Univerzita Palackého v Olomouci Přírodovědecká fakulta Katedra buněčné biologie a genetiky
microRNA a jejich význam v sepsi Bakalářská práce
Terezie Macková Studijní program: Biologie Studijní obor: Molekulární a buněčná biologie Forma studia: Prezenční Vedoucí práce: doc. Ing. Bc. Igor Šplíchal, CSc. Olomouc 2014
Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením doc. Ing. Bc. Igora Šplíchala, CSc. v průběhu bakalářského studia. Všechny použité literární zdroje jsou v práci řádně citovány. Tato práce nebyla použita pro získání jiného nebo stejného titulu. V Olomouci, dne 6. 5. 2014 Podpis:
Děkuji doc. Ing. Bc. Igoru Šplíchalovi, CSc. za možnost vypracování bakalářské práce na téma, které mne velmi zajímalo, za cenné odborné rady a připomínky, za obětavou pomoc
a
čas,
který
mi
při
tvorbě
této
práce
věnoval.
Dále
děkuji
MUDr. Alle Šplíchalové, Ph.D. za rady při laboratorní práci a všem pracovníkům Mikrobiologického ústavu AV ČR, v.v.i. za podporu a přátelské jednání. Tato práce byla vypracována v rámci výzkumného záměru Mikrobiologického ústavu AV ČR, v.v.i. RVO: 61388971 a za podpory grantů Grantové agentury České republiky, granty 524-09-0365, 13-14736S a 13-08803S.
Souhrn microRNA jsou krátké jednovláknové molekuly RNA, které hrají zásadní roli v regulaci genové exprese, díky čemuž se podílí na důležitých procesech, jako je ontogenetický vývoj, růst, umlčování genů, imunita a vznik nádorů. Jsou stabilnější než molekuly mRNA a lze je získat z tělních tekutin, v nichž cirkulují. To je činí zajímavými molekulami pro další studium, neboť jejich vlastnosti slibují využití těchto molekul jako neinvazivní biomarkery různých nádorových onemocnění a patologických stavů. Mezi takové patologické stavy patří i sepse - systémová zánětlivá odpověď na infekční podnět. Její nebezpečí spočívá především v tom, že je pro správnou léčbu nutná včasná a přesná diagnostika, která dnes stále ještě není úplně vyvinuta. Bylo zjištěno, že hodnoty exprese určitých molekul microRNA při sepsi jsou odlišné od hodnot u zdravých lidí a že se tyto hodnoty mohou lišit i mezi různě závažnými stádii sepse. Pro studium hodnot exprese vybraných molekul microRNA při sepsi byl v této práci z důvodu blízké fyziologické a morfologické příbuznosti s člověkem použit prasečí gnotobiotický model. Na základě dostupné odborné literatury byly vybrány dvě microRNA, jejichž hodnota exprese by se při sepsi měla měnit (hsa-mir-182-5p, hsa-mir-150-5p) a jedna microRNA, která by ve vybraných vzorcích měla sloužit jako referenční gen (hsa-mir-192). Hodnoty exprese vybraných microRNA byly stanoveny u tří skupin selat – konvenčních, bezmikrobních a septických, u všech skupin byly tyto hodnoty sledovány v jaterní tkáni a plazmě. Byla zvolena vhodná metoda izolace a detekce microRNA z jaterní tkáně a plazmy selat. Statistickými programy bylo provedeno zhodnocení rozdílů v hodnotách exprese sledovaných microRNA mezi jednotlivými skupinami.
Summary microRNAs are small single-stranded RNA molecules that play key role in regulation of gene expressions. They take part in important processes such as ontogenesis, growth, gene silencing, immunity and tumorigenesis. They are more stable than mRNA molecules and they can be obtained from body fluids. That makes them important molecules for further study because their characteristics promise use of these molecules as non-invasive biomarkers for different kinds of cancer and pathological stages. Such pathological stages include sepsis – systemic inflammatory response syndrome caused by infection. The danger of sepsis consists in the fact that for the correct therapy of sepsis is need for timely and proper diagnostics. However, the diagnostic methods have not been fully developed yet. It was found that expression profiles of some microRNA molecules vary between septic patients and healthy people. The expression profiles also vary among different stages of sepsis. A pig gnotobiotic model was used for a study of expression profiles of selected microRNA due to closed physiological and morphological similarity of the pig to the human. Based on the available literature two microRNAs which expression profiles should be changed in sepsis (hsa-mir-182-5p, hsa-mir-150-5p) and one microRNA which should be used as reference gene (hsa-mir-192) were chosen. Expression profiles of selected microRNAs were measured in three groups of piglets – convetional, germ-free and septic piglets. In these groups expression profiles were measured in liver tissue and plasma. The differences in expression profiles between the groups were carried out by statistical evaluation.
Obsah 1. Úvod..................................................................................................................... 8 2. Cíle práce........................................................................................................... 10 3. Literární přehled ................................................................................................. 11 3.1
microRNA ....................................................................................................... 11
3.2
Objev microRNA ............................................................................................. 11
3.3
Biogeneze microRNA ..................................................................................... 12
3.4
Mechanismy microRNA regulace .................................................................... 13
3.5
Izolace microRNA ........................................................................................... 14
3.6
Stabilita microRNA ve vzorcích ....................................................................... 14
3.7
Detekce microRNA ......................................................................................... 15
3.7.1
Northern blot analýza .................................................................................. 16
3.7.2
microRNA microarrays ................................................................................ 16
3.7.3
RT-PCR ....................................................................................................... 17
3.7.3.1 RT-qPCR systém firmy Exiqon .................................................................... 20 3.7.3.2 RT-qPCR systém firmy Qiagen ................................................................... 22 3.7.3.3 RT-qPCR systém firmy Life Technologies ................................................... 23 3.8
Sepse ............................................................................................................. 24
3.8.1
Biomarkery .................................................................................................. 25
3.8.2
MicroRNA a sepse....................................................................................... 26
3.9
Gnotobiotický prasečí model........................................................................... 27
4. Materiál a metody............................................................................................... 29 4.1
Materiál ........................................................................................................... 29
4.2
Metody ............................................................................................................ 29
4.2.1
Izolace microRNA ........................................................................................ 29
4.2.2
Stanovení koncentrace nukleových kyselin ................................................. 33
4.2.3
Reverzní transkripce.................................................................................... 36
4.2.4
Real-time PCR............................................................................................. 37
4.2.5
Křivka tání ................................................................................................... 39
4.3
Použitý software ............................................................................................. 39
4.4
Použité přístroje .............................................................................................. 40
4.5
Použité chemikálie a roztoky .......................................................................... 41
5. Výsledky............................................................................................................. 43 6. Diskuze .............................................................................................................. 49 7. Závěr .................................................................................................................. 53 8. Seznam použitých zkratek ................................................................................. 55 9. Použitá literatura ................................................................................................ 56
1. Úvod V dějinách snad každého odvětví lidského počínání se vždy objeví okamžik, kdy se zdá, že lidstvo dosáhlo vrcholu vědění, které již nemá kam se rozvíjet. A tak stejně jako ve století páry, kdy se zdála na vrcholu technika, mohla takový dojem budit i doba, kdy vědci rozluštili záhadu čím a jak je kódována genetická informace a kdy byl vyvinut způsob sekvenace genomů nejrůznějších organismů. Vypadalo to, že nyní již budeme přesně rozumět dědičnosti znaků a předpovídat podobu potomků. Ale stejně jako vždy i zde se ukázalo, že ne vše je tak prosté, jak se jeví. Objevily se různé epigenetické způsoby regulace exprese genů, ukázalo se také, že velikost genomu nesouvisí se složitostí organismu. Poté došlo k objevu, kterému nikdo v té době nevěnoval zásadní pozornost, avšak časem bylo zjištěno, že molekuly microRNA, které objevili roku 1993 při své práci na hlístici Caenorhabditis Elegans Victor Ambros se svými kolegy, mají zásadní význam v regulaci genové exprese. Následně bylo zjištěno, že se nevyskytují pouze u červů, ale že je nalezneme napříč všemi druhy rostlin i živočichů, často ve velmi konzervované podobě. To odstartovalo novou vlnu honby za poznáním, která při úspěchu slibovala nejen objasnění další záhady, ale i širokou škálu aplikací těchto nově objevených „trpaslíků“. MicroRNA jsou 20 – 25 nukleotidů dlouhé jednovláknové molekuly RNA, které hrají důležitou roli v RNA interferenci a regulaci exprese genů. Dnes předpokládáme, že je jimi regulováno více než 30% lidského genomu. Proto jim byla věnována velká pozornost, díky čemuž již víme, že hrají důležitou roli při vzniku a regulaci nádorových onemocnění, diabetu, srdečních chorob, řízení ontogenetického vývoje, atd. Díky tomu lze předpokládat, že je v budoucnu budeme moci používat jako biomarkery či jako terapeutické nástroje. Sepse je systémová zánětlivá odpověď na infekční podnět. Vážnost tohoto stavu spočívá především v tom, že jej často nelze správně včas diagnostikovat. Přitom nasazení včasné a správné léčby hraje v tomto případě zásadní roli. Důležité je především odlišit sepsi od systémové zánětlivé odpovědi vyvolané jiným podnětem než infekčním. V současné dobé jsou jako markery sepse obvykle
8
používány zánětlivé mediátory, které jsou uvolňovány po průniku infekčního agens do hostitelského organismu. Často je však stále pro diagnostiku sepse nutno používat kombinaci více těchto markerů společně se sledováním vnějších příznaků. Proto je v tomto oboru stále vyvíjena další snaha o nalezení markeru, který by byl jednoduše stanovitelný a sám o sobě měl vysokou vypovídající hodnotu. Bylo zjištěno, že hladina určitých molekul microRNA se v průběhu sepse mění. Znalost těchto molekul a možnost jejich izolace z tělních tekutin jako je například krev, by mohla dopomoci k vyvinutí neinvazivní a včasné metody pro diagnostiku sepse, čímž by byla zásadně zvýšena šance na úspěšnou léčbu tohoto stavu.
9
2. Cíle práce 1. Vypracování rešerše na téma bakalářské práce. 2. Výběr vhodné metody izolace a detekce microRNA z tkání a plazmy bezmikrobních, konvenčních a septických selat. 3. Dle dostupné literatury výběr microRNA, jejichž hodnota se při sepsi u člověka mění, stanovení odpovídajících microRNA ze vzorků jater a plazmy bezmikrobních, konvenčních a septických selat. 4. Porovnání rozdílů v hodnotách exprese vybraných microRNA mezi septickými a zdravými selaty.
10
3. Literární přehled
3.1 microRNA microRNA jsou endogenní, 20 - 25 nukleotidů dlouhé jednovláknové molekuly RNA. Některé jsou fylogeneticky vysoce konzervované (Lagos-Quintana et al., 2001). Vyskytují se jak v živočišných, tak v rostlinných buňkách a hrají důležitou roli v regulaci genové exprese. Tato regulace probíhá na post-transkripční úrovni. Dochází zde k potlačení translace, jelikož se microRNA váží na molekuly mRNA (Bartel,
2009). microRNA působí při vývoji
organismu, z čehož vyplývá, že se některé objevují jen v určitých vývojových stádiích. Mnoho microRNA také vykazuje tkáňovou specifitu (Ambros, 2001). Předpokládá se, že geny kódující microRNA zabírají 1-5 % lidského genomu a regulují expresi nejméně 30% genů kódujících proteiny (Macfarlane
a
Murphy, 2010). Z toho, že microRNA hrají důležitou roli v řadě biologických a patologických procesů, je zřejmé, že změna exprese microRNA je spojená s množstvím onemocnění. To činí microRNA zajímavými molekulami, které by mohly sloužit jako biomarkery. Dalším důvodem proč jsou microRNA vhodnými kandidáty na biomarkery je to, že nepodléhají degradaci tak rychle jako např. mRNA. Ukazuje se, že microRNA v séru či plazmě jsou stabilní až 48 hodin při pokojové teplotě a že je nepoškozuje ani opakované zmražování a rozmražování. (Andreasen et al., 2010; Blondal et al., 2012).
3.2 Objev microRNA První zmínky o microRNA pochází z 90. let minulého století ze studie skupiny amerických vědců z Harvardovy univerzity. Ve své práci se zabývali studiem genů lin-4 a lin-14 při larválním vývoji hlístice Caenorhabditis elegans. Zjistili, že se průběhu prvního larválního stádia u Caenorhabditis elegans objevují dva malé RNA transkripty genu lin-4, dlouhé 22 a 61 nt, které nekódují žádný protein, ale místo toho obsahují sekvence komplementární k opakovaným sekvencím 3´ nepřekládané oblasti (3´-UTR) mRNA genu lin-14, z čehož se dá usuzovat, že lin-4 reguluje translaci lin-14 cestou RNA-RNA interakce (Lee et al., 1993). 11
Po několikaleté odmlce byla objevena microRNA let-7. Bylo zjištěno, že se podílí na kontrole průběhu vývoje Nematodes tím, že se váže na 3´-UTR lin-14 mRNA, čímž inhibuje její translaci (Reinhart et al., 2000). Zpočátku se vědci domnívali, že se jedná pouze o bizardní mechanismus, který se vyskytuje pouze u hlístic. Tato domněnka přetrvávala až do doby, kdy byl roku 2000 v časopise Nature publikován článek, v němž bylo dokázáno, že let-7 má konzervovanou sekvenci napříč živočišnými druhy (Pasquinelli et al., 2000). To dalo studiu microRNA nový rozměr, který odstartoval množství dalších studií zabývajících se touto problematikou.
3.3 Biogeneze microRNA Biogeneze microRNA je složitý proces, jehož první část probíhá v jádře buňky a druhá v cytosolu, viz obrázek č. 1. microRNA mohou být kódovány jak v mimogenových oblastech (nejčastěji u rostlin), tak v intronech oblastí genových (spíše živočichové)(Rodriguez et al., 2004). Biogeneze začíná přepisem genu pro microRNA do dlouhých primárních transkriptů, tzv. pri-miRNA, které, stejně jako RNA kódující proteiny, mají na 5´ konci 7-methylguanosinovou čepičku a na 3´ konci polyadenylový řetězec a jsou nejčastěji produkovány RNA polymerázou II (Cai et al., 2004; Lee et al., 2004). Pri-miRNA
obsahují
smyčkovitých
jednu
struktur
a
či
více vytváří
tzv. stem-loop struktury, které se skládají z nedokonale spárované dvouvláknové stopky a terminální kličky (Cai et al., 2004;
Treiber et al., 2012).
Budoucí zralá microRNA je obsažena právě v dvouvláknové oblasti stopky (Treiber et al., 2012). Stem-loop struktura těchto smyček pri-miRNA je jedinečná, což ji odlišuje od ostatních jaderných RNA. Tuto unikátní strukturu je
12
schopen rozpoznat multiproteinový mikroprocesorový komplex, který obsahuje ribonukleázu Drosha (RNase III enzym) a RNA-vazebný protein DGCR8 (DiGeorge syndrome critical region gene 8). Drosha, jakožto RNase III enzym představuje katalytické centrum komplexu, zatímco DGCR8 na sebe váže bázi stem-loop struktury (Denli et al., 2004; Gregory et al., 2004; Lee et al., 2003). Drosha sestříhá pri-miRNA přibližně 11 bp od místa, které rozpoznal DGCR8 a dojde ke vzniku pre-miRNA, která má strukturu smyčky, na 3´konci má 2 nt přesah a je dlouhá přibližně 70 nt. Tyto procesy probíhají v jádře. Pre-miRNA je poté rozpoznána jaderným Eportinem 5 a je transportována do cytosolu, kde je dál upravována (Treiber et al., 2012). V cytosolu pre-miRNA díky přesahu na 3´konci rozpoznává PAZ doména enzymu Dicer, který patří do skupiny RNase III. Dicer sestříhá pre-miRNA poblíž terminální kličky a vytvoří miRNA-miRNA duplex, který má na obou 3´koncích dvounukleotidový přesah. Jedno z těchto vláken je následně začleněno do RISC (RNA-induced
silencing
complex),
druhé
je
uvolněno
a
degradováno
(Treiber et al., 2012).
3.4 Mechanismy microRNA regulace Molekuly microRNA regulují genovou expresi tím, že se komplementárně váží k cílové mRNA, poté dochází buď k inhibici translace a tím i syntézy proteinů nebo k degradaci mRNA přímým sestříháním. K tomu musí být zralá jednovláknová molekula microRNA začleněna do RNA-induced silencing komplexu (RISC) (Schwarz et al., 2003). V regulaci genové exprese molekulami microRNA u rostlin a živočichů se vyskytují určité rozdíly. Rostlinné microRNA se váží do sekvence cílové mRNA přesnou nebo téměř přesnou komplementaritou bází a tím řídí sestříhání či destrukci mRNA (Tang et al., 2003). Oproti tomu většina microRNA studovaných u zvířat nemusí být k mRNA přesně komplementární, zde stačí jen komplementarita částečná a syntézu proteinů inhibují tím, že jsou navázány na cílovou mRNA, čímž blokují její translaci (Ambros, 2004). Bylo také zjištěno, že jedna microRNA může u živočichů cílit na množství různých transkriptů.
13
MicroRNA povětšinou umlčují translaci, i když byly objeveny i takové, které ji naopak posilují. Často je však mechanismus aktivace nepřímý. Dochází například k potlačení exprese represoru určitého genu, vedoucí ke zvýšení exprese tohoto genu (Lee a Vasudevan, 2013).
3.5 Izolace microRNA Pro izolaci microRNA ze vzorku je již dnes vyvinuto velké množství způsobů. Některé metody vycházejí z toho, že je nejprve vyizolována celková RNA a z ní následně detekována pouze microRNA, jiné větší RNA ze vzorku oddělují a izolována je pouze kratší RNA. Čím dál častěji je izolace microRNA prováděna pomocí komerčně dostupných souprav pracujících na principu „spin column chromatography“. Tento způsob izolace je založen na použití dvou rozdílných kolon – v případě námi používaných souprav nazvaných - Large RNA Removal Column a microRNA Enrichment Column. Princip ve zkratce spočívá v tom, že je nejprve homogenizovaná tkáň či tělesná tekutina lyzována a supernatant lyzátu je umístěn na první kolonu. Tou mohou projít pouze molekuly velké podobně jako
Obrázek č. 2 – izolace microRNA, obrázek zkumavky s kolonou převzat z www.clker.com
microRNA. Roztok, který kolonou prošel je nanesen na další kolonu, která je schopna zachytit malé molekuly RNA. Ostatní molekuly jsou odstraněny několika promytími kolony. Následně je nanesen eluční roztok, díky němuž dojde k vymytí krátkých molekul RNA, viz obrázek č. 2. Výhodou použití komerčně dostupných souprav je snadnost a rychlost stanovení, nevýhodou pak je neznámé složení použitých roztoků a sorbentů kolon.
3.6 Stabilita microRNA ve vzorcích Při studiu molekul microRNA je důležité, za jakých podmínek mohou být skladovány, popř. jak moc jsou ve vzorku degradovány, aby při opakovaných testech byla jistota, že nejsou falešně negativní.
14
Skupinou brněnských vědců byla provedena studie stability skladované microRNA, kdy byla microRNA vyizolována z B lymfocytů klinických vzorků chronické lymfocytální leukemie trizol/TRI regentem s následnou alkoholovou precipitací. Ihned po izolaci byla provedena RT-qPCR (reverzní transkripce následovaná kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí) pro stanovení 29 microRNA přítomných ve vzorku. RT-qPCR byla opakována po 14 dnech skladování vzorků při – 80 °C a poté ještě několikrát v průběhu dalších 10 měsíců skladování. Z výsledků vyplynulo, že microRNA vyizolovaná trizol/TRI regentem a skladovaná při – 80 °C nevykazuje tendenci k degradaci v průběhu 10 měsíců skladování (Mraz et al., 2009). Podobně byl proveden i experiment, kdy byl k izolaci microRNA použit mirVana miRNA isolation kit. MicroRNA byla izolována ze zmražené myší mozkové a jaterní tkáně, poté byly vzorky rozděleny, část každého vzorku byla skladována při – 80 °C a část při – 20 °C. U vybraných microRNA (Let-7d, miR-16, miR-32, miR-335 a miR-451) ve vzorcích skladovaných při – 80 °C bylo následně stanoveno jejich množství po 1 hodině, 7 hodinách, 8 hodinách a 15 dnech. Bylo zjištěno, že se po tuto dobu nijak zásadně nemění. Po 15 dnech bylo porovnáno množství výše uvedených microRNA ve vzorcích skladovaných při – 80 °C s množstvím ve vzorcích skladovaných při – 20 °C. Ani zde nebyly pozorovány žádné odchylky. Dá se tedy usuzovat, že microRNA je po dobu 15 dní ve vzorku stabilní, ať je skladována při – 20 °C, tak při – 80 °C (Anonym01, 2014). Výše uvedené studie potvrzují, že microRNA jsou poměrně stabilní molekuly. Dlouhodobě je vhodné je skladovat při – 80 °C, krátkodobě lze i při – 20 °C.
3.7 Detekce microRNA Z důvodu krátké délky a výrazné sekvenční podobnosti jednotlivých microRNA (někdy se liší pouze jediným nukleotidem), je nalezení spolehlivé a přesné metody jejich kvantifikace obtížným úkolem. Pokud chceme využít potenciál microRNA jako biomarkerů a používat je v klinické praxi, pak je důležité klást důraz i na přímočarost, jednoduchost a reprodukovatelnost metody, která by měla fungovat jak u klinicky dostupných vzorků, tak u uchovávaného materiálu (Blondal et al., 2012). 15
Dříve nejpoužívanější metodou pro stanovování microRNA byla Northern blot analýza. Její výhoda spočívá především v její jednoduchosti, navíc nevyžaduje speciální vybavení a technické znalosti.
Nevýhodou pak je nižší citlivost.
V současnosti mezi metodami detekce microRNA hraje prim RT-qPCR. V dnešní době se již podařilo překonat počáteční problémy, které tuto metodu provázely. Délka molekuly microRNA se totiž blíží standardní velikosti primerů, čímž by při použití RT-qCR v podobě, v jaké je používána např. pro mRNA, vznikaly nespecifické produkty (např. by se amplifikovala pre-microRNA) a dimery primerů. Pro expresní analýzy se pak nejčastěji používají microarrays, jejichž nespornou výhodou je možnost stanovování obrovského množství microRNA ve vzorku současně.
3.7.1 Northern blot analýza Northern blot analýza vychází z metody Southern blotting zavedené v roce 1975 Edwinem Southernem. Southern blotting spočívá v přenosu elektroforézou rozdělených úseků DNA z gelu na membránu z nitrocelulózy či nylonu, kde je vzorek zviditelněn značenými sondami (radioaktivní, imunofluorescenční, atd.) (Alberts, 1994). Úpravou této metody vznikl Northern blotting, kde je možno místo fragmentů DNA podobným způsoben stanovovat fragmenty RNA. Ze vzorku bývá izolována RNA, která je následně elektroforeticky rozdělena v polyakrylamidovém gelu podle velikosti. Poté je přenesena na membránu, na níž je microRNA detekována pomocí specifických oligonukleotidových DNA či LNA (lock nucleid acid) sond (Kim et al., 2010; Varallyay et al., 2008).
3.7.2 microRNA microarrays Monitorování exprese microRNA technologií microarray je dobrým nástrojem, kterým lze sledovat expresi množství microRNA v organismu provedením jednoho testu. Lze jím jednoduše zjistit, jaké microRNA jsou v konkrétním vzorku exprimovány. Jako ostatní metody se i tato metoda, používaná původně na sledování exprese mRNA a aktivity genů DNA, potýkala s počátečními problémy 16
souvisejícími s krátkou délkou molekul microRNA a rozlišení zralých a nezralých forem microRNA. To je v této metodě obzvláště důležité, neboť je nutno označit všechny zralé molekuly specificky fluorescenční značkou tak, aby nebyly současně označeny i molekuly mRNA ani nezralé formy microRNA. Metoda je založená na komplementaritě sond a hledaných molekul. Testování probíhá na čipu. Ten je vytvořen tak, že jsou na sklíčku zachyceny DNA sondy komplementární ke známým molekulám microRNA. DNA sondy jsou uspořádány do oblastí podle toho, ke které microRNA jsou komplementární. Po vyizolování microRNA a naznačení molekul fluorescenčními značkami je vzorek nanesen na čip. Molekuly microRNA se naváží na DNA sondy. Následně je snímán signál z jednotlivých oblastí. Oblasti, na nichž je navázána microRNA vydávají signály. O oblastech bez signálu pak víme, že microRNA se sekvencí, která by se do nich vázala, se ve vzorku nevyskytovala. Tím můžeme jednoduše v jednom testu zjistit, jaká microRNA byla v daném vzorku exprimována (Shingara et al., 2005).
3.7.3 RT-PCR Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction, PCR) je technikou, která umožňuje získat požadovanou a specifickou sekvenci genomové DNA bez jejího předchozího klonování ve vektorech. Byla zavedena roku 1985 Kary B. Mullisem a pro molekulární biologii má dodnes obrovský přínos. Principem této techniky je replikace nukleových kyselin. Podstata PCR spočívá v enzymové syntéze nových řetězců vybraných úseků DNA, tato syntéza se cyklicky opakuje, čímž docílíme amplifikace původního vzorku (Saiki et al., 1985). PCR probíhá obvykle ve třech krocích. Nejprve je DNA denaturována za vysoké teploty (asi 95 °C), díky rozpadu vodíkových můstků dojde k rozpletení vláken DNA. Následně je studovaný úsek DNA vymezen nasednutím dvou specifických primerů. S nimi asociují jednovláknové řetězce DNA díky opětovnému snížení teploty (30 – 65 °C). Primery jsou v reakční směsi v nadbytku, také jsou kratší než řetězce DNA, která byla předtím denaturována, proto dochází k jejich nasedání na jednovláknovou DNA rychleji, než nasedá komplementární vlákno. 17
Po přidání DNA polymerázy a nukleotidů pak probíhá syntéza nových vláken DNA (65 – 75 °C). Princip PCR spočívá v opakování těchto kroků, přičemž v každém dalším kroku slouží nově nasyntetizovaná vlákna DNA jako další templáty, tudíž počet DNA vláken roste geometrickou řadou (Šmarda et al., 2005; Zima et al., 2004). Dříve bylo u PCR nutno po každé denaturaci DNA znovu dodávat DNA polymerázu, neboť byl tento enzym denaturován společně s DNA. To se však změnilo po objevu DNA polymerázy termofilní gramnegativní bakterie Thermus aquaticus, která vysokým teplotám odolávala. V současné době se proto tohoto enzymu pro PCR používá. Název, který nese je Tag polymeráza a byl odvozen právě z názvu oné termofilní bakterie, z níž byla izolována (Saiki et al., 1988). PCR se provádí v zařízení zvaném termocykler. Toto zařízení zajišťuje automatické změny teploty v naprogramovaných časových intervalech. Primery, užívané při PCR musí mít nejméně 16 nukleotidů, zpravidla jsou ale používány primery delší (18 – 25 nukleotidů). Při návrhu primerů je také důležité dbát na obsah C+G bází, který by měl být 40 – 60 %, dále na rovnoměrné rozmístění oblastí bohatých na A/T páry a C/G páry. Tm (melting temperature) by měla být u obou primerů podobná a neměla by být nižší než 50 °C. Primery musí být specifické a nesmějí se v nich vyskytovat komplementární sekvence, které by vedly k tvorbě duplexů (Šmarda J. et al., 2005). Reakční směs pro PCR obsahuje Tag DNA polymerázu, specifické primery, hořečnaté ionty (nejčastěji MgCl2), pufr a RNas a DNas prostou deionizovanou vodu. Optimální počet cyklů je v rozmezí 25 – 35 cyklů. Při větším počtu cyklů by mohlo dojít k výraznému zvýšení množství nespecifických produktů PCR (Anonym05, 2014). RT-PCR (Reverzní transkripce následovaná polymerázovou řetězovou reakcí) je modifikací PCR, která umožňuje amplifikaci RNA. RNA nemůže sloužit jako templát pro PCR, proto je v prvním kroku přepsána za pomocí reverzní transkriptázy do cDNA (komplementární DNA), která je následně amplifikována. V současné době je pro RT-PCR nejpoužívanější Tth DNA-polymeráza, která je
18
vhodná pro specifické převedení RNA do cDNA za teploty 72 °C. Pro RT-PCR můžeme použít několik typů primerů. Prvním z nich je oligo-(dT)-primer, který rozpoznává poly(A)-konec mRNA, dalším jsou náhodné oligonukleotidy a posledním specifické primery. Výhoda těch posledních spočívá v tom, že tyto specifické primery bývají navrženy tak, aby bylo možné odlišit produkty RT-PCR od produktů standardní PCR s genomovou DNA, která vzorky pro RT-PCR často kontaminuje. Své využití nachází RT-PCR především v detekci a kvantifikaci určité mRNA ve tkáních, při studiu úrovně exprese genů, při diagnostice některých virových genomových nukleových kyselin i pro detekci microRNA (Šmarda et al., 2005; Zima et al., 2004). RT-qPCR (reverzní transkripce následovaná kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí) je jednou z velmi užitečných modifikací RT-PCR. Jsou při ní využívány fluorescenční sondy nebo fluorescenční interkalační barviva, která se používají pro sledování nárůstu nově syntetizovaných vláken DNA. Pro tuto modifikaci RT-PCR je nutno použít termocykler, který je vybaven zařízením pro měření fluorescenčního záření po každém cyklu PCR. Výstupem RT-qPCR jsou křivky, které ukazují, jak v průběhu času narůstalo množství PCR produktu, z nich lze poté absolutní kvantifikací stanovit původní množství sledované RNA (v tomto případě je RT-qPCR nutno provést i pro standardní roztoky o známé koncentraci sledované RNA) nebo provést relativní kvantifikaci, kdy je množství stanovované RNA vyjádřeno jako relativní poměr k množství referenčního genu (genu, jehož hodnota exprese by se ve sledovaném vzorku neměla měnit) (Bustin et al., 2005). RT-qPCR byla upravena i pro použití u krátkých RNA, jako jsou například microRNA. Díky malému počtu nukleotidů v molekule microRNA, který se přibližně rovná počtu nukleotidů běžných primerů používaných pro PCR a díky sekvenční podobnosti mezi maturující a prekurzorovou microRNA, bylo uzpůsobení metody PCR pro tyto molekuly poněkud složitější. Přes tyto problémy ale byly vyvinuty přesné metody pro kvantifikaci a jak maturující, tak prekurzorové microRNA, jejichž šíře využití a spolehlivost se začíná rovnat spolehlivosti RT-PCR pro tradičně stanovované typy RNA - např. mRNA. V drtivé většině případů bývá z důvodu biologické aktivity stanovována maturující microRNA. Vyskytují se ale případy, kdy jsou prekurzory microRNA měřitelné, zatímco 19
maturující microRNA měřitelná není. Proto je dobré, pokud se dá metoda RT-PCR použít pro stanovování jak maturující, tak prekurzorové RNA (Bustin et al., 2005; Schmittgen et al., 2008). U microRNA je tedy její molekulu při reverzní transkripci do cDNA nutno „prodloužit“, aby bylo možné v dalším kroku užít dostatečně dlouhé primery, které budou nasedat na specifická místa. Pokud by microRNA zůstala dlouhá svých přibližně 22 nt, musely by být navrženy primery kratší, které by se ale mohly vázat na nespecifická místa. Pokud bychom navrhli normálně dlouhé primery na 22 nt dlouhou microRNA, jejich sekvence by se překrývaly a mohly by vznikat dimery primerů, které by také způsobily falešně pozitivní výsledky. Toto „prodloužení“ je možno provést několika způsoby např. použitím stem-loop primerů či přidáním polyadenylového konce. Tyto způsoby u různých firem liší.
3.7.3.1 RT-qPCR systém firmy Exiqon Exiqon využívá pro syntézu komplementární DNA (cDNA) k vláknům RNA přidání poly-A sekvence na 3’ konec zralé microRNA, obrázek č. 3, 1. krok, A). Na tuto sekvenci nasedá poly-T primer, který má na 5’ konci přidanou univerzální specifickou sekvenci. Za přítomnosti reverzní transkriptázy dochází k přepisu zralé microRNA do cDNA. Ta má oproti původní microRNA vetší délku, neboť nese na 5’ konci poly-T sekvenci a přidanou specifickou sekvenci, viz obrázek č. 3, 1. krok, B). V dalším kroku je provedena PCR amplifikace za přítomnosti
microRNA-specifického
forwardového
a
reverzního
primeru.
Reverzní primer nasedá na poly-T sekvenci a přidanou specifickou sekvenci, čímž je zamezeno reakci s prekurzory microRNA, mRNA a genomovou DNA, neboť ty tuto sekvenci nenesou. Forward primer je specifický pro vybranou microRNA, kterou hodláme stanovovat, viz obrázek č. 3, 2. krok.
20
Obrázek č. 3 – RT-qPCR Exiqon - podle miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR Instruction manual v.5.3
Pro detekci microRNA využívá firma Exiqon interkalační barvivo SYBR® Green. To se váže do dvouvláknových oblastí DNA. Po excitaci (vlnová délka 498 nm) emituje navázané barvivo měřitelné záření (vlnová délka 522 nm). S tím, jak narůstá množství PCR produktu, se zvyšuje i intenzita záření, jelikož může stále více barviva interkalovat do dvouvláknových molekul DNA. Výhodou je, že se jedná o jednoduchý, citlivý a ekonomický způsob detekce a kvantifikace PCR produktů při RT-PCR. Nevýhodou tohoto barviva je, že se váže do jakékoli dvouvláknové
DNA,
tudíž
není
schopno
rozlišit
mezi
specifickými
a
nespecifickými produkty, jako jsou například dimery primerů a kontaminace genomovou DNA (Anonym02, 2014). Tento problém lze vyřešit kontrolou pomocí tzv. křivky tání. Zkouška vychází z rozdílných teplot disociace odlišných dvouvláknových úseků DNA (různé délky, různého poměru CG/AT bází). Postupně zvyšujeme teplotu a sledujeme záření emitované barvivem, v našem případě barvivem SYBR® Green. Bod, kdy je disociována právě polovina vláken DNA, označujeme jako teplotu tání (melting temperature) - Tm. Závislost fluorescence na teplotě vynášíme do grafu, čímž získáme křivku tání. Po záporné derivaci této křivky lze z grafu snadno odečíst Tm, která leží na vrcholu křivky. V ideálním případě, kdy se ve vzorku nevyskytují žádné nespecifické produkty má křivka tání pouze jeden vrchol, viz graf č. 1. Případ výskytu nespecifických produktů je zobrazen na grafu č. 2.,
21
kde je vidět, že je ve vzorku přítomno více různých produktů s rozdílnou Tm (Ririe et al., 1997).
3.7.3.2 RT-qPCR systém firmy Qiagen Firma Qiagen využívá pro reverzní transkripci podobného postupu jako firma Exiqon. K microRNA je dosyntetizován poly-A konec, na nějž nasedá oligo-dT primer s přidanou univerzální specifickou DNA sekvencí. Tato sekvence je při následné PCR amplifikaci rozpoznávána jedním z primerů, zatímco druhý primer je specifický pro konkrétní microRNA, jež má být namnožena. Tímto jsou do cDNA přepsány pouze maturující microRNA. Tomu, aby byla v následné PCR amplifikována i možná kontaminace genomonou DNA, je zabráněno tím, že všechny cDNA vytvořené z microRNA obsahují ve své sekvenci poly-T a přidanou univerzální specifickou sekvenci, což genomová DNA neobsahuje. Detekce microRNA v reálném čase následně probíhá za přítomnosti interkalačního barviva SYBR® Green, jehož výhody a zápory byly popsány výše (Anonym03, 2014). Qiagen nabízí i možnost do cDNA přepsat všechny RNA ve vzorku. To je zajištěno tak, že maturující microRNA je přepsána stejně, jak bylo popsáno výše, přičemž další molekuly RNA jsou přepsány použitím oligo-dT primerů a náhodných n-merů.
22
3.7.3.3 RT-qPCR systém firmy Life Technologies Základem syntézy cDNA z microRNA u Life Technologies je využití tzv. stem-loop primerů při reverzní transkripci. Tyto primery mají dvouvláknovou smyčkovitou strukturu, která zabraňuje hybridizaci primeru s prekurzory microRNA a dalšími dlouhými RNA. Po přepisu sekvence microRNA dojde k prodloužení původní microRNA o sekvenci přidanou na stem-loop primeru, díky čemuž lze pro následující PCR navrhnout dostatečně dlouhé a specifické primery, viz obrázek č. 4. I zde je pro PCR použit jeden reverzní primer, který nasedá na sekvenci přidanou při reverzní transkripci stem-loop primerem a forwardový primer, který je specifický pro sekvenci konkrétní microRNA (Schmittgen et al., 2008).
Obrázek č. 4- RT-qPCR Life Technologies – podle TaqMan® Small RNA Assays Protokol
Pro detekci vznikajících PCR produktů využívá firma Life Technologies hydrolytické TaqMan sondy. Tyto oligonukleotidové sondy mají na 5´konci kovalentně navázanou fluorescenční značku (na obrázku č. 4 značena písmenem R) a na 3´konci „zhášeč“ (na obrázku č. 4 značek písmeny NFQ – non fluorescent quencher). Ve stavu, kdy jsou navázány na sondu, jsou obě tyto molekuly dostatečně blízko sobě, tudíž nedochází k uvolňování žádného fluorescenčního záření, jelikož je jeho energie pohlcována „zhášečem“. Princip funkce těchto sond závisí na 5´ - 3´exonukleázové aktivitě Taq polymeráz. Při syntéze nového vlákna dle 3´ - 5´ templátu postupuje polymeráza až k místu, kde je navázána sonda. Tu začne exonukleázovou aktivitou štěpit, čímž dojde 23
k uvolnění fluorescenční značky. Ta se tím dostane mimo dosah „zhášeče“. Díky tomu lze měřit emitované fluorescenční záření. Množství emitovaného záření pak přibývá s množstvím PCR produktů (Anonym04, 2014).
3.8 Sepse Sepse je systémová zánětlivá odpověď organismu na infekční podnět (Bone et al., 1992). Tato definice byla stanovena na konferenci Critical Care Society v r. 1992 v USA a v téměř nezměněné podobě se používá dodnes. Doplněna byla na Mezinárodní konferenci definice sepse ve Washingtonu roku 2003 (Levy et al., 2003).
Obrázek č. 5: Schéma vzájemného vztahu SIRS (systémové zánětlivé odpovědi), sepse a infekce - převzato a upraveno z (Bone et al., 1992)
Diagnostika sepse tedy vyplývá z diagnostiky systémové zánětlivé odpovědi a infekce. Za systémovou zánětlivou odpověď (Systemic Inflammatory Response Syndrome – SIRS) považujeme stav, kdy dojde současně k projevu alespoň dvou z následujících příznaků (Bone et al., 1992; Levy et al., 2003): Tělesná teplota vyšší než 38 °C nebo nižší než 36 °C Srdeční frekvence vyšší než 90 tepů za minutu Dechová frekvence vyšší než 20 vdechů za minutu nebo hyperventilace, kdy je PaCO2 nižší než 32 mm Hg 24
Počet bílých krvinek vyšší než 12 000 buněk na mikrolitr nebo menší než 4 000 buněk na mikrolitr Přítomnost více jak 10% nezralých neutrofilů Infekce vzniká, když do normální sterilní tkáně, tělní tekutiny či tělní dutiny vnikne cizí mikroorganismus. Z lékařského hlediska je důležité, že ačkoli SIRS a sepse mají podobné klinické příznaky, mohou tyto dva stavy vyžadovat odlišné způsoby léčby. Sepse často vyžaduje léčbu antibiotiky (v případech, kdy byla vyvolána bakteriální infekcí), zatímco u SIRS by mohla antibiotika vyvolat další problémy (Kumar et al., 2009). Různé faktory se při sepsi vzájemně ovlivňují a interagují s dalšími poruchami, tudíž je stále složité tento stav přesně definovat a rozlišit jednotlivá stádia sepse. V současnosti rozlišujeme tři stádia. Sepsi, těžkou sepsi a septický šok. Těžká sepse je definována jako sepse spojená s orgánovou dysfunkcí. Septický šok je určován rozdílně u dospělých a dětí. U dospělých je za septický šok považován stav akutního oběhového selhání, který se vyznačuje přetrvávající arteriální hypotenzí, která nemá jinou vysvětlitelnou příčinu. U dětí je septický šok definován jako tachykardie se známkami sníženého prokrvení zahrnujícího snížený periferní puls, prochladlé končetiny či snížený výdej moči. Hypotenze se u dětí objevuje později než u dospělých (Jawad et al., 2012).
3.8.1 Biomarkery Definice sepse popsaná v předchozí části však stále neumožňuje přesně rozlišit mezi jednotlivými stádii sepse či předpovědět, jak velká je šance tento stav zvrátit. Proto je snaha nalézt specifické biomarkery sepse, které budou jednoznačně vypovídat o stádiu sepse a umožní tak nasadit odpovídající léčbu. Jako biomarkery označujeme určité charakteristiky, které mohou být objektivně změřeny a zhodnoceny jako indikátory normálních biologických a patologických procesů, farmakologických odpovědí a terapeutických zásahů do organismu (Wittes et al., 1989). Lze je dělit podle toho, zda se jedná o markery používané v diagnostice, markery pro sledování vývoje onemocnění nebo markery pro sledování odpovědi organismu (potažmo v některých případech 25
patogenů) na léčbu (Aronson, 2005). V případě sepse jsme dále schopni pomocí biomarkerů odlišit bakteriální infekci od infekce virové či infekce plísněmi, lokální infekci od sepse. Jejich další potenciál zahrnuje řízení antibiotické terapie, hodnocení odpovědí na terapii a zotavení se ze sepse, rozlišení Gram-pozitivních a Gram-negativních bakterií, předpověď komplikací sepse a zhodnocení orgánových dysfunkcí (Dellinger et al., 2008). Ideální biomarker by měl mít následující vlastnosti:
Přijatelnost pro pacienta
Stabilitu in vivo a in vitro
Adekvátní analytickou senzitivitu
Jednoduchost stanovení
Dobrou reprodukovatelnost a přesnost
Nepříliš dlouhou dobu stanovování
Možnost automatizace stanovení biomarkeru
Mezinárodní standardizaci
Nízkou cenu
Nízkou biologickou variabilitu
Dobrou diagnostickou a prognostickou vypovídatelnost
Dobrý poměr cena/benefity (Clerico a Plebani, 2013)
Jako markery sepse jsou obvykle používány zánětlivé mediátory, které jsou uvolňovány po průniku infekčního agens do hostitelského organismu. V současné době jsou nejnadějnější a nejprobádanější markery sepse prokalcitonin, C-reaktivní protein cytokiny a chemokiny.
3.8.2 MicroRNA a sepse Velkou naději na vhodné diagnostické markery sepse nesou microRNA. Jelikož cirkulují v tělních tekutinách, vykazují značnou specifitu a jsou v séru či plazmě stabilní až 48 hodin. Proto je snaha vyvinout metodu založenou na měření hodnot exprese microRNA, od níž si slibujeme specifitu, rychlost a malou invazivitu (Andreasen et al., 2010; Blondal et al., 2012).
26
První micoRNA, u níž byla použitím microarray zjištěna spojitost se sepsí, byla hsa-mir-150. Hodnoty exprese hsa-mir-150 byly sníženy jak v leukocytech, tak v séru septických pacientů oproti pacientům, kteří sepsí netrpěli. Při stanovování cílů hsa-mir-150 bylo zjištěno, že jimi je množství genů funkčně spojených s procesy imunitního systému. Jedním z nich je např. interleukin-18 (IL-18), který je u septických pacientů exprimován mnohem více, než u zdravých lidí. Hodnoty IL-18 vykazují v séru negativní korelaci s hodnotami hsa-mir-150. Další microRNA, u níž byla zjištěna rozdílná exprese u septických pacientů oproti neseptickým kontrolám, je hsa-mir-182. Hodnoty její exprese se při sepsi zvyšují (Vasilescu et al., 2009; Wang et al., 2014). Dalšími možnými kandidáty na biomarkery sepse, které by byly schopny rozlišit i mezi sepsí a SIRS jsou hsa-mir-146a a hsa-mir-223. Hodnota exprese obou jmenovaných microRNA je znatelně snížená u septických pacientů oproti pacientům se SIRS a normálním kontrolám (Wang et al., 2010).
3.9 Gnotobiotický prasečí model Gnotobiotická zvířata jsou zvířata s definovanou střevní mikrobiotou. Své využití mají
gnotobionti
především
při
sledování
interakcí
jejich
organismu
s mikroorganismy, jimiž jsou cíleně osazeni. Přitom nedochází k zatížení výsledků konvenčním pozadím, které je u konvenčních zvířat způsobeno interakcemi sledovaného organismu s neznámými typy mikroorganismů a interakcí neznámých mikroorganismů s mikroorganismy, kterými bylo zvíře cíleně osazeno. V takovém případě by nebylo možné přesně určit čím je pozorovaný efekt způsoben. Z důvodu blízké fyziologické a morfologické podobnosti s člověkem, je prase jedním z vhodných modelů pro využití v biomedicínském výzkumu. Díky epiteliochoriálnímu typu placentace neprocházejí imunoglobuliny přes placentu do krevního oběhu plodu, jak je tomu například u hlodavců, jedněch z nejpoužívanějších laboratorních modelů pro výzkum imunity. Novorozená selata získávají první protilátky až příjmem kolostra, prvotního mateřského mléka (Sterzl a Silverstein, 1967). Proto jsou gnotobiotická selata využívána pro studium vzniku protilátek a vývoje imunitního systému v přímé reakci na 27
přítomnost určitého patogenního mikroorganismu bez přítomnosti protilátek získaných od matky. Získávána jsou hysterektomií a následným převedením do bezmikrobních podmínek (Miniats a Jol, 1978). Poté jsou osazována určitými typy mikroorganismů, jejichž vliv hodláme sledovat. Hysterektomie je prováděna z toho důvodu, jelikož k prvnímu osídlení zvířete mikroorganismy dochází již při průchodu plodu porodními cestami. Gnotobiotická selata jsou následně odchovávána ve sklolaminátových izolátorech a krmena mléčnou stravou, kde je kladen velký důraz na zabránění kontaminací izolátoru a chovaných selat. Důležité vitamíny a komplex železo-dextran jsou selatům aplikovány injekčně (Mandel a Travnicek, 1987).
28
4. Materiál a metody 4.1 Materiál Biologickým materiálem, použitým pro experimentální část bakalářské práce, byla jaterní tkáň a plazma získaná z konvenčních, bezmikrobních a septických selat. Selata byla získána hysterektomií šestnáctý týden březosti prasnice. Poté byla chována ve sterilním prostředí a krmena mléčnou stravou (Mandel a Travnicek, 1987). Selata, z konvenčních a bezmikrobních skupin, byla ve stáří 1 a 7 dní. Tkáň byla fixována v roztoku RNAlater a skladována při – 20 °C, plazma byla skladována zmražená při – 80 °C. Vzorky byly odebrány celkem z 33 selat, složení jednotlivých skupin je uvedeno v tabulce č. 1. Tabulka č. 1 – Zastoupení selat v jednotlivých skupinách
Játra
Plazma
Bezmikrobní selata
12
12
Konvenční selata
10
10
Septická selata
11
11
Celkem
33
33
Skupiny selat
4.2 Metody
4.2.1 Izolace microRNA K izolaci microRNA ze vzorků jaterní tkáně byl použit microRNA Pufication Kit (Norgen Biotek, Thorold, Canada). Izolace microRNA byla prováděna v laminárním boxu. Postupovali jsme dle následujícího protokolu, který je upraven pro izolaci z jaterní tkáně: Před začátkem práce je nutno připravit Lysis solution. Na každý vzorek bude potřeba 400 l Lysis solution. Do každého 1 ml Lysis solution je nutno přidat 10 l β-mercaptoethanolu.
29
1. Do zkumavky bylo odváženo přibližně 20 mg jaterní tkáně. 2. Ke vzorku bylo přidáno 400 l Lysis Solution, 3 velké a 7 malých zirkoniových kuliček a poté byl homogenizován v Tissue Lyseru LT po dobu 5 minut při 50 Hz. 3. Zkumavka byla centrifugována 2 minuty při 14 000 rpm, supernatant byl 10× natažen a vypuštěn stříkačkou s jehlou 25 G a poté přenesen do nové RNase-free zkumavky. Jeho objem byl zaznamenán pro výpočet množství dalších reagencií. 4. Byl přidán objem 95-100% ethanolu, který odpovídá 15% objemu odebraného supernatantu – např. 15 l ethanolu na 100 l vzorku. Poté byl vzorek zvortexován. 5. Large RNA Removal Column byla umístěna na Collection Tube. 6. Lyzát s ethanolem byl nanesen na Large RNA Removal Column a 1 minutu centrifugován při 14 000 rpm. To, co prošlo kolonkou, bylo uchováno (obsahuje malé molekuly RNA). 7. Dle zaznamenaného objemu supernatantu bylo přídáno 1,5 objemu 95-100% ethanolu (např. 150 l ethanolu na 100 l objemu supernatantu). Vzorek byl 10 sekund vortexován. 8. microRNA Enrichment Column byla umístěna na colection tube. 9. Polovina lyzátu s ethanolem byla nanesena na microRNA Enrichment Column a 1 minutu centrifugována 14 000 rpm. 10. To, co prošlo kolonkou, bylo vylito. Poté byla kolonka opět umístěna na Collection Tube. 11. Na stejnou kolonku byla nanesena druhá polovina lyzátu a poté byla 1 minutu centrifugována při 14 000 rpm. 12. To, co prošlo kolonkou, bylo vylito. Poté byla kolonka opět umístěna na Collection Tube. 13. 400 l Wash Solution bylo naneseno na microRNA Enrichment Column a 1 minutu centrifugováno 14 000 rpm. To, co prošlo kolonkou, bylo vylito. 14. Podruhé bylo naneseno 400 l Wash Solution na microRNA Enrichment Column a 1 minutu centrifugováno 14 000 rpm. To, co prošlo kolonkou, bylo vylito. 30
15. Potřetí bylo naneseno 400 l Wash Solution na microRNA Enrichment Column a 1 minutu centrifugováno 14 000 rpm. To, co prošlo kolonkou, bylo vylito. 16. Centrifugace byla poté spuštěna ještě na další 2 minuty při 14 000 rpm. 17. microRNA Enrichment Column byla umístěna na 1,7 Elution tube. 18. Na filtr kolonky bylo dáno 50 l Elution Solution. 19. Kolonka byla následně centrifugována 2 minuty při 2000 rpm a poté 1 minutu při 14000 rpm. Pokud kolonkou neprojde všechen roztok, je nutno opakovat centrifugaci 1 minutu při 14000 rpm. Izolace microRNA ze vzorků plazmy byla prováděna kitem Plasma/Serum Circulating and Exosomal RNA Purification Mini Kit - Slurry format (Norgen Biotek, Thorold, Canada). Postup byl prováděn dle následujícího protokolu, ten je optimalizován pro 1,5 ml vzorku plazmy. Pro jiné objemy je množství nutno upravit dle tabulky č. 2.
Před začátkem práce je nutno připravit PS Solution B přidáním 10 l β-mercaptoethanolu na každý 1 ml PS solution B. PS Solution A je třeba před každým pipetováním promíchat, neboť obsahuje částice, které velice snadno sedimentují.
Tabulka č. 2 – množství reagencií na izolaci microRNA pro různé objemy vzorků plazmy Objem vzorku (ml)
PS Solution A (ml) krok 1
PS Solution B (ml) Ethanol 96-100% (ml) krok 1 krok 3
0,5
0,2
0,3
0,75
1
0,2
0,8
1,5
1,5
0,2
1,8
3
2
0,2
2,8
4,5
2,5
0,2
3,8
6
1. Do 50 ml zkumavky bylo k 1 ml plasmy přidáno 0,2 ml PS Solution A a 1,8 ml PS Solution B (po přídání β-mercaptoethanolu). 2. Směs byla inkubována 10 minut při 60 °C ve vodní lázni. 31
3. Po inkubaci byly přidány 3 ml 96-100% etanolu. Směs byla 15 sekund vortexována. 4. Směs byla centrifugována 30 vteřin při 1 000 rpm. Poté byl supernatant opatrně slit tak, aby pelet zůstal na dně. 5. K peletu bylo přidáno 0,3 ml PS Solution C, směs byla vortexována 15 sekund. 6. Směs byla inkubována 10 minut při 60 °C. 7. Po inkubaci bylo přidáno 0,3 ml 96-100% etanolu. Směs byla 15 sekund vortexována. 8. Mini Filter Spin Column byla umístěna na Collection Tube. 9. 650 ml směsi z kroku 7 bylo přeneseno na Mini Filter Spin Column a centrifugováno 1 min při 14 000 rpm. To, co prošlo kolonkou, bylo vylito. Kolonka byla poté umístěna zpět na Collection Tube. 10. Krok 9 byl opakován tak dlouho, dokud všechna směs z kroku 7 neprošla přes Mini Filter Spin Collumn. 11. Na kolonku bylo napipetováno 400 µl Wash Solution, poté následovala centrifugace 1 min při 14 000 rpm. To, co prošlo kolonkou, bylo vylito a kolonka byla umístěna zpět na Collection Tube. 12. Krok 11 byl opakován ještě dvakrát tak, aby byla provedena celkem tři promytí. 13. Kolonka byla poté centrifugována ještě jednou 3 minuty při 14 000 rpm. Collection Tube byla poté vyhozena a kolonka přenesena na Elution Tube. 14. Na filtr kolonky bylo napipetováno 100 l Elution solution a poté následovala centrifugace 2 minuty při 2 000 rpm a následně 3 minuty při 14 000 rpm. Tím byl eluován roztok obsahující microRNA. 15. Skladování RNA: Krátkodobě -20 °C, dlouhodobě -75 °C.
32
4.2.2 Stanovení koncentrace nukleových kyselin Koncentrace nukleových kyselin byla stanovována dvojím způsobem. U vzorků kde
byla
očekávána
větší
koncentrace
microRNA
bylo
využito
spektrofotometrické stanovení, v našem případě se jednalo o vzorky microRNA vyizolované z jaterní tkáně. U vzorků kde byla koncentrace microRNA nižší, než bychom byli schopni spolehlivě stanovit na spektrofotometru, byla pro její měření použita souprava využívající fluorochormu vážícího se na RNA. Tuto soupravu jsme použili pro stanovení koncentrace microRNA ve vzorcích vyizolovaných z plazmy.
Koncentrace nukleových kyselin u vzorků s vyšším obsahem RNA U vzorků s vyšším obsahem vyizolované RNA byl pro stanovení její koncentrace využit UV/VIS spektrofotometr. Koncentrace RNA byla stanovována v desetkrát ředěném roztoku - do křemenné kyvety bylo odebráno 20 l roztoku RNA a 180 l TRIS pufru (10 mmol/l TRIS – HCl, pH 7,5). TRIS pufr byl využit také jako blank pro nastavení bazálních hodnot absorbance.
Koncentrace nukleových kyselin u vzorků s nižším obsahem RNA U vzorků s nižším obsahem vyizolované RNA byl pro stanovení její koncentrace použit Quant-iT™ RiboGreen®RNA Reagent and Kit (Life Technologies, Carlsbad, California). Při vytváření kalibrační křivky a měření koncentrace jednotlivých roztoků obsahujících RNA, bylo postupováno dle následujícího protokolu. Ten je optimalizován pro měření v množství 200 l v destičkách s 96 jamkami a současně pro měření koncentrace RNA od 20 ng/ml do 1000 ng/ml.
Quant-iTTM RiboGreen reagent je hydroskopický a absorbuje vzdušnou vlhkost, proto je nutno jej nechat zahřát na pokojovou teplotu než otevřeme víčko! Skladován musí být v přítomnosti vysoušedla.
Na ředění 20x TE pufru byla použita nuclease-free voda.
Vše bylo připraveno do nuclease-free zkumavek, byly použity špičky a pipety vyhrazené pouze pro práci s RNA.
33
Standardní kalibrační křivka pro měření koncentrací RNA v rozsahu 20 ng/ml - 1000 ng/ml:
Pro vytvoření standardní křivky byla použita 16S a 23S ribozomální RNA (dodána v soupravě)
1. Potřebné množství TE pufru (dodán 20x koncentrovaný) bylo naředěno nuclease-free vodou (bude dále potřeba pro ředění RNA, RiboGreen reagentu a vzorků). 2. Roztok 16S a 23S ribozomální RNA byl naředěn TE pufrem pro dosažení výsledné koncentrace 2 g/ml. V tomto případě byla dodána 16S a 23S ribozomální RNA o koncentraci 100 g/ml, proto byla ředěna 50x (1 : 49). 3. TE pufrem byl 200x naředěn Quant-iT RiboGreen Reagent (1:199). 4. Do jednotlivých jamek byly napipetovány reagencie dle tabulky č. 3. Tabulka č. 3 – Rozpis pipetování reagencií
Číslo jamky
Objem TE pufru (l)
Objem 2 g/ml RNA (l)
Objem 200x ředěného QuantiT RiboGreen Reagentu (l)
Konečná koncentrace RNA (ng/ml)
0
100
100
1000
2
50
50
100
500
3
90
10
100
100
4
98
2
100
20
5
100
0
100
Blank
1
5. Reagencie byly promíchány pipetováním a nechány 2 – 5 minut ve tmě pro inkubaci. 6. V jednotlivých jamkách byla změřena fluorescence. Excitační vlnová délka 480 nm, emisní vlnová délka 520 nm.
34
Kalibrační křivka pro stanovení koncentrace RNA v roztoku: Dle postupu uvedeného výše byla vytvořena kalibrační křivka pro stanovení koncentrace RNA v roztoku. Tabulka č. 4 uvádí hodnoty fluorescence naměřené u roztoků o známé koncentraci RNA. Na základě těchto hodnot byla vytvořena standardní kalibrační křivka, graf č. 3. Rovnice této křivky byla následně použita pro výpočet koncentrace RNA ve vzorcích izolovaných z plazmy testovaných selat. Tabulka č. 4 – hodnoty fluorescence roztoků o známých koncentracích RNA pro vytvoření kalibrační křivky
RNA (ng/ml) 1000 500 100 20 0
fluorescence 60370 29947 6154 1869 858
70000
y = 59,626x + 520,77 R² = 0,9998
60000
Fluorescence
50000 40000 30000 20000 10000 0 0
500
1000
1500
RNA (ng/ml)
Graf č. 3 - Standardní kalibrační křivka pro stanovení koncentrace microRNA
35
Měření koncentrace RNA ve vzorcích: 1. Vzorek RNA byl naředěn do finálního objemu 100 l. Koncentrace byla měřena u 10x ředěného vzorku – do 90 l TE pufru bylo přidáno 10 l roztoku vyizolované RNA. 2. Quant-iT RiboGreen Reagent byl 200x naředěn TE pufrem (1:199). 3. Ke vzorku bylo přidáno 100 l ředěného Quant-iT RiboGreen Reagentu. 4. Reagencie byly promíchány pipetováním a nechány 2 – 5 minut ve tmě pro inkubaci. 7. V jednotlivých jamkách byla změřena fluorescence. Excitační vlnová délka 480 nm, emisní vlnová délka 520 nm. 5. Z kalibrační křivky byla odečtena koncentrace RNA v jednotlivých vzorcích (10x ředěných), z čehož byla následně vypočítána koncentrace původních roztoků.
4.2.3 Reverzní transkripce Pro reverzní transkripci byl použit Universal cDNA synthesis kit (Exiqon, Copenhagen, Denmark). Syntéza cDNA dle templátu microRNA byla provedena tak, jak je popsáno v následujícím postupu.
Před prvním použitím RNA-spike-ins byla UniSP6 RNA spike-in (dodána v kitu) resuspendována přidáním 80 l nuclease-free vody, roztok byl řádně rozmíchán a skladován v 10 l alikvótách při – 20 °C.
36
1. RNA templát byl naředěn nuclease-free vodou na koncentraci 5 ng/l. 2. Dle tabulky č. 5 byla připravena RT směs. Tabulka č. 5 – směs pro reverzní transkripci
Reagencie 5x Reaction buffer Nuclease-free water Enzyme mix Syntetic RNA spike-ins
Objem (l) 2 4,5 1 0,5
Template total RNA (5 ng/l)
2
Celkový objem
10
3. Reagencie byly promíchány jemným pipetováním a poté stočeny na centrifuze. 4. Směs byla inkubována v cykléru (iCycler, Bio-Rad, Hercules, USA) 60 minut při 42 °C, poté byla reverzní transkriptáza deaktivována vystavením směsi 95 °C po dobu 5 minut. Následně byla teplota snížena na 4 °C a zachována tak dlouho, dokud nebyla směs z cykléru vyjmuta a umístěna na led. 5. Před skladováním byly vzorky 8x naředěny nuklease-free vodou. 6. Vzorky byly uchovávány při – 20 °C.
4.2.4 Real-time PCR Real-time PCR byl použit Real-time PCR SYBR® Green master mix, Universal RT (Exiqon, Copenhagen, Denmark). Reakce byla provedena dle následujícího protokolu.
PCR Master mix je nutno chránit před světlem. Před použitím byly reagencie promíchány pipetováním a po celou dobu práce byly uchovávány na ledu.
37
1. cDNA teplát byl 10x naředěn nuclease-free vodou. Pozn. před uskladněním byl naředěn 8x. Celkové ředění bylo 80x. 2. Dle tabulky č. 6 bylo smíseno potřebné množství Primer mixu a Master mixu pro všechny reakce a rozpipetováno po 6 l do jamek 96-jamkové destičky pro PCR. 3. Destička byla 1 minutu centrifugována při 1500 rpm k odstranění bublin. 4. Poté byly přidány 4 l cDNA templátu. Tabulka č. 6 – množství reagencií PCR směsi pro 1 vzorek
Reagencie
Objem (l)
PCR Master mix
5
PCR Primer mix
1
cDNA templát
4
Celkový objem
10
5. Reagencie byly promíchány jemným pipetováním a jamky byly přelepeny fólií. 6. Destička byla centrifugována 1 minutu při 1500 rpm, následně vložena do cykléru, kde proběhla PCR za podmínek uvedených v tabulce č. 7. Tabulka č. 7 – Podmínky PCR
Teplota (°C)
Čas
Počet cyklů
Počáteční denaturace
95
10 min
1
Denaturace
95
10 s
Real-time PCR
Annealing + elongace
45 60
60 s
38
4.2.5 Křivka tání Křivka tání byla sestrojena na základě proměření fluorescence emitované barvivem SYBR® Green při různých teplotách. Teplota byla nejprve snížena pod očekávanou teplotu Tm na 55 °C a následně byla po 0,5 °C zvyšována. Po každém zvýšení byla zaznamenána hodnota fluorescence, zvyšování teploty skončilo, jakmile bylo dosaženo 95 °C. Poté byl sestrojen graf závislosti intenzity fluorescence na teplotě a provedena první záporná derivace křivky, čímž byla získána křivka tání. Za vzorek bez nespecifických produktů byl považován každý vzorek, u něhož měla křivka tání pouze jeden vrchol.
4.3 Použitý software Reference Manager Literární citace byly vytvořeny s použitím programu Reference Manager, verze 12.0.1 (Thomson Reuters, Carlsbad, USA). Ten vyhledává reference v různých databázích odborné literatury, na základě zadání klíčových slov nebo jmen autorů. Databáze miRBase Online databáze microRNA miRBase byla použita pro srovnání sekvencí lidských a prasečích microRNA. Databáze je dostupná na internetové adrese www.mirbase.org. Graph Pad Prism 6 Statistické analýzy a výsledné grafy byly vytvořeny a provedeny pomocí programu Graph Pad Prism 6 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Microsoft Office 2013 Tvorba textu byla provedena s použitím softwaru Microsoft Word 2013 (Microsoft Corporation, Redmond, USA) a tvorba tabulek s použitím Microsoft Excel 2013 (Microsoft Corporation, Redmond, USA).
39
PubMed online databáze odborných článků Pro vyhledávání odborných publikací souvisejících s tématem byl použit online archiv biomedicínských článků PubMed central, který byl vytvořen U.S. National Library of Medicine National Institutes of Health. Pro přístup k článkům byl využit přístup Střediska vědeckých informací Fyziologického ústavu AV ČR, v.v.i. Články, které nebylo možné tímto způsobem získat, byly po písemné žádosti laskavě poskytnuty od korespondujících autorů ve formě pdf souborů.
GenEx Pro 5 Statistické zhodnocení výsledků bylo provedeno s použitím programu GenEx Pro 5 (MultiD Analyses AB, Göteborg, Švédsko).
iQ5 Optical System Software PCR reakce, včetně kalibračních křivek, byla vyhodnocena s použitím iQ5 Optical System Software firmy Bio-Rad.
4.4 Použité přístroje Centrifuga Universal R32 (Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, SRN) - použit rotor 1614 Centrifuga Micro200R (Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, SRN) Spektrofotometr-fluorimetr pro mikrotitrační destičky Infinite 200 PRO (Tecan, Männersdorf, Schwitzerland) Chladnička Liebherr CUP 2711 premium (Biberach an der Riss, SRN) Laminární box Euro Flow EF/S (CleanAir Techniek, Woerden, Nizozemsko) Mikrocentrifuga Spectrafuge Mini Centrifuge C1301 (Labnet International, Woodbridge, USA) 40
Hlubokomrazící box Sanyo Ultra Freezer MDF-U72V (SANYO Electric Co., Ltd., Japan) Pipety Finpipette digital (Thermo Fischer, Helsinki, Finsko) Poloautomatické pipety Bio Control (Thermo Fischer, Helsinki, Finsko) Spektrofotometr UltroSpec 2100 pro (Pharmacia LKB, Uppsala, Švédsko) Stolní váha A & D GF-1200 (A & D, Miltipas, USA) Termocyklér iCycler (Bio-Rad, Hercules, USA) Termocyklér s optickým nástavcem pro real time PCR iCycler – iQ5 (Bio-Rad, Hercules, USA) Tkáňový homogenizátor Tissue Lyser LT (Qiagen, Hilden, SRN) Třepačka (vortex) BR-2000 (Hercules, CA, USA) Vodní lázeň Julabo TW2 (Julambo GmbH, Seelbach, SRN) Výrobník ledu F125 Compact icematic (Icematic Deutschland, Meerbusch, SRN)
4.5 Použité chemikálie a roztoky β-merkaptoethanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) Deionizovaná voda (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) Ethanol – 96% roztok (Penta, Praha, ČR) 41
microRNA Pufication Kit (Norgen Biotek, Thorold, Canada) Plasma/Serum Circulating and Exosomal RNA Purification Mini Kit - Slurry format (Norgen Biotek, Thorold, Canada) Real-time PCR SYBR® Green master mix (Exiqon, Copenhagen, Denmark) RNAlater (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) TRIS pufr (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) Universal cDNA synthesis kit (Exiqon, Copenhagen, Denmark) Quant-iT™ RiboGreen®RNA Reagent and Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)
42
5. Výsledky Bylo provedeno srovnání komerčně dostupných souprav pro izolaci microRNA z různých vzorků, viz tabulka č. 8. Důraz byl kladen především na přítomnost látek, které by mohly negativně ovlivnit zdraví pracovníků (např. fenol, chloroform). Tabulka č. 8 – srovnání komerčně dostupných souprav pro izolaci microRNA
Výrobce
Kat. č.
Použití
Fenol, choroform
Norgen Biotek
21300
Tkáň, buňky, plná krev
Ne
Norgen Biotek
51000
Plazma, sérum
Ne
Exiqon
300112
Tělní tekutiny včetně séra a plazmy
Ne
Exiqon
300111
Tkáň
Ne
Ambion, Life technologies
AM1560
Tkáň, buňky
Ano
Ambion, Life technologies
K1570-01
Rostlinné a živočišné buňky, bakterie, kvasinky
Ne
miRNA Isolation Kit
Geneaid
RMI050
Tkáň, buňky
Ano
mirPremier® microRNA Isolation Kit
Sigma-Aldrich
SNC50
Tkáň, buňky
Ne
miRNeasy Mini Kit
Qiagen
217004
Tkáň, buňky
Ano
miRNeasy Serum/Plasma Kit
Qiagen
217184
Plazma, sérum
Ano
Název microRNA Purification Kit Plasma/Serum Circulating and Exosomal RNA Purification Mini Kit (Slurry Format) miRCURY™ RNA Isolation Kits Biofluids miRCURY™ RNA Isolation Kit - Tissue mirVana™ miRNA Isolation Kit, with phenol PureLink® miRNA Isolation Kit
Ze vzorků jater a plazmy celkem 33 selat byla izolována microRNA. Testovaná skupina se skládala z 11 bezmikrobních, 10 konvenčních a 11 septických selat. Množství vyizolované microRNA ze vzorků jater a plazmy ukazují tabulky č. 9 a 10. 43
Tabulka č. 9 – množství microRNA vyizolované ze vzorků jaterní tkáně testovaných selat
Popis a označení vzorků Číslo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
Sele 859/3 859/4 859/5 860/1 860/5 860/6 860/0 860/2 837/2 837/4 837/7 837/9 CV1 CV2 CV3 CV4 CV5 CV6 CV7 CV8 CV9 CV10 862/0 862/4 863/2 863/5 863/1 863/7 863/9 868/0 868/1 870/10 870/20
Popis Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Konvenční Konvenční Konvenční Konvenční Konvenční Konvenční Konvenční Konvenční Konvenční Konvenční Septické Septické Septické Septické Septické Septické Septické Septické Septické Septické Septické
Konc.
Izolace celkové RNA Poměry Absorbance
[g/L] A260/A280 A260/A230 A230 0,014 0,021 0,013 0,023 0,022 0,040 0,035 0,017 0,018 0,011 0,004 0,026 0,035 0,020 0,018 0,033 0,032 0,030 0,014 0,023 0,007 0,013 0,031 0,018 0,018 0,012 0,020 0,002 0,022 0,027 0,013 0,082 0,049
2,00 1,93 1,68 1,90 1,93 1,94 1,78 1,87 1,91 1,80 2,00 2,00 1,87 1,67 1,64 1,82 2,14 1,83 1,79 1,81 1,64 1,78 1,95 1,55 1,91 1,88 2,04 1,50 1,93 1,94 2,06 2,10 2,03
2,00 0,72 0,62 0,83 1,17 1,07 0,95 1,30 1,00 1,42 1,11 3,76 0,24 0,21 0,18 0,22 0,30 0,29 0,94 1,04 0,72 0,74 1,37 2,25 1,05 0,86 2,23 0,32 1,65 1,74 0,24 2,02 2,44
0,021 0,092 0,073 0,073 0,063 0,120 0,125 0,046 0,055 0,023 0,014 0,019 0,384 0,249 0,260 0,388 0,290 0,270 0,050 0,079 0,036 0,059 0,064 0,035 0,049 0,043 0,024 0,021 0,04 0,04 0,145 0,106 0,052
A260
A280
A320
0,039 0,072 0,053 0,061 0,071 0,127 0,12 0,056 0,055 0,031 0,015 0,066 0,101 0,058 0,055 0,098 0,102 0,088 0,048 0,081 0,029 0,048 0,085 0,06 0,051 0,038 0,051 0,008 0,062 0,069 0,041 0,21 0,124
0,021 0,047 0,04 0,034 0,044 0,078 0,082 0,036 0,034 0,019 0,01 0,034 0,06 0,038 0,037 0,061 0,06 0,054 0,033 0,055 0,022 0,034 0,047 0,044 0,03 0,024 0,026 0,006 0,035 0,036 0,024 0,102 0,062
0,003 0,020 0,021 0,004 0,015 0,026 0,033 0,013 0,011 0,004 0,005 0,002 0,013 0,008 0,009 0,016 0,023 0,013 0,014 0,023 0,011 0,016 0,007 0,015 0,007 0,008 0,002 0,002 0,006 0,001 0,008 0,004 0,002
44
Ředění v 0,1 mmol/l Tris 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Tabulka č. 10 - množství microRNA vyizolované ze vzorků plazmy testovaných selat
Popis a označení vzorků Číslo Sele 1 859/3 2 859/4 3 859/5 4 860/1 5 860/5 6 860/6 7 860/0 8 860/2 9 837/2 10 837/4 11 837/7 12 837/9 13 CV1 14 CV2 15 CV3 16 CV4 17 CV5 18 CV6 19 CV7 20 CV8 21 CV9 22 CV10 23 862/0 24 862/4 25 863/2 26 863/5 27 863/1 28 863/7 29 863/9 30 868/0 31 868/1 32 870/10 33 870/20
Popis Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Bezmikrobní Konvenční Konvenční Konvenční Konvenční Konvenční Konvenční Konvenční Konvenční Konvenční Konvenční Septické Septické Septické Septické Septické Septické Septické Septické Septické Septické Septické
Izolace microRNA Konc. [ng/L] 3,564 0,250 0,333 0,308 0,408 0,514 0,425 0,487 0,402 0,208 0,265 0,370 0,947 0,454 0,561 0,432 2,542 0,699 1,170 1,421 0,886 0,883 3,233 1,382 0,310 0,316 0,322 0,326 0,283 1,358 3,197 0,768 1,906
45
Z jednotlivých vzorků vyizolované microRNA byla provedena RT-qPCR, ze získaných údajů byly poté programem GenEx Pro 5 provedeny analýzy (NormFinder, geNorm), při nichž bylo zjištěno, která ze sledovaných microRNA je nejstabilnější – jejíž exprese se u různých vzorků nejméně mění. Analýzou geNorm pro vzorky jaterní tkáně byla zhodnocena jako nejstabilnější hsa-mir-150-5p a hsa-mir-182-5p, pro vzorky plazmy hsa-mir-150-5p a hsa-mir-192 – viz grafy č. 4 a 5.
Graf č. 4 – geNorm vzorky jaterní
Graf č. 5 – geNorm vzorky plazmy
tkáně
Analýzou NormFinder byla zhodnocena u vzorků jaterní tkáně i u vzorků plazmy jako nejstabilnější hsa-mir-150-5p, viz graf č. 6 a 7. Z tohoto důvodu byla hsa-mir-150-5p vybrána jako referenční gen pro zjištění relativní exprese ostatních microRNA ve sledovaných vzorcích.
Graf č. 6 – NormFinder vzorky jaterní
Graf č. 7 – NormFinder vzorky plazmy
tkáně
46
Pro stanovení rozdílů v hodnotách exprese sledovaných microRNA ve vzorcích byl
použit
parametrický
ANOVA
test
(analýza
rozptylu)
následovaný
Student-Newman-Keuls post-testem. Relativní exprese hsa-mir-182-5p v jaterní tkáni s použitím referenčního genu hsa-mir-150-5p se znázorněním SEM (standard error mean - střední chyba průměru) je zobrazena v grafu č. 8. Použitým statistickým hodnocením nebyl v relativní expresi hsa-mir-182-5p zjištěn žádný významný statistický rozdíl mezi jednotlivými skupinami.
Graf č. 8 – relativní exprese hsa-mir-182-5p v jaterní tkáni GF – bezmikrobní, CV – konvenční
Graf č. 9 znázorňuje relativní expresi hsa-mir-192 vztaženou k referenčnímu genu hsa-mir-150-5p a se znázorněním SEM. Mezi jednotlivými skupinami nebyl zjištěn žádný statisticky významný rozdíl v relativní expresi hsa-mir-192.
Graf č. 9 – relativní exprese hsa-mir-192 v jaterní tkáni GF – bezmikrobní, CV – konvenční
47
Relativní exprese hsa-mir-182-5p v jednotlivých skupinách s využitím referenčního genu hsa-mir-150-5p a se znázorněním SEM je zobrazena v grafu č. 10. Provedenými testy nebyl zjištěn žádný statisticky významný rozdíl v relativní expresi hsa-mir-182-5p mezi testovanými skupinami.
Graf č. 10 - relativní exprese hsa-mir-182-5p v plazmě GF – bezmikrobní, CV – konvenční
Relativní exprese hsa-mir-192 ve vzorcích plazmy s použitím referenčního genu hsa-mir-150-5p a se znázorněním SEM je zobrazena v grafu č. 11. Nebyl zjištěn žádný významný statistický rozdíl v relativní expresi hsa-mir-192 mezi jednotlivými skupinami.
Graf č. 11 - relativní exprese hsa-mir-192 v plazmě GF – bezmikrobní, CV – konvenční
48
6. Diskuze microRNA jsou velice zajímavé molekuly slibující široké možnosti využití. Jedná se o jednovláknové molekuly RNA, dlouhé přibližně 20-25 nukleotidů (Lagos-Quintana et al., 2001). Tyto molekuly hrají velice důležitou roli v regulaci genové exprese, jelikož se podílí na procesu umlčování genů (Bartel, 2009). Změna exprese některých microRNA může být i reakcí na nějaký patologický stav, jakým je např. sepse. Sepse, jež byla na konferenci Critical Care Society v r. 1992 v USA definována jako systémová zánětlivá odpověď organismu na infekční podnět (Bone et al., 1992), je stále jednou z velice častých příčin úmrtní pacientů. Důvodem, proč k tomu dochází, je to, že je při sepsi důležité nasadit včas správnou a odpovídající léčbu. K tomu je ale nutné tento stav spolehlivě a rychle rozpoznat. Dnes jsou již známy molekuly, které lze použít jako biomarkery sepse, většinou se jedná o zánětlivé mediátory, které jsou uvolňovány po průniku infekčního agens do hostitelského organismu. Bohužel jimi nelze většinou spolehlivě odlišit jednotlivá stádia sepse. Jednou z nadějí vhodných diagnostických markerů sepse jsou proto právě microRNA. Ty vykazují značnou specifitu, cirkulují v tělních tekutinách a jsou v séru či plazmě stabilní až 48 hodin. Proto je snaha vyvinout metodu založenou na měření hodnot exprese microRNA. Ta by mohla zajistit specifitu, rychlost a malou invazivitu (Andreasen et al., 2010; Blondal et al., 2012). V rešeršní části práce jsme se věnovali také studiím, které se zabývaly stabilitou microRNA v průběhu skladování a to z toho důvodu, abychom si byli jistí, že po delším skladování microRNA nezískáme falešně negativní výsledky. Jedním z hlavních cílů této práce bylo zavedení spolehlivého způsobu izolace a detekce microRNA ze vzorků jaterní tkáně a plazmy gnotobiotických selat na pracoviště. Bylo provedeno srovnání komerčně dostupných souprav pro izolaci microRNA z hlediska obsahu toxických látek (jako je např. fenol a chloroform), ceny a schopnosti izolovat microRNA z požadovaných typů vzorků. Cena jednotlivých souprav není ve výsledcích z důvodu proměnlivosti uváděna. Jako nejvýhodnější se po této stránce jevily tyto soupravy: pro izolaci microRNA z jaterní tkáně microRNA Pufication Kit a pro izolaci z plazmy Plasma/Serum Circulating and Exosomal RNA Purification Mini Kit - Slurry format obojí od firmy Norgen Biotek (Thorold, Canada). Jelikož koncentrace microRNA vyizolované 49
z plazmy byla řádově stokrát nižší, než koncentrace microRNA vyizolované z jaterní tkáně, bylo nutno ji stanovit jiným způsobem než spektrofotometricky. Proto byla pro měření koncentrace microRNA v plazmě použita souprava Quant-iT™ RiboGreen®RNA Reagent and Kit (Life Technologies, Carlsbad, USA). Ta využívá fluorescenčních barviv, která se váží na RNA. Po vytvoření kalibrační křivky ze vzorků o známé koncentraci RNA lze pak odečíst koncentraci RNA v neznámém vzorku. V manuálech souprav pro izolaci microRNA bývá často doporučováno při izolaci využívat DNasu, ta by měla vzorek zbavit kontaminace genomovou DNA. V této práci nebyla DNasa využita z několika důvodů. Prvním důvodem je, že byla po průběhu každé RT-qPCR sestrojena křivka tání. Pokud by byla přítomna kontaminace genomovou DNA, projevilo by se to po záporné derivaci vznikem více vrcholů na křivce tání. Tento jev nebyl u žádného vzorku pozorován. Dalším důvodem je způsob provedení reverzní transkripce microRNA do cDNA. Námi využitý způsob přepisu microRNA do cDNA spočíval v přidání poly-A konce ke zralé microRNA. Na tuto poly-A sekvenci pak nasedal oligo-T primer s připojenou univerzální specifickou sekvencí, microRNA přepsaná do cDNA tedy navíc obsahovala oligo-T sekvenci a univerzální specifickou sekvenci. Při následné PCR pak jeden z použitých primerů nasedal na oligo-T a přidanou sekvenci, kterou genomová DNA neobsahuje a tudíž by nemohlo dojít k její amplifikaci. Výše zmíněná skutečnost byla také důvodem, proč nebyly z testování vyřazeny vzorky, u nichž byl po spektrofotometrickém stanovení zjištěn poměr absorbancí A260/A280 menší než 1,8. Za normálních okolností, např. při stanovování mRNA, bychom tyto vzorky vyřadili z důvodu předpokládané kontaminace genomovou DNA. V našem případě spoléháme na to, že navržený RT-qPCR systém je specifický pouze pro microRNA, tudíž případná mírná kontaminace genomovou DNA není pokládána za závadu. Z tohoto důvodu jsme do testování zařadili všechny vzorky s poměrem absorbancí A260/A280 větším než 1,5 včetně. Při výběru microRNA vhodných pro srovnání hodnot exprese mezi septickými a zdravými selaty jsme vycházeli z předpokladu, že liší-li se při sepsi hodnota exprese některé microRNA u člověka, pak lze očekávat, že pokud nalezneme u prasete microRNA se stejnou sekvencí, bude se při sepsi její hodnota exprese 50
měnit také. Proto jsme postupovali následovně. Z literatury dostupné k tématu využití molekul microRNA při sepsi jsme zjistili, že u člověka bylo detekováno množství molekul microRNA, jejichž hodnota exprese se v průběhu sepse mění. Sekvence těchto microRNA byla s použitím databáze miRBase porovnána se sekvencemi microRNA známých u prasete. Pokud bylo zjištěno, že má u těchto dvou druhů microRNA konzervovanou sekvenci, zjišťovali jsme dále, zda byla tato microRNA u člověka či prasete detekována v krvi. MicroRNA, která splňovala i tuto druhou podmínku pak byla zařazena na seznam testovaných microRNA. Z nich jsme pro stanovení vybrali dvě: hsa-mir-150-5p a hsa-mir-182-5p. Hsa-mir-150-5p a hsa-mir-182-5p byly u člověka v krvi identifikovány jako microRNA, jejichž hodnota se při sepsi mění a to tak, že hodnota exprese hsa-mir-150-5p je u septických pacientů nižší než u zdravých lidí, zatímco hodnota exprese hsa-mir-182-5p je u septických pacientů zvýšená. Jako referenční microRNA byla zvolena hsa-mir-192, jejíž hodnota byla u septických i u zdravých pacientů stejná (Vasilescu et al., 2009; Wang et al., 2014). Po provedení RT-qPCR a statistických analýz geNorm a NormFinder jsme zjistili, že hodnota exprese hsa-mir-192 mezi jednotlivými vzorky kolísá, tudíž ji nebylo možno použít jako referenční gen pro vzorky plazmy a jater selat. Jako nejstabilnější ze sledovaných vyšla hsa-mir-150-5p. Tyto výsledky nebyly očekávány, nelze tedy jako referenční gen použít stejnou microRNA, která je používána jako referenční při sledování sepse u člověka. Z toho vyplývá potřeba nalezení takové microRNA u selat. Jelikož zatím nebyly publikovány studie sledující microRNA při sepsi u selat, kde bychom mohli zjistit, jakou microRNA je vhodné využít jako referenční gen, využili jsme pro další hodnocení výsledků hsa-mir-150-5p, která ze statistických analýz vyplynula jako nejstabilnější z námi sledovaných. Hodnoty exprese vybraných microRNA byly sledovány u tří skupin selat – bezmikrobních, konvenčních a septických. Konvenční selata, selata s přirozenou střevní mikroflórou, zastupovala skupinu zdravých jedinců. Selata septická byla použita pro sledování patologického stavu. Bezmikrobní selata byla zařazena jako model, u něhož není důvod k tomu, aby jakkoli reagoval na antigenní 51
podnět – u nich by tedy hodnota exprese microRNA souvisejících se systémovou zánětlivou odpovědí na infekční podnět měla být v hladině odpovídající stavu bez zánětu. Proto lze k této skupině vztahovat hodnoty exprese předešlých dvou skupin. Při porovnání hodnot exprese hsa-mir-192 v játrech a plazmě, nebyl mezi sledovanými skupinami zjištěn žádný statisticky významný rozdíl. Rozdíl nebyl zjištěn asi při stejném srovnání hodnot exprese hsa-mir-182-5p v játrech a plazmě sledovaných skupin selat. Z těchto výsledků by vyplynulo, že sledované microRNA nelze použít jako biomarkery sepse u gnotobiotických selat. Je ale nutno přihlédnout k velikosti testovaných skupin selat, ty nebyly příliš početné - 12, 10 a 11 zvířat ve skupině. Výsledky mohlo ovlivnit i použití hsa-mir-150-5p jako referenčního genu. Ačkoli její hodnota exprese mezi jednotlivými vzorky kolísala nejméně ze všech sledovaných, bylo by pro spolehlivé stanovení výsledků vhodné provést srovnání více microRNA ze vzorků jater a plazmy septických a zdravých selat a určit spolehlivý referenční gen. Studium molekul microRNA je rychle se rozvíjející oblastí molekulární biologie, která slibuje množství nových poznatků a jejich dalších použití. Možnost využití molekul microRNA jako biomarkerů sepse je další velikou nadějí. Výzkum tohoto problému na modelech podobných lidskému organismu – jako je např. prasečí model (Meurens et al., 2012), je jednou z možných cest, jak dosáhnout tohoto cíle. Z našich výsledků vyvozujeme nutnost nalezení vhodného referenčního genu pro sledování hodnot exprese microRNA při sepsi u gnotobiotických selat.
52
7. Závěr V předložené práci jsme si kladli několik dílčích cílů: 1) Vypracování rešerše na téma bakalářské práce. Zvolené téma rešerše této práce bylo: microRNA a jejich význam v sepsi. Hlavní důraz byl kladen na zpracování různých metod detekce microRNA, především pak RT-qPCR. Dále byly shrnuty dosavadní poznatky o sepsi (sytémové zánětlivé odpovědi na infekční podnět) a možnosti využití molekul microRNA pro včasnou diagnostiku tohoto stavu. 2) Výběr vhodné metody izolace a detekce microRNA z tkání a plazmy bezmikrobních, konvenčních a septických selat. Bylo provedeno srovnání komerčně dostupných souprav pro izolaci microRNA z různých typů vzorků, přičemž bylo dbáno na to, aby souprava obsahovala co nejméně látek, které by mohly poškodit zdraví pracovníků. Na základě dostupných informací byly zvoleny dvě soupravy – jedna pro izolaci microRNA z plazmy, druhá pro izolaci microRNA z jaterní tkáně. Postup byl poté optimalizován pro použití při izolaci microRNA z jaterní tkáně a plazmy gnotobiotických a konvenčních selat. Následně byla zvolena vhodná metoda detekce těchto molekul, pracující na systému RT-qPCR. 3) Dle dostupné literatury výběr microRNA, jejichž hodnota se při sepsi u člověka mění, stanovení těchto microRNA ze vzorků jater a plazmy bezmikrobních, konvenčních a septických selat aplikací systémů vhodných pro stanovení microRNA metodou PCR u člověka. Na základě dostupné literatury byly určeny microRNA, jejichž hodnota se při sepsi u člověka mění, dále pak byla vybrána microRNA, která je při stanovování hodnot relativní exprese microRNA u člověka při sepsi používána jako referenční. 4) Porovnání rozdílů v hodnotách exprese vybraných microRNA mezi septickými a zdravými selaty. Byly stanoveny hodnoty relativní exprese vybraných microRNA, přičemž byly porovnány rozdíly v hodnotách exprese vybraných microRNA mezi septickými a zdravými selaty.
53
Z našich výsledků vyplynulo, že v hodnotách relativní exprese sledovaných microRNA (hsa-mir-192 a hsa-mir-182-5p) ve vzorcích jaterní tkáně a plazmy není mezi sledovanými skupinami selat žádný statisticky významný rozdíl. Přesto se domníváme, že molekuly microRNA mají při sepsi význam, jelikož to vyplývá ze studií provedených na pacientech trpících sepsí a zdravých lidech jinými výzkumnými skupinami. Pro naši další práci proto považujeme za důležité nalezení vhodného referenčního genu pro stanovování microRNA ze vzorků jaterní tkáně a plazmy gnotobiotických a konvenčních selat. Rozsáhlý výzkum molekul microRNA v posledních letech přináší mnoho poznání, odkrývá však další oblasti, které dosud poznány nebyly. Význam molekul microRNA při sepsi u prasat zatím není prostudován. Další výzkum této problematiky je velice zajímavý, jelikož prase je dobrý model, který je svou fyziologickou i morfologickou stránkou podobný člověku. Vzhledem k výše uvedenému se domníváme, že cíle této bakalářské práce byly splněny. Výsledky se lišily od očekávání, avšak další výzkum této problematiky by je mohl objasnit.
54
8. Seznam použitých zkratek ANOVA – analýza rozptylu (analysis of variance) Bp – pár bází (base pair) CV – konvenční cDNA – komplementární DNA (complementary DNA) DNA – deoxyribonukleová kyselina (deoxyribonucleic acid) DGCR8 - DiGeorge syndrome critical region gene 8 GF – bezmikrobní (germ-free) Gnotobiont – mikrobiologicky definovaný organismus Gnotobiotický – mikrobiologicky definovaný IL-18 – interleukin 18 LNA – uzamčená nukleová kyselina (lock nucleic acid) NFQ – nefluorescenční zhášeč (non fluorescent quencher) Nt – nukleotid PCR – polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction) RISC – RNA-induced silencing complex RNA – ribonukleová kyselina (ribonucleic acid) Rpm – otáčky za minutu (revolutions per minute) RT-qPCR - reverzní transkripce následovaná kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí (reverse transcription quantitative polymerase chain reaction) SEM – střední chyba průměru (standard error mean) SIRS – systémová zánětlivá odpověď (systemic infammatory response) UTR – nepřekládáná oblast (untranslated region)
55
9. Použitá literatura Alberts, B., 1994, Recombinant DNA Technology, Molecular Biology of the Cell: New York, Garland Science. Ambros, V., 2001, microRNAs: tiny regulators with great potential: Cell, v. 107, no. 7, str. 823-826.
Ambros, V., 2004, The functions of animal microRNAs: Nature, v. 431, no. 7006, str. 350-355. Andreasen, D., J. U. Fog, W. Biggs, J. Salomon, I. K. Dahslveen, A. Baker a P. Mouritzen, 2010, Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples: Methods, v. 50, no. 4, str. S6-S9.
Anonym01, 2014, Tips from the Bench: Stability of miRNA at Sub-Zero Temperatures, http://www.lifetechnologies.com/cz/en/home/references/ambiontech-support/microrna-studies/tech-notes/stability-of-mirna-at-sub-zerotemperatures.html, vid. 28. 4. 2014.
Anonym02, 2014, The Basics: RT-PCR https://www.lifetechnologies.com/ cz/en/home/references/ambion-tech-support/rtpcr-analysis/general-articles/ rt-pcr-the-basics.html?cfc-ck=1320855426155, vid. 28. 4. 2014 Anonym03, 2014, miScript II RT Kit,
http://www.qiagen.com/products/
applications/mirna-research/detection/miscript-ii-rt-kit?applicationflowStep={C73 48BEB-824C-4597-BCB8-91A2DD4EC0C4}&StepName=Detection&Page=2# productdetails, vid. 28. 4. 2014. Anonym04, 2014, TaqMan® Probes,
http://premierbiosoft.com/tech_notes/
TaqMan.html, vid. 28. 4. 2014. Anonym05,
2014,
DNA
polymerázy
a
pufry,
http://www.top-bio.cz/dna-
polymerazy-a-pufry-13.html, vid. 28. 4. 2014 Aronson, J. K., 2005, Biomarkers and surrogate endpoints: Br.J.Clin.Pharmacol., v. 59, no. 5, str. 491-494. 56
Bartel, D. P., 2009, MicroRNAs: target recognition and regulatory functions: Cell, v. 136, no. 2, str. 215-233. Blondal, T., N. S. Jensby, A. Baker, D. Andreasen, P. Mouritzen, T. M. Wrang a I. K. Dahlsveen, 2012, Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids 1: Methods.
Bone, R. C., R. A. Balk, F. B. Cerra, R. P. Dellinger, A. M. Fein, W. A. Knaus, R. M. Schein a W. J. Sibbald, 1992, Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. The ACCP/SCCM Consensus
Conference
Committee.
American
College
of
Chest
Physicians/Society of Critical Care Medicine: Chest, v. 101, no. 6, str. 1644-1655.
Bustin, S. A., V. Benes, T. Nolan a M. W. Pfaffl, 2005, Quantitative real-time RT-PCR - a perspective: J.Mol.Endocrinol., v. 34, no. 3, str. 597-601. Cai, X., C. H. Hagedorn a B. R. Cullen, 2004, Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs: RNA., v. 10, no. 12, str. 1957-1966.
Clerico, A. a M. Plebani, 2013, Biomarkers for sepsis: an unfinished journey: Clin.Chem.Lab Med., v. 51, no. 6, str. 1135-1138.
Dellinger, R. P., M. M. Levy, J. M. Carlet, J. Bion, M. M. Parker, R. Jaeschke, K. Reinhart, D. C. Angus, C. Brun-Buisson, R. Beale, T. Calandra, J. F. Dhainaut, H. Gerlach, M. Harvey, J. J. Marini, J. Marshall, M. Ranieri, G. Ramsay, J. Sevransky, B. T. Thompson, S. Townsend, J. S. Vender, J. L. Zimmerman a J. L. Vincent, 2008, Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2008: Crit Care Med., v. 36, no. 1, str. 296-327.
Denli, A. M., B. B. Tops, R. H. Plasterk, R. F. Ketting a G. J. Hannon, 2004, Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex: Nature, v. 432, no. 7014, str. 231-235.
57
Gregory, R. I., K. P. Yan, G. Amuthan, T. Chendrimada, B. Doratotaj, N. Cooch a R. Shiekhattar, 2004, The Microprocessor complex mediates the genesis of microRNAs: Nature, v. 432, no. 7014, str. 235-240.
Jawad, I., I. Luksic a S. B. Rafnsson, 2012, Assessing available information on the burden of sepsis: global estimates of incidence, prevalence and mortality: J.Glob.Health, v. 2, no. 1, str. 10404.
Kim, S. W., Z. Li, P. S. Moore, A. P. Monaghan, Y. Chang, M. Nichols a B. John, 2010, A sensitive non-radioactive northern blot method to detect small RNAs: Nucleic Acids Res., v. 38, no. 7, str. e98.
Kumar, A., P. Ellis, Y. Arabi, D. Roberts, B. Light, J. E. Parrillo, P. Dodek, G. Wood, A. Kumar, D. Simon, C. Peters, M. Ahsan a D. Chateau, 2009, Initiation of inappropriate antimicrobial therapy results in a fivefold reduction of survival in human septic shock: Chest, v. 136, no. 5, str. 1237-1248.
Lagos-Quintana, M., R. Rauhut, W. Lendeckel a T. Tuschl, 2001, Identification of novel genes coding for small expressed RNAs: Science, v. 294, no. 5543, str. 853-858.
Lee, R. C., R. L. Feinbaum a V. Ambros, 1993, The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14: Cell, v. 75, no. 5, str. 843-854. Lee, S. a S. Vasudevan, 2013, Post-transcriptional stimulation of gene expression by microRNAs: Adv.Exp.Med.Biol., v. 768, str. 97-126.
Lee, Y., C. Ahn, J. Han, H. Choi, J. Kim, J. Yim, J. Lee, P. Provost, O. Radmark, S. Kim a V. N. Kim, 2003, The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing: Nature, v. 425, no. 6956, str. 415-419.
58
Lee, Y., M. Kim, J. Han, K. H. Yeom, S. Lee, S. H. Baek a V. N. Kim, 2004, MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II: EMBO J., v. 23, no. 20, str. 4051-4060.
Levy, M. M., M. P. Fink, J. C. Marshall, E. Abraham, D. Angus, D. Cook, J. Cohen, S. M. Opal, J. L. Vincent a G. Ramsay, 2003, 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference: Intensive Care Med., v. 29, no. 4, str. 530-538.
Macfarlane, L. A. a P. R. Murphy, 2010, MicroRNA: Biogenesis, Function and Role in Cancer: Curr.Genomics, v. 11, no. 7, str. 537-561.
Mandel, L. a J. Travnicek, 1987, The minipig as a model in gnotobiology: Nahrung, v. 31, no. 5-6, str. 613-618.
Meurens, F., A. Summerfield, H. Nauwynck, L. Saif a V. Gerdts, 2012, The pig: a model for human infectious diseases: Trends Microbiol., v. 20, no. 1, str. 50-57. Miniats, O. P. a D. Jol, 1978, Gnotobiotic pigs-derivation and rearing: Can.J.Comp Med., v. 42, no. 4, str. 428-437.
Mraz, M., K. Malinova, J. Mayer a S. Pospisilova, 2009, MicroRNA isolation and stability in stored RNA samples: Biochem.Biophys.Res.Commun., v. 390, no. 1, str. 1-4.
Pasquinelli, A. E., B. J. Reinhart, F. Slack, M. Q. Martindale, M. I. Kuroda, B. Maller, D. C. Hayward, E. E. Ball, B. Degnan, P. Muller, J. Spring, A. Srinivasan, M. Fishman, J. Finnerty, J. Corbo, M. Levine, P. Leahy, E. Davidson a G. Ruvkun, 2000, Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA: Nature, v. 408, no. 6808, str. 86-89.
59
Reinhart, B. J., F. J. Slack, M. Basson, A. E. Pasquinelli, J. C. Bettinger, A. E. Rougvie, H. R. Horvitz a G. Ruvkun, 2000, The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans: Nature, v. 403, no. 6772, str. 901-906. Ririe, K. M., R. P. Rasmussen a C. T. Wittwer, 1997, Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction: Anal.Biochem., v. 245, no. 2, str. 154-160.
Rodriguez, A., S. Griffiths-Jones, J. L. Ashurst a A. Bradley, 2004, Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units: Genome Res., v. 14, no. 10A, str. 1902-1910. Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis a H. A. Erlich, 1988, Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase: Science, v. 239, no. 4839, str. 487-491. Saiki, R. K., S. Scharf, F. Faloona, K. B. Mullis, G. T. Horn, H. A. Erlich a N. Arnheim, 1992, Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. 1985: Biotechnology, v. 24, str. 476-480.
Schmittgen, T. D., E. J. Lee, J. Jiang, A. Sarkar, L. Yang, T. S. Elton a C. Chen, 2008, Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA: Methods, v. 44, no. 1, str. 31-38. Schwarz, D. S., G. Hutvagner, T. Du, Z. Xu, N. Aronin a P. D. Zamore, 2003, Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex: Cell, v. 115, no. 2, str. 199-208. Shingara, J., K. Keiger, J. Shelton, W. Laosinchai-Wolf, P. Powers, R. Conrad, D. Brown a E. Labourier, 2005, An optimized isolation and labeling platform for accurate microRNA expression profiling: RNA., v. 11, no. 9, str. 1461-1470.
60
Šmarda J., Doškař J., Pantůček R., Růžičková V., and Koptíková J., 2005, Amplifikace
nukleových
kyselin,
Metody
molekulární
biologie:
Brno,
Vydavatelství MU, Brno-Kraví Hora, str. 73-110. Sterzl, J. a A. M. Silverstein, 1967, Developmental aspects of immunity: Adv.Immunol., v. 6, str. 337-459. Tang, G., B. J. Reinhart, D. P. Bartel a P. D. Zamore, 2003, A biochemical framework for RNA silencing in plants: Genes Dev., v. 17, no. 1, str. 49-63.
Treiber, T., N. Treiber a G. Meister, 2012, Regulation of microRNA biogenesis and function: Thromb.Haemost., v. 107, no. 4, str. 605-610.
Varallyay, E., J. Burgyan a Z. Havelda, 2008, MicroRNA detection by northern blotting using locked nucleic acid probes: Nat. Protoc., v. 3, no. 2, str. 190-196.
Vasilescu, C., S. Rossi, M. Shimizu, S. Tudor, A. Veronese, M. Ferracin, M. S. Nicoloso, E. Barbarotto, M. Popa, O. Stanciulea, M. H. Fernandez, D. Tulbure, C. E. Bueso-Ramos, M. Negrini a G. A. Calin, 2009, MicroRNA fingerprints identify miR-150 as a plasma prognostic marker in patients with sepsis: PLoS.One., v. 4, no. 10, str. e7405.
Wang, H. J., B. Z. Wang, P. J. Zhang, J. Deng, Z. R. Zhao, X. Zhang, K. Xiao, D. Feng, Y. H. Jia, Y. N. Liu a L. X. Xie, 2014, Identification of four novel serum protein biomarkers in sepsis patients encoded by target genes of sepsis-related miRNAs: Clin.Sci.(Lond), v. 126, no. 12, str. 857-867.
Wang, J. F., M. L. Yu, G. Yu, J. J. Bian, X. M. Deng, X. J. Wan a K. M. Zhu, 2010, Serum miR-146a and miR-223 as potential new biomarkers for sepsis: Biochem.Biophys.Res.Commun., v. 394, no. 1, str. 184-188.
Wittes, J., E. Lakatos a J. Probstfield, 1989, Surrogate endpoints in clinical trials: cardiovascular diseases: Stat.Med., v. 8, no. 4, str. 415-425.
61
Zima J., Macholán M., Muclinger P., and Piálek P., 2004, Polymerázová řetězová reakce, Genetické metody v zoologii: Praha, Nakladatelství Karolinum, str. 126-137.
62
