embriókból (több lépcsıben, < 25 utód) Sejtvonalakból Embrió-eredető Magzati Felnıtt
Minden állat egyenlı, de vannak akik egyenlıbbek
A klónozás elınyei 1. •Értékes állatok gyors elszaporítása •A genetikai elırehaladás gyorsítása •Klónozott hímek természetes szaporításhoz •Heterózis tenyésztés lehetısége •Termelı csoportok gyors elıállítása •Szabványos termékek •Veszélyeztetett fajok/fajták megmentése
A klónozás elınyei 2. Kutatási célokra Genetikailag megegyezı egyedek kísérleti célokra (immunológia, takarmányozás, tenyészérték becsléshez…) A maganyag újraprogramozásának alapkutatása
Labor- és haszonállatok genetikai módosítása Transzgénikus állatok elıállítása és elszaporítása Génkiütéses módszerek
A klónozáshoz gyakorlati sikerét biztosító szaporodásbiológiai módszerek In vitro petesejt érlelés In vitro embrió-elıállítás Embrió mélyhőtés Petesejt mélyhőtés Embrió beültetés A vemhesség és az újszülöttek nyomon követése
Alapvetı klónozási problémák Alacsony hatékonyság sejtvonalak és típus
Alapvetı klónozási problémák Alacsony hatékonyság sejtvonalak és típus
Magzati/újszülött rendellenességek genetikai okok, X-kromoszóma inaktiválódás rendellenességei,metilációs változások, rendellenességek viszonya
A klónozott állatok fejlıdési problémái •
Nagy újszülöttek
•
Légzési problémák
•
Placenta problémák
•
Magzati rendellenességek:
máj megnagyobbodás epidermiszben vérzések egyéb elváltozások
Klónok fejlıdési vesztesége
Yanagimachi, R. 2002. "Cloning: experience from the mouse and other animals." Molecular and Cellular Endocrinology. 21 March, 187.
Alapvetı klónozási problémák Alacsony hatékonyság sejtvonalak és típus
Magzati/újszülött rendellenességek genetikai okok, X-kromoszóma inaktiválódás rendellenességei,
metilációs változások, rendellenességek viszonya
Kivitelezése bonyolult
kémiai mageltávolítás, sejt injektálás, vagy fúzió
A genetikai újraprogramozás folyamatának
megértése
George and Charlie, 1998, USA
ACT klónok, USA
21 éves bika
Second Chance, 1999
Japán, 1998 - 2001
Kamitakafuku, 21 éves bika
Saburo
Sho-zaburo
Klónozás klónozott állatból
1998
Cumulina
F1
F2
Az elsı klónozott egér utódgenerációi
Yangyang, 2000 Kecskeklón, Kína
Tetra – embrióosztás, 2000
ES klónok
CC – CopyCat (carbon copy)
Rainbow
CC
Genetic Savings & Clone – 2006-ig üzemelı klónozó cég A világ elsı klónozott macskája – CC - 2001 A világ elsı kereskedelmi célból klónozott háziállata – Little Nicky, 2004 – 50000 USD
Veszélyeztett faj modell
Jazz Afrikai vadmacska Mélyhőtött embrió, Házimacska recipiens
Ditteaux, 2003 Klónozott vadmacska USA
Snuppy Dél Korea, USA 2005
Idaho Gem, öszvér 2003, USA http://www.uidaho.edu/cloning/
http://www.cvm.tamu.edu/news/releases/2003/deer_clone.shtml
Dewey, 2003 USA
Ralph, 2003
Prometea, 2003 Lóklón, Olaszország
2002, kumuluszsejtekbıl klónozott nyúl (Franciaország)
2007, fibroblasztsejtekbıl klónozott nyúl (Kína)
Klónozott sertések
Japán
2000. márc. 5 - 15 USA, UK
Elsı transzgénikus klónozott sertés, USA
Magyar klónozott állatok Dr. Dinnyés András kutatócsoportja, MBK
Kumuluszsejtekbıl klónozott állatok Klonilla – B6D2 F1 klónegér 2006
Tapsilla –HyCole klónnyúl 2007
NT utódok
Nagy placenta Akit nem fogadtak el 2006. okt.26.
Akit igen Klonilla 2006. november 6, 18:30 PM
Klónozás különbözı fajokban blasztomer
Juh Szarvasmarha Egér Kecske Sertés Nyúl Gaur, muflon Macska Majom Kutya Patkány
+ + + + + + + -
testi sejt
+ + + + + + + + + +
Egyformák-e a klónok? Fenotípus: genotípus + környezeti tényezık Genotípusos eltérések okai:
Genetikai változások a sejttenyésztés során (ESsejtekben!) Mitokondriális DNS Sejtmag újraprogramozása: epigenetikus változások X-kromoszóma inaktiválódás Környezeti eltérések:
A petesejt citoplazma A befogadó méh A születés utáni környezet
A klónozás várható alkalmazásai Humán orvosi célú állat klónozás Összehasonlító állat kísérletek – funkcionális genomika Emberi betegségek állatmodelljei atherosclerosis, neurodegenerativ, mitochondriális, cisztás fibrózis Gyógyszer elıállítás – tejben,vérben Gyógyszer tesztek Xenotranszplantáció
Xenotranszplantáció: állati szervek emberi beültetésre
Sejtfelszíni antigének megváltoztatása: a xenograft ellen nem alakul ki hiperakut immunválasz
Klónozás humán terápiás célból
A klónozás várható alkalmazásai Humán orvosi célú állat klónozás Összehasonlító állat kísérletek – funkcionális genomika Emberi betegségek állatmodelljei atherosclerosis, neurodegenerativ, mitochondriális, cisztás fibrózis
Gyógyszer elıállítás – tejben,vérben Gyógyszer tesztek Xenotranszplantáció Gyógyhatású táplálékok
Állategészségügyi Betegség rezisztencia Homogén vakcinázás
Állati termékek mennyiségi és minıségi javítása
KLÓNOZÁS
REPRODUKTÍV
TERÁPIÁS
HUMÁN TERÁPIÁS KLÓNOZÁS
http://easyweb.easynet.co.uk/~sfl/rlb3a.jpg
İssejtek elıállítása klónozással
Enukleáció CZB-Hepes + CB
FIBROBLASZT
CITOPLASZT
ES --- HM1 Sejt „ragasztás” PHA in CZB-Hepes PVA
Sejt fúzió 2 kV/cm 2 x 16 microsec 0.28M Mannitol solution wo Ca ion
Embrió tenyésztés - WOW CZB-IVC
110
97,82
98,00
90
82,74 74,09
70
63,28
50
30
16,29 10
-10
enukl%
constr%
fus%
NT lépések hatékonysága
act%
cl%
bl%
Fejlıdési adatok
Petesejt: B6D2 F1
Donorsejt: GFP+ B6D2 F1 ES GFP+ B6D2 F1 Fibro
ICM
GFP trg F1 ES sejtbıl klónozott blasztociszta
ES sejtvonal alapítása hólyagcsíra állapotú egérembriókból
Kontroll embrió
NT embrió
IMPLANTÁCIÓS IN VITRO MODELL
In vitro pluripotencia vizsgálat DAPI
AP
SSEA-1-Cy3
Oct-4-FITC
Teamwork!
Clonefactory
http://www.physics.ohio-state.edu/~wilkins/writing/Assign/topics/Cloning/cloning-nytmag2-4-01.html
http://www.rael.org/hungarian/ Akik igent mondanak a humán reproduktív klónozásra 1.
Antinori
2004-2005 – az elsı klónozott emberi embriók UK, Dél Korea Akik igent mondanak a humán reproduktív klónozásra 2.
Boba Fetts Lama Su
http://www.sl.kvl.dk/cloninginpublic/ http://robby.nstemp.com/index.html http://www.crystalinks.com/cloning.html
Az elıadás részben támaszkodott dr. Dinnyés András és Dr. Bodó Szilárd MSc és PhD kurzusainak anyagára
