Miért hasznos az enzimgátlások tanulmányozása? • Metabolikus utak, szabályozó mechanizmusok feltárása pl az enzimaktivitás szabályozása természetes inhibítorokon keresztül valósulhat pl. meg • Következtethetünk az enzim működés mechanizmusára
pl milyen kölcsönhatást alakít ki a szubsztráttal pl. szubsztráttal, aktív centrum topológia A gyógyszerek nagy része enzim inhibítor gyógyszeriparban a „drog tervezés” alapja az enzim kinetikai jellemzése és háromdimenziós szerkezetének meghatározása (Röntgen krisztallográfia; ligandg enzim komplex p kölcsönhatásának vizsgálata) g ) - specifikus, p nagy gy affinitású enzim inhibítorok tervezése •Penicillin, Ampicillin, irreverzibilis inhibítorok baktérium sejtfalszintézisét gátolják •Methotrexate: tumor ellenes szer DNS metabolizmust gátolja aktívan növekedő sejtben Jövő: enzimterápia - specifikus vivőrendszerrel az enzimet a beteg sejthez juttatják juttatják, ahol a megfelelő nem toxikus prodrogot az enzim aktivál, a felszabadult drog a beteg szövetben fejtheti ki hatását
Enzimreakciók jellemzői •Enyhe körülmények között játszódnak le pl. állandó nyomáson, szűk hőmérséklet intervallumban, jellemző pH tartományban •Nincsen melléktermék • Jól szabályozhatók pH; ionerősség; kis molekulákkal gátolhatók ill. aktiválhatók • a reakció sebességét a nem katalizált reakcióhoz képest 106-1012-szeresére is megnövelhetik •Gyakran használnak kofaktorokat, koenzimeket, prosztetikus csoportokat (NAD+; átmeneti fémek, flavin) •Nagy fokú szubsztrátspecificitás
Termodinamika I. főtétele: zárt rendszerben azok a változások mehetnek végbe, amelyekben az rendszer belső energiája állandó marad, azaz ∆U=0. (energia megmaradás elve ∆U= ∆H ∆U ∆H+ ∆W W=pV
biológiai rendszerben végbemenő folyamatok állandó térfogaton és nyomán zajlanak :
∆W=0
Termodinamika II. főtétele az S, entrópia segítségével megadja az I főtétel által megengedett spontán I. spontán, önként végbemenő változások irányát. Zárt rendszer entrópiája valamely spontán spontán, önként lejátszódó folyamatban nő: ΔS > 0 ΔS= Q/T
R. Clausius (1864)
Zárt rendszerben a belső energia változásának csak egy része alakítható hasznos munkává – Gibbs féle szabadenergia (G)
Energia átalakulás Termodinamika I főtétele I.
Energia átalakulás Hasznos munkára fordítható energia g
Termodinamika II. főtétele
Hasznos munkára nem fordítható energia
Energia átalakulások
Hasznos munkára nem fordítható energia
SzabadSzabad energia Spontán folyamatok y iránya y -entrópia növekedés
A különbözõ energiafajták átalakulásakor végső soron termikus energiává „degradálódnak” degradálódnak” (diss (disszipáció). ipáció)
Gibbs-féle SZABADENERGIA (G) A két fõtétel egyesítése; Gibbs Gibbs-féle féle szabadenergia (P és T konst konst.)) változása az a maximális energia, ami hasznos munkára fordítható. Δ G = Δ H – TΔ S
(J.W. Gibbs, 1878)
Δ G < 0 exergonikus Szabadenergia befektetés szükséges : Δ G > 0 endergonikus Termodinamikai egyensúly: Δ G=0
• Önként lejátszódó folyamat: •
•
csak a rendszerre vonatkozik •
Mivel a szabadenergia állapotfüggvény, a változását csak a végállapot (a termékek szabadenergiájának összege) és a kezdeti állapot (a kiindulási anyagok y g szabadenergiájának g j összege) g ) szabja j meg, g, azaz független gg az átalakulás tényleges molekuláris mechanizmusától.
•
A ΔG G nem ad d információt i f á iót a reakciók k iók sebességérõl, b é é õl amit it a tõle tõl teljesen független aktivációs szabadenergia szab meg (ΔG‡).
A reakciók kinetikai és termodinamikai kontrollja Termodinamika II. II főtéle leírja a reakciók spontán irányát - termotermo dinamika kontroll Δ G = Δ H – TΔ S • Önként lejátszódó folyamat:
ΔG<0
exergonikus
:
Kinetikai kontroll (ΔG‡ ): az átmeneti állapot (a reakció folyamán f llé ő legmagasabb fellépő l bb energia i áll állapot) t) szabad b d energiája iáj a meghatáh tá rozó – ΔG‡,: aktiválási szabad energia Enzimreakciókban a ΔG‡,(aktiválási szabad energia) csökken, a nem katalizált reakcióhoz képestc
Enzimreakciókban a ΔG‡,(aktiválási szabadenergia) csökken Nem katalizált Ebben a mértékmérték ben csökkenti az enzim az aktiválási energiát
Enzimmel
Kinetikai kontroll (ΔG‡ ): az átmeneti állapot szabad energiája – ΔG‡,: aktiválási szabad energia
Átmeneti állapot, a reakció folyamán legnagyobb energiájú állapot , aktiválási szabadenergiával jellemezhető ΔG‡, Enzim katalízis : az aktiválási szabad energia csökkentése Átmeneti állapot
(reakció előrehaladásának mértéke)
Hogyan gy csökkenti az enzim részvétele a szabad energiát? g Specifikusan megköti a szubsztrátot - enzim-szubsztrát komplex képzése •Szubsztrát kötődés megfelelő orientációban •A reaktánsok megfelelő távolságban tartása •A szubsztrát megfelelő kötésének fellazítása, hidrát burok megszüntetése
•Az átmeneti állapot stabilizálása
Acetil-CoA + oxálacetát → citrát
1. Az 1 enzim molekula orientálja és térbenmolecules közel viszi a reaktánsokat Enzymes orient substrate molecules, bringing (szubsztrátokat) és az őket körülvevő hidrátburkot megszünteti
together the atoms that will bond.
Reakció kinetika
Reakció sebesség
N Nem k katalizált t li ált reakció k ió
Kezdeti sebességg enzim koncentráció függése: lineáris
Enzim Katalizált reakció
Nem katalizált reakció
Kezdeti sebesség –szubszszubsz trát koncentráció függése hiperbola lefutású
Reakció ó sebess ség
Nulladrendű reakció
A régió:
B régió: Látszólagos elsőrendű reakció
Szubsztrát koncentráció A régió B régió
t (min)
konce entráció
k1 E+S
•
1. 2.
ES
E+S ES
k2
k-1
P+E
ES
k2
P+E
G Gyors előegyensúly lő úl
l lassú ú lépés lé é
Az enzimreakció sebességmeghatározó lépése
3. Az ES komplex keletkezésének és bomlásának sebessége megegyezik: STEADY-STATE S S feltétel e téte
d[ES]/dt = 0
dES/dt = k1[E] [S] – k-1 [ES] – k2 [ES] = 0 4.
Anyagmérleg: Eo = [E] + [ES]
k2[Eo] [S] V= (k-1 + k ) / k1 + [S] 2
V=
V=
[S] k2 [Eo]][S] KM + [S]
vmax KM
[S] + [S]
Michaelis –Menten egyenlet kinetikai állandói
•Michaelis Menten állandó: •Michaelis-Menten
KM = (k -11 + k2 )/ k1
dimenzió : M (μM)
Az a szubsztrátkoncentráció, ahol az enzimreakció sebessége vmax/2 Ha : k2
<< k -1
K M = KS
az enzim-szubsztrát komplex disszociációs állandója
•Katalitikus állandó /átviteli szám:
k2 = kcat
dimenzió : 1/min; 1/sec
Vmax = k2 [Eo]
Fiziológiás körülmények
Az enzim katalízis hatékonysága
k cat [Eo]][S] [S] V= KM +[S] 1.
Ha [S] >> KM
2. Ha [S] << KM
a sebesség megegyezik Vmax a sebesség sokkal kisebb mint kcat
k 2 [E ]][S] V= o [S] KM Specificitás állandó:
k2 KM
-fiziológiás körülmény
Dimesion: M-1s-1
Az enzim katalízis hatékonyágát jelIemzi
Az enzim katalízis hatékonyságát jelIemzi:
kcat/KM
Az enzim katalízis sebességének felső határa Specificitás állandó
k2 KM
=
k2 k1 k-11 + k2
k-1<
Az enzim katalízis sebességének felső határa az ES komplex képződésének maximális sebessége, amely diffúzió kontrollált : 108 – 109 M-1 s-1
Szénsav anhidráz 3-ketoszteroid izomeráz Laktát dehidrogenáz
600 000 1/s 280 000 1/s 1 000 1/s
Michaelis-Menten egyenlet linearizációja I.KETTŐS RECIPROK vagy LINEWEAVER-BURK ábrázolás:
1/ 1/v
Lineweaver-Burk egyenes
1 KM 1 1 = + v v max [ S ] v max 1/vMAX
-1/KM
tgα = KM / Vmax 1/[S] [ ] ordinátán való metszéspont: 1/Vmax abcisszán való metszéspont : -1/KM
Lineweaver-Burk-féle ábrázolás előnye/hátránya • Kettős reciprok ábrázolással szeparált változók (1/v és 1/S), az ábrázolás egyértelműen megmutatja különböző ü ö ö ő paraméterek é sebességre é ill. [S]-ra kifejtett hatását
• •
• Kis szubsztrát koncentrációhoz tartozó mérési hiba a kettős reciprok p ábrázolásnál, súlyánál nagyobb arányban jelenik meg •Jó indikátora a gátlások típusának megállapítására
••
Michaelis-Menten egyenlet linearizációja II. HANES-FÉLE ÁBRÁZOLÁS
[S] / V = KM / Vmax V + [S] / Vmax V
[S] /v
Hanes egyenes
tgα = 1 / Vmax •
• •
KM /vMAX
-KM
ordinátán való metszéspont: p KM / Vmax
•
abszciszán való metszéspont: -KM
[S]
Széles [S] tartományban hűen tükrözi a mért v értékeket !
Michaelis-Menten egyenlet linearizációja III EADIE-HOFSTEE III. EADIE HOFSTEE LINEARIZÁCIÓ: LINEARIZÁCIÓ
1/MM egyenlet mindkét oldalának szorzása vmax v
V= -(( KM V/ [[S]] ) + Vmax
tgα = - KM v/[S] v
vMAX /KM
vmax Eadie-Hofstee Eadie Hofstee egyenes
1 KM 1 1 = + v v max [ S ] v max
Sebesség mérés hibája mind a két tengelyen megjelenik és elhajlást okoz Jól tükrözi ha a Michaelis –Menten Menten kinetikától való eltérést
• • vMAX VV/[S]
MM egyenlet linearizációja – kinetikai paraméterek meghatározása Line-Weaver Burke kettős reciprok ábrázolás
1 1 KM 1 = + v Vmax Vmax S
1/v vs 1/S alacsony [S]-nál hiba
Eadie- Hofstee
v v = Vmax − K M S
v vs v/S Kisebb hiba alacsony [S]-nál
Hanes Wolf
S KM 1 = + S v Vmax Vmax
S/v versus S pontosabb Vmax
•Nem lineáris regresszió Számítógép segítségével nem-lineáris regressziós analízissel, iterációval állapítjuk meg a kísérleti eredményünket legjobban leíró függvény paramétereit. • V =f(S) hiperbola egyenlet alapján becsült KM ,Vmax kezdeti értékeknél megoldjuk . Az így képzett elméleti görbe eltérését a kísérleti adatoktól a legkisebb négyzetek módszerével állapítjuk meg. Addig változtatjuk KM ,Vmax értékét amíg az eltérés a kísérl ti adatoktól leti d t któl eléri lé i a minimumot. i i t V [M//s]
Model: Hyperbl
y = P1x / x +P2 vmax P1 P2
KM
2.65575 2 65575 0 16203 0.16203 372.21439 34.58494
SPECIFIKUS GÁTLÁSOK I.
REVERZIBILIS
II. IRREVERZIBILIS
vagy teljes gátlás
1. KOMPETITÍV 2. NEM-KOMPETITÍV 3. UNKOMPETITÍV 4. VEGYES TÍPUSÚ 5.Szubsztrát felesleg és termék gátlás
Kovalens módosítás Affinitás jelölés M h i Mechanizmus csapda d
I.1.Kompetitív p gátlás g •Az inhibítor és a szubsztrát verseng az aktív centrumhoz való kötődésért •Elegendően nagy szubsztrát koncentráció esetén a gátló anyag nem befolyásolja az enzim-szubsztrát komplex bomlásának sebességét -változatlan
Vmax érték •Látszólag a szubsztrát kötésének erőssége megváltozik, növekszik
KM értéke
a
Kompetitív p gátlás g
[I]
nő
S
E
+
k2
k1
ES
k-1
P+E
+
I KI
KOMPETITÍV GÁTLÁS
EI E+I EI
EI E+I
Inhibitor kontans : az EI komplex disszociációs állandója
[E] [I] = KI [EI] [EI] = [E] [I] / KI
Disszociációs állandó
KIf=1/KI KIf = [EI] / [E] [I]
EI kompex képződési (formációs) állandója
1. A STEADY-STATE FELTÉTEL:
S
E
+
k1 k-1
ES
I KI
Kompetitív gátlás
dES/dt = k1[E] [S] – k-1 [ES] – k2 [ES]
[ S ][ E ]
EI
KM II. ANYAGMÉRLEG: [Eo ]= [E] + [ES] + [EI]
[ E 0] = [ E ](1 +
[S ]
KM
P+E
+
d[ES]/dt = 0
[ ES ] =
k2
+
[I ]
[v ] =
KI
V =k2[ES]
vmax [S ] K M (1 +
I ) + [S ] KI
KM látszólagos növekedése, amely az [I] és KI függvénye : app
KM = KM (1+ [I] / KI)
Kompetitív gátlás- Lineweaver-Burk linearizáció: V= VMAX [S] / [KM(1+ [I] / KI) +S] 1/V=[K 1/V [KM(1+ [I] /KI )] / (Vmax [S]) + [S]/ Vmax [S]
1/V=(KM(1+ [I] / KI) / Vmax)• 1/ [S]) + 1/ Vmax [I]2
1/v
[I]1 [I]=0
tgα = KM(1+ [I] KI ) / Vmax
1/vMAX -1/KM
app
-1/KM
1/[S]
Kompetitív gátlás
Inhibítor konstans megállapítása 1.– kompetitív gátlás esetén
KMapp = KM+ (KM/ KI) [I]
KMapp
Meredekség= KM/ KI KM
[I]
Inhibítor konstans megállapítása 2.– kompetitív gátlás esetén Kompetitív gátlás
Dixon-féle ábrázolása [[S]=K ] M/2
1/v
[S]=KM [S]=2KM
1/vmax -K KiId
[I]
1/V=(KM(1+ [I] /KI) / Vmax)• 1/ [S]) + 1/ Vmax
Inhibítor konstans megállapítása 2.– kompetitív gátlás esetén Dixon-féle ábrázolás alapján 1/V=(KM(1+ [I] /KI) / Vmax)• 1/ [S]) + 1/ Vmax Két különböző szubsztrát koncentráció esetén a kezdeti sebesség reciproka vs Inhibítor koncentráció függvény a maximális sebességnél metszi egymást
1/vMAX + (1+[I] /KI)KM /vMAX) •1/[S]1 = 1/vMAX + (1+[I] /KI)KM /vMAX) •1/[S]2
(1+[I]/KI) / [S]1=(1+[I]/KI) / [S]2 Akk iigaz h Akkor ha:
1+[I] /KI=0
[I]= -KI
Példák Kompetitív inhibítorra - 1. Methotrexate (Pirimidin Bioszintézisben dihidrofolát reduktáz gátló)
vagy aminopterin
Dihidrofolát szerkezeti analógja a methotrexate, amely 1000-szer erősebben kötődik a dihidrofolát reduktázhoz mint fiziológiás szubsztrátja
Dihid f lát reduktáz Dihidrofolát d ktá katalizált k t li ált reakció k ió
Kompetitív inhibítor 2.: malonát (Citrát ciklusban szukcinát dehidrogenázt gátló) FAD+
FADH, H+
No Reaction
Unkompetitív Inhibíció •Inhibítornak és szubsztrátnak eltérő a szerkezete •Inhibítor I hibít nem az aktív ktí centrumhoz t h kötődik •A szubsztrát kötődése konformációs változást indukál ezáltal az inhibítor képes kötődni az ES komplexhez •Az inhibítor kötődése meggátolja a termékképződést •Nagyobb mennyiségű szubsztrátum nem ellensúlyozza a gátlást
Unkompetitív Gátlás Inhibítornak és szubsztrátnak eltérő a szerkezete Inhibítor nem az aktív centrumhoz kötődik A szubsztrát kötődése k f konformációs á ió változást ált á t iindukál d kál ezáltal az inhibítor kötődni képes az ES komplexhez Az inhibítor kötődés meggátolja a termékkeletkezést Nagyobb mennyiségű szubsztrátum nem ellensúlyozza a gátlást
animáció
UNKOMPETITÍV GÁTLÁS S
+
E
k1 k-1
k2
ES
P+E
+ I KI
EIS
Inhibítor jelenlétében csökken VMAX értéke és látszólag csökken Km is
?
Unkompetitív gátlás
1/V [I]3
[I]2 [I]1=0
app 1/Km 1/Km
1/[S] [ ]
UNKOMPETITÍV GÁTLÁS 1. ANYAGMÉRLEG É
E+S
Ks
+ I
[Eo ]= [E] + [EIS] + [ES] [E]o = [ES] (1+ [I] / KI )+ [E] 2. Ks = KM =
[E][S] [E][S] ⇒ [ES] = [KM] [ES]
k2
ES
P+E
KI
EIS
v=(k2 [E]o [S] ) / ((1+ [I] / KI) [S]+ KM
vmax [S]
V=
(1+[I] / KI)
KM + [S] 1+[I] / KI
app
Vmax = Vmax/ (1+[I]/ (1 [I]/ KI)
app
KM
látszólag csökken = KM / (1+ (1 [I]/ KI)
( ) (1) (2) (3) (4)
Visszahelyettesítés (2)-es maid az (1)-es egyenletbe
Unkompetitív gátlás – Kettős reciprok ábrázolás 1/V [I]3
[I]2 [I]1
1/[S]
Meredekség nem változik
Unkompetitív Dihidrofolát reduktázNADP+ kötődés NADP
Dihidrofolát reduktázNADP+ kötődés
Inhibitor kötődése az ES komplexhez meghatározott sorrendben történik pl. termékgátlás több szubsztrátos rendszerek esetén
Herbicid glifozát „Roundup”: N-foszfonmetilglicin U k Unkompetitív tití inhibítora i hibít az 1-karboxiviniltranszferáz 1 k b i i ilt f á enzimnek i k 1 karboxiviniltranszferáz enzim két szubsztrátja :3-foszfosikimát 1-karboxiviniltranszferáz :3 foszfosikimát és foszfoenolpiruvá
Unkompetitív inhibítor: a szabad enzimhez nem kötődik csak a 3-foszfosikimát-Enzim Komplexhez, versenyezve a foszfoenolpiruváttal
Aromás aminosavak szintézise növényekben
1-karboxiviniltranszferáz
‘Roundup’ glifozát gátlás
N-foszfonometilglicin
Nem-kompetitív gátlás •Az Inhibítor kötődhet a szabad enzimhez és a szubsztrát kötött enzimhez is is, a kötődés véletlenszerű •Sem az inhibítor sem a szubsztrát nem gátolja g j meg a másik kötődését
•Az A enzim-inhibítor i i hibít é és enzim-szubsztrát-inhibítor i b t át i hibít komplexből termék nem képződik úgynevezett „„dead-end komplex” p
Nem-kompetitív
S
+
E
k1
inhibíció
k2
ES
P+E
k-1
+ I
+ I
KI
EI
KI
EIS
EI és EIS komplexek disszociációs állandója egyenlő
Nem-kompetitív p gátlás g
Inhibitor kötődése nem meghatározott sorrendben történik az E-hez és ES komplexhez (random)
VEGYES GÁTLÁS speciális esete a Nem-kompetitív p gátlás g S
+
E
k1 k-1
k2
ES S + I
+ I
KI
P+E
KI
EI
EIS
Ha KIEI = KIEIS : nem-kompetitív gátlásról beszélünk Vmax értéke csökken csökken, míg Km értéke nem változik
H KIEI = KIEIS : vegyes gátlás Ha átlá
Nem-kompetitív gátlás Ks
k2
1/VMAX = y tengelymetszet -1/KM
KM/VMAX= meredekség
V=
[VMAX /(1+ [I] / KI )]• [S] [S] +KM
Az inhibítor azonos affinitással kötődik az enzimhez és az enzimszubsztrát komplexhez, mindkét esetben keletkező EI és ESI komplex inhibítor állandója azonos (KI) ;
KM Vmax értéke csökken, míg Km értéke nem változik
Nem-kompetitív p inhibítorok Kis molekulák esetén valósul meg pl. protonálódás, fém kötődés (részben irreverzibilis)
• Fluorid – Enoláz inhibítora
• α-glükóz - invertáz i tá • Doxycycline
– Kollagenáz inhibítora
A metabolit fluxus az enzim állandó aktivitását tartja fenn fenn, enzim aktivitás a B pontban
Az enzim a metabolikus út közepén- hogyan gátol egy inhibítor
Különböző gátlás típusok
Gátlás típusok összefoglalása – 1. Kompetitív
Unkompetitív
Nem-kompetitív (vegyes gátlás speciális esete
Gátlás típusok kettős reciprok ábrázolása
kompetitív
Nem-kompetitív
unkompetitív
Reverzibilis gátlás
Teljes gátlás vagy lineáris gátlás app
1 app Vmax
KM app Vmax
[I] Kompetitív vagy specifikus gátlás app
app
KM
Vmax = Vmax
app
[I]
Nem változik
Vmax
U k Unkompetitív tití vagy k katalitikus t litik gátlás átlá app
KM
app
Nem változik
Vmax
Vegyes gátlás app
KM
app
Vmax
app
Vmax
Tiszta nem-kompetitív gátlás app
Vmax
app
Vmax
app
Nem változik KM = KM
Gátlás típusa
app
VMAX
app
KM
kompetitív
VMAX
KM (1+ [I]/ KEI)
Nem-kompetitív
VMAX /(1+ [I] /KEI)
KM
unkompetitív
VMAX /(1+ [I] / KESI)
KM /(1+ [I] /KESI )
vegyes
VMAX /(1+[I] /KESI)
KM (1+ [I] /KEI) (1+ [I] / KESI)
Szubsztrát felesleg g gátlás g Esetei:
1.Ha az enzimreakcióhoz az szükséges, hogy a szubsztrát két vagy több csoportjával kötődjön az Aktív centrumhoz; akkor nagy [S]-nál [S] nál előfordulhat, előfordulhat hogy nem ugyanazon molekula kötődik több Csoportján keresztül, hanem egy új S molekula csoportja létesíti a hiányzó kötéseket
2. Nagy [S]-nál a szubsztrát nemcsak az aktív centrumhoz, hanem „nem-kompetitív” módon más Helyhez is kötődik
3. Ha az enzim aktivátor jelenlétében működik, és a szubsztrát komplexet képez az aktivátorral, ezált l kivonja által ki j az aktivátort kti át t az enzim i ffelületéről lül té ől
4 Nagy [S] ionerősség növekedést okoz, 4. okoz amellyel aspecifikusan gátolhatja az enzimet
Unkompetitív gátláshoz hasonló: nincsen EI komplex
Szubsztrát felesleg gátlás Pl Pl.: k1 S+E
SE + S
k2 P +E KSI
SES
v= k2EoS / (KM + S + S2/KSI )
-1/Ks 1/Ks
1/KI
Subsztrát felesleg Gátlás v= k2EoS / (KM + S + S2/KSI ) • Alacsony szubsztrát koncentráció S2/KS1 << 1 a gátlást nem észleljük
vmax S v= KM + S • Nagy szubsztrát koncentráció KM/S << 1 erős gátlás
v=
vmax ⎛ S ⎞ ⎜⎜1 + ⎟⎟ ⎝ K S1 ⎠
