Př íloha č . 2 k vyhláš ce MŽP č . 222/2004 Sb. METODY PRO ZKOUŠENÍ VLASTNOSTÍ NEBEZPEČNÝCH PRO ŽIVOTNÍ PROSTŘEDÍ I. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ TOXICITY PRO RYBY – metoda C.1 podle př ílohy smě rnice Komise 92/69/EHS ze dne 31. č ervence 1992, kterou se po sedmnácté přizpůsobuje technickému pokroku smě rnice Rady 67/548/EHS o sbliž ování správních a právních púředpúsůtýkajících se klasifikace, balení a označování nebezpeč ných látek (dále jen „směrnice 92/69/EHS“) I.1. I.1.1
I.1.2
I.1.3
I.1.4
I.1.5
METODA ÚVOD Úč elem této zkouš ky je stanovit akutní letální toxicitu látek pro sladkovodní ryby. Pro usnadně ní výbě ru nejvhodnějš í zkuš ební metody (statické, semistatické nebo průtokové) s cílem zajistit dostatečně konstantní koncentrace zkuš ební látky po celou dobu experimentu je ž ádoucí mít pokud možno k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě , o tenzi par, chemické stabilitě, disociač ních konstantách a o biologické rozlož itelnosti látky. Dalš í informace (např . strukturní vzorec, stupeňč istoty, povaha a podíl významných neč istot v procentech, př ítomnost a množ ství př ísad a rozdělovací koeficient n-oktanol/voda) je tř eba vzít v úvahu př i plánování zkouš ky i př i interpretaci výsledků. DEFINICE A JEDNOTKY Akutní toxicitou se rozumí zř etelný nepř íznivý úč inek, který je v krátké době(ř ádověve dnech) v organismu vyvolán expozicí látce. V této zkouš ce se akutní toxicita vyjadř uje prostř ednictvím stř ední letální koncentrace (LC50), tj. takové koncentrace látky ve vodě , která bě hem nepř etrž ité expozice po urč itou dobu způsobí úhyn 50 % jedincůve zkuš ební skupiněryb. Vš echny koncentrace zkuš ební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l-1). Mohou se také vyjádř it v hmotnostních podílech -1 (mg·kg ). REFERENČNÍ LÁTKY Zkouš ky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, ž e se reakce zkuš ebních druhůza laboratorních zkuš ebních podmínek podstatněnezmě nila. Referenč ní látky nejsou pro tuto zkouš ku stanoveny. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY Můž e být provedena limitní zkouš ka s koncentrací 100 mg·l-1, s cílem prokázat, že LC50 je vyš š í nežtato koncentrace. Ryby se vystaví úč inku různým koncentracím zkuš ební látky př idané do vody po dobu 96 h. Úhyn se zaznamenává nejméněkaždých 24 h a je-li to možné, vypočtou se př i kaž dém pozorování koncentrace, které způsobí úhyn 50 % ryb (LC50). KRITÉRIA JAKOSTI Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkouš ku, tak na úplný zkuš ební postup.
I.1.6
I.1.6.1 I.1.6.1.1
Mortalita v kontrolních skupinách nesmí být na konci zkouš ky vě tš í než 10 % (nebo jednu rybu, pokud se použ ije méněneždeset ryb). Koncentrace rozpuš tě ného kyslíku musí být po celou dobu zkouš ky vyš š í než60 % hodnoty nasycení vzduchem. Koncentrace zkuš ební látky nesmí po celou zkouš ky klesnout pod 80 % původních hodnot koncentrací. U látek, které se ve zkuš ebním médiu lehce rozpouš tě jí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míř e netě kají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze poč áteč ní koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, ž e byly koncentrace po celou zkouš ku udrž eny a ž e kritéria jakosti byla dodrž ena. U látek, které i) jsou ve zkuš ebním médiu š patněrozpustné, nebo ii) mohou vytvář et stabilní emulze nebo disperse, nebo iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní, musí být poč áteční koncentrace brána jako koncentrace namě ř ená v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci) na zač átku zkouš ky. Koncentrace se stanoví po urč ité dobějejího ustálení, avš ak př ed nasazením testovacích ryb. Ve vš ech uvedených př ípadech musí být během zkouš ky provedena dalš í měř ení s cílem potvrdit skuteč né expoziční koncentrace nebo dodrž ení kritérií jakosti. pH by se nemá změnit o více než1. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY Mohou být použ ity tř i postupy: Statická zkouš ka: Zkouš ka, př i nížzkuš ební roztok neprotéká. (Roztoky se během celé zkouš ky nemě ní.) Semistatická metoda: Zkouš ka, př i nížzkuš ební roztok neprotéká, ale je pravidelněpo delš ích č asových úsecích (např . po 24 h) zcela vymě ňován. Průtoková metoda: Zkouš ka toxicity, př i nížse voda ve zkuš ebních nádrž ích neustále obměňuje, př ič emžse zkuš ební látka př ivádí s vodou, kterou se zkuš ební médium obnovuje. Činidla Roztoky zkuš ebních látek Zásobní roztoky o pož adované koncentraci se př ipraví rozpuš tě ním látky v deionizované voděnebo ve voděpodle bodu 1.6.1.2. Zvolené zkuš ební koncentrace se př ipraví ř eděním zásobního roztoku. Jsou-li zkouš eny vysoké koncentrace látky, lze látku rozpustit př ímo vř edicí vodě. Látky se obvykle zkouš í aždo meze jejich rozpustnosti. U ně kterých látek (např . u látek s nízkou rozpustností ve voděnebo vysokou hodnotou P o/v, nebo u látek, které ve voděvytvář ejí spíš e stabilní disperse nežpravé roztoky) je mož né provést zkouš ku př i koncentraci vyš š í, nežje mez rozpustnosti, aby bylo zajiš tě no, ž e je dosaž eno maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě . Je ovš em nutné, aby tato koncentrace jinak nenaruš ovala zkuš ební systém (např . vytvoř ením filmu na hladiněbránícímu okyslič ení vody atd.).
I.1.6.1.2
I.1.6.2
I.1.6.3
I.1.6.3.1
Pro př ípravu zásobních roztokůlátek s nízkou rozpustností ve voděnebo pro usnadně ní rozptýlení látky ve zkuš ebním médiu lze použ ít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouš tědla či emulgátory nebo dispergátory. Použ ijí-li se takové pomocné látky, měly by vš echny zkuš ební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkuš ebních sériích by mě ly být exponovány dalš í kontrolní ryby. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném př ípaděby nemě la př ekroč it 100 mg na l zkuš ebního média. Zkouš ka se provede bez úpravy pH. Existují-li známky toho, ž e dochází k výrazné změ něpH, doporuč uje se zkouš ku opakovat s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém př ípaděse upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ř edě ní, pokud proti tomu neexistuji specifické důvody. Př i úpravěpH se dává př ednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkuš ební látky v zásobním roztoku v podstatné míř e změ ně na. Dojde-li úpravou ve zkuš ebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skuteč nosti se zaznamenají. Voda pro chov ryb a ř edě ní Můž e být použ ita pitná voda (nekontaminovaná potenciálněš kodlivými koncentracemi chloru, těž kých kovůnebo jiných látek), kvalitní př írodní voda nebo upravená voda (viz doplněk 1). Upř ednostňuje se voda o celkové tvrdosti od 10 do 250 mg·l1 (vztaž eno na CaCO 3) a pH od 6,0 do 8,5. Přístroje Veš keré př ístroje musí být vyrobeny z chemicky inertního materiálu: — systém pro automatické ř edě ní (pro průtokovou metodu), — př ístroj pro mě ř ení koncentrace kyslíku, — vybavení pro stanovení tvrdosti vody, — vhodný př ístroj pro mě ř ení teploty, — pH-metr. Testovací ryby Ryby by měly být zdravé a bez zjevných malformací. Použ itý druh by mě l být zvolen podle praktických kritérií, jako je jejich dostupnost po celý rok, snadný chov, vhodnost pro zkouš ení, relativní citlivost k chemickým látkám a jakékoli dalš í významné ekonomické a biologické faktory. Př i výběru druhu ryb by mě la být také zohledněna potř eba srovnatelnosti získaných dat a mezinárodní harmonizace (1). Seznam doporuč ených druhůryb pro provedení této zkouš ky je uveden v doplňku 2; dává se př ednost druhům danio pruhované a pstruh duhový. Chov Ryby by mě ly pocházet pokud mož no z jednoho chovu a mě ly by být stejné délky a stejného stář í. Ryby musí být chovány nejméně12 dní v následujících podmínkách: Obsádka: Vhodná vzhledem k metodě (metoda s recirkulací nebo průtoková metoda) a druhu ryb. Voda: Viz 1.6.1.2. Osvě tlení: Osvětlení 12 až16 h denně .
I.1.6.3.2
I.1.6.4
I.1.6.5
Koncentrace rozpuš tě ného kyslíku: Nejméně80 % hodnoty nasycení vzduš ným kyslíkem. Krmení: Tř ikrát týdněnebo jednou za den; vysazení krmení 24 h př ed začátkem zkouš ky. Mortalita Po 48hodinové aklimatizaci se zaznamená mortalita a použijí se následující kritéria: — mortalita vyš š í než10 % populace za 7 dní: celá obsádka ryb se vyř adí, — mortalita 5 až10 % populace: v chovu se pokračuje dalš ích 7 dní. Nedojde-li k dalš ím př ípadům úhynu, obsádka se použije, v opač ném př ípadě musí být vyř azena, — mortalita menš í než5 % populace: obsádka je pro zkouš ku použ itelná. Aklimatizace Vš echny ryby musí být nejméněna 7 dnůpř ed použ itím ve zkouš ce nasazeny do vody stejné kvality a stejné teploty, jaká se použ ije př i zkouš ce. Zkuš ební postup Př ed vlastní zkouš kou může být provedena př edbě žná zkouš ka s cílem získat informace o rozsahu koncentrací, které mají být použ ity v hlavní zkouš ce. Kroměsérií zkouš ek se provede kontrolní zkouš ka bez zkuš ební látky a podle potř eby kontrolní zkouš ka s pomocnou látkou. V závislosti na fyzikálních a chemických vlastnostech zkuš ební látky se zvolí statická, semistatická nebo průtoková zkouš ka, aby byla splněna kritéria jakosti. Ryby se exponují zkuš ební látce za níže uvedených podmínek: — délka expozice: 96 h; — poč et ryb: nejméně7 na každou koncentraci; — nádrž e: vhodný objem vzhledem k doporuč ené obsádce; — obsádka: pro statickou a semistatickou zkouš ku se doporuč uje 1,0 g na litr; v průtokovém systému je př ijatelná vyš š í obsádka; — zkuš ební koncentrace: nejméně pět koncentrací, které jsou odstupňovány faktorem nepř evyš ujícím 2,2 a které pokrývají rozsah mortality od 0 % do 100 %; — voda: viz 1.6.1.2; — osvětlení: osvě tlení 12 až16 h denně ; — teplota: podle druhu ryb (doplně k 2), avš ak v rámci dané zkouš ky kolísající v toleranci ±1 °C; — koncentrace rozpuš tě ného kyslíku: ne nižš í než60 % hodnoty nasycení vzduš ným kyslíkem př i dané teplotě ; — krmení: ž ádné. Ryby se kontrolují po prvních 2 až4 h a dále nejméněkaždých 24 h. Ryby se považ ují za mrtvé, jestliž e př i dotyku ocasní ploutve nedochází k ž ádné reakci a nejsou-li patrné ž ádné dýchací pohyby. Mrtvé ryby se odstraní, jakmile jsou zpozorovány, a úhyn se zaznamená.
I.2
I.3
Zaznamenají se vš echny zjevné abnormality (např . ztráta rovnováhy, změ ny v plavání, chování, v dýchací funkci, v pigmentaci atd.). Mě ř ení pH, obsahu rozpuš tě ného kyslíku a teploty se provádí denně. Limitní zkouš ka S využitím postupůpopsaných v této metoděmůže být provedena limitní zkouš ka s koncentrací 100 mg·l-1 s cílem prokázat, ž e LC50 je vyš š í než tato koncentrace. Je-li povaha zkuš ební látky taková, že ve vodě nelze dosáhnout koncentrace 100 mg·l 1, provede se limitní zkouš ka př i koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použ itém médiu (nebo př i maximální koncentraci, kdy látka vytvář í stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1). Limitní zkouš ka se provede se 7 až10 rybami a se stejným poč tem ryb v kontrole (kontrolách). (Podle teorie binomického rozdělení je př i použití 10 ryb a př i nulové mortalitě99,9% pravdě podobnost, že je LC50 větš í než 100 mg·l -1. Př i 7, 8 nebo 9 rybách znamená nulová mortalita nejméně99% pravděpodobnost, ž e je LC 50 vě tš í nežkoncentrace použitá v limitní zkouš ce.) Dojde-li k úhynům, musí se provést celá studie. Jsou-li pozorovány subletální úč inky, zaznamenají se. DATA A HODNOCENÍ Na pravdě podobnostní logaritmický papír se pro kaž dé období, kdy byla prováděna pozorování (24, 48, 72 a 96 h), vynese pro kaž dou expozič ní dobu mortalita v procentech proti koncentraci. Pokud je to mož né, odhadnou se standardními postupy pro kaž dou délku expozice hodnoty LC50 a meze spolehlivosti (p = 0,05); tyto hodnoty se zaokrouhlí na jednu, nebo nejvýš e na dvě platné číslice (př íklad zaokrouhlení na dvěplatné č íslice: 173,5 se zaokrouhlí na 170, 0,127 na 0,13, 1,21 na 1,2). V př ípadech, kdy je sklon kř ivky závislosti mortality v procentech na koncentraci látky př ílišstrmý, aby umožnil výpočet hodnoty LC50, postačuje grafický odhad této hodnoty. Jestliž e dvěpo sobějdoucí koncentrace liš ící se faktorem 2,2 vyvolají mortalitu 0 a 100 %, jsou dostateč nou informací o tom, ž e se LC50 nachází mezi tě mito hodnotami. Zjistí-li se, že není mož né udrž et stabilitu nebo homogenitu zkuš ební látky, uvede se to ve zprávěa výsledky se interpretují s opatrností. ZPRÁVY Protokol o zkouš ce má pokud mož no obsahovat následující údaje: — údaje o testovacích rybách (vě decký název, kmen, dodavatel, veš kerá př edchozí oš etř ení, velikost a počet ryb použ itých př i kaž dé zkuš ební koncentraci); — zdroj ř edicí vody a hlavní chemické charakteristiky (pH, tvrdost, teplota); — u látek s malou rozpustností ve voděúdaj o metoděpř ípravy zásobních a zkuš ebních roztoků; — koncentrace vš ech pomocných látek; — př ehled použ itých koncentrací a veš keré dostupné informace o stabilitězkuš ební látky ve zkuš ebním roztoku př i použ itých koncentracích;
—
I.4
jestliž e byly provedeny chemické analýzy, údaje o použ itých metodách a získané výsledky; — výsledek limitní zkouš ky, pokud byla provedena; — důvody pro volbu použ itého zkuš ebního postupu a podrobnosti o ně m (např . statický, semistatický, dávkování, průtoková rychlost, zda byla voda provzduš ňována obsádka ryb atd.); — popis zkuš ebního zař ízení; — světelný rež im; — koncentrace rozpuš tě ného kyslíku, hodnoty pH, teplota zkuš ebních roztokůkaž dých 24 h; — důkaz, že byla splně na kritéria jakosti; — tabulka kumulativních hodnot mortality př i kaž dé koncentraci a př i kontrolní zkouš ce (a popř ípadě př i kontrolní zkouš ce s pomocnou látkou) př i kaž dé z doporuč ených dob pozorování; — graf kř ivky závislosti účinku, vyjádř eného v procentech, na koncentraci na konci zkouš ky; — podle možnosti hodnoty LC50 př i každé z doporučených dob pozorování (př i 95% intervalu spolehlivosti); — použ ité statistické metody stanovení hodnot LC50 ; — př i použ ití referenč ní látky a údaj o získaných výsledcích; — nejvyš š í zkuš ební koncentrace, která nevyvolala za dobu zkouš ky úhyn ryb; — nejniž š í zkuš ební koncentrace, která vyvolala za dobu zkouš ky 100 % mortalitu. LITERATURA (1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C(81) 30 final and updates. (2) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio – Static and Flow Through methods – NFT 90-303, June 1985. (3) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri – Static and Flow-Through methods – NFT 90-305, June 1985. (4) ISO 7346/1, /2, /3 – Water Quality – Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan – Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part : Semi-static method. Part 3: Flow-through method. (5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden – Part II 1974. (6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L (15). (7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish. (8) NEN 6506 – Water – Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980. (9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.
(10)
(11) (12) (13)
(14)
(15) (16) (17) (18)
(19)
(20)
Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978. Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979. Standard methods for the examination of water and wastewater, 14th ed., APHA-AWWA-WPCF, 1975. Commission of the European Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979. Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten FischTest. Rudolph, P., Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986. Litchfield, J. T., Wilcoxon, F. A simplified method for evaluating dose effects experiments. J. Pharm, Exp. Therap., 1949, 96, 99. Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978. Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, 3, 793-821. Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, 4, 332. Stephan, C. E. Methods for calculating an LC 50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (F. I. Mayer, J. L. Hamelink (eds.)). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84. Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J., Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50 . US EPA. DODATEK 1 Upravená voda
Př íklad vhodné ř edicí vody Vš echny chemikálie musí být čistoty p.a. Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menš í než5 µS·cm1. Destilač ní př ístroj nesmí obsahovat ž ádné mě dě né č ásti. Zásobní roztoky: CaCl2·2H2O (chlorid vápenatý dihydrát) 11,76 g se rozpustí ve voděa doplní vodou na 1 litr. MgSO4·7H2O (síran hoř eč natý heptahydrát) 4,93 g se rozpustí ve voděa doplní vodou na 1 litr. NaHCO3 (hydrogenuhličitan sodný) 2,59 g se rozpustí ve voděa doplní vodou na l litr. KCl (chlorid draselný) 0,23 g se rozpustí ve voděa doplní vodou na 1 litr.
Upravená ř edicí voda Smísí se po 25 ml vš ech čtyřzásobních roztokůa doplní vodou na 1 litr. Provzduš ňuje se, dokud koncentrace rozpuš těného kyslíku neodpovídá koncentraci nasycení vzduš ným kyslíkem. pH musí být 7,8 ± 0,2. Podle potř eby se pH upraví pomocí NaOH (hydroxid sodný) nebo HCl (kyselina chlorovodíková). Tato ř edicí voda se nechá 12 h stát a nesmí být dále provzduš ňována. Koncentrace úhrnu iontůCa a Mg v tomto roztoku je 2,5 mmol·l 1. Pomě r množství iontůCa : Mg je 4 : 1 a pomě r množ ství iontůNa : K je 10 : 1. Celková koncentrace alkalických kovův tomto roztoku je 0,8 mmol·l1. Jakákoli odchylka v př ípravěvody k ř edě ní nesmí změ nit slož ení ani vlastnosti vody. DODATEK 2 Druhy ryb doporučené pro zkouš ení Doporučený druh Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton - Buchanan), danio pruhované Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque), stř evle Cyprinus carpio (Teleostei Cyprinidae) (Linneanus 1758), kapr obecný Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Tomminck a Schlegel 1850), halančík japonský Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters 1859), živorodka duhová Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque, Linneanus 1758), slunečnice modrá Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum 1988), pstruh duhový Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae) (Linneanus 1758), jelec jesen
Doporuč ený rozsah teplot př i zkouš ce (°C) 20 až24
Doporuč ená celková délka ryb (cm) 3,0 ± 0,5
20 až24
5,0 ± 2,0
20 až24
6,0 ± 2,0
20 až24
3,0 ± 1,0
20 až24
3,0 ± 1,0
20 až24
5,0 ± 2,0
12 až17
6,0 ± 2,0
20 až24
6,0 ± 2,0
Opatř ování ryb Ryby uvedené v seznamu se snadno chovají nebo jsou dobř e dostupné po celý rok. Lze je množit a chovat buďv rybích farmách, nebo v laboratoř i za kontrolovaných zdravotních a parazitologických podmínek tak, aby ryby byly zdravé a byly známého původu. Tyto ryby jsou dostupné v mnoha č ástech svě ta.
DODATEK 3 Př íklad kř ivky závislosti úmrtnosti, vyjádřené v procentech, na koncentraci Př íklad stanovení LC 50 na pravděpodobnostním logaritmickém papíru
Mortalita v % (pravděpodobnostní stupnice)
Koncentrace (logaritmická stupnice)
II. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ TOXICITY PRO DAFNIE – metoda C.2 podle př ílohy smě rnice 92/69/EHS II.1 II.1.1
METODA ÚVOD Úč elem této zkouš ky je stanovit stř ední úč innou koncentraci látky pro imobilizaci (EC50) dafnií ve sladkovodním prostř edí. Př ed započetím zkouš ky je ž ádoucí mít pokud mož no k dispozici údaje o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, chemické stabilitě , disociač ních konstantách a o biologické rozložitelnosti látky.
II.1.2
II.1.3
II.1.4
II.1.5.
Dalš í informace (např . strukturní vzorec, stupeňč istoty, povaha a podíl významných neč istot v procentech, př ítomnost a množ ství př ísad a rozdělovací koeficient n-oktanol/voda) je tř eba vzít v úvahu př i plánování zkouš ky i př i interpretaci výsledků. DEFINICE A JEDNOTKY Pož adavek smě rnice stanovit LC 50 pro dafnie se považ uje za splně ný stanovením EC50, jak je popsáno v této zkuš ební metodě . Akutní toxicita se v této zkouš ce vyjadř uje stř ední úč innou koncentrací látky pro imobilizaci (EC50) dafnií. Je to koncentrace (rozumí se výchozí koncentrace), která během nepř etržité expozice po urč itou stanovenou dobu imobilizuje 50 % dafnií ve zkuš ební skupiněbě hem doby působení (doby expozice). Imobilizace: Dafnie, které nejsou schopné do 15 s po lehkém zatř epání zkuš ební nádrží zač ít plavat, se považují za imobilizované. Vš echny koncentrace zkuš ební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l-1). Mohou se také vyjádř it v hmotnostních podílech -1 (mg·kg ). REFERENČNÍ LÁTKY Zkouš ky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, ž e se reakce zkuš ebních druhůza laboratorních zkuš ebních podmínek podstatněnezmě nila. Souhrn výsledkůokruž ního testu laboratoř í EHS s použ itím č tyřrůzných látek je uveden v doplňku 2. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY Můž e být provedena limitní zkouš ka s koncentrací 100 mg·l-1, s cílem prokázat, že EC50 je vyš š í nežtato koncentrace. Dafnie se 48 h exponují zkuš ební látce př idané v různých koncentracích do vody. Použ ije-li se kratš í doba, zdůvodní se ve zprávě. Za jinak stejných experimentálních podmínek a v př iměř eném rozmezí koncentrací zkuš ební látky působí různé koncentrace zkuš ební látky na schopnost plavání dafnií rozdílně. Různé koncentrace mají za následek skutečnost, že na konci zkouš ky ztrácí různý procentuální podíl dafnií schopnost plavat. Koncentrace, které nezpůsobují ž ádnou imobilizaci nebo způsobují 100% imobilizaci, se zjistí př ímo pozorováním, zatímco hodnota 48hodinová EC 50 se stanoví podle možnosti výpoč tem. Př i této metoděse používá statický systém, zkuš ební roztoky se tedy bě hem doby expozice neobnovují. KRITÉRIA JAKOSTI Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkouš ku, tak na úplný zkuš ební postup. Imobilizace v kontrolních zkouš kách nesmí být na konci zkouš ky větš í než10 %. Dafnie se v kontrolních zkouš kách nesmí trvale zdrž ovat u hladiny. Koncentrace rozpuš těného kyslíku ve zkuš ební nádrži musí být po celou dobu zkouš ky vyš š í než 3 mg·l-1. Koncentrace kyslíku vš ak nesmí -1 vž ádném př ípaděklesnout pod 2 mg·l . Koncentrace zkuš ební látky nesmí po celou zkouš ky klesnout pod 80 % původní hodnoty koncentrace.
II.1.6 II.1.6.1 II.1.6.1.1
U látek, které se ve zkuš ebním médiu lehce rozpouš tě jí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míř e netě kají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze poč áteč ní koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, ž e byly koncentrace po celou zkouš ku udrž eny a ž e kritéria jakosti byla dodrž ena. U látek, které i) jsou ve zkuš ebním médiu š patněrozpustné, nebo ii) mohou vytvář et stabilní emulze nebo disperse, nebo iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní, musí být poč áteční koncentrace brána jako koncentrace namě ř ená v roztoku (nebo, není-li to technicky možné, ve vodním sloupci) na zač átku zkouš ky. Koncentrace se stanoví po urč ité dobějejího ustálení, avš ak př ed nasazením testovacích organismů. Ve vš ech uvedených př ípadech musí být během zkouš ky provedena dalš í měř ení s cílem potvrdit skuteč né expoziční koncentrace nebo dodrž ení kritérií jakosti. pH by se nemělo změ nit o více než1. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY Činidla Roztoky zkuš ebních látek Zásobní roztoky o pož adované koncentraci se př ipraví rozpuš tě ním látky v deionizované voděnebo ve voděpodle bodu 1.6.1.2. Zvolené zkuš ební koncentrace se př ipraví ř eděním zásobního roztoku. Jsou-li zkouš eny vysoké koncentrace látky, lze látku rozpustit př ímo vř edicí vodě. Látky se obvykle zkouš ejí aždo meze jejich rozpustnosti. U ně kterých látek (např . u látek s nízkou rozpustností ve voděnebo vysokou hodnotou Po/v , nebo u látek, které ve voděvytvář ejí spíš e stabilní disperse nežpravé roztoky) je mož né provést zkouš ku př i koncentraci vyš š í, nežje mez rozpustnosti, aby bylo zajiš tě no, ž e je dosaž eno maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě . Je ovš em nutné, aby tato koncentrace jinak nenaruš ovala zkuš ební systém (např . vytvoř ením filmu na hladiněbránícímu okyslič ení vody atd.). Pro př ípravu zásobních roztokůlátek s nízkou rozpustností ve voděnebo pro usnadně ní rozptýlení látky ve zkuš ebním médiu lze použ ít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouš tědla či emulgátory nebo dispergátory. Použ ijí-li se takové pomocné látky, měly by vš echny zkuš ební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkuš ebních sériích by mě ly být exponovány dalš í kontrolní dafnie. Koncentrace pomocných látek by měly být minimální a v ž ádném př ípaděby nemě la př ekročit 100 mg/l zkuš ebního média. Zkouš ka se provede bez úpravy pH. Existují-li známky toho, ž e dochází k výrazné změ něpH, doporuč uje se zkouš ku opakovat s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém př ípaděse upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ř edě ní, pokud proti tomu neexistuji specifické důvody. Př i úpravěpH se dává př ednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkuš ební látky v zásobním roztoku v podstatné míř e změ ně na. Dojde-li úpravou ve zkuš ebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skuteč nosti se zaznamenají ve zprávě.
II.1.6.1.2
II.1.6.2
II.1.6.3
II.1.6.4
Zkuš ební voda Pro tuto zkouš ku se použ ije upravená voda (viz doplně k 1 a odkaz (2): ISO 6341). Aby nebylo nutné aklimatizovat dafnie př ed zkouš kou, doporuč uje se, aby byla voda pro kultivaci podobné jakosti (pH, tvrdost), jako voda pro zkouš ku. Přístroje Použ ijí se běž né laboratorní př ístroje a zař ízení. Zař ízení, které př ijde do styku se zkuš ebními roztoky, by mělo být nejlépe skleněné: — př ístroj pro mě ř ení koncentrace kyslíku (s mikroelektrodou, nebo jiný vhodný př ístroj na mě ř ení koncentrace rozpuš těného kyslíku ve vzorcích malého objemu), — vhodný př ístroj pro mě ř ení teploty, — pH-metr, — vybavení pro stanovení tvrdosti vody. Testovací organismy Př ednost se dává druhu Daphnia magna, ač koliv se př ipouš tí také druh Daphnia pulex. Testovací dafnie musí být na zač átku zkouš ky mladš í než 24 h, musí být laboratorněodchované, bez zjevných nemocí a musí být známého původu (např . chov, př edchozí oš etř ení, atd.). Zkuš ební postup Př ed vlastní zkouš kou může být provedena př edbě žná zkouš ka s cílem získat informace o rozsahu koncentrací, které mají být použ ity v hlavní zkouš ce. Kroměsérií zkouš ek se provede kontrolní zkouš ka bez zkuš ební látky a podle potř eby kontrolní zkouš ka s pomocnou látkou. Dafnie se exponují zkuš ební látce následujícím způsobem: — délka expozice: 48 h, — poč et dafnií: nejméně20 na každou zkuš ební koncentraci, nejlépe rozdě lených na č tyř i skupiny po pě ti dafniích nebo na dvě skupiny po 10 dafniích, — obsádka: na každou dafnii by mě ly př ipadat 2 ml zkuš ebního roztoku, — zkuš ební koncentrace: zkuš ební roztok se př ipraví bezprostř edně př ed nasazením dafnií, nejlépe bez použ ití jiného rozpouš tě dla nežvody. Př ipraví se koncentrace tvoř ící geometrickou ř adu, př ič emžpomě r mezi koncentracemi nesmí být vyš š í než2,2. Zároveňs kontrolami se zkouš ejí koncentrace dostateč né pro to, aby po 48 h vyvolaly nulovou nebo a 100% imobilizaci, a dále mezilehlé koncentrace umož ňující výpočet 48hodinové EC50, — voda: viz 1.6.1.2, — osvě tlení: stř ídání světla a tmy je libovolné, — teplota: zkuš ební teplota by měla být 18 až22 °C, avš ak v rámci dané zkouš ky kolísající v tomto rozmezí maximálněo ±1 °C, — provzduš ňování: zkuš ební roztok nesmí být provzduš ňován probubláváním, — krmení: žádné. Mě ř ení pH a obsahu rozpuš tě ného kyslíku v kontrolních skupinách a u vš ech zkuš ebních koncentrací se provede na konci zkouš ky; pH zkuš ebního roztoku nesmí být mě ně no.
II.2
II.3
Těkavé slouč eniny se zkouš ejí v hermeticky uzavř ených nádobách naplně ných po okraj, dostatečněvelkých, aby nedoš lo k nedostatku kyslíku. Prohlídka dafnií se provede nejpozději po 24 h a znovu po 48 h. Limitní zkouš ka S využitím postupůpopsaných v této metoděmůže být provedena limitní zkouš ka s koncentrací 100 mg·l-1 s cílem prokázat, ž e EC50 je vyš š í než tato koncentrace. Je-li povaha zkuš ební látky taková, že ve vodě nelze dosáhnout koncentrace 100 mg·l 1, provede se limitní zkouš ka př i koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použ itém médiu (nebo př i maximální koncentraci, kdy látka vytvář í stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1). Limitní zkouš ka se provede s 20 dafniemi rozdělenými do dvou nebo čtyř skupin a se stejným poč tem v kontrolní skupině (v kontrolních skupinách). Dojde-li k imobilizaci, musí se provést celá studie. DATA A HODNOCENÍ Na pravdě podobnostní logaritmický papír se pro kaž dé období, kdy byla prováděna pozorování (24 a 48 h), vynese mortalita v procentech proti koncentraci. Pokud je to mož né, odhadnou se pro kaž dé pozorovací období EC50 a meze spolehlivosti (p = 0,05); tyto hodnoty se zaokrouhlí na jednu, nebo nejvýš e na dvěplatné č íslice (př íklad zaokrouhlení na dvěplatné č íslice: 173,5 se zaokrouhlí na 170, 0,127 na 0,13, 1,21 na 1,2). V př ípadech, kdy je sklon kř ivky závislosti mortality v procentech na koncentraci látky př ílišstrmý, aby umožnil výpočet hodnoty EC50, postačuje grafický odhad této hodnoty. Jestliž e dvěpo sobějdoucí koncentrace liš ící se faktorem 2,2 vyvolají nulovou a 100% imobilizaci, jsou dostatečnou informací o rozpě tí, ve kterém EC 50 leží. Zjistí-li se, že není mož né udrž et stabilitu nebo homogenitu zkuš ební látky, uvede se to ve zprávěa výsledky se interpretují s opatrností. ZPRÁVY Protokol o zkouš ce má pokud mož no obsahovat následující údaje: — údaje o testovacím organismu (vě decký název, kmen, dodavatel nebo původ, veš kerá př edchozí oš etř ení, metoda chovu – vč etně původu, druhu a množství potravy, frekvence krmení); — zdroj ř edicí vody a hlavní chemické charakteristiky (pH, teplota, tvrdost); — u látek s malou rozpustností ve voděúdaj o metoděpř ípravy zásobních a zkuš ebních roztoků; — koncentrace vš ech pomocných látek; — př ehled použ itých koncentrací a veš keré dostupné informace o stabilitězkuš ební látky ve zkuš ebním roztoku př i použ itých koncentracích; — jestliž e byly provedeny chemické analýzy, údaje o použ itých metodách a získané výsledky; — výsledek limitní zkouš ky, pokud byla provedena; — popis zkuš ebního zař ízení; — světelný rež im;
—
II.4
koncentrace rozpuš tě ného kyslíku, hodnoty pH, teplota zkuš ebních roztoků; — důkaz, že byla splně na kritéria jakosti; — tabulka kumulativních hodnot imobility př i kaž dé koncentraci a př i kontrolní zkouš ce (a popř ípadě př i kontrolní zkouš ce s pomocnou látkou) př i kaž dé z doporuč ených dob pozorování (24 a 48 h); — graf kř ivky závislosti účinku, vyjádř eného v procentech, na koncentraci na konci zkouš ky; — podle možnosti hodnoty EC50 př i každé z doporučených dob pozorování (př i 95% intervalu spolehlivosti) — použ ité statistické metody stanovení hodnot EC 50; — př i použ ití referenč ní látky údaj o získaných výsledcích; — nejvyš š í zkuš ební koncentrace, která nevyvolala za dobu zkouš ky imobilizaci; — nejniž š í zkuš ební koncentrace, která vyvolala za dobu zkouš ky 100% imobilizaci. LITERATURA (1) OECD, Paris, 1981, Test Guidelines 202, Decision of the Council C(81) 30 final and updates. (2) International Standard ISO, Water Quality – Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341-1989. (3) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera – crustacea) NFT 90 301 (January 1983). (4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-Test. Rudolph, P., Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986. (5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (L11). (6) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978. (7) Litchfield, J. T., Wilcoxon, F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. Exper. Ther., 1949, 96, 99-113. (8) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, 3, 793-821. (9) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, 4, 332. (10) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC 50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (F. I. Mayer, J. L. Hamelink (eds.)). American Society for Testing and Materials. ASTM, 1977, STP 634, 65-84. (11) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J., Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA. DODATEK 1 Upravená voda
Př íklad vhodné ř edicí vody (podle ISO 6341) Vš echny chemikálie musí být čistoty p.a. Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menš í 1 než5 µS·cm . Destilač ní př ístroj nesmí obsahovat ž ádné mě dě né č ásti. Zásobní roztoky: CaCl2·2H2O (chlorid vápenatý dihydrát) 11,76 g se rozpustí ve voděa doplní vodou na 1 litr. MgSO4·7H2O (síran hoř eč natý heptahydrát) 4,93 g se rozpustí ve voděa doplní vodou na 1 litr. NaHCO3 (hydrogenuhličitan sodný) 2,59 g se rozpustí ve voděa doplní vodou na l litr. KCl (chlorid draselný) 0,23 g se rozpustí ve voděa doplní vodou na 1 litr. Upravená ř edicí voda Smísí se po 25 ml vš ech čtyřzásobních roztokůa doplní vodou na 1 litr. Provzduš ňuje se, dokud koncentrace rozpuš těného kyslíku neodpovídá koncentraci nasycení vzduš ným kyslíkem. pH musí být 7,8 ± 0,2. Podle potř eby se pH upraví pomocí NaOH (hydroxid sodný) nebo HCl (kyselina chlorovodíková). Tato ř edicí voda se nechá 12 h stát a nemusí být dále provzduš ňována. Koncentrace úhrnu iontůCa a Mg v tomto roztoku je 2,5 mmol·l 1. Pomě r množství iontůCa : Mg je 4 : 1 a pomě r množ ství iontůNa : K je 10 : 1. Celková koncentrace alkalických kovův tomto roztoku je 0,8 mmol·l1. Jakákoli odchylka v př ípravěvody k ř edě ní nesmí změ nit slož ení ani vlastnosti vody. DODATEK 2 Souhrn výsledků kruhového testu EHS provedeného v roce 1978 (citovaného také v (2)). Upozorně ní: úč elem tohoto kruhového testu bylo stanovení 24hodinové hodnoty EC 50. Použ ité látky: 1) Dichroman draselný 2) Kyselina tetrapropylbenzensulfonová 3) Kyselina tetrapropylbenzensulfonová, sodná sůl 4) Kyselina 2,4,5-trichlorfenoxyoctová, draselná sůl Látka
Počet zúč astněných laboratoř í
Poč et výsledkůpro výpoč et
1 2 3 4
46 36 31 32
129 108 84 72
Stř ední hodnota 24hodinové EC50 mg/l 1,5 27 27 770
DODATEK 3 Př íklad závislosti imobilizace, vyjádř ené v procentech, na koncentraci Př íklad stanovení EC 50 s použitím pravděpodobnostního logaritmického papíru
Imobilizace v %
III. METODA PRO STANOVENÍ INHIBICE RŮSTU ŘAS – metoda C.3 podle př ílohy směrnice 92/69/EHS III.1 III.1.1
METODA ÚVOD Úč elem této zkouš ky je stanovit úč inky látky na růst jednobuně čných zelených ř as. Relativněkrátkodobými zkouš kami (72 h) lze posoudit úč inky na několik generací ř as. Tato metoda může být upravena pro
III.1.2
III.1.3
III.1.4
III.1.5.
použ ití s ně kolika druhy ř as, př ič emžmusí být v protokolu o zkouš ce uveden popis metody. Použ ití metody je nejsnadně jš í v př ípadělátek rozpustných ve vodě , které za podmínek zkouš ky pravdě podobnězůstávají ve vodě . Metodu lze použít pro látky, které př ímo neovlivňují mě ř ení růstu ř as. Je ž ádoucí mít př ed započ etím zkouš ky k dispozici co nejúplně jš í údaje o rozpustnosti látky ve vodě , o tenzi par, chemické stabilitě , disociač ních konstantách a o biologické rozlož itelnosti látky. Dalš í informace (např . strukturní vzorec, stupeňč istoty, druh a podíl významných neč istot v procentech, př ítomnost a množ ství př ísad a rozdělovací koeficient n-oktanol/voda) je tř eba vzít v úvahu př i plánování zkouš ky i př i interpretaci výsledků. DEFINICE A JEDNOTKY Hustota buněk: poč et buně k na jeden mililitr. Růst: zvyš ování hustoty buněk bě hem doby trvání zkouš ky. Růstová rychlost: nárůst hustoty buně k za jednotku č asu. EC50: v této metodějde o koncentraci zkuš ební látky, která má za následek 50% sníž ení růstu (EbC50) nebo růstové rychlosti (ErC50) vzhledem ke kontrole. NOEC (no observed effect concentration): v této metodějde o je nejvyš š í zkouš enou koncentraci, př i nížnení pozorováno ž ádné významné sníž ení růstu nebo růstové rychlosti ve srovnání s kontrolou. Vš echny koncentrace zkuš ební látky se udávají v hmotnosti na jednotku objemu (mg·l-1). Mohou se také vyjádř it v hmotnostních podílech -1 (mg·kg ). REFERENČNÍ LÁTKY Zkouš ky s referenčními látkami mohou být provedeny s cílem prokázat, ž e se reakce zkuš ebních druhůza laboratorních zkuš ebních podmínek podstatněnezmě nila. Př i použití referenč ní látky musí být výsledky uvedeny do protokolu o zkouš ce. Jako referenč ní látka můž e být použit dichroman draselný, ale jeho barva můž e ovlivnit kvalitu a intenzitu světla dostupného buňkám a také spektrofotometrická mě ř ení, pokud se použ ijí. Dichroman draselný byl použ it v mezinárodních mezilaboratorních testech (viz (3) a doplněk 2). PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY Můž e být provedena limitní zkouš ka s koncentrací 100 mg·l-1, s cílem prokázat, že EC50 je vyš š í nežtato koncentrace. Exponenciálněrostoucí kultury vybraných zelených ř as jsou po ně kolik generací vystaveny za definovaných podmínek různým koncentracím zkuš ební látky. Zkuš ební roztoky se kultivují 72 h, bě hem nichžse alespoňkaždých 24 h měř í hustota buně k v kaž dém roztoku. Stanoví se sníž ení růstu ve srovnání s kontrolní kulturou. KRITÉRIA JAKOSTI Kritéria jakosti se vztahují jak na limitní zkouš ku, tak na celý zkuš ební postup. Hustota buně k v kontrolních kulturách by se mě la za 3 dny zvýš it alespoň š estnáctkrát.
Koncentrace zkuš ební látky nesmí po celou zkouš ky klesnout pod 80 % původní hodnoty koncentrace. U látek, které se ve zkuš ebním médiu lehce rozpouš tě jí a dávají stabilní roztoky, tj. v podstatné míř e netě kají, nerozkládají se, nehydrolyzují nebo se neadsorbují, lze poč áteč ní koncentraci pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. Musí být potvrzeno, ž e byly koncentrace po celou zkouš ku udrž eny a ž e kritéria jakosti byla dodrž ena. U látek, které i) jsou ve zkuš ebním médiu š patněrozpustné, nebo ii) mohou vytvář et stabilní emulze nebo disperse, nebo iii) jsou ve vodných roztocích nestabilní, musí být poč áteční koncentrace brána jako koncentrace namě ř ená v roztoku na zač átku zkouš ky. Koncentrace se stanoví po určité době jejího ustálení. Ve vš ech uvedených př ípadech musí být během zkouš ky provedena dalš í měř ení s cílem potvrdit skuteč né expoziční koncentrace nebo dodrž ení kritérií jakosti. Je známo, ž e podstatná č ást zkuš ební látky může být bě hem zkouš ky zabudována do biomasy ř as. Proto by se za úč elem prokázání dodrž ení kritérií jakosti mě lo brát v úvahu jak množ ství látky zabudované do biomasy ř as, tak látka v roztoku (nebo, není-li to technicky mož né, ve vodním sloupci). Protože vš ak stanovení koncentrace látky v biomase ř as může př edstavovat technické obtíž e, můž e být dodrž ení kritérií jakosti prokázáno zkouš kou s nejvyš š í koncentrací látky, ale bez ř as, a mě ř ením koncentrací v roztoku (nebo, není-li to technicky mož né, ve vodním sloupci) na zač átku a na konci zkouš ky. III.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍHO POSTUPU III.1.6.1 Činidla III.1.6.1.1 Roztoky zkuš ebních látek Zásobní roztoky o pož adované koncentraci se př ipraví rozpuš tě ním látky v deionizované voděnebo ve voděpodle bodu 1.6.1.2. Zvolené zkuš ební koncentrace se př ipraví př idáním vhodného alikvotního podílu k př edkulturám ř as (viz doplněk 1). Látky se obvykle zkouš ejí aždo meze jejich rozpustnosti. U ně kterých látek (např . u látek s nízkou rozpustností ve voděnebo vysokou hodnotou Po/v nebo u látek, které ve voděvytvář ejí spíš e stabilní disperse nežpravé roztoky) je mož né provést zkouš ku př i koncentraci vyš š í, nežje mez rozpustnosti, aby bylo zajiš tě no, ž e je dosaž eno maximální koncentrace odpovídající maximální rozpustnosti/stabilitě . Je ovš em nutné, aby tato koncentrace jinak nenaruš ovala zkuš ební systém (např . vytvoř ením filmu na hladiněbránícímu okyslič ení vody atd.). Pro př ípravu zásobních roztokůlátek s nízkou rozpustností ve voděnebo pro usnadně ní rozptýlení látky ve zkuš ebním médiu lze použ ít ultrazvukovou dispergaci, organická rozpouš tědla či emulgátory nebo dispergátory. Použ ijí-li se takové pomocné látky, měly by vš echny zkuš ební koncentrace obsahovat stejné množství těchto pomocných látek a stejné koncentraci pomocné látky jako ve zkuš ebních sériích by mě ly být exponovány dalš í kontroly. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném př ípadě by neměla př ekročit 100 mg na l zkuš ebního média.
Zkouš ka se provede bez úpravy pH. Existují-li známky toho, ž e dochází k výrazné změ něpH, doporuč uje se zkouš ku opakovat s úpravou pH a výsledky zaznamenat. V takovém př ípaděse upraví pH zásobního roztoku na pH vody k ř edě ní, pokud proti tomu neexistuji specifické důvody. Př i úpravěpH se dává př ednost HCl a NaOH. Úprava pH se provede tak, aby nebyla koncentrace zkuš ební látky v zásobním roztoku v podstatné míř e změ ně na. Dojde-li úpravou ve zkuš ebním médiu k chemické reakci nebo ke srážení, skuteč nosti se zaznamenají. III.1.6.1.2 Zkuš ební médium Voda musí být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menš í 1 než5 µS·cm . Destilační př ístroj nesmí obsahovat ž ádné mědě né části. Je doporuč eno následující médium: Podle následující tabulky se př ipraví čtyř i zásobní roztoky. Tyto roztoky se sterilizují membránovou filtrací nebo v autoklávu a skladují se v temnu př i 4 °C. Zásobní roztok č . 4 by se mě l sterilizovat pouze membránovou filtrací. Ředěním tě chto roztokůse získají koneč né ž ivné koncentrace zkuš ebních roztoků. Živina Zásobní roztok č. 1: makrož iviny NH4Cl MgCl2ּ 6H2O CaCl2ּ 2H2O MgSO4 ּ 7H2O KH2PO4 Zásobní roztok č. 2: Fe - EDTA FeCl3ּ 6H2O Na2 EDTAּ 2H2O Zásobní roztok č. 3: stopové prvky H3BO3 MnCl2·4H2O ZnCl2 CoCl2·6H2O CuCl2·2H2O Na2 MoO4·2H2O Zásobní roztok č. 4: NaHCO3 NaHCO3
III.1.6.2
Koncentrace v zásobním roztoku 1,5 1,2 1,8 1,5 0,16 80 100 185 415 3 1,5 0,01 7 50
Konečná koncentrace ve zkuš ebním roztoku 15 12 18 15 1,6 0,08 0,1 0,18 0,415 3×103 3 1,5×10 5 1×10 7×103 50
mg·l1 mg·l1 1 mg·l 1 mg·l mg·l1 mg·l1 1 mg·l 1
mg·l mg·l1 mg·l1 1 mg·l 1 mg·l mg·l1 mg·l1
Po ustálení a po provzduš ně ní by mělo mít médium hodnotu pH př ibliž ně8. Přístroje a pomůcky — Bě ž né laboratorní vybavení. — Kultivač ní baňky o vhodném objemu (např . Erlenmeyerovy baňky na 250 ml jsou vhodné v př ípadězkuš ebního roztoku o objemu 100 ml). Vš echny zkuš ební baňky by mě ly být identické, pokud jde o materiál a rozmě ry. — Kultivač ní zař ízení: místnost nebo komora, v nichžlze udrž ovat teplotu 21 – 25 °C ± 2 °C a stálé rovnomě rné osvě tlení v rozsahu vlnových délek od 400 do 700 nm. Jestliž e vš echny ř asy v kontrolních kulturách dosáhly doporuč ené růstové rychlosti, lze př edpokládat, ž e podmínky pro jejich růst, vč etněintenzity světla, jsou vyhovující.
III.1.6.3
III.1.6.4
U zkuš ebních roztoků s průmě rnými koncentracemi se doporuč uje použít svě telnou intenzitu od 60 do 120 µE·m -2·s-1 (35 – 70·1018 fotonům -2·s-1) př i měř ení v rozsahu 400 – 700 nm vhodným detektorem. Př i mě ř ení intenzity luxmetry je př ijatelný rozsah odpovídající 6000 – 10 000 lx. Této světelné intenzity lze dosáhnout umístě ním č tyřažsedmi univerzálních bílých 30W zář ivek (teplota chromatičnosti př ibliž ně4 300 K) ve vzdálenosti 0,35 m od kultury ř as. — Měř ení hustoty buněk by se mě lo provádět př ímým poč ítáním ž ivých buně k, např . pod mikroskopem s poč ítacími komůrkami. Za př edpokladu dostatečné citlivosti a prokázané dobré korelace s buněč nou hustotou mohou být použ ity i jiné postupy (fotometrie, turbidimetrie,…). Testovací organismy Je doporučeno použít rychle rostoucí druhy zelených ř as vhodné pro kultivaci a zkouš ení. Dává se př ednost následujícím druhům: — Selenastrum capricornutum, např . ATCC 22662 nebo CCAP 278/4, — Scenedesmus subspicatus, např . 86.81 SAG. Poznámka: ATCC = American Type Culture Collection (USA) CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (VB) SAG = Collection of algal culture (Göttingen, SRN) Použ ití jiného druhu ř as musí být uvedeno ve zprávě. Zkuš ební postup Koncentrač ní rozmezí, ve kterém lze oč ekávat úč inky, se urč í na základě výsledkůorientač ních zkouš ek. Dva parametry, ježjsou mírou růstu (biomasa a růstová rychlost), mohou poskytovat zcela rozdílné hodnoty sníž ení růstu; v orientač ní zkouš ce by měly být použity oba parametry, aby mohlo zajiš tě no, že geometrická ř ada koncentrací umožní odhadnout jak EbC50, tak ErC50. Počáteční hustota buněk Doporuč uje se, aby byla poč áteč ní hustota buně k ř asy Selenastrum capricornutum a ř asy Scenedesmus subspicatus ve zkuš ebních roztocích př ibliž ně104 buně k na ml. Použije-li se jiný druh ř asy, mě la by být biomasa srovnatelná. Koncentrace zkuš ební látky Pro zkouš ku se př ipraví geometrická ř ada nejméněpěti koncentrací liš ících se od sebe vž dy faktorem nepř ekrač ujícím 2,2. Nejnižš í zkouš ená koncentrace by nemě la vykazovat ž ádný pozorovatelný úč inek na růst ř as. Nejvyš š í zkouš ená koncentrace by mě la omezit růst ve srovnání s kontrolní zkouš kou nejméněo 50 %, nejlépe by měla růst zcela zastavit. Opakování a kontroly Plán zkouš ky by mě l zahrnovat tř i opakování s kaž dou zkuš ební koncentrací. Dále se provedou tř i kontroly bez zkuš ební látky, a je-li použ ita pomocná látka, téžtř i kontroly s touto látkou. Je-li pro to důvod, může být plán zkouš ky upraven tak, ž e se použ ije více koncentrač ních úrovní a sníž í se počet opakování zkouš ky s každou koncentrací. Provedení zkouš ky
III.2
III.2.1
Zkuš ební roztoky o požadované koncentraci zkuš ební látky a pož adovaném množ ství inokula ř as se př ipraví př idáním alikvotních podílůzásobního roztoku zkuš ební látky k vhodnému množství prekultury ř as (viz doplně k 1). Kultivač ní baňky se protř epou a umístí se do kultivač ního zař ízení. Buňky ř as se udrž ují v suspensi tř epáním, mícháním nebo probubláváním vzduchem, aby se zlepš ila výměna plynůa zmenš ilo se kolísání pH ve zkuš ebních roztocích. Kultury se udrž ují př i teplotě21 – 25 °C udrž ované s př esností na ± 2 °C. Hustota buně k v kaž dé baňce se stanoví nejméněpo 24, 48 a 72 h po zahájení zkouš ky. Použ ívá-li se měř ení hustoty buně k jiná metoda, nežje jejich př ímé poč ítání, použije se ke stanovení pozadí filtrované médium pro kultivaci ř as obsahující odpovídající koncentraci zkuš ební chemické látky. pH se mě ř í na zač átku zkouš ky a po 72 h. Hodnota pH by se nemě la bě hem zkouš ky změnit víc nežo 1,5. Zkouš ení tě kavých látek V současné doběneexistuje obecněpř ijatý způsob zkouš ení tě kavých látek. Je-li o látce známo, ž e se snadno vypař uje, mohou být použ ity uzavř ené kultivač ní nádoby se zvě tš eným mrtvým objemem. Př i plánování objemu horní č ásti kultivač ních baněk se musí zohlednit eventuální nedostatek CO2. Byly navrž eny varianty této metody (4). Mě l by být uč iněn pokus stanovit množ ství zkuš ební látky, které v roztoku zůstalo; př i interpretaci výsledků zkouš ek s tě kavými látkami v uzavř ených systémech je doporuč eno postupovat mimoř ádněopatrně. Limitní zkouš ka S využ itím postupůpopsaných v této metoděmůže být provedena limitní zkouš ka s koncentrací 100 mg·l-1 s cílem prokázat, ž e EC50 je vyš š í než tato koncentrace. Je-li povaha zkuš ební látky taková, že nelze ve vodě dosáhnout koncentrace 100 mg·l 1, provede se limitní zkouš ka př i koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použ itém médiu (nebo př i maximální koncentraci, kdy látka vytvář í stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1). Limitní zkouš ka se provede alespoňtř ikrát, se stejným poč tem kontrol. V limitní zkouš ce se stanoví oba parametry, ježjsou mírou růstu (biomasa a růstová rychlost). Zjistí-li se v limitní zkouš ce pokles růstu biomasy nebo růstové rychlosti ve srovnání s kontrolami o 25 % nebo více, provede se úplná zkouš ka. DATA A HODNOCENÍ Naměř ené hustoty buně k ve zkuš ební kultuř e a v kontrolách se spolu s koncentracemi zkuš ební látky a dobami měř ení shrnou do tabulky. Stř ední hodnota hustoty buně k pro každou zkuš ební koncentraci a pro kontroly se vynese proti č asu (0 – 72 h) a sestrojí se růstová kř ivka. Vztah koncentrace/úč inek se stanoví dvě ma následujícími postupy. Ně které látky mohou růst př i nízkých koncentracích stimulovat. V úvahu by měla být vzata pouze data udávající potlač ení růstu mezi 0 a 100 %. POROVNÁNÍ PLOCH POD RŮSTOVÝMI KŘIVKAMI Plocha mezi růstovou kř ivkou a vodorovnou linií N = N0 se vypoč te podle následujícího vzorce:
N N 2 N N 2 2 N 0 N N 2 N 0 A 1 t1 1 t 2 t 1 ... n1 n t n t n 1 2 2 2
III.2.2
kde A= plocha, N0 = poč et buně k v ml v č ase t 0 (na poč átku zkouš ky), N1 = naměř ený poč et buně k v 1 ml v č ase t 1, Nn = naměř ený poč et buně k v 1 ml v č ase t n, t1 = doba prvního mě ř ení od poč átku zkouš ky, tn = doba n-tého mě ř ení od poč átku zkouš ky, n= poč et mě ř ení od poč átku zkouš ky. Potlač ení růstu vyjádř ené v % (IA) se pro každou koncentraci zkuš ební látky vypoč te podle vzorce: A At IA c 100 Ac kde Ac = plocha mezi růstovou kř ivkou kontrolní zkouš ky a horizontální linií N = N0, At = plocha mezi růstovou kř ivkou př i koncentraci t a horizontální linií N = N0. Hodnoty I A se nanesou na semilogaritmický nebo na pravdě podobnostní semilogaritmický papír proti odpovídajícím koncentracím. Vynesou-li se body na pravdě podobnostní papír, prolož í se body př ímka, a to ruč něnebo regresním výpoč tem. Hodnota EC50 se odhadne odečtením z regresní př ímky jako koncentrace odpovídající 50% sníž ení růstu (IA = 50 %). Pro jednoznač né označ ení této hodnoty v rámci této metody výpočtu se doporuč uje použít symbol EbC50. Je důležité, aby byla s hodnotou E bC50 uvedena př ísluš ná expoziční doba, např . E bC50 (0 – 72 h). POROVNÁNÍ RŮSTOVÝCH RYCHLOSTÍ Průmě rnou specifickou růstovou rychlost (µ) pro exponenciálněrostoucí kultury lze vypoč ítat jako:
ln N n ln N 0 t n t 0
kde t 0 je čas začátku zkouš ky. Průmě rnou specifickou růstovou rychlost lze také odvodit ze sklonu regresní př ímky v závislosti ln N na čase. Snížení specifické růstové rychlosti vyjádř ené v procentech pro každou koncentraci zkuš ební látky (Iµt) se vypočte podle vzorce: t It c 100 c kde µc = stř ední specifická růstová rychlost v kontrole, µt = stř ední specifická růstová rychlost pro zkuš ební koncentraci t. Snížení stř ední specifické růstové rychlosti v procentech př i vš ech koncentracích zkuš ební látky ve srovnání s kontrolní hodnotou se vynese proti logaritmu koncentrace. Hodnotu EC 50 lze odeč íst z výsledného grafu. Pro jednoznač né označení EC50 odvozené touto metodou se doporuč uje
III.2.3
III.3
III.4
použ ít symbol E rC50. Musí být uvedeny okamž iky mě ř ení, např . vztahuje-li se hodnota k č asu 0 a k 72 h, označ í se symbolem ErC50 (0 – 72 h): Poznámka: Ve výrazu pro specifickou růstovou rychlost vystupují logaritmy, tzn. malé změ ny růstové rychlosti mohou odpovídat velkým změ nám biomasy. Hodnoty E bC a ErC tedy nejsou č íselněsrovnatelné. VÝPOČET NOEC Hodnota koncentrace nezpůsobující ž ádné pozorovatelné úč inky (NOEC) se stanoví vhodnou statistickou metodou pro srovnávání více vzorků (např . analýza rozptylu a Dunnettův test) s využitím jednotlivých hodnot ploch pod růstovými kř ivkami A (viz bod 2.1) nebo specifických růstových rychlostí µ (viz bod 2.2). ZPRÁVY Protokol o zkouš ce má pokud mož no obsahovat následující údaje: — zkuš ební látka: údaje o chemické identitě ; — testovací organismus: původ, laboratorní kultura, číslo kmene, metoda kultivace; — zkuš ební podmínky: — datum zahájení a ukončení zkouš ky a délka zkouš ení, — teplota, — složení média, — kultivační zař ízení, — hodnoty pH roztoku na počátku a na konci zkouš ky (je-li pozorováno kolísání pH o více než 1,5, uvede se vysvě tlení), — nosiča metoda použitá pro rozpouš tě ní zkuš ební látky, koncentrace nosič e ve zkuš ebních roztocích, — intenzita a kvalita svě tla, — zkouš ené koncentrace (naměř ené nebo nominální); — výsledky: — koncentrace buněk v jednotlivých baňkách v každé době měř ení a metoda měř ení koncentrace buněk, — průměrné hodnoty koncentrace buněk, — růstové kř ivky, — grafické znázornění vztahu koncentrace – úč inek, — hodnoty EC a metoda výpočtu, — NOEC, — dalš í pozorované úč inky. LITERATURA (1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81) 30 Final. (2) Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subspicatus“, In: Rudolph / Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg,1986. (3) ISO 8692 – Water quality – Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum. (4) S. Galassi, M. Vighi. Chemosphere, 1981, 10, 1123-1126.
DODATEK 1 Př íklad postupu kultivace řas Obecné poznámky Úč elem kultivace následujícím postupem je získání kultur ř as pro zkouš ky toxicity. Mě ly by být použ ity vhodné metody k tomu, aby bylo zajiš těno, ž e kultury ř as nebudou infikovány bakteriemi (ISO 4833). Vhodné mohou být axenické kultury, avš ak základem jsou jednodruhové kultury. Vš echny operace se provádě jí za sterilních podmínek, aby nedoš lo ke kontaminaci bakteriemi a jinými ř asami. Kontaminované kultury se vyř adí. Postupy při získání kultur ř as Př íprava ž ivných roztoků(média): Médium lze př ipravit zř eděním koncentrovaných základních roztokůž ivin. K získání pevného média se př idává 0,8 % agaru. Použité médium by mě lo být sterilní. Sterilizace v autoklávu můž e vést ke ztrátěNH 3. Kmenová kultura: Kmenové kultury jsou malé kultury ř as, které se pravidelněpř enáš ejí do č erstvého média, kde slouží jako výchozí testovací materiál. Nejsou-li kultury pravidelně používány, vyoč kovávají se na š ikmý agar. Poté se nejménějednou za dva mě síce př enáš ejí do čerstvého média. Kmenové kultury se pě stují v Erlenmeyerových baňkách obsahujících vhodné medium (objem př ibližně100 ml). Jsou-li ř asy kultivovány př i teplotě20 °C a stálém osvě tlení, musí se př enáš et každý týden. Př i př eoč kování se př enese sterilní pipetou do baňky s čerstvým mediem takové množ ství „staré“ kultury, aby byla výchozí koncentrace u rychle rostoucího druhu ř as asi stokrát menš í nežkoncentrace kultury staré. Růstovou rychlost druhu ř as lze odeč íst z růstové kř ivky. Je-li známa, lze z ní odhadnout hustotu, př i nížmusí být kultura př enesena do čerstvého média. K tomu musí dojít př ed fází odumírání kultury. Př edkultura: Úč elem př edkultur je poskytnout dostateč né množ ství ř as potř ebných pro naoč kování testovacích kultur. Př edkultura se kultivuje za zkuš ebních podmínek a použ ije se ješ tě během exponenciálního růstu, to znamená obvykle po tř ídenní inkubač ní lhůtě . Obsahují-li kultury ř as deformované nebo abnormální buňky, musí se odstranit. DODATEK 2 V norměISO 8692 - Jakost vody - Růstová inhibič ní zkouš ka na sladkovodních ř asách Scenedesmus subspicatus a Selenastrum capricornutum jsou uvedeny výsledky mezilaboratorních zkouš ek dichromanu draselného provedených 16 laboratoř emi. Er C50 (0 – 72 h) EbC 50 (0 – 72 h)
Střední hodnota (mg·l1) 0,84 0,53
Rozpě tí (mg·l 1) 0,60 až1,03 0,20 až0,75
IV. METODY PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – metody C.4 podle př ílohy směrnice 92/69/EHS IV.I.1
ÚVOD
IV.I.2
Je popsáno š est metod, které umožňují screeningové posouzení snadné biologické rozložitelnosti chemických látek v aerobním vodním prostř edí: a) Zkouš ka na úbytek rozpuš tě ného organického uhlíku (DOC) (metoda C.4-A) b) Modifikovaná screeningová zkouš ka OECD – na úbytek DOC (metoda C.4-B) c) Zkouš ka na uvolňování oxidu uhlič itého (CO2 ) (modifikovaná Sturmova zkouš ka) (metoda C.4-C) d) Zkouš ka manometrickou respirometrií (metoda C.4-D) e) Zkouš ka v uzavř ených lahvičkách (metoda C.4-E) f) Zkouš ka MITI (Ministerstvo zahraničního obchodu a průmyslu – Japonsko) (metoda C.4-F) Obecné a společ né úvahy pro vš ech š est zkouš ek jsou uvedeny v č ásti I metody. Specifické body jednotlivých metod jsou uvedeny v částech II až VII. Př ílohy obsahují definice, vzorce a návody. Mezilaboratorní srovnávací test OECD provedený v roce 1988 ukázal, že metody poskytují shodné výsledky. V závislosti na fyzikálním charakteru látky, která má být zkouš ena, se vš ak můž e dávat př ednost urč ité metodě . VÝBĚR VHODNÉ METODY Pro volbu nejvhodnějš í metody jsou nezbytné informace o rozpustnosti, tenzi par a o adsorpčních vlastnostech chemické látky. Pro výpoč et teoretických hodnot a/nebo ově ř ení namě ř ených hodnot parametrů, např . TSK, TCO2, DOC, TOC, CHSK (viz př ílohy I a II) je nutné znát chemickou strukturu nebo vzorec. Zkuš ební chemické látky, jejichž rozpustnost ve vodě je alespoň 100 mg·l -1, lze zkouš et vš emi metodami za př edpokladu, ž e netě kají a neadsorbují se. Pro látky š patněrozpustné ve vodě, které tě kají nebo se adsorbují, jsou vhodné metody uvedené v tabulce 1. Způsob, jakým je tř eba zacházet s látkami š patněrozpustnými ve voděa s látkami tě kavými, je popsán v př íloze III. Mírnětě kavé látky je mož no zkouš et metodou úbytku DOC, pokud je ve zkuš ebních nádobách (které musí být vhodně uzavř eny) dostateč něvelký prostor pro plyn. V tomto př ípaděmusí být provedena abiotická kontrola pro zohledně ní př ípadné fyzikální ztráty. Tabulka 1: Použ itelnost zkuš ebních metod Zkouš ka
na úbytek DOC
Analytická metoda
rozpuš těný organický uhlík modif. zkouš ka OECD rozpuš těný organický – na úbytek DOC uhlík na uvolňování CO 2 respirometrie: uvolňování CO2 manometrická manometrická respirometrie respirometrie: spotř eba kyslíku zkouš ka v uzavř ených respirometrie: rozpuš tě ný lahvič kách kyslík MITI respirometrie: spotř eba kyslíku
Vhodnost pro látky š patně těkavé adsorbující rozpustné se — — +/– —
—
+/–
+
—
+
+
+/–
+
+/–
+
+
+
+/–
+
IV.I.3
IV.I.4
IV.I.5 IV.I.5.1
Pro interpretaci získaných výsledků, zejména pokud jsou výsledky nízké nebo marginální, se vyžadují informace o čistotěnebo relativních podílech hlavních složek zkuš ebního materiálu. Pro volbu vhodných zkuš ebních koncentrací mohou být velmi už itečné informace o toxicitězkuš ební chemické látky pro bakterie (př íloha IV); tyto informace mohou být důlež ité pro správnou interpretaci nízkých hodnot biologického rozkladu. REFERENČNÍ LÁTKY Pro ověř ení postupu se souběž něse zkouš kou a ve vlastní baňce zkouš ejí referenč ní chemické látky, které splňují kritéria snadné biologické rozlož itelnosti. Vhodnými chemickými látkami jsou anilin (č erstvěpř edestilovaný), natrium-acetát, natrium-benzoát. Vš echny tyto referenč ní chemické látky se za podmínek v uvedených metodách rozkládají, i kdyžse zámě rně nepř idá ž ádné inokulum. Byl podán návrh hledat referenč ní chemickou látku, která by byla snadno rozlož itelná, avš ak vyž adovala by př idání inokula. Navrž en byl kalium-hydrogen-ftalát. O této látce je tř eba ješ tězískat více údajů, nežji bude mož né př ijmout jako referenční látku. V respirometrických zkouš kách mohou v důsledku nitrifikace ovlivnit spotř ebu kyslíku látky obsahující dusík (viz př ílohy II a V). PODSTATA ZKUŠEBNÍCH METOD Roztok nebo suspense zkuš ební látky v minerálním prostř edí se inokuluje a kultivuje v aerobních podmínkách v temnu nebo v difuzním svě tle. Množ ství DOC ve zkuš ebním roztoku pocházející z inokula se musí udrž ovat ve srovnání s DOC pocházejícího ze zkuš ební látky co nejniž š í. Endogenní aktivita inokula se zohlední na základěsoubě žné slepé zkouš ky s inokulem, avš ak bez zkouš ené látky, tř ebaž e endogenní aktivita buně k v př ítomnosti látky př esně neodpovídá aktivitě v endogenní kontrolní zkouš ce. Za účelem kontroly postupu se soubě žněprovádí zkouš ka s referenč ní látkou. Obecněse rozklad sleduje stanovením parametrůjako DOC, tvorba CO2 nebo spotř eba kyslíku a mě ř ení se provádějí v dostatečněkrátkých intervalech, aby bylo mož né identifikovat zač átek a konec biologického rozkladu. Mě ř ení automatickými respirometry je kontinuální. Někdy se doplňkověk jinému parametru mě ř í DOC, avš ak obvykle pouze na zač átku a na konci zkouš ky. Lze rovněžpoužít specifickou chemickou analýzu, kterou se vyhodnotí primární rozklad zkuš ební látky nebo kterou se stanoví koncentrace kteréhokoli vzniklého meziproduktu (ve zkouš ce MITI povinné). Zkouš ka obvykle trvá 28 dnů. Je vš ak možné ukonč it mě ř ení př ed uplynutím 28 dní, tj. jakmile vykazuje kř ivka biologického rozkladu plató po tř i po soběnásledující mě ř ení. Je také možné mě ř ení po 28 dnech prodloužit, jestliž e z kř ivky vyplývá, ž e biologický rozklad zač al, avš ak 28. dne ješ těnebylo ješ tědosaž eno plató. KRITÉRIA JAKOSTI Reprodukovatelnost Vzhledem k charakteru biologického rozkladu a smě sných populací bakterií použ ívaných jako inokula se stanovení provádějí nejméně duplicitně .
IV.I.5.2
IV.I.6
Je obecněznámo, ž eč ím vyš š í je koncentrace mikroorganismůpř idaných na poč átku do zkuš ebního média, tím menš í jsou rozdíly mezi vícenásobnými mě ř eními. Okruž ní testy rovně žukázaly, že mezi výsledky získanými různými laboratoř emi mohou být velké rozdíly, avš ak u snadno biologicky rozlož itelných slouč enin se obvykle dosahuje dobré shody. Platnost zkouš ky Zkouš ka se považ uje za platnou, je-li na konci zkouš ky nebo popř ípaděna konci 10denního období rozkladu rozdíl hodnot krajních výsledků vícenásobných mě ř ení rozkladu zkuš ební chemické látky v oblasti plató kř ivky menš í než20 % a dosáhl-li stupeňrozkladu referenč ní látky vyjádř ený v procentech úrovně snadné biologické rozložitelnosti do 14 dní. Není-li splněna kterákoli z tě chto podmínek, mě ř ení se opakuje. Vzhledem k nároč nosti metod neznamenají nízké hodnoty nutně skutečnost, ž e zkuš ební látka není v podmínkách životního prostř edí biologicky rozlož itelná, ale znamenají, ž e k prokázání biologické rozlož itelnosti jsou tř eba dalš í studie. Jestliž e ve zkouš ce toxicity zahrnující jak zkuš ební látku, tak referenč ní chemickou látku doš lo bě hem 14 dnů k méně než 35% rozkladu (stanoveného podle DOC) nebo k méněnež25% rozkladu (stanoveného podle TSK nebo TCO2), lze zkuš ební chemické látky považovat za inhibující (viz také př íloha IV). Série zkouš ek by mě la být opakována, pokud možno s niž š í koncentrací zkuš ební chemické látky a/nebo s vyš š í koncentrací inokula, avš ak ne s koncentrací vyš š í než30 mg tuhých látek v litru. OBECNÉ POSTUPY A PŘÍPRAVA Obecné podmínky pro zkouš ky jsou shrnuty v tabulce 2. Př ístroje a dalš í experimentální podmínky specifické pro jednotlivé metody jsou popsány dále v kapitolách pro tyto př ísluš né metody.
Tabulka 2: Zkuš ební podmínky Zkouš ka Koncentrace zkuš ební látky 1 mg·l mg DOC/l mg TSK/l Koncentrace inokula (buňky/l, př ibližně )
Zkouš ka na úbytek DOC
Zkouš ka na uvolňování CO 2
10 - 40
10 - 20
Manometrická respirometrie
Modif. screeningová zkouš ka OECD
100 50 - 100 ≤30 mg/l SL nebo ≤100 ml odpadní vody/l 7 8 (10 -10 )
Zkouš ka v uzavř ených lahvič kách
Zkouš ka MITI (I)
2 - 10
100
5 - 10 ≤5 ml odpadní vody/l 4 6 (10 -10 )
30 mg/l SL 7 8 (10 -10 )
10 - 40 0,5 ml sekundární odpadní vody/l (105)
Koncentrace prvků 1 v minerálním médiu (v mg·l ) P 116 N 1,3 Na 86 K 122 Mg 2,2 Ca 9,9 Fe 0,05 – 0,1 pH 7,4 ± 0,2 Teplota 22 ± 2 °C DOC = rozpuš tě ný organický uhlík, TSK = teoretická spotř eba kyslíku, SL = suspendované látky
11,6 0,13 8,6 12,2 2,2 9,9 0,05 - 0,1
29 1,3 17,2 36,5 6,6 29,7 0,15 nejlépe 7,0 25 ± 1 °C
IV.I.6.1
IV.I.6.2
Ředicí voda Použ ívá se deionizovaná nebo destilovaná voda neobsahující inhibující koncentrace toxických látek (např . ionty Cu 2+). Voda smí obsahovat nejvýš e 10 % obsahu organického uhlíku vneseného zkuš ebním materiálem. Vysoká čistota vody pro zkouš ky je nezbytná pro to, aby se nevyskytovaly vysoké hodnoty slepého pokusu. Kontaminace můž e pocházet z vlastních př ítomných neč istot, z materiálu mě nič e iontů, z rozkladných látek z bakterií a ř as. Pro kaž dou sérii měř ení se použ ije pouze jedna š arže vody, která byla př edem př ekontrolována analýzou DOC. Tato kontrola není nutná u zkouš ky v uzavř ených lahvič kách, spotř eba kyslíku vodou vš ak musí být nízká. Zásobní roztoky minerálních slož ek Pro př ípravu zkuš ebních roztoků se př ipraví zásobní roztoky o vhodných koncentracích minerálních slož ek. Níž e uvedené zásobní roztoky je mož né použ ít (př i různých zř eďovacích faktorech) pro metodu s úbytkem DOC, modifikovanou screeningovou metodu OECD, metodu s uvolňováním CO2, pro manometrickou respirometrii a pro metodu s uzavř enými lahvičkami. Zř eďovací faktory a specifická př íprava minerálního media pro zkouš ku MITI jsou uvedeny v oddílech pro jednotlivé zkouš ky. Zásobní roztoky: Za použití reakč ních činidel čistoty p.a. se př ipraví následující zásobní roztoky: a) Dihydrogenfosforeč nan draselný, KH 2PO4 8,50 g Hydrogenfosforeč nan didraselný, K2HPO4 21,75 g Hydrogenfosforeč nan disodný dihydrát, Na2 HPO4·2H2O 33,40 g Chlorid amonný, NH4Cl 0,50 g Rozpustí se ve voděa doplní na 1 litr. pH roztoku musí být 7,4. b)
Chlorid vápenatý bezvodý, CaCl2 nebo chlorid vápenatý dihydrát, CaCl2·2H2O Rozpustí se ve voděa doplní na 1 litr.
27,50 g 36,40 g
c)
Síran hoř ečnatý heptahydrát, MgSO4·7H2O Rozpustí se ve voděa doplní na 1 litr.
22,50 g
Chlorid ž elezitý hexahydrát, FeCl3·6H2O 0,25 g Rozpustí se ve voděa doplní na 1 litr. Poznámka: Aby nebylo nutné př ipravovat tento roztok bezprostř edně př ed použ itím, př idá se jedna kapka koncentrované kyseliny chlorovodíkové nebo 0,4 g disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) na 1 litr. Zásobní roztoky chemických látek Pokud je rozpustnost vyš š í než1 g·l 1, rozpustí se např íklad 1 – 10 g (podle potř eby) zkuš ební nebo referenč ní látky v deionizované voděa doplní se na 1 litr. Jinak se zásobní roztoky př ipravují v minerálním médiu, nebo se chemická látka př idá př ímo do minerálního média. Pokud jde o postup s méněrozpustnými chemickými látkami, viz př íloha III; ve zkouš ce MITI (metoda C.4-F) se nepoužívají ani rozpouš tě dla, ani emulgač ní č inidla. Inokula Inokulum lze získat z ř ady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaš kových vod (nechlorovaných), z povrchových vod a půd nebo z jejich směsi. Použ ívá-li se d)
IV.I.6.3
IV.I.6.4
aktivovaný kal ve zkouš ce na úbytek DOC, na uvolňování CO2 a ve zkouš ce manometrickou respirometrií, mě l by být odebrán z č istírny nebo z laboratorní jednotky č istící př eváž nědomovní odpadní vody. U inokulí z jiných zdrojůbyl zjiš tě n vě tš í rozptyl výsledků. V modifikované screeningové zkouš ce OECD a ve zkouš ce v uzavř ených lahvič kách je potř ebné zř eděně jš í inokulum bez vloček kalu a nejvhodnějš ím zdrojem je voda z druhého stupněč istírny domovních odpadních vod nebo z laboratorní jednotky. Pro zkouš ku MITI se inokulum získává ze směsi zdrojůa je popsáno v oddílu věnovaném této zkouš ce. IV.I.6.4.1 Inokulum z aktivovaných kalů Odebere se č erstvý vzorek aktivovaného kalu z aerač ní nádrž eč istírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky č istící př eváž nědomovní odpadní vody. Podle potř eby se filtrací př es jemné síto odstraní hrubé částice a kal se udrž uje v aerobních podmínkách. Jinou mož ností je usazení nebo odstř edě ní (např . 10 min př i 1 100 g) po odstranění hrubých částic. Voda nad usazeninou se odstraní. Kal se promyje minerálním médiem. Koncentrovaný kal se suspenduje v minerálním médiu na koncentraci 3 – 5 g suspendovaných tuhých látek na litr a aždo použití se provzduš ňuje. Kal by mě l být odebrán z dobř e fungující konvenč ní č istírny. Je-li nutné odebrat kal z čistírny s vysokým výkonem nebo př edpokládá-li se, ž e kal obsahuje inhibitory, je tř eba jej promýt. Po důkladném promíchání se kal nechá usadit nebo se odstř edí, voda nad usazeninou se odstraní a promytý kal se opě t suspenduje v nové dávce minerálního média. Tento postup se opakuje, dokud se kal nepovaž uje za prostý př ebytečného substrátu nebo inhibitoru. Po opakovaném suspendování nebo z neupravovaného kalu se těsněpř ed použitím odebere vzorek pro stanovení hmotnosti suš iny suspendovaných tuhých látek. Dalš í mož ností je homogenizace aktivovaného kalu (3 – 5 g suspendovaných látek v litru). Kal se 2 min zpracovává v mechanickém mísič i př i stř ední rychlosti. Promíchaný kal se nechá 30 min, popř ípadědéle, usazovat a kapalina se dekantuje pro použ ití jako inokulum v koncentraci 10 ml na litr minerálního média. IV.I.6.4.2 Jiné zdroje inokula Inokulum lze získat z výstupu z druhého stupněč istírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky zpracovávající př evážnědomovní odpadní vody Odebere se č erstvý vzorek a bě hem př epravy se udrž uje v aerobních podmínkách. Nechá se 1 h usadit nebo se zfiltruje př es hrubý filtrační papír a dekantovaná kapalina nebo filtrát se aždo použití udrž uje v aerobních podmínkách. Na litr média lze použ ít až100 ml tohoto typu inokula. Dalš ím zdrojem inokula je povrchová voda. V tomto př ípaděse odebere vzorek vhodné povrchové vody, např . ř íč ní nebo jezerní vody, a uchovává se aždo použ ití v aerobních podmínkách. V př ípaděpotř eby se inokulum zkoncentruje filtrací nebo odstř edě ním. IV.I.6.5 Předběž ná úprava inokulí Inokula je mož né př edbě žněupravit pro experimentální podmínky, ale nikoli př edbě žněadaptovat na zkuš ební látku. Př edběž ná úprava spočívá v aeraci aktivovaného kalu v minerálním médiu nebo výstupu z druhého stupněč istírny po dobu 5 – 7 dnůpř i zkuš ební teplotě. Př edbě ž ná úprava ně kdy zlepš í př esnost zkuš ebních metod snížením hodnot ze slepých pokusů. Př edbě žná úprava inokula pro zkouš ku MITI se nepovaž uje za nutnou. IV.I.6.6 Abiotické kontroly
IV.I.6.7
IV.I.7
IV.I.7.1
V př ípadě potř eby se kontroluje mož ný abiotický rozklad zkuš ební látky stanovením úbytku DOC, př ijmu kyslíku nebo uvolňování oxidu uhlič itého ve sterilních kontrolách bez inokula. Sterilizace se provádí filtrací př es membránu (0,2 – 0,45 µm) nebo př idáním vhodné toxické látky v odpovídající koncentraci. Použ ívá-li se membránová filtrace, odebírají se vzorky asepticky, aby byla zachována sterilita. Pokud nebyla př edem vylouč ena adsorpce zkuš ební látky, měly by zkouš ky, kterými se sleduje biologický rozklad podle úbytku DOC, zejména př i použití inokula z aktivovaného kalu, zahrnovat abiotickou kontrolu, která je inokulována a intoxikována. Počet nasazených baně k Poč et nasazených baněk v typické zkouš ce je uveden v oddílech vě novaných jednotlivým zkouš kám. Mohou být použ ity tyto baňky: Zkuš ební suspense: obsahující zkuš ební látku a inokulum Slepá zkouš ka s inokulem: obsahující pouze inokulum Kontrolní zkouš ka postupu: obsahující referenční látku a inokulum Abiotická sterilní kontrola: sterilní, obsahující zkuš ební látku (viz I.6.6) Kontrola adsorpce: obsahující zkuš ební látku, inokulum a sterilizač ní č inidlo Kontrola toxicity: obsahující zkuš ební látku, referenč ní látku a inokulum Stanovení ve zkuš ební suspensi a slepý pokus s inokulem musí být provádě ny soubě ž ně. Doporuč uje se, aby stanovení v ostatních baňkách bylo prováděno rovně žsouběž ně . To vš ak nemusí být vž dy mož né. Je tř eba zajistit, aby se odebíral dostatečný poč et vzorkůnebo aby se provádě l dostateč ný poč et odeč tůpro vyhodnocení procenta úbytku v 10denním období rozkladu. DATA A HODNOCENÍ Př i výpoč tu rozkladu v procentech Dt, se použ ijí stř ední hodnoty z mě ř ení parametru provedených duplicitněv obou zkuš ebních nádobách a ze slepého pokusu s inokulem. Vzorce jsou uvedeny dále v oddílech pro jednotlivé zkouš ky. Průbě h rozkladu se znázorní graficky a vyznač í se 10denní období rozkladu. Vypoč te se a uvede úbytek v procentech dosaž ený na konci 10denního období rozkladu a hodnota pro plató kř ivky nebo popř ípaděhodnota odpovídající konci zkouš ky. V respirometrických zkouš kách mohou v důsledku nitrifikace ovlivnit spotř ebu kyslíku látky obsahující dusík (viz př ílohy II a V). Měř ení rozkladu prostř ednictvím stanovení DOC Za úč elem posouzení platnosti zkouš ky (viz I.5.2) by se mě la hodnota rozkladu Dt v procentech v kaž dém časovém okamž iku, ve kterém se odebral vzorek, vypoč ítat odděleněpro kaž dou baňku obsahující zkuš ební látku, a to pomocí stř edních hodnot měř ení DOC provedených duplicitně . Vypoč te se podle následující rovnice: Ct C bt Dt 1 100 C C 0 b0 kde Dt = rozklad v procentech v čase t, C0 = stř ední poč áteč ní koncentrace DOC v inokulovaném kultivačním médiu obsahujícím zkuš ební látku (v mg DOC na litr), Ct = stř ední koncentrace DOC v inokulovaném kultivačním médiu obsahujícím zkuš ební látku v č ase t (v mg DOC na litr),
Cbo =
IV.I.7.2
IV.I.7.3
IV.I.8
stř ední poč áteč ní koncentrace DOC ve slepém inokulovaném minerálním médiu (v mg DOC na litr), Cbt = stř ední koncentrace DOC ve slepém inokulovaném minerálním médiu vč ase t (v mg DOC na litr). Vš echny koncentrace se stanoví experimentálně . Rozklad mě ř ený specifickou analýzou Je-li možné získat specifické analytické údaje, vypoč te se primární biologický rozklad z rovnice: Sb Sa Dt 100 Sb kde Dt = rozklad v procentech v čase t, obvykle po 28 dnech, Sa = zbylé množ ství zkuš ební látky v médiu s inokulem na konci zkouš ky (mg), Sb = zbylé množství zkuš ební látky ve slepém pokusu s vodou/médiem, do kterých byla př idána pouze zkuš ební látka (mg). Abiotický rozklad Použ ije-li se abiotická sterilní kontrola, vypočte se abiotický rozklad v procentech podle rovnice: C Cs(t ) abiotický rozklad v % s(0) 100 Cs(0) kde: Cs(0) = koncentrace DOC ve sterilní kontrole v den 0, Cs(t) = koncentrace DOC ve sterilní kontrole v den t. ZPRÁVY Protokol o zkouš ce má pokud mož no obsahovat následující údaje: — zkuš ební a referenční chemické látky a jejich č istota; — zkuš ební podmínky; — inokulum: charakter a místo (místa) odbě ru, koncentrace a jakákoli př edbě ž ná úprava; — podíl a charakter průmyslového odpadu obsaž eného v odpadní vodě , jsou-li známy; — délka zkouš ky a teplota; — v př ípadě š patně rozpustných zkuš ebních látek použ itý způsob zpracování; — použ itá zkuš ební metoda; mě ly by být uvedeny vě decké důvody a vysvě tlení pro veš keré změ ny postupu; — př ehled dat; — veš keré pozorované projevy inhibice; — jakýkoli pozorovaný abiotický rozklad; — specifická analytická data o chemické látce, pokud existují; — analytická data o meziproduktech, pokud existují; — graf závislosti rozkladu v procentech na čase pro zkuš ební a referenční látku; je tř eba zř etelněoznač it fázi iniciace, fázi rozkladu, 10denní období rozkladu a smě rnici (př íloha I). Vyhovuje-li zkouš ka kritériím jakosti, je možné v grafu použ ít stř ední hodnotu rozkladu v procentech v baňkách obsahujících zkuš ební látku; — rozklad v procentech po 10denním období rozkladu, v oblasti plató a na konci zkouš ky.
IVA. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ÚBYTKU ROZPUŠTĚNÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (DOC) – metoda C.4-A podle přílohy smě rnice 92/69/EHS IVA.1
IVA 2 IVA 2.1
IVA 2.2
IVA 2.3
IVA 2.4
PODSTATA METODY Odmě ř ený objem inokulovaného minerálního média obsahujícího známou koncentraci zkuš ební látky (10 – 40 mg DOC na litr) jako nominální jediný zdroj organického uhlíku se provzduš ňuje v temnu nebo v difusním světle př i 22 ± 2 °C. Rozklad se sleduje v krátkých intervalech během 28denního období prostř ednictvím analýzy DOC. Stupeň biologického rozkladu se vypoč te vyjádř ením koncentrace rozloženého DOC (opravené na koncentraci DOC ve slepé zkouš ce s inokulem) v procentech koncentrace, která byla př ítomna na zač átku. Stupeň primárního biologického rozkladu lze rovně ž vypoč ítat z doplňkové chemické analýzy provedené na zač átku a na konci kultivace. POPIS METODY Aparatura a) Erlenmeyerovy baňky, např . 250 ml až2 litry, podle objemu potř ebného pro analýzu DOC; b) Tř epač ka upravená pro umístě ní Erlenmeyerových baně k, buď s automatickou regulací teploty nebo používaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostateč ným výkonem pro udržení aerobních podmínek ve vš ech baňkách; c) Filtrační aparatura s vhodnými membránami; d) Analyzátor DOC; e) Př ístroj pro stanovení rozpuš těného kyslíku; f) Odstř edivka; Př íprava minerálního média Př íprava zásobních roztokůje popsána v boděI.6.2. Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ř edicí vody, př idá se po 1 ml roztokůb) ažd) a doplní se ř edicí vodou na 1 litr. Př íprava a př edbě ž ná úprava inokula Inokulum lze získat z ř ady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaš kových vod, z povrchových vod, z půd nebo z jejich smě si. Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5. Př íprava baněk Do dvoulitrových Erlenmeyerových baně k se např íklad odměř í 800 ml minerálního média a do jednotlivých baněk se př idají dostateč ná množství zásobních roztokůzkuš ební a referenční látky tak, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 – 40 mg DOC na litr. Zkontrolují se hodnoty pH a popř ípaděse upraví na 7,4. Baňky se inokulují aktivovaným kalem nebo jiným zdrojem inokula (viz I.6.4), aby se získala výsledná koncentrace nejvýš e 30 mg suspendovaných látek na litr. Př ipraví se rovně ž kontroly s inokulem v minerálním médiu, avš ak bez zkuš ební nebo referenč ní látky. Podle potř eby se použ ije jedna nádoba ke kontrole možného inhibičního účinku zkuš ební látky inokulací roztoku, který obsahuje srovnatelná množství jak zkuš ební, tak referenč ní chemické látky v minerálním médiu.
IVA 2.5
IVA 2.6
IVA 3 IVA 3.1
IVA 3.2 IVA 3.3 IVA 4
Podle potř eby se také použ ije dalš í, sterilní baňka s roztokem chemické látky bez inokula, a to ke kontrole, zda se zkuš ební chemická látka rozkládá abioticky (viz I.6.6). Existuje-li dále podezř ení, že se zkuš ební látka významněadsorbuje na skle, kalu apod., provede se př edbě žný odhad pravděpodobného rozsahu adsorpce, a tedy vhodnosti zkouš ky pro danou látku (viz tabulka 1). Nasadí se baňka obsahující zkuš ební látku, inokulum a sterilizač ní č inidlo. Obsah vš ech baně k se doplní minerálním médiem na 1 litr a po promíchání se z kaž dé baňky odebere vzorek pro stanovení poč áteční koncentrace DOC (viz př íloha II, bod 4). Ústí baně k se zakryjí např . hliníkovou fólií tak, aby byla umožně na volná výmě na vzduchu mezi baňkami a okolní atmosférou. Baňky se poté umístí do tř epač ky a zahájí se zkouš ka. Počet baněk v typické zkouš ce Baňka 1 a 2: Zkuš ební suspense Baňka 3 a 4: Slepá zkouš ka s inokulem Baňka 5: Kontrolní zkouš ka postupu Dále se doporuč ují nebo se podle potř eby použijí: Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola Baňka 7: Kontrola adsorpce Baňka 8: Kontrola toxicity Viz také bod I.6.7. Provedení zkouš ky Bě hem zkouš ky se ve známých č asových intervalech duplicitně stanovuje koncentrace DOC v každé baňce, a to dostateč něč asto, aby bylo mož né urč it zač átek 10denního období rozkladu a úbytek v procentech na konci 10denního období rozkladu. Pro kaž dé stanovení se odebere pouze minimální nezbytné množství zkuš ební suspense. Př ed kaž dým odbě rem vzorkůse podle potř eby nahradí ztráty odpař ováním z baně k př idáním potř ebného množství ř edicí vody (1.6.1). Př ed odbě rem vzorků se kultivační médium dobř e promíchá a zajistí se, aby látky ulpě lé na stě nách nádob př eš ly do roztoku nebo suspense. Vzorky se ihned po odbě ru zfiltrují př es membránu nebo odstř edí (viz př íloha II, bod 4). Zfiltrované nebo odstř edě né vzorky se analyzují týžden, v opač ném př ípaděse uchovávají nejdéle 48 h př i2– 4 °C nebo delš í dobu př i teplotěniž š í než18 °C. DATA A ZPRÁVY Zpracování výsledků Rozklad v procentech v č ase t se vypoč te podle bodu I.7.1. (stanovení DOC) nebo podle bodu I.7.2 (specifická analýza). Vš echny výsledky se uvedou na př ísluš ných formulář ích př ehledu dat. Platnost výsledků Viz bod I.5.2. Zprávy Viz bod I.8. PŘEHLED DAT Dále je uveden př íklad př ehledu dat. ZKOUŠKA NA ÚBYTEK DOC 1. LABORATOŘ 2. DATUM POČÁTKU ZKOUŠKY 3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA Název:
4.
Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l 1 Počáteční koncentrace chemické látky v médiu v č ase t0: mg·l1 INOKULUM Zdroj: Provedená úprava: Př edbě ž ná úprava, pokud byla provedena: Koncentrace suspendovaných látek v reakční smě si: mg·l-1 STANOVENÍ UHLÍKU Analyzátor uhlíku:
5
1
Baňka č.
Zkuš ební látka a inokulum
Slepá zkouš ka s inokulem bez zkuš ební látky
a1 a2 1 a, stř ední hodnota C a(t) b1 b2 2 b, stř ední hodnota C b(t) c1 c2 3 c, stř ední hodnota Cc(t) d1 d2 4 d, stř ední hodnota C d(t) C c (t ) + C d (t ) C bl(t ) = 2
DOC po n dnech (mg·l ) 0 n1 n2 n3 nx
VYHODNOCENÍ NAMĚŘENÝCH DAT
6.
Baňka č .
Rozklad v % po n dnech 0 n1 n2 n3 nx
Ca(t) Cbl(t ) D1 1 C a (0) Cbl(0)
1
2 Stř ední hodnota*
100
Cb (t ) Cbl(t ) 100 D2 1 C b(0) Cbl(0) D – D2 D= 1 2
0
0 0
*
Hodnoty D1 a D2 by nemě ly být průměrovány, pokud je mezi nimi významný rozdíl. Poznámka: Podobné formulář e lze použ ít pro referenč ní chemickou látku a kontrolu toxicity. 7. ABIOTICKÁ KONTROLA (nepovinná) Čas (dny) 1
DOC (mg·l ) ve sterilní kontrole
0 C s(0)
t C s(t)
C Cs(t ) abiotický rozklad v % s(0) 100 Cs(0) 8. SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA (nepovinná)
Sterilní kontrola Inokulované zkuš ební médium
Zbylé množství zkuš ební chemické látky na konci 1 zkouš ky (mg·l ) Sb Sa
Primární rozklad v procentech
Sb Sa 100 Sb
IVB. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ÚBYTKU ROZPUŠTĚNÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (DOC) - MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD – metoda C.4-B podle př ílohy smě rnice 92/69/EHS IVB.1
IVB.2 IVB.2.1
IVB.2.2
PODSTATA METODY Odmě ř ený objem minerálního média obsahujícího známou koncentraci zkuš ební látky (10 – 40 mg DOC na litr) jako jediný zdroj organického uhlíku se inokuluje 0,5 ml odpadní vody na litr média. Smě s se provzduš ňuje v temnu nebo v difusním světle př i 22 ± 2 °C. Rozklad se sleduje v krátkých intervalech během 28denního období prostř ednictvím analýzy DOC. Stupeň biologického rozkladu se vypoč te vyjádř ením koncentrace rozloženého DOC (opravené na koncentraci DOC ve slepé zkouš ce s inokulem) v procentech koncentrace, která byla př ítomna na zač átku. Stupeň primárního biologického rozkladu lze rovně ž vypoč ítat z doplňkové chemické analýzy provedené na zač átku a na konci inkubace. POPIS METODY Aparatura a) Erlenmeyerovy baňky, např . 250 ml až2 litry, podle objemu potř ebného pro analýzu DOC; b) Tř epač ka pro umístě ní Erlenmeyerových baněk, buď s automatickou regulací teploty nebo použ ívaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostateč ným výkonem pro udržení aerobních podmínek ve vš ech baňkách; c) Filtrační aparatura s vhodnými membránami; d) Analyzátor DOC; e) Př ístroj pro stanovení rozpuš těného kyslíku; f) Odstř edivka. Př íprava minerálního média Př íprava zásobních roztokůje popsaná v boděI.6.2. Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ř edicí vody, př idá se po 1 ml roztokůb) ažd) a doplní se ř edicí vodou na 1 litr. V této metoděse používá jako inokulum pouze 0,5 ml odpadní vody na litr, a proto je nutné do média dodat stopové prvky a růstové faktory. Toho se dosáhne př idáním 1 ml každého z dále uvedených roztokůna jeden litr výsledného média: Roztok stopových prvků: Síran manganatý tetrahydrát, MnSO4·4H2O 39,9 mg Kyselina boritá, H3BO 3 57,2 mg Síran zinečnatý heptahydrát, ZnSO4·7H2O 42,8 mg Heptamolybdenan hexaamonný, (NH4 )6Mo7O24 34,7 mg Chelát Fe (FeCl 3 s kyselinou ethylendiaminotetraoctovou) 100,0 mg Rozpustí se v ř edicí voděa doplní se touto vodou na 1 000 ml. Vitaminový roztok:
IVB.2.3
IVB.2.4
IVB.2.5
IVB.2.6
Kvasnič ný extrakt 15,0 mg Kvasnič ný extrakt se rozpustí ve 100 ml vody. Sterilizuje se průchodem membránou 0,2 µm, nebo se př ipraví č erstvě. Př íprava a př edbě ž ná úprava inokula Inokulum se získá z výstupu druhého stupněč istírny nebo laboratorní jednotky zpracovávající př evážnědomovní odpadní vody. Viz I.6.4.2 a I 6.5. Použ ije se 0,5 ml na litr minerálního média. Př íprava baněk Do dvoulitrových Erlenmeyerových baně k se např íklad odměř í 800 ml minerálního média a do jednotlivých baněk se př idají dostateč ná množství zásobních roztokůzkuš ební a referenční látky tak, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 – 40 mg DOC na litr. Zkontrolují se hodnoty pH a popř ípaděse upraví na 7,4. Baňky se inokulují odpadní vodou z druhého stupně č iš tě ní odpadních vod (viz I.6.4.2) v objemu 0,5 ml na litr. Př ipraví se rovně ž slepé zkouš ky s inokulem v minerálním médiu, avš ak bez zkuš ební nebo referenč ní látky. Podle potř eby se použ ije jedna nádoba ke kontrole možného inhibičního účinku zkuš ební látky inokulací roztoku, který obsahuje srovnatelná množství jak zkuš ební, tak referenč ní chemické látky v minerálním médiu. Podle potř eby se také použ ije dalš í, sterilní baňka s roztokem chemické látky bez inokula, a to ke kontrole, zda se zkuš ební chemická látka rozkládána abioticky (viz I.6.6). Existuje-li dále podezř ení, že se zkuš ební látka významněadsorbuje na skle, kalu apod., provede se př edbě žný odhad pravděpodobného rozsahu adsorpce, a tedy vhodnosti zkouš ky pro danou látku (viz tabulka 1). Nasadí se baňka obsahující zkuš ební látku, inokulum a sterilizač ní č inidlo. Obsah vš ech baně k se doplní minerálním médiem na 1 litr a po promíchání se z kaž dé baňky odebere vzorek pro stanovení poč áteční koncentrace DOC (viz př íloha II, bod 4). Ústí baně k se zakryjí např . hliníkovou fólií tak, aby byla umožně na volná výmě na vzduchu mezi baňkami a okolní atmosférou. Baňky se poté umístí do tř epač ky a zahájí se zkouš ka. Počet baněk v typické zkouš ce Baňka 1 a 2: Zkuš ební suspense Baňka 3 a 4: Slepá zkouš ka s inokulem Baňka 5: Kontrolní zkouš ka postupu Dále se doporuč ují se nebo se podle potř eby použijí: Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola Baňka 7: Kontrola adsorpce Baňka 8: Kontrola toxicity Viz také bod I.6.7. Provedení zkouš ky Bě hem zkouš ky se ve známých č asových intervalech duplicitně stanovuje koncentrace DOC v každé baňce, a to dostateč něč asto, aby bylo mož né urč it zač átek 10denního období rozkladu a úbytek v procentech na konci 10denního období rozkladu. Pro kaž dé stanovení se odebere pouze minimální nezbytné množství zkuš ební suspense. Př ed odbě rem vzorkůse podle potř eby nahradí ztráty odpař ováním z baně k př idáním potř ebného množství ř edicí vody (1.6.1). Př ed odbě rem vzorkůse kultivační médium dobř e promíchá a zajistí se, aby látky ulpě lé na stě nách nádob
IVB.3 IVB.3.1
IVB.3.2 IVB.3.3 IVB.4
př eš ly do roztoku nebo suspense. Vzorky se ihned po odbě ru zfiltrují př es membránu nebo odstř edí (viz př íloha II, odst. 4). Zfiltrované resp. odstř eděné vzorky se analyzují týžden, v opač ném př ípaděse uchovávají nejdéle 48 h př i2– 4 °C nebo delš í dobu př i teplotěniž š í než18 °C. DATA A ZPRÁVY Zpracování výsledků Rozklad v procentech v č ase t se vypoč te podle bodu I.7.1. (stanovení DOC) nebo podle bodu I.7.2 (specifická analýza). Vš echny výsledky se uvedou na př ísluš ných formulář ích př ehledůdat. Platnost výsledků Viz bod I.5.2. Zprávy Viz bod I.8. PŘEHLED DAT Dále je uveden př íklad př ehledu dat. MODIFIKOVANÁ SCREENINGOVÁ ZKOUŠKA OECD 1. LABORATOŘ 2. DATUM POČÁTKU ZKOUŠKY 3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA Název: Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l 1 Počáteční koncentrace chemické látky v médiu v č ase t0: mg·l1 4. INOKULUM Zdroj: Provedená úprava: Př edbě ž ná úprava, pokud byla provedena: Koncentrace suspendovaných látek v reakční smě si: mg·l-1 5 STANOVENÍ UHLÍKU Analyzátor uhlíku: Baňka č.
Zkuš ební látka a inokulum
Slepá zkouš ka s inokulem bez zkuš ební látky
6.
1
DOC po n dnech (mg·l ) 0 n1 n2 n3 nx
a1 a2 1 a, stř ední hodnota C a(t) b1 b2 2 b, stř ední hodnota C b(t) c1 c2 3 c, stř ední hodnota Cc(t) d1 d2 4 d, stř ední hodnota C d(t) Cc(t) + Cd (t ) C bl(t ) = 2
VYHODNOCENÍ NAMĚŘENÝCH DAT Baňka č .
Rozklad po n dnech
C a(t ) C bl(t ) D1 1 100 Ca (0) Cbl(0)
1
2 Stř ední hodnota*
Cb (t ) Cbl(t ) D2 1 100 C b(0) Cbl(0) D – D2 D= 1 2
0 0
n1
n2
n3
n4
0
0
Hodnoty D1 a D2 by nemě ly být průměrovány, pokud je mezi nimi významný rozdíl. Poznámka: Podobné formulář e lze použ ít pro referenč ní chemickou látku a kontrolu toxicity. 7. ABIOTICKÁ KONTROLA (nepovinná) *
Čas (dny) 0 C s(0)
1
DOC (mg·l ) ve sterilní kontrole
t C s(t)
Cs(0) Cs(t ) abiotický rozklad v % 100 Cs(0) 8.
SPECIFICKÁ CHEMICKÁ ANALÝZA (nepovinná)
Sterilní kontrola Inokulované zkuš ební médium
Zbylé množství zkuš ební chemické látky na konci zkouš ky (mg·l1) Sb Sa
Primární rozklad v procentech
Sb Sa 100 Sb
IVC. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ UVOLŇOVÁNÍ OXIDU UHLIČITÉHO (CO 2) – MODIFIKOVANÁ STURMOVA ZKOUŠKA – metoda C.4-C podle přílohy smě rnice 92/69/EHS IVC.1
IVC.2 IVC.2.1
PODSTATA METODY Odmě ř ený objem inokulovaného minerálního média obsahující známou koncentraci zkuš ební látky (10 – 20 mg DOC nebo TOC na litr), která je jediným zdrojem uhlíku, se provzduš ňuje v temnu nebo v difusním svě tle regulovaným proudem vzduchu bez CO2. Rozklad se sleduje po dobu 28 dnůprostř ednictvím vznikajícího CO2 jímaného v roztoku hydroxidu barnatého nebo sodného, kde se stanoví titrací zbytkového hydroxidu nebo jako anorganický uhlík. Množ ství CO2 vzniklého ze zkuš ební látky (po korekci na CO2 pocházející z čistého inokula) se vyjádř í v procentech TCO2. Stupeňbiologického rozkladu můž e být také vypoč ten z doplňkového stanovení DOC na začátku a na konci inkubace. POPIS METODY Př ístroje a) Baňky na 2 – 5 l vybavené provzduš ňovací trubicí dosahující ažke dnu nádoby a výstupnímo tvorem; b) Magnetické míchačky pro zkouš ení š patněrozpustných látek; c) Absorpč ní lahv; d) Zař ízení pro regulaci a mě ř ení průtoku vzduchu;
e)
IVC.2.2
IVC.2.3
IVC.2.4
Zař ízení pro odstraňování CO2 př i př ípravěvzduchu bez CO2, popř ípadě můž e být použ ita směs kyslíku bez CO2 a dusíku bez CO2 ve správném pomě ru (20 % O 2 a 80 % N2) z lahví se stlač enými plyny; f) Zař ízení na stanovení CO2 buď titračněnebo pomocí analyzátoru anorganického uhlíku; g) Zař ízení pro membránovou filtraci (podle volby); h) Analyzátor DOC (podle volby). Př íprava minerálního média Př íprava zásobních roztokůje popsána v části I.6.2. Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ř edicí vody, př idá se po 1 ml roztokůb) ažd) a doplní se ř edicí vodou na 1 litr. Př íprava a př edbě ž ná úprava inokula Inokulum lze získat z ř ady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaš kových vod, z povrchových vod, z půd nebo z jejich smě si. Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5. Př íprava baněk Jako př íklad jsou uvedeny hodnoty pro baňky na 5 litrů obsahující 3 litry suspense. V př ípaděpouž ití menš ích objemůse hodnoty úmě rněupraví, musí být ovš em zajiš tě no, aby bylo mož né př esněměř it vznikající CO2. Do každé baňky na 5 litrůse př enese 2 400 ml minerálního média. Př idá se vhodné množství př ipraveného inokula (viz I.6.4.1 a I.65), aby koncentrace suspendovaných látek v koneč ném objemu 3 l inokulované smě si byla 30 mg·l1. Eventuálnělze nejdř íve zř edit př ipravený kal v minerálním médiu na suspensi o 1 koncentraci 500 – 1 000 mg·l a poté př idat alikvotní části do baňky na 5 litrů, 1 aby byla dosaž ena koncentrace 30 mg·l ; zajistí se tím vě tš í př esnost. Mohou být použ ity i jiné zdroje inokula (viz I.6.4.2). Inokulovaná smě s se př es noc provzduš ňuje vzduchem bez CO2, aby se ze systému odstranil oxid uhličitý. Oddě lenědo dvojic baně k se ze zásobních roztokůpř idá zkuš ební látka a referenč ní látka tak, aby koncentrace pocházející z chemických látek byla v rozmezí 10 až20 mg DOC nebo TOC na litr; ně které lahve se nasadí jako kontrola inokula bez př idání chemických látek. Špatněrozpustné látky se odváží nebo odmě ř í př ímo do baněk, nebo se postupuje podle př ílohy III. Podle potř eby se jedna baňka použ ije ke kontrole mož ného inhibič ního úč inku zkuš ební látky, a to př idáním zkuš ební i referenč ní látky ve stejných koncentracích jako v ostatních baňkách. Podle potř eby se dalš í baňka použ ije k ově ř ení, zda se zkuš ební látka nerozkládá abioticky, př ičemžse použ ije roztok chemické látky bez inokula (viz I.6.6). Sterilizace se provádí př idáním vhodné koncentrace toxické látky. Ve vš ech baňkách se upraví objem na 3 1 př ídavkem minerálního média bez CO2. Podle potř eby lze odebrat vzorky pro stanovení DOC (viz př íloha II, bod 4) a/nebo pro specifickou analýzu. Poté se na výstup plynůu baněk př ipojí absorpč ní lahve. V př ípaděpoužití hydroxidu barnatého se za každou baňku na 5 litrůzař adí tř i absorpč ní lahve, každá obsahující 100 ml roztoku Ba(OH) 2 o koncentraci 0,0125 mol·l1. Roztok nesmí obsahovat sraženinu síranůa uhlič itanu barnatého a jeho koncentrace musí být stanovena bezprostř edněpř ed použ itím. Je-li použ it hydroxid sodný, spojí se 2 absorpč ní lahve, z nichždruhá slouží jako kontrola, že byl veš kerý CO2 zachycen v první absorpč ní lahvi. K tomuto úč elu se hodí absorpč ní lahve opatř ené sérovými uzávě ry. Do kaž dé absorpč ní lahve se př idá po
IVC.2.5
IVC.2.6
IVC.3 IVC.3.1
200 ml roztoku NaOH o koncentraci 0,05 mol·l1 , cožpostač uje k absorpci veš kerého oxidu uhličitého, který by se uvolnil př i úplném rozkladu látky. Roztok hydroxidu sodného, i kdyžje čerstvěpř ipraven, obsahuje stopy uhličitanů; korekce se provede odeč tením množ ství uhličitanůve slepém pokusu. Počet baněk v typické zkouš ce Baňka 1 a 2: Zkuš ební suspense Baňka 3 a 4: Slepá zkouš ka s inokulem Baňka 5: Kontrolní zkouš ka postupu Dále se doporuč ují se nebo se podle potř eby použijí: Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola Baňka 7: Kontrola toxicity Viz také bod I.6.7. Provedení zkouš ky Zkouš ka se zahájí probubláváním vzduchu bez CO2 suspensí př i průtoku 30 – 1 100 ml·min . Za úč elem analýzy obsahu CO2 se pravidelněodebírají vzorky absorbentu. Doporuč uje se, aby se v průběhu prvních 10 dnůprováděly analýzy každý druhý ažtř etí den a dále pak kaž dý pátý den aždo 28. dne, cožumožní rozpoznat období 10denního období rozkladu. 28. den se (nepovinně) odebere vzorek pro stanovení DOC a/nebo pro specifickou analýzu, změ ř í se pH suspensí a poté se do každé baňky př idá 1 ml koncentrované HCl; provzduš ňuje se př es noc, aby se odstranil CO 2 př ítomný v suspensi. Poslední analýza uvolně ného CO 2 se provede 29. den. Ve dnech, kdy se provádí stanovení CO2, se odpojí absorpč ní lahev s hydroxidem barnatým bliž š í zkuš ební baňce a roztok hydroxidu barnatého se titruje 0,05M HCl za př ítomnosti fenolftaleinu jako indikátoru. Zbývající dvěabsorpč ní lahve se posunou k baňce a na konec ř ady se zař adí nová absorpční lahev se 100 ml č erstvě př ipraveného 0,0125M hydroxidu barnatého. Titrace se provádě jí podle potř eby, např . je-li pozorována v první absorpč ní lahvi zř etelná sraženina a př ed tím, než vznikne viditelná sraženina ve druhé absorpční lahvi, nebo alespoňjednou týdně. Jinou mož ností je provést př i použití NaOH jako absorbentu odběr malého vzorku hydroxidu sodného pomocí injekč ní stř íkač ky (podle použ itého analyzátoru uhlíku) z absorpční lahve, která je nejblíž e k baňce. Vzorek se nastř íkne př ímo do IC-č ásti analyzátoru uhlíku pro analýzu anorganického uhlíku. Obsah druhé absorpč ní lahve se analyzuje pouze na konci zkouš ky s cílem stanovit korekci na mož ný únik CO2. DATA A ZPRÁVY Zpracování výsledků Množ ství CO 2 zachyceného v absorpční lahvi je v př ípadětitrač ního stanovení dáno vztahem: mg CO2 = (100 × CB 0,5 × V × CA) × 44 kde V= objem HCl spotř ebovaný př i titraci 100 ml obsahu absorpč ní lahve (ml), l CB = koncentrace roztoku hydroxidu barnatého (mol·l ), CA = koncentrace roztoku kyseliny chlorovodíkové (mol·ll). Je-li CB 0,0125 mol·ll a C A 0,05 mol·ll, je spotř eba pro titraci 100 ml roztoku Ba(OH)2 50 ml a hmotnost CO2 je dána vztahem: 0,05 44 poč et ml HCl spotř ebované př i titraci 1,1 ml HCl 2 V tomto př ípaděse tedy k př epočtu objemu HCl spotř ebovaného př i titraci na hmotnost vzniklého CO2 použ ije faktor 1,1.
S použ itím př ísluš ných výsledkůtitrace se vypoč te hmotnost CO2 vzniklého ze samotného inokula a inokula se zkuš ební látkou a jejich rozdíl je hmotnost CO 2 vzniklého ze samotné zkuš ební látky. Je-li např . výsledkem titrace samotného inokula 48 ml a inokula se zkuš ební látkou 45 ml, je množ ství CO2 z inokula = 1,1 × (50 48) = 2,2 mg, CO2 z inokula a zkuš ební látky = 1,1 × (50 45)= 5,5 mg, a tedy hmotnost CO2 vzniklého ze zkuš ební látky 3,3 mg. Biologický rozklad v procentech se vypoč te podle vztahu: vzniklý CO2 v mg 100 rozklad v procentech TCO 2 př idaná zkuš ební látka v mg nebo vzniklý CO2 v mg 100 rozklad v procentech TCO př idaný ve zkouš ce v mg 3, 67 př ičemž3,67 je př evodní faktor (44/12) pro uhlík a oxid uhlič itý. Rozklad v procentech se po každém období vypoč te dosazením hodnoty TCO2 vypoč ítané pro kaž dý den aždo doby, kdy byl mě ř en. Př i zachytávání do NaOH se vypoč te hmotnost vzniklého CO2, vyjádř eného jako anorganický uhlík v mg, vynásobením koncentrace anorganického uhlíku v absorpč ní lahvi objemem absorpč ního roztoku. Rozklad v procentech se vypočte podle vztahu: anorg. C ze zkuš eb. baňky v mg anorg. C ze slep. pokusu v mg TCO2 v % =
× 100 TOC př idaný jako zkuš ební látka v mg
IVC.3.2
IVC.3.3 IVC.4
Úbytky DOC se (nepovinně ) vypoč ítají podle bodu I.7. Tento výsledek spolu s ostatními výsledky se zaznamenají do př ísluš ného formulář e př ehledu dat. Platnost výsledků Obsah anorganického uhlíku ve zkuš ební suspensi v minerálním médiu na zač átku zkouš ky musí být menš í než5 % TC a celkové množství CO2 vzniklé na konci slepé zkouš ky s inokulem nesmí za normálních okolností př ekroč it 40 mg na litr média. Jsou-li hodnoty vě tš í než70 mg CO2 na litr, měla by být data i experimentální postup kriticky př ehodnoceny. Viz také I.5.2. Zprávy Viz I. 8. PŘEHLED DAT Dále je uveden př íklad př ehledu dat: ZKOUŠKA NA UVOLŇOVÁNÍ OXIDU UHLIČITÉHO 1. LABORATOŘ 2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY 3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA Název: Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l 1 Počáteční koncentrace chemické látky v médiu: mg·l1 Celkové množ ství uhlíku př idaného do baňky: mg C TCO2: mg CO2
4.
INOKULUM Zdroj: Provedená úprava: Př edbě ž ná úprava, pokud byla provedena: Koncentrace suspendovaných látek v reakční smě si: mg·l-1 TVORBA OXIDU UHLIČITÉHO A ROZLOŽITELNOST Metoda: Ba(OH)2 / NaOH / jiná
5. Čas (dny)
CO2 uvolněný ve zkouš ce (mg)
CO2 uvolně ný ve slepé zkouš ce (mg)
1
3
2
průměr
4
průměr
Celkové množ ství CO2 (průměr ve zkouš ce minus průměr ve slepé zkouš ce) (mg) 1 2
TCO2 kumulativní CO 2 100 TCO2 1
2
průmě r
0 n1 n2 n3
28
Poznámka: podobný formulářlze použ ít i pro referenč ní látku a pro kontroly toxicity. 6. ANALÝZA UHLÍKU (podle volby) Analyzátor uhlíku: Čas (dny) 0 28* * nebo na konci kultivace
1
Slepý pokus (mg·l ) C b(0) C b(t)
1
Zkuš ební látka (mg·l ) C0 Ct
Ct C b(t ) odstraněný DOC v % 1 C0 Cb(0)
100
7.
ABIOTICKÝ ROZKLAD (nepovinné) tvorba CO2 ve steril. podm. po 28 dnech v mg abiotický rozklad v % = 100 TCO 2
IVD. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ C.4-D podle př ílohy smě rnice 92/69/EHS IVD.1
PODSTATA METODY Odmě ř ený objem inokulovaného minerálního média obsahující známou koncentraci zkuš ební chemické látky (100 mg zkuš ební látky na litr, dávající nejméně50 – 100 mg TSK na litr), která je jediným zdrojem organického uhlíku, se míchá v uzavř ené nádoběpř i konstantní teplotě(tolerance ±1 °C nebo menš í) na dobu 28 dnů. Spotř eba kyslíku se stanoví buď mě ř ením množ ství kyslíku (elektrolyticky produkovaného), který je potř ebný k udrž ení konstantního objemu plynu v respirač ní nádobce, nebo ze změ n objemu nebo tlaku (nebo obojího) v aparatuř e. Uvolněný CO2 se jímá v roztoku hydroxidu draselného nebo v jiném vhodném absorbentu. Množství kyslíku, které je zkouš enou látkou spotř ebováno
IVD.2 IVD.2.1
IVD.2.2
IVD.2.3
IVD.2.4
IVD.2.5
(korigované na spotř ebu kyslíku inokulem ve slepé zkouš ce, která se provádí souč asně ), se vyjádř í v procentech TSK nebo CHSK. Popř ípaděmůž e být z doplňkové specifické chemické analýzy provedené na zač átku a na konci kultivace vypočten primární biologický rozklad a z analýzy DOC úplný biologický rozklad. POPIS METODY Př ístroje a) vhodný respirometr; b) regulátor teploty s př esností na ±1 °C nebo lepš í; c) zař ízení pro membránovou filtraci (nepovinné); d) analyzátor uhlíku (nepovinné). Př íprava minerálního média Př íprava zásobních roztokůje popsána v části I.6.2. Smísí se 10 ml roztoku a) s 800 ml ř edicí vody, př idá se po 1 ml roztokůb) ažd) a doplní se ř edicí vodou na 1 litr. Př íprava a př edbě ž ná úprava inokula Inokulum lze získat z ř ady zdrojů: z aktivovaného kalu, ze splaš kových vod, z povrchových vod, z půd nebo z jejich smě si. Viz I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 a I.6.5. Př íprava baněk S použ itím zásobních roztoků se př ipraví samostatné sady roztokůzkuš ební chemické látky a referenč ní chemické látky v minerálním médiu o koncentraci odpovídající obvykle 100 mg chemické látky na litr (dávající nejméně50 – 100 mg TSK na litr). TSK se vypoč te z tvorby amoniových solí, pokud lze vyloučit nitrifikaci, v opačném př ípaděby měl být výpočet založen na tvorbědusičnanů (viz př íloha II, bod 2). Změ ř í se pH a v př ípaděpotř eby se upraví na 7,4 ± 0,2. Špatněrozpustné látky se př idají v pozdě jš ím stádiu (viz dále). Má-li se stanovit toxicita zkuš ební látky, př ipraví se dalš í roztok v minerálním médiu, jenžobsahuje referenč ní i zkuš ební látku, a to ve stejných koncentracích jako v roztocích obsahujících jen jednu látku. Pož aduje-li se stanovení fyzikálně-chemické spotř eby kyslíku, př ipraví se roztok zkuš ební látky obvykle o koncentraci 100 mg TSK na litr sterilizovaný př ídavkem vhodné toxické látky (viz I.6.6). Př ipravené objemy roztokůzkuš ební a referenč ní chemické látky se rozdě lí alespoňduplicitnědo baně k. Do dalš ích baně k se př idá pouze minerální médium (pro kontrolu inokula) a podle potř eby směs roztoku zkuš ební a referenč ní chemické látky a sterilní roztok. Je-li zkuš ební chemická látka š patněrozpustná, odváž í se nebo odmě ř í v tomto stádiu př ímo do baně k, nebo se postupuje podle př ílohy III. Do lahví pro absorpci CO2 se př idá hydroxid draselný, pelety hydroxidu sodného nebo jiný absorbent. Počet baněk v typické zkouš ce Baňka 1 a 2: Zkuš ební suspense Baňka 3 a 4: Slepá zkouš ka s inokulem Baňka 5: Kontrolní zkouš ka postupu Dále se doporuč ují se nebo se podle potř eby použijí: Baňka 6: Sterilní kontrola Baňka 7: Kontrola toxicity Viz také bod I.6.7.
IVD.2.6
IVD.3 IVD.3.1
IVD.3.2
Provedení zkouš ky V baňkách se nechá ustavit pož adovaná teplota a vybrané baňky se inokulují př idáním aktivovaného kalu nebo jiného zdroje inokula, aby nebyla koncentrace suspendovaných látek větš í než30 mg·l1. Zař ízení se sestaví, spustí se míchač ka, př ezkouš í se na vzduchotě snost a zahájí se mě ř ení spotř eby kyslíku. Obvykle není tř eba věnovat zkouš ce žádnou zvláš tní pozornost, kroměnezbytných odeč tůa denní kontroly teploty a míchání. Z pravidelných častých odeč tůse podle postupu uvedeného výrobcem zař ízení vypoč te spotř eba kyslíku. Na konci inkubace, obvykle po 28 dnech, se změ ř í pH v baňkách, a to zvláš tětehdy, je-li spotř eba kyslíku malá nebo větš í nežTSKNH4 (platí pro látky obsahující dusík). V př ípaděpotř eby se na zač átku a na konci odebírá vzorek z respirač ních nádobek pro stanovení DOC nebo pro specifickou analýzu (viz př íloha II, bod 4). Př i poč áteč ním odběru z baňky se zajistí, aby byl znám objem zkuš ební suspense, která v baňce zůstala. Je-li kyslík spotř ebováván látkami obsahujícími dusík, stanoví se př írůstek koncentrací dusič nanůa dusitanůza 28 dnůa vypočte se korekce na spotř ebu kyslíku nitrifikací (př íloha V). DATA A ZPRÁVY Zpracování výsledků Spotř eba kyslíku (mg) zkuš ební látkou za danou dobu (korigovaná na spotř ebu kyslíku inokulem za stejnou dobu ve slepé zkouš ce) se podělí hmotností zkuš ební látky v baňce. Získá se tak hodnota BSK vyjádř ená v mg kyslíku na mg zkuš ební látky: spotř . O2 zk. chem. látkou v mg spotř . O2 ve slep zkouš ce v mg BSK = hmotnost zkuš ební chem. látky v baňce v mg = mg O2 na mg zkuš ební chemické látky. Biologický rozklad v procentech se vypoč te buďz rovnice: BSK (mg O 2 na mg chem. látky) biolog. rozklad v % = % TSK = 100 TSK (mg O2 na mg chem. látky) nebo z rovnice: BSK (mg O 2 na mg chem. látky) % COD = 100 . COD (mg O2 na mg chem. látky) Je tř eba poznamenat, že tyto dvěmetody nemusí poskytovat stejné hodnoty; př ednost se dává první metodě . Pro látky, ježobsahují dusík, se použ ije vhodná hodnota TSK (pro NH4 nebo NO3) podle toho, zda se oč ekává nitrifikace, č i nikoli (př íloha II, bod 2). Jestliže k nitrifikaci dochází, avš ak není úplná, vypočte se korekce na spotř ebu kyslíku př i nitrifikaci ze změ n koncentrace dusitanůa dusič nanů(př íloha V). V př ípadě , že se provádí nepovinné stanovení organického uhlíku a/nebo specifické chemické látky, vypočte se stupeňrozkladu podle bodu I.7. Vš echny výsledky se zaznamenají do př ísluš ného formulář e př ehledu dat. Platnost výsledků Obvyklá spotř eba kyslíku inokulem je 20 – 30 mg O2 na litr a nemě la by být vě tš í 1 1 než 60 mg·l za 28 dnů. Hodnoty vě tš í než 60 mg·l vyžadují kritické př ehodnocení výsledkůa experimentální techniky. Je-li pH mimo rozpě tí 6 – 8,5 a spotř eba kyslíku zkuš ební látkou je menš í než60 %, mě la by být zkouš ka opakována s niž š í koncentrací zkuš ební látky. Viz také I.5.2.
IVD.3.3 IVD.4
Zprávy Viz I.8. PŘEHLED DAT Dále je uveden př íklad př ehledu dat: ZKOUŠKA MANOMETRICKOU RESPIROMETRIÍ 1. LABORATOŘ 2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY 3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA Název: Koncentrace zásobního roztoku: mg·l1 Počáteční koncentrace v médiu, C0: mg·l1 Objem zkuš ební baňky (V): ml TSK nebo CHSK: v mg O2 na mg zkuš ební látky (NH4 , NO3): 4. INOKULUM Zdroj: Provedená úprava: Př edbě ž ná úprava, pokud byla provedena: Koncentrace suspendovaných látek v reakční smě si: mg·l-1 5. SPOTŘEBA KYSLÍKU: BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST Čas (dny) 0 Spotř eba O 2 (mg) zkuš ební látkou Spotř eba O 2 (mg) ve slepé zkouš ce Korigovaná BSK (mg)
BSK na mg zkuš ební látky
7
14
21
28
1 2 a, průměr 3 4 b, průměr (a1 bm) (a2 bm) (a1 – b ) C 0V
( a2 – b) C 0V Rozklad v % D1 (a1) BSK D2 (a2) 100 Průmě r* TSK V = objem média ve zkuš ební baňce *
Hodnoty D1 a D2 by nemě ly být průmě rovány, je-li mezi nimi výrazný rozdíl. Poznámka: Podobný formulářlze použ ít i pro referenč ní látku a pro kontroly toxicity. 6. KOREKCE NA NITRIFIKACI (viz př íloha V) Den i) Koncentrace dusič nanů(mg N na litr) ii) Kyslíkový ekvivalent (4,57 × N × V) (mg) iii) Koncentrace dusitanů(mg N na litr) iv) Kyslíkový ekvivalent (3,43 × N × V) (mg) ii + iv) Celkový kyslíkový ekvivalent
7. ANALÝZA UHLÍKU (podle volby) Analyzátor uhlíku: Čas (dny)
Slepá zkouš ka (mg·l 1 )
0
28
—
—
— —
— —
Rozdíl (N) (N)
Zkuš ební látka (mg·l1)
0 28* * nebo na konci inkubace
(Cbl(0)) (Cbl(t))
(C0) (Ct)
Ct Cbl(t ) odstraně ný DOC v % 1 100 C C 0 bl(0)
8.
9.
SPECIFICKÁ ANALÝZA (nepovinné) Sb = koncentrace ve fyzikálně-chemické kontrole (sterilní) po 28 dnech, Sa = koncentrace v inokulované baňce po 28 dnech. S – Sa bio log ický rozklad v % b 100 Sb ABIOTICKÝ ROZKLAD (nepovinné) a= spotř eba kyslíku ve sterilních baňkách po 28 dnech v mg, a spotř eba kyslíku na mg zkuš ební chemické látky = C0V (viz oddíl 1 a 3) a×100 abiotický rozklad v % = . C0V TSK
IVE. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ZKOUŠKY V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH – metoda C.4-E podle př ílohy směrnice 92/69/EHS IVE.1.
IVE.2 IVE.2.1
IVE.2.2
IVE.2.3
PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY Roztok zkuš ební látky v minerálním médiu, obvykle o koncentraci 2 až5 mg·l 1, se inokuluje malým množ stvím mikroorganismůze smě sné kultury a udržuje se ve zcela naplně ných uzavř ených lahvič kách, v temnu a př i konstantní teplotě . Rozklad se sleduje po dobu 28 dnůprostř ednictvím analýzy rozpuš tě ného kyslíku. Množ ství spotř ebovaného kyslíku po korekci na souběž nou slepou zkouš ku s inokulem se vyjádř í jako TSK nebo CHSK. POPIS METODY Př ístroje a pomůcky a) Lahve pro analýzu BSK se skleně nými zátkami, např . na 250 – 300 ml. b) Vodní lázeňnebo inkubátor pro udržování lahvič ek př i konstantní teplotě (tolerance ±1 °C nebo menš í) v temnu. c) Velké skleněné lahve na 2 – 5 1 pro př ípravu média a pro naplně ní lahvič ek pro analýzu BSK. d) Kyslíková elektroda a oxymetr nebo vybavení a č inidla pro Winklerovu titrač ní metodu. Př íprava minerálního média Př íprava zásobních roztokůje popsána v části I.6.2. Smísí se po 1 ml roztokůa) ažd) a doplní se vodou na 1 litr. Př íprava inokula Inokulum se obvykle získává z výstupu z druhého stupněč istírny odpadních vod nebo laboratorní jednotky zpracovávající př evážnědomovní odpadní vody. Alternativním zdrojem inokula může být povrchová voda. Obvykle se použ ije
IVE.2.4
IVE.2.5
IVE.2.6
jedna kapka (0,05 ml) až5 ml filtrátu na litr média; k nalezení optimálního objemu dané odpadní vody můž e být nezbytné provést pokusy (viz I.6.4.2 a I.6.5). Př íprava lahviček Minerální médium se alespoň20 min silněprovzduš ňuje. Vš echny série zkouš ek se provedou s minerálním médiem ze stejné dávky. Obecněje médium př ipraveno k použ ití po 20 h stání př i zkuš ební teplotě. Pro kontrolu se stanoví obsah kyslíku v médiu; jeho obsah by mě l být asi 9 mg·l1 př i 20 °C. Vš echny operace př enosu média nasyceného vzduchem a jeho plně ní se provedou tak, aby nevznikaly bublinky, např . pomocí nasávaček. Př ipravují se shodné skupiny lahvič ek pro analýzu BSK pro stanovení se zkuš ební látkou a referenč ní látkou v souběž ných sériích experimentů. Př ipraví se dostateč ný poč et lahvič ek, vč etněslepých pokusů, tak, aby v každém zvoleném č asovém intervalu, např . 0, 7, 14, 21 a 28 dnů, bylo možné provést alespoňdvě měř ení spotř eby kyslíku. K tomu, aby bylo mož né rozpoznat 10denní období rozkladu, může být potř eba více lahviček. Velké lahve se př ibliž nědo jedné tř etiny naplní provzduš ně ným médiem. Poté se zvláš ťdo jednotlivých velkých lahví př idá dostateč ný objem zásobního roztoku zkuš ební látky a referenč ní látky, a to obvykle tak, aby nebyla konečná koncentrace chemických látek vě tš í než10 mg·l1. Ke slepému pokusu v dalš í velké lahvi se nepř idávají ž ádné chemické látky. S cílem zajistit, aby aktivita inokula nebyla omezená, nesmí koncentrace kyslíku v lahvič kách pro analýzu BSK klesnout pod 0,5 mg·l 1. Toto omezuje koncentraci zkuš ební látky na 2 mg·l1. Pro látky, které se š patněrozkládají, a pro látky s nízkou hodnotou TSK lze použ ít koncentraci 5 10 mg·l 1. V ně kterých př ípadech se doporuč uje provést soubě žné série měř ení př i dvou různých koncentracích zkuš ební látky, např . př i 2 a 5 mg·l1. Obvykle se TSK poč ítá na základětvorby amonných solí, ale v př ípadech, kdy se př edpokládá nitrifikace nebo kdy dochází k nitrifikaci, se TSK vypoč te na základětvorby dusičnanů (TSKNO3, viz př íloha II, bod 2). V př ípadech, kdy nitrifikace není úplná, se provede korekce na změ ny analyticky stanovených koncentrací dusitanů a dusič nanů(viz př íloha V). Má-li být vyš etř ena toxicita zkuš ební látky (např . v př ípadědř íve zjiš tě né nízké biologické rozložitelnosti), je nezbytné nasadit dalš í sérii lahvič ek. Př ipraví se dalš í velká láhev s provzduš něným minerálním médiem (naplně ná asi do jedné tř etiny objemu), do které se př idá zkuš ební a referenč ní chemická látka o konečné koncentraci obvykle stejné jako v př ípaděostatních velkých lahví. Roztoky ve velkých lahvích se inokulují výstupem z druhého stupněč istírny odpadních vod (jedna kapka nebo 0,05 až5 ml·l1) nebo z jiného zdroje inokula, jako je např . ř íč ní voda (viz I.6.4.2). Nakonec se lahve doplní na objem provzduš ně ným minerálním médiem za použ ití hadič ky, která sahá na dno, aby se dosáhlo dostatečného promíchání. Počet lahviček v typické zkouš ce V typické zkouš ce se použ ijí následující lahvič ky: nejméně10 lahvič ek se zkuš ební látkou a inokulem (zkuš ební suspense), nejméně10 lahvič ek pouze s inokulem (slepá zkouš ka s inokulem), nejméně10 lahvič ek s referenč ní látkou a inokulem (kontrolní zkouš ka postupu), a podle potř eby 6 lahvič ek se zkouš enou látkou, referenč ní látkou a inokulem (kontrola toxicity). Pro rozpoznání 10denního období rozkladu je vš ak potř ebný dvojnásobný počet lahviček. Provedení zkouš ky
IVE.3 IVE.3.1
Vš echny př ipravené roztoky se ihned po př ípravěrozdě lí do př ísluš né skupiny lahvič ek pro analýzu BSK, a to pomocí hadičky zavedené do spodní čtvrtiny velké lahve (nikoliv ke dnu) tak, aby se vš echny lahvič ky pro analýzu BSK zcela naplnily. Jemně se poklepe, aby se odstranily bublinky. V lahvič kách se Winklerovou metodou nebo pomocí oxymetru ihned stanoví obsah rozpuš těného kyslíku k poč átku zkouš ky (k času nula). Obsah lahviček lze konzervovat pro pozdějš í analýzu př ídavkem síranu manganatého a hydroxidu sodného (prvním Winklerovým č inidlem). Př ed provedením zbývajících krokůWinklerovy metody se peč livěuzavř ené lahvič ky obsahující kyslík vázaný ve forměhydratovaného oxidu manganitého skladují v temnu nejdéle 24 h př i teplotě10 – 20 °C. Zbývající soubě ž něpř ipravené lahvič ky se uzavř ou tak, aby v nich nezůstaly bublinky vzduchu, a inkubují se v temnu př i 20 °C. Každá série musí být doprovázena úplnou sérií slepého pokusu s inokulovaným médiem. Ve vš ech sériích se bě hem 28 dnů inkubace v pravidelných intervalech (nejménějednou týdně) stanoví alespoňve dvou lahvič kách obsah rozpuš těného kyslíku. Týdenní vzorky umož ní stanovení rozkladu v procentech ve 14denním období rozkladu, zatímco vzorky odebírané kaž dé 3 – 4 dny umož ní rozpoznat 10denní období rozkladu, cožvyž aduje dvojnásobný poč et lahvič ek. U látek obsahujících dusík se provede korekce na spotř ebu kyslíku př i nitrifikaci. K tomuto úč elu se stanoví koncentrace rozpuš tě ného kyslíku oxymetrem a poté se z lahvičky pro analýzu BSK odebere vzorek pro stanovení dusitanůa dusičnanů. Z př írůstku koncentrace dusitanů a dusič nanů se vypoč te množství spotř ebovaného kyslíku (viz př íloha V). DATA A ZPRÁVY Zpracování výsledků Nejprve se vypoč te BSK, ke které doš lo po každé časové periodě , a to odečtením spotř eby kyslíku (v mg O2 na litr) ve slepém pokusu s inokulem od spotř eby zkuš ební chemickou látkou. Takto korigovaná spotř eba se vydě lí koncentrací zkuš ební látky (mg·l1) a získá se specifická BSK v mg kyslíku na mg zkuš ební látky. Biologická rozložitelnost v procentech se vypoč te jako podíl specifické BSK a specifické TSK (vypoč tené podle př ílohy II, bodu 2) nebo CHSK (stanovené analyticky, viz př íloha II, bod 3), tedy: BSK =
spotř . O2 zk. chem. látkou v mg spotř . O2 ve slep. pokusu v mg hmotnost zkuš ební chem. látky v baňce v mg = mg O2 na mg zkuš ební chemické látky.
rozklad v % =
BSK (mg O 2na mg zkuš eb. chem. látky) 100 TSK (mg O2 na mg zkuš eb. chem. látky)
nebo BSK (mg O2 na mg zkuš eb. chem. látky) 100 COD (mg O2 na mg zkuš eb. chem. látky) Je tř eba poznamenat, že tyto dvěmetody nemusí poskytovat stejné hodnoty; př ednost se dává první metodě . Pro látky, ježobsahují dusík, se použ ije odpovídající hodnota TSK (pro NH4 nebo NO3) podle toho, zda se oč ekává nitrifikace, č i nikoli (př íloha II, bod 2). Jestliže k nitrifikaci dochází, avš ak není úplná, vypočte se korekce na spotř ebu kyslíku př i nitrifikaci ze změ n koncentrace dusitanůa dusič nanů(př íloha V). Platnost výsledků rozklad v % =
IVE.3.2
IVE.3.3 IVE.4
Spotř eba kyslíku ve slepém pokusu s inokulem by neměla být po 28 dnech vyš š í 1 než 1,5 mg·l . Vyš š í hodnoty vyžadují př eš etř ení experimentální techniky. Zbytková koncentrace kyslíku ve zkuš ebních lahvič kách by neměla nikdy 1 klesnout pod 0,5 mg·l . Takto nízké úrovněkyslíku jsou platné pouze tehdy, lze-li použ itou metodou stanovení rozpuš tě ného kyslíku tak nízké úrovněpř esně změ ř it. Viz také I.5.2. Zprávy Viz I.8. PŘEHLED DAT Dále je uveden př íklad př ehledu dat: ZKOUŠKA V UZAVŘENÝCH LAHVIČKÁCH 1. LABORATOŘ 2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY 3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA Název: Koncentrace zásobního roztoku: mg·l 1 Počáteční koncentrace v lahvič ce: mg·l 1 TSK nebo CHSK: v mg O2 na mg zkuš ební látky 4. INOKULUM Zdroj: Provedená úprava: Př edbě ž ná úprava, pokud byla provedena: Koncentrace v reakč ní směsi: mg·l-1 5. STANOVENÍ ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU: Metoda: Winklerova metoda / oxymetr Analýzy lahvič ek Doba kultivace (d)
Slepá zkouš ka (bez chemické látky)
C1 C2
1 2
C1 C2 mb 2
Průměr Zkuš ební chemická látka Průměr
Rozpuš těný kyslík 1 (mg·l ) 0 n1 n2
a1 a2
1 2
a1 a2 mt 2
Poznámka: podobný formulářlze použ ít i pro referenč ní látku a pro kontroly toxicity. 6. KOREKCE NA NITRIFIKACI (viz př íloha V) Doba kultivace i) Koncentrace dusič nanů(mg N na litr) ii) Změna koncentrace dusičnanů(mg N na litr) 1 iii) Kyslíkový ekvivalent (mg·l ) iv) Koncentrace dusitanů(mg N na litr) v) Změna koncentrace dusitanů(mg N na litr) 1 vi) Kyslíkový ekvivalent (mg·l ) iii + vi) Celkový kyslíkový ekvivalent (mg·l1)
7.
0
n1
n2
— — — — —
ÚBYTEK ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU: ROZKLAD V PROCENTECH
n3
Úbytek po n dnech (mg·l1) n1 n2 n3 LAHVIČKA 1: (mt0 mtx) (mb0 mbx ) LAHVIČKA 2: (mt0 mtx) (mb0 mbx ) LAHVIČKA 1: – mb0 – mbx mt0 – mtx 100 % D1 konc. zkuš . chem. látky × TSK LAHVIČKA 2:
– mb0 – mbx mt 0 – mtx 100 %D 2 konc. zkuš . chem. látky × TSK
D – D2 * průměr % D = 1 2 *
Hodnoty nelze průmě rovat, je-li mezi nimi výrazný rozdíl. mt0 = hodnota pro zkuš ební lahvič ku v č ase 0 mtx = hodnota pro zkuš ební lahvič ku v č ase x mb0 = hodnota pro slepý pokus v čase 0 mbx = hodnota pro slepý pokus v čase x Použ ijí se rovně žkorekce na nitrifikaci z bodu iii + vi v oddílu 6. 8. ÚBYTEK ROZPUŠTĚNÉHO KYSLÍKU VE SLEPÉM POKUSU Spotř eba kyslíku ve slepém pokusu je (mb0 mb28) v mg·l 1. Tato spotř eba je 1 důlež itá pro platnost zkouš ky. Mě la by být menš í než1,5 mg·l . IVF. METODA PRO STANOVENÍ „SNADNÉ“ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI POMOCÍ ZKOUŠKY MITI – metoda C.4-F podle přílohy smě rnice 92/69/EHS IVF.1 PODSTATA METODY Mě ř ení spotř eby kyslíku v míchaném roztoku nebo suspensi zkuš ební chemické látky v minerálním médiu inokulovaném speciální kulturou neadaptovaných mikroorganismůse provádí automaticky po dobu 28 dnůza tmy v uzavř eném respirometru př i 25 ± 1 °C. Uvolňovaný oxid uhlič itý se jímá v hydroxidu sodném. Biologická rozlož itelnost se vyjádř í jako spotř eba kyslíku (korigovaná na slepý pokus) vyjádř ená v procentech teoretické spotř eby kyslíku (TSK). Primární biologická rozlož itelnost vyjádř ená v procentech se rovně žvypoč te z doplňkové specifické chemické analýzy provedené na zač átku a na konci kultivace, popř ípaděz analýzy DOC. IVF.2 POPIS METODY IVF.2.1 Př ístroje a pomůcky a) automatický elektrolytický mě ř ičBSK nebo respirometr standardně vybavený 6 baňkami na 300 ml opatř enými uzávě ry obsahujícími absorbent CO2; b) místnost s konstantní teplotou nebo vodní lázeňnastavená na 25 ± 1 °C; c) zař ízení pro membránovou filtraci (nepovinné); d) analyzátor uhlíku (nepovinné). IVF.2.2 Př íprava minerálního média a) Dihydrogenfosforeč nan draselný, KH 2PO4 8,50 Hydrogenfosforeč nan didraselný, K2HPO4 21,75 g Hydrogenfosforeč nan disodný dodekahydrát, 44,60 g Na2HPO4·12H2O Chlorid amonný, NH4Cl 1,70 g
Rozpustí se ve voděa doplní na 1 litr. pH roztoku musí být 7,2. b)
Síran hoř ečnatý heptahydrát, MgSO4·7H2O Rozpustí se ve voděa doplní na 1 litr.
22,50 g
c)
Chlorid vápenatý bezvodý, CaCl2 Rozpustí se ve voděa doplní na 1 litr.
27,50 g
Chlorid ž elezitý hexahydrát, FeCl3·6H2O 0,25 g Rozpustí se ve voděa doplní na 1 litr. Spojí se po 3 ml roztokůa), b), c), a d) a doplní se na 1 litr. Př íprava inokula Odeberou se čerstvé vzorky nejméněz deseti lokalit, kde se použ ívají a vypouš tě jí různé chemické látky. Z míst, jako jsou čistírny mě stských a průmyslových odpadních vod, ř eky, jezera a moř e se odeberou litrové vzorky kalu, povrchových půd, vody atd., které se peč livěsmíchají. Po odstraně ní vyplavených látek a ustálení se pH supernatantu upraví na 7 ± 1 hydroxidem sodným nebo kyselinou fosforeč nou. Vhodným objemem filtrovaného supernatantu se naplní nádoba na aktivaci kalu a kapalina se 23½ h provzduš ňuje. Tř icet minut po ukončení provzduš ňování se odlije př ibližnějedna tř etina celkového objemu supernatantu a k usazenému materiálu se př idá stejný objem roztoku (pH 7), který obsahuje vždy po 0,1 % glukosy, peptonu a dihydrogenfosforečnanu draselného, a obnoví se provzduš ňování. Tento postup se opakuje jednou denně . Kalová jednotka musí být provozovaná podle zásad správné laboratorní praxe: odtok má být čirý, teplota má být udržována př i 25 ± 2 °C, pH má být 7 ± l, kal se má dobř e usazovat, provzduš ňování musí být za vš ech okolností dostateč né, mají být př ítomni prvoci a aktivita kalu se má kontrolovat pomocí referenční látky nejméněkaždé tř i měsíce. Inokulum se nepoužívá dř íve nežpo 1 měsíci kultivace, ale ne později než po čtyř ech mě sících. Proto se v pravidelných intervalech jednou za tř i mě síce odebírají vzorky z 10 míst. K udržení stejné aktivity č erstvého a starého kalu se filtrovaný supernatant aktivovaného použitého kalu mísí se stejným objemem filtrovaného supernatantu č erstvěodebraného kalu pocházejícího z deseti zdrojůa směs se kultivuje podle výš e uvedeného postupu. Kal se použije jako inokulum až18 – 24 h po uvedeném zpracování. Př íprava baněk Př ipraví se následujících 6 baně k: Baňka č . 1: zkuš ební chemická látka v ř edicí vodě, 100 mg·l1 Baňky č . 2, 3, 4: zkuš ební chemická látka v minerálním médiu, 100 mg·l 1 Baňka č . 5: referenč ní látka (např . anilin) v minerálním médiu, 100 mg·l 1 Baňka č . 6: pouze minerální médium Špatněrozpustné chemické látky se odváž í nebo odmě ř í, nebo se zpracují podle př ílohy III, s výjimkou tě ch, u nichžnesmějí být použ ita rozpouš tědla ani emulgátory. Do speciálních uzávě rů vš ech lahví se př idá absorbent oxidu uhlič itého. pH v baňkách č . 2, 3 a 4 se upraví na 7,0. Provedení zkouš ky Baňky č . 2, 3, 4 (zkuš ební suspense), č . 5 (kontrola aktivity), č . 6 (slepý pokus s inokulem) se inokulují malým množ stvím inokula tak, aby byla výsledná d)
IVF.2.3
IVF.2.4
IVF.2.5
IVF.3 IVF.3.1
IVF.3.2
koncentrace kalu 30 mg·l1. Do lahve č . 1 se inokulum nepř idává, slouž í jako abiotická kontrola. Zař ízení se sestaví, př ezkouš í se na vzduchotě snost, spustí se míchačka a v temnu se zahájí mě ř ení spotř eby kyslíku. Denněse kontroluje teplota, míchání, coulometrický zapisovačspotř eby kyslíku a zaznamenají se vš echny změ ny barvy obsahu baněk. Spotř eba kyslíku pro 6 baně k se odeč ítá př ímo, např . š estikanálovým zapisovačem, č ímžse získá kř ivka BSK. Na konci kultivace, obvykle po 28 dnech, se změ ř í pH v baňkách a stanoví se zbytková koncentrace zkuš ební chemické látky a jejích produktůrozkladu a v př ípadě zkouš ení látek rozpustných ve vodětaké koncentrace DOC (postup podle př ílohy II, bodu 4). Zvláš tní pozornost je tř eba vě novat tě kavým látkám. Pokud se př edpokládá nitrifikace, stanoví se podle možnosti koncentrace dusič nanů a dusitanů. DATA A ZPRÁVY Zpracování výsledků Spotř eba kyslíku (mg) zkuš ební látkou za danou dobu (korigovaná na spotř ebu inokulem za stejnou dobu ve slepém pokusu) se podě lí hmotností použ ité zkuš ební látky. Získá se tak hodnota BSK vyjádř ená v mg kyslíku na mg zkuš ební látky: spotř . O2 zk. chem. látkou v mg – spotř . O2 ve slepé zkouš ce v mg BSK = hmotnost zkuš ební chem. látky v baňce v mg = mg O2 na mg zkuš ební chemické látky. Biologický rozklad v procentech se vypoč te buďz rovnice: BSK (mg O 2 na mg chem. látky) biolog. rozklad v % = % TSK = 100 . TSK (mg O2 na mg chem. látky) Pro smě si se TSK vypoč te z elementární analýzy, tak jako pro jednoduché slouč eniny. Použ ije se odpovídající hodnota TSK (TSK NH4 nebo TSKNO3) podle toho, zda se oč ekává nitrifikace, či nikoli (př íloha II, bod 2). Jestliž e k nitrifikaci dochází, avš ak není úplná, vypoč te se korekce na spotř ebu kyslíku př i nitrifikaci ze změn koncentrace dusitanůa dusič nanů(př íloha V). Vypoč te se primární biologický rozklad v procentech z úbytku specifické (výchozí) chemické látky (viz I.7.2): Sb Sa Dt 100 Sb Zjistí-li se př i mě ř ení fyzikálně-chemického úbytku ztráta zkuš ební chemické látky v baňce č. 1, zaznamená se to a jako koncentrace zkuš ební látky (Sb) po 28 dnech se pro výpoč et biologické rozlož itelnosti dosadí tato koncentrace. Stanovuje-li se koncentrace DOC (nepovinné), vypoč te se konečná hodnota biologického rozkladu v procentech podle vztahu: Ct C bt Dt 1 100 C0 Cb0 jak je uvedeno v boděI.7.1. Zjistí-li se př i měř ení fyzikálně -chemického úbytku ztráta DOC v baňce č. 1, použije se př i výpočtu biologického rozkladu v procentech tato koncentrace DOC. Vš echny výsledky se zaznamenají do př ehledu dat. Platnost výsledků Obvyklá spotř eba kyslíku inokulem je 20 – 30 mg O2 na litr a nemě la by být vě tš í než 60 mg·l 1 za 28 dnů. Hodnoty vě tš í než 60 mg·l 1 vyžadují kritické
IVF.3.3 IVF.4
př ehodnocení výsledkůa experimentální techniky. Je-li pH mimo rozpě tí 6 – 8,5 a spotř eba kyslíku zkuš ební látkou je menš í než60 %, mě la by být zkouš ka opakována s niž š í koncentrací zkuš ební látky. Viz také I.5.2. V př ípadě , ž e rozklad anilinu vypoč tený ze spotř eby kyslíku nepř ekroč í po 7 dnech 40 % a po 14 dnech 65 %, považ uje se zkouš ka za neplatnou. Zprávy Viz I.8. PŘEHLED DAT Dále je uveden př íklad př ehledu dat: ZKOUŠKA MITI (I) 1. LABORATOŘ 2. DATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY 3. ZKUŠEBNÍ LÁTKA Název: Koncentrace chemické látky v zásobním roztoku: mg·l1 Počáteční koncentrace chemické látky v médiu, C0: mg·l1 Objem reakč ní smě si, V: ml TSK: mg O2 na litr 4. INOKULUM Místa odbě ru kalu: 1)… 6)… 2)… 7)… 3)… 8)… 4)… 9)… 5)… 10)… Koncentrace suspendovaných látek v aktivovaném kalu po aklimatizaci se syntetickými splaš ky = … mg·l 1. Objem aktivovaného kalu v litru koneč ného média = … ml Koncentrace kalu v koneč ném médiu = … mg·l1 5. SPOTŘEBA KYSLÍKU: BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST Typ použ itého respirometru: 0 a1 a2 a3 b
Spotř eba O 2 (mg) zkuš ební látkou Spotř eba O 2 (mg) ve slepé zkouš ce Korigovaná spotř eba O2 (mg)
BSK na mg zkuš ební látky
Rozklad v % BSK 100 TSK
(a1 b) (a2 b) (a3 b)
( a – b) C 0V
Baňka 1 Baňka 2 Baňka 3 1 2 3 * Průměr
7
Čas (dny) 14 21
28
Poznámka: podobný formulářlze použít i pro referenční látku. * Hodnoty nelze průmě rovat, je-li mezi nimi výrazný rozdíl. 6. ANALÝZA UHLÍKU (podle volby) Analyzátor uhlíku: DOC Baňka Voda + zkuš ební látka Kal + zkuš ební látka Kal + zkuš ební látka Kal + zkuš ební látka Kontrolní slepá zkouš ka
7.
Namě ř ená hodnota a b1 b2 b3 c
Korigovaná hodnota b1 c b2 c b3 c —
úbytek DOC v %
Průmě r
—
—
—
—
a – (b – c) odstraně ný DOC v % 100 a DATA ZE SPECIFICKÉ CHEMICKÉ ANALÝZY
Slepá zkouš ka s vodou Inokulované médium
Zbytkové množ ství zkuš ební chemické látky na konci zkouš ky Sb Sa1 Sa2 Sa3
Rozklad v %
S – Sa rozklad v % b 100 Sb Rozklad v % se vypoč te pro baňky a1, a2, a3. 8. POZNÁMKY Př ipojí se kř ivka závislosti BSK na č ase, je-li k dispozici.
PŘÍLOHA I ZKRATKY A DEFINICE Rozpuš těný kyslík (dissolved oxygen) (mg·l 1) je koncentrace kyslíku, který je rozpuš těn ve vodném vzorku. BSK: Biochemická spotř eba kyslíku (biochemical oxygen demand, BOD) (g) je množství kyslíku, ježje v průbě hu metabolizace zkuš ební látky spotř ebováno mikroorganismy; vyjadř uje se také jako spotř eba kyslíku v gramech na gram zkuš ební látky. (Viz metoda C.5). CHSK: Chemická spotř eba kyslíku (chemical oxygen demand, COD) (g) je množství kyslíku, ježje spotř ebováno v průbě hu oxidace zkuš ební látky horkým kyselým dichromanem; je mě ř ítkem množství př ítomných oxidovatelných látek; vyjadř uje se také v gramech kyslíku spotř ebovaného na gram zkuš ební látky. (Viz metoda C.6). DOC: Rozpuš těný organický uhlík (dissolved organic carbon) je celkový organický uhlík, který je př ítomný v roztoku nebo projde př es filtr o velikosti pórů0,45 µm nebo zůstane v supernatantu po odstř eďování po dobu 15 min př i zrychlení 40 000 m·s 2 (asi 4 000 g). TSK: Teoretická spotř eba kyslíku (theoretical oxygen demand, ThOD) (mg) je celkové množství kyslíku nezbytné pro úplnou oxidaci chemické látky; vypoč te se z molekulového vzorce látky (viz př íloha II, bod 2) a vyjadř uje se také jako množství kyslíku v mg nezbytné na mg zkuš ební látky. DO:
TCO2: Teoretický oxid uhlič itý (theoretical carbon dioxide, ThCO2 ) je množ ství oxidu uhlič itého, které by mě lo vzniknout ze známého nebo změ ř eného obsahu uhlíku ve zkuš ební látce za př edpokladu její úplné mineralizace; vyjadř uje se v mg oxidu uhlič itého uvolněného z 1 mg zkuš ební látky. TOC: Celkový organický uhlík (total organic carbon) ve vzorku je souč tem organického uhlíku v roztoku a v suspensi. IC: Anorganický uhlík (inorganic carbon). TC: Celkový uhlík (total carbon) je souč tem organického a anorganického uhlíku ve vzorku. Primární biologický rozklad: jsou změ ny chemické struktury látky způsobené biologickým působením, vedoucí ke ztrátě specifických vlastnosti látky. Úplný biologický rozklad (aerobní): je stupeňrozkladu látky dosaž ený po jejím úplném zužitkování mikroorganismy, vedoucí k produkci oxidu uhličitého, vody, minerálních solí a nové mikrobiální buně č né hmoty (biomasy). Snadno biologicky rozlož itelná: je dohodnutá klasifikace chemických látek, které proš ly screeningovými zkouš kami úplné biologické rozlož itelnosti; tyto zkouš ky jsou tak př ísné, že lze př edpokládat, ž e se látky budou ve vodném prostř edí za aerobních podmínek rychle a úplněbiologicky rozkládat. Biologicky rozlož itelná: je klasifikace chemických látek, pro ně žexistuje nepochybný důkaz o jejich biologické rozlož itelnosti (primární nebo koneč né) v kterékoli uznávané zkouš ce biologické rozlož itelnosti. Odstranitelnost: je náklonnost látek k jejich odstraně ní př i biologickém č iš tě ní odpadních vod, anižby byl nepř íznivěovlivně n normální průběh č isticích pochodů. Látky snadno biologicky rozlož itelné jsou obecněodstranitelné, avš ak ne vš echny rozlož itelné látky jsou odstranitelné. Mohou zde působit také abiotické procesy. Fáze iniciace: je doba, ve zkouš ce na úbytek rozpuš tě ného organického uhlíku, od inokulace do dosaž ení alespoň 10% biologického rozkladu. Fáze iniciace je č asto různě dlouhá a š patně reprodukovatelná. Doba rozkladu: je doba od konce fáze zdržení do dosažení 90 % maximální dosaž itelné úrovněrozkladu. 10denní období rozkladu: je 10 dnů, které následují bezprostř edněpo dosažení 10% rozkladu. PŘÍLOHA II VÝPOČET A STANOVENÍ NĚKTERÝCH SOUHRNNÝCH PARAMETRŮ V závislosti na zvolené zkuš ební metoděse vyž aduje určení ně kterých souhrnných parametrů. V následujícím oddíle je popsán výpoč et těchto hodnot. Využ ití tě chto parametrůje popsáno u jednotlivých metod. 1. Obsah uhlíku Obsah uhlíku se poč ítá ze známého elementárního složení nebo se stanoví analýzou prvkůve zkuš ební látce. 2. Teoretická spotř eba kyslíku (TSK) Teoretickou spotř ebu kyslíku (TSK) lze vypočítat ze znalosti elementárního slož ení nebo z výsledkůanalýzy prvků. Pro látku
Cc HhClclNn NanaOoPpSs bez nitrifikace, 16 2c 1 2 (h – cl – 3n) 3s 5 2 p 1 2 na – o * TSK NH4 v mg/mg M nebo s nitrifikací, 16 2c 1 2 (h – cl) 5 2 n 3s 5 2 p 1 2 na – o TSK NH4 M 3. Chemická spotřeba kyslíku (CHSK) Chemická spotř eba kyslíku (CHSK) se stanoví metodou C.6. 4. Rozpuš tě ný organický uhlík (DOC) Rozpuš tě ným organickým uhlíkem je podle definice organický uhlík př ítomný ve vodném roztoku chemické látky nebo směsi, který projde př es filtr o velikosti pórů0,45 µm. Odeberou se vzorky ze zkuš ebních nádob a ihned se filtrují pomocí filtračního zař ízení s vhodným membránovým filtrem. Prvních 20 ml (toto množ ství může být př i použ ití malých filtrůzmenš eno) se odstraní. 10 20 ml, nebo v př ípaděnástř iku menš í objem (objem závisí na množ ství potř ebném pro analýzu), se uschová pro analýzu uhlíku. Koncentrace DOC se stanoví pomocí analyzátoru organického uhlíku, který umožňuje př esné stanovení koncentrace uhlíku, která je menš í nebo rovna 10 % poč áteč ní koncentrace DOC použ ité ve zkouš ce. Zfiltrované vzorky, které není mož né analyzovat ve stejný pracovní den, se uchovávají v ledničce 48 h př i 2 – 4 °C nebo delš í dobu př i teplotěniž š í než18 °C. Poznámky: Membránové filtry jsou č asto impregnovány povrchověaktivními látkami za úč elem jejich hydrofilizace. Filtr tedy může obsahovat ažněkolik mg rozpustného organického uhlíku, který můž e ovlivnit stanovení biologické rozlož itelnosti. Povrchověaktivní látky a jiné rozpustné organické látky se z filtrůodstraňují vyvař ením tř ikrát jednu hodinu v deionizované vodě . Filtry lze poté skladovat 1 týden ve vodě . Př i použití filtračních patron pro jedno použití se musí u každé š arže ověř it, zda neobsahuje rozpustný organický uhlík. V závislosti na typu membránového filtru můž e docházet k adsorpci zkuš ební látky na filtru. Doporuč uje se ově ř it, zda k adsorpci zkuš ební chemické látky na filtru nedochází. Místo filtrace lze použ ít k rozliš ení TOC od DOC odstř eďování př i 40 000 m·s1 (4 000 g) po dobu 15 min. Tato metoda vš ak není spolehlivá př i počáteč ní koncentraci DOC < 10 mg·l1, protož e buďnelze odstranit vš echny bakterie, nebo se zpě tněrozpouš tí uhlík, který je souč ástí bakteriální plasmy. LITERATURA — Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 12th ed., Am. Publ. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, p 65. — Wagner, R. von Wasser, 1976, vol 46, 139. — DIN-Entwurf 38 409, Teil 41 – Deutsches Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasserund Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- und Stoffkenngrössen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuss Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e.V. — Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol 13(1), 169. *
Poznámka. M je molekulová hmotnost.
PŘÍLOHA III VYHODNOCENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI ŠPATNĚROZPUSTNÝCH LÁTEK Př i zkouš kách biologické rozložitelnosti š patněrozpustných látek si zaslouž í zvláš tní pozornost následující aspekty. Zatímco odbě r vzorkůhomogenních kapalin je problémem jen zř ídka, u tuhých látek se doporučuje provést homogenizaci vhodnými prostř edky, aby v důsledku nehomogenity nedoš lo k chybám. Zvláš tní pozornost musí být vě nována odbě rům reprezentativních vzorků o několika miligramech ze smě sí látek, které obsahují velké množ ství neč istot. V průbě hu zkouš ek lze použít různé způsoby míchání. Je tř eba vě novat pozornost tomu, aby míchání bylo př imě ř ené právěpro udrž ení látky v disperzi a nedocházelo k př ehř ívání, nadmě rnému pě nění a nadmě rným tř ecím silám. Můž e se použ ít emulgátor vytvář ející stabilní disperzi chemické látky. Nesmí být toxický pro bakterie a nesmí se biologicky rozkládat nebo pě nit za zkuš ebních podmínek. Stejná kritéria jako pro emulgátory platí i pro rozpouš tědla. U tuhých zkuš ebních látek se nedoporučuje používat tuhé nosič e, mohou vš ak být vhodné v př ípaděolejovitých látek. Použ ijí-li se pomocné látky, jako jsou emulgátory, rozpouš tě dla a nosiče, musí být proveden slepý pokus s pomocnou látkou. Pro studium biologické rozložitelnosti š patněrozpustných látek lze použít kteroukoli ze tř í respirometrických zkouš ek (zkouš ka na úbytek CO2, na BSK, zkouš ka MITI). LITERATURA — de Morsier, A. et al. Biodegradation tests for poorly soluble compounds. Chemosphere, 1987, 16, 833. — Gerike, P. The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, 13, 169. PŘÍLOHA IV VYHODNOCENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI LÁTEK POTENCIÁLNĚ TOXICKÝCH PRO INOKULUM Je-li chemická látka podrobena zkouš ení snadné biologické rozlož itelnosti a jeví se jako biologicky nerozlož itelná, doporučuje se postupovat př i pož adavku rozliš it inhibič ní působení od odolnosti látky vůč i rozkladu následujícím způsobem (Reynolds et al., 1987). Ve zkouš kách toxicity i ve zkouš kách biologické rozložitelnosti se použijí podobná nebo stejná inokula. K posouzení toxicity chemických látek zkouš ených ve zkouš kách snadné biologické rozlož itelnosti se doporuč uje použít zkouš ku inhibice dýchání aktivovaného kalu (směrnice 88/302/EHS), stanovení BSK nebo metodu inhibice růstu nebo kombinaci tě chto metod. Nemá-li dojít k inhibici z důvodu toxicity, mě la by být koncentrace zkuš ební látky použ itá ve zkouš kách snadné biologické rozložitelnosti menš í než1/10 hodnoty EC50 (nebo menš í než 1 EC 20) zjiš těné zkouš kou toxicity. Látky s EC50 > 300 mg·l pravdě podobněnemají př i zkouš kách snadné biologické rozlož itelnosti toxické úč inky. Hodnoty EC 50 < 20 mg·l 1 mohou př i následném zkouš ení působit potíže. Mě ly by být použ ity nízké koncentrace, cožvyžaduje použít př ísné a citlivé zkouš ky v uzavř ených lahvič kách nebo materiál znač ený 14C. Použití vyš š ích koncentrací zkuš ební látky můž e být popř ípadě
umož ně no nasazením aklimatizovaného inokula. V tomto př ípaděse vš ak ztrácí specifické kritérium zkouš ky snadné biologické rozlož itelnosti. LITERATURA Reynolds, L. et al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere, 1987, 16, 2259. PŘÍLOHA V KOREKCE NA SPOTŘEBU KYSLÍKU PŘI NITRIFIKACI Chyby způsobené tím, že př i stanovení spotř eby kyslíku ve zkouš kách látek, které neobsahují dusík, není vzata v úvahu nitrifikace, nejsou významné (nejsou vě tš í než5 %), i kdyžje oxidace amoniakálního dusíku ve zkuš ebních nádobách a ve slepém pokusu nepravidelná. U zkuš ebních látek obsahujících dusík můž e dojít ke znač ným chybám. Dochází-li k nitrifikaci, avš ak nikoli úplné, musí být spotř eba kyslíku reakč ní směsí korigována na množ ství kyslíku spotř ebovaného na oxidaci amoniaku a amonných iontůna dusitany a dusič nany, jsou-li změny koncentrace dusitanůa dusičnanůběhem kultivace stanoveny pomocí následujících rovnic: 2 NH 4Cl + 3 O2 = 2 HNO2 + 2 HCl + 2 H2O (1) 2 HNO2 + O 2 = 2 HNO3 (2) Celkově : 2 NH 4Cl + 4 O2 = 2 HNO3 + 2 HCl + 2 H2O (3) Podle rovnice 1 je spotř eba kyslíku př i oxidaci 28 g dusíku obsaž eného v NH4Cl na dusitan 96 g, tzn., ž e př epoč ítávací faktor je 3,43 (96/28). Stejnětak je podle rovnice 3 spotř eba kyslíku př i oxidaci na dusič nan 128 g, tzn. př epočítávací faktor je 4,57 (128/28). Protože popsané reakce následují po sobě, př ičemžjsou realizovány odliš nými druhy bakterií, můž e koncentrace dusitanůstoupat i klesat; př i poklesu roste odpovídajícím způsobem koncentrace dusičnanů. Spotř eba kyslíku př i tvorbědusičnanůse tedy vypoč te vynásobením př írůstku koncentrace dusič nanůfaktorem 4,57, zatímco spotř eba kyslíku př i tvorbědusitanů se vypoč te vynásobením př írůstku koncentrace dusitanůfaktorem 3,43, nebo př i poklesu obsahu dusitanůse ztráty kyslíku vypočtou vynásobením poklesu koncentrace faktorem 3,43. To znamená: spotř eba O 2 př i tvorbědusič nanů= 4,57 × př írůstek koncentrace dusičnanů (4) spotř eba O 2 př i tvorbědusitanů= 3,43 × př írůstek koncentrace dusitanů (5) ztráta O 2 př i úbytku dusitanů: = 3,43 × pokles koncentrace dusitanů (6) Tedy spotř eba O2 př i nitrifikaci = ± 3,43 × změ na koncentrace dusitanů + 4,57 × změna koncentrace dusič nanů (7) a proto spotř eba O2 v důsledku oxidace C = celková pozorovaná spotř eba spotř eba v důsledku nitrifikace (8) Jinými slovy, pokud se stanoví pouze celkový oxidovaný N, je možno za spotř ebu kyslíku v důsledku nitrifikace považ ovat v prvém př iblížení hodnotu 4,57 x př írůstek oxidovaného dusíku. Korigovaná hodnota spotř eby kyslíku v důsledku oxidace C se potom porovnává s TSK NH3 vypoč ítanou podle př ílohy II.
V. METODA PRO STANOVENÍ ROZLOŽITELNOSTI – BIOCHEMICKÁ SPOTŘEBA KYSLÍKU – metoda C.5 podle př ílohy smě rnice 92/69/EHS V.1 V.1.1
V.1.2
V.1.3 V.1.4
V.1.5
V.1.6
V.2
V.3
V.4
METODA ÚVOD Metoda je určena pro mě ř ení biochemické spotř eby kyslíku (BSK) tuhých nebo kapalných organických látek. Data získaná př i této zkouš ce platí pro látky rozpustné ve vodě; tě kavé látky a látky s nízkou rozpustností ve vodělze touto metodou alespoňv zásaděrovněž zkouš et. Metodu lze použít pouze pro organické látky, které nemají v koncentracích použ ívaných př i zkouš ce inhibič ní úč inek na bakterie. Není-li daná látka př i koncentracích používaných ve zkouš ce rozpustná, můž e být nezbytné použ ít pro dosaž ení dobré dispergace zkuš ebního materiálu zvláš tní postupy, např . dispergaci ultrazvukem. Informace o toxicitěchemické látky mohou být už iteč né př i interpretaci nízkých hodnot výsledku zkouš ky a př i volběvhodných zkuš ebních koncentrací. DEFINICE A JEDNOTKY Biochemická spotř eba kyslíku (BSK) je definována jako množ ství rozpuš těného kyslíku, které je nutné k biochemické oxidaci určitého objemu roztoku látky za př edepsaných podmínek. Výsledky se vyjadř ují v gramech spotř eby kyslíku (BSK) na 1 g zkuš ební látky. REFERENČNÍ LÁTKY Je ž ádoucí použít vhodnou referenč ní látku pro kontrolu aktivity inokula. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY Př edem stanovené množství látky rozpuš tě né nebo dispergované ve vhodném, dobř e provzduš ně ném médiu se inokuluje mikroorganismy a kultivuje se v temnu za stálé, definované teploty. BSK se stanoví z rozdílu mezi obsahem rozpuš těného kyslíku na zač átku a na konci zkouš ky. Zkouš ka musí trvat nejméněpě t dní a nejdéle 28 dní. Soubě ž němusí být provedena slepá zkouš ka bez obsahu zkuš ební látky. KRITÉRIA JAKOSTI Stanovení BSK nelze považ ovat za ově ř ené stanovení biologické rozlož itelnosti látky. Tuto zkouš ku lze považ ovat pouze za screeningovou zkouš ku. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY Př ipraví se př edbě žný roztok nebo disperse zkuš ební látky o koncentraci vhodné pro použ itou metodu. Poté se stanoví BSK některou vhodnou vnitrostátní nebo mezinárodní standardizovanou metodou. DATA A HODNOCENÍ BSK př edbě ž ného roztoku se vypoč te vybranou normalizovanou metodou a př epoč te se na BSK vyjádř enou v gramech na 1 g zkuš ební látky. ZPRÁVY Uvede se použitá metoda. Biochemická spotř eba kyslíku se vypočte jako průmě r výsledkůalespoňtř í platných mě ř ení. Musí být uvedeny vš echny informace a poznámky, které jsou důležité pro interpretaci výsledkůa které by mohly ovlivnit výsledek, zejména pokud jde o nečistoty, fyzikální stav, toxické úč inky a vlastní slož ení zkuš ební látky. Použ ití př ísad pro inhibici biologické nitrifikace musí být uvedeno. LITERATURA
Seznam př íkladůstandardizovaných metod: NF T 90-103: Determination of the biochemical oxygen demand. NBN 407: Biochemical oxygen demand. NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemisch zuurstofverbruik (BZV). The determination of biochemical oxygen demand, Methods for the examination of water and associated materials, HMSO, London. ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n days. VI. METODA PRO STANOVENÍ ROZLOŽITELNOSTI - CHEMICKÁ SPOTŘEBA KYSLÍKU – metoda C.6 podle př ílohy směrnice 92/69/EHS VI.1 VI.1.1
VI.1.2
VI.1.3
VI.1.4.
VI.1.5
VI.1.6
*
METODA ÚVOD Metoda je určena pro měř ení chemické spotř eby kyslíku (CHSK) tuhých nebo kapalných organických látek prováděné standardním dohodnutým způsobem za pevněstanovených laboratorních podmínek. Pro provedení této zkouš ky a pro interpretaci výsledkůjsou už itečné informace o chemickém vzorci látky (např . zda jde o soli halogenů, ž eleznaté soli organických slouč enin, organické sloučeniny chloru). DEFINICE A JEDNOTKY Chemická spotř eba kyslíku (CHSK) je mírou oxidovatelnosti látky, která se vyjadř uje jako ekvivalentní množ ství kyslíku oxidač ního č inidla spotř ebovaného látkou za pevněstanovených laboratorních podmínek. Výsledek se vyjadř uje jako množ ství spotř ebovaného kyslíku (COD) v gramech na 1 g zkuš ební látky. REFERENČNÍ LÁTKY Př i vyš etř ování nové látky není nutné vždy použ ívat referenč ní látky. Měly by v první ř aděsloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledkůzískaných jinými metodami. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY Př edem stanovené množ ství látky rozpuš tě né nebo dispergované ve voděse za př ítomnosti síranu stř íbrného jako katalyzátoru oxiduje dichromanem draselným v prostř edí koncentrované kyseliny sírové pod zpětným chladičem. Př ebyteč ný dichroman se stanoví titrací odměrným roztokem síranu amonno-železnatého. U látek obsahujících chlór se pro omezení ruš ení chloridy př idává síran rtuť natý* . KRITÉRIA JAKOSTI Vzhledem k dohodnutým podmínkám stanovení je CHSK „ukazatelem oxidovatelnosti“ a jako takový se použ ívá pro hodnocení organických látek. Ve zkouš ce mohou ruš it chloridy; na stanovení CHSK mohou mít rovněžvliv anorganické redukč ní a oxidač ní látky. U některých cyklických slouč enin a u ř ady tě kavých sloučenin (např . u nižš ích mastných kyselin) nedochází v této zkouš ce k úplné oxidaci. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY Př ipraví se počáteční roztok nebo disperse látky tak, aby bylo dosaženo CHSK od 250 do 600 mg·l 1. Poznámky:
S roztoky obsahujícími rtuťse po použ ití nakládá tak, aby nedoš lo k průniku rtuti do ž ivotního prostř edí.
VI.2
VI.3
VI.4
U š patněrozpustných nebo nedispergovatelných látek lze jemněrozmě lně nou látku nebo kapalinu v množství odpovídajícím 5 mg CHSK odvážit a vpravit př ímo do experimentální aparatury s vodou. Často je výhodné, zejména v př ípaděš patněrozpustných látek, stanovit CHSK upravenou metodou, tj. v uzavř eném systému s vyrovnávač em tlaku (H. Kelkenberg, 1975). Touto upravenou metodou lze č asto úspěš někvantifikovat i látky, u nichžje stanovení konvenční metodou obtíž né – např . kyselinu octovou. Metoda vš ak také selhává v př ípaděpyridinu. Zvýš í-li se koncentrace dichromanu draselného př edepsaná v (1), na 0,25 N (0,0416 M), usnadní se př ímé navaž ování 5 – 10 mg látky, cožje důležité pro stanovení CHSK látek obtíž něrozpustných ve vodě(2). Jinak se CHSK stanoví vhodnou vnitrostátní nebo mezinárodní metodou. DATA A HODNOCENÍ CHSK obsahu experimentální baňky se vypoč te vybranou normalizovanou metodou a př epočte se na CHSK vyjádř enou v gramech na 1 g zkuš ební látky. ZPRÁVY Uvede se odkaz na použitou metodu. Chemická spotř eba kyslíku se vypočte jako průmě r výsledkůalespoňtř í mě ř ení. Jsou-li známy, musí být uvedeny vš echny informace a poznámky, které jsou důlež ité pro interpretaci výsledkůa které by mohly ovlivnit výsledek, zejména pokud jde o neč istoty, fyzikální stav a základní vlastnosti zkuš ební látky. Uvede se použití síranu rtuť natého za úč elem omezení ruš ení chloridy. LITERATURA (1) Kelkenberg, H. Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 8, 146. (2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, 13, 169. Seznam př íkladůnormovaných metod: NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen demand. ISBN O 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromat value) of polluted and waste waters. NF T 90-101 Determination of the chemical oxygen demand. DS 217 Water analysis –Determination of the chemical oxygen demand. DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen demand (COD) within the range above 15 mg per litre. NEN 3235 5.3 Bepaling van bet chemisch zuurstofverbruik. ISO 6060 Water Quality: Chemical oxygen demand dichromate methods.
VII. METODA PRO STANOVENÍ ABIOTICKÉHO ROZKLADU – HYDROLÝZA JAKO FUNKCE pH – metoda C.7 podle př ílohy smě rnice 92/69/EHS VII.1 VII.1.1
METODA Metoda je založena na Pokynech OECD pro zkouš ení (1). ÚVOD Hydrolýza je důležitá reakce ovlivňující abiotický rozklad. Tato reakce má zvláš tní význam u látek, které jsou málo biologicky rozlož itelné; může ovlivnit stálost látky v ž ivotním prostř edí.
VII.1.2
VII.1.3
VII.1.4
Vě tš ina reakcí hydrolýzy probíhá jako reakce pseudoprvního ř ádu, a poločasy jsou tedy nezávislé na koncentraci. To zpravidla dovoluje extrapolaci výsledků získaných s laboratorními koncentracemi na podmínky v životním prostř edí. Mimoto byly u ně kolika typů chemických slouč enin publikovány př íklady uspokojivé shody výsledkůnaměř ených v č isté voděa v př írodních vodách (2). Př i provádění této zkouš ky je užiteč né znát hodnotu tlaku par dané látky. Metoda je použitelná pouze pro látky rozpustné ve vodě. Neč istoty mohou ovlivnit výsledky. Chování látek př i hydrolýze by mě lo být zkoumáno př i hodnotách pH, které se obvykle vyskytují v životním prostř edí (pH 4 – 9). DEFINICE A JEDNOTKY Hydrolýzou se rozumí reakce látky RX s vodou. Tuto reakci lze znázornit prostou výmě nou skupiny X za skupinu OH: RX + HOH → ROH + HX (1) Rychlost, kterou klesá koncentrace látky RX, je dána vztahem: rychlost = k·[H2O]·[RX] (2) Protož e je voda př ítomna vůč i zkouš ené látce ve velkém př ebytku, označ uje se obvykle tento typ reakce jako reakce pseudoprvního ř ádu, ve které je pozorovaná rychlostní konstanta dána vztahem: kpozorov. = k·[H2O] (3) Tuto konstantu lze určit pro danou hodnotu pH a teplotu T z výrazu: 2,303 C k pozorov. log 0 (4) t Ct kde t= č as, C0 = koncentrace látky v čase 0, Ct = koncentrace látky v čase t, 2,303 = př epoč ítací faktor mezi př irozeným logaritmem a dekadickým logaritmem. Koncentrace se vyjádř í v g·l1 nebo v mol·l1. Konstanta kpozorov. má rozmě r [č as]1. „Poločas“ t ½ je definován jako doba potř ebná pro sníž ení koncentrace látky o 50 %, Ct = 1/2·C0 (5) Z rovnic (4) a (5) plyne, ž e t½ = 0,693 / kpozorov. (6) REFERENČNÍ LÁTKY Př i vyš etř ování nové látky není nutné vždy použ ívat referenč ní látky. Měly by v první ř aděsloužit k občasné kontrole provedení metody a ke vzájemnému porovnávání výsledkůzískaných jinými metodami. Jako referenč ní látky byly použ ity následující látky (1): Kyselina acetylsalicylová (aspirin), O,O-diethyl-O-(2-isopropyl-6-methylpyrimidin-4-yl)fosforothioát (dimpylát, diazinon). PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY Látka se rozpustí ve voděv nízké koncentraci; pH a teplota se regulují. Vhodnou analytickou metodou se sleduje pokles koncentrace látky v závislosti na č ase.
Sestrojí se graf závislosti logaritmůkoncentrací na č ase, a je-li závislost lineární, lze zjistit rychlostní konstantu reakce prvního ř ádu ze smě rnice př ímky (viz bod 2). Není-li možné stanovit rychlostní konstantu pro danou teplotu př ímo, je obvykle možné odhadnout ji pomocí Arrheniovy rovnice, která udává teplotní závislost rychlostních konstant. Z průbě hu lineární závislosti logaritmů rychlostních konstant, získaných př i vhodných teplotách, na př evrácené hodnotěabsolutní teploty (K) lze extrapolací získat hodnotu rychlostní konstanty, kterou nebylo možné stanovit př ímo. VII.1.5 KRITÉRIA JAKOSTI V odkazu (2) se uvádí, že mě ř ení rychlostních konstant hydrolýzy lze u 13 tř íd organických sloučenin provádě t s vysokou př esností. Reprodukovatelnost závisí zejména na regulaci pH a teploty a může být ovlivněna př ítomností mikroorganismůa ve speciálních př ípadech koncentrací rozpuš tě ného kyslíku. VII.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY VII.1.6.1 Reakč ní č inidla VII.1.6.1.1 Pufrační roztoky Zkouš ka se provádí př i tř ech hodnotách pH: 4,0, 7,0 a 9,0. K tomuto účelu se za použití chemikálií č istoty p.a. a destilované nebo deionizované vody př ipraví pufrač ní roztoky. Ně které př íklady pufrač ních roztoků jsou uvedeny v doplňku. Použ itý pufrač ní roztok můž e mít vliv na rychlost hydrolýzy; je-li tomu tak, je tř eba zvolit jiný pufrační roztok. V odkazu (2) se doporuč uje použ ít namísto fosforeč nanových pufračních roztokůboritanové a acetátové pufrač ní roztoky. Není-li známa hodnota pH pufračních roztokůpř i zkuš ební teplotě , lze ji stanovit s př esností na ±0,1 pH-metrem kalibrovaným př i zvolené teplotě . VII.1.6.1.2 Zkuš ební roztoky Zkuš ební látka se rozpustí ve zvoleném pufračním roztoku a koncentrace by nemě la př ekročit 0,01 mol·l1 nebo polovinu koncentrace nasyceného roztoku, podle toho, která z tě chto hodnot je niž š í. Použ ití organických rozpouš tě del mísitelných s vodou se doporučuje jen u látek s nízkou rozpustností ve vodě. Množ ství tohoto rozpouš tě dla by mělo být menš í než1 % a nemělo by mít vliv na proces hydrolýzy. VII.1.6.2 Aparatura Použ ijí se skleněné baňky se zabrouš enými zátkami, pro ně žnení vhodné použ ívat mazací tuk. Pokud jsou chemická látka nebo pufrač ní roztok tě kavé, nebo provádí-li se zkouš ka př i zvýš ené teplotě, upř ednostňují se baňky zatavené nebo jinak uzavř ené a s omezeným prostorem nad roztokem. VII.1.6.3 Analytická metoda Použ itá metoda musí být specifická pro stanovení zkuš ební látky př i zkuš ebních koncentracích a můž e být i kombinací vhodných analytických technik. Použ itá analytická metoda bude záviset na povaze látky a musí být dostatečně př esná a citlivá pro zjiš tě ní úbytku poč áteč ní koncentrace o 10 %. VII.1.6.4 Zkuš ební podmínky Zkouš ky se provádí v termostatovaném prostoru nebo za použ ití termostatované lázněnastavené na zvolenou teplotu s tolerancí ±0,5 °C. Teplota se udrž uje a mě ř í s př esností na ±0,1 °C. Vhodnými opatř eními je tř eba zabránit fotolýze.
VII.1.6.5 VII.1.6.5.1
VII.1.6.5.2
VII.1.6.5.3
VII.1.6.5.4
U snadno oxidovatelných látek je nezbytné odstranit rozpuš těný kyslík (např . 5minutovým probubláváním roztoku dusíkem nebo argonem př ed př ípravou roztoku). Zkuš ební postup Př edběž ná zkouš ka U vš ech látek se provede př edbě žná zkouš ka př i teplotě50 ± 0,5 °C pro tř i hodnoty pH: 4,0, 7,0 a 9,0. Provede se dostatečný počet mě ř ení, aby bylo možné pro každé pH odhadnout, zda je př i 50 °C poloč as (t½) menš í než2,4 h nebo zda po 5 dnech dojde k hydrolýze méněnež10 %. (Lze odvodit, ž e tyto hodnoty odpovídají za podmínek, které se nejč astě ji vyskytují v životním prostř edí (25 °C), poloč asu kratš ímu nežjeden den, resp. delš ímu než1 rok). Jestliže se v př edbě žném experimentu ukáž e, že př i 50 °C dojde př i vš ech tř ech hodnotách pH (4, 7, 9) za 2,4 h k hydrolýze 50 nebo více procent zkuš ební látky, nebo ž e po 5 dnech dojde k hydrolýze méně než 10 % zkuš ební látky, nejsou dalš í experimenty nezbytné. V ostatních př ípadech a pro hodnoty pH, u nichžvýš e uvedené podmínky nenastanou, se provede zkouš ka 1. Zkouš ka 1 Zkouš ka 1 se provede př i jedné teplotě, nejlépe př i 50 ± 0,5 °C, a pokud mož no za sterilních podmínek př i pH, pro něžse v př edbě ž né zkouš ce ukázala nutnost dalš ích zkouš ek. Zvolí se dostateč ný poč et vzorků, aby byl pokryt stupeňhydrolýzy 20 až70 % a bylo tak možné ově ř it, ž e jde př i specifikovaném pH o reakci pseudoprvního ř ádu. Pro kaž dé pH, př i ně mžse zkouš ka 1 provede, se stanoví ř ád reakce. Odhad rychlostní konstanty př i 25 °C: Rozhodnutí o dalš ím experimentálním postupu závisí na tom, zda lze ze zkouš ky 1 usuzovat na reakci pseudoprvního ř ádu, č i nikoliv. Pokud nelze ze zkouš ky 1 s jistotou usuzovat na reakci pseudoprvního ř ádu, je tř eba provést dalš í experimenty podle zkouš ky 2. Vyplývá-li s jistotou ze zkouš ky 1, že jde o rekci pseudoprvního ř ádu, provedou se dalš í experimenty podle zkouš ky 3. (Za speciálních okolností lze vypočítat rychlostní konstanty př i 25 °C z konstant př i 50 °C vypoč tených s použitím výsledkůzkouš ky 1, viz bod 3.2). Zkouš ka 2 Tato zkouš ka se provede př i kaž dém pH, pro ně žse její provedení ukázalo na základěvýsledkůzkouš ky 1 nezbytným, a to — buďpř i teplotěniž š í než40 °C, — nebo př i dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liš í nejméněo 10 °C. Př i kaž dém pH a př i kaž dé teplotě, př i nichžse má provést zkouš ka 2, se v př imě ř ených intervalech zvolí nejméně6 bodůtak, ž e stupeňhydrolýzy je v oblasti 20 až70 %. Pro jedno pH a pro jednu teplotu se provede měř ení dvakrát. Pokud se zkouš ka 2 provádí př i dvou teplotách nad 50 °C, provede se mě ř ení dvakrát nejlépe př i nižš í z tě chto dvou teplot. Př i kaž dém pH a př i kaž dé teplotě, př i nichžse provede zkouš ka 2, se podle možnosti uvede grafický odhad poločasu (t½). Zkouš ka 3 Tato zkouš ka se provede př i kaž dém pH, pro ně žse její provedení ukázalo na základěvýsledkůzkouš ky 1 nezbytným, a to — buďpř i teplotěniž š í než40 °C,
VII.2
VII.3 VII.3.1
VII.3.2
VII.4
— nebo př i dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liš í nejméněo 10 °C. Př i kaž dém pH a př i kaž dé teplotě, př i nichžse má provést zkouš ka 3, se zvolí tř i body, první v čase 0, druhý a tř etí př i stupni hydrolýzy vyš š ím než30 %; vypoč te se konstanta kpozorov. a poloč as t ½. DATA Jde-li o reakci pseudoprvního ř ádu, lze vypoč ítat hodnoty konstanty kpozorov. pro každé pH a kaž dou zkuš ební teplotu z grafu závislosti hodnot logaritmů koncentrací na čase pomocí rovnice: kpozorov. = směrnice × 2,303 (7) Dále je mož né z rovnice (6) vypoč ítat t½. Podle potř eby se s použ itím Arrheniovy rovnice stanoví k25 °C. Pokud chování neodpovídá reakci pseudoprvního ř ádu, viz bod 3.1. ZPRÁVA PROTOKOL O ZKOUŠCE Protokol o zkouš ce má pokud mož no obsahovat následující údaje: — specifikaci látky; — vš echny výsledky získané s referenč ními látkami; — podstatu a podrobnosti použ ité analytické metody; — pro kaž dou zkouš ku: teplotu, pH, slož ení pufrač ního roztoku, tabulku se vš emi údaji o koncentraci a č ase; — u reakcí pseudoprvního ř ádu hodnoty kpozorov. a t½, vč etněmetody jejich výpočtu; — u reakce, která neodpovídá pseudoprvnímu ř ádu, graf průběhu závislosti logaritmu koncentrace na čase; — vš echny informace a pozorování nezbytné pro interpretaci výsledků. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Můž e existovat mož nost vypoč ítat př ijatelné hodnoty rychlostních konstant (př i 25 °C) zkuš ebních látek za př edpokladu, ž e pro homology chemické látky již existují experimentální údaje pro aktivač ní energii a za př edpokladu, že lze důvodněočekávat, ž e aktivač ní energie zkuš ební látky je stejného ř ádu. LITERATURA (1) OECD, Paris 1981, Test Guideline 111, Decision of the Council C(81), 30 final. (2) W. Mabey, T. Mill.: Critical Review of Hydrolysis of Organic Compounds in Water Under Environmental Conditions. J. Phys, Chem. Ref. Data, 1978, 7 (2), 383-415. DODATEK Pufrační roztoky
A.
CLARK A LUBS Hodnoty pH uvedené v následujících tabulkách byly vypoč teny na základěmě ř ení potenciálu za použ ití Sörensenových standardních rovnic. Skuteč né hodnoty pH jsou o 0,04 vyš š í nežhodnoty v tabulce. Slož ení 1 1 kalium-hydrogenftalát (0,1 mol·l ) a HCl (0,1 mol·l ) př i 20 °C 2,63 ml HCl + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml 1
pH 3,8
1
kalium-hydrogenftalát (0,1 mol·l ) a NaOH (0,1 mol·l ) př i 20 °C 0,40 ml NaOH + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml 3,70 ml NaOH + 50 ml ftalátu doplnit do 100 ml
4,0 4,2
1
1
dihydrogenfosforečnan draselný (0,1 mol·l ) a NaOH (0,1 mol·l ) př i 20 °C 23,45 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml 29,63 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml 35,00 ml NaOH + 50 ml fosforečnanu doplnit do 100 ml 1
1
1
H3BO3 (0,1 mol·l ) v KCl (0,1 mol·l ) a NaOH (0,1 mol·l ) př i 20 °C 16,30 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml 21,30 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml 26,70 ml NaOH + 50 ml kyseliny borité doplnit do 100 ml
B.
8,8 9,0 9,2
KOLTHOFF A VLEESHOUWER Slož ení 1 1 Monokalium-citrát (0,1 mol·l ) a NaOH (0,1 mol·l ) př i 18 °C (je tř eba př idat malý krystalek thymolu, aby nevznikaly plísně ) 2,0 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 9,0 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml 16,3 ml NaOH + 50 ml citrátu doplnit do 100 ml
C.
6,8 7,0 7,2
pH
3,8 4,0 4,2
SÖRENSEN Borax (0,05 mol·l1) a HCl (0,1 mol·l1 ) Slož ení ml boraxu ml HCl
8,0 8,5 9,0 9,5 10,0
2,0 1,5 1,0 0,5 0,0
pH Sörensen 18 °C 8,91 9,01 9,09 9,17 9,24
Walbum 10 °C 8,96 9,06 9,14 9,22 9,30
40 °C 8,77 8,86 8,94 9,01 9,08
70 °C 8,59 8,67 8,74 8,80 8,86
Borax (0,05 mol·l1) a NaOH (0,1 mol·l1) Slož ení ml boraxu ml HCl
10,0 9,0 8,0 7,0
0,0 1,0 2,0 3,0
pH Sörensen 18 °C 9,24 9,36 9,50 9,68
Walbum 10 °C 9,30 9,42 9,57 9,76
40 °C 9,08 9,18 9,30 9,44
70 °C 8,86 8,94 9,02 9,12
VIII. METODA PRO STANOVENÍ TOXICITY PRO ŽÍŽALY – ZKOUŠKA NA UMĚLÉ PŮDĚ– metoda C.8 podle přílohy smě rnice 92/69/EHS VIII.1 VIII.1.1
VIII.1.2
METODA ÚVOD V této laboratorní zkouš ce se zkouš ená látka př idá do umě lé půdy, do které se na 14 dní umístí ž ížaly. Po této době(a nepovinněi po sedmi dnech) se vyš etř í letální úč inek látky na ž ížaly. Zkouš ka je metodou relativněkrátkodobého orientač ního zjiš tě ní účinku chemických látek na žíž aly př i dermálním a potravním př íjmu. JEDNOTKY A DEFINICE
LC50: Koncentrace látky, vyhodnocená jako hodnota, př i které v průbě hu zkouš ky dojde k uhynutí 50 % pokusných zvíř at. VIII.1.3
REFERENČNÍ LÁTKA Referenč ní látka se použ ívá periodicky jako prostř edek pro důkaz, že se citlivost zkuš ebního systému podstatněnezmě nila. Jako referenč ní látka se doporuč uje chloracetamid analytické č istoty.
VIII.1.4
PRINCIP ZKOUŠKY Půda př edstavuje proměnlivé prostř edí, takž e se pro zkouš ku používá peč livě definovaná umě lá hlinitá půda. V definované umě lé půděse chovají dospě lé ž íž aly druhu Eisenia foetida (viz poznámku v př íloze) a exponují se různým koncentracím zkouš ené látky. Obsah nádob se 14 dní (a nepovinněi 7 dní) po zač átku zkuš ky rozprostř e na podložku a spočítají se ž ížaly, které př i jednotlivých koncentracích př ež ijí.
VIII.1.5
KRITÉRIA KVALITY Zkouš ka je navržena tak, aby byla z hlediska zkuš ebního substrátu a organismů co nejreprodukovatelně jš í. Úhyn v kontrolních skupinách nesmí na konci zkouš ky př ekroč it 10 %, jinak je zkouš ka neplatná. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
VIII.1.6 VIII.1.6.1
Látky
VIII.1.6.1.1 Substrát pro zkouš ku Jako základní substrát pro zkouš ku se použ ívá definovaná umělá půda. (a) Základní substrát (procenta se rozumí na bázi suché hmotnosti): - 10 % sfagnové raš eliny (s pH co nejblíž e 5,5 až6,0, bez viditelných zbytkůrostlin a jemněmleté), - 20 % kaolinitického jílu, pokud mož no s více než50 % kaolinitu, - asi 69 % průmyslového kř emenného písku (dominantní jemný písek s více než50 % č ástic velikosti 0,05 až0,2 mm). Pokud zkouš ená látka není dostateč nědispergovatelná ve vodě , je tř eba ponechat k dispozici pro pozdějš í míš ení se zkouš enou látkou 10 g na kaž dou zkuš ební nádobu, - asi 1 % uhlič itanu vápenatého (CaCO 3), práš kového, chemicky č istého, př idaného pro úpravu pH na 6,0 0,5. (b) Substrát pro zkouš ku: Substrát pro zkouš ku obsahuje základní substrát, zkouš enou látku a deionizovanou vodu. Obsah vody činí asi 25 až42 % suš iny základního substrátu. Obsah vody v substrátu se stanoví vysuš ením vzorku na konstantní hmotnost př i 105 oC. Klíč ovým kritériem je, že mě lá půda musí být vlhč ena tak, aby neobsahovala stojící vodu. Je tř eba vě novat péč i mísení, aby se dosáhlo rovnoměrného rozdě lení zkouš ené látky a substrátu. působ uvedení zkouš ené látky do substrátu je tř eba uvést ve zprávě . (c) Kontrolní substrát: Kontrolní substrát obsahuje základní substrát a vodu. Př idává-li se aditivní č inidlo, musí dalš í kontrola obsahovat stejné množ ství aditivního činidla.
VIII.1.6.1.2 Nádoby pro zkouš ku Skleněné nádoby o obsahu asi jednoho litru (ř ádně př ikryté plastovými víky, miskami nebo plastovou fólií s otvory pro vě trání), naplně né množ stvím vlhkého substrátu pro zkouš ku nebo kontrolního substrátu, ekvivalentním 500 g suchého substrátu. VIII.1.6.2 Experimentální podmínky Nádoby je tř eba uchovávat v klimatizovaných komorách př i 20 2 oC se stálým svě tlem. Intenzita svě tla by měla být 400 až800 lux. Doba trvání zkouš ky je 14 dní, ale je možné nepovinněvyhodnotit úhyn sedm dní po zač átku zkouš ky. VIII.1.6.3 Pracovní postup Zkouš ené koncentrace Koncentrace zkouš ené látky se vyjadř ují jako hmotnost látky na hmotnost suš iny základního substrátu (mg.kg-1). Zkouš ka pro zjiš tě ní rozsahu koncentrací Aby se získaly informace o vhodném rozmezí koncentrací pro definitivní zkouš ku provede se př edběž ná zkouš ka, kterou se zjistí rozsah koncentrací, které právě způsobují úhyn od 0 do 100 %. Látku je tř eba zkouš et př i tě chto koncentracích: 1000; 100; 10; 1; 0,1 mg -1 látky.kg substrátu pro zkouš ku (jako suš ina). Je-li tř eba provést úplnou definitivní zkouš ku, stačí pro zkouš ku pro zjiš tění rozsahu koncentrací jedna zkuš ební skupina na kaž dou koncentraci a jedna pro neexponovanou kontrolu, kaž dá o 10 ž ížalách. Definitivní zkouš ka Výsledky zkouš ky pro zjiš tě ní rozsahu koncentrací se použ ijí pro volbu nejméně pě ti koncentrací, odstupňovaných v geometrické posloupnosti, právěpokrývajících rozsah 0 až100 % mortality, liš ících se o konstantní č initel nepř evyš ující 1,8. Zkouš ky používající tyto ř ady koncentrací musí umož nit co nejpř esnějš í stanovení hodnoty LC 50 a jejích mezí spolehlivosti. V definitivní zkouš ce se používají nejméněč tyř i zkuš ební skupiny na kaž dou koncentraci a č tyř i neexponované kontrolní skupiny, kaž dá o 10 ž ížalách. Výledky za tyto replikované skupiny se uvedou průměrem a standardní odchylkou. Tam, kde úhyn 0 % a 100 % vyvolají dvěpo sobě následující koncentrace, jež jsou vůč i soběv poměru 1,8 , jsou tyto dvěhodnoty dostatečné pro identifikaci oblasti, do které spadá LC 50. Mísení základního substrátu a zkouš ené látky Substrát pro zkouš ení musí být vš ude tam kde je to mož né př ipraven bez jakýchkoli př ídavných č inidel jiných nežvoda. Těsněpř ed zač átkem zkouš ky se smísí emulze nebo disperze zkouš ené látky v deionizované voděnebo v jiném rozpouš tědle se základním substrátem pro zkouš ení, nebo se na ně j rovnoměrně rozstř íká rozpraš ovač em pro chromatografii nebo podobným rozpraš ovač em. Je-li zkouš ená látka nerozpustná ve vodě , můž e se rozpustit v co nejmenš ím objemu vhodného organického rozpouš tě dla (např . hexanu, acetonu nebo chloroformu).
K rozpuš tě ní, dispergaci nebo emulgaci zkouš ené látky lze použít pouze č inidla, která snadno tě kají. Substrát pro zkouš ení je nutné př ed použ itím odvě trat. Množ ství odpař ené vody je nutné nahradit. Kontrolní zkouš ka musí obsahovat stejné množství vš ech aditivních činidel. Není-li zkouš ená látka rozpustná, dispergovatelná ani emulgovatelná v organických rozpouš tě dlech, př ipraví se směs 10 g kř emenného písku a množství zkouš ené látky potř ebné pro př ípravu 500 g zkuš ebního substrátu a ta se smíchá se 490 g zvlhč eného základního substrátu (hmotnost se rozumí v suš ině ). Pro kaž dou jednotlivou vsázku použitou ve zkouš ce se do skleně né nádoby vpraví množ ství vlhkého substrátu pro zkouš ku, ekvivalentní 500 g suš iny, a na povrch substrátu se umístí 10 ž íž al, které byly př ed použ itím kondicionovány po 24 hodiny v podobném vlhkém základním substrátu, poté rychle omyty a zbaveny př ebyteč né vody absorpcí filtrač ním papírem. Nádoby se př ikryjí plastovými víky s otvory, miskami nebo fólií, aby se zabránilo vysychání substrátu, a udržují se v podmínkách zkouš ky po 14 dní. Vyhodnocení je tř eba provést 14 dní (a nepovinně i sedm dní) po zahájení zkouš ky. Substrát se rozprostř e na podnos ze skla nebo nerezové oceli. Žížaly se vyš etř í a stanoví se poč et př ež ívajících jedinců. Žížaly se považují za mrtvé, jestliže nereagují na jemné mechanické podráž dění na př edním konci. Provádí-li se vyš etř ení po sedmi dnech, nádoba se znovu naplní substrátem a ž íž aly se znovu vloží na povrch téhožsubstrátu. VIII.1.6.4 Organizmy použité ve zkouš ce Ke zkouš ce musí být použ ity dospě lé ž íž aly Eisenia foetida (viz poznámku v př íloze) (alespoňdva mě síce staré s klitellem) o hmotnosti (ve vlhkém stavu) 300 až600 mg. (Pokud se týká metody chovu, viz př íloha.) VIII.2
VÝSLEDKY
VIII.2.1
ZPRACOVÁNÍ A VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ Uvedou se koncentrace zkouš ené látky s odpovídajícím procentem mrtvých žíž al. Jsou-li údaje vyhovující, stanoví se hodnota LC50 a meze spolehlivosti (p = 0,05) s použitím standardních metod (Litchfield a Wilcoxon, 1949, nebo ekvivalentní metoda). LC50 se udává v mg zkouš ené lát ky na 1 kg substrátu pro zkouš ku (v suš ině ). V př ípadech, kdy sklon kř ivky koncentrací je pro vý poč et LC 50 př ílišstrmý, stač í grafický odhad této hodnoty. Tam, kde úhyn 0 % a 100 % vyvolají dvěpo sobě následující koncentrace, jež jsou vůči soběv poměru 1,8 jsou tyto dvěhodnoty dostateč né pro identifikaci rozsahu, do kterého spadá LC50.
VIII.3
ZPRÁVA
VIII.3.1
PROTOKOL O ZKOUŠCE Je-li to možné, má protokol obsahovat tyto informace: - prohláš ení, že zkouš ka byla provedena v souladu s výš e uvedenými kritérii kvality, - o druhu provedené zkouš ky (zkouš ka pro zjiš tě ní rozsahu koncentrací a (nebo) definitivní zkouš ka),
-
-
VIII.4
př esný popis experimentálních podmínek nebo konstatování, že zkouš ka byla provedena v souladu s metodou; je nutno uvést veš keré odchylky, př esný popis, jak byla zkouš ená látka smísena se základním substrátem, informace o organismech použ itých ve zkouš ce (druh, stář í, stř ední hmotnost a rozsah jednotlivých hodnot, podmínky chovu, dodavatel), metoda použitá ke stanovení LC50, výsledky zkouš ky včetněvš ech použ itých údajů, popis pozorovaných symptomůnebo změn v chování organizmůpouž itých ve zkouš ce, úhyn v kontrolních zkouš kách, LC50 nebo nejvyš š í zkouš ená koncentrace nevyvolávající úhyn a nejniž š í zkouš ená koncentrace vyvolávající 100 % úhyn 14 dní (a nepovinněsedm dní) od zač átku zkouš ky, grafické znázornění kř ivky koncentrace/odezva, výsledky získané s referenč ní látkou, aťv souvislosti s touto zkouš kou nebo dř ívějš ích zkouš ek kontroly jakosti.
LITERATURA (1) OECD, Paris, 1981. Test Guideline 207, Decision of the Council C(81) 30 final. (2) Edwards, C.A. a Lofty, J.R., 1977, Biology of Earthworms, Chapman and all, London. (3) Bouche, M.B., 1972, Lombriciens de France, Écolo gieet Systématique, Institut National de la Recherche Agronomique, 671 str. (4) Litchfield, J.T., Wilcoxon, F., A simplified method of evaluation dose effect experiments. J. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, str. 99 (5) Commission of the European Communities, Development of a standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983. (6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Landund Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfah rensvorschlag "Toxizitätstest am Regenwurm Eisenia foetida in künstlichem Boden", in Rudolph/Boje, Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986. PŘÍLOHA Chov žíž al před zkouš kou Pro úč ely chovu se 30 až50 dospělých žíž al umístí do chovné schránky s č erstvým substrátem a vyjmou se po 14 dnech. Tyto jedince je mož né použ ít pro dalš í chovné vsázky. Žížaly vylíhlé ze zámotkůse použ ijí ke zkouš ení, kdyžjsou dospě lé (v uvedených podmínkách po dvou ažtř ech mě sících). Podmínky chovu Klimatizovaná komora: teplota 20 2 oC, nejlépe s neustálým svě tlem (intenzita 400 - 800 lux). Chovné nádoby: vhodné mě lké nádoby o objemu 10 až20 l. Substrát: Eisenia foetida je mož né chovat v různých zvíř ecích exkrementech. Jako chovné médium se doporuč uje použ ívat smě s 50 % obj. raš eliny a 50 % obj.hově zího
nebo koňského hnoje. Médium musí mít pH asi 6 až7 (upraví se uhlič itanem vápenatým) a nízkou iontovou vodivost (méněnež6 mmhos nebo 0,5 % koncentraci solí). Substrát musí být vlhký, ale ne př ílišmokrý. Vedle výš e uvedené metody je mož né použ ívat i jiné úspěš né postupy. Poznámka: Eisenia foetida existuje ve dvou odrůdách, které ně kteř í taxonomové rozliš ili na druhy (Bouche, 1972). Jsou si morfologicky podobné, avš ak jedna, Eisenia foetida foetida, má na č láncích typické př íč né pruhování nebo páskování a druhá, Eisenia foetida andrei, toto postrádá a má pestř eč ervené zbarvení. Pokud je to možné, je tř eba použ ívat Eisenia foetida andrei. Jiné druhy je mož né použ ít, pokud existuje potř ebná metodika. IX. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – ZAHNWELLENSOVA ZKOUŠKA – metoda C.9 podle př ílohy smě rnice 92/69/EHS IX.1 IX.1.1
METODA ÚVOD Cílem metody je stanovení úplné biologické rozlož itelnosti ve voděrozpustných netě kavých organických látek statickou zkouš kou, př i které jsou tyto látky vystaveny úč inku vysokých koncentrací mikroorganismů. Př i interpretaci výsledkůmusí být zohledněna fyzikálně -chemická adsorbce na suspendované pevné č ástice. Zkouš ené látky jsou zř eďovány v koncentracích odpovídajících hodnotám DOC nebo TOC od 50 do 400 mg.l-1 nebo hodnotám CHSK 100 - 1000 mg.l-1. Tyto poměrněvysoké koncentrace umožňují dostateč něspolehlivou analýzu. Slouč eniny s toxickými vlastnostmi mohou vš ak proces rozkladu zpomalit. Mírou biologické rozlož itelnosti zkouš ené látky v této metodě je úbytek rozpuš těného organického uhlíku nebo chemická spotř eba kyslíku. Specifickými analytickými metodami můž e být stanovena i primární biologická rozložitelnost látek. Touto metodou mohou být zkouš eny pouze organické látky, které př i koncentracích použitých ve zkouš ce: — jsou za podmínek zkouš ky rozpustné ve vodě , — mají za podmínek zkouš ky nevýznamnou tenzi par, — neinhibují bakterie, — jsou ve zkuš ebním systému jen omezeněadsorbovány, — pěně ním nesniž ují svou koncentraci ve zkouš eném roztoku. Pokud jsou stanoveny nízké nebo marginální hodnoty biologické rozlož itelnosti, je nutné pro interpretaci výsledků znát obsah nejdůlež itě jš ích komponent zkouš ené látky. Pro interpretaci nižš ích hodnot biologické rozlož itelnosti a volbu vhodných koncentrací zkouš ené látky jsou důlež ité rovněžinformace o toxicitězkouš ené látky.
IX.l.2
DEFINICE A JEDNOTKY
Procentuální hodnota biologického rozkladu v č ase se vypočítá podle vztahu: CT CB DT % 1 . 100 C A CBA kde: DT = rozklad ( %) v čase T, Ca = hodnoty DOC (nebo CHSK) zkouš ené látky 3 h od zahájení zkouš ky (mg.l-1), CT = hodnoty DOC (nebo CHSK) zkouš ené látky v doběodbě ru vzorku (mg.l-1), CB = hodnoty DOC (nebo CHSK) kontroly v doběodbě ru vzorku (mg.l-1), CBA = hodnoty DOC (nebo CHSK) kontroly 3 h od zahájení zkouš ky (mg.l-1). Stupeňrozlož itelnosti se zaokrouhluje na celá procenta. Jako procentuální rozlož itelnost je udáván procentuální úbytek hodnot DOC (nebo CHSK) zkouš ené látky. Rozdíl mezi hodnotami namě ř enými po 3 h po zahájení zkouš ky a mezi vypoč ítanými a zejména vš ak namě ř enými poč áteč ními hodnotami, poskytuje už itečnou informaci o rozlož itelnosti zkouš ené látky (viz 3.2). IX.l.3 STANDARDNÍ LÁTKY Př i posuzování rozlož itelnosti nových látek mohou být v jednotlivých př ípadech využ ity referenč ní materiály, v této metodice vš ak nejsou doporuč eny ž ádné. IX.l.4 PRINCIP METODY Aktivovaný kal, minerální ž ivné médium a zkouš ená látka ve vodném roztoku jako zdroj uhlíku se smíchají v 1 - 4 l skleněné nádoběs míchadlem a aerač ním zař ízením. Suspenze je míchána a aerována až28 dní př i teplotě20-25 o C v difuzním svě tle nebo temnu. Rozklad je sledován denněnebo v jinak vhodně stanovených č asových intervalech prostř ednictvím měř ení hodnot DOC (nebo CHSK) v odebraném vzorku po jeho př efiltrování. Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase je definována jako pomě r mezi hodnotami DOC (nebo CHSK) v doběodbě ru vzorku a po 3 h od zahájení zkouš ky. Výsledek je vyjádř en graficky jako funkce času. V př ípadě , že se analyticky stanovují změ ny koncentrací původní molekuly látky, jsou tyto změny mě ř ítkem primární biologické rozložitelnosti. IX.l.5 KRITÉRIA KVALITY Dostateč ná reprodukovatelnost byla ověř ena mezilaboratorními zkouš kami. Citlivost metody je značnězávislá na variabilitěkontrolního vzorku, na poměrně malé př esnosti stanovení množ ství organického uhlíku a na koncentraci zkouš ené látky v suspenzi. IX.l.6 POSTUP ZKOUŠENÍ IX.l.6.l Př íprava IX.l.6.1.1 Reagencie Voda: Pitná voda s obsahem organického uhlíku menš ím než5 mg.l-1 .Koncentrace vápenatých a hoř eč natých iontůnesmí př ekroč it 2,7 mmol.l-1, jinak je nutné jako rozpouš tě dlo použít deionizovanou nebo destilovanou vodu. Kyselina sírová p. a. 50 g.l-1 Hydroxid sodný p.a. 40 g.l-1 Minerální živné médium: v jednom litru deionizované vody se rozpustí: Chlorid amonný NH4 Cl p.a. 38,5 g NaH 2PO4 . 2H2O p.a. 33,4 g KH2PO4 p.a. 8,5 g K2HPO4 p.a. 21,75 g Tento roztok slouž í zároveňjako tlumičpH. IX.l.6.1.2 Př ístroje
Skleněné nádoby o objemu 1 - 4 l. Skleněné nebo kovové míchadlo, které by mě lo být umístě no 5 - 10 cm nad dnem nádoby. Použ ito může být rovně žmagnetické míchadlo se 7 - 10 cm dlouhým ramenem. Skleněná aerační trubice o vnitř ním průmě ru 2 - 4 mm. Vyústě ní trubice by mě lo být umístě no cca 1 - 10 cm nad dnem nádoby. Odstř edivka (cca 3 550 g). pH-metr. Oximetr. Papírový filtr. Membránový filtrač ní př ístroj. Membránový filtr o velikosti pórů0,45 m, který bě hem filtrace neuvolňuje a neabsorbuje uhlík. Analyzátor ke stanovení obsahu organického uhlíku a vybavení ke stanovení CHSK. IX.1.6.1.3 Př íprava inokula Aktivovaný kal z biologické č istírny se promývá opakovaněvodou př edepsané kvality a buďse opakovaněcentrifuguje nebo sedimentuje. Aktivovaný kal musí mít vhodné složení, tzn., ž e musí obsahovat co nejvíce druhů bakteriálních kultur. Inokulum můž e být namícháno z různých zdrojů(např . z č istírny, z půdního extraktu, z ř íč ní vody, atd.). Stanovení aktivity aktivovaného kalu je popsáno v kap. 1. 6. 2 nazvané Funkč ní kontrola. IX.1.6.1.4 Př íprava pracovních roztokůzkouš ené látky Do zkuš ební nádoby odmě ř íme 500 ml vody, 2,5 ml.l-1 minerálního ž ivného -1 roztoku a př idáme aktivovaný kal v množ ství 0,2 až 1,0 g.l suš iny v konečné smě si a odpipetujeme takový objem základního roztoku zkouš ené látky, aby bylo dosaž eno koncentrace rozpuš tě ného organického uhlíku od 50 do 400 mg.l-1 suspenze. Odpovídající hodnoty CHSK jsou 100 až1000 mg.l-1. Doplníme vodou na celkový objem 1 - 4 l. Zvolený objem je závislý na poč tu odebíraných vzorků nutných ke stanovení hodnot DOC nebo CHSK a na tom, kolik odbě růbude vyž adovat zvolený analytický postup. Zpravidla postač uje objem 2 l. Současněje s kaž dou zkuš ební sérií nasazena alespoňjedna kontrola, do které je odmě ř en aktivovaný kal a minerální ž ivné médium doplně né na stejný objem jako má zkouš ená směs. IX.1.6.2 Pracovní postup Kultivač ní nádoby se inkubují př i difusním svě tle nebo v tmavé komoř e př i teplotě20 - 25 oC, za stálého míchání pomocí magnetického míchadla nebo š roubovitého míchadla. Nádoba se provzduš ňuje tlakovým vzduchem, který je č iš tě n, pokud je to potř ebné, vatovým filtrem nebo př es promývač ku. Musí být zajiš těno, aby nedoš lo k usazování kalu a koncentrace rozpuš těného kyslíku neklesla pod 2 mg.l-1 . V pravidelných časových intervalech se měř í pH (např . denně ) a pokud je to potř ebné upravuje se na hodnotu pH 7 - 8. Ztráty vypař ováním se vyrovnávají destilovanou nebo deionizovanou vodou vž dy př ed odebráním vzorku. Je účelné označ it hladinu kapaliny př ed začátkem zkouš ky a znovu zaznamenat výš ku hladiny po odebrání vzorku př i vypnuté aeraci a míchaní. První vzorky se odebírají 3 h po zahájení zkouš ky, aby aktivovaný kal dostateč něadsorboval zkouš enou látku. Rozklad zkouš ené látky se sleduje stanovením hodnoty DOC a CHSK
IX.2
IX.3 IX.3.1
v pravidelných č asových intervalech. Vzorky z nádoby se zkouš enou látkou a z kontroly se př ed analýzou filtrují na promytém papírovém filtru. Prvních 5 ml filtrátu se vylévá. Kaly, které se š patněfiltrují mohou být oddě leny 10 min odstř eděním. Stanovení DOC a CHSK se provede nejménědvakrát. Vš echny baňky se nechají inkubovat 28 dní. Poznámka: Vzorky, které jsou po uvedeném postupu ješ tězakalené, se filtrují na membránovém filtru, který nesmí uvolňovat nebo adsorbovat organické látky. F u n k čn í k o n t r o l a a k t i v o v a n é h o k a l u Paralelněse ke každé sérii pokusůnasazuje referenč ní nádoba s kalem, médiem, vodou a referenční látkou, která slouž í ke kontrole citlivosti aktivovaného kalu. Doporuč ován je diethylenglykol. Adaptace V relativněkrátkých č asových intervalech (např . denně) jsou prováděny analýzy a namě ř ené hodnoty jsou vynáš eny do grafu. Na inhibiční kř ivce lze zpoč átku rozliš it tzv. adaptační fázi (viz obr. 2), proto by zkouš ka nemě la být nasazována ke konci týdne. Jestliže na konci normální délky zkouš ky dochází znovu k adaptaci, může být zkouš ka prodloužen aždo koneč ného rozložení zkouš ené látky. Upozorně ní: Pokud chcete důkladněpoznat chování aktivovaného kalu, upravte ho následujícím postupem: Míchadlo a aerační zař ízení se vypne, aby se mohl aktivovaný kal usadit. Kapalná fáze se vypustí, dekantovaný kal v nádoběse doplní vodou na objem 2 l, 15 min se míchá a znovu se nechá sedimentovat. Kapalná fáze se znovu vypustí a zkouš ka se opakuje se sedimentovaným kalem a stejnou zkouš enou látkou podle kap. 1. 6. 1. 4 a 1. 6. 2. Aktivovaný kal může být upraven také centrifugací. Adaptovaný kal můž e být smíchán s č erstvým aktivovaným kalem tak, aby bylo dosaž eno koncentrace 0,2 - 1 g suš iny na litr suspenze. P ří p r a v a p r o a n a l ý z u Vzorky se filtrují př es promyté papírové filtry (k promývání se použ ívá deionizovaná voda). Zakalené vzorky se filtrují př es membránové filtry (0,45 m). Ve filtrátech vzorku (prvních 5 ml filtrátu se nepoužívá) se př ístrojem na mě ř ení TOC stanoví dvakrát koncentrace rozpuš tě ného uhlíku DOC . Jestliž e nemůž e být filtrát analyzován v den odbě ru vzorku, musí být do př íš tího dne uchován v lednič ce. Delš í skladování se vš ak nedoporučuje. CHSK se ve filtrátu vzorku stanoví standardním postupem podle této vyhláš ky. VYHODNOCENÍ ZKOUŠKY Koncentrace DOC a nebo CHSK se ve vzorcích stanoví dle kap. 1. 6. 2 nejméně dvakrát. Biologická rozložitelnost v čase t se vypoč ítá podle vzorce 1. 2 a její hodnota se zaokrouhluje na celá procenta. Takt stanovená rozlož itelnost se označ uje jako „Biologická rozlož itelnost stanovená Zahn-Wellensovou zkuš kou“. Poznámka: Jestliž e je dosaž eno úplného rozlož ení zkouš ené látky př ed ř ádným probě hnutím zkouš ky a výsledek je potvrzen dalš í analýzou provedenou následující den, můž e být zkouš ka ukonč ena. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA PROTOKOL O ZKOUŠCE V protokolu o zkouš ce by mě ly být uvedeny následující údaje: — počáteč ní koncentrace látky, — vš echny informace a experimentální výsledky (název zkouš ené látky, referenční látka, kontrolní vzorek),
koncentrace látky po 3 h, inhibiční kř ivka s popisem, datum a zdroj odběru kalu, stav adaptace, použ itá koncentrace atd., vědecké odůvodně ní př ípadných změ n v provedení zkouš ky. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Postupné ubývání DOC nebo CHSK bě hem dnůažtýdnůnaznačuje, ž e zkouš ená látka je biologicky rozkládána. V mnoha př ípadech můž e ovlivňovat výsledky zkouš ky fyzikálně -chemická adsorbce. To lze prokázat tím, ž e se zjistí úplné nebo č ásteč né odstranění DOC nebo CHSK bě hem prvních tř í hodin zkouš ky a rozdíl mezi supernatantem z kontroly a ze zkouš eného vzorku je neč ekaněmalý. Má-li se rozliš it úplná nebo č ásteč ná biologická rozlož itelnost od adsorbce, musí se provést dalš í zkouš ky. Ty mohou být provedeny více postupy, nejsprávnějš í je ale použít supernatant nebo inokulum v některé zkouš ce snadné biologické rozložitelnosti (nejlépe v respirometrické zkouš ce. Zkouš ené látky, které vykazují velký úbytek DOC nebo CHSK a nejsou ovlivně ny adsorbcí lze pokládat za biologicky rozlož itelné. Částečný, neadsorbční úbytek znamená, ž e látka je př inejmenš ím alespoňč ásteč něbiologicky rozlož itelná. Jestliž e je úbytek DOC nebo CHSK minimální nebo ž ádný, mohla nastat inhibice mikroorganismůpůsobením zkouš ené látky. Tato inhibice se může projevovat rozpuš těním nebo úbytkem kalu nebo zákalem zkouš ené suspenze. V takových př ípadech se zkouš ka opakuje s niž š ími koncentracemi zkouš ené látky. Vyš š í citlivosti můž e být dosaženo specifickými analytickými metodami nebo použ itím látek znač ených 14C. Jestliže je použita zkouš ená látka s 14C, je možné 14 stanovením CO2 prokázat, že nastal rozklad zkouš ené látky. Pokud je udáván výsledek jako primární biologická rozložitelnost, měly by být uvedeny, pokud je to mož né, změ ny v chemické struktuř e, které způsobily sníž ení obsahu výchozí, rodičovské, zkouš ené látky. Musí se také dokladovat ově ř ení analytické metody a výsledky stanovení v ž ivném médiu bez př ídavku zkouš ené látky. LITERATURA (l) OECD Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Beschluss des Rates C (81) 330 Final (2) Anhang V C.9 Abbaubarkeit. Chemischer Sauerstoffbedarf, Richtlinie der Kommission 84/449/EWG (Amtsblatt den Europäischen Gemeinschaften Nr. L 251 vom 19. September 1984). — — — —-
IX.3.2
IX.4
PŘÍLOHA PŘÍKLAD VYHODNOCENÍ Organická látka: Teoretická koncentrace ve zkouš ce: Teoretická DOC : Inokulum: Koncentrace: Adaptace: Analytika:
4 - ethoxybenzoová kyselina 600 mg.l-1 390 mg.l-1 mě stská čistírna v ..... l g suš iny . l -1 bez adaptace stanovení DOC
Množ ství vzorku: Referenční látka: Toxicita zkouš ené látky:
Doba zkouš ky 0 3h 1 den 2 dny 5 dnů 6 dnů 7 dnů 8 dnů 9 dnů 10 dnů
sl. p. mg.l -1 4,0 6,1 5,0 6,3 7,4 11,3 7,8 7,0 18,0
3 ml diethylenglykol ž ádné toxické úč inky př i koncentraci menš í než1000 mg.l -1 Použitá zkouš ka: zkouš ka ve fermentačních trubicích
Referenč ní látka Zkouš ená látka DOC DOCn Rozklad DOC DOCn Rozklad mg.l-1 mg.l -1 % mg-l-1 mg.l -1 % 300 390 298,0 294,0 2 371,6 367,6 6 288,3 282,3 6 373,3 367,2 6 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76 142,5 134,7 55 58,9 51,1 87 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97 37,0 19,0 94 20,0 2,0 99
Poznámka: DOC stanovena v triplikátech. sl. p. = slepý pokus Obrázek 1 Př íklad kř ivek biologického rozkladu
Obrázek 2 Př íklad adaptace kalu
X. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – SIMULAČNÍ ZKOUŠKA S AKTIVOVANÝM KALEM – metoda C.10 podle přílohy smě rnice 92/69/EHS X.1 X.1.1 X.1.1.1
X.1.1.2
METODA ÚVOD Obecné poznámky Metoda je vhodná pouze pro ty organické látky, které v použ ívaných koncentracích: — jsou natolik rozpustné ve vodě , aby bylo mož né př ipravit zásobní roztok, — mají za podmínek zkouš ky zanedbatelnou tenzi par, — neinhibují bakterie. Je užiteč né mít informace o relativním podílu nejdůležitě jš ích komponent obsaž ených ve zkouš eném materiálu, zvláš tětehdy, kdyžbiologická rozložitelnost dosahuje nízkých nebo marginálních hodnot. Př i interpretaci nízkých hodnot biologické rozlož itelnosti a volběvhodné zkuš ební koncentrace je potř ebné znát údaje o toxicitělátky vůč i mikroorganismům. Stanovení úplné biologické rozlož itelnosti (analýza DOC/CHSK) Cílem metody je stanovení úplné biologické rozložitelnosti organické látky na základěmě ř ení úbytku zkouš ené látky a vzniklých metabolitů v koncentracích DOC více než12 mg.1-1 (nebo CHSK cca 40 mg.1-1) ve zkuš ebním zař ízení s náplní aktivovaného kalu. Prokázalo se, ž e optimální je koncentrace DOC 20 mg /1. Je nutné znát obsah organického uhlíku nebo CHSK zkouš ené látky.
X.1.1.3
Stanovení primární biologické rozložitelnosti (specifická analýza) Cílem metody je stanovení primární biologické rozlož itelnosti zkouš ené látky př i koncentraci cca 20 mg/l v modelovém zař ízení s aktivovaným kalem (pokud to umožňuje analytická metoda nebo toxicita zkouš ené látky, můž e být použ ita koncentrace zkouš ené látky vyš š í nebo nižš í). To dovolí odhadnout primární biologickou rozlož itelnost zkouš ené látky (vymizení původní „rodič ovské“ chemické struktury). Cílem metody není stanovení stupněmineralizace zkouš ené látky. Ke kvantitativní analýze musí být k dispozici vhodná metoda.
X.1.2 X.1.2.1
DEFINICE A JEDNOTKY Analýza DOC/CHSK Úbytek látky je vyjádř en vztahem: T E Eo DR 100% (la) T DR = DOC nebo CHSK úbytek v % vztažený na zkouš enou látku př i dané stř ední doběprodlení, T = koncentrace zkouš ené látky na př ítoku do zkuš ební jednotky v mg.l-1 DOC nebo CHSK, E = koncentrace DOC nebo CHSK na odtoku ze zkuš ební jednotky v mg.l-1 , Eo = koncentrace DOC nebo CHSK na odtoku z kontrolní jednotky v mg.l-1. Rozklad je definován jako procentuální úbytek DOC nebo CHSK př i udané době zdržení, vztažený na zkouš enou látku. Specifická analýza Procentuální odstraně ní zkouš ené látky z vodné fáze (Rw) během udaného času prodlení: C C0 (1b) Rw 1 100% C1 C1 = koncentrace zkouš ené látky v př ítoku do zkuš ebního zař ízení (v mg.l-1) stanovená specifickou analýzou, C0 = koncentrace zkouš ené látky na odtoku ze zkuš ebního zař ízení (v mg.l-1) stanovená specifickou analýzou. REFERENČNÍ LÁTKY Př i zkouš ení nových látek je ně kdy vhodné použít referenční látku. Specifické referenč ní látky doposud nejsou doporuč eny. PRINCIP ZKUŠEBNÍCH METOD Ke stanovení úplné biologické rozlož itelnosti se použ ívají dvěparalelněpracující modelová zař ízení s aktivovaným kalem (potvrzující zkouš ka OECD nebo zař ízení s porézní nádobkou). Zkouš ená látka se př idává na př ítoku do jedné z jednotek (se syntetickou nebo s komunální odpadní vodou), zatímco ve druhé je obsaž ena pouze odpadní voda. Ke stanovení primární biologické rozlož itelnosti pomocí specifické analýzy zkouš ené látky na př ítoku a odtoku je zapotř ebí jedna jednotka. Na odtoku se mě ř í koncentrace DOC nebo CHSK nebo se stanoví koncentrace zkouš ené látky specifickou analýzou. DOC zkouš ené látky se nestanovuje, pouze se konstatuje. Př i měř ení DOC nebo CHSK se vychází z toho, ž e rozdíl mezi prů mě rnými koncentracemi na odtoku ze zkuš ební a z kontrolní jednotky je způsoben nerozlož enou č ástí zkouš ených látek.
X.l. 2. 2
X.l.3
X.l.4
X.1.5
X.1.6 X.1.6.1 X.1.6.1.1
X.l.6.1.2
X.1.6.1.3
Jestliž e jsou provádě ny specifické analýzy, lze stanovovat změ ny koncentrace původní chemické látky (primární biologická rozlož itelnost). Obězař ízení mohou být provozována jako „spř až ená“ pomocí postupu vzájemné inokulace. KRITÉRIA KVALITY Koncentrace zkouš ené látky se volí s ohledem na druh analytické metody a její mez stanovitelnosti. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY Př íprava Př ístroje Pokud se neprovádí specifická analýza, použ ívají se dvěmodelové zkuš ební jednotky stejného typu. Mohou být používány dva typy zař ízení: P o t v r z u j í c í z k o u šk a O E C D Zař ízení se skládá ze zásobní nádoby (A) na syntetickou odpadní vodu, dávkovacího č erpadla (B), aerač ní nádoby (C), sedimentač ní nádoby (D), mamutky (E) k recirkulaci aktivovaného kalu a sbě rné nádoby vyč iš tě né vody (F). Nádoby (A a F) musí být ze skla nebo z vhodné umě lé hmoty objemu nejméně24 l. Čerpadlo (B) musí zajiš ť ovat konstantní př ítok syntetických splaš kůdo aerač ní nádoby. Použ it může být jakýkoliv vhodný systém zajiš ť ující stanovený př ítok a koncentraci. Za normálních podmínek je výš ka separátoru (D) nastavena tak, aby objem kultivač ní suspenze v aerač ní nádoběbyl 3 l. V dolní č ásti konické č ásti aerač ní nádoby je ponoř ena porézní aerač ní krychlička. Množství dodávaného vzduchu může být kontrolováno průtokoměrem. Mamutka (E) je osazena tak, aby byl aktivovaný kal ze separátoru do aktivač ní nádoby dopravován rovnomě rně. Z a ří z e n í s p o r é z n í n á d o b k o u Porézní nádobka je vyrobena z porézní polyethylenové fólie (tlouš ť ka 2 mm, maximální velikost pórů95 mikronů) stočené do válce o průmě ru 14 cm s konickým dnem 45 o, obrázky 1 a 2 v př íloze 2. Porézní nádobka je umístě na v nepropustné nádoběo průmě ru l5 cm zhotovené z vhodné umělé hmoty, která má nad konickou č ástí odtok ve výš ce 17,2 cm, č ímžje v zař ízení vymezen objem 3 l. Na horním konci vnitř ní nádoby je upevně n kruhový drž ák tak, že mezi vnějš í a vnitř ní nádobou je 0,5 cm odtoková mezera. Celé zař ízení je umístě no do vodní lázněregulované termostatem. Vzduch je př ivádě n na dno vnitř ní nádoby pomocí vhodného rozvadě č e. Nádoby (A) a (E) musí být vyrobeny ze skla nebo vhodné umělé hmoty a mají mít objem nejméně24 l. Čerpadlo (B) umož ňuje konstantní př ítok odpadních vod do aerač ní nádoby. Můž e být použit jakýkoliv vhodný systém za př edpokladu, že zaruč uje stanovený př ítok a koncentraci. K dispozici musí být zásoba dalš ích porézních nádobek jako náhrada za zanesené; zanesené nádobky se č istí namočením na 24 hodin do roztoku chlornanu sodného a promytím pitnou vodou. Filtrace Použ ívají se membránové filtrač ní př ístroje a membránové filtry (velikost pórů 0,45 m). Membránový filtr nesmí uvolňovat uhlík ani nesmí adsorbovat zkouš enou látku př i filtraci. Odpadní voda Můž e být použ ito buďvhodné syntetické médium nebo komunální odpadní voda. Př íklad syntetického média: V l l pitné vody se rozpustí: pepton 160 mg,
X.l.6.1.4
X.1.6.1.5
X.1.6.2
masový extrakt 110 mg, močovina 30 mg, NaCl 7 mg, CaCl2 . 2 H2O 4 mg, MgSO4 . 7 H2O 2 mg, K2HPO4 28 mg. Komunální odpadní vody: Odebírají se čerstvé kaž dý den z př epadu mechanického stupněč istírny, která č istí př eváž němě stské odpadní vody. Zásobní roztok zkouš ené látky Př ipraví se např . l% roztok zkouš ené látky, který se bude př idávat do zkuš ební jednotky. Stanoví se koncentrace zkouš ené látky a určí se př ísluš ný objem zásobního roztoku, který je potř ebné př idat k odpadní voděnebo dalš ím č erpadlem př ímo do zkuš ební jednotky, aby byla dosažena požadovaná zkuš ební koncentrace. Inokulum Poznámka: Je-li používána komunální odpadní voda není vhodné používání inokula s malou koncentrací bakterií, ale má se použ ívat aktivovaný kal. Mohou se použ ívat inokula z různých zdrojů. Př íklady vhodného inokula: a) Inokulum z odtoku biologické čistírny odpadních vod Inokulum můž e být získáno z odtoku dobř e fungující č istírny zpracovávající př eváž někomunální odpadní vody. Vzorek odtoku musí být v doběmezi odběrem a použ itím uchován v aerobních podmínkách. Inokulum se př ipraví filtrací vzorku vody př es hrubý filtr, prvních 200 ml filtrátu se vylije. Aždo okamž iku použití se filtrát uchovává v aerobních podmínkách. Inokulum musí být použ ito ve stejný den kdy bylo př ipraveno. K inokulaci se už ívá nejméně3 ml. b) Směsné inokulum Inokulum odebrané z odtoku č istírny: Viz př edchozí popis. Inokulum z půdy: 100 g zahradní zeminy (úrodná, nesterilní zemina) se suspenduje v l l nechlórované pitné vody (nevhodné jsou zeminy s vysokým obsahem jílu, písku a humusu). Po zamíchání se nechá suspenze 30 minu dekantovat. Kapalná fáze se př efiltruje, prvních 200 ml se vylije. Filtrát se ihned provzduš ňuje aždo okamž iku použití. Inokulum je mož né použ ít pouze ten den, kdy bylo př ipraveno. Inokulum z povrchové vody: Dalš í díl smě sného inokula se získává z mesosaprobních povrchovým vod. Odebraný vzorek se filtruje, prvních 200 ml se vylije. Aždo okamžiku použ ití se filtrát udrž uje v aerobních podmínkách. Inokulum musí být použ ito pouze ten den, kdy bylo př ipraveno. Směsné inokulum se získá smísením a dobrým promícháním stejných objemových dílůvš ech tř í dílč ích inokulí. K oč kování se použ ívají nejméně3 ml smě sného roztoku. c) Inokulum z aktivovaného kalu Použ ívá se aktivovaný kal (s obsahem suspendovaných pevných č ástic do 2,5 g/l) odebraný z aerač ní nádrž e čistírny komunálních odpadních vod. Postup
X.1.6.2.1
Zkouš ka se provádí př i laboratorní teplotě , která se má udržovat mezi 18 - 25 oC. Zkouš ka může být event. provádě na př i nižš ích teplotách (do 10 o C). Pokud se zkouš ená látka za tě chto podmínek rozkládá, nejsou zapotř ebí žádná dalš í mě ř ení. Jestliž e vš ak př i niž š í teplotěrozkládána není, musí být zkouš ka opakována př i o teplotě18 - 25 C. Fáze zapracování: tvorba kalu/stabilizace kalu Fází růstu/stabilizace kalu je období, během kterého dochází za provozních podmínek k ustálení koncentrace aktivovaného kalu a funkce zkuš ební jednotky Rozběhová fáze zač íná první vsádkou zkouš ené látky a konč í dobou, kdy namě ř ený úbytek zkouš ené látky dosáhne relativněkonstantní hodnoty. Tato fáze by nemě l trvat déle než6 týdnů. Hodnotící fáze je doba trvající 3 týdny od okamž iku kdy úbytek zkouš ené látky dosáhl relativněkonstantní, zpravidla vysoké, hodnoty. Pro látky, které se bě hem š est týdnůtrvající rozbě hové fáze nerozkládají nebo jejich úbytek dosahuje nízkých hodnot se za vyhodnocovací fázi považuje období dalš ích tř í následujících týdnů. Na zač átku zkouš ky se zkuš ební jednotka(y) naplní zkuš ební kapalinou s inokulem. Zapne se provzduš ňování a mamutka (př i použ ití zkuš ebního zař ízení podle OECD) a zapne se dávkovací zař ízení. Př ítok odpadních vod bez zkouš ené látky do aerač ní nádoby se udržuje na -1 -1 rychlosti l l.h nebo l/2 l.h ; doba zdržení tak dosáhne 3 h nebo 6 h. Intenzita provzduš ňování musí být regulována tak, aby se udrž oval obsah aerační nádoby ve vznosu a obsah rozpuš těného kyslíku neklesl pod hodnotu 2 mg.l-1. Pě ně ní smě si se zabraňuje vhodnými prostř edky, které neinhibují kal. Kal, který se shromažďuje v horní části aerační nádoby a u průkazné zkouš ky OECD na dněsedimentač ní nádoby a v cirkulač ním okruhu musí být alespoň jednou za den vracen do matečné suspenze setř ením nebo jiným vhodným způsobem. Jestliž e kal š patněsedimentuje lze zvýš it jeho hustotu př ídavkem 2 ml 5% roztoku chloridu ž elezitého. Př ídavek je mož né opakovat podle potř eby. Odtok ze sedimentační nádrže se shromaž ďuje v nádobách E nebo F po dobu 20 24 hod. Př ed odebráním vzorku se smě s důkladněpromíchá. Nádoby E a F se musí peč livěč istit. Pro potř eby sledování účinnosti procesu a pro potř eby jeho ř ízení se stanoví nejménědvakrát týdněCHSK nebo DOC zfiltrovaného průmě rného vzorku výtoku ze zař ízení a filtrované smě si dávkované do zař ízení. K filtraci se použ ívá membránový filtr s velikostí pórů0,45 m. Prvních 20 ml filtrátu se vylije. Pokud se rozkladné procesy ustálí, vyrovnají se i poklesy CHSK nebo DOC. Suš ina kalu v aerač ní nádoběse stanovuje dvakrát týdně(g.l -1). Zař ízení mohou být provozována dvě ma způsoby: pokud je suš ina kalu vyš š í než -1 2,5 g.l př ebyteč ný kal se vypustí nebo se denněodebere z kaž dé nádoby 500 ml suspenze, takž e stř ední doba zdrž ení kalu v zař ízení je 6 dní. Jestliž e jsou namě ř ené a hodnocené parametry (úč innost metody stanovená na základěúbytku CHSK nebo DOC, koncentrace kalu, schopnost sedimentace kalu, zákal kapalné fáze v sedimentač ní nádoběatd.) dvou jednotek dostatečněstabilní, může být zahájeno př idávání zkouš ené látky dle kap. 1. 6. 2. 2 do nátoku do jedné z jednotek. Alternativněmůže být zkouš ená látka př idávána na zač átku fáze růstu kalu (1. 6. 2. 1), zvláš ťtehdy, kdyžje jako inokulum použ íván aktivovaný kal.
X.1.6.2.2
X.1.6.2.3
X.2 X.2.1
Pracovní postup Za dodrž ování podmínek pro rozbě hovou fázi se do př ítoku do zkuš ebního zař ízení př idává zásobní roztok zkouš ené látky (cca 1 %), aby obsah DOC v suspenzi byl v rozmezí 10 - 20 mg.l -1 nebo CHSK 40 mg.l-1. Zásobní roztok se buďdenněpř imíchává do odpadní vody nebo se př ivádí pomocí č erpadla př ímo do suspenze. Koncentrace se postupnězvyš uje ažna pož adovanou hodnotu. Vyzkouš eny mohou být i vyš š í koncentrace nežudává př edchozí odstavec, pokud nemá zkouš ená látka na aktivovaný kal toxické úč inky. Do kontrolní jednotky se dávkuje pouze odpadní voda bez zkouš ené látky. Z odtoku se odebírají vzorky pro analýzu a filtrují se na membránovém filtru s velikostí pórů0,45 m. Prvních 20 ml filtrátu se vylévá. Filtráty vzorkůmusí být analyzovány v den odbě ru nebo musí být konzervovány (např . př ídavkem 0,05 ml 1% chloridu rtuťnatého na 10 ml filtrátu, ulož ením na 24 h př i teplotě2 - 4 oC nebo př i -18 o C na delš í dobu). Doba trvání rozbě hové fáze od okamž iku př ídavku zkouš ené látky by nemě la př ekroč it 6 týdnů. Vyhodnocovací fáze by nemě la být kratš í než3 týdny, aby bylo mož né provést 14 - 20 stanovení nutných k vyhodnocení zkouš ky. Spř až ená zař ízení Zař ízení jsou spř až ena tak, ž e je mezi nimi 1x denněvymě ňováno 1,5 l suspenze (vč etněkalu) z aerač ních nádob. Dochází-li k silné adsorbci zkouš ené látky, odebere se 1,5 l kapalné fáze ze sedimentač ní nádoby a př idává se do aerač ní nádoby druhého zař ízení. Analytika Ke sledování chování zkouš ené látky se používají dvěmetody stanovení: DOC a CHSK. Hodnoty DOC se stanoví dvakrát pomocí analyzátoru uhlíku a CHSK se stanoví podle literatury (2). Specifická analýza Koncentrace zkouš ené látky se stanoví vhodnou analytickou metodou. Je-li to možné, stanoví se zvláš ťmnož ství látky adsorbované na aktivovaný kal. DATA A VYHODNOCENÍ SPŘAŽENÁ ZAŘÍZENÍ Pokud je použ íváno spř až ené zař ízení, poč ítá se denněstupeňodstranění, DR, postupem podle 1. 2. 1. Tyto denní hodnoty se opraví na hodnotu Drc , zohledně ním př enosu materiálu př i oč kování. Tento výpoč et se provádí dle rovnice (2) pro stř ední dobu prodlení 3 hodiny a podle rovnice (3) pro stř ední dobu prodlení 6 hodin. 8 100 DRc DR (2) 7 7 4 100 (3) DRc DR 3 3 Ze získaných hodnot se vypočítá jejich průměr a dále standardní odchylka podle rovnice (4)
DRc DRc n
sDRc kde: sDRc = DRc =
2
i
i 1
n 1 standardní odchylka, průmě r hodnot DRc ,
(4)
X.2.2
X.2.2.1
n = poč et stanovení. Odlehlé hodnoty DRc se eliminují vhodnou statistickou metodou, např . Nalimovou metodou (6) pro 95% hladinu významnosti, průměr a standardní odchylka se potom vypoč tou s vyloučením odlehlých hodnot Drc: Výsledek se vyjádř í dle (5) : t ; DRc DRc n 1 sDRc (5) n kde tn-1; = tabulková hodnota t pro n dvojic hodnot e a Eo a statistickou mez spolehlivosti P (P=1-), kde P = 95% (l). Výsledkem je průmě r s udanými mezemi tolerance pro 95% hladinou významnosti př ípadněs udanou standardní odchylkou, poč tem dat hodnot DRc bez odlehlých hodnot a poč tem odlehlých hodnot. Např . DRc = 98,6 2,3% úbytku DOC, s = 4,65% úbytku DOC, n = 18, x = poč et odlehlých hodnot. NESPŘAŽENÁ ZAŘÍZENÍ Provozní výkon zař ízení můž e být ově ř en následovně : % odstraně ní CHSK nebo DOC = CHSK nebo DOCodp. vody CHSK nebo DOC výtoku = . 100 CHSK nebo DOC odp. vody Vynáš ením denněnamě ř ených úbytkůdo grafu se zdůrazní vš echny trendy, např . adaptace. Využití stanovení CHSK/DOC Z denněnaměř ených hodnot se podle kap. 1.2.1 vypoč ítá procentuální úbytek DR. Z ř ady hodnot DR se spoč ítá jejich průmě r a podle rovnice (6) standardní odchylka:
DR DR n
sDR
2
i
i 1
n 1
(6)
kde sDR = standardní odchylka hodnot Dri , DR = průmě r hodnot Dri , n = poč et stanovení. Odlehlé hodnoty DR se eliminují vhodnou statistickou metodou např . podle Nalimova (6) př i 95% hladiněvýznamnosti, stř ední hodnota a standardní odchylka jsou potom znovu vypoč ítány s vyloučením odlehlých hodnot DR. Výsledná hodnota se poč ítá dle rovnice (7) t ; DR = DR n 1 sDR (7) n kde tn-1; - tabulková hodnota t pro n dvojic hodnot e a Eo a statistickou n mez spolehlivosti P (P=1-), kde P = 95 % (l).
X.2.2.2 X.3 X.3.1
X.3.2
Výsledkem je průmě r s mezemi tolerance př i 95% hladiněvýznamnosti s udanou standardní odchylkou, poč tem dat hodnot DR bez odlehlých hodnot a poč tem odlehlých hodnot. Např .: Dr = (98,6 2,3%) úbytku DOC, s = 4,65% úbytku DOC, n = 18, x = poč et odlehlých hodnot. Použ ití výsledkůspecifické analýzy Odstraně ní zkouš ené látky z vodné fáze (Rw) v % se poč ítá podle 1. 2. 2. ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA PROTOKOL O ZKOUŠCE V protokolu o zkouš ce by mě ly být uvedeny pokud je to možné následující údaje: — provozní podmínky, které jsou zaznamenány do formulář e uvedeného v př íloze č . 3 této metody; — druh použitého zkuš ebního zař ízení (zař ízení pro průkaznou zkouš ku OECD nebo zař ízení s porézní nádobkou); — způsob provozování zař ízení: spř až ená nebo nespř ažená zař ízení; — druh odpadních vod: syntetické nebo komunální odpadní vody, u komunálních odpadních vod datum a místo odbě ru; — druh inokula, datum a místo odběru; — popis použ itých analytických metod, pokud byly provádě ny specifické analýzy; — grafické vyjádř ení závislosti úbytku CHSK nebo DOC na čase ve fázi rozbě hové a vyhodnocovací; — výsledek stanovení obsahu zkouš ené látky prostř ednictvím CHSK nebo DOC v zásobním roztoku; — př i provádění specifické analýzy: grafické vyjádř ení procentuálního úbytku zkouš ené látky z kapalné fáze bě hem rozběhové a vyhodnocovací fáze v závislosti na č ase; — stř ední úbytek DOC nebo CHSK zkouš ené látky a standardní odchylka výsledkůzískaných bě hem vyhodnocovací fáze, kdy úbytek zkouš ené látky je konstantní; — grafické vyjádř ení koncentrace aktivovaného kalu v závislosti na č ase; — poznámky týkající se aktivovaného kalu (odstraňování př ebytečného kalu ze zař ízení, tvorba shluků, použ ití chloridu ž elezitého atd.); — promě ř ované koncentrace zkouš ené látky; — výsledky analýz kalu; — vš echny informace o zkouš ené látce a o referenč ní látce, pokud byla použ ita; — vědecké zdůvodně ní vš ech odchylek a změ n metody. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Př íč inou nízké hodnoty úbytku zkouš ené látky z vodné fáze může být inhibice mikroorganismůzpůsobená touto látkou. Projevuje se to př edevš ím rozpouš tě ním a ztrátou kalu, zakalováním kapalné fáze a snížením úč innosti odstraňování CHSK nebo DOC v zař ízení. Ně kdy hraje roli fyzikálně -chemická adsorbce. Vztah mezi biologickým působením na látku a její fyzikálně -chemickou adsorpcí je mož né rozliš it po odpovídající desorpci.
K rozliš ení úplného nebo částečného biologického rozkladu od adsorbce je nutno provést dalš í zkouš ky. Nabízí se zde více mož ností. Nejlepš ím postupem je použ ití kapalné fáze ze sedimentač ní nádoby jako inokula v ně které ze zkouš ek snadné biologické rozlož itelnosti (nejlépe v respirometrické zkouš ce). Vysoké hodnoty úbytku DOC nebo CHSK jsou zpravidla způsobovány biologickým rozkladem, nízké hodnoty úbytku naproti tomu nelze odliš it od jiných mechanizmůodstraně ní látky. Pokud např . rozpustná sloučenina vykazuje stupeňadsorbce 98 % a denněje odstraňováno 10 % kalu, dochází ažke 40 % odstranění látky v tomto kalu. Je-li denněodstraňováno 30 % kalu, může eliminace na základěadsorbce a odstraně ní kalu stoupnout na 65 % (4): Př i použ ívání specifických analýz je tř eba brát na zř etel vliv struktury látky na specifickou analýzu. Úbytek látky stanovený specifickou analýzou nemůž e být interpretován jako mineralizace látky. X.4
LITERATURA (l) OECD, Paris 1981, Test Guideline 303 A, Decision of the Council C (81) 30 final. (2) Annex V C9 Degradation Test - Chemical Oxygen Demand, Commission Directive 84/449/EEC,Official Journal of the European Communities, No L 251,19. 9. 1984). (3) H. A. Painter and E. F. King, WRC Porous Pot method for asessing biodegradability. Technical report TR7O. June 1978, Water Research Center, Velká Británie. (4) Wierich P. and Gerike P., The Fate of Soluble, Recalcitrant, and Absorging Compounds in Activated Sludge Plants, Ecotoxicology and Enviromental Safety, Vol 5, Nr. 2 - June 1981, str. 161 - 171. (5) Council Directives 82/242/EEC und 82/243/EEC, Official Journal of the European Communities, No L109, 22. 4. 1982, amending Council Directives 73/404/EEC und 73/405/EEC on biodegradability of detergents, Official Journal of the European Communities, No L347, 17. 12. 1973. (6) Streuli, H., Fehlerhafte Interpretation und Anwendung von Ausreissetest, insbesondere bei Rindversuchen zur Überprüfung analytisch-chemischer Untersuchungsmethoden, Fressenius-Zeitschrift für Analytische Chemie (1980), str. 406 - 408.
PŘÍLOHA 1 Obrázek 1
A = zásobník B = dávkovací zař ízení C = aerač ní komora (objem 3 litry) D = sedimentač ní nádoba
E = mamutka F = zásobník na výtok G = aerátor H = průtokomě r (nepovinně )
Obrázek 2
PŘÍLOHA 2
Obrázek 1 Zař ízení použ ívané pro stanovení biologické rozložitelnosti
A = zásobník B = dávkovací č erpadlo C = porézní aerač ní nádobka D = vnějš í nepropustná nádoba
E = zásobník na výtok F = vzduchovací kámen G = rotametr
Obrázek 2 Detaily tř ílitrové vzduchovací porézní nádobky
PŘÍLOHA 3 Provozní podmínky simulační zkouš ky s aktivovaným kalem Označv kaž dé skupině Zař ízení: průkazná zkouš ka OECD zař ízení s porézní nádobkou Způsob provozu: samostatná jednotka spř ažená zař ízení nespř až ená zař ízení Př eočkování: žádné aktivovaným kalem kapalnou fází vzniklou odstraně ním sedimentu Stř ední doba zdrž ení:
3 hodiny 6 hodin Živné médium: komunální odpadní voda syntetická odpadní voda Inokulum: zč istírny odpadních vod smě sné inokulum aktivovaný kal Př idávání zkouš ené látky: na začátku postupně po vytvoř ení kalu Analýzy: specifická CHSK DOC XI. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – ZKOUŠKA INHIBICE DÝCHÁNÍ AKTIVOVANÉHO KALU – metoda C.11 podle přílohy smě rnice 92/69/EHS XI.1 METODA XI.1.1 ÚVOD Popsaná metoda hodnotí vliv zkouš ené látky na mikroorganizmy mě ř ením intenzity jejich dýchání za definovaných podmínek v př ítomnosti různých koncentrací zkouš ené látky. Úč elem této metody je poskytnout rychlou vyhledávací metodu, kterou je možné urč it látky, které mohou nepř íznivěovlivnit aerobní mikrobiální čistírny vod, a naznač it vhodné koncentrace zkouš ených látek, které nejsou inhibující a které je možno použ ít ve zkouš kách biologické rozlož itelnosti. Definitivní zkouš ce můž e př edcházet zkouš ka pro nalezení pracovní oblasti. Může poskytnout informace o oboru koncentrací, které je mož né použ ít v hlavní zkouš ce. Do schématu zkouš ky jsou zař azeny dvěkontroly, jedna na zač átku a druhá na konci ř ady pokusů. Každou dávku aktivovaného kalu je také nutno kontrolovat s použ itím referenč ní látky. Tato metoda se nejsnáze aplikuje na látky, které díky své rozpustnosti a nízké těkavosti zůstávají ve vodě. U látek s nízkou rozpustností v médiích používaných ve zkouš ce můž e být nemož né stanovit EC50. Pokud má zkouš ená látka sklon k rozkladu oxidač ní fosforylací mohou výsledky založ ené na absorpci kyslíku vést k nesprávným závě rům, Pro provedení zkouš ky je užiteč né znát následující informace: — rozpustnost ve vodě ,
tlak par, strukturní vzorec, —č istota zkouš ené látky. Doporučení: Aktivovaný kal může obsahovat potenciálněpatogenní organizmy a je tř eba s ním zacházet opatrně . XI.1.2 DEFINICE A JEDNOTKY Respirač ní rychlost je spotř eba kyslíku mikroorganizmy odpadních vod v aerobním kalu, obecněvyjádř ená jako mg O2 na 1 mg kalu za hodinu. Pro výpoč et inhibičního úč inku zkouš ené látky př i urč ité koncentraci se respirační rychlost vyjadř uje jako procento průmě rné hodnoty dvou kontrolních respiračních rychlostí: 2 RS 1 100 = %inhibice Rc1 Rc2 kde: Rs = rychlost spotř eby kyslíku př i použité koncentraci zkouš ené látky, Rc1 = rychlost spotř eby kyslíku v kontrolní zkouš ce 1, Rc2 = rychlost spotř eby kyslíku v kontrolní zkouš ce 2. EC50 v této zkouš ce je koncentrace zkouš ené látky, př i které respirační rychlost č iní 50 % hodnoty vycházející z kontrolní zkouš ky za podmínek popsaných v této metodě . XI.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY Jako referenč ní látku se doporuč uje používat známý inhibitor dýchání 3,5dichlorfenol. Ověř ením EC50 u každé dávky aktivovaného kalu by mě lo být zkontrolováno, že kal není abnormálněcitlivý. XI.1.4 PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY Rychlost dýchání aktivovaného kalu vyž ivovaného standardním množ stvím syntetické odpadní vody se mě ř í po doběkontaktu 30 minut, 3 hodin nebo v obou č asech. Mě ř í se také rychlost dýchání téhožaktivovaného kalu v př ítomnosti různých koncentrací zkouš ené látky za jinak stejných podmínek. Inhibiční efekt zkouš ené látky př i urč ité koncentraci se vyjadř uje jako procento průměrné rychlosti dýchání ze dvou kontrolních pokusů. Hodnota EC50 se vypoč ítá ze stanovení př i různých koncentracích. XI.1.5 KRITÉRIA KVALITY Výsledky zkouš ky jsou platné, jestliž e: — respirač ní rychlosti dvou kontrolních pokusůse od sebe liš í nejvýš e o 15 %, — EC 50 (pro 30 minut nebo pro 3 hodiny) 3,5-dichlorfenolu lež í v př ijatém rozmezí 5 - 30 mg.l -1. XI.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY XI.1.6.1 Či n i d l a XI.1.6.1.1 Roztoky zkouš ené látky Roztoky zkouš ené látky se př ipravují č erstvé na začátku studie s použitím zásobního roztoku. Použije-li se níž e popsaný postup, je vhodná koncentrace zásobního roztoku 0,5 g.l-1. XI.1.6.1.2 Roztok kontrolní látky Roztok 3,5-dichlorfenolu lze př ipravit např íklad rozpuš těním 0,5 g 3,5dichlorfenolu v 10 ml 1 M NaOH, zř edě ním destilovanou vodou př ibližněna 30 ml, př idáním 0,5 M H2SO4 do bodu začínajícího sráž ení ( je tř eba asi 8 ml 0,5 M H2SO 4) a konečným doplněním směsi destilovanou vodou na 1 litr. pH musí potom lež et mezi 7 a 8. — —
XI.1.6.1.3 Syntetická odpadní voda Použ ívaná syntetická odpadní voda se př ipraví rozpuš tě ním následujícího množství látek v 1 litru vody: — 16 g peptonu, — 11 g masového extraktu, — 3 g moč oviny, — 0,7 g NaCl, — 0,4 g CaCl 2.2H2O, — 0,2 g MgSO4.7H2O, — 2,8 g K 2HPO4. Poznámka 1: Tato syntetická odpadní voda má stonásobnou koncentraci oproti voděpopsané v technické zprávěOECD "Návrh metody stanovení biologické rozlož itelnosti povrchově aktivních látek použ ívaných v syntetických detergentech" (11.6.1976), s př ídavkem monohydrogenfosforeč nanu draselného. Poznámka 2: Nepouž ije-li se př ipravené médium ihned, je nutné je př echovávat o v temnu př i 0 - 4 C ne déle nežjeden týden za podmínek, které nezpůsobují ž ádné změ ny v jeho slož ení. Médium je také mož né př ed uschováním sterilizovat, nebo je možné pepton a masový extrakt př idat krátce př ed provedením zkouš ky. Př ed použ itím je nutné médium důkladněpromíchat a upravit pH. XI.1.6.2 Aparatura Mě ř icí aparatura: Př esná konstrukce není podstatná. Musí vš ak mít volný prostor nad kapalinou a sonda musí př esnězapadat do hrdla odmě rné baňky. Z bě žného laboratorního vybavení je tř eba zejména toto: — mě ř icí př ístroje, — provzduš ňovací zař ízení, — mě ř ičpH a monitorovací zař ízení, — kyslíková elektroda. XI.1.6.3 Př íprava inokula Jako mikrobiální inokulum pro zkouš ku se použ ívá aktivovaný kal z č istírny odpadních vod č istící př evážnědomovní odpadní vody. Je-li to nutné, je možné př i dodání kalu do laboratoř e odstranit hrubé částice krátkodobým usazením (např . 15 minut) a dekantovat horní vrstvu jemně jš ích tuhých č ástic pro použití. Alternativně je mož né kal po ně kolik sekund.promíchat. Lze-li mimoto př edpokládat, ž e je př ítomna látka mající inhibič ní účinek, je nutné kal promýt vodovodní vodou nebo izotonickým roztokem. Po zcentrifugování se roztok nad usazeninou dekantuje (tento postup se opakuje tř ikrát). Malé množ ství kalu se zváží a vysuš í. Z výsledku je možné vypoč ítat množství vlhkého kalu, které je nutné suspendovat ve vodě , aby se získal aktivovaný kal v oblasti koncentrací suspendovaných tuhých látek ve smě sné kapaliněmezi 2 a 4 g.l-1. Dodrž í-li se níž e doporuč ený postup získá se zkuš ební médium s -1 koncentrací kalu 0,8 a 1,6 g.l . Není-li mož né kal použ ít v den kdy byl shromáždě n př idá se ke každému litru aktivovaného kalu, př ipraveného tak, jak je popsáno výš e, 50 ml syntetické o odpadní vody, potom se provzduš ňuje př es noc př i 20 2 C. Poté se udrž uje za provzduš ňování pro použití během dne. Př ed použitím se zkontroluje pH a je-li tř eba, upraví se na 6 - 8. Obsah suspendovaných tuhých látek ve smě sné kapalině je tř eba stanovit, jak je popsáno v př edchozím odstavci.
XI.1.6.4
XI.2
Pož aduje-li se použ ití stejné dávky kalu v následující dny (nejvýš e po č tyř i dny), př idává se na konci každého pracovního dne dalš ích 50 ml syntetické odpadní vody na litr kalu. Provedení zkouš ky Trvání/doba kontaktu: 30 minut a (nebo) 3 hodiny, bě hem kterých probíhá provzduš ňování Voda: Pitná voda (v př ípaděpotř eby zbavená chlóru) Př ívod vzduchu: Čistý vzduch, prostý oleje. Průtok 0,1 - 1 l.min-1 . Mě ř icí aparatura: Baňka s plochým dnem, jaká se použ ívá pro stanovení BSK. Mě ř ičobsahu kyslíku: Vhodná kyslíková elektroda, se zapisovač em. Živný roztok: Syntetická odpadní voda (viz výš e). Zkouš ená látka: Roztok zkouš ené látky se př ipraví č erstvý na zač átku zkouš ky. Referenč ní látka: např . 3,5-dichlorfenol (nejménětř i koncentrace) Kontrolní zkouš ka: Naočkovaný vzorek bez zkouš ené látky o Teplota: 20 2 C Dále je uveden navrž ený experimentální postup, kterého je mož né použít jak pro zkouš enou, tak pro referenč ní látku, pro dobu kontaktu tř i hodiny: Použ ívá se ně kolika nádob (např . jednolitrových kádinek). Je tř eba použít alespoňpě t koncentrací, odstupňovaných o konstantní faktor nepř evyš ující pokud mož no 3,2. V okamž iku "0" se 16 ml syntetické odpadní vody doplní vodou na 300 ml. Př idá se 200 ml mikrobiálního inokula a výsledná smě s (500 ml) se př evede do první nádoby (první kontrola C 1). Nádoby, používané v pokusu, je nutné nepř etrž itě provzduš ňovat, aby bylo zaruč eno, že koncentrace rozpuš tě ného kyslíku nepoklesne pod 2,5 mg.l-1 a aby těsně př ed měř ením rychlosti dýchání č inila koncentrace kyslíku př ibližně6,5 mg.l -1. V okamžiku "15 minut" (15 minut je libovolnězvolený, avš ak vhodný interval) se opakuje totéžažna to, ž e se k 16 ml syntetické odpadní vody př ed doplně ním vodou na 300 ml a př idáním mikrobiálního inokula na celkový objem 500 ml př idá 100 ml zásobního roztoku zkouš ené látky. Tato směs se pak př evede do druhé nádoby a provzduš ňuje se jako výš e. Tento postup se opakuje v 15minutových intervalech s různými objemy zásobního roztoku zkouš ené látky, č ímžse získá ř ada nádob obsahujících různé koncentrace zkouš ené látky. Nakonec se př ipraví druhá kontrolní nádoba. Po tř ech hodinách se zaznamená pH, dobř e promíchaný vzorek obsahu první nádoby se př evede do mě ř icí aparatury a v dobědo 10 minut se změř í rychlost dýchání. Stanovení se opakuje u obsahu každé z nádob v 15minutových intervalech tak, že doba kontaktu v kaž dé nádoběje tř i hodiny. Referenč ní látka se zkouš í na kaž dé dávce mikrobiálního inokula týmžzpůsobem. Mají-li se mě ř ení provádě t po 30 minutách kontaktu, je tř eba použít jiného režimu (např . použ ití více nežjednoho mě ř ič e kyslíku). Vyžaduje-li se měř ení chemické spotř eby kyslíku, př ipraví se dalš í nádoby, obsahující zkouš enou látku, syntetickou odpadní vodu a č istou vodu, ale ne aktivovaný kal. Spotř eba kyslíku se mě ř í a zaznamená po doběprovzduš ňování 30 minut a (nebo) tř i hodiny (doba kontaktu). VÝSLEDKY A VYHODNOCENÍ
XI.3 XI.3.1
XI.3.2
XI.4
Rychlost dýchání se vypoč ítá ze záznamu zapisovač e mezi př ibližně6,5 mg.l -1 a -1 2,5 mg.l , nebo za desetiminutovou periodu, je-li rychlost dýchání nízká. Část respirační kř ivky, ze které se vyhodnocuje rychlost dýchání, musí být lineární. Jestliž e rychlosti dýchání v obou kontrolních pokusech nelež í v rozmezí 15 % od sebe navzájem, nebo EC50 (za 30 minut nebo tř i hodiny) referenč ní látky nelež ív akceptovaném rozmezí (5 - 30 mg.l-1 pro 3,5-dichlorfenol), je zkouš ka neplatná a musí se opakovat. Pro kaž dou zkuš enou koncentraci (viz bod 1. 2) se vypočte inhibice v %. Inhibice v % se vynese proti koncentraci na logaritmicko-normálním (nebo logaritmickopravdě podobnostním) papíru a odečte se hodnota EC50. Standardními postupy je mož né stanovit pro hodnoty EC 50 95% meze spolehlivosti. ZPRÁVA PROTOKOL O ZKOUŠCE Je-li to možné, má protokol o zkouš ce obsahovat tyto informace: — zkouš ená látka: chemické identifikač ní údaje, —- systém použ itý př i zkouš ce: zdroj, koncentrace a veš kerá př edbě ž ná úprava aktivovaného kalu, — experimentální podmínky: — pH reakč ní smě si př ed mě ř ením respirace, — teplota př i zkouš ce, — ba trvání zkouš ky, — referenč ní látka a její změ ř ená EC50, — abiotická spotř eba kyslíku (pokud k ní dochází). — výsledky: — veš keré namě ř ené hodnoty, — kř ivka inhibice a metoda výpoč tu EC50, — EC50 a je-li mož né 95% meze spolehlivosti, EC 20 a EC80 , — veš kerá pozorování a veš keré odchylky od této zkuš ební metody, které mohly ovlivnit výsledek. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Hodnotu EC50 je tř eba považ ovat pouze za orientační hodnotu pravděpodobné toxicity zkouš ené látky buď př i zpracování odpadních vod aktivovaným kalem, nebo pro mikroorganizmy v odpadních vodách, protož e slož ité interakce, ke kterým dochází v životním prostř edí, nelze př esně simulovat laboratorní zkouš kou. Mimoto, zkouš ené látky, které mohou mít inhibič ní úč inky na oxidaci amoniaku, mohou také způsobovat atypické inhibič ní kř ivky. Proto je nutné interpretovat tyto kř ivky opatrně . LITERATURA (1) International Standard ISO 8192-1986. (2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, str. 165 (3) Brown, D., Hitz, H.R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, str. 245 (4) ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs Manufacturing Industries - Ekologická a toxikologická asociace průmyslu výroby barviv), Recommended Method No 103, také popsáno v: (5) Robra, B., Wasser/Abwasser 117, 1976, str. 80 (6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, str. 247 (7) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 209, Decision of the Council C(81) 30 final.
XII. METODA PRO STANOVENÍ BIOLOGICKÉ ROZLOŽITELNOSTI – MODIFIKOVANÁ ZKOUŠKA SCAS – metoda C.12 podle př ílohy smě rnice 92/69/EHS XII.1 XII.1.1
XII.1.2
METODA ÚVOD Cílem této metody je hodnocení potenciální úplné biologické rozlož itelnosti netě kavých organických látek rozpustných ve vodě, jsou-li vystaveny poměrně vysokým koncentracím mikroorganizmů po dlouhé časové období. Životaschopnost mikroorganizmůse udrž uje po tuto dobu denními př ídavky ž ivin z usazené odpadní vody. (Pro potř ebu bě hem víkendů lze odpadní vodu př echovávat př i 4 oC. Alternativněje možné použít syntetickou odpadní vodu podle potvrzující zkouš ky OECD.) Př i interpretaci výsledků(viz 3. 2) je nutné brát v úvahu, že může docházet k fyzikálně -chemické adsorpci na suspendovaných tuhých látkách. V důsledku dlouhé doby zdrž ení kapalné fáze (36 hodin) a průbě ž ného př idávání ž ivin nesimuluje zkouš ka podmínky existující v č istírněodpadních vod. Výsledky získané př i pokusech s různými látkami ukazují, že zkouš ka má vysoký potenciál biologického rozkladu. Podmínky poskytované zkouš kou jsou vysoce př íznivé pro výbě r a adaptaci mikroorganizmůschopných rozkládat zkouš enou látku. (Postup je mož né použít také k získávání aklimatizovaných inokulí pro použ ití v jiných zkouš kách.) V této metoděse použ ívá k hodnocení výsledné biologické rozlož itelnosti zkouš ené látky hodnota koncentrace rozpuš těného organického uhlíku (DOC). DOC se doporuč uje radě ji stanovit po okyselení a př eč iš tě ní nežjako rozdíl C celk. - Canorg. . Souč asné použ ití specifické analytické metody může umož nit urč ení primárního rozkladu látky (úbytek výchozí chemické struktury). Metoda je použitelná pouze pro ty organické látky, které v koncentracích použ ívaných ve zkouš ce: — jsou rozpustné ve vodě(alespoň20 mg rozpuš tě ného organického uhlíku na litr), — mají zanedbatelnou tenzi par, — nepůsobí inhibič něna bakterie, —- významněse neadsorbují ve zkuš ebním systému, — neztrácejí se ze zkouš eného roztoku pě něním. Je nutné stanovit obsah organického uhlíku ve zkouš ené látce. Př i interpretaci získaných výsledků, zejména v př ípadech, kdy výsledky jsou nízké nebo marginální, jsou cenné informace o relativních podílech hlavních slož ek ve zkouš eném vzorku Pro interpretaci nízkých výsledkůa př i volběvhodné koncentrace př i zkouš ce mohou být už iteč né informace o toxicitělátky pro mikroorganizmy. DEFINICE A JEDNOTKY CT = koncentrace zkouš ené látky na zač átku provzduš ňovací periody, vyjádř ená jako množ ství organického uhlíku př ítomného nebo př idaného k usazené odpadní vodě(mg.l-1), Ct = koncentrace rozpuš tě ného organického uhlíku v kapaliněnad usazeninou, ve zkouš ce, na konci provzduš ňovací periody (mg.l -1),
Cc = koncentrace rozpuš tě ného organického uhlíku v kapaliněnad sedimentem, v kontrolní zkouš ce, na konci provzduš ňovací periody (mg.l-1). Biologický rozklad je v této metodědefinován jako úbytek organického uhlíku. Biologický rozklad je mož né vyjádř it jako: 1. Procentický úbytek D da množ ství denněpř idávané látky: C Ct Cc Dda T 100 (1) CT kde Dds = rozklad/denní př ídavek 2. Procentický úbytek D ssd množství látky př ítomného na začátku kaž dého dne: 2 CT Cti Cci 3Ct ( i 1) 3Cc (i 1 ) Dssd 100 (2( a)) CT Cti Cci 2CT 2 Ct Cc 100 2CT Ct Cc
XII.1.3 XII.1.4
XII.1.5
XII.1.6 XII.1.6.1
(2 (b ))
kde Dred = rozklad/denní př ídavek; indexy i a (i + 1) se vztahují ke dni měř ení. Rovnice 2(a) se doporučuje, mě ní-li se DOC v odcházející voděden ode dne, zatímco rovnici 2(b) lze použ ívat, zůstává-li DOC v odcházející voděden ode dne relativněkonstantní. REFERENČNÍ LÁTKY PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY Aktivovaný kal z č istírny odpadních vod se vpraví do semikontinuální jednotky pro aktivovaný kal (SCAS, semi-continuous activated sludge unit). Př idají se zkouš ená látka a usazená domovní odpadní voda a smě s se provzduš ňuje 23 hodin. Provzduš ňování se pak ukonč í, kal se nechá usadit a kapalina nad usazeninou se odstraní. Kal zbylý v provzduš ňovací komoř e se pak smísí s dalš í alikvotní č ástí zkouš ené látky a odpadní vody a cyklus se opakuje. Biologický rozklad se urč í stanovením obsahu rozpuš těného organického uhlíku v kapaliněnad sedimentem. Tato hodnota se porovná s hodnotou, zjiš tě nou pro kapalinu získanou z kontrolní nádoby, do které byla dávkována pouze usazená odpadní voda. Použ ije-li se specifická analytická metoda, je mož né mě ř it změ ny koncentrace výchozí chemické látky v důsledku biologického rozkladu (primární biologický rozklad). KRITÉRIA KVALITY Reprodukovatelnost této metody, založ ené na úbytku rozpuš tě ného organického uhlíku, nebyla ješ těstanovena. (Pokud se uvažuje primární biologický rozklad, dosahuje se velmi př esných hodnot pro látky, které se rozkládají ve vysokém stupni.) Citlivost metody je ve velké míř e určena variabilitou slepé zkouš ky a v menš í míř e př esností stanovení rozpuš tě ného organického uhlíku a obsahem zkouš ené látky v kapaliněna začátku kaž dého cyklu. POPIS PRACOVNÍHO POSTUPU Př íprava Sestaví se dostatečný poč et č istých provzduš ňovacích jednotek, alternativněje možné použ ít originální zkuš ební jednotku SCAS o obsahu 1,5 l, a trubic pro př ívod vzduchu (obrázek 1) pro kaž dou zkouš enou látku a pro kontrolní zkouš ky. Stlač ený vzduch př ivádě ný do zkuš ebních jednotek, př eč iš tě ný vatovým filtrem,
XII.1.6.2
XII.1.6.3
musí být prostý organického uhlíku a musí být př edem nasycen vodou, aby se sníž ily ztráty vypař ováním. Vzorek směsné kapaliny, obsahující 1 - 4 g suspendovaných tuhých látek v 1 litru, se získá z č istírny pracující s aktivovaným kalem, č istící př eváž ně domovní odpadní vody. Pro každou provzduš ňovací jednotku je tř eba př ibližně150 ml smě sné kapaliny. Zásobní roztoky zkouš ené látky se př ipravují s použitím destilované vody; normálněpožadovaná koncentrace je 400 mg.l-1 jako organický uhlík, což př edstavuje koncentraci zkouš ené látky 20 mg.l-1 uhlíku na zač átku kaž dého cyklu provzduš ňování, nedochází-li k biologickému rozkladu. Dovoluje-li to toxicita pro mikroorganizmy jsou př ípustné vyš š í koncentrace. Mě ř í se obsah organického uhlíku zásobních roztoků. Experimentální podmínky Zkouš ku je tř eba provádě t př i 20 - 25 oC.Použ ívá se vysoká koncentrace aerobních -1 mikroorganizmů(1 - 4 g.l suspendovaných látek), a efektivní doba zdržení je 36 hodin. Uhlíkaté látky v př iváděné odpadní voděse v š iroké míř e oxidují, normálně bě hem osmi hodin po začátku kaž dého cyklu provzduš ňování. Potom kal endogennědýchá po zbytek provzduš ňovací periody, a v této doběje jediným dostupným substrátem zkouš ená slouč enina, pokud se také rychle nemetabolizuje. Tyto skuteč nosti spolu s denněopakovaným oč kováním, použ ívá-li se jako médium domovní odpadní voda, vytvář ejí vysoce př íznivé podmínky jak pro aklimatizaci, tak pro vysoký stupeňrozkladu. Provedení zkouš ky Získá se vzorek smě sné kapaliny z vhodné č istírny čistící aktivovaným kalem př evážnědomovní odpadní vody nebo vzorek kapaliny z laboratorní jednotky a udrž uje se v aerobních podmínkách aždo použ ití v laboratoř i. Do kaž dé aerač ní i kontrolní jednotky se naplní 150 ml smě sné kapaliny (použ ívá-li se originální jednotka pro zkouš ku SCAS, je tř eba uvedené objemy násobit 10) a zahájí se provzduš ňování. Po 23 hodinách se provzduš ňování ukonč í a kal se nechá 45 minut usadit. Postupněse otevř ou kohouty vš ech nádob a odeberou se 100 ml podíly kapaliny nad usazeninou. Ke kalu zbylému v každé aerač ní jednotce se př idá 100 ml usazené domovní odpadní vody získané bezprostř edně př ed použ itím. Opě t se zahájí provzduš ňování. V této etapěse nepř idávají ž ádné zkouš ené látky, a do jednotek se denněpř idává domovní odpadní voda pouze do té doby, nežse po usazení získá čirá kapalina nad usazeninou. To trvá obvykle aždva týdny, bě hem kterých se obsah rozpuš těného organického uhlíku v kapaliněnad usazeninou na konci kaž dého aerač ního cyklu př iblíž í konstantní hodnotě. Na konci této fáze se jednotlivé usazené kaly smísí a do kaž dé jednotky se př edlož í 50 ml výsledného smě sného kalu. Do kontrolních jednotek se př idá 95 ml usazené odpadní vody a 5 ml vody, a do zkuš ebních jednotek se př idá 95 ml usazené odpadní vody plus 5 ml př ísluš ného zásobního roztoku zkouš ené látky (450 mg.l-1). Znovu se zahájí provzduš ňování a pokrač uje se v něm 23 hodin. Kal se pak nechá 45 minut usadit, kapalina nad usazeninou se odebere a analyzuje na obsah rozpuš tě ného organického uhlíku. Výš e uvedený postup plně ní a odbě ru se opakuje v průbě hu zkouš ky denně . Můž e se ukázat nutným oč istit př ed usazováním stěny jednotek, aby se př edeš lo hromadě ní tuhých látek nad hladinou kapaliny. Pro každou jednotku se použ ívá samostatná stěrka nebo kartáč , aby se př edeš lo vzájemné kontaminaci. V ideálním př ípaděse rozpuš tě ný organický uhlík stanoví v kapalinách nad
XII.2
XII.3 XII.3.1
XII.3.2
usazeninami denně , i když jsou př ípustné méněč asté analýzy. Př ed analýzou se kapaliny zfiltrují př es promyté 0,45 m membránové filtry nebo se zcentrifugují. Membránové filtry jsou vhodné, je-li zaruč eno, ž e ani neuvolňují uhlík, ani ve filtračním kroku neabsorbují př ísluš nou látku. Teplota vzorku po dobu, kdy je v odstř edivce, nesmí př esáhnout 40 oC. Doba trvání zkouš ky pro látky, u kterých dochází k malému nebo ž ádnému biologickému rozkladu není určena, ale na základězkuš enosti lze doporučit, aby trvala obecněnejméně12 týdnů, avš ak ne déle než26 týdnů. VÝSLEDKY A VYHODNOCENÍ Hodnoty koncentrace rozpuš tě ného organického uhlíku v č iré kapalině nad usazeninami ve zkuš ebních jednotkách a v kontrolních jednotkách se vynesou proti č asu. Po skonč ení biologického rozkladu se koncentrace zjiš tě ná ve zkouš ce př iblíž í hodnotěv kontrolní jednotce. Jakmile se ve tř ech po soběnásledujících mě ř eních zjistí, ž e rozdíl mezi oběma úrovně mi je konstantní, provede se takový poč et dalš ích mě ř ení, který je postač ující pro statistické vyhodnocení výsledků, a vypoč te se procentní hodnota biologického rozkladu zkouš ené látky (Dda nebo Dred, viz 1. 2). ZPRÁVA PROTOKOL O ZKOUŠCE Je-li to možné, má protokol o zkouš ce obsahovat tyto informace: — veš keré informace o druhu odpadní vody, typu použité jednotky a o experimentálních výsledcích týkajících se zkouš ené látky, referenční látky ( pokud byla použ ita) a slepé zkouš ky, — teplotu, — kř ivku úbytku s popisem, způsob výpočtu (viz 1. 2), — datum a lokalitu, kde byly odebrány aktivovaný kal a odpadní voda, stav adaptace, koncentrace atd., — vědecké důvody pro veš keré změ ny v postupu zkouš ky, — podpis a datum. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Protož e látky zkouš ené touto metodou nejsou snadno biologicky rozlož itelné, bude normálnějakýkoli úbytek DOC, ke kterému dojde pouze v důsledku biologického rozkladu, během dnůnebo týdnů, postupný, s výjimkou př ípadů, kdy aklimatizace je náhlá, jak je to indikováno náhlým vymizením zkouš ené látky po ně kolika týdnech. Ně kdy můž e hrát významnou úlohu fyzikálně -chemická adsorpce; to je indikováno úplným nebo č ásteč ným úbytkem př idaného DOC na zač átku. K č emu dojde potom, závisí na č initelích jako je míra adsorpce a koncentrace suspendovaných látek v nepouž ité odcházející vodě . Obvykle rozdíl mezi koncentrací DOC v kapalinách nad usazeninou u kontroly a ve zkouš ce postupně vzrůstá z poč áteční nízké hodnoty a tento rozdíl pak, pokud nedojde k aklimatizaci, zůstává na nové hodnotěpo zbytek experimentu,. Je-li tř eba rozliš it mezi biologickým rozkladem (nebo částečným biologickým rozkladem) a adsorpcí, jsou nezbytné dalš í zkouš ky. Je mož né je provést ř adou způsobů, ale nejpř esvě dčivě jš í je použití kapaliny nad usazeninou nebo kalu jako inokula ve zkouš ce vybrané ze základního souboru (nejlépe v respirometrické zkouš ce). Zkouš ené látky, u kterých v této zkouš ce dochází k vysokému neadsorpč nímu úbytku DOC, je tř eba považ ovat za potenciálněbiologicky rozložitelné. Částeč ný
XII.4
neadsorpč ní úbytek ukazuje, ž e u látky dochází alespoňk urč itému biologickému rozkladu. Nízké nebo nulové úbytky DOC mohou být způsobeny inhibicí mikroorganizmů zkouš enou látkou, cožse může projevit také lyzí a ztrátou kalu, takž e kapalina nad usazeninou je zakalená. Zkouš ku je nutné opakovat s niž š í koncentrací zkouš ené látky. Vyš š í citlivosti je mož né dosáhnout použitím specifické analytické metody nebo slouč eniny znač ené 14C. V př ípadězkouš ené látky znač ené uhlíkem 14C se 14 zachycením CO2 potvrdí, ž e doš lo k biologickému rozkladu. Tam, kde jsou výsledky uvedeny také jako primární biologický rozklad, je tř eba, pokud je to možné, uvést také vysvětlení změny chemické struktury, která vede ke ztrátěodezvy u mateř ské zkouš ené látky. Je nutné uvést potvrzení platnosti metody spolu s odezvou zjiš tě nou u média ve slepé zkouš ce. LITERATURA (1) OECD, Paris, 1981. Test Guideline 302 A, Decision of the Council C(81) 30 final. PŘÍLOHA 1 Zkouš ka SCAS: př íklad výsledků Látka
CT (mg.l -1)
Cl - Cc (mg.l-1)
Procento biolog. Doba trvání rozkladu Dda zkouš ky (dny) 85 40
4 -acetylaminobenzen sulfonan tetrapropylenbenzen sulfonan 4 - nitrofenol diethylenglykol anilin cyklopentantetrakarboxylát
17,2
2,0
17,3
8,4
51,4
40
16,9 16,5 16,9 17,9
0,8 0,2 1,7 3,2
95,3 98,8 95,9 81,1
40 40 40 120
PŘÍLOHA 2 Př íklad zkuš ební aparatury
XIII. METODA PRO STANOVENÍ BIOAKUMULACE - PRŮTOKOVÁ ZKOUŠKA NA RYBÁCH – metoda C.13 podle přílohy smě rnice Komise 98/73/ES ze dne 18. září 1998, kterou se po dvacáté čtvrté přizpůsobuje technickému pokroku smě rnice rady 67/548/EHS o sbliž ování správních a právních př edpisůtýkajících se klasifikace, balení a označování nebezpeč ných látek XIII.1 XIII.1.1
XIII.1.2
METODA Tato bioakumulač ní metoda je replikou metody OECD TG 305 (1996). Úvod V této metodě je popsán postup pro charakterizování potenciálu látek bioakumulovat se v rybách za průtokových podmínek. Ačkoliv jsou průtokové režimy preferovány, semistatické režimy se př ipouš tě jí, jsou-li splněna kritéria validace. V metodějsou dostateč něpopsány podrobnosti pro provedení zkouš ky, př ič emžje poskytnuta dostateč ná volnost pro př izpů sobení experimentálního uspoř ádání podmínkám v jednotlivých laboratoř ích a různým vlastnostem zkuš ebních látek. Metoda je nejefektivně jš í pro stabilní organické chemikálie s hodnotou logPov od 1,5 do 6,0 (1), ale může být také použita na superlipofilní látky (s hodnotou log Pov > 6,0). Př edbě ž ně odhadnutý bioakumulační faktor (BCF), ně kdy označ ován jako KB, bude pro takové superlipofilní látky pravděpodobněvyš š í než hodnota bioakumulač ního faktoru v rovnováž ném stavu (BCF ss), která je oč ekávána z laboratorních experimentů. Př edběž né odhady pro organické látky s hodnotou log Pov ažasi 9,0 lze získat pomocí rovnice Binteina et al (2). Mezi parametry, které charakterizují bioakumulační potenciál, patř í rychlostní konstanta př íjmu (k1), rychlostní konstanta vyluč ování (k2) a BCFss. Zkuš ební látky znač ení radioizotopy mohou usnadnit analýzu vzorkůvody a ryb a mohou být použ ity v př ípadě , ž e by mě la být provedena identifikace a kvantifikace produktůodbourávání. Měř í-li se celkový obsah radioaktivního zůstatku (např íklad spálením nebo solubilizací tkáně ), zakládá se hodnota BCF na výchozí slouč enině , vš ech zadržených metabolitech a také na asimilovaném uhlíku. Hodnoty BCF založ ené na celkovém obsahu radioaktivního zbytku tedy nemohou být př ímo srovnatelné s hodnotou BCF získanou specifickou chemickou analýzou pouze výchozí slouč eniny. V metodách se znač ením radioaktivními izotopy mohou být pro stanovení výchozí slouč eniny zař azeny purifikač ní postupy, a je-li to považ ováno za nezbytné, mohou být charakterizovány hlavní metabolity. Je mož né rovně žkombinovat studii metabolismu ryb se studií bioakumulace analýzou a identifikací reziduí v tkáních. Definice a jednotky Biokoncentrace/Bioakumulace je nárůst koncentrace zkuš ební látky v organismu (v jeho specifické tkáni) nebo na ně m vzhledem ke koncentraci zkuš ební látky v okolním médiu. Bioakumulač ní faktor (BCF nebo KB ) je koncentrace zkuš ební látky v rybách nebo na nich nebo v jejich specifikovaných tkáních (Cf v µg/g (ppm)) dělená koncentrací chemikálie v okolním médiu (C w v µg/ml (ppm)), a to v kaž dém okamž iku fáze př íjmu př i této zkouš ce. Bioakumulač ní faktor v rovnováž ném stavu (BCFss nebo KB) se po dlouhou dobu výrazněnemě ní; koncentrace zkuš ební látky v okolním médiu je po tuto dobu konstantní.
XIII.1.3
Plató nebo rovnováž ný stav je stav dosaž ený tehdy, je-li př i grafickém vyjádř ení kř ivka časové závislosti koncentrace zkuš ební látky v rybách (Cf) rovnobě žná sč asovou osou a tř i po sobějdoucí analýzy C f vzorkůodebraných v intervalech alespoňdvou dnůse neliš í více nežo ±20 % a není-li mezi tě mito tř emi dobami odbě ru žádný výrazný rozdíl. Analyzují-li se sdružené vzorky, požadují se č tyř i po sobějdoucí analýzy. V př ípadězkuš ebních látek, jejichžpř íjem probíhá pomalu, jsou vhodně jš í sedmidenní intervaly. Bioakumulač ní faktory vypoč tené př ímo z rychlostních konstant kinetiky (k 1/k2) se nazývají kinetické koncentrač ní faktory (BCFk). Rozdě lovací koeficient oktanol-voda (P ov) je rovnováž ný pomě r mezi rozpustností chemikálie v n-oktanolu a ve vodě(metoda A.8) a označ uje se také jako Kow. Logaritmus hodnoty Pov se použ ívá jako ukazatel potenciálu chemikálie bioakumulovat se ve vodních organismech. Expozice nebo fáze př íjmu je č asový úsek, bě hem ně hožjsou ryby vystaveny působení zkuš ební chemikálii. Rychlostní konstanta př íjmu (k1 ) je č íselná hodnota definující rychlost nárůstu koncentrace zkuš ební látky v testovacích rybách nebo na nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních), jsou-li ryby této chemikálii vystaveny (k1 se vyjadř uje ve jednotce den–1). Po-expozič ní nebo vyluč ovací fáze je č asový úsek po př emístě ní testovacích ryb z média obsahujícího zkuš ební látku do média, které tuto látku neobsahuje, bě hem ně hožse studuje vyluč ování látky z testovacích ryb (nebo její č istý úbytek v nich). Rychlostní konstanta vylučování (k2) je č íselná hodnota definující rychlost poklesu koncentrace zkuš ební látky v testovacích rybách (nebo v jejich specifikovaných tkáních) po jejich př emístění z média obsahujícího zkuš ební látku do média, které tuto látku neobsahuje (k 2 se vyjadř uje ve jednotce den–1). Princip zkuš ební metody Zkouš ka má dvěfáze: fázi expozice (př íjem) a po-expozič ní fázi (vyluč ování). Bě hem fáze př íjmu jsou dvěoddě lené skupiny ryb stejného druhu exponovány alespoňdvě ma koncentracím zkuš ební látky. Poté jsou př emístě ny do média, které zkuš ební látku neobsahuje, aby začala fáze vylučování. Fáze vyluč ování je vž dy nezbytná, není-li př íjem látky během fáze př íjmu nevýznamný (např . je-li BCF menš í než10). Koncentrace zkuš ební látky v rybách nebo na nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních) se sleduje v průběhu obou fází zkouš ky. Vedle tě chto dvou zkuš ebních koncentrací se za stejných podmínek, s výjimkou př ítomnosti zkuš ební látky, udrž uje kontrolní skupina ryb, aby mohly být na odpovídající kontrolní skupině porovnány mož né nepř íznivé účinky pozorované př i bioakumulač ních zkouš kách a aby byly získány pozaďové koncentrace zkuš ební látky. Fáze př íjmu tvá 28 dnů, není-li prokázáno, ž e rovnováhy je dosaž eno dř íve. Délku fáze př íjmu a dobu potř ebnou k ustavení rovnovážného stavu lze př edpově dě t pomocí rovnice v př íloze 3. Fáze vyluč ování poté začne po př emístě ní ryb do jiné nádrže bez zkuš ební látky. Je-li to možné, vypoč ítají se bioakumulač ní faktory nejlépe jako pomě r (BCFss), tj. pomě r koncentrace v rybách (C f) a ve vodě(Cw) ve zř etelném rovnováž ném stavu, a jako kinetický bioakumulač ní faktor (BCFk), tj. poměr rychlostních konstant př íjmu (k1) a vyluč ování (k 2) za př edpokladu kinetiky prvního ř ádu. Neř ídí-li se zjevněnamě ř ené hodnoty kinetikou prvního ř ádu, mě l by být použit slož itě jš í model (př íloha 5).
XIII.1.4
XIII.1.5
Nedojde-li k rovnovážnému stavu do 28 dnů, měla by být fáze př íjmu prodlouž ena do jeho dosažení nebo na 60 dnů, podle toho, co nastane dř íve; poté zač ne fáze vyluč ování. Rychlostní konstanta př íjmu, rychlostní konstanta vylučování (úbytku) (nebo konstanty, jsou-li použity složitě jš í modely), bioakumulač ní faktor a, je-li to možné, intervaly spolehlivosti každého z tě chto parametrůse vypočítají z modelu, který popisuje namě ř ené koncentrace zkuš ební látky v rybách a ve vodě . Faktor BCF se vyjadř uje jako funkce celkové ž ivé hmotnosti ryby. Pro zvláš tní úč ely vš ak mohou být použ ity specifikované tkáněnebo orgány (svalovina, játra), je-li ryba dostateč něvelká nebo je-li možné ji rozdě lit na jedlý (vykostě ný) podíl a nejedlý podíl (vnitř nosti). Vzhledem k tomu, že u mnoha organických látek existuje zř etelný vztah mezi potenciálem bioakumulace a lipofilií, existuje také odpovídající vztah mezi obsahem tuku v testovacích rybách a pozorovanou bioakumulací takové látky. Aby se tedy snížilo kolísání výsledkůpro tyto látky s vysokou lipofilií (tj. s log Pov > 3), mě la by být bioakumulace vztaž ena vedle celkové hmotnosti tě la také k obsahu tuku. Obsah tuku by měl být stanoven pokud mož no na stejném biologickém materiálu, jaký je použit ke stanovení koncentrace zkuš ební látky. Informace o zkuš ební látce Př ed provádě ním zkouš ek bioakumulace by měly být o zkuš ební látce známy tyto informace: a) rozpustnost ve vodě, b) rozdě lovací koeficient oktanol-voda Pov (označ ovaný také jako K ow, stanovený metodou HPLC, viz A.8), c) hydrolýza, d) fototransformace ve vodě stanovená ozář ením sluneč ním nebo simulovaným slunečním svě tlem za podmínek zkouš ky bioakumulace (3), e) povrchové napětí (tj. u látek, u nichžnelze stanovit log Pov), f) tlak par, g) popř ípaděochota k biologickému odbourávání. Dalš í požadovanou informací je toxicita pro druh ryby, který má být použ it, nejlépe asymptotická hodnota LC50 (tj. č asověnezávislá). Musí být k dispozici vhodná analytická metoda o známé správnosti, př esnosti a citlivosti pro kvantitativní stanovení zkuš ební látky ve zkuš ebních roztocích a v biologickém materiálu a dále podrobnosti o př ípravěa uchovávání vzorků. Mě ly by být také známy meze stanovitelnosti zkuš ební látky jak ve vodě , tak v rybích tkáních. Je-li použ ita zkuš ební látka znač ená 14C, měla by být známá aktivita nečistot vyjádř ená v procentech. Platnost zkouš ky Aby zkouš ka platila, mě ly by platit následující podmínky: — kolísání teploty je menš í než±2 °C, — koncentrace rozpuš tě ného kyslíku neklesne pod 60% nasycení, — koncentrace zkuš ební látky v nádrži je udrž ována v intervalu ±20 % kolem stř ední hodnoty namě ř ených hodnot během fáze př íjmu, — mortalita nebo jiné nepř íznivé úč inky/choroby jak u kontrolních, tak u exponovaných ryb je na konci zkouš ky menš í než10 %; jestliž e je zkouš ka prodloužena na ně kolik týdnůnebo měsíců, mě l by být úhyn nebo jiné nepř íznivé úč inky v obou skupinách ryb menš í než5 % za mě síc nebo by neměl př ekroč it celkem 30 %.
Referenč ní slouč eniny Použ ití referenč ních sloučenin o známém bioakumulač ním potenciálu je popř ípaděužiteč né pro kontrolu experimentálního postupu. Zatím nelze ješ tě doporuč it ž ádné specifické látky. XIII.1.7 Popis zkuš ební metody XIII.1.7.1 Př ístroje a pomůcky V př ípaděvš ech částí zař ízení je tř eba se důsledněvyhýbat použití materiálů, které mají schopnost rozpouš tě t, sorbovat nebo vyluhovat a mají nepř íznivý úč inek na ryby. Lze použít standardní pravoúhlé nebo válcové nádrž e vyrobené z inertního materiálu a mající vhodný objem s ohledem na náplň. Použ ití měkkých trubek z plastu by mělo být minimalizováno. Mě ly by být použ ity trubky z teflonu (R), z korozivzdorné oceli a/nebo ze skla. Zkuš enosti ukázaly, že pro látky s vysokými absorpč ními koeficienty, jako jsou syntetické pyrethroidy, je potř ebné silanizované sklo. V tě chto př ípadech musí být zař ízení po použ ití zlikvidováno. XIII.1.7.2 Voda Ve zkouš ce se použ ívá př írodní voda a mě la by být získána z nekontaminovaného zdroje stálé kvality. Ředicí voda musí mít kvalitu, která umožní př ež ití zvoleného druhu ryby po dobu aklimatizace a v průbě hu fází zkouš ky, anižby vykazoval abnormální klinický zjev nebo chování. V ideálním př ípadě by mělo být prokázáno, ž e testovací druh může v ř edicí voděpř ež ít, růst a rozmnož ovat se (např . zkouš kou s laboratorní kulturou nebo zkouš kou toxicity bě hem životního cyklu). Voda by mě la být charakterizována alespoň hodnotou pH, tvrdostí, celkovým obsahem nerozpuš tě ných látek, celkovým obsahem organického uhlíku a podle možnosti také obsahem amoniaku a dusičnanů, alkalitou a v př ípadě moř ských druhůsalinitou. Vš echny parametry, které jsou důlež ité pro optimální prospívání ryb, jsou známy, v př íloze I jsou př esto uvedeny doporuč ené maximální koncentrace pro ř adu parametrůsladkovodní a moř ské vody. Voda by mě la mít po celou dobu zkouš ky stejnou kvalitu. Hodnota pH by mě la být v rozmezí 6,0 až8,5, avš ak bě hem zkouš ky by se pH nemě lo liš it o více než ±0,5. Pro ujiš tě ní, že voda nebude mít př íliš ný vliv na výsledky zkouš ky (např íklad tvorbou komplexůse zkuš ební látkou) nebo nepř íznivý vliv na stav obsádky ryb, by mě ly být odebírány v pravidelných intervalech její vzorky pro analýzu. Stanovení tě žkých kovů(např . Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), hlavních aniontů, kationtů(např . Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pesticidů(např . celkový obsah organofosforových a organochlorových pesticidů), celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek by mě l být proveden každé tř i mě síce, je-li kvalita ř edicí vody relativněkonstantní. Je-li prokázáno, že kvalita vody je konstantní po dobu alespoňjednoho roku, mohou být stanovení méněč astá a intervaly lze prodloužit (např . kaž dých š est mě síců). Celkový př irozený obsah č ástic a rovně žobsah organického uhlíku (TOC) v ř edicí vodě by mě l být co nejniž š í, aby nedoš lo k absorpci zkuš ební látky na organických látkách, cožmůže sníž it její biologickou dostupnost (4). Maximální př ijatelná hodnota je 5 mg/l pro č ástice (suš ina zachycená filtrem 0,45 µm) a 2 mg/l pro celkový organický uhlík (viz př íloha II). Je-li to nezbytné, měla by být voda př ed použitím filtrována. Př íspěvek k obsahu organického uhlíku od testovacích ryb (exkrety) a ze zbytkůpotravy by mě l být co nejmenš í. V průbě hu zkouš ky by neměla koncentrace organického uhlíku ve zkuš ební nádrž i př ekroč it koncentraci organického uhlíku pocházejícího ze zkuš ební látky a z rozpouš tě dla, je-li použito, o více než10 mg/l (±20 %). XIII.1.7.3 Zkuš ební roztoky c1.6
XIII.1.7.4
XIII.1.7.5
XIII.1.8 XIII.1.8.1
XIII.1.8.2
Zásobní roztok zkuš ební látky se př ipraví ve vhodné koncentraci. Zásobní roztok by měl být př ipraven nejlépe jednoduchým smícháním nebo protř epáním zkuš ební látky s ř edicí vodou. Použití rozpouš tě del nebo dispersantů (solubilizač ních č inidel) se nedoporuč uje; můž e vš ak být v některých př ípadech nezbytné pro vytvoř ení zásobního roztoku o vhodné koncentraci. Rozpouš tědly, která mohou být použita, jsou ethanol, methanol, ethylenglykol-monomethylester, ethylenglykol-dimethylester, dimethylformamid a triethylenglykol. Dispersanty, které mohou být použity, jsou Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% methylcelulosa a HCO-40. Snadno biologicky odbouratelná č inidla je tř eba použ ívat rozváž ně, neboť mohou způsobit problémy s růstem bakterií v průtokových zkouš kách. Zkuš ební látka můž e být značena radioaktivními izotopy a mě la by být nejvyš š í čistoty (např . > 98%). Pro průtokové zkouš ky je pro zajiš tění koncentrací testované látky nezbytný systém, který plynule dávkuje a ř edí zásobní roztok zkuš ební látky (např . dávkovací č erpadlo, proporcionální dávkovač, saturač ní systém). Př ijatelná je výmě na nejlépe pěti objemův kaž dé zkuš ební nádrž i za den. Upř ednostňuje se průtokový režim, není-li to vš ak mož né (např . jsou-li testovací organismy nepř íznivěovlivňovány), může být použita semi-statická technika za př edpokladu, ž e jsou splně na kritéria validity. Rychlosti průtoku zásobního roztoku a ř edicí vody by mě ly být kontrolovány jak 48 hodin př ed zkouš kou, tak poté alespoň denněbě hem zkouš ky. Tato kontrola by mě la zhrnovat stanovení rychlosti průtoku v kaž dé testovací nádrž i a mě la by zajistit, aby se rychlost průtoku nemě nila o více než20 % v rámci jedné nádrž e nebo mezi nádrž emi. Výbě r druhů Důležitými kritérii pro výběr druhu jsou jeho dostupnost, možnost získat jej ve vyhovující velikosti a jeho bezproblémové udržování v laboratoř i. Dalš ími kritérii pro výběr druhu ryb jsou jeho rekreač ní, komerční a ekologický význam a rovně ž srovnatelná citlivost, úspě š né dř ívějš í použití atd. Doporuč ené druhy jsou uvedeny v př íloze II. Mohou být použ ity jiné druhy, avš ak zkuš ební postup musí být upraven, aby byly vytvoř eny vhodné zkuš ební podmínky. V takovém př ípaděby měly být uvedeny důvody pro výbě r druhu a experimentální podmínky. Chov ryb Obsádka ryb se nechá aklimatizovat alespoňdva týdny př i zkuš ební teplotěa krmí se odpovídající potravou stejného typu jako v průbě hu zkouš ky. Po 48 hodinách aklimatizace se zaznamená úhyn a použ ijí se následující kritéria: — úhyn vyš š í než10 % populace za sedm dnů: vymě nit celou obsádku; — úhyn 5 až10 % populace za sedm dnů: nechat aklimatizovat dalš ích sedm dnů; — úhyn niž š í než5 % populace za sedm dnů: násada se př ijímá; dojde li bě hem dalš ích sedmi dnůk úhynu vyš š ímu než5 %, celá násada se vymě ní. Zajistí se, aby ryby použ ité pro zkouš ku nevykazovaly pozorovatelné nemoci a abnormality. Vš echny nemocné ryby se vymění. Dva týdny př ed zkouš kou nebo v průbě hu zkouš ky nesmí být léč eny nemoci u ryb. Provedení zkouš ky Př edběž ná zkouš ka Můž e být užiteč né provést př edbě žný experiment s cílem optimalizovat zkuš ební podmínky koneč né zkouš ky, např . výbě r koncentrace (koncentrací) zkuš ební látky, délka fáze př íjmu a fáze vyluč ování. Délka fáze p ř íjmu
Př edpově ďdélky fáze př íjmu lze získat z praktických zkuš eností (např . z dř ívě jš í studie nebo z akumulace podobné chemikálie) nebo z urč itých empirických vztahůvyuž ívajících znalosti buď rozpustnosti ve vodě, nebo rozdě lovacího koeficientu oktanol-voda pro zkuš ební látku (viz př íloha 3). Fáze př íjmu tvá 28 dnů, není-li prokázáno, že rovnováhy je dosaž eno dř íve. Nedojde-li k rovnovážnému stavu do 28 dnů, měla by být fáze př íjmu prodlouž ena do jeho dosaž ení, př ič emžse provádě jí dalš í mě ř ení, nebo na 60 dnů, podle toho, co nastane dř íve. XIII.1.8.2.2 Délka fáze vylučování Doba odpovídající polovinědélky fáze př íjmu je obvykle dostatečná k tomu, aby doš lo k př imě ř enému (např . 95%) snížení obsahu látky v organismu (vysvětlení odhadu viz př íloha 3). Jestliž e doba nezbytná pro dosaž ení 95% úbytku je neúčelnědlouhá, př ekrač uje např íklad dvakrát normální délku fáze př íjmu (tj. více než56 dnů), můž e být použita kratš í doba (tj. dokud není koncentrace zkuš ební látky menš í než10 % koncentrace v rovnovážném stavu). V př ípadělátek se slož itě jš ím charakterem př íjmu a vyluč ování, nežjaký je popsán modelem ryby s jedním kompartmentem ř ídícím se kinetikou prvního ř ádu, vš ak delš í fáze vyluč ování umožní stanovit rychlostní konstanty úbytku. Délka fáze vš ak může být urč ena dobou, po kterou zůstává koncentrace zkuš ební látky v rybách nad mezí detekce analytické metody. XIII.1.8.2.3 Po čet testovacích ryb Poč et ryb na jednu zkuš ební koncentraci se zvolí tak, aby pro každý odbě r byly k dispozici čtyř i ryby na jeden vzorek. Je-li pož adována vě tš í statická síla, bude na vzorek nezbytných více ryb. Použ ijí-li se pohlavnědospě lé ryby, uvede se, zda byly v experimentu použ ity ryby samič ího nebo samč ího pohlaví (nebo – uvede se pohlaví ryb použ itých v experimentu). V př ípaděpouž ití obou pohlaví společněby mě lo být př ed započ etím expozice prokázáno, ž e rozdíl v obsahu tuku mezi oběma pohlavími není významný; oddě lení samcůa samic může být nezbytné. V kaž dé zkouš ce se vyberou ryby podobné hmotnosti, tak aby hmotnost nejmenš í z nich nebyla niž š í neždvětř etiny hmotnosti největš í ryby. Vš echny by mě ly být stejného stář í a mě ly by pocházet ze stejného zdroje. Vzhledem k tomu, ž e se jeví, ž e stář í a hmotnost ryby mají č asto významný vliv na hodnoty BCF (1), musí být tyto podrobnosti př esnězaznamenány. Doporuč uje se zváž it př ed zkouš kou dílčí vzorek obsádky ryb s cílem odhadnout stř ední hmotnost. XIII.1.8.2.4 Násada Volí se vysoký poměr množ ství vody k množ ství ryb, aby se minimalizovalo sníž ení koncentrace C w způsobené př idáním ryb na zač átku zkouš ky a také proto, aby nedoš lo k poklesu koncentrace rozpuš tě ného kyslíku. Je důležité, aby rychlost nasazování byla př imě ř ená použ itému druh. V kaž dém př ípaděse obvykle doporuč uje rychlost nasazování 0,1 až1,0 g ryb (živá hmotnost) na litr vody za den. Vysoká rychlost nasazování může být zvolena, je-li prokázáno, že pož adovaná koncentrace zkuš ební látky může být udrž ována v mezích ±20 % a že koncentrace rozpuš tě ného kyslíku neklesne pod 60% nasycení. Př i volběrež imu nasazování má být př ihlédnuto k obvyklému př irozenému prostř edí ryb. Např íklad ryby žijící u dna mohou vyžadovat př i stejném obejmu vody vě tš í plochu dna nežpelagické druhy ryb. XIII.1.8.2.5 Krmení Bě hem aklimatizace a po dobu zkouš ky se ryby krmí vhodnou potravou se známým obsahem tuku a celkových bílkovin podávanou v množství dostateč ném
pro udrž ení zdravého stavu a pro udrž ení tě lesné hmotnosti. Ryby se krmí denně v průbě hu aklimatizace a po dobu zkouš ky množstvím př ibližně1 až2 % tě lesné hmotnosti; tím se udrž í v průběhu zkouš ky obsah tuku u vě tš iny druhůryb na relativněkonstantní úrovni. Množ ství krmiva by mělo být např íklad jednou týdně nověpř epoč ítáno, aby byla udrž ena odpovídající tě lesná hmotnost a obsah tuku. Hmotnost ryb v kaž dé nádrž i můž e být pro tento výpočet odhadnuta z hmotnosti ryb naposledy odebraných z dotyč né nádrž e. Ryby, které zůstaly v nádrž i, se neváž í. Nezkrmená potrava a exkrety se odstraňují z nádrž í denněkrátce po krmení (30 minut ažjednu hodinu). Nádrž e se udrž ují v celém průbě hu zkouš ky v co nejvyš š í čistotě, aby byla koncentrace organických látek co nejniž š í, neboť př ítomnost organického uhlíku může snižovat biologickou dostupnost zkuš ební látky (1). Poně vadžmnoho krmiv pochází z rybí moučky, mě lo by být krmivo analyzováno na př ítomnost zkuš ební látky. Je rovně žž ádoucí, aby bylo krmivo analyzováno na př ítomnost pesticidůa tě žkých kovů. XIII.1.8.2.6 Sv ětlo a teplota Fotoperioda je obvykle 12 až16 hodin a teplota (±2 °C) by mě la odpovídat testovacímu druhu (viz př íloha 2). Druh a charakteristiky osvě tlení by měly být známy. Mě la by být vě nována pozornost mož né fototransformaci zkuš ební látky za svě telných podmínek studie. Měly by být použ ito vhodné osvě tlení, aby nedoš lo k expozici ryb fotoproduktům nevyskytujícím se v př írodě . V ně kterých př ípadech může být vhodné použít filtr pro odfiltrování UV zář ení s vlnovou délkou kratš í než290 nm. XIII.1.8.2.7 Zkušební koncentrace Ryby jsou vystaveny za průtokových podmínek alespoňdvěma koncentracím zkuš ební látky ve vodě. Vyš š í (nejvyš š í) koncentrace zkuš ební látky se obvykle volí tak, aby byla na úrovni 1 % její asymptotické hodnoty akutní LC50 a aby byla desetkrát vyš š í nežje mez detekce této látky ve voděpř i použití analytické metody. Nejvyš š í zkuš ební koncentraci lze také stanovit dě lením akutní 96hodinové LC50 př ísluš ným pomě rem akutní/chronická letální dávka (u ně kterých chemikálií můž e koeficient lež et mezi 3 a 100). Je-li to mož né, volí se druhá (dalš í) koncentrace tak, aby se liš ila od výš e uvedené faktorem 10. Není-li to mož né z důvodu kritéria 1 % z LC50 nebo z důvodu kritéria meze detekce, může být použ it niž š í faktor než10 nebo by mělo být zváž eno použ ití zkuš ební látky 14 znač ené C. Žádná koncentrace by nemě la př ekroč it rozpustnost látky. Je-li použito rozpouš těcí č inidlo, nemě la by být jeho koncentrace vyš š í než 0,1 ml/l a mě lo by být stejné ve vš ech zkuš ebních nádrž ích. Jeho př íspěvek, společněs př íspě vkem zkuš ební látky, k celkovému obsahu organického uhlíku ve zkuš ební voděby mě l být znám. Avš ak maximální snaha by mě la být vynalož ena k zamezení použití takovýchto látek . XIII.1.8.2.8 Kontrol y Vedle zkuš ební série by mě la být založ ena kontrola sestávající z ř edicí vody, která popř ípaděobsahuje rozpouš tě cí č inidlo, pokud bylo zjiš těno, ž e toto činidlo nemá ž ádné úč inky na ryby. Není-li tomu tak, mě ly by být založ eny oběkontroly. XIII.1.8.3 Četnost měř ení kvality vody V průbě hu zkouš ky by mě ly být v kaž dé nádrž i mě ř eny množství rozpuš těného kyslíku, TOC, pH a teplota. Celková tvrdost a popř ípaděsalinita by mě ly být měř eny v kontrolách a v jedné nádrž i s vyš š í (nejvyš š í) koncentrací. Množství rozpuš těného kyslíku a popř ípaděsalinita by mě ly být mě ř eny alespoňtř ikrát – na
zač átku, př ibližněuprostř ed a na konci fáze př íjmu – a jednou týdněve fázi vyluč ování. Hodnota TOC by mě la být mě ř ena na zač átku zkouš ky (24 hodin a 48 hodin př ed započetím fáze př íjmu) př ed nasazením ryb a alespoňjednou týdně jak v průběhu fáze př íjmu, tak v průběhu fáze vylučování. Teplota by mě la být měř ena denně , pH na začátku a na konci kaž dé fáze a tvrdost vody jednou v průbě hu zkouš ky. Teplota by mě la být mě ř ena nejlépe nepř etrž itěalespoň v jedné nádrži. XIII.1.8.4 Odbě r vzorkůa analýza ryb a vody XIII.1.8.4.1 Časový rozvrh odebírání vzorkůryb a vody Voda ze zkuš ebních nádrž í se pro stanovení koncentrace zkuš ební látky odebírá př ed nasazením ryb a během fáze př íjmu i bě hem fáze vyluč ování. Voda se odebírá alespoňve stejnou dobu jako ryby a př ed krmením. Bě hem fáze př íjmu se stanovují koncentrace zkuš ební látky, aby se ově ř ilo, že jsou v souladu s kritérii validity. Ryby se odebírají alespoňpětkrát bě hem fáze př íjmu a alespoňč tyř ikrát bě hem fáze vyluč ování. Vzhledem k tomu, ž e v mnoha př ípadech bude obtížné s tímto poč tem vzorkůvypočítat rozumněpř esný odhad hodnoty BCF, zejména jde-li o jinou nežjednoduchou kinetiku prvního ř ádu, můž e být účelné odebírat vzorky v obou fázích č astě ji (viz př íloha 4). Dodateč né vzorky se ulož í a analyzují až poté, co se výsledky prvního kola analýz ukáž í jako nedostateč né pro výpoč et hodnoty BCF o pož adované př esnosti. Př íklad př ijatelného č asového rozvrhu odběru vzorkůje uveden v př íloze 4. Jiné plány lze snadno odvodit pomocí jiné př edpokládané hodnoty P ov, jejížpomocí se vypoč ítá expoziční doba pro 95% př íjem. V odbě ru vzorkůse pokračuje během fáze př íjmu do ustavení rovnováž ného stavu nebo po dobu 28 dnů, podle toho, co nastane dř íve. Není-li rovnovážného stavu dosaž eno do 28 dnů, v odbě ru se vzorkůse pokrač uje do ustavení rovnovážného stavu nebo do 60 dnů, podle toho, co nastane dř íve. Př ed zahájením fáze vyluč ování se ryby př emístí do č istých nádrž í. XIII.1.8.4.2 Odb ěr vzorkůa p ř íprava vzork ů Vzorky vody pro analýzy se odebírají např íklad odsáváním potrubím z inertního materiálu ze stř edu zkuš ební nádrž e. Vzhledem k tomu, ž e se biologicky nedostupná frakce zkuš ební látky nedá často oddělit od biologicky dostupné frakce ani filtrací, ani odstř edě ním (zejména v př ípaděsuperlipofilních chemikálií, tj. chemikálií s log Pov > 5) (1), (5), nemohou být vzorky takto zpracovány. Namísto toho je tř eba učinit opatř ení pro to, aby nádrže byly udrž ovány co nejč istš í, a obsah organického uhlíku by měl být pravidelněmonitorován jak bě hem fáze př íjmu, tak bě hem fáze vyluč ování. Př i kaž dém odbě ru se z nádrž í odebere vhodný poč et ryb (obvykle alespoňč tyř i). Odebrané ryby se rychle omyjí pod tekoucí vodu, osuš í se „do sucha“, ihned se usmrtí nejvhodnějš í humánní metodou a zváž í se. Ryby a voda se pokud mož no analyzují ihned po odbě ru s cílem př edejít degradaci nebo ztrátám a vypoč ítat př ibližné rychlosti př íjmu a vyluč ování ješ těv průbě hu zkouš ky. Okamž itá analýza rovněžzabrání zpož dě ní ve stanovení plató př i jeho dosaž ení. Nedojde-li k okamž ité analýze, vzorky se vhodným způsobem uchovají. Př ed zahájením studie je tř eba zjistit informace o ř ádné metoděuchovávání vzorků s ohledem na dotyčnou zkuš ební látku – např íklad hluboké zmrazení, udrž ování př i 4 °C, délka uchovávání, vyluhování atd. XIII.1.8.4.3 Kvalita anal ytické metody
Vzhledem k tomu, ž e celý postup je urč en hlavněsprávností, př esností a citlivostí analytické metody použité pro analýzu zkuš ební látky, je tř eba experimentálně kontrolovat, ž e př esnost a reprodukovatelnost chemické analýzy a rovněžvýtě ž ek zkuš ební látky jak z vody, tak ze vzorůryb jsou pro dotyč nou analytickou metodu dostateč né. Kontroluje se také, zda se zkuš ební látka nevyskytuje v použité ř edicí vodě . Hodnoty Cw a C f se podle potř eby korigují podle výtě žku a pozaďových hodnot kontrol. Vzorky ryb a vody se zpracovávají tak, aby se minimalizovala kontaminace a ztráty (např . v důsledku absorpce odběrovým zař ízením). XIII.1.8.4.4 Anal ýza vzorkůryb Je-li ve zkouš ce použ it materiál znač ený radioizotopy, je možné provést analýzu s celkovou aktivitou (tj. s výchozí látkou i s metabolity) nebo lze provést separaci, tak aby mohla být výchozí látka analyzována samostatně . V rovnovážném stavu nebo na konci fáze př íjmu, podle toho, k čemu dojde dř íve, mohou být stanoveny také hlavní metabolity. Je-li hodnota BCF vypoč tená z celkové aktivity reziduí ≥1 000 %, můž e být účelné, a pro urč ité kategorie chemikálií, např . pesticidy, je to důraznědoporučeno, identifikovat a kvantifikovat produkty odbourávání př edstavující ≥10 % celkového množ ství reziduí v tkáních ryb v rovnováž ném stavu. Jsou-li produkty odbourávání př edstavující ≥10 % celkové aktivity reziduí identifikovány a kvantifikovány, doporuč uje se také identifikovat a kvantifikovat produkty odbourávání ve vodě . Koncentrace zkuš ební látky by mě la být obvykle stanovena pro kaž dou jednotlivou zváženou rybu. Není-li to možné, mohou být vzorky př i kaž dém odbě ru sdruž ovány, avš ak sdruž ování omezuje statistické postupy, které lze na data aplikovat. Pokud na specifickém statistickém postupu a na síle zálež í, mě l by být ve zkouš ce nasazen dostatečný počet ryb vyhovující požadovanému sdruž ování a pož adované síle (6), (7). Hodnota BCF by mě la být vyjádř ena jako funkce celkové ž ivé hmotnosti a v př ípadělipofilních látek také jako funkce obsahu tuku. Obsah tuku v rybách se stanoví pokud možno př i kaž dém odběru. Pro stanovení obsahu tuku by mě la být použ ita vhodná metoda (odkazy 8 a 2 v př íloze 3). Jako standardní metoda může být doporuč ena technika extrakce do chloroformu/methanolu (9). Různé metody nedávají stejné hodnoty (10), je proto důležité uvést podrobnosti o použ ité metodě . Je-li to mož né, měla by být analýza tuků provedena na extraktu př ipravenému pro analýzu zkuš ební látky, neboťtuky musí být č asto př ed chromatografickou analýzou odstraně ny. Obsah tuku v rybách (v mg/kg ž ivé hmotnosti) na konci experimentu by se nemě l liš it od obsahu na poč átku od více než±25 %. Měl by být uveden také podíl pevných látek v tkáních, aby bylo možné provést př epoč et koncentrace tukůz živé hmotnosti na hmotnost suš iny. XIII.2 DATA XIII.2.1 Zpracování výsledků Kř ivka př íjmu zkuš ební látky se sestrojí vynesením její koncentrace v rybách nebo na nich (nebo ve specifikovaných tkáních) v průbě hu fáze př íjmu proti č asu v lineárním měř ítku. Dosáhla-li kř ivka plató, tj. zač íná být rovnobě žná s č asovou osou, vypoč ítá se hodnota BCFss v rovnováž ném stavu z pomě ru Cf v rovnovážném stavu (stř ední hodnota) Cw v rovnováž ném stavu (stř ední hodnota) Není-li rovnováž ného stavu dosaž eno, je mož né vypoč ítat hodnotu BCFss s dostateč nou př esností pro posouzení rizika z „rovnovážného stavu v 80%
XIII.2.2
XIII.3 XIII.3.1
XIII.3.2
XIII.3.3
(1,6/k2) nebo 95% (3,0/k 2) rovnováze. Také koncentrač ní faktor BCFk se stanoví jako poměr dvou rychlostních konstant prvního ř ádu k 1/k2. Rychlostní konstanta vyluč ování se obvykle stanoví z kř ivky vyluč ování (tj. grafu poklesu koncentrace zkuš ební látky v rybách v č ase). Rychlostní konstanta př íjmu se poté vypoč te pomocí hodnoty k2 a hodnoty Cf odvozené z kř ivky př íjmu (viz také př íloha 5). Upř ednostňovanou metodou pro získání hodnoty BCFk a rychlostních konstant k1 a k2 je metoda nelineárního odhadu parametrůs využ itím poč ítač e (11). K výpoč tu hodnot k1 a k2 lze jinak použ ít grafické metody. Není-li zjevněkř ivka vyluč ování kř ivkou prvního ř ádu, mě ly by být použity složitě jš í modely (viz odkazy v př íloze 3) a mě l by být konzultován biostatistik. Interpretace výsledků Výsledky by mě ly být interpretovány opatrněv př ípadě ,ž e naměř ené koncentrace zkuš ebních roztokůse pohybují na úrovních blízkých mezi detekce analytické metody. Jasněvymezené kř ivky př íjmu a úbytku jsou ukazatelem dobré kvality dat o bioakumulaci. Rozdíl konstant př íjmu/vyluč ování pro dvězkuš ební koncentrace by mě l být nižš í než 20 %. Pozorované významné rozdíly v rychlostech př íjmu/vyluč ování mezi dvě ma použ itými zkuš ebními koncentracemi by měly být zaznamenány a mě lo by být uvedeno jejich mož né vysvětlení. Interval spolehlivosti hodnot BCF u dobř e navrž ených studií se vš eobecněblíží ±20 %. ZPRÁVY Protokol o zkouš ce musí obsahovat následující informace: Zkuš ební látka — fyzikální povaha a popř ípaděfyzikálně-chemické vlastnosti, — chemické identifikační údaje (vč etněobsahu organického uhlíku, je-li to tř eba), — v př ípaděznačení radioaktivními izotopy jejich př esná poloha a aktivita př íměsí, vyjádř ená v procentech. Testovací druh — vě decký název, kmen, zdroj, př ípadné př edbě ž né oš etř ení, aklimatizace, stář í, rozpě tí velikostí atd. Zkuš ební podmínky — použ itý zkuš ební postup (např . průtokový nebo semistatický), — typ a charakteristiky použitého osvě tlení a fotoperioda (fotoperiody), — uspoř ádání zkouš ky (např . poč et a velikost zkuš ebních nádrž í, rychlost výmě ny objemu vody, poč et opakování, počet ryb v jednom opakování, poč et zkuš eních koncentrací, délka fází př íjmu a vyluč ování, č etnost odbě ru vzorkůryb a vzorkůvody), — metoda př ípravy zásobních roztokůa č astost jejich obnovování (je-li použ ito rozpouš těcí č inidlo,musí být uvedena jeho koncentrace a jeho př íspě vek k obsahu organického uhlíku ve vodě), — nominální zkuš ební koncentrace, stř ední hodnoty namě ř ených koncentrací ve zkuš ebních nádržích, jejich směrodatné odchylky a metody jejich stanovení, — zdroj ř edicí vody, popis jakékoliv př edchozí úpravy, výsledky jakéhokoliv prokazování schopnosti zkuš ebních ryb ž ít v této voděa charakteristiky vody: hodnota pH, tvrdost, teplota, koncentrace rozpuš tě ného kyslíku, úroveňzbytkového chloru (je-li měř ena), obsah celkového organického uhlíku, obsah suspendovaných látek, (popř ípadě )
XIII.3.4
XIII.4
salinita zkuš ebního média a výsledky jakýchkoliv jiných provedených mě ř ení, — kvalita vody ve zkuš ebních nádrž ích, hodnota pH, tvrdost vody, obsah TOC, teplota a koncentrace rozpuš tě ného kyslíku, — podrobné informace o krmení (např íklad typ krmiva, zdroj, složení – alespoňpokud možno obsah tuku a bílkovin, podávané množ ství a č etnost), — informace o zpracování vzorků ryb a vody, vč etně podrobností o př ípravě , uchovávání, o extrakci a analytických postupech (a př esnosti), pokud jde o zkuš ební látku a obsah tuku (je-li měř en). Výsledky — výsledky jakýchkoliv provedených př edbě ž ných studií, — úhyn kontrolních ryb a ryb v kaž dé expozič ní nádrž i a jakékoliv pozorované neobvyklé chování, — obsah tuku v rybách (je-li stanoven př i zkouš ce), — kř ivky (vč etněvš ech namě ř ených dat) př íjmu a vyluč ování zkuš ební chemikálie rybami, doba dosažení rovnováž ného stavu, — hodnoty Cf a Cw (popř ípaděse směrodatnými odchylkami a rozpě tím) pro vš echny odbě ry (hodnota Cf se vyjadř uje v µg/g ž ivé hmotnosti (ppm) celého tě la nebo specifikované tkáně , např . tuku, a C w se vyjadř uje v µg/ml (ppm)); hodnoty Cw pro kontroly (mě ly by být uvedeny také hodnoty pozadí), — bioakumulač ní faktor v rovnováž ném stavu (BCFss ) a/nebo kinetický koncentrač ní faktor (BCFk) a popř ípadě95% intervaly spolehlivosti pro rychlostní konstanty př íjmu a vyluč ování (úbytku) (vš e vztaženo na celý organismus a na celkový obsah tuku v rybě, je-li stanoven, nebo na její specifikovanou tkáň), intervaly spolehlivosti a smě rodatné odchylky (jsou-li k dispozici) a metody výpoč tu/analýzy dat pro kaž dou použ itou koncentraci zkuš ební látky, — v př ípaděpouž ití látek značených radioaktivními izotopy a je-li to nutné, musí být uvedena akumulace jakýchkoliv detekovaných metabolitů, — vš echny zvláš tnosti zkouš ky, vš echny odchylky od těchto postupůa ostatní relevantní informace. Vš em výsledkům typu „nedetekováno př i uvedené mezi detekce“ by mě lo být př edcházeno př edbě ž ným odzkouš ením metod a uspoř ádání experimentu, neboť takové výsledky nelze použ ít pro výpoč et rychlostních konstant. LITERATURA (1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117-156. (2) Bintein S., Devillers J., Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29-390. (3) OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3. (4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.
US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994. US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975. US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human or animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711. Compaan H. (1980) in „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation“, Ch. 2.3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands. Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099-1105. Randall R. C., Lee H., Ozretich R. J., Lake J. L., Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp 1431-1436. CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method - Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen, N. Nyholm. ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.
(5)
(6) (7)
(8)
(9) (10)
(11)
(12)
PŘÍLOHA 1 Chemické charakteristiky př ijatelné ř edicí vody 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Látka Nerozpuš těné látky Celkový obsah organického uhlíku Neionizovaný amoniak Zbytkový chlor Celkové organofosforové pesticidy Celkové organochlorové pesticidy a polychlorované bifenyly Celkový organický chlor Hliník Arsen Chrom Kobalt Měď Železo Olovo Nikl Zinek Kadmium Rtuť Stř íbro
Koncentrační limit 5 mg/l 2 mg/l 1 µg/l 10 µg/l 50 ng/l 50 ng/l 25 ng/l 1 µg/l 1 µg/l 1 µg/l 1 µg/l 1 µg/l 1 µg/l 1 µg/l 1 µg/l 1 µg/l 100 ng/l 100 ng/l 100 ng/l
PŘÍLOHA 2 Doporučené druhy ryb pro zkouš ení Doporuč ený druh
1
1
Danio rerio (Teleostei, Cyprinidae)
Doporuč ené rozpě tí zkuš ební teploty (°C) 20 - 25
Doporučená celková délka těla testovacích jedinců (cm) 3,0 ± 0,5
(Hamilton-Buchanan), danio pruhované Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) 20 - 25 (Rafinesque), stř evle 3 Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) 20 - 25 (Linnaeus), kapr obecný 4 Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) 20 - 25 (Temminck and Schlegel), halančík japonský 5 Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) 20 - 25 (Peters), ž ivorodka duhová 6 Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) 20 - 25 (Rafinesque), slunečnice 7 Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) 13 - 17 (Walbaum), pstruh duhový 8 Gasterosteus aculeatus (Teleostei Gasterosteidae) 18 - 20 (Linnaeus), koljuš ka tř íostná 1 Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B., Vol. 252, p. 231. 2
5,0 ± 2,0 5,0 ± 3,0 4,0 ± 1,0 3,0 ± 1,0 5,0 ± 2,0 8,0 ± 4,0 3,0 ± 1,0
V různých zemích byly použ ity různé druhy estuarinních a moř ských druhů, např íklad: ryba z čeledi Scienidae (Smuhovití) halanč ík ryba z čeledi Argentinidae (Stř íbronicovití) ryba z čeledi Enbiotocidae (Př íbojkovití) platýz z čeledi Pleuronectidae vranka z č eledi Cottidae koljuš ka tř íostná moř čák z č eledi Moronidae ouklej obecná
Leiostomus xanthurus Cyprinodon variegatus Menidia beryllina Cymatogaster aggregata Parophrys vertulus Leptocottus armatus Gasterosteus aculeeatus Dicentracus labrax Alburnus alburnus
Dostupnost ryb Sladkovodní ryby uvedené v seznamu se snadno chovají a/nebo jsou dobř e dostupné po celý rok, zatímco dostupnost moř ských nebo estuarijních ryb je omezena na určité země . Lze je množ it a chovat buďv rybích farmách, nebo v laboratoř i za kontrolovaných zdravotních a parazitologických podmínek tak, aby ryby byly zdravé a byly známého původu. Tyto ryby jsou dostupné v mnoha částech svě ta.
1.
PŘÍLOHA 3 Předpověďdélky fáze př íjmu a fáze vyluč ování Př edpověďdélky fáze př íjmu Př ed provedením zkouš ky lze získat odhad hodnoty k 2 a odtud lze získat dobu nezbytnou pro dosaž ení urč itého stupněrovnováž ného stavu (v procentech) z empirických vztahůmezi k 2 a rozdělovacím koeficientem n-oktanol/voda (Pov) nebo mezi k2 a rozpustností ve vodě(s). Odhad hodnoty k2 (den–1 ) lze získat např íklad z následujícího empirického vztahu (1): log10k2 = – 0,414 log10 (Pov) + 1,47 (r2 = 0,95) (1) Dalš í vztahy viz odkaz 2. Není-li rozdělovací koeficient (Pov) znám, lze jej odhadnout (3) ze znalosti rozpustnosti látky ve vodě(s) pomocí vztahu: log10(P ov) = 0,862 log10(s) + 0,710 (r2 = 0,994) (2) kde s = rozpustnost (v mol/l): (n = 36).
2.
Tyto vztahy platí pouze pro chemikálie s hodnotou log Pov od 2 do 6,5 (4). Dobu, za kterou dojde k dosaž ení urč itého stupněrovnováž ného stavu vyjádř eného v procentech, lze získat pomocí odhadu hodnoty k2, z obecné rovnice kinetiky popisující př íjem a vylučování (kinetika prvního ř ádu): dC f k 1 Cw k2 Cf dt nebo je-li C w konstanta: k k t Cf 1 C w (1 e 2 ) (3) k2 Blíž í-li se rovnovážný stav (t→∞), můž e být rovnice 3 zjednoduš ena (5), (6) na k1 Cf C w nebo Cf/Cw = k1/k 2 = BCF k2 Pak k1/k2·Cw př iblíž ením koncentrace v rybách v „rovnováž ném stavu“ (Cf,s). Rovnice 3 může být př epsána na rovnici: Cf Cf Cf,s (1 e k 2 t ) nebo 1 e k 2 t (4) C fs Použ itím rovnice 4 lze př edpově dě t dobu potř ebnou k dosažení urč itého stupně rovnovážného stavu vyjádř eného v procentech, je-li hodnota k2 př edem odhadnuta z rovnice 1 nebo 2. Je pravidlem, ž e statisticky optimální délka fáze př íjmu pro získání statisticky př ijatelných dat (BCFk ) je doba nezbytná k tomu, aby kř ivka sestrojená vynesením logaritmu koncentrace zkuš ební látky v rybách proti času v lineárním mě ř ítku dosáhla svého stř edního bodu, popř ípadě1,6k2, neboli 80 % rovnovážného stavu, ale ne více než3,0k2, neboli 95 % rovnováž ného stavu (7). Doba nezbytná pro dosažení 80 % rovnovážného stavu je př i použ ití rovnice 4: 1,6 0,80 1 e k 2 t80 nebo t 80 (5). k2 Podobně95 % rovnovážného stavu je dosaž eno: 3,0 t 95 (6). k2 Např íklad délka fáze př íjmu (up) pro zkuš ební látku s log Pov = 4 je (př i použ ití rovnic 1, 5 a 6): log10k2 = – 0,414·(4) + 1,47 k2 = 0,652 den-1 up (80 %) = 1,6/0,652, tj. 2,45 dnů(59 hodin) nebo up (95 %) = 3,0/0,652, tj. 4,60 dnů(110 hodin). Podobněpro zkuš ební látku s hodnotou s = 10-5 mol/l (log(s) = 5,0) je délka fáze (př i použ ití rovnic 1, 2, 5 a 6): log10(P ov) = 0,862 (–5,0) + 0,710 = 5,02 log10 k2 = – 0,414 (5,02) + 1,47 k2 = 0,246 den-1 up (80 %) = 1,6/0,246, tj. 6,5 dnů(156 hodin) nebo up (95 %) = 3,0/0,246, tj. 12,2 dnů(293 hodin). Rovnice teq = 6,54 × 10-3 Pov + 55,31 (hodin) může být eventuelněpoužita pro výpoč et doby potř ebné pro dosažení efektivního rovnovážného stavu (4). Př edpověďdélky fáze vyluč ování
Př edpově ďdoby nezbytné pro snížení obsahu látky v organismu na urč itou procentuální úroveňpoč áteční koncentrace může být rovněžzískána z obecné rovnice kinetiky popisující př íjem a vyluč ování (kinetika prvního ř ádu) (1), (8): V př ípaděfáze vyluč ování se Cw př edpokládá rovna nule. Rovnice může být zjednoduš ena na rovnici: dC f k 1 Cw nebo C f C f,0 e k 2 t dt kde Ct,0 je koncentrace na počátku fáze vyluč ování. 50% vylouč ení bude dosaženo vč ase (t 50): Cf 1 0,693 e k 2 t nebo t 50 Ct,0 2 k2 Podobně95% vyloučení bude dosaž eno v č ase 3,0 t 95 k2 Je-li pro první fázi zvoleno dosaž ení 80% př íjmu (1,6/k2) a pro fázi vyluč ování je zvoleno dosaž ení 95% úbytku (3,0/k2 ), je délka fáze vylučování př ibližně dvojnásobkem délky fáze př íjmu. Je vš ak důlež ité poznamenat, ž e odhady jsou založ eny na př edpokladu, ž e se př íjem a vyluč ování ř ídí kinetikou prvního ř ádu. Neř ídí-li se zjevněkinetikou prvního ř ádu, měl by být použit složitějš í model (např . odkaz (1)). Literatura (k př íloze 3) (1) Spacie A., Hamelink J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, pp. 309-320. (2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute. (3) Chiou C. T., Schmedding D. W. (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp. 4-10. (4) Hawker D. W., Connell D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp. 701-707. (5) Branson D. R., Blau G. E., Alexander H. C., Neely W. B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp. 785-792. (6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W., Bourdeau P. H. Part 4.4, pp. 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd N.Y. (7) Reilly P. M., Bajramovic R., Blau G. E., Branson D. R., Sauerhoff M. W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kisnetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp. 614-622. (8) Könemann H., Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp. 3-19.
PŘÍLOHA 4 Teoretický příklad plánu odbě ru vzorkůpro bioakumulač ní zkouš ky látek s logPov = 4 Odběr vzorkůryb
Plán dob odbě ru vzorků Dodatečný odbě r vzorků
1.
Minimální požadovaná č etnost (dny) –1 0 0,3
2.
0,6
0,9
3.
1,2
1,7
4.
2,4
3,3
5. Fáze vyluč ování
4,7
6.
5,0
5,3
7.
5,9
7,0
8.
9,3
11,2
9.
14,0
17,5
Fáze př íjmu
0,4
Počet vzorkůvody
Počet ryb na vzorek
2(* ) 2 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2
Přídavek 45 až80 ryb 4 (4) 4 (4) 4 (4) 4 (4) 6 Přenesení ryb do vody neobsahující zkuš ební chemikálii 4 (4) 4 (4) 4 (4) 6 (4)
*
( ) Odběr vzorku vody po dodání alespoňtř í „objemůnádrže“. Hodnoty v závorkách jsou poč ty vzorků(vody, ryb), které mají být odebrány, je provádě n dodatečný odběr. -1 Poznámka: Př edběž ný odhad k 2 pro logP ov rovný 4,0 je 0,652 den . Celková délka experimentu je stanovena na 3 × up = 3 × 4,6 dnů, tj. 14 dnů. Odhad hodnoty „up“ viz př íloha 3.
PŘÍLOHA 5 Omezení modelu U vě tš iny bioakumulačních dat se př edpokládá, že jsou „rozumně “ dobř e popsány jednoduchým modelem se dvěma kompartmenty/dvě ma parametry, jak je patrné z př ímky, která aproximuje body pro koncentrace v rybách bě hem fáze vylučování, je-li vynesena na semilogaritmickém papíru. (Nelze-li tyto body popsat př ímkou, mě l by být použ it složitějš í model (viz např íklad Spacie a Hamelik, odkaz 1 v př íloze 3). Grafická metoda stanovení rychlostní konstanty vyluč ování (úbytku) k2 Koncentrace zkuš ební látky nalezená v kaž dém vzorku ryb se vynese na semi-logaritmickém papíru proti č asu odbě ru vzorků. Smě rnice této př ímky je rovna k2 . ln(C f1/C f2 ) k2 t 2 t 1
100 Cf2
10
Cf1 1
t1
t2
t
Je tř eba si vš imnout, ž e odchylky od př ímky mohou znamenat složitějš í model vyluč ování, nežje kinetika prvního ř ádu. Pro analýzu typůvyluč ování, které se odchylují od kinetiky prvního ř ádu, mohou být použ ity grafické metody. Grafická metoda stanovení rychlostní konstanty př íjmu k1 Př i dané konstantěk2 se k1 vypoč te následujícím způsobem: Cf k 2 k1 (1) k t C w x (1 e 2 ) Hodnota C f se odeč te ze stř edního bodu hladké kř ivky př íjmu vytvoř ené vynesením logaritmu koncentrace proti č asu (v lineárním mě ř ítku). Metoda výpočtu rychlostních konstant příjmu a vyluč ování (úbytku) s využ itím počítač e Upř ednostňovanou metodou pro získání hodnoty bioakumulač ního faktoru a rychlostních konstant k1 a k2 je metoda nelineárního odhadu parametrůs využ itím poč ítač e. Tě mito programy se naleznou hodnoty k 1 a k2 založ ené na saděpo sobějdoucích dat koncentrací a na modelu: k k t Cf Cw 1 x (1 e 2 ) 0 < t < tc (2) k2 k -k (t t ) k t Cf Cw 1 x (e 2 c e 2 ) t < t c (3) k2 kde t c = čas konce fáze př íjmu. Tento př ístup poskytuje odhady smě rodatné odchylky k 1 a k2. Vzhledem k tomu, že ve větš iněpř ípadůlze odhadnout k2 z kř ivky vyluč ování s relativně vysokou př esností a vzhledem k tomu, ž e mezi těmito dvě ma parametry k1 a k 2 existuje silná korelace, jsou-li odhadovány souč asně , můž e být úč elné nejdř íve vypoč ítat k2 pouze z dat vyluč ování a následněvypoč ítat k 1 z dat př íjmu pomocí nelineární regrese. XIV. METODA PRO STANOVENÍ RŮSTU NA NEDOSPĚLÝCH RYBÁCH – metoda C.14 podle př ílohy směrnice Komise 2001/59/ES ze dne 6. srpna 2001, kterou se po dvacáté osmé př izpůsobuje technickému pokroku smě rnice Rady 67/548/EHS o
sbližování správních a právních púředpúsůtýkajících se klasifikace, balení a označ ování nebezpeč ných látek (dále jen „smě rnice 2001/59/ES“) XIV.1
XIV.1.1
XIV.1.2
XIV.1.3
XIV.1.4
METODA Metoda růstové zkouš ky pro stanovení toxicity je replikou metody OECD TG 215 (2000). ÚVOD Zkouš ka je urč ena k posouzení úč inkůdlouhodobé expozice chemickým látkám na růst nedospě lých ryb. Je založena na metoděpro posouzení úč inkůchemických látek na růst nedospělého pstruha duhového (Oncorynchus mykiss) př i průtokových podmínkách, která byla vyvinuta v Evropské unii a testována v okruž ních testech (1, 3). Mohou být použity také jiné dobř e popsané druhy. Byly např íklad získány zkuš enosti z růstových zkouš ek s daniem pruhovaným (Danio rerio) (2, 4, 5) a halančíkem japonským (Oryzias latipes) (6, 7, 8). Viz také obecný úvod, č ást C. DEFINICE Nejniž š í koncentrace s pozorovanými úč inky (Lowest observed effect concentration, LOEC): je nejniž š í zkouš ená koncentrace zkouš ené látky, př i níž jsou u látky pozorovány významné úč inky ve srovnání s kontrolou (na úrovni pravdě podobnosti faleš něpozitivního hodnocení p < 0,05). Vš echny zkouš ené koncentrace vyš š í nežLOEC musí mít stejné nebo váž nějš íš kodlivé úč inky, než úč inky pozorované př i koncentraci LOEC. NOEC (no observed effect concentration, koncentrace bez pozorovaných úč inků): je zkuš ební koncentrace bezprostř edněnižš í nežLOEC. ECx: je pro tuto metodu koncentrace zkouš ené látky, která vyvolává x% změ nu rychlosti růstu ryb ve srovnání s kontrolami. Velikost násady: je ž ivá hmotnost ryb v jednotce objemu vody. Hustota obsádky: je poč et ryb v jednotce objemu vody. Individuální specifická rychlost růstu ryby: vyjadř uje rychlost růstu jedince vycházející z jeho výchozí hmotnosti. Průměrná specifická rychlost růstu pro nádrž : vyjadř uje stř ední rychlost růstu populace v nádrž i př i urč ité koncentraci. Pseudospecifická rychlost růstu: vyjadř uje rychlost růstu jednotlivce vycházející ze stř ední poč áteč ní hmotnosti populace v nádrži. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY Nedospě lé ryby v exponenciální fázi růstu se po zváž ení umístí do zkuš ebních nádrží a vystaví se ř aděsubletálních koncentrací zkouš ené látky nejlépe za průtokových podmínek, nebo, pokud mož no za vhodných semistatických podmínek (statické podmínky s obnovením média). Zkouš ka trvá 28 dnů. Ryby se krmí denně . Př ísun potravy se ř ídí počáteč ní hmotností ryb a můž e být po 14 dnech nověvypoč ten. Na konci zkouš ky se ryby opě t zváž í. Účinky na rychlost růstu se analyzují pomocí regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která vyvolává x% změ nu rychlosti růstu, tj. EC x (např . EC10, EC20 nebo EC30). Data mohou být popř ípaděporovnána s hodnotami pro kontrolní skupiny s cílem stanovit nejniž š í koncentraci s pozorovanými účinky (LOEC) a tím i koncentraci bez pozorovaných úč inků(NOEC). INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE Výsledky zkouš ky akutní toxicity (viz zkuš ební metoda C.1) provedené nejlépe na druhu zvolenému pro tuto zkouš ku jižmusí být př edlož eny. To znamená, že jsou známy rozpustnost zkouš ené látky ve voděa tlak jejích par a je k dispozici
vhodná analytická metoda pro kvantitativní stanovení látky ve zkuš ebních roztocích, a to se známou a dolož enou správností a známou mezí stanovitelnosti. Už iteč nými informacemi jsou strukturní vzorec, čistota látky, její stálost ve voděa na svě tle, pK a, Po/v a výsledky zkouš ky snadné biologické rozlož itelnosti (viz zkuš ební metoda C.4). XIV.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY Má-li být zkouš ka platná, musí být splně ny následující podmínky: — mortalita v kontrolních zkouš kách nesmí být na konci zkouš ky vě tš í než 10 %, — nárůst stř ední hodnoty hmotnosti ryb v kontrolní skupině(skupinách) musí být dostateč ný na to, aby umož nil rozeznat minimální významnou změ nu rychlosti růstu. Okružní test (3) ukázal, že u pstruha duhového musí stř ední hmotnost ryb v kontrolních skupinách vzrůst alespoňo polovinu (tj. o 50 %) jejich poč áteč ní hmotnosti za 28 dnů; např . poč áteč ní hmotnost: 1 g/rybu (= 100 %), koneč ná hmotnost po 28 dnech: 1,5 g/rybu (150 %), — koncentrace rozpuš tě ného kyslíku musí dosahovat alespoň60 % hodnoty nasycení vzduchem (ASV) po celou dobu zkouš ky, — teplota vody se po celou dobu zkouš ky nesmí mezi zkuš ebními nádrž emi liš it o více než± 1 °C a mě la by být udržována v rozpě tí 2 °C v rozsahu teplot stanovených pro zkuš ební druh (dodatek 1). XIV.1.6 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY XIV.1.6.1 Př ístroje a pomůcky Normální laboratorní vybavení a zejména: a) oxymetr a pH metr; b) vybavení pro stanovení tvrdosti vody a alkality; c) vhodné zař ízení pro regulaci teploty a pro její pokud mož no nepř etrž ité sledování; d) nádrž e z chemicky inertního materiálu o vhodném objemu vzhledem k doporučenému nasazování a obsádce (viz bod 1.8.5 a dodatek 1); e) vhodné př esné váhy (tj. vážící s př esností na ± 0,5 %). XIV.1.6.2 Voda Jako zkuš ební voda můž e být použ ita jakákoli voda, v nížzkuš ební druh dlouhodoběpř ež ívá a roste. Mě la by mít po celou dobu zkouš ky stejnou kvalitu. Hodnota pH vody by mě la být v rozmezí 6,5 až8,5, avš ak během zkouš ky by se pH nemělo liš it o více než ± 0,5. Doporuč uje se tvrdost nad 140 mg/l (jako CaCO3). S cílem zajistit, aby ř edicí voda nemě la nadmě rný vliv na výsledek zkouš ky (např íklad v důsledku tvorby komplexůzkuš ební látky), by měly být v urč itých intervalech odebírány vzorky k analýze. Je-li kvalita ř edicí vody relativněkonstantní, mělo by být stanovení tě ž kých kovů(např . Cu, Pb, Zn, Hg, Cd a Ni), hlavních aniontůa kationtů(např . Ca, Mg, Na, K, Cl a SO 4), pesticidů (např . celkový obsah organických fosforových a chlorových pesticidů), celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek provedeno např . každé tř i měsíce. Je-li prokázáno, ž e kvalita vody je konstantní po dobu alespoňjednoho roku, mohou být stanovení méněčastá a intervaly lze prodlouž it (např . každých š est mě síců). Ně které chemické charakteristiky př ijatelné ř edicí vody jsou uvedeny v dodatku 2. XIV.1.6.3 Zkuš ební roztoky Zkuš ební roztoky o zvolených koncentracích se př ipraví ř edě ním zásobního roztoku.
Zásobní roztok by měl být př ipraven nejlépe jednoduchým mechanickým mícháním nebo protř epáváním zkouš ené látky v ř edicí vodě(např . mechanickým mícháním nebo sonifikací). Pro dosažení vhodné koncentrace zásobního roztoku mohou být použ ity saturační kolony. V ně kterých př ípadech můž e být pro vytvoř ení zásobního roztoku o vhodné koncentraci nezbytné použ ití rozpouš tě del nebo dispergátorů(solubilizač ních č inidel). Ke vhodným rozpouš tědlům patř í aceton, ethanol, methanol, dimethylsulfoxid, dimethylformamid a triethylenglykol. Ke vhodným dispergátorům patř í Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% methylcelulosa a HCO40. Snadno biologicky rozlož itelná č inidla (např . aceton) nebo vysoce tě kavé slouč eniny je tř eba používat rozvážně , neboťmohou způsobit problémy s růstem bakterií v průtokových zkouš kách. Je-li použ ito solubilizač ní činidlo, nesmí mít významné účinky na růst ryb ani viditelné nepř íznivé úč inky na nedospě lé ryby, cožmusí být prokázáno na kontrolní skupiněvystavené pouze rozpouš tě dlu. Př i průtokových zkouš kách je pro zajiš tě ní ř ady koncentrací nezbytný systém, který nepř etrž itědávkuje a ř edí zásobní roztok zkouš ené látky (např . dávkovací č erpadlo, zař ízení pro proporcionální ř edě ní, saturač ní systém). Průtok zásobních roztokůa ř edicí vody by měl být v průbě hu zkouš ky kontrolován v urč itých intervalech, nejlépe denně , a neměl by se v průbě hu zkouš ky měnit o více než 10 %. Okruž ní test (3) ukázal, ž e u pstruha duhového je př ijatelná výmě na vody 6 litrůna gram ryb za den (viz bod 1.8.2.2). U semistatických zkouš ek (s obnovením média) bude č astost obnovování média záviset na stálosti zkouš ené látky, avš ak doporuč uje se obnovovat vodu denně . Není-li podle př edbě žných zkouš ek stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkouš ené látky mezi obnoveními média stálá, (tj. nepohybuje se v intervalu 80 – 120 % nominální koncentrace nebo klesá pod 80 % namě ř ené poč áteč ní koncentrace), měla by být zvážena průtoková zkouš ka. XIV.1.6.4 Výběr druhů Pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss) je doporuč eným druhem pro tuto zkouš ku, neboťu něj bylo v okruž ních testech získáno nejvíce zkuš eností (1, 3). Mohou vš ak být použity jiné dobř e popsané druhy, může vš ak být nutné zkuš ební postup upravit, aby byly vytvoř eny vhodné zkuš ební podmínky. Jsou např íklad zkuš enosti s daniem pruhovaným (Danio rerio) (4, 5) a halanč íkem japonským (Oryzias latipes) (6, 7, 8). V takovém př ípaděby mě ly být uvedeny v závě reč né zprávědůvody pro výbě r druhu a experimentální podmínky. XIV.1.6.5 Chov ryb Testovací ryby by měly pocházet z jednoho chovu (nejlépe ze stejného tř ení), který se alespoňdva týdny př ed zkouš kou udrž uje v podmínkách kvality vody a osvě tlení, které jsou podobné podmínkám použitým ve zkouš ce. V průbě hu chovu a v průběhu zkouš ky by mě ly být krmeny množstvím potravy odpovídajícím minimálně2 % tě lesné hmotnosti za den a nejlépe 4 % tě lesné hmotnosti za den. Po 48hodinové aklimatizaci se zaznamená mortalita a použ ijí se následující kritéria: — mortality vyš š í než10 % populace za sedm dnů: vymě nit celou obsádku; — mortality od 5 % do 10 % populace: aklimatizace dalš ích sedm dnů; je-li mortalita během následujících sedmi dnůvyš š í než5 %, vymě ní se celá obsádka, — mortalita niž š í než5 % populace za sedm dnů: obsádka se př ijme. Dva týdny př ed zkouš kou nebo v průbě hu zkouš ky nesmí být léč eny u ryb ž ádné nemoci.
XIV.1.7
USPOŘÁDÁNÍ ZKOUŠKY „Uspoř ádáním zkouš ky“ se rozumí výbě r poč tu zkuš ebních koncentrací a jejich odstupňování, počet nádrž í pro každou koncentraci a poč et ryb v nádrži. Uspoř ádání by mě lo být v ideálním př ípadězvoleno s ohledem na: a) cíl studie; b) metodu statistické analýzy, která bude použ ita; c) dostupnost a cenu prostř edkůpro experiment. Pož adováno je stanovení statistické významnosti, s jakou má být daná velikost změ ny (např . změny rychlosti růstu) rozeznána, nebo př esnost, s jakou má být odhadnuta hodnota EC x (např . x = 10, 20 nebo 30, pokud možno ne méně než10). Bez toho nelze stanovit př esný rozsah studie. Je důlež ité vzít na vědomí, ž e uspoř ádání, které je optimální př i použití jedné metody statistické analýzy (nejlépe využ ívá prostř edky), není nezbytněoptimální pro jinou metodu. Doporuč ené uspoř ádání pro odhad LOEC/NOEC tedy nebývá stejné jako uspoř ádání pro analýzu regresí. V mnoha př ípadech se regresní analýze dává př ednost př ed analýzou variance, a to z důvodůdiskutovaných Stephanem a Rogersem (9). Není-li vš ak nalezen vhodný 2 regresní model (r < 0,9), mě l by být stanoven pomě r NOEC/LOEC. XIV.1.7.1 Uspoř ádání pro analýzu regresí Pro uspoř ádání zkouš ky, která má být analyzována regresí, jsou důlež ité tyto zř etele: a) koncentrace použité ve zkouš ce musí v každém př ípadě pokrývat koncentraci vyvolávající úč inek (např . EC10,20,30) a rozsah koncentrací, př i nichž dochází ke sledovanému účinku. Př esnost, s jakou mohou být odhadnuty koncentrace vyvolávajících úč inek, bude nejlepš í, bude-li koncentrace vyvolávající úč inek ležet uprostř ed rozsahu zkuš ebních koncentrací. Př i výběru vhodných zkuš ebních koncentrací mohou být užiteč né př edbě ž né orientač ní zkouš ky. b) aby mohl být vytvoř en uspokojivý statistický model, mě la by zkouš ka zahrnovat alespoňjednu kontrolní nádrža pět dalš ích nádrž í o různých koncentracích. Podle vhodnosti by př i použ ití solubilizač ního č inidla mě la být vedle zkuš ebních skupin nasazena jedna kontrolní skupina vystavená koncentraci solubilizač ního č inidla použité př i nejvyš š í zkuš ební koncentraci (viz body 1.8.3 a 1.8.4); c) můž e být použ ita vhodná geometrická nebo logaritmická ř ada koncentrací (10) (viz dodatek 3). Upř ednostňuje se logaritmické stupňování koncentrací; d) je-li k dispozici více nežš est nádrž í, mě ly by být dalš í nádrž e použity buď pro duplicitní stanovení, nebo by měly být použ ity pro koncentrace rozložené v rozsahu koncentrací tak, aby se zmenš ily rozestupy mezi koncentracemi. Oběpouž ití lze doporučit stejnou měrou. XIV.1.7.2 Uspoř ádání pro odhad NOEC/LOEC analýzou variance (ANOVA) Pro kaž dou koncentraci by mě ly být nejlépe k dispozici nádrž e pro duplicitní stanovení, statistická analýza by mě la být provedena pro kaž dou jednotlivou nádrž (11). Bez duplicitních nádrž í není mož né zohlednit jinou variabilitu mezi nádržemi, nežjaká je důsledkem rozdílůmezi jednotlivými rybami. Zkuš enosti ale ukazují (12), že variabilita mezi nádržemi byla velmi malá ve srovnání s variabilitou v rámci nádrž e (tj. mezi rybami). Relativněpř ijatelnou alternativou je tedy provedení statistické analýzy pro jednotlivé ryby. Zpravidla se použije alespoňpě t zkuš ebních koncentrací tvoř ících geometrickou ř adu s faktorem nepř ekrač ujícím 3,2.
Provádí-li se zkouš ka s duplicitními nádržemi, mě l by být poč et duplicitních kontrolních nádrž í, a tedy i poč et ryb, dvojnásobkem počtu ryb pro kaž dou zkouš enou koncentraci, který by mě l být pro vš echny koncentrace stejný (13, 14, 15). Nejsou-li naproti tomu duplicitní nádrže použ ity, mě l by být v kontrolní skupiněstejný poč et ryb jako ve skupiněpro každou zkuš ební koncentraci. Je-li ANOVA založ ena na nádrž ích namísto jednotlivých rybách (což by znamenalo buďryby jednotlivěoznač it nebo použít „pseudospecifickou“ rychlost růstu (viz bod 2.1.2)), je nezbytné poč et nádrž í dostateč něznásobit, aby bylo možné stanovit odchylku pro nádrže v rámci jednotlivé koncentrace. To znamená, ž e by mě l být poč et stupňůvolnosti pro chybu v analýze variance alespoň5 (11). Jsou-li duplicitněpoužity pouze kontroly, existuje nebezpeč í, ž e bude variabilita chyby vychýlena, neboťmůž e narůstat se stř ední hodnotou dotyč né rychlosti růstu. Vzhledem k tomu, ž e rychlost růstu s nejvě tš í pravdě podobností klesá s rostoucí koncentrací, povede to k nadhodnocení variability. XIV.1.8 POSTUP XIV.1.8.1 Výběr a váž ení testovacích ryb Je důlež ité minimalizovat rozdíly v hmotnostech ryb na zač átku zkouš ky. Vhodná rozpětí velikostí ryb různých druhůdoporuč ených pro tuto zkouš ku jsou uvedena v dodatku 1. Rozpě tí individuálních hmotností na začátku zkouš ky by mě lo být pro celou násadu ryb použitých ve zkouš ce nejlépe ± 10 % aritmetického průmě ru hmotností a v ž ádném př ípaděby nemě lo př ekroč it 25 %. Doporuč uje se zváž it př ed zkouš kou menš í vzorek ryb s cílem odhadnout stř ední hodnotu hmotnosti. 24 hodin př ed zahájením zkouš ky se obsádka ryb př estane krmit. Poté se provede náhodný výbě r ryb. Za použití bě ž ného anestetika (např . vodný roztok trikainmethansulfonátu (MS 222) o koncentraci 100 mg/l neutralizovaný př ídavkem dvou dílůhydrogenuhlič itanu sodného na jeden díl MS 222) se ryby jednotlivěs př esností uvedenou v dodatku 1 zváž í za úč elem stanovení ž ivé hmotnosti (po osuš ení do sucha). Ryby s hmotností v pož adovaném rozsahu se náhodněrozdě lí do nádrž í. Zaznamená se celková ž ivá hmotnost ryb v každé zkuš ební nádrž i. Př i manipulaci s rybami za použ ití anestetik (vč etněosuš ení a zváž ení) můž e u nedospě lých ryb, a zejména u druhůo malé velikosti, dojít ke stresu a poraně ní. S nedospě lými rybami se tedy musí manipulovat s nejvyš š í opatrností, aby nedoš lo u zkuš ebních ryb ke stresu a poranění. Ryby se opět zváží po 28 dnech zkouš ky (viz bod 1.8.6). Považ uje-li se vš ak za nezbytné nověvypoč ítat př ísun potravy, mohou být ryby opě t zváž eny po 14 dnech zkouš ky (viz bod 1.8.2.3). Ke stanovení změ n velikosti ryb, na jejichž základě se upravuje př ísun potravy, může být použita jiná metoda, např . fotografická metoda. XIV.1.8.2 Podmínky expozice XIV.1.8.2.1 Délka expozice Zkouš ka trvá více než28 dnů. XIV.1.8.2.2 Velikost násady a hustota obsádky Je důležité, aby velikost násady a hustota obsádky vyhovovaly použitému zkuš ebnímu druhu (viz dodatek 1). Je-li hustota obsádky př ílišvysoká, dojde ke stísnění vedoucímu ke snížené rychlosti růstu a popř ípaděk nemocem. Je-li př ílišnízká, může vyvolat teritoriální chování, cožby mohlo rovně žovlivnit růst. V kaž dém př ípaděby mě la být velikost násady tak nízká, aby bylo možné udrž et koncentraci rozpuš těného kyslíku na alespoň60 % ASV bez provzduš ňování. Okruž ní test (3) ukázal, ž e u pstruha duhového je velikost násady 16 ryb o
hmotnosti 3 – 5 g do objemu 40 litrůpř ijatelná. Doporuč ené obnovování vody bě hem zkouš ky je 6 litrůna gram ryb za den. XIV.1.8.2.3 Krmení Ryby by mě ly být krmeny dostatečným množ stvím vhodného krmiva (dodatek 1), aby byla umožně na př ijatelná rychlost růstu. Je tř eba dbát na to, aby nedoš lo k růstu mikroorganismůa k zakalení vody. U pstruha duhového by mě lo tě mto pož adavkům vyhovovat množ ství odpovídající 4 % jejich tělesné hmotnosti za den (3, 16, 17, 18). Denní množ ství můž e být rozdě leno na dva stejné podíly a podáno rybám dvakrát za den s odstupem alespoňpě ti hodin. Množ ství se ř ídí poč áteč ní hmotností ryb v jednotlivé zkuš ební nádrž i. Ryby se opě t zváž í 14. den a množ ství se nověvypoč te. 24 hodin př ed váž ením se ryby př estanou krmit. Nespotř ebovaná potrava a výkaly se ze zkuš ebních nádrž í kaž dý den odstraní důkladným odsátím ze dna každé nádrže. XIV.1.8.2.4 Svě tlo a teplota Fotoperioda a teplota vody by mě ly vyhovovat zkuš ebním druhům (dodatek 1). XIV.1.8.3 Zkuš ební koncentrace Obvykle je nutných pě t koncentrací zkouš ené látky, a to bez ohledu na uspoř ádání zkouš ky (viz bod 1.7.2). Př i volběvhodných zkuš ebních koncentrací by mě la pomoci př edcházející znalost toxicity zkouš ené látky (např . ze zkouš ek akutní toxicity nebo z orientačních studií). Použije-li se méněnežpět koncentrací, mělo by být uvedeno odůvodnění. Nejvyš š í zkuš ební koncentrace by nemě la př ekroč it rozpustnost látky ve vodě . Použ ije-li se k usnadně ní př ípravy zásobního roztoku solubilizační č inidlo, nemě la by být jeho koneč ná koncentrace vyš š í než0,1 ml/l a mě la by být ve vš ech zkuš ebních nádržích stejná (viz bod 1.6.3). Mě la by vš ak být vynalož ena maximální snaha takové látky nepouž ívat. XIV.1.8.4 Kontrolní skupiny Poč et kontrolních skupin v ř edicí vodězávisí na uspoř ádání zkouš ky (viz body 1.7 až1.7.2). Použ ije-li se solubilizač ní činidlo, mě l by být nasazen stejný poč et kontrolních skupin se solubilizač ním č inidlem jako s ř edicí vodou. XIV.1.8.5 Častost analytických stanovení a mě ření Bě hem zkouš ky se v pravidelných intervalech (viz níž e) stanovují koncentrace zkouš ené látky Př i průtokových zkouš kách se průtok zásobních roztokůtoxické látky a ř edicí vody kontroluje v urč itých intervalech, nejlépe denně , a nemě l by se v průbě hu zkouš ky mě nit o více než10 %. Oč ekávají-li se změ ny koncentrace zkouš ené látky v rozmezí ± 20 % nominálních hodnot (tj. od 80 – 120 %, viz body 1.6.2 a 1.6.3), doporučuje se, aby byly nejniž š í a nejvyš š í zkouš ené koncentrace analyzovány na zač átku zkouš ky a poté v týdenních intervalech. U zkouš ek, u nichžse (na základědat o stálosti látky) nepř edpokládá, že se bude koncentrace zkouš ené látky pohybovat v rozmezí ± 20 % nominální hodnoty, je nezbytné analyzovat vš echny zkuš ební koncentrace, a to stejněč asto jako u stabilních látek. U semistatických zkouš ek (s obnovením média), u nichž se má zkuš ební koncentrace pohybovat v rozmezí ± 20 % nominálních hodnot, se doporuč uje analyzovat nejvyš š í a nejniž š í zkuš ební koncentrace na začátku studie ihned po jejich př ípravěa bezprostř edněpř ed obnovením a poté v týdenních intervalech. U zkouš ek, u nichžse nepř edpokládá, ž e se bude zkuš ební koncentrace pohybovat v rozmezí ± 20 nominální hodnoty, musí být vš echny koncentrace analyzovány stejněč asto jako u stabilnějš ích látek.
Doporuč uje se zakládat výsledky na namě ř ených koncentracích. Lze-li vš ak prokázat, ž e po celou dobu zkouš ky byla koncentrace zkouš ené látky v roztoku uspokojivěudrž ována v rozmezí ±20 % nominální hodnoty, mohou být výsledky založ eny na nominálních nebo namě ř ených hodnotách. Můž e být nezbytné vzorky filtrovat (např . př es filtr velikostí pórů0,45 µm) nebo odstř edit. Doporuč uje se odstř eďování. Filtrace je př ípustná jen neadsorbuje-li se zkouš ená látka na filtry. V průbě hu zkouš ky se měř í v každé zkuš ební nádrži množství rozpuš těného kyslíku, pH a teplota. Celková tvrdost, alkalita a popř ípaděsolnost se mě ř í v kontrolních nádržích a v jedné nádrž i s nejvyš š í koncentrací. Množství rozpuš těného kyslíku a solnost (podle potř eby) se mě ř í alespoňtř ikrát (na zač átku, uprostř ed a na konci zkouš ky). U semistatických zkouš ek se doporučuje mě ř it množství rozpuš tě ného kyslíku č astěji, nejlépe př ed každým obnovením média a po ně m, nebo alespoňjednou týdně . pH se mě ř í na zač átku a na konci každé výmě ny vody u statických zkouš ek a alespoňtýdněu průtokových zkouš ek. Tvrdost vody a alkalita se měř í v každé zkouš ce jednou. Teplota se mě ř í nejlépe nepř etrž itěalespoňv jedné zkuš ební nádrž i. XIV.1.8.6 Pozorování Hmotnost: na konci kaž dé zkouš ky se musí ryby, které př ež ily, zváž it za účelem XIV.stanovení živé hmotnosti (po osuš ení do sucha), a to buďjako skupina pro každou zkuš ební nádrž , nebo jednotlivě . Váž ení ryb jako skupin se upř ednostňuje př ed váž ením jednotlivých ryb, které vyž aduje, aby byly ryby jednotlivě označ eny. V př ípaděvážení jednotlivých ryb pro stanovení individuální specifické rychlosti růstu by neměla zvolená technika označ ení vyvolávat u ryb stres (alternativou ke značení ryb vymražením znač ky může být popř ípaděpouž ití barevného rybář ského vlasce). Ryby se v průběhu zkouš ky vyš etř ují denněa zaznamenávají se jakékoli odchylky (hemoragie, odbarvení) a neobvyklé chování. Každý úhyn se zaznamená a uhynulé ryby se co nejdř íve odstraní. Uhynulé ryby se nenahrazují, neboťvelikost násady a hustota obsádky by mě ly být dostateč né na to, aby nedoš lo k ovlivně ní růstu v důsledku změ n počtu ryb. Bude vš ak nutné upravit množství krmiva. XIV.2 DATA A ZPRÁVY XIV.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ Doporuč uje se, aby se návrhu zkouš ky i analýzy výsledkůzkouš ky účastnil statistik, neboťtato zkuš ební metoda umož ňuje znač né variace v experimentálním uspoř ádání, např íklad v poč tu zkuš ebních nádrž í, v poč tu zkuš ebních koncentrací, v poč tu ryb. Pokud jde o možnosti uspoř ádání zkouš ky, nejsou zde uvedeny ž ádné pokyny. Rychlost růstu se nevypoč ítává pro zkuš ební nádrže, v nichžmortalita př ekročila 10 %. Velikost mortality se ale uvede pro vš echny zkuš ební koncentrace. Bez ohledu na použ itou metodu je hlavním ukazatelem specifická rychlost růstu r od okamžiku t1 do t2 . Můž e být definována ně kolika způsoby v závislosti na tom, zda jsou či nejsou ryby individuálněznač eny nebo zda se pož aduje průměrná hodnota pro nádrž . log w log e w1 r1 e 2 100 t2 t1 log w log e w1 r2 e 2 100 t2 t1
log w log e w1 r3 e 2 100 t 2 t1
kde: r1 = r2 = r3 = w1, w2 loge w1
individuální specifická rychlost růstu ryby průmě rná specifická rychlost růstu pro nádrž „pseudospecifická“ rychlost růstu = hmotnosti urč ité ryby v č ase t1 a t 2 = logaritmus hmotnosti jednotlivé ryby na začátku vyš etř ovacího intervalu loge w2 = logaritmus hmotnosti jednotlivé ryby na konci vyš etř ovacího intervalu loge w1 = průmě r logaritmů hodnot w1 pro ryby v nádrž i na zač átku vyš etř ovacího intervalu loge w2 = průmě r logaritmůhodnot w2 pro ryby v nádrži na konci vyš etř ovacího intervalu t1, t 2 = č as (ve dnech) zač átku a konce vyš etř ovacího intervalu r1, r2, r3 mohou být vypoč teny pro interval 0 – 28 dnůa popř ípadě(bylo-li provedeno mě ř ení 14. den) pro intervaly 0 – 14 a 14 – 28 dnů. XIV.2.1.1 Analýza výsledkůregresí (modelování závislosti koncentrace – odezva) Touto metodou se závislostí mezi specifickou rychlostí růstu a koncentrací proloží vhodná matematická funkce, a to umožní odhadnout „ECx“, tj. jakoukoli pož adovanou hodnotu EC. U této metody není nutný výpočet r pro jednotlivou rybu (r1) a namísto toho se analýza založ í na průmě rné hodnotěr (r2) pro nádrž . Dává se př ednost posledněuvedené metodě. Je také vhodně jš í př i použ ití velmi malých druhů. Průmě rné specifické rychlosti růstu pro nádrž(r2) se graficky vynesou proti koncentraci kvůli kontrole závislosti odezvy. K vyjádř ení závislosti r2 na koncentraci se zvolí vhodný model; jeho volba musí být ř ádnězdůvodněna. Liš í-li se pro jednotlivé nádrž e poč ty ryb, které př ež ily, prokládá se váž ený model s cílem zohlednit různé velikosti skupin. Metoda prolož ení modelu musí umož nit odhadnout např íklad hodnotu EC 20 a stanovit její rozptyl (buďsmě rodatnou odchylku nebo interval spolehlivosti). Graf proloženého modelu se vynese spolu s daty, aby byla zř ejmá vhodnost použ itého modelu (9, 19, 20, 21). XIV.2.1.2 Analýza výsledkůpro stanovení LOEC Bylo-li ve zkouš ce použ ito pro každou koncentraci více nádrž í, můž e být odhad LOEC založen na analýze variance (ANOVA) průmě rné specifické rychlosti růstu pro nádrž(viz bod 2.1) následované vhodným srovnáním průmě rné hodnoty r pro každou koncentraci s průmě rnou hodnotou r pro kontrolní skupiny (např . Dunnettovým nebo Williamsovým testem (13, 14, 15, 22)), aby se zjistila nejmenš í koncentrace, u nížje na úrovni pravděpodobnosti 0,05 rozdíl významný. Nejsou-li př edpoklady pro použití parametrických metod splně ny, kvůli jinému nežnormálnímu rozdělení (např . se použ ije Shapiro-Wilkův test) nebo kvůli heterogennímu rozptylu (Bartlettův test), mě la by být př ed provedením ANOVA zváž ena transformace dat za úč elem homogenizace rozptylůnebo by měla být provedena vážená ANOVA. Není-li pro kaž dou koncentraci poč et nádrž í znásoben, nebude ANOVA u jednotlivé nádrž e citlivá nebo bude nemož ná. V takovém př ípaděje př ijatelným
XIV.2.2
XIV.2.3 XIV.2.3.1
XIV.2.3.2
XIV.2.3.3
XIV.2.3.4
kompromisem založ it ANOVA na „pseudospecifické“ rychlosti růstu r3 nebo na jednotlivých rybách. Průmě rná hodnota r3 pro každou koncentraci můž e být poté porovnána s průmě rnou hodnotou r3 pro kontrolní skupiny. Hodnotu LOEC lze poté nalézt výš e uvedeným způsobem. Je tř eba vzít na vě domí, že tato metoda neumož ňuje zohlednit variabilitu mezi nádrž emi ve větš í míř e, nežs jakou se poč ítá v důsledku variability mezi rybami, a ani př ed ní nechrání. Ukázalo se vš ak (9), ž e variabilita mezi nádrž emi byla ve srovnání s variabilitou v rámci nádrž e (tj. mezi rybami) velmi malá. Nejsou-li v analýze využ ity jednotlivé ryby, musí být ve zprávě uvedena metoda nalezení odlehlých hodnot a její použ ití musí být zdůvodně no. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Výsledky je tř eba interpretovat opatrně , lež í-li namě ř ené hodnoty koncentrací toxické látky v roztocích blízko meze stanovitelnosti analytické metody, nebo klesá-li u semistatických zkouš ek koncentrace zkouš ené látky od okamžiku př ípravy roztoku do jeho obnovení. PROTOKOL O ZKOUŠCE Protokol o zkouš ce musí obsahovat následující informace: Zkouš ená látka — fyzikální stav a relevantní fyzikálně -chemické vlastnosti, — údaje o chemické identitěvč etněúdajůo č istotěa podle potř eby o metodě kvantitativního stanovení zkouš ené látky. Testovací druh — vědecký název, podle možnosti, — kmen, velikost, původ, jakákoli př íprava atd., Zkuš ební podmínky — použitý zkuš ební postup (např . semistatický/s obnovením, průtokový, nasazování, hustota obsádky atd.), — uspoř ádání zkouš ky (např . poč et zkuš ebních nádrž í, zkuš ební koncentrace a znásobení počtu nádrží, poč et ryb v nádrži), — metoda př ípravy zásobních roztokůa č astost obnovování (je-li použ ito, uvede se solubilizač ní činidlo a jeho koncentrace), — nominální zkuš ební koncentrace, stř ední hodnota namě ř ených hodnot v jednotlivých nádrž ích, její smě rodatná odchylka a metody jejich stanovení a důkazy toho, ž e namě ř ené hodnoty odpovídají koncentracím zkouš ené látky v pravém roztoku, — charakteristiky ř edicí vody: pH, alkalinita, tvrdost, teplota, koncentrace rozpuš tě ného kyslíku, koncentrace zbytkového chloru (je-li mě ř ena), obsah celkového organického uhlíku, obsah suspendovaných látek, popř ípadě solnost zkuš ebního média a výsledky jakýchkoli jiných provedených mě ř ení, — kvalita vody ve zkuš ebních nádrž ích: pH, tvrdost, teplota a koncentrace rozpuš tě ného kyslíku, — podrobné informace o krmení (např . druh krmiva (krmiv), původ, podávané množ ství a frekvence krmení). Výsledky — doklady o tom, že kontrolní skupiny vyhově ly kriteriu př ež ití, a data o mortalitěpro kaž dou zkuš ební koncentraci, — použité metody statistické analýzy, statistiky založ ené na znásobeném počtu nádrž í nebo na jednotlivých rybách, zpracování dat a zdůvodnění použ itých metod,
—
XIV.3
data ve formětabulky o individuálních a stř edních hodnotách hmotností ryb v den 0, 14 (bylo-li provádě no váž ení) a 28, hodnoty průmě rných rychlostí růstu pro nádržnebo popř ípaděpseudospecifických rychlostí růstu pro intervaly 0 – 28 dnůnebo popř ípadě0 – 14 a 14 – 28 dnů, — výsledky statistické analýzy (tj. regresní analýzy nebo ANOVA) nejlépe ve formětabulky nebo v grafické forměa hodnota LOEC (p = 0,05) a NOEC nebo EC x, popř ípaděse smě rodatnými odchylkami, — výskyt jakýchkoli neobvyklých reakcí ryb a viditelné úč inky vyvolané zkouš enou látkou. LITERATURA (1) Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals (CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. WRc Report No PRD 1388-M/2. (2) Meyer, A., Bierman, C. H., Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231-236. (3) Ashley S., Mallett M. J., Grandy N. J. (1990). EEC Ring Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M. (4) Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, 1855-1870. (5) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., Munk R., Scholz N., Höfte B. B. (1991). Effect of 3,4-dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brachydanio rerio): results of a comparative laboratory study. Ecotox. Environ. Safety, 21, 157-164. (6) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japonsko. (7) Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., Leonard, E. N., Johnson, R. D. (1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes). Arch. Environ. Contam. Toxicol. 28, 287-297. (8) Benoit, D. A., Holcombe, G. W., Spehar, R. L. (1991). Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA-600/3-91-063. US Environmental Protection Agency, Duluth, Minnesota. (9) Stephan C. E., Rogers J. W. (1985). Advantages of using regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium, ASTM STP 891, R. C. Bahner, D. J. Hansen, eds., American Society for Testing and Materials, Filadelfie, 328338. (10) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Report EPS 1/RM/28, 81 str. (11) Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt. (12) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10.– 12. prosinec 1991.
(13) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121. (14) Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. J. Amer. Statist. Assoc, 20, 482-491. (15) Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. J. Amer. Statist. Assoc 27, 103-117. (16) Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994). A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, Oncorhynchus mykiss: effect of feeding level. Aquaculture,120, 123-133. (17) Quinton, J. C., Blake, R. W. (1990). The effect of feed cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology, 37, 33-41. (18) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 str. (19) Bruce, R. D., Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485-1494. (20) DeGraeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, J. H., Dean, Marcus, M. D., McIntyre, D. O. (1989). Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. Report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Research Institute, Palo Alto, CA. (21) Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. 12 str. (22) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. J. Amer. Statist. Assoc., 28, 510-531.
DODATEK 1 DRUHY RYB DOPORUČNÉ KE ZKOUŠENÍ A VHODNÉ ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY Druhy
Doporučené druhy: Oncorhynchus mykiss pstruh duhový
Jiné dobře popsané druhy: Danio rerio danio pruhované Oryzias latipes halančík japonský
Doporuč ený rozsah zkuš ební teploty (°C)
Fotoperioda (h)
Doporučené rozpětí počáteční hmotnosti ryb (g)
Doporuč ená př esnost Velikost mě ř ení násady (g/l)
Hustota obsádky (l-1)
12,5-16,0
12-16
1-5
na 100 mg
1,2-2,0
4
21-25
12-16
0,050-0,100
na 1 mg
0,2-1,0
5-10
21-25
12-16
0,050-0,100
na 1 mg
0,2-1,0
5-20
Krmivo
Délka zkouš ky (d)
suš ené krmivo pro plůdek lososovitých ryb
28
ž ivé krmivo (Brachionus Artemia) ž ivé krmivo (Brachionus Artemia)
28 28
NĚKTERÉ VODY
CHEMICKÉ
DODATEK 2 CHARAKTERISTIKY
Látka Nerozpuš těné látky Celkový organický uhlík Nedisociovaný amoniak Zbytkový chlor Celkové organofosforové pesticidy Celkové organochlorové pesticidy a polychlorované bifenyly Celkový organický chlor
PŘIJATELNÉ
ŘEDICÍ
Koncentrace < 20 mg/l < 2 mg/l < 1µg/l < 10 µg/l < 50 ng/l < 50 ng/l < 25 ng/l
DODATEK 3 LOGARITMICKÁ ŘADA KONCENTRACÍ VHODNÁ PRO ZKOUŠKU TOXICITY (9) Sloupec (poč et koncentrací mezi 100 a 10, nebo mezi 10 a 1) (1) 1 2 3 4 5 100 100 100 100 100 32 46 56 63 68 10 22 32 40 46 3,2 10 18 25 32 1,0 4,6 10 16 22 2,2 5,6 10 15 1,0 3,2 6,3 10 1,8 4,0 6,8 1,0 2,5 4,6 1,6 3,2 1,0 2,2 1,5 1,0
1
6 100 72 52 37 27 19 14 10 7,2 5,2 3,7 2,7 1,9 1,4 1,0
7 100 75 56 42 32 24 18 13 10 7,5 5,6 4,2 3,2 2,4 1,8 1,3 1,0 Ze sloupcůmůž e být zvolena ř ada pěti (nebo více) po sobějdoucích koncentrací. Mezilehlé body pro koncentrace ve sloupci (x) jsou uvedeny ve sloupci (2x + 1). Uvedené hodnoty mohou být koncentracemi vyjádř enými v objemových nebo hmotnostních procentech (mg/l nebo µg/l). Hodnoty mohou být podle potř eby násobeny nebo dě leny jakoukoli mocninou 10. Řada ve sloupci 1 by mohla být použ ita př i značné nejistotě , pokud jde stupeňtoxicity.
XV. METODA PRO STANOVENÍ TOXICITY NA RYBÍCH EMBRYÍCH A POTĚRU - KRÁTKODOBÁ ZKOUŠKA – metoda C.15 podle př ílohy smě rnice 2001/59/ES XV.1
XV.1.1
METODA Tato zkouš ka krátkodobé toxicity je replikou metody OECD TG 212 (1998). ÚVOD Tato zkouš ka krátkodobé toxicity na rybím embryu a váč kovém plůdku je krátkodobou zkouš kou, př i nížjsou exponována ž ivotní stádia od č erstvě oplodněných jiker do stadia váč kových plůdků. Př i zkouš ce na embryu a
XV.1.2
XV.1.3
na váč kovém plůdku se nekrmí, zkouš ka by tedy měla být ukonč ena dokud je váč kový plůdek stále vyž ivován ze ž loutkového váčku. Zkouš ka je urč ena k zjiš tě ní letálních a v omezené míř e subletálních úč inkůchemických látek na specifická stadia a testovací druhy. Tato zkouš ka by mě la poskytnout užiteč né informace, neboťby a) mohla být př echodem mezi letálními a subletálními zkouš kami, b) mohla být použ ita jako screeningová zkouš ka pro úplnou zkouš ku toxicity na časných vývojových stadiích nebo pro zkouš ky chronické toxicity a c) mohla by být použita pro zkouš ení na druzích, u nichžnejsou dostatečněrozvinuty chovné techniky, aby pokryly období od endogenního k exogennímu vyž ivování. Je tř eba mít na pamě ti, ž e pouze zkouš ky pokrývající celý životní cyklus ryb obecněumožňují odhadnout chronickou toxicitu chemické látky pro ryby a že jakékoli omezení expozice nějakého životního stadia může sníž it citlivost a tím podhodnotit chronickou toxicitu. Oč ekává se tedy, že zkouš ka na embryu a váčkovém plůdku je méněcitlivá nežúplná zkouš ka na č asných vývojových stádiích, zejména pokud jde o vysoce lipofilní chemické látky (log Po/v > 4) a chemické látky se specifickým mechanismem úč inku. V citlivostech tě chto dvou zkouš ek se vš ak oč ekávají menš í rozdíly v př ípaděchemických látek s nespecifickým, narkotickým mechanismem úč inku (1). Př ed publikováním této zkouš ky bylo nejvíce zkuš eností s touto zkouš kou na embryu a váčkovém plůdku získáno u sladkovodní ryby Danio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae – obecný název danio pruhované). Podrobnějš í pokyny pro zkouš ku s tímto druhem jsou tedy uvedeny v dodatku 1. To nevyluč uje použ ití jiného druhu, pro který jsou zkuš enosti rovně žk dispozici (tabulky IA a IB). DEFINICE Nejniž š í koncentrace s pozorovanými úč inky (Lowest observed effect concentration, LOEC): je nejnižš í zkouš ená koncentrace zkouš ené látky, př i nížjsou pozorovány významné úč inky ve srovnání s kontrolou (na úrovni pravdě podobnosti faleš ně pozitivního hodnocení p < 0,05). Vš echny zkouš ené koncentrace vyš š í nežLOEC musí mít stejné nebo vážně jš íš kodlivé úč inky, nežúčinky pozorované př i koncentraci LOEC. NOEC (no observed effect concentration, koncentrace bez pozorovaných úč inků): je zkuš ební koncentrace bezprostř edněniž š í než LOEC. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY Embrya a váč kové plůdky se vystaví rozsahu koncentrací zkouš ené látky rozpuš těné ve vodě. Zkouš ka umož ňuje volit mezi semistatickým a průtokovým uspoř ádáním. Volba závisí na povaze zkouš ené látky. Zkouš ka se zahájí umístě ním oplodně ných jiker do zkuš ebních nádrží a ukonč í se tě sněpř ed tím, neždojde k úplné absorpci ž loutkového váč ku č erstvých plůdků v ně které ze zkuš ebních nádrž í, nebo než začne v kontrolních skupinách docházet k úhynu v důsledku hladově ní. Posoudí se letální a subletální úč inky a porovnají se s kontrolními hodnotami s cílem stanovit nejnižš í koncentraci s pozorovanými úč inky, tedy koncentraci bez pozorovaných úč inků. Úč inky mohou být eventuálně analyzovány za použ ití regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci,
XV.1.4
XV.1.5
XV.1.6 XV.1.6.1
XV.1.6.2
XV.1.6.3
XV.1.6.4
(1)
která způsobuje určitý procentuálněvyjádř ený úč inek (tj. LC/ECx, kde x je definovaný procentuální úč inek). INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE Mě ly by být dostupné výsledky zkouš ky akutní toxicity (viz metoda C.1) provedené nejlépe na druhu zvolenému pro tuto zkouš ku. Výsledky mohou být už itečné př i výběru vhodného rozsahu zkuš ebních koncentrací ve zkouš ce na č asných vývojových stádiích. Měly by být známy rozpustnost látky ve vodě(včetněrozpustnosti ve zkuš ební vodě ) a tlak par látky. Mě la by být k dispozici vhodná analytická metoda pro kvantitativní stanovení látky ve zkuš ebních roztocích, a to se známou a doloženou správností a známou mezí stanovitelnosti. Už iteč nými informacemi o zkouš ené látce pro účely stanovení zkuš ebních podmínek jsou strukturní vzorec, č istota látky, stálost na svě tle, pKa , Po/v a výsledky zkouš ky snadné biologické rozlož itelnosti (viz metoda C.4). VALIDITA ZKOUŠKY Má-li být zkouš ka platná, musí být splněny následující podmínky: — celková míra př ež ití oplodně ných jiker v kontrolních skupinách a podle potř eby v nádrž ích, do nichžbylo př idáno pouze rozpouš tě dlo, musí být vyš š í nebo rovna limitům stanoveným v dodatcích 2 a 3, — koncentrace rozpuš tě ného kyslíku musí lež et mezi 60 a 100 % nasycení vzduchem (ASV) po celou dobu zkouš ky, — teplota vody se po celou dobu zkouš ky nesmí mezi zkuš ebními nádrž emi nebo den ode dne liš it o více než± 1,5 °C a mě la by být udržována v rozpě tí teplot stanoveném pro zkuš ební druh (dodatky 2 a 3). POPIS ZKUŠEBNÍ METODY Zkuš ební nádrž e Mohou být použ ity jakékoli nádrž e ze skla nebo z jiného inertního materiálu. Rozmě ry zkuš ebních nádrž í by mě ly být dostateč né k tomu, aby vyhovovaly velikosti násady (viz bod 1.7.1.2). Doporuč uje se, aby byly nádrž e umístě ny ve zkuš ebním prostoru náhodně. Uspoř ádání do náhodných blokůs možností expozice v každém bloku se upř ednostňuje př ed zcela náhodným uspoř ádáním, kdyžexistují systémové účinky v laboratoř i, které mohou být blokovým uspoř ádáním kontrolovány. Je-li použ ito blokové uspoř ádání, mě lo by být zohledně no př i následné analýze dat. Nádrž e by mě ly být chráněny př ed nežádoucími ruš ivými vlivy. Výběr druhůryb Doporuč ené druhy ryb jsou uvedeny v tabulce 1A. To nevyluč uje použ ití jiného druhu (př íklady jsou uvedeny v tabulce 1B), zkuš ební postup musí být ale upraven, aby byly vytvoř eny vhodné zkuš ební podmínky.V takovém př ípaděby mě ly být uvedeny důvody pro výbě r druhu a experimentální podmínky. Chov mateč ných ryb Podrobnosti o chovu mateč ných ryb v uspokojivých podmínkách jsou uvedeny v metoděOECD TG 210 (1) a v literatuř e (2, 3, 4, 5, 6). Chov embryí a plůdků Embrya a čerstvěvykulené plůdky mohou být exponovány v hlavní nádrži v menš ích nádobách s pletivovými stě nami nebo uzávě ry, aby jimi mohl proudit zkuš ební roztok. Nevíř ivého průtoku nádobami lze dosáhnout
OECD, Paris 1992, Test Guideline 210, Fish, Early-life Toxicity Test
XV.1.6.5
XV.1.6.6
jejich zavě š ení do ramen, pomocí nichžlze pohybovat nádobami nahoru a dolů, př ič emžorganismy zůstanou stále ponoř eny; lze rovněžpouž ít syfonový systém př ítoku a výpusti. Oplodně né jikry lososovitých ryb mohou lež et na podlož ce nebo pletivu s dostateč něvelkými oky, aby jimi mohly plůdky po vylíhnutí propadnout. K př emístě ní embryí a plůdků v semistatické zkouš ce s kaž dodenní úplnou výměnou média je vhodné použ ít Pasteurovy pipety. (viz bod 1.6.6). Jsou-li k udržení jiker v hlavní nádrž i použity nádoby, mř íž ky nebo (1) pletiva, mě ly by být po vylíhnutí plůdkůodstraně ny , pokud ovš em nemají být ponechány k zamezení úniku ryb. Je-li tř eba plůdky př emístit, nemě ly by být vystaveny vzduchu a nemě ly by se k jejich vytaž ení z nádob používat síť ky (taková opatrnost není nutná u méněkř ehkých druhů, např . u kapra). Okamžik př emístě ní se liš í podle druhu a nemusí být vž dy nutný. U semistatických technik mohou být použity kádinky nebo mě lké nádobky a podle potř eby mohou být opatř eny sítem umístě ným nepatrně nad dnem kádinky. Je-li objem tě chto nádob dostateč ný, aby vyhovoval pož adavkům na nasazování (viz bod 1.7.1.2) nemusí být př emístě ní embryí nebo plůdkůnutné. Voda Pro tuto zkouš ku je vhodná jakákoliv voda, která vyhovuje chemickým charakteristikám př ijatelné ř edicím vody, jak jsou uvedeny v dodatku 4 a v nížtestovací druhy kontrolních skupin př ež ívají alespoňtak, jak je uvedeno v dodatcích 2 a 3. Měla by mít po celou dobu zkouš ky stejnou kvalitu. pH by se nemě lo měnit o více než± 0,5. Pro ujiš tění, že ř edící voda nebude mít př íliš ný vliv na výsledky zkouš ky (např íklad tvorbou komplexůse zkouš enou látkou) nebo nepř íznivý vliv na stav matečných ryb, by mě ly být odebírány v pravidelných intervalech její vzorky pro analýzu. Je-li kvalita ř edicí vody relativněkonstantní, mě lo by být stanovení tě ž kých kovů(např . Cu, Pb, Zn, Hg, Cd a Ni), hlavních aniontů a kationtů(např . Ca, Mg, Na, K, Cl a SO4), pesticidů(např . celkový obsah organických fosforových a chlorových pesticidů), celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek provedeno např . kaž dé tř i měsíce. Je-li prokázáno, ž e kvalita vody je konstantní po dobu alespoň jednoho roku, mohou být stanovení méněč astá a intervaly lze prodlouž it (např . kaž dých š est mě síců). Zkuš ební roztoky Zkuš ební roztoky o zvolených koncentracích se př ipraví ř edě ním zásobního roztoku. Zásobní roztok by měl být nejlépe př ipraven jednoduchým mechanickým mícháním nebo protř epáváním zkouš ené látky v ř edicí vodě (např . mechanickým mícháním a sonifikací). Pro dosažení vhodné koncentrace zásobního roztoku mohou být použ ity saturační kolony. Nemě la by být použ ívána rozpouš tě dla nebo dispergátory (solubilizač ní činidla), v ně kterých př ípadech vš ak můž e být použití takových látek pro vytvoř ení zásobního roztoku o vhodné koncentraci nezbytné. Ke vhodným rozpouš tědlům patř í aceton, ethanol, methanol, dimethylformamid a triethylenglykol. Ke vhodným dispergátorům patř í Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% methylcelulosa a HCO-40. Snadno biologicky rozlož itelná činidla (např . aceton) nebo vysoce těkavé slouč eniny je tř eba
použ ívat rozváž ně , neboťmohou způsobit problémy s růstem bakterií v průtokových zkouš kách. Je-li použ ito solubilizač ní č inidlo, nesmí mít významné úč inky na př ež ití ani viditelné nepř íznivé úč inky na č asná vývojová stádia, cožmusí být prokázáno na kontrolní skupiněvystavené pouze rozpouš tědlu. Mě la by vš ak být vynalož ena maximální snaha takové látky nepoužívat. U semistatických technik mohou být použity dva různé postupy obměny; buďi) se do č istých nádob př ipraví nové zkuš ební roztoky a př ež ívající jikry a plůdky se s malým objemem starého roztoku opatrněpř emístí do nových nádob, aniž by se vystavily vzduchu, nebo ii) se testovací organismy ponechají v nádoběa vymění se urč itý podíl (alespoňtř i č tvrtiny) zkuš ební vody. Častost obnovování média bude záviset na stálosti zkouš ené látky, avš ak doporuč uje se obnovovat médium denně . Není-li podle př edběž ných zkouš ek stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkouš ené látky mezi obnoveními média stálá, (tj. nepohybuje se v intervalu 80 – 120 % nominální koncentrace nebo klesá pod 80 % namě ř ené poč áteč ní koncentrace), mě la by být zvážena průtoková zkouš ka. V kaž dém př ípaděje tř eba dbát na to, aby plůdky nebyly př i obnovování vody vystaveny stresu. Př i průtokových zkouš kách je pro zajiš tění ř ady koncentrací nezbytný systém, který nepř etrž itědávkuje a ř edí zásobní roztok zkouš ené látky (např . dávkovací č erpadlo, zař ízení pro proporcionální ř edě ní, saturač ní systém). Průtok zásobních roztokůa ř edicí vody by mě l být kontrolován v urč itých intervalech, nejlépe denně , a nemě l by se v průbě hu zkouš ky měnit o více než10 %. Jako vhodný by shledán průtok zajiš ť ující výmě nu alespoňpě ti objemůnádrž e za 24 h (2). XV.1.7 POSTUP Už iteč né informace o provádě ní zkouš ek toxicity na rybím embryu a váčkovém plůdku jsou dostupné v literatuř e, př ičemžně které literární zdroje (7, 8, 9) jsou uvedeny v tomto textu v oddílu s literaturou. XV.1.7.1 Podmínky expozice XV.1.7.1.1 Délka expozice Zkouš ka se zahájí nejlépe do 30 minut po oplodnění jiker. Embrya se ponoř í do zkuš ebního roztoku př ed započetím rýhování blastuly, nebo co nejdř íve po něm, a v kaž dém př ípaděpř ed poč átkem stádia gastruly. U jiker získaných od komerč ního dodavatele nemusí být mož né zahájit zkouš ku ihned po oplodně ní. Vhledem k tomu, ž e citlivost zkouš ky může být závažněovlivně na zpož dě ní začátku zkouš ky, měla by být zkouš ka zahájena do osmi hodin po oplodně ní. Vzhledem k tomu, ž e se plůdky v průbě hu expozice nekrmí, ukončí se zkouš ka tě sněpř ed tím, neždojde k úplné absorpci ž loutkového váčku u plůdkův některé ze zkuš ebních nádrží, nebo než zač ne v kontrolních skupinách docházet k úhynu v důsledku hladově ní. Délka zkouš ky bude záviset na použ itém druhu. Ně které doporuč ené délky zkouš ky jsou uvedeny v dodatcích 2 a 3. XV.1.7.1.2 Nasazování Poč et oplodněných jiker na zač átku zkouš ky by mě l být dostateč ný ke splně ní statistických pož adavků. Mě ly by být k expozici náhodně rozděleny a na jednu koncentraci by mělo být rozdě leno alespoň30 jiker rovným dílem (nebo alespoňjak je to jen možné s ohledem na to, ž eu ně kterých druhůmůž e být obtíž né získat stejněvelké podíly) mezi alespoň
tř i dalš í zkuš ební nádrž e. Velikost násady (biomasa v jednotce objemu) by měla být tak nízká, aby bylo mož né udrž et koncentraci rozpuš těného kyslíku na alespoň 60 % ASV bez provzduš ňování. U průtokových zkouš ek se doporuč uje nasazování nepř ekrač ující 0,5 g/l za 24 h a vž ádném okamž iku nepř ekrač ující 5 g/l roztoku (2). XV.1.7.1.3 Světlo a teplota Fotoperioda a teplota zkuš ební vody by mě ly vyhovovat zkuš ebním druhům (dodatky 2 a 3). Pro sledování teploty může sloužit dalš í zkuš ební nádrž. XV.1.7.2 Zkuš ební koncentrace Obvykle je nezbytných pět koncentrací zkouš ené látky liš ících se od sebe faktorem nepř ekrač ujícím 3,2. Př i výbě ru rozsahu zkuš ebních koncentrací by mě la být zohledněna kř ivka závislosti hodnoty LC50 na délce expozice ve studii akutní toxicity. Za urč itých okolností můž e být oprávně né použ ít méně než pět koncentrací, např . v limitní zkouš ce, a užš í rozsah koncentrací. Použ ití méněnežpě ti koncentrací by mě lo být zdůvodně no. Koncentrace látky, které jsou vyš š í než96hodinová LC50 nebo vyš š í než 100 mg/l, podle toho, co je niž š í, nemusí být zkouš eny. Látky by neměly být zkouš eny pro koncentrace vyš š í, nežje jejich rozpustnost ve zkuš ební vodě . Použ ije-li se k usnadně ní př ípravy zásobního roztoku solubilizač ní č inidlo (viz bod 1.6.6), neměla by být jeho konečná koncentrace ve zkuš ební nádrži vyš š í než0,1 ml/l a mě la by být ve vš ech zkuš ebních nádrž ích stejná. XV.1.7.3 Kontrolní skupiny Jako dalš í zkuš ební sady by mě ly být nasazeny kontrolní skupina v ř edicí vodě(př ísluš ným způsoben znásobená) a podle potř eby také jedna kontrolní skupina se solubilizač ním č inidlem (př ísluš ným způsoben znásobená). XV.1.7.4 Častost analytických stanovení a mě ření Bě hem zkouš ky se koncentrace zkouš ené látky stanovují v pravidelných intervalech. U semistatických zkouš ek, pokud se př edpokládá, že se bude zkuš ební koncentrace pohybovat v rozmezí ± 20 % nominálních hodnot (tj. od 80 do 120 %, viz bod 1.4 a 1.6.6), se doporuč uje analyzovat nejvyš š í a nejniž š í zkuš ební koncentrace na začátku studie ihned po jejich př ípravěa bezprostř edně př ed obnovením alespoň v nejméně tř ech nádrž ích (tj. analýzy se provedou na vzorku téhožroztoku – ihned po jeho př ípravě a př i jeho výmě ně ). U zkouš ek, u nichžse (na základědat o stálosti látky) př edpokládá, že se bude koncentrace zkouš ené látky pohybovat v rozmezí vě tš ím než± 20 % nominální hodnoty, je nezbytné analyzovat vš echny zkouš ené koncentrace ihned po jejich př ípravěa př ed jejich výměnou, a to stejněčasto (tj. alespoňve tř ech okamžicích rovnomě rněrozložených př es celkovou dobu zkouš ky). Stanovení koncentrací zkouš ené látky př ed obnovením je tř eba provést pro kaž dou koncentraci pouze u jedné paralelní nádrže. Stanovení se provádě jí v odstupu ne více než7 dnů. Doporučuje se zakládat výsledky na namě ř ených koncentracích. Lze-li vš ak prokázat, že po celou dobu zkouš ky byla koncentrace uspokojivěudrž ována v rozmezí
± 20 % nominální hodnoty, mohou být výsledky založeny na nominálních nebo namě ř ených poč átečních hodnotách. Pro průtokové zkouš ky je vhodný podobný vzorkovací rež im, jako je popsán u semistatických zkouš ek (v tomto př ípaděse vš ak neprovádí měř ení „starých“ roztoků). Je-li zkouš ka delš í nežsedm dnů, doporuč uje se zvýš it počet odbě rův prvním týdnu (např . tř i sady mě ř ení) pro ujiš tění, ž e jsou zkuš ební koncentrace stálé. Můž e být nezbytné vzorky odstř edit nebo filtrovat (např . př es filtr s velikostí pórů0,45 µm). Vzhledem k tomu, že vš ak odstř edění ani filtrace vždy neoddělí od sebe biologicky dostupný a biologicky nedostupný podíl zkuš ební látky, nemusí být vzorky takto zpracovány. V průbě hu zkouš ky se mě ř í v každé zkuš ební nádrži množství rozpuš těného kyslíku, pH a teplota. Celková tvrdost a solnost se měř í v kontrolních nádržích a v jedné nádrži s nejvyš š í koncentrací. Množství rozpuš těného kyslíku a solnost (podle potř eby) se měř í alespoňtř ikrát (na zač átku, uprostř ed a na konci zkouš ky). U semistatických zkouš ek se doporuč uje mě ř it množ ství rozpuš tě ného kyslíku č astě ji, nejlépe př ed každým obnovením média a po něm, nebo alespoňjednou týdně . pH se měř í na zač átku a na konci každé výmě ny vody u semistatických zkouš ek a alespoňtýdněu průtokových zkouš ek. Tvrdost vody se měř í v každé zkouš ce jednou. Teplota se mě ř í denně , nejlépe nepř etržitěalespoň v jedné zkuš ební nádrž i. XV.1.7.5 Pozorování XV.1.7.5.1 Stádia vývoje embrya Embryonální stádium (tj. stadium gastruly) na začátku expozice zkouš ené látce by mě lo být identifikováno co nejpř esněji. Lze to provést za použití reprezentativního vzorku vhodněuchovávaných a oč iš tě ných jiker. Popis a vyobrazení embryonálních stádií lze také nalézt v literatuř e (2, 5, 10, 11). XV.1.7.5.2 Líhnutí a př ež ívání Líhnutí a př ežívání se pozoruje alespoňjednou denněa zaznamenávají se poč ty. Můž e být žádoucí provádět na zač átku zkouš ky častě jš í pozorování (např . kaž dých 30 min bě hem prvních tř í hodin), neboťv ně kterých př ípadech mohou být důležitě jš í doby př ež ití nežpouhé poč ty úhynů (např . dochází-li k akutním toxickým úč inkům). Uhynulá embrya a plůdky se odstraní ihned po nalezení, neboťse rychle rozkládají. Př i odstraňování uhynulých jedinců se postupuje s mimoř ádnou opatrností, aby se nezasáhlo do sousedních jiker/plůdků nebo aby se tyto fyzicky nepoš kodily, neboťjsou mimoř ádněsubtilní a citlivé. Kritéria uhynutí se už ivotních stádií liš í: — u jiker: zejména v časných stádiích zř etelná ztráta průsvitnosti a změna ve zbarvení vyvolané koagulací a/nebo sraž ením bílkovin vedoucími k bílému zakalení, — u embryí: absence pohybu nebo tepu srdce nebo neprůsvitné zbarvení u druhů, jejichžembrya jsou za normálních okolností průsvitná, — u plůdků: nepohyblivost nebo absence dýchacích pohybůnebo tepu srdce nebo bílé neprůsvitné zbarvení centrálního nervového systému a nedostateč ná reakce na mechanické podně ty. XV.1.7.5.3 Neobvyklý vzhled
Poč et plůdkůvykazujících neobvyklý tě lesný vzhled nebo pigmentaci a stav absorpce žloutkového váč ku se zaznamenávají v př imě ř ených intervalech závisejících na délce zkouš ky a na povaze popisované odchylky. Je tř eba si uvě domit, ž e neobvyklá embrya a plůdky se př irozeněvyskytují a u některých druhůjich můž e být v kontrolních skupinách ř ádověně kolik procent. Neobvyklí jedinci by mě li být ze zkuš ební nádrž e odstraně ní pouze v př ípaděuhynutí. XV.1.7.5.4 Neobvyklé chování Odchylky, např . hyperventilace, nekoordinované plavání a netypická nečinnost se zaznamenávají v př iměř ených intervalech závisejících na délce zkouš ky. Tyto úč inky, př estože je obtížné je kvantifikovat, mohou – jsou-li pozorovány – napomoci interpretovat data o mortalitě , tj. mohou poskytnout informace o mechanismu toxického působení látky. XV.1.7.5.5 Tě lesná délka Na konci zkouš ky se doporuč uje změ ř it individuální délku: můž e být změ ř ena standardní délka, délka těla (the fork lenght) nebo celková délka. Doš lo-li vš ak k uhnití ocasní ploutve nebo k erozi ploutví, použije se standardní délka. Obecněby měl být v dobř e provedených zkouš kách variač ní koeficient pro délku mezi jednotlivými kontrolními skupinami 20 %. XV.1.7.5.6 Hmotnost Na konci se zkouš ky lze stanovit jednotlivé hmotnosti; hmotnost za sucha (24 h př i 60 °C) se upř ednostňuje př ed ž ivou váhou (po osuš ení do sucha). Obecněby měl být v dobř e provedených zkouš kách variač ní koeficient pro hmotnost mezi jednotlivými kontrolními skupinami 20 %. Tato pozorování povedou k některým nebo ke vš em následujícím údajům, které budou k dispozici pro statistickou analýzu: — kumulativní mortalita, — počet zdravých plůdkůna konci zkouš ky, — čas začátku líhnutí a konce líhnutí (tj. 90% vylíhnutí v každé paralelní skupině), — počet plůdkůvylíhnutých každý den, — délka (a hmotnost) ryb, které př ež ily do konce zkouš ky, — počet plůdků, které jsou deformované nebo mají neobvyklý vzhled, — počet plůdkůvykazujících neobvyklé chování. XV.2 DATA A ZPRÁVY XV.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ Doporuč uje se, aby se návrhu zkouš ky i analýzy výsledkůzkouš ky úč astnil statistik, neboťtato zkuš ební metoda umož ňuje znač né variace v experimentálním uspoř ádání, např íklad v počtu zkuš ebních nádrží, v poč tu zkuš ebních koncentrací, ve výchozím poč tu oplodně ných jiker v měř ených parametrech. Pokud jde o mož nosti uspoř ádání zkouš ky, nejsou zde uvedeny ž ádné pokyny. Mají-li být odhadnuty hodnoty LOEC/NOEC, bude nezbytné analyzovat odchylky pro každou sadu paralelních skupin pomocí analýzy variance (ANOVA) nebo pomocí kontingenč ní tabulky. K vícenásobnému porovnání výsledkůpro jednotlivé koncentrace a pro kontrolní skupiny může být už itečný Dunnettův test (12, 13). K dispozici jsou dalš í už itečné př íklady (14, 15). Vypoč te se a uvede stupeňúč inku, který lze prokázat pomocí ANOVA nebo jiných metod (tj. vypovídací schopnost zkouš ky).
XV.2.2
XV.2.3 XV.2.3.1
XV.2.3.2
XV.2.3.3
Je tř eba si uvě domit, ž e ne vš echna pozorování uvedená v bodě1.7.5.6 jsou vhodná pro statistickou analýzu pomocí ANOVA. Např íklad kumulativní mortalita a počet zdravých plůdkůna konci zkouš ky by mohly být analyzovány probitovými metodami. Mají-li být odhadnuty LC nebo ECx, proloží se daty vhodná kř ivka (vhodné kř ivky), jako např . logaritmická kř ivka, a to statistickou metodou, např . metodou nejmenš ích č tvercůnebo nelineární metodou nejmenš ích č tverců. Kř ivka nebo kř ivky by mě ly být tak parametrizovány, aby bylo možné př ímo odhadnout pož adované hodnoty LC nebo EC x a jejich smě rodatné odchylky. To znač ně usnadňuje výpoč et intervalů spolehlivosti pro hodnoty LC nebo EC x. Pokud nejsou dobré důvody pro upř ednostnění jiných intervalůspolehlivosti, uvede se oboustranný 95% interval spolehlivosti. Metoda proložení by měla pokud možno umož nit posouzení závaž nosti nedostatkůprolož ení. Prolož ení lze provést graficky. Regresní analýza je vhodná pro vš echna pozorování uvedená v bodě1.7.5.6. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Výsledky by měly být interpretovány opatrněv př ípadě , ž e se namě ř ené koncentrace toxické látky ve zkuš ebních roztocích pohybují na úrovních blízkých mezi stanovitelnosti analytické metody. Interpretace výsledků pro koncentrace vyš š í nežje rozpustnost látky ve voděby mě la být rovněž opatrná. PROTOKOL O ZKOUŠCE Protokol o zkouš ce musí obsahovat následující informace: Zkouš ená látka — fyzikální stav a relevantní fyzikálně -chemické vlastnosti, — údaje o chemické identitěvčetněúdajůo č istotěa podle potř eby o metoděkvantitativního stanovení zkouš ené látky. Testovací druh — vědecký název, kmen, poč et matečných ryb (tj. kolik samič ek bylo ve zkouš ce použ ito pro opatř ení pož adovaného poč tu jiker), zdroj a metoda sběru oplodně ných jiker a následné zpracování. Zkuš ební podmínky — použitá zkuš ební metoda (např . semistatická nebo průtoková metoda, doba od oplodnění do zač átku zkouš ky, nasazování atd.), — fotoperioda (fotoperiody), — uspoř ádání zkouš ky (např . počet zkuš ebních nádrž í a jejich znásobení, počet embryí v nádrž i), — metoda př ípravy zásobních roztokůa č astost obnovení (je-li použ ito, uvede se solubilizač ní činidlo a jeho koncentrace), — nominální zkuš ební koncentrace, namě ř ené hodnoty ve zkuš ebních nádrž ích, jejich stř ední hodnoty a směrodatné odchylky a metody jejich stanovení a je-li zkouš ená látka rozpustná ve vodě v koncentracích nižš ích, nežjsou vyš etř ované koncentrace, uvede se důkaz toho, ž e naměř ené koncentrace odpovídají koncentraci zkouš ené látky v roztoku, — charakteristiky ř edicí vody: hodnota pH, tvrdost, teplota, koncentrace rozpuš tě ného kyslíku, koncentrace zbytkového chloru (je-li měř ena), obsah celkového organického uhlíku, obsah
XV.2.3.4
XV.3
suspendovaných látek, popř ípadě salinita zkuš ebního média a výsledky jakýchkoli jiných provedených mě ř ení, — kvalita vody ve zkuš ebních nádrž ích: pH, tvrdost, teplota a koncentrace rozpuš tě ného kyslíku. Výsledky — výsledky př ípadných př edbě žných studií stálosti zkouš ené látky, — doklady o tom, ž e kontrolní skupiny splnily obecné požadavky na př ijatelnost př ež ití pro testovací druh (dodatky 2 a 3), — údaje o mortalitěnebo př ež ití v embryonálním stádiu a ve stádiu plůdku a údaje o celkové mortalitěnebo př ežití, — doba do vylíhnutí, poč et vylíhnutých jedinců, — údaje o délce (a hmotnosti), — výskyt a popis morfologických odchylek, pokud se vyskytly, — výskyt a popis úč inkůna chování, pokud se vyskytly, — statistická analýza a zpracování dat, — u zkouš ek analyzovaných pomocí ANOVA nejnižš í koncentrace s pozorovanými úč inky (LOEC) na úrovni pravděpodobnosti faleš ně pozitivního hodnocení p = 0,05 a koncentrace bez pozorovaných účinků(NOEC) pro kaž dou posuzovanou reakci, vč etněpopisu použité statistické metody a údaje o tom, jak velký úč inek bylo mož né odhalit, — u zkouš ek analyzovaných pomocí regresních metod, hodnoty LC a EC x a intervaly spolehlivosti a graf prolož eného modelu použ itého pro jejich výpoč et, — vysvě tlení jakékoli odchylky od této zkuš ební metody. LITERATURA (1) Kristensen P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, 60 str., červen 1990. (2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. 26 str. (3) Brauhn J. L., Schoettger R. A. (1975). Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel Catfish and Bluegills. str. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75011, Duluth, Minnesota. (4) Brungs W. A., Jones B. R. (1977). Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures. str. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota. (5) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Biol. 10, 121-173. (6) Legault R. (1958). A Technique for Controlling the Time of Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, 328-330. (7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander B., Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish (Brachydanio rerio) Using Chromium and Zinc as Toxicants. Environ. Toxicol. Chem., 6, 61-71.
(8)
(9)
(10) (11)
(12)
(13) (14)
(15)
(16)
(17)
(18)
(19)
(20)
(21)
(22)
Birge J. W., Black J. A., Westerman A. G. (1985). Short-term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environ. Toxicol. Chem., 4, 807-821. Van Leeuwen C. J., Espeldoorn A., Mol F. (1986). Aquatic Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, 129-145. Kirchen R. V., W. R. West (1969). Teleostean Development. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply Company. Kirchen R. V., W. R. West (1976). The Japanese Medaka. Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina. 36 str. Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121. Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 20, 482-491. Mc Clave J. T., Sullivan J. H., Pearson J.G. (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Filadelfie. Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M., Hermes J. (1990). Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, 321-334. Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 1/RM/28, prosinec 1992, 81 str. Dave G., Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydanio rerio. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 21, 126-134. Meyer A., Bierman C. H., Orti G. (1993). The phylogenetic position of the Zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology – an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: 231-236. Ghillebaert F., Chaillou C., Deschamps F., Roubaud P. (1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicol. Environ. Safety, 32, 19-28. US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese Medaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, EPA, Duluth. US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPA report EPA/600/3-91/063, prosinec. 1991, EPA, Duluth. De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic T. L., Reichenbach N. G., Dean J. H., Marcus M. D. (1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow (Pimephales promelas) larval survival and growth test: an intra- and interlaboratory study. Environ. Toxicol. Chem. 10, 1189-1203.
(23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine and Marine fish. (24) Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New developmental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., Dordrecht, 280 str. (25) Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, v: W. S. Hoar, D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academic press, 1-58. TABULKA 1A: Druhy ryb doporučené pro zkouš ku Sladkovodní Oncorhynchus mykiss pstruh duhový (9, 16) Danio rerio danio pruhované (7, 17, 18) Cyprinus caprio kapr obecný (8, 19) Oryzias latipes halanč ík japonský (20, 21) Pimephales promelas stř evle (8, 22)
TABULKA 1B: Př íklady dalš ích dobř e popsaných druhů, které byly také použ ity Sladkovodní Carassius auratus karas zlatý (8) Lepomis macrochirus slunečnice modrá (8)
Moř ské Menidia peninsulae (23, 24, 25) Clupea harengus sleď(24, 25) Gadus morhua treska (24, 25) Cyprinodon variegatus (23, 24, 25)
DODATEK 1 NÁVOD K PROVEDENÍ ZKOUŠKY TOXICITY NA EMBRYÍCH A VÁČKOVÝCH PLŮDCÍCH DANIA PRUHOVANÉHO (BRACHYDANIO RERIO) ÚVOD Danio pruhované pochází z indického pobř eží Coromandel, kde žije v bystř inách. Je běž nou akvarijní rybou z č eledi kaprovitých. Informace o péč i o ně j a o jeho chovu jsou uvedeny v standardních př íruč kách o tropických rybách. Př ehled jeho biologie a použití ve výzkumu ryb podává Laale (1). Ryba zř ídka dorůstá délky více než45 mm. Má válcové tělo se 7 – 9 horizontálními tmavěmodrými stř íbř itými pruhy. Pruhy pokrač ují př es ocasní a ř itní ploutve. Hř bet má olivovězelený. Sameč ci jsou š tíhlejš í nežsamič ky. Samič ky jsou stř íbrně jš í a mají rozš íř ené bř icho, zejména př ed tř ením. Dospě lé ryby dokáž í snáš et velké kolísání teploty, pH a tvrdosti vody. Mají-li se získat zdravé ryby poskytující jikry dobré kvality, mě ly by být zajiš tě ny optimální podmínky. Př i tř ení sameček sleduje samič ku, doráž í na ni a př i vypuzení jiker je oplodní. Jikry, které jsou průsvitné a nejsou př ilnavé, dopadají na dno, kde mohou být pozř eny
rodič i. Na tř ení má vliv světlo. Př i odpovídajícím ranním svě tle se ryby tř ou v prvních hodinách po rozedně ní. Samič ka můž e klást v odstupu jednoho týdne dávky o ně kolika tisících jiker. PODMÍNKY PRO MATEČNÉ RYBY, REPRODUKCE A ČASNÁ VÝVOJOVÁ STÁDIA Vybere se vhodný počet zdravých ryb, které se alespoň dva týdny př ed př edpokládaným tř ením udržují ve vhodné vodě(např . dodatek 4). Skupiny ryb by mě ly mít možnost se př ed kladením jiker pro zkouš ku alespoňjednou vytř ít. Hustota obsádky ryb by v tomto období nemě la př esáhnout 1 gram ryb na litr. Pravidelná výmě na vody nebo použ ití př eč iš ť ovacího systému umožní obsádku zvýš it. Teplota v chovných nádržích se má udrž ovat na 25 ± 2 °C. Ryby by měly dostávat rozmanitou stravu, která můž e obsahovat např íklad komerč ní suché krmivo, č erstvěvylíhnuté Arthemia, chironomidy, dafnie, bílé červy (Enchytraeids). Dále jsou uvedeny dvěmetody, které v praxi vedly k získání dostateč ného množství zdravých oplodně ných jiker pro provedení zkouš ky: i) Osm samič ek a 16 samečkůse umístí do nádrže obsahující 50 litrůř edicí vody, chráněné př ed př ímým svě tlem a ponechají se alespoň48 h co nejvíce v klidu. Na dno nádrž e se odpoledne v den př ed započetím zkouš ky umístí podložka pro tř ení. Podlož ka pro tř ení se skládá z 5 – 7 mm vysokého rámu (z plexiskla nebo jiného vhodného materiálu) s 2 – 5mm hrubým roš tem nahoř e a s 10 – 30µm jemným roš tem vespod. Na hrubém roš tu je př ipevně n tř ecí substrát vyrobený z nylonových vláken. Poté co byly ryby drž eny 12 h v temnu se slaběnasvítí, čímžse vyvolá tř ení. Dvěažčtyř i hodiny po vytř ení se podlož ka pro tř ení vyjme a jikry se seberou. Podlož ka pro tř ení zabrání rybám v pož írání jiker a zároveňumožní snadný sbě r jiker. Skupiny ryb by se měly př ed tř ením určeným k produkci jiker pro zkouš ku vytř ít alespoň jednou. ii) Pě t aždeset samečkůa samič ek se alespoňdva týdny př ed zamýš leným tř ením chová odděleně . Po 5 až10 dnech se bř icha samiček rozš íř í a zviditelní se jejich pohlavní papily. Sameč ci papily nemají. Tř ení se provede v tř ecích nádržích opatř ených faleš ným dnem z pletiva (jako výš e). Nádržse naplní ř edicí vodou tak, aby voda sahala 5 – 10 cm nad roš t. Jedna samič ka a dva samečci se umístí do nádrž e den př ed zamýš leným tř ením. Teplota vody se postupnězvýš í jeden stupeňnad aklimatizační teplotu. Vypne se osvětlení a nádržse ponechá co nejvíce v klidu. Ráno se slaběnasvítí, č ímžse vyvolá tř ení. Po 2 – 4 h se ryby vyjmou a jikry se seberou. Je-li potř eba více dávek jiker, nežlze získat od jedné samič ky, nasadí se paralelnědostateč ný poč et tř ecích nádrž í. Zaznamenáním reprodukč ní úspěš nosti (množ ství a kvality) jednotlivých samiček př ed zkouš kou, lze vybrat pro chov samič ky s nejvyš š í úspě š ností. Jikry se př enesou do zkuš ebních nádrž í skleněnou trubičkou (o vnitř ním průměru ne menš ím než4 mm) opatř enou pružným nasávacím balónkem. Množ ství vody, které se př enáš í s jikrami, by mělo být co nejmenš í. Jikry jsou tě žš í nežvoda a z trubič ky vypadnou do vody. Je tř eba zabránit tomu, aby jikry (a plůdky) př iš ly do kontaktu se vzduchem. Mikroskopickým vyš etř ením vzorku (vzorků) jiker se ově ř í, ž e v prvních stádiích vývoje nedoš lo k nepravidelnostem. Desinfekce jiker není př ípustná. Mortalita jiker je nejvyš š í bě hem prvních 24 h po oplodnění. V této doběje často pozorována mortalita 5 – 40 %. Jikry degenerují v důsledku neúspě š ného oplodně ní nebo vývojových vad. Zdá se, ž e kvalita dávek jiker závisí na samičce, neboťně které
samič ky soustavněkladou jikry dobré kvality, jakou jiné samič ky neposkytují. Rovněžrychlost vývoje a líhnutí se mezi snůš kami liš í. Úspě š něoplodně né jikry a plůdky se žloutkovým váč kem př ežívají dobř e, obvykle jich př ež ívá více než90 %. Př i 25 °C se z jiker líhnou jedinci po 3 – 5 dnech po oplodnění a žloutkový váč ek je absorbován př ibliž něpo 13 dnech po oplodnění. Embryonální vývoj byl dobř e popsán Hisaokou a Battlem (2). Díky průsvitnosti jiker a plůdků č erstvěpo vylíhnutí lze vývoj ryb dobř e sledovat a lze pozorovat malformace. Př ibližněč tyř i hodiny po vytř ení lze rozliš it neoplodněné jikry od oplodně ných (3). K tomuto vyš etř ení se jikry a plůdky umístí do nádobky o malém objemu a prohlížejí se pod mikroskopem. Zkuš ební podmínky požadované pro časná vývojová stádia jsou uvedena v dodatku 2. Optimální hodnoty pH a tvrdosti vody jsou 7,8 a 250 mg/l, vyjádř eno jako CaCO3. VÝPOČTY A STATISTIKA Navrhuje se dvoufázový př ístup. V první fázi se statisticky analyzují data o mortalitě , nenormálním vývoji a dobělíhnutí. Poté se pro ty koncentrace, př i nichžnebyly pozorovány ž ádné nepř íznivé úč inky na tyto parametry, statisticky vyhodnotí tě lesná délka. Tento př ístup se doporučuje, neboťtoxická látka může selektivněusmrcovat menš í ryby, prodlužovat dobu líhnutí a indukovat makroskopické malformace a tedy zkreslovat délku. Kromětoho tak bude pro každou expozici mě ř en zhruba stejný počet ryb, čímžse zajistí validita statistiky zkouš ky. STANOVENÍ LC50 a EC 50 Procento př ež ití jiker a č erstvých plůdků se vypočte a zkoriguje na mortalitu v kontrolních skupinách podle Abbottovy rovnice (4): P 100 C P ' 100 C kde: P = korigované procento př ež ití P' = procento př ež ití pozorované ve zkuš ební koncentraci C = procento př ež ití v kontrolní skupině Podle možnosti se vhodnou metodou stanoví hodnota LC50 na konci zkouš ky. Požaduje-li se, aby byly do statistiky pro EC50 zahrnuty morfologické odchylky, lze k tomu nalézt návod v práci Stephana (5). ODHAD LOEC A NOEC Cílem zkouš ky na jikrách a váč kových plůdcích je porovnat koncentrace, u nichžbyl pozorovatelný účinek, s kontrolními skupinami, tj. stanovit LOEC. Použije se tedy metoda vícenásobného srovnání (6, 7, 8, 9, 10). LITERATURA (1) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, 121-173. (2) Hisaoka K. K., Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan), J. Morph., 102, 311 str. (3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrab‰rbling (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). J. Appl. Ichthyol., 2, 173-181. (4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, Great Britain, 1-333.
(5)
(6) (7) (8)
(9) (10)
Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster, W. E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, 69-81. Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121. Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 20, 482-491. Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. J. Amer. Statist. Assoc, 27, 103-117. Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a Zero Dose Control. J. Amer. Statist. Assoc 28, 519-531. Sokal R. R., Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of Statistics in Biological Research, W. H. Freeman, Co., San Francisco.
DODATEK 2 ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO DOPORUČENÉ DRUHY Druh
Teplota (°C)
Salinita (‰)
Fotoperioda (h)
Délka stádií (d) Embryo
Váčkový plůdek
12-16
3-5
8-10
SLADKOVODNÍ Brachydanio rerio Danio pruhované
25 ± 1
Oncorhynchus mykiss Pstruh duhový
10 ± 1 (1) — 12 ± 1 (2)
0(3)
30-35
25-30
Cyprinus carpio Kapr obecný
21-25
—
12-16
5
>4
Oryzias latipes Halančík japonský
24 ± 1 (1) — 23 ± 1 (2)
12-16
8-11
4-8
Pimephales promelas Stř evle
25 ± 2
16
4-5
5
1 2 3
—
—
Typická délka zkouš ky
Pokud mož no ihned od oplodnění (od č asného stádia gastruly) do 5 dnůpo vylíhnutí (8 - 10 dnů) Pokud mož no ihned od oplodnění (od č asného stádia gastruly) do 20 dnůpo vylíhnutí (50 - 55 dnů) Pokud mož no ihned od oplodnění (od č asného stádia gastruly) do 4 dnůpo vylíhnutí (8 - 9 dnů) Pokud mož no ihned od oplodnění (od č asného stádia gastruly ) do 5 dnůpo vylíhnutí (13 - 16 dnů) Pokud mož no ihned od oplodnění (od č asného stádia gastruly) do 4 dnůpo vylíhnutí (8 - 9 dnů)
Pro embrya. Pro plůdky. Temno pro embrya a plůdky do jednoho týdne po vylíhnutí, s výjimkou okamžikůprohlídky. Poté po dobu zkouš ky tlumené světlo.
Př ežití v kontrolních skupinách (minimální hodnota v %) Úspěš nost Po vylíhnutí líhnutí 80
90
66
70
80
75
80
80
60
70
DODATEK 3 ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO JINÉ DOBŘE POPSANÉ DRUHY Druh
Teplota (°C)
Salinita (‰)
Fotoperioda (h)
Délka stádií (d) Embryo
Váč kový plůdek
SLADKOVODNÍ Carassius auratus karas zlatý
24 ± 1
—
—
3-4
>4
Leopomis macrochirus sluneč nice modrá
21 ± 1
—
16
3
>4
22-25
15-22
12
1,5
10
Clupea harengus Sleď
10 ± 1
8-15
12
20-25
3-5
Gadus morhua Treska
5±1
5-30
12
14-16
3-5
Cyprinodon variegatus
25 ± 1
15-30
12
—
—
MOŘSKÝ Menidia peninsulae
Typická délka zkouš ky
Př ež ití v kontrolních skupinách (minimální hodnota v %) Úspě š nost Po vylíhnutí líhnutí
Pokud mož no ihned od oplodnění — (od č asného stádia gastruly) do 4 dnůpo vylíhnutí (7 dnů) Pokud mož no ihned od oplodnění — (od č asného stádia gastruly) do 4 dnůpo vylíhnutí (7 dnů)
80
Pokud mož no ihned od oplodnění (od č asného stádia gastruly) do 5 dnůpo vylíhnutí (6 - 7 dnů) Pokud mož no ihned od oplodnění (od č asného stádia gastruly) do 3 dnůpo vylíhnutí (23 - 27 dnů) Pokud mož no ihned od oplodnění (od č asného stádia gastruly) do 3 dnůpo vylíhnutí (18 dnů) Pokud mož no ihned od oplodnění (od č asného stádia gastruly) do 4/7 dnůpo vylíhnutí (28 dnů)
80
60
60
80
60
80
> 75
80
75
NĚKTERÉ VODY
CHEMICKÉ
DODATEK 4 CHARAKTERISTIKY
Látka Nerozpuš těné látky Celkový organický uhlík Nedisociovaný amoniak Zbytkový chlor Celkové organofosforové pesticidy Celkové organochlorové pesticidy a polychlorované bifenyly Celkový organický chlor
PŘIJATELNÉ
ŘEDICÍ
Koncentrace < 20 mg/l < 2 mg/l < 1 µg/l < 10 µg/l < 50 ng/l < 50 ng/l < 25 ng/l
XVI. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ ORÁLNÍ TOXICITY PRO VČELU MEDONOSNOU – metoda C.16 podle přílohy smě rnice 2001/59/ES XVI.1 XVI.1.1
XVI.1.2
XVI.1.3
METODA Tato zkouš ka akutní toxicity je replikou metody OECD TG 213 (1998). ÚVOD Tato zkouš ka toxicity je laboratorní metodou určenou k posouzení orální akutní toxicity př ípravkůna ochranu rostlin a jiných chemických látek pro dospě lou dělnici vč ely medonosné. Př i posuzování a hodnocení toxických charakteristik látek můž e být nezbytné stanovení akutní orální toxicity pro včelu medonosnou, např . může-li dojít k expozici vč el dané chemické látce. Zkouš ka akutní orální toxicity se provádí s cílem stanovit vlastní toxicitu pesticidůa jiných chemických látek pro vč ely. Výsledky této zkouš ky by mě ly být použ ity pro formulování potř eby dalš ího posuzování. Tato metoda můž e být použ ita zejména ve stupňovaných programech hodnocení nebezpečnosti pesticidůpro vč ely založených na postupném př echodu od laboratorních zkouš ek k semi-polním experimentům (1). Pesticidy mohou být zkouš eny ve forměúč inné látky (ú. l.) nebo ve forměformulovaných př ípravků. K ově ř ení citlivosti včel a př esnosti zkuš ebního postupu se použ ije referenč ní látka. DEFINICE Akutní orální toxicita: je nepř íznivý úč inek, ke kterému dojde nejpozdě ji do 96 h od orálního podání jedné dávky zkouš ené látky. Dávka: je množ ství požité zkouš ené látky. Dávka se vyjadř uje hmotností (µg) zkouš ené látky na jeden testovací organismus (µg na vč elu). Skutečnou dávku u kaž dé vč ely nelze vypoč ítat, neboťse včely krmí kolektivně. Lze vš ak odhadnout průmě rnou dávku (celkové pož ité množství zkouš ené látky dě lené poč tem včel v klícce). LD50 (stř ední letální dávka) orálně: je statisticky vypočtená jednotlivá dávka látky, která může po orálním podáním způsobit úhyn 50 % jedinců. Hodnota LD50 se vyjadř uje v µg zkouš enou látky na jednu vč elu. U pesticidů muž e být zkouš enou látkou buď účinná látka (ú. l) nebo formulovaný př ípravek obsahující jednu nebo více účinných látek. Mortalita: jedinec se považuje za uhynulý, jeli zcela nepohyblivý. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY Dospělé dě lnice vč ely medonosné (Apis mellifera) se exponují ř adědávek zkouš ené látky rozptýlené do cukerného roztoku. Vč ely jsou poté krmeny
stejným roztokem neobsahujícím zkouš enou látku. Mortalita se zaznamenává denněběhem alespoň48 hodin a porovnává se s kontrolními hodnotami. Jestliže mortalita v průběhu 24 a 48 h roste, zatímco kontrolní mortalita zůstává na př ijatelné úrovni, tj. ≤10 %, je vhodné zkouš ku prodloužit na maximálně96 h. Výsledky zkouš ky se analyzují s cílem vypoč ítat LD50 pro 24 h a 48 h a v př ípaděprodlouž ené studie pro 72 h a 96 h. XVI.1.4 VALIDITA ZKOUŠKY Má-li být zkouš ka platná, musí být splněny následující podmínky: — průmě rná mortalita u vš ech kontrolních skupin nesmí na konci zkouš ky př ekroč it 10 %, — LD50 pro referenční látku odpovídá př edpokládané hodnotě. XVI.1.5 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY XVI.1.5.1 Vč elstvo Použ ijí se mladé dospě lé vč ely dě lnice z téhožplemena, tj. včely stejného stář í, stejněkrmené, stejného druhu atd. Vč ely by měly být získány z př imě ř eněkrmeného, zdravého vč elstva s matkou, pokud možno bez nemocí a se známou anamnézou a fyziologickým stavem. Mě ly by být vybrány ráno v den zkouš ky nebo by mě ly být vybrány več er př ed zkouš kou a drženy v podmínkách zkouš ky do př íš tího dne. Vhodné jsou vč ely z plástůbez plůdků. Vč ely by nemě ly být vybírány brzy na jař e nebo pozděna podzim, neboťse během tě chto období fyziologicky mě ní. Musí-li být zkouš ky provedeny brzy na jař e nebo pozděna podzim, měly by se včely vylíhnout v inkubátoru a mě ly by být ž iveny plástovým pylem (pyl sebraný z plástu) a cukrovým roztokem. Vč ely oš etř ované chemickými látkami, jako jsou antibiotika a prostř edky proti varoáze, by nemě ly být použity pro zkouš ky toxicity po č tyř i týdny od konce posledního oš etř ení. XVI.1.5.2 Podmínky chovu a krmení Použ ijí se snadno č istitelné a dobř e vě trané klícky. Lze použ ít jakýkoli vhodný materiál, např . klícky z korozivzdorné oceli, pletiva, plastu nebo jednorázové dř evě né klícky atd. Nasazují se pokud možno skupiny po 10 vč elách. Velikost zkuš ebních klícek by mě la vyhovovat poč tu vč el, tj. měla by poskytovat dostatek prostoru. Vč ely by mě ly být drženy v temnu v experimentální místnosti př i teplotě 25 ± 2 °C. Po dobu zkouš ky se zaznamenává relativní vlhkost, která je obvykle 50 – 70 %. Obsluha, vč etněexponování a pozorování, můž e být prováděna za (denního) svě tla. Jako potrava se používá vodný roztok cukru o konečné koncentraci 500 g·l-1 (50% (m/V)). Po podání zkuš ební dávky se podává potrava podle libosti. Systém krmení by mě l umož ňovat zaznamenání př íjmu potravy pro každou klícku (viz bod 1.6.3.1). Lze použ ít skleně nou trubičku (př ibliž ně50 mm dlouhou, s průmě rem 10 mm, zúženou na otevř eném konci na průměr asi 2 mm). XVI.1.5.3 Příprava vč el Shromáždě né vč ely se náhodněrozdě lí do klícek, které se náhodněumístí v experimentální místnosti. Př ed zač átkem zkouš ky mohou vč ely až2 h hladově t. Doporuč uje se, aby nebyla včelám př ed expozicí podávána potrava, aby byly na zač átku zkouš ky rovnocenné, pokud jde o obsah zaž ívacího ústrojí. Vč ely v agónii se př ed zahájením zkouš ky nahradí zdravými vč elami.
XVI.1.5.4 Příprava dávek Je-li zkouš ená látka mísitelná s vodou, můž e být rozptýlena př ímo v 50% cukerném roztoku. U technických př ípravkůa látek s nízkou rozpustností ve voděmohou být použita vehikula, jakou jsou organická rozpouš tě dla, emulgátory nebo dispergátory s nízkou toxicitou pro vč ely (např . aceton, dimethylformamid, dimethylsulfoxid). Koncentrace vehikula závisí na rozpustnosti zkouš ené látky a mě la by být stejná pro vš echny zkouš ené koncentrace. Obecněje př iměř ená 1% koncentrace vehikula a nemě la by být př ekrač ována. Př ipraví se vhodné kontrolní roztoky, tzn. Použ ijí-li se k rozpuš tění zkouš ené látky rozpouš tědlo nebo dispergátor, použijí se dvěsamostatné kontrolní skupiny: roztok ve vodě a cukerný roztok s rozpouš tě dlem/nosič em v koncentraci použ ité v dávkách. XVI.1.6 POSTUP XVI.1.6.1 Zkuš ební a kontrolní skupiny Poč et zkouš ených dávek a jejich opakování by měl splňovat statistické pož adavky na stanovení LD 50 na úrovni spolehlivosti 95 %. Zpravidla se pro zkouš ku pož aduje alespoň pě t zkuš ebních koncentrací tvoř ících geometrickou ř adu s faktorem nepř ekrač ujícím 2,2 a pokrývajících rozsah pro LD50. Ředicí faktor a poč et koncentrací pro dávkování se vš ak stanoví s ohledem na smě rnici kř ivky toxicity (dávka versus mortalita) a s ohledem na statistickou metodu zvolenou pro analýzu výsledků. Vhodné koncentrace pro dávky je možné zvolit pomocí orientač ní zkouš ky. Kaž dá zkuš ební koncentrace se podá alespoňtř em paralelním zkuš ební skupinám o 10 vč elách. Vedle zkuš ebních skupin se nasadí alespoňtř i kontrolní skupiny, každá o 10 včelách. Nasadí se také zkuš ební skupiny pro použ ité rozpouš tě dlo nebo nosič(viz bod 1.5.4). XVI.1.6.2 Referenč ní látka V rámci zkuš ebních skupin se použ ije referenč ní látka. Vyberou se alespoňtř i dávky pokrývající oč ekávanou hodnotu LD50 . Pro kaž dou zkuš ební dávku se nasadí alespoňtř i paralelní klícky po deseti včelách. Př ednostní referenč ní látkou je dimethoát, pro ně jžse uvádí LD50 , 24 h, orálněv rozmezí 0,10 – 0,35 µg úč inné látky na včelu (2). Jsou vš ak př ijatelné i jiné referenč ní látky, pokud lze př edložit dostatek údajůpro ově ř ení oč ekávané reakce na dávku (např . parathion). XVI.1.6.3 Expozice XVI.1.6.3.1 Podávání dávek Kaž dé zkuš ební skupině vč el se podá 100 – 200 µl 50% vodného cukerného roztoku obsahujícího zkouš enou látku ve vhodné koncentraci. Vě tš í objem je nezbytný u látek s nízkou rozpustností, nízkou toxicitou nebo nízkou koncentrací ve formulaci, neboťv cukerném roztoku musí být použit větš í podíl. Sleduje se množ ství spotř ebované potravy se zkouš enou látkou. Po spotř ebování potravy (obvykle do 3 – 4 h) se z klícky odebere krmicí zař ízení a nahradí se krmicím zař ízením obsahujícím pouze cukerný roztok. Cukerný roztok se poté podává podle libosti. U ně kterých slouč enin může vést odmítnutí potravy s vysokými koncentracemi k tomu, že je spotř ebováno málo potravy nebo že se nespotř ebuje ž ádná potrava. Po maximálně6 h se nespotř ebovaná potrava se zkouš enou látkou nahradí samotným cukerným roztokem. Stanoví se
množství spotř ebované potravy se zkouš enou látkou (např . mě ř ením objemu nebo zváž ení nespotř ebované stravy). XVI.1.6.3.2 Délka zkouš ky Zkouš ka trvá 48 h od okamž iku, kdy byl zkuš ební roztok nahrazen samotným cukerným roztokem. Vzroste-li mortalita bě hem prvních 24 h o 10 %, zkouš ka se prodlouží na 96 h, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepř ekročí 10 %. XVI.1.6.4 Pozorování Mortalita se zaznamená po 4 h od zahájení zkouš ky a poté po 24 h a 48 h (rozumí se po podání dávky). Jeli nezbytné pozorování prodlouž it, provedou se dalš í vyhodnocení v 24hodinových intervalech až do maximálně 96 hodin, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepř ekrač uje 10 %. Odhadne se množ ství spotř ebované potravy. Porovnáním rychlostí spotř ebování potravy se zkouš enou látkou a bez ní lze získat informaci o př ijatelnosti potravy se zkouš enou látkou. Zaznamená se neobvyklé chování pozorované bě hem doby zkouš ky. XVI.1.6.5 Limitní zkouš ka V ně kterých př ípadech (např . oč ekává-li se u látky nízká toxicita) může být provedena limitní zkouš ka za použ ití 100 µg účinné látky na vč elu s cílem prokázat, ž e LD50 je vyš š í nežtato hodnota. Př i ní se postupuje stejným způsobem, tj. nasadí se tř i paralelní zkuš ební skupiny pro kaž dou zkuš ební koncentraci, odpovídající kontrolní skupiny, stanoví se množství spotř ebované potravy s účinnou látkou a použ ije se referenč ní látka. Dojde-li k úhynům, musí se provést úplná studie. Jsou-li pozorovány subletální úč inky (viz bod 1.6.4), zaznamenají se. XVI.2 DATA A ZPRÁVY XVI.2.1 DATA Data se shrnou do tabulky, př ič emžse pro každou zkuš ební skupinu, kontrolní skupiny a skupiny s referenč ní látkou uvede poč et použ itých vč el, mortalita v kaž dém pozorovacím č ase a počet vč el s nepř íznivě ovlivně ným chováním. Údaje o mortalitě se analyzují vhodnými statistickými metodami (např . probitovou analýzou, klouzavým průměrem, proložením binomického rozdě lení) (3, 4). Sestrojí se kř ivky závislosti dávka-odezva pro každý č as pozorování a vypočtou se smě rnice kř ivek a stř ední letální dávky (LD50 ) s 95% intervalem spolehlivosti. Korekce na mortalitu ve kontrolních skupinách lze provést Abbottovou korekcí (4, 5). Pokud nebyla potrava zcela spotř ebována, stanoví se spotř ebovaná dávka zkouš ené látky na skupinu. LD 50 se vyjádř í v µg zkouš ené látky na vč elu. XVI.2.2 PROTOKOL O ZKOUŠCE Protokol o zkouš ce musí obsahovat následující informace: XVI.2.2.1 Zkouš ená látka — fyzikální stav a relevantní fyzikálně chemické vlastnosti (např . stálost ve vodě, tlak par), — údaje o chemické identitěvč etněstrukturního vzorce, č istota, (tj. u pesticidůidentita a koncentrace úč inné látky (úč inných látek)). XVI.2.2.2 Testovací druh — vědecký název, plemeno, př ibliž né stář í (v týdnech), metoda výbě ru včel, datum výběru,
—
informace o vč elstvech použ itých pro výbě r testovacích včel, vč etně informací o zdravotním stavu, nemocech dospě lců, o př ípadné př ípravěatd. XVI.2.2.3 Zkuš ební podmínky — teplota a relativní vlhkost v experimentální místnosti, — podmínky chovu včetnětypu, velikosti a materiálu klícek, — metody př ípravy zásobních a zkuš ebních roztoků (jeli použito, uvede se rozpouš tědlo a jeho koncentrace), — metoda př ípravy zásobních roztokůa častost obnovení (jeli použ ito, uvede se solubilizač ní činidlo a jeho koncentrace), — uspoř ádání zkouš ky, např . použ ité zkuš ební koncentrace a jejich počet, počet kontrolních skupin, pro každou koncentraci a kontrolu počet paralelních klícek a počet včel na klícku, — datum zkouš ky. XVI.2.2.4 Výsledky — výsledky př edbě žné orientační zkouš ky, byla-li provedena, — primární údaje: mortalita pro kaž dou zkouš enou koncentraci v kaž dém č ase pozorování, — graf kř ivek závislosti dávka-odezva na konci zkouš ky, — hodnoty LD50 s 95% intervaly spolehlivosti pro každý doporučený čas pozorování a to pro zkouš enou látku a pro referenč ní látku, — statistické metody použité pro stanovení LD50, — mortalita v kontrolních skupinách, — jiné pozorované nebo namě ř ené biologické úč inky, např . neobvyklé chování vč el (vč etně odmítnutí zkuš ební dávky), rychlost spotř ebování potravy v exponovaných a neexponovaných skupinách, — jakákoli odchylka od zde popsaného zkuš ebního postupu a jiné důležité informace. XVI.3 LITERATURA (1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, str. 151 – 165. bř ezen 1993. (2) Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981 – 1992. J. Apicultur. Res. 22, str. 119 – 125. (3) Litchfield, J. T., Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharm. Exper. Ther., 96, str. 99 – 113. (4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York. (5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ. Entomol. 18, str. 265 – 267. XVII. METODA PRO STANOVENÍ AKUTNÍ KONTAKTNÍ TOXICITY PRO VČELU MEDONOSNOU – metoda C.17 podle přílohy smě rnice 2001/59/ES
METODA Tato zkouš ka akutní toxicity je replikou metody OECD TG 214 (1998). XVII.1.1 ÚVOD Tato zkouš ka toxicity je laboratorní metodou určenou k posouzení akutní kontaktní toxicity př ípravkůna ochranu rostlin a jiných chemických látek pro dospě lou dělnici vč ely medonosné. Př i posuzování a hodnocení toxických charakteristik látek můž e být nezbytné stanovení akutní kontaktní toxicity pro vč elu medonosnou, např . může-li dojít k expozici vč el dané chemické látce. Zkouš ka akutní kontaktní toxicity se provádí s cílem stanovit vlastní toxicitu pesticidůa jiných chemických látek pro vč ely. Výsledky této zkouš ky by mě ly být použ ity pro formulování potř eby dalš ího posuzování. Tato metoda může být použ ita zejména ve stupňovaných programech hodnocení nebezpečnosti pesticidůpro vč ely založ ených na postupném př echodu od laboratorních zkouš ek k semi-polním experimentům (1). Pesticidy mohou být zkouš eny ve forměúčinné látky (ú. l.) nebo ve forměformulovaných př ípravků. K ověř ení citlivosti vč el a př esnosti zkuš ebního postupu se použ ije referenční látka. XVII.1.2 DEFINICE Akutní kontaktní toxicita: je nepř íznivý úč inek, ke kterému dojde nejpozdě ji do 96 h od lokální aplikace jedné dávky zkouš ené látky. Dávka: je množ ství aplikované zkouš ené látky. Dávka se vyjadř uje v hmotnosti (µg) zkouš ené látky na jednoho zkuš ebního živoč icha (µg na vč elu). LD50 (stř ední letální dávka) kontaktně : je statisticky vypoč tená jednotlivá dávka látky, která může po kontaktní aplikaci způsobit úhyn 50 % jedinců. Hodnota LD50 se vyjadř uje v µg zkouš ené látky na jednu vč elu. U pesticidůmuže být zkouš enou látkou buďúč inná látka (ú. l) nebo formulovaný př ípravek obsahující jednu nebo více účinných látek. Mortalita: jedinec se považuje za uhynulý, je-li zcela nepohyblivý. XVII.1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY Dospělé dě lnice vč ely medonosné (Apis mellifera) se exponují ř adědávek zkouš ené látky rozpuš tě né ve vhodném nosič i př ímou aplikací na hrudník (jako kapičky). Zkouš ka trvá 48 h. Jestliž e mortalita v průběhu 24 a 48 h roste, zatímco kontrolní mortalita zůstává na př ijatelné úrovni, tj. 10 %, je vhodné zkouš ku prodloužit na maximálně 96 h. Mortalita se zaznamenává denněa porovnává se s kontrolními hodnotami. Výsledky zkouš ky se analyzují s cílem vypoč ítat LD50 pro 24 h a 48 h a v př ípadě prodloužené studie pro 72 h a 96 h. XVII.1.4 VALIDITA ZKOUŠKY Má-li být zkouš ka platná, musí být splněny následující podmínky: — průmě rná mortalita u vš ech kontrolních skupin nesmí na konci zkouš ky př ekroč it 10 %, — LD50 pro referenční standard odpovídá specifikovanému rozsahu. XVII.1.5 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY XVII. 1.5.1 Výbě r vč el Použ ijí se mladé dospě lé vč ely dě lnice z téhožplemena, tj. včely stejného stář í, stejněkrmené, stejného druhu atd. Vč ely by měly být získány z př imě ř eněkrmeného, zdravého vč elstva s matkou, pokud možno bez XVII.1
XVII. 1.5.2
XVII. 1.5.3
XVII. 1.5.4
XVII.1.6 XVII.1.6.1
nemocí a se známou anamnézou a fyziologickým stavem. Mě ly by být vybrány ráno v den zkouš ky nebo by mě ly být vybrány več er př ed zkouš kou a drženy v podmínkách zkouš ky do př íš tího dne. Vhodné jsou vč ely z plástůbez plůdků. Vč ely by nemě ly být vybírány brzy na jař e nebo pozděna podzim, neboťse během tě chto období fyziologicky mě ní. Musí-li být zkouš ky provedeny brzy na jař e nebo pozděna podzim, měly by se včely vylíhnout v inkubátoru a mě ly by být ž iveny plástovým pylem (pyl sebraný z plástu) a cukrovým roztokem. Vč ely oš etř ované chemickými látkami, jako jsou antibiotika a prostř edky proti varoáze, by nemě ly být použity pro zkouš ky toxicity po č tyř i týdny od konce posledního oš etř ení. Podmínky chovu a krmení Použ ijí se snadno č istitelné a dobř e vě trané klícky. Lze použ ít jakýkoli vhodný materiál, např . klícky z korozivzdorné oceli, pletiva, plastu nebo jednorázové dř evě né klícky atd. Velikost zkuš ebních klícek by mě la vyhovovat poč tu vč el, tj. klícky by mě ly poskytovat dostatek prostoru. Nasazují se pokud možno skupiny po 10 vč elách. Vč ely by mě ly být drženy v temnu v experimentální místnosti př i teplotě 25 ± 2 °C. Po dobu zkouš ky se zaznamenává relativní vlhkost, která je obvykle 50 – 70 %. Obsluha, vč etněexponování a pozorování, můž e být prováděna za (denního) svě tla. Jako potrava se používá vodný roztok cukru o koneč né koncentraci 500 g·l -1 (50% (m/V)) a podává se za použ ití vč elího krmítka po dobu zkouš ky podle libosti. Lze použít skleně nou trubič ku (př ibližně50 mm dlouhou, s průmě rem 10 mm, zúž enou na otevř eném konci na průmě r asi 2 mm). Příprava vč el Shromáždě né vč ely mohou být za úč elem aplikace zkuš ební látky narkotizovány oxidem uhličitým nebo dusíkem. Množství anestetika v doběexpozice by mě lo být minimalizováno. Vč ely v agónii se př ed zahájením zkouš ky nahradí zdravými vč elami. Příprava dávek Zkuš ební látka se aplikuje jako roztok v nosič i, tj. v organickém rozpouš tědle nebo ve voděse smáč edlem. Jako organické rozpouš tě dlo se upř ednostňuje aceton, mohou vš ak být použ ity i jiná rozpouš tě dla s nízkou toxicitou pro vč ely (např . dimethylformamid, dimethylsulfoxid). U formulovaných př ípravkůdispergovaných ve voděa u silněpolárních organických látek nerozpustných v organických nosičových rozpouš tědlech lze aplikaci usnadnit jejich rozpuš tění ve slabém roztoku komerč ního smáč edla (např . smáč edla Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween). Př ipraví se vhodné kontrolní roztoky, tzn. použ ijí-li se k rozpuš tě ní zkuš ební látky rozpouš tě dlo nebo dispergátor, použ ijí se dvěsamostatné kontrolní skupiny: roztok ve voděa roztok s rozpouš tě dlem/nosičem. POSTUP Zkuš ební a kontrolní skupiny Poč et zkouš ených dávek a jejich paralelních experimentůby mě l splňovat statistické požadavky na stanovení LD50 na hladiněspolehlivosti 95 %. Zpravidla se pro zkouš ku požaduje alespoňpě t zkuš ebních koncentrací tvoř ících geometrickou ř adu s faktorem nepř ekrač ujícím 2,2 a pokrývajících rozsah pro LD50. Poč et dávek se vš ak stanoví s ohledem na
smě rnici kř ivky toxicity (dávka versus mortalita) a s ohledem na statistickou metodu zvolenou pro analýzu výsledků. Vhodné dávky je možné zvolit pomocí orientač ní zkouš ky. Kaž dá zkuš ební koncentrace se podá alespoňtř em paralelním zkuš ební skupinám o 10 vč elách. Vedle zkuš ebních skupin se nasadí alespoňtř i kontrolní skupiny, kaž dá o 10 vč elách. Je-li použito organické rozpouš tě dlo nebo smáč edlo, zař adí se dalš í tř i kontrolní skupiny po 10 včelách pro rozpouš tědlo a smáč edlo. XVII.1.6.2 Referenč ní látka V rámci zkuš ebních skupin musí být použ ita referenč ní látka. Vyberou se alespoňtř i dávky pokrývající oč ekávanou hodnotu LD50 . Pro kaž dou zkuš ební dávku se nasadí alespoňtř i paralelní klícky po 10 včelách. Upř ednostňovanou referenč ní látkou je dimethoát, pro ně jžse uvádí LD50, 24 h, kontaktněv rozmezí 0,10 – 0,30 µg úč inné látky na vč elu (2). Jsou vš ak př ijatelné i jiné referenč ní látky, pokud lze př edlož it dostatek údajů pro ově ř ení oč ekávané reakce na dávku (např . parathion). XVII.1.6.3 Expozice XVII.1.6.3.1 Podávání dávek U narkotizovaných včel se jednotlivěprovede lokální aplikace. Vč ely se náhodněrozdě lí do různých zkuš ebních a kontrolních skupin. Objem 1 µl roztoku obsahující zkuš ební látku ve vhodné koncentraci se aplikuje mikroaplikátorem na zádovou oblast hrudníku každé včely. Mohou být použ ity i jiné objemy, je-li to opodstatněné. Po aplikaci se včely umístí do zkuš ebních klícek a zásobí se cukerným roztokem. XVII.1.6.3.2 Délka expozice Zkouš ka má trvat nejlépe 48 h. Jestliže mortalita v průbě hu 24 a 48 h roste, je vhodné zkouš ku prodlouž it na maximálně96 h, pokud kontrolní mortalita nepř ekračuje 10 %. XVII.1.6.4 Pozorování Mortalita se zaznamená po 4 h od aplikace a poté po 24 h a 48 h. Je-li nezbytné pozorování prodlouž it, provedou se dalš í vyhodnocení v 24hodinových intervalech aždo maximálně96 h, pokud mortalita v kontrolních skupinách nepř ekrač uje 10 %. Zaznamená se neobvyklé chování pozorované bě hem doby zkouš ky. XVII.1.6.5 Limitní zkouš ka V ně kterých př ípadech (např . oč ekává-li se u látky nízká toxicita) může být provedena limitní zkouš ka za použ ití 100 µg účinné látky na vč elu s cílem prokázat, ž e LD50 je vyš š í nežtato hodnota. Postupuje se stejným způsobem, vč etněnasazení tř í paralelních zkuš ebních skupin pro kaž dou zkuš ební dávku, odpovídajících kontrolních skupin a použití referenč ní látky. Dojde-li k úhynům, musí se provést úplná studie. Jsou-li pozorovány subletální účinky (viz bod 1.6.4), zaznamenají se. XVII.2. DATA A ZPRÁVY XVII.2.1 DATA Data se shrnou do tabulky, př ič emžse pro každou zkuš ební skupinu, kontrolní skupiny a skupiny s referenč ní látkou uvede poč et použ itých vč el, mortalita v kaž dém pozorovacím č ase a počet vč el s nepř íznivě ovlivně ným chováním. Údaje o mortalitě se analyzují vhodnými statistickými metodami (např . probitovou analýzou, klouzavým průměrem, proložením binomického rozdělení) (3, 4). Sestrojí se kř ivky
XVII.2.2 XVII.2.2.1
XVII.2.2.2
XVII.2.2.3
XVII.2.2.4
XVII.3
závislosti dávka-reakce pro každý č as pozorování (tj. 24 h, 48 h a podle potř eby 72 h, 96 h) a vypočtou se smě rnice kř ivek a stř ední letální dávky (LD50) s 95% intervalem spolehlivosti. Korekce na mortalitu v kontrolních skupinách lze provést Abbottovou korekcí (4, 5). LD 50 se vyjádř í v µg zkuš ební látky na vč elu. PROTOKOL O ZKOUŠCE Protokol o zkouš ce musí obsahovat následující informace: Zkouš ená látka — fyzikální stav a fyzikálně -chemické vlastnosti (např . stálost ve vodě , tlak par), — údaje o chemické identitěvč etněstrukturního vzorce, č istota, (tj. u pesticidůidentita a koncentrace úč inné látky (úč inných látek)). Testovací druh — vědecký název, plemeno, př ibliž né stář í (v týdnech), metoda výbě ru shromáž dě ní vč el, datum výbě ru, — informace o vč elstvech použ itých pro shromáždě ní testovacích vč el, včetně informací o zdravotním stavu, nemocech dospě lců, o př ípadné př ípravěatd. Zkuš ební podmínky — teplota a relativní vlhkost v experimentální místnosti, — podmínky chovu včetnětypu, velikosti a materiálu klícek, — metody aplikace zkouš ené látky, např . použ ité nosné rozpouš tědlo, aplikovaný objem zkuš ebního roztoku, použ ité anestetikum, — uspoř ádání zkouš ky, např . použité zkuš ební dávky a jejich poč et, počet kontrolních skupin, pro každou dávku a kontrolu poč et paralelních klícek a počet včel na klícku, — datum zkouš ky. Výsledky — výsledky př edbě žné orientační zkouš ky, byla-li provedena, — primární data: data: mortalita pro kaž dou zkouš enou dávku v kaž dém č ase pozorování, — graf kř ivek závislosti dávka-odezva na konci zkouš ky; — hodnoty LD50 s 95% intervaly spolehlivosti pro každý doporučený čas pozorování, a to pro zkouš enou látku a referenč ní látku, — statistické metody použité pro stanovení LD50, — mortalita v kontrolních skupinách, — jiné pozorované nebo změ ř ené biologické úč inky a jakékoli neobvyklé reakce vč el, — jakákoli odchylka od zde popsaného zkuš ebního postupu metody a jiné důležité informace. LITERATURA (1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, str. 151 – 165. March 1993. (2) Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981 – 1992. J. Apicultur. Research 22, str. 119 – 125.
(3)
(4) (5)
Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. Exper. Ther., 96, str. 99 – 113. Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York. Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ. Entomol. 18, str. 265 – 267.
XVIII. METODA PRO STANOVENÍ ADSORPCE / DESORPCE V ROVNOVÁŽNÉM STAVU – metoda C.18 podle přílohy směrnice 2001/59/ES METODA Tato metoda je replikou metody OECD TG 106 pro stanovení půdní adsorpce/desorpce násadovou rovnovážnou metodou (Batch Equilibrium Method) (2000). XVIII.1.1 ÚVOD Tato metoda se opírá o okružní testy a seminářo výbě ru půd pro vývoj zkouš ky adsorpce (1, 2, 3, 4) a rovněžo existující národní metodiky (5, 6, 7, 8, 9, 10, 11). Studie adsorpce/desorpce jsou už iteč né pro získávání důlež itých informací o mobilitěa distribuci chemických látek v půdních, vodních a vzduš ných slož kách biosféry (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21). Informace lze použ ít k př edpově di nebo např . odhadu dostupnosti chemické látky pro rozklad, (22, 23), transformace a př íjmu organismy (24), vymývání půdním profilem, (16, 18, 19, 21, 25, 26, 27, 28); těkání z půdy (21, 29, 30); odtoku z půdního povrchu do vod (18, 31, 32). Data o adsorpci mohou být použ ita pro úč ely porovnání a modelování (19, 33, 34, 35). Rozdělení chemické látky mezi půdu a vodní fázi je složitý proces, který závisí na ř aděrůzných faktorů: na chemické povaze látky (12, 36, 37, 38, 39, 40), na charakteristikách půdy (4, 12, 13, 14, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49) a na klimatických faktorech, jako jsou sráž ky, teplota, sluneční svit a vítr. Poč etné fenomény a mechanismy účastnící se adsorpce chemické látky v půdě tedy nelze v celém rozsahu definovat zjednoduš eným laboratorním modelem, na jakém je založena tato metoda. Př estož e nelze tímto pokusem podchytit vš echny možné př ípady z životního prostř edí, poskytuje cenné informace o významnosti adsorpce chemické látky z hlediska životního prostř edí. Viz také obecný úvod. XVIII.1.2 POUŽITÍ Tato metoda je zaměř ena na odhad adsorpč ního/desorpč ního chování látky v půdách. Cílem je získat sorpč ní charakteristiky, které lze použ ít pro př edpově ďrozdě lení za nejrůzně jš ích podmínek v ž ivotním prostř edí; k tomuto úč elu se pro chemickou látku stanovují rovnováž né adsorpční koeficienty v různých půdách jako funkce půdních charakteristik (např . obsahu organického uhlíku, obsahu jílu, půdní textury a pH). Pro co nejš irš ího podchycení interakcí dané látky s půdami vyskytujícími se v př íroděmusí být použity př i zkouš ce různé druhy půd. V této metoděvyjadř uje adsorpce proces vázání chemické látky na půdní povrch; nerozliš uje se mezi různými adsorpčními procesy (fyzikální a chemickou adsorpcí) a procesy, jako jsou povrchově katalyzovaný XVIII.1.
rozklad, adsorpce velkých množ ství nebo chemická reakce. Adsorpce na koloidních č ásticích (průmě r < 0,2 µm) vznikajících v půděse nebere v úvahu. Půdními parametry, které jsou považovány za nejdůlež itě jš í, jsou: obsah organického uhlíku (3, 4, 12, 13, 14, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48), obsah jílu a půdní textura (3, 4, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48) a pro disociující slouč eniny také pH (3, 4, 42). Dalš ími půdními parametry, které mohou mít vliv na adsorpci/desorpci určité látky jsou efektivní kationtová výměnná kapacita (ECEC), obsah amorfních oxidůž eleza a hliníku, zejména u vulkanických a tropických půd (4) a rovně žmě rný povrch (49). Zkouš ka je navrž ena pro posouzení adsorpce chemické látky na různých druzích půd s různým obsahem organického uhlíku, jílu, různou půdní texturou a různým pH. Je trojstupňová: Stupeň1: Př edbě žná zkouš ka za úč elem stanovení: — pomě ru půda/roztok, — rovnováž ného adsorpč ního č asu a množství zkouš ené látky adsorbovaného v rovnováze, — adsorpce zkouš ené látky na stěnách zkuš ební nádoby a stálosti zkouš ené látky v průběhu zkouš ky. Stupeň2: Screeningová zkouš ka: studie adsorpč ní kinetiky a stanovení distribučních koeficientůKd a Kou pro pě t druhů půd a jednu koncentraci. Stupeň3: Stanovení Freundlichových isotherm za účelem zjiš tě ní vlivu koncentrace na velikost adsorpce na půdách. Studie desorpce prostř ednictvím desorpční kinetiky/ Freundlichových desorpč ních isotherm (dodatek 1). XVIII.1.3 DEFINICE A JEDNOTKY Symbol Ati
Definice procento adsorpce v č ase ti
Jednotky %
Aeq
procento adsorpce v adsorpční rovnováze
mads ( ti ) p
množství zkouš ené látky adsorbované na půdě µg v čase ti množství zkouš ené látky adsorbované na pů d ěza µg č asový interval ti
mads ti ) p ( mads p (eq) m0 ads
mm ( ti ) ads
mv (eq)
mpůda C zás C0 ads
C vod (ti )
C pads (eq)
%
množství zkouš ené látky adsorbované na půdě µg v adsorpč ní rovnováze množství zkouš ené látky ve zkuš ební nádoběna µg zač átku adsorpční zkouš ky A množství zkouš ené látky naměř ené v podílu ( va ) µg v okamžiku ti množství zkouš ené látky v roztoku v adsorpční µg rovnováze množství půdní fáze vyjádř ené v suché hmotnosti g půdy -3 hmotnostní koncentrace zásobního roztoku látky µg·cm poč áteč ní hmotnostní koncentrace zkuš ebního µg·cm -3 roztoku v kontaktu s půdou -3 hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v čase µg·cm ti, kdy je prováděna analýza množství látky adsorbované na půděv adsorpční µg·cm -3 rovnováze
Symbol ads C vod (eq)
V0 A
va
Definice hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v adsorpč ní rovnováze poč áteč ní objem vodné fáze v kontaktu s půdou bě hem adsorpční zkouš ky objem podílu, ve kterém je látka stanovována
Jednotky -3 µg·cm cm 3 cm
3
cm 3·g- 1
Kd
distribuční koeficient pro adsorpci
K ou
adsorpční koeficient normalizovaný na organický cm ·g uhlík distribuční koeficient normalizovaný na obsah cm 3·g- 1 organického materiálu 1- 1/n 3 1/n -1 Freundlichův adsorpční koeficient µg (cm ) ·g
K om ads
KF
1/ n
3
-1
3
-1
Dti
Freundlichův exponent procento desorpce v č ase ti
%
Dti
procento desorpce za č asový interval ti
%
K des
zdánlivý desorpční koeficient
cm ·g
K Fdes
Freundlichův desorpční koeficient
µg1- 1/n (cm 3) 1/n·g-1
Pov
množství zkouš ené látky desorbované z půdy v čase µg ti množství zkouš ené látky desorbované z půdy za µg č asový interval ti analyticky stanovené množ ství látky ve vodné fázi µg v desorpč ní rovnováze celkové množ ství zkouš ené látky desorbované µg v desorpč ní rovnováze množství látky, která zůstává adsorbovaná na půdě µg po uplynutí č asového intervalu ti množství látky, které zbylo (anižse adsorbovalo) po µg ustavení adsorpč ní rovnováhy, a to v důsledku nekvantitativní výmě ny objemu vodné fáze množství zkouš ené látky, které zůstalo adsorbované µg·g -1 na pů d ěv desorpč ní rovnováze -3 hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi µg·cm v desorpč ní rovnováze celkový objem vodné fáze v kontaktu s půdou cm 3 bě hem experimentu pro studium desorpční kinetiky provedeného sériovou metodou objem supernatantu odebraného ze zkuš ební nádoby cm 3 po dosaž ení adsorpč ní rovnováhy a nahrazeného stejným objemem 0,01M roztoku CaCl2 objem podílu odebraného k analýze od okamžiku ti cm 3 bě hem experimentu pro studium desorpční kinetiky provedeného sériovou metodou objem roztoku odebraného ze zkuš ební nádoby (i) cm 3 ke stanovení zkouš ené látky v experimentu pro studium desorpční kinetiky (paralelní metoda) objem roztoku odebraného ze zkuš ební nádoby ke cm 3 stanovení zkouš ené látky v desorpč ní rovnováze množstevní bilance % celkové množství zkouš ené látky extrahované µg z půdy a ze stě n zkuš ební nádoby ve dvou krocích objem supernatantu získaný po dosažení adsorpční cm 3 rovnováhy rozdě lovací koeficient oktanol/voda
pK a
disociač ní konstanta
des
mvod (ti ) mdes (ti ) vod mdes (eq) m des
mvod (eq)
mdes ( ti ) p mAvod
C pdes (eq) des
C vod (eq) VT VR vaD Vri VrF
MB mE Vrec
Symbol Sv
Definice rozpustnost ve vodě
Jednotky -1 g·l
XVIII.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY Známé objemy roztokůzkouš ené látky o známé koncentraci, znač ené nebo neznač ené radionuklidy, se v 0,01M CaCl2 př idají k půdním vzorkům o známé suš ině , které byly př edběž něuvedeny do rovnováhy s 0,01M CaCl2. Směs se př imě ř enou dobu protř epává. Půdní suspenze se poté oddě lí centrifugací a podle požadavkůzfiltruje a vodná fáze se analyzuje. Množ ství zkouš ené látky adsorbované na půdním vzorku se vypoč te z rozdílu mezi poč áteč ním množ stvím zkouš ené látky v roztoku a množstvím, které v něm zbylo na konci experimentu (nepř ímá metoda). Alternativnělze adsorbované množství zkouš ené látky stanovit také př ímo analýzou půdy (př ímá metoda). Tato metoda, která zahrnuje postupnou extrakci vhodným rozpouš tě dlem se doporuč uje v př ípadech, kdy nelze př esněstanovit rozdíl koncentrací látky v roztocích. Jde např íklad o tyto př ípady: adsorpce zkouš ené látky na stě nách zkuš ebních nádob, nestálost zkouš ené látky v pomě ru k délce experimentu, nízká adsorpce s malou změ nou koncentrace v roztoku a vysoká adsorpce, jejímždůsledkem je nízká koncentrace, kterou nelze př esněstanovit. Použ ije-li se látka znač ená radioizotopy, lze extrakci půdy obejít analýzou půdní fáze spoč ívající v jejím spálení a v mě ř ení kapalinovou scintilační spektrometrií. Mě ř ení kapalinovou scintilační spektrometrií je nespecifickou technikou, která nerozliš uje mezi mateř skými a transformač ními produkty; mě la by tedy být použ ita pouze tehdy, je-li zkouš ené chemická látka po celou dobu studie stálá. XVIII.1.5 INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE Chemikálie musí být analytické čistoty. Doporuč uje se použ ití radioizotopověneznačených zkouš ených látek se známým slož ením a alespoň95% č istotou, nebo zkouš ených látek znač ených radioizotopy, které mají známé složení a jsou radioizotopověč isté. U stopovač ů s krátkým poloč asem rozpadu musí být provedena korekce na rozpad. Př ed prováděním zkouš ek adsorpce-desorpce by mě ly být o zkouš ené látce známy tyto informace: a) rozpustnost ve vodě(A.6); b) tlak par (A.4) a/nebo Henryho konstanta; c) abiotický rozklad: hydrolýza jako funkce pH (C.7); d) rozdě lovací koeficient (A.8); e) snadná rozložitelnost (C.4) nebo aerobní a anaerobní transformace v půdě; f) pK a disociovatelných látek; g) př ímá fotolýza ve vodě(tj. UV-Vis absorpč ní spektrum ve vodě , kvantový výtěž ek) a fotodegradace v půdě . XVIII.1.6 POUŽITELNOST ZKOUŠKY Zkouš ka je použ itelná u látek, pro něžexistuje analytická metoda s dostateč nou správností. Důlež itým parametrem, který můž e ovlivnit spolehlivost výsledku, zejména př i nepř ímé metodě , je stálost zkouš ené látky po celou dobu zkouš ky. Je tedy nezbytné ově ř it stabilitu v př edbě žné studii; je-li v průbě hu zkouš ky pozorována transformace látky, doporuč uje se, aby byla v hlavní studii provedena analýza jak půdní, tak vodné fáze.
Obtíže mohou nastat př i provádě ní této zkouš ky u látek s nízkou -4 -1 rozpustností ve vodě(Sv < 10 g·l ) a rovně žu silněnabitých látek v důsledku toho, ž e koncentraci ve vodné fázi nelze změ ř it s dostateč nou správností. V tě chto př ípadech musí být podniknuty dalš í kroky. Doporuč ení pro ř eš ení těchto problémůje uvedeno v př ísluš ných č ástech této metody. Př i zkouš ení těkavých látek je tř eba dbát na to, aby nedoš lo v průbě hu studie ke ztrátám. XVIII.1.7 POPIS METODY XVIII.1.7.1 Př ístroje, pomůcky a reakč ní č inidla Standardní laboratorní vybavení, zejména: a) Zkumavky nebo nádoby pro provedení experimentů. Je důležité, aby tyto zkumavky nebo nádoby — patř ily k centrifuze, aby se minimalizovaly nepř esnosti v důsledku manipulace a př enáš ení, — byly z inertního materiálu, který minimalizuje adsorpci zkouš ené látky na jejich stě nách. b) Mísicí zař ízení: př eklápě cí mísičnebo rovnocenné zař ízení; mísič musí v průbě hu mísení udržovat půdu v suspenzi. c) Centrifuga: nejlépe vysokootáčková, např . s odstř edivým zrychlením > 3 000 g, s nastavením teploty, schopná odstř edit z vodného roztoku č ástice o průmě ru vě tš ím než0,2 µm. Kyvety by mě ly být bě hem tř epání a centrifugace opatř eny víčky, aby nedoš lo ke ztrátám tě kavých látek a vody; aby se minimalizovala adsorpce na víčkách, použ ijí se víč ka z neadsorbujících materiálů, např . víčka se závitem potažená teflonem. d) Volitelné: filtrační zař ízení; filtry o velikosti pórů0,2 µm, sterilní, na jedno použ ití. Zvláš tní pozornost by mě la být vě nována volbě filtrač ního materiálu, aby na ně m nedoš lo k žádným ztrátám zkouš ené látky; u š patněrozpustných zkouš ených látek se organický filtrač ní materiál nedoporuč uje. e) Analytické př ístroje vhodné pro mě ř ení koncentrace zkouš ené látky. f) Laboratorní suš árna umož ňující udrž ovat teplotu od 103 °C do 110 °C. XVIII.1.7.2 Charakterizace a výbě r půd Půdy by mě ly být charakterizovány tř emi parametry, které jsou považovány za nejdůlež itě jš í pro adsorpč ní kapacitu: obsahem organického uhlíku, obsahem jílu a půdní texturou a hodnotou pH. Jak již bylo uvedeno, (viz oddíl Použití), mohou mít vliv na dalš í adsorpci/desorpci určité látky fyzikálně -chemické charakteristiky půdy a měly by být v takových př ípadech zohledně ny. Metody použité pro charakterizaci půdy jsou velmi důlež ité a mohou významně ovlivnit výsledky. Doporuč uje se tedy, aby bylo podle odpovídající metody ISO (ISO-10390-1) pH mě ř eno v 0,01M CaCl2 (jde o roztok použitý př i zkouš ení adsorpce/desorpce). Doporučuje se rovněž , aby byly ostatní důlež ité půdní charakteristiky stanoveny standardními metodami (např . ISO „Handbook of Soil Analysis“); to umožní, aby byla analýza sorpč ních dat založ ena na mezinárodně standardizovaných půdních parametrech. Ně které existující standardní metody analýzy a
charakterizace půdy jsou uvedeny v literatuř e (50 – 52). Ke kalibraci metod zkouš ení půd se doporuč ují referenč ní půdy. Návod pro výběr půd pro adsorpční/desorpční experimenty je uveden v tabulce 1. Sedm vybraných druhůpůd pokrývá půdní druhy vyskytující se v mírném země pisném pásmu. V př ípadědisociovatelných zkouš ených látek by mě ly vybrané půdy pokrývat š irokých rozsah pH, aby bylo možné hodnotit adsorpci látky v její disociované a nedisociované formě. Návod k volběpoč tu různých půd, které mají být použ ity v jednotlivých stádiích zkouš ky, je uveden v bodě1.9. Provedení zkouš ky. Upř ednostňují-li se jiné druhy půd, mě ly by být charakterizovány stejnými parametry a jejich charakteristiky by se měly pohybovat ve stejném rozpětí jako v tabulce 1, tř ebaže kritériím neodpovídají př esně . Tabulka 1: Návod pro výbě r půdních vzorkůpro adsorpci/desorpci Obsah Obsah jílu Textura půdy1 organického (%) uhlíku (%) 4,5 - 5,5 1,0 - 2,0 65 - 80 jíl > 7,5 3,5 - 5,0 20 - 40 jílovitohlinitá 5,5 - 7,0 1,5 - 3,0 15 - 25 prachovitohlinitá 4,0 - 5,5 3,0 - 4,0 15 - 30 hlinitá 2 2, 3 2 < 4,0 - 6,0 < 0,5 - 1,5 < 10 - 15 hlinitopísčitá 2, 3 > 7,0 < 0,5 - 1,0 40 - 65 jílovitohlinitá/jíl < 4,5 > 10 < 10 písek/hlinitopísčitá Podle FAO a severoamerického systému (85). Hodnoty jednotlivých parametrůby měly pokud mož no lež et v uvedeném rozsahu. Vyskytnou-li se obtíž e př i hledání vhodného půdního materiálu, jsou př ijatelné hodnoty lež ící pod uvedeným minimem. U půd s obsahem organického uhlíku niž š ím než0,3 % může být poruš ena korelace mezi obsahem organického uhlíku a adsorpcí. Doporučují se tedy půdy s minimálním obsahem organického uhlíku 0,3 %.
Druh půdy
1 2 3 4 5 6 7 1 2
3
Rozsah pH (v 0,01M CaCl2)
XVIII.1.7.3 Sbě r a uchovávání půdních vzorků XVIII.1.7.3.1 Sbě r Není doporuč ena žádná specifická technika odbě ru vzorků; technika odbě ru závisí na úč elu studie (53, 54, 55, 56, 57, 58). Je tř eba zohlednit: a) nezbytné jsou informace o historii lokality; zahrnují informace o lokalitě , vegetaci, použ ití pesticidůnebo hnojiv, o biologických vnosech nebo náhodné kontaminaci. Pokud jde o popis místa odběru, mě la by být dodrž ena doporuč ení normy ISO o vzorkování půd (ISO 10381-6); b) místo odběru musí být definováno souř adnicemi UTM (Universal Transversal Mercator-Projection/European Horizontal Datum) nebo zeměpisnými souř adnicemi; to by mohlo umož nit opakovaný odběr dané půdy v budoucnu nebo usnadnit definování půdy podle různých klasifikač ních systémů použ ívaných v různých zemích. Kromětoho by mě la být vzorkován pouze horizont A do maximální hloubky 20 cm. Zvláš těje-li u půdního druhu č . 7 součástí půdy horizont 0 h, mě l by být zahrnut do vzorkování. Půdní vzorky by měly být př epravovány v kontejnerech a za teploty, jež zaruč í, že nedojde k výrazné změ něpůvodních charakteristik půdy. XVIII.1.7.3.2 Uchovávání
Př ednost se dává se použ ití čerstvěodebraných půd. Pouze není-li to možné, mohou být půdy uchovávány př i teplotěokolí, př ípadněvysuš ené na vzduchu. Pro dobu uchovávání neexistuje ž ádný doporuč ený limit, ale půdy uchovávané déle než tř i roky by mě ly být př ed použitím analyzovány na obsah organického uhlíku, pH a CEC (kationtovou výměnnou kapacitu). XVIII.1.7.3.3 Zpracování půdních vzorkůa jejich př íprava ke zkouš ce Půdy se vysuš í na vzduchu př i teplotěokolí (nejlépe př i 20 – 25 °C). Rozruš ení půd se provede minimální silou, aby se původní textura půdy změ nila co nejméně . Půdy se prosejí na sítu ≤2 mm; př i prosévání by měla být dodrž ována doporuč ení normy ISO (ISO 10381-6). Doporuč uje se opatrná homogenizace, neboťzlepš uje reprodukovatelnost výsledků. Vlhkost každé půdy se stanoví na tř ech dílčích vzorcích zahř íváním na 105 °C, dokud se významněmě ní hmotnost (př ibliž ně12 h). Ve vš ech výpoč tech je hmotností půdy hmotnost po suš ení (suš ina), tj. hmotnost půdy korigovaná na obsah vlhkosti. XVIII.1.7.4 Př íprava zkouš ené látky pro aplikaci na půdu Zkouš ená látka se rozpustí v 0,01M roztoku CaCl2 v destilované nebo deionisované vodě; roztok CaCl2 se použ ije jako vodná rozpouš tě dlová fáze ke zlepš ení centrifugace a minimalizaci kationtové výmě ny. Koncentrace zásobního roztoku by mě la být nejlépe o tř iř ády vyš š í než mez stanovitelnosti použ ité analytické metody. Tento práh zabezpeč uje př esnost měř ení s ohledem na metodiku, ježje základem tohoto postupu; kromětoho by měla být koncentrace zásobního roztoku pod rozpustností zkouš ené látky ve vodě . Zásobní roztok se př ipravuje nejlépe tě sněpř ed aplikací na půdní vzorky a uchovává se uzavř ený v temnu př i 4 °C. Skladovatelnost závisí na stálosti zkouš ené látky a na její koncentraci v roztoku. Pouze u š patněrozpustných látek (Sv < 10-4 g·l-1) můž e být nezbytné použ ít solubilizač ní č inidlo, je-li obtíž né zkouš enou látku rozpustit. Solubilizač ní činidlo: a) by mě lo být mísitelné s vodou, např . methanol nebo acetonitril, b) jeho koncentrace by nemě la př ekroč it 1 % celkového objemu zásobního roztoku a ješ těméněby ho mělo být v roztoku př icházejícím do kontaktu s půdou (nejlépe v koncentraci niž š í než0,1 %), a c) nemě lo by být surfaktantem nebo by nemělo podléhat solvolytickým reakcím se zkouš enou chemickou látkou. Použití solubilizač ního činidla by mělo být uvedeno a odůvodněno v př ehledu dat. Jinou mož ností u š patněrozpustných látek je jejich př imíchání do systému (spiking): zkouš ená látka se rozpustí v organickém rozpouš tě dle a alikvot se př idá do směsi půdy a 0,01M roztoku CaCl2 v destilované nebo deionisované vodě . Obsah organického rozpouš tě dla ve vodné fázi by měl být co nejniž š í a obvykle by nemě l př ekroč it 0,1 %. Nedostatkem př imíchání v organickém rozpouš tě dle je nereprodukovatelnost objemu. To můž e znamenat zanesení dalš í nepř esnosti, neboť koncentrace zkouš ené látky a spolurozpouš tědla nebývají ve vš ech zkouš kách tytéž . XVIII.1.8 PŘEDPOKLADY PRO PROVEDENÍ ZKOUŠKY ADSORPCE/DESORPCE XVIII.1.8.1 Analytická metoda Klíčovými parametry, které mohou mít vliv na správnost měř ení sorpce, jsou správnost metody analýzy jak roztoku, tak adsorbované fáze, stálost a
č istota zkouš ené látky, dosažení sorpč ní rovnováhy, velikost změ ny koncentrace v roztoku, pomě r půda/roztok a změ ny v půdní struktuř e bě hem ustavování rovnováhy (35, 59 – 62). Ně které př íklady týkající se problematiky správnosti jsou uvedeny v dodatku 2. Spolehlivost použ ité analytické metody musí být ově ř ována př i koncentracích, které se mohou vyskytnout v průběhu zkouš ky. Je na experimentátorovi, aby vyvinul vhodnou metodu s náležitou správností, př esností, reprodukovatelností, mezí stanovitelnosti a výtě ž kem. Návodem k provedení takové zkouš ky je níž e uvedený experiment. Vhodný objem 0,01M CaCl2, např . 100 cm3, se protř epává 4 h s např . 20 g půdy o vysoké adsorpční schopnosti, tj. s vysokým obsahem organického uhlíku a jílu; tato hmotnost a objem se mohou mě nit podle pož adavků analýzy, avš ak pomě r půda/roztok 1:5 je vhodnou výchozí hodnotou. Smě s se odstř edí a vodnou fázi lze zfiltrovat. K vodné fázi se př idá urč itý objem zásobního roztoku zkouš ené látky, aby bylo dosaž eno nominální hodnoty v koncentračním rozsahu, který se můž e vyskytnou v průbě hu zkouš ky. Tento objem by neměl př ekroč it 10 % koneč ného objemu vodné fáze, aby byl charakter roztoku př ed ustavením rovnováhy změně n co nejméně. Roztok se analyzuje. Založ í se jeden slepý pokus s půdou a roztokem CaCl2 (bez zkouš ené látky) s cílem odhalit náhodné chyby analytické metody a matricové jevy způsobené půdou. Mezi analytické metody, které mohou být použ ity v sorpč ních mě ř eních, patř í plynová chromatografie s kapalnou stacionární fází, (GLC), vysokoúč inná kapalinová chromatografie (HPLC), spektrometrie (např . GC/hmotnostní spektrometrie, HPLC/hmotnostní spektrometrie) a kapalinová scintilační spektrometrie (pro látky značené radioizotopy). Bez ohledu na použitou analytickou metodu se za př imě ř ené považují výtěž ky od 90 % do 110 % nominální hodnoty. Má-li být mož né provést stanovení a zhodnocení poté, co dojde k rozdělení, musí být meze stanovitelnosti analytické metody alespoňo dva ř ády niž š í nežnominální koncentrace. Charakteristiky a meze stanovitelnosti analytické metody použitelné pro provedení studií adsorpce hrají významnou roli př i definování zkuš ebních podmínek a př i celém experimentálním provedení zkouš ky. Tato metoda sleduje obecný experimentální postup a obsahuje doporuč ení a pokyny pro alternativní ř eš ení, jsou-li analytická metoda a laboratorní vybavení omezeny. XVIII.1.8.2 Výbě r optimálních pomě růpůda/roztok Výbě r vhodných pomě rů půda/roztok pro sorpč ní studie závisí na distribuč ním koeficientu Kd a na pož adovaném relativním stupni adsorpce. Změ na koncentrace látky v roztoku je určující pro statistickou správnost měř ení v důsledku formy adsorpční rovnice a omezení analytické metodiky př i stanovování koncentrace chemické látky v roztoku. V obecné praxi je tedy užiteč né urč it několik pevných pomě rů, pro ně žje adsorbovaný podíl vyš š í než20 %, nejlépe > 50 % (62), a dbát na to, aby byla koncentrace zkouš ené látky ve vodné fázi dostateč něvysoká pro její správné změ ř ení. To je zvláš tědůlež ité u vysokých adsorbovaných podílů. Vyhovující př ístup k výbě ru vhodných pomě růpůda/voda je založ en na odhadu hodnoty Kd buď př edběž nými studiemi, nebo zavedenými metodami odhadu (dodatek 3). Vhodný pomě r lze poté vybrat na základě
grafického provedení závislosti pomě ru půda/roztok na Kd pro daný adsorbovaný podíl (obrázek 1). V tomto grafickém vyjádř ení se př edpokládá, ž e je adsorpč ní rovnice lineární 1. Použ itelný poměr se získá upravením rovnice pro Kd (4) do tvaru rovnice (1): m V0 ads 0 1K d (1) mpůda mp (eq) nebo do její logaritmické formy př i př edpokladu ads m (eq) R = mpůda/V0 a Aeq % 100 p m0
(2)
Pomě r půda/roztok
Aeq % 100 log R log Kd log Aeq % 1 100
Distribuční koeficient Kd (cm 3·g-1) Obrázek 1. Vztah mezi poměry půda/roztok a hodnotou Kd př i různých adsorbovaných podílech zkouš ené látky Na obrázku 1 jsou uvedeny požadované pomě ry půda/roztok jako funkce Kd pro různé úrovněadsorpce. Např íklad př i poměru půda/roztok 1:5 a př i Kd rovno 20 by doš lo př ibliž něk 80% adsorpci. Má-li dojít př i téže hodnotěKd k 50% adsorpci, musí být použit pomě r 1:25. Tento př ístup k výbě ru vhodných pomě růpůda/roztok umožňuje výzkumníkovi pružně vyhově t experimentálním potř ebám. Obtíže nastávají v oblastech, kdy se chemická látka adsorbuje silněnebo velmi slabě. Je-li adsorpce nízká, doporučuje se pomě r půda/roztok 1:1, tř ebaž e u ně kterých vysloveně organických druhů půdy může být 1
ads Cpads (eq) = Kd · Cvod (eq)
k získání suspenze nezbytný nižš í pomě r. Analytická metodika mě ř ení malých změ n koncentrace roztoku musí být peč livá; v opačném př ípadě bude mě ř ení nepř esné. Na druhé straněse můž e př i velmi vysokých distribuč ních koeficientech Kd dospě t ažk poměru půda/roztok 1:100, má-li v roztoku zůstat významné množství chemické látky. Je vš ak tř eba dbát na dobré promíchání a musí být ponechána dostateč ná doba k tomu, aby systém dosáhl rovnováhy. Jiným př ístupem je v těchto extrémních př ípadech, kdy chybí vhodná metodika, odhadnutí hodnoty Kd metodou založ enou např íklad na hodnotách Pov (dodatek 3). Může být užiteč ný zvláš těu slaběadsorbovaných polárních chemických látek s P ov < 20 a u lipofilních/silněadsorbovaných chemických látek s Pov > 104. XVIII.1.9 PROVEDENÍ ZKOUŠKY XVIII.1.9.1 Zkuš ební podmínky Vš echny experimenty se provádějí př i teplotěokolí a pokud možno př i konstantní teplotěod 20 °C do 25 °C. Parametry odstř eďování by mě ly umožnit odstranit z roztoku částice větš í než0,2 µm. Tuto velikost mají nejmenš í č ástice považované za pevné č ástice a je hranicí mezi pevnými a koloidními č ásticemi. Návod ke stanovení parametrůodstř eďování je uveden v dodatku 4. Nezaruč uje-li centrifuga, ž e budou částice vě tš í než0,2 µm odstraně ny, mohla by být použ ita kombinace odstř eďování a filtrace př es 0,2µm filtry. Tyto filtry musí být z vhodného inertního materiálu, aby na nich nedoš lo kž ádným ztrátám zkouš ené látky. V kaž dém př ípadě by mě lo být ově ř eno, ž e př i filtraci nedochází k žádným ztrátám zkouš ené látky. XVIII.1.9.2 Stupeň1 – př edbě ž ná studie Úč el provedení př edbě žné studie byl již uveden v oddíle Použ ití. Návodem pro založ ení takové studie je níže navržený experiment. XVIII.1.9.2.1 Výběr optimálních poměrůpůda/roztok Použ ijí se dva půdní druhy a tř i poměry půda/roztok (š est experimentů). Jeden půdní druh s vysokým obsahem organického uhlíku a nízkým obsahem jílu a druhý půdní druh s nízkým obsahem organického uhlíku a vysokým obsahem jílu. Jsou navrženy následující poměry půda/roztok: — 50 g půdy a 50 cm3 vodného roztoku zkouš ené látky (poměr 1/1), — 10 g půdy a 50 cm3 vodného roztoku zkouš ené látky (poměr 1/5), — 2 g půdy a 50 cm3 vodného roztoku zkouš ené látky (poměr 1/25). Minimální množství půdy, se kterým lze experiment provést, závisí na laboratorním vybavení a na úč innostních charakteristikách použ itých analytických metod. Doporuč uje se vš ak použ ít alespoň1 g, a nejlépe 2 g, aby zkouš ka poskytla spolehlivé výsledky. Jeden kontrolní vzorek obsahující pouze zkouš enou látku v 0,01M CaCl2 (bez půdy) se podrobí naprosto stejným krokům jako zkuš ební systémy, s cílem ověř it stálost zkouš ené látky v roztoku CaCl2 a její mož nou adsorpci na stě nách zkuš ební nádoby. Stejnému zkuš ebnímu postupu se podrobí slepý vzorek s kaž dou půdou a 3 celkem 50 cm 0,01M roztoku CaCl2 (bez zkouš ené látky). Úč elem je kontrola pozaďových hodnot bě hem analýzy s cílem detekovat interferující látky nebo rozeznat kontaminované půdy. Vš echny experimenty vč etněkontrolních a slepých vzorkůse provedou alespoňdvojmo. Celkový poč et vzorků, které by mě ly být pro studii př ipraveny, lze odvodit z metodiky, podle které bude postupováno.
Metody pro př edbě žnou studii a hlavní studii jsou zpravidla stejné, výjimky jsou podle potř eby uvedeny. Vzorky vysuš ené na vzduchu se den př ed experimentem uvedou př es noc (12 h) do rovnováhy protř epáváním s 45 cm 3 0,01M CaCl2. Poté se urč itým objemem zásobního roztoku zkouš ené látky upraví koneč ný objem na 50 cm3. Tento objem př idaného zásobního roztoku: a) by neměl být vyš š í než10 % konečného objemu 50 cm 3 vodné fáze, aby byl charakter roztoku př ed ustavením rovnováhy změ něn co nejméně ; a b) měl by zajistit, ž e bude poč áteč ní koncentrace zkouš ené látky v kontaktu s půdou (C0) alespoňo dva ř ády vyš š í nežmez stanovitelnosti analytické metody; tento práh zabezpečuje mož nost provést př esné mě ř ení i př i vysoké adsorpci (> 90 %) a pozdě ji stanovit adsorpč ní izotermy. Doporuč uje se rovně ž, aby počáteč ní koncentrace látky (C0) pokud mož no nepř ekrač ovala polovinu hodnoty rozpustnosti látky. Př íklad výpoč tu koncentrace zásobního roztoku látky (Czás) je uveden níže. Př edpokládá se mez stanovitelnosti 0,01 µg·cm-3 a 90% adsorpce; poč áteční koncentrace zkouš ené látky v kontaktu s půdou by tedy mě la -3 být nejlépe 1 µg·cm (o dva ř ády vyš š í, nežje mez stanovitelnosti). Za př edpokladu, že bude př idán maximální doporuč ený objem zásobního 3 3 roztoku, tj. 5 cm do 45 cm 0,01M roztoku CaCl2 pro ustavení rovnováhy, (= 10% př ídavek zásobního roztoku v celkovém objemu 3 vodné fáze 50 cm ), by mě la být koncentrace zásobního roztoku 10 µg·cm -3; je o tř iř ády vyš š í nežmez stanovitelnosti analytické metody. Hodnota pH vodné fáze se měř í př ed kontaktem s půdou a po ně m, neboť hraje významnou roli v celém adsorpč ním procesu, zvláš těu disociujících látek. Smě s se protř epává, dokud se neustaví adsorpč ní rovnováha. Doba nezbytná k dosažení rovnováhy v půdě silně kolísá v závislosti na chemické látce a půdě ; zpravidla stač í 24 h (77). V př edbě žné studii lze vzorky odebírat postupněv průbě hu míchání po 48 h (např íklad 4, 8, 24, 48 h). Čas analýzy by mě l být volen pruž něs ohledem na pracovní plán laboratoř e. Existují dvěmož nosti, jak provádět analýzu zkouš ené látky ve vodném roztoku: a) paralelní metoda a b) sériová metoda. Je tř eba zdůraznit, že ačkoli je paralelní metoda experimentálněnároč ně jš í, je její matematické zpracování jednoduš š í (dodatek 5). Volba metodiky, podle které bude postupováno, se vš ak ponechává na experimentátorovi, který bude muset zváž it dostupné laboratorní vybavení a prostř edky. a) Paralelní metoda: pro kaž dý pomě r půda/roztok se př ipraví tolik vzorků, kolik bude č asů, v nichžse má provést vyš etř ení adsorpční kinetiky. Po centrifugaci a podle pož adavku po filtraci se z první zkuš ební nádoby odebere pokud možno celá vodná fáze a mě ř í se např . po 4 h; vodná fáze druhé zkuš ební nádoby se takto zpracuje a změř í po 8 h, vodná fáze tř etí zkuš ební nádoby se takto zpracuje a změř í po 24 h atd. b) Sériová metoda: pro kaž dý poměr půda/roztok se př ipraví pouze dva vzorky. V definovaných č asových intervalech se smě s zcentrifuguje a fáze se oddě lí. Malý podíl vodné fáze se ihned analyzuje na zkouš enou látku; v experimentu se poté pokrač uje s původní smě sí. Následuje-li po centrifugaci filtrace, měla by mít laboratořzař ízení
pro filtraci malých podílůvodné fáze. Doporuč uje se, aby celkový objem odebraného podílu nepř esahoval 1 % celkového objemu roztoku, aby se významněnezmě nil pomě r půda/roztok a aby se nesníž ilo množství rozpuš těné látky dostupné bě hem zkouš ky pro adsorpci. Procento adsorpce Ati se pro kaž dý č as (ti ) vypočte z nominální poč áteční koncentrace a namě ř ené koncentrace v odběrovém č ase (t i) po korekci na hodnoty ze slepého pokusu. Sestrojí se kř ivky závislosti Ati na čase (obrázek 1 v dodatku 5) za úč elem odhadu míry dosaž ení rovnovážného plató2. Rovně žse vypočte hodnota Kd v rovnováze. Na základětéto hodnoty K d se z obrázku 1 vyberou vhodné pomě ry půda/roztok tak, aby adsorpce dosahovala více než20 % a nejlépe více než50 % (61). Vš echny př ísluš né rovnice a zásady pro sestrojování kř ivek jsou uvedeny v oddíle Data a zprávy a v dodatku 5. XVIII.1.9.2.2 Stanovení rovnováž ného adsorpč ního č asu a množ ství zkouš ené látky adsorbovaného v rovnováze ads Jak jižbylo uvedeno, umož ňuje kř ivka závislosti Ati nebo Cvod na č ase odhadnout dobu nezbytnou pro dosažení adsorpč ní rovnováhy a adsorbované množství zkuš ební látky v rovnováze. Př íklady tě chto kř ivek jsou na obrázcích 1 a 2 v dodatku 5. Rovnováž ný č as je č as nezbytný k tomu, aby bylo v systému dosaž eno plató. Nevyskytuje-li se u určité půdy plató, ale nepř etrž itý nárůst, můž e to být způsobeno komplikujícími faktory, jako jsou biologický rozklad a pomalá difuse. Biologický rozklad lze prokázat opakováním experimentu se sterilizovaným vzorkem půdy. Není-li ani v tomto př ípadědosaž eno plató, měl by experimentátor pátrat po jiném jevu, ke kterému by mohlo př i jeho studiích docházet; můž e tak uč init vhodnou změ nou experimentálních podmínek (teploty, doby protř epávání, poměrůpůda/roztok). Ponechává se na rozhodnutí experimentátora, zda bude pokrač ovat ve zkuš ebním postupu i př es př ípadné nedosaž ení rovnováhy. XVIII.1.9.2.3 Adsorpce na stě nách zkuš ební nádoby a stálost zkouš ené látky Ně které informace o adsorpci zkouš ené látky na stě nách zkuš ební nádoby a rovně žo stálosti zkouš ené látky lze odvodit z analýzy kontrolních vzorků. Pozoruje-li se úbytek vě tš í, nežby odpovídalo obvyklé chybě analytické metody, můž e docházet k abiotickému rozkladu a/nebo adsorpci na stě nách zkuš ební nádoby. Tyto dva jevy lze rozliš it důkladným omytím stě n nádoby známým objemem vhodného rozpouš tědla a analýzou výplachu na zkouš enou látku. Není-li zjiš tě na adsorpce na stě nách zkuš ební nádoby, je úbytek důkazem abiotické nestálosti zkouš ené látky. Je-li zjiš tě na adsorpce, je nezbytné změ nit materiál zkuš ebních nádob. Data o adsorpci na stěnách zkuš ebních nádob získaná v tomto experimentu vš ak nelze př ímo extrapolovat na experiment půda/roztok. Př ítomnost půdy bude mít na tuto adsorpci vliv. Dalš í informace o stálosti zkouš ené látky lze odvodit z množstevní bilance výchozí látky provedené po urč itém č ase. To znamená, že se na zkuš enou látku analyzují vodná fáze, extrakty půdy a stě ny zkuš ební nádoby. Rozdíl 2
K odhadu dosaž ení rovnováž ného plató by mohly být rovně žpouž ity kř ivky závislosti koncentrace ads zkouš ené látky ve vodné fázi ( C vod ) na č ase
mezi množstvím př idané zkouš ené látky a souč tem množství zkouš ené látky ve vodné fázi, v extraktech půdy a na stěnách zkuš ební nádoby je roven množ ství, které se rozlož ilo, vytěkalo a/nebo se neextrahovalo. Máli být provedena množ stevní bilance, mělo by být v doběexperimentu dosaž eno adsorpč ní rovnováhy. Množ stevní bilance se provede u obou druhůpůd a pro jeden pomě r půda/roztok u kaž dé půdy, u něhožje úbytek v rovnováze větš í než20 % a nejlépe větš í ně ž50 %. Je-li experiment pro nalezení poměru dokončen analýzou posledního vzorku po 48 hodinách, fáze se oddě lí centrifugací a podle pož adavkůfiltrací. Odebere se pokud mož no veš kerá vodná fáze a k půděse př idá vhodné extrakč ní rozpouš tě dlo (extrakč ní koeficient alespoň95 %) za úč elem extrakce zkouš ené látky. Doporuč ují se alespoň dvěextrakce za sebou. Stanoví se množství zkouš ené látky v půděa v extraktech ze zkuš ební nádoby a provede se množ stevní bilance (rovnice 10, Data a zprávy). Je-li nižš í než90 %, považ uje se zkouš ená látka za nestálou v poměru k délce zkouš ky. Studie vš ak můž e pokrač ovat, př ičemžse zohlední nestálost zkouš ené látky; v takovém př ípaděse doporuč uje, aby byly v hlavní studii analyzovány oběfáze. XVIII.1.9.3 Stupeň2 – adsorpč ní kinetika při jedné koncentraci zkouš ené látky Použ ije se pě t druhůpůd vybraných z tabulky 1. Je výhodné zahrnout mezi tě chto pě t půd ně které nebo vš echny půdy z př edběž né studie. V tomto př ípadě nemusí být stupeň2 opakován pro půdy použ ité v př edběž né studii. Rovnovážný č as, poměr půda/roztok, hmotnost půdního vzorku, objem vodné fáze v kontaktu s půdou a koncentrace zkouš ené látky v roztoku se volí na základěvýsledkůpř edbě žné studie. Analýzy se provádě jí nejlépe po 2, 4, 6, 8 (podle mož nosti také po 10) a 24 h kontaktu s půdou; protř epávání můž e být prodlouž eno ažna maximálně48 h u chemických látek, u nichžje pro dosažení rovnováhy podle výsledkůpř edbě žných studií nezbytný delš íč as. Časy, kdy má být provedena analýza, lze volit pruž ně. Kaž dý experiment (s jednou půdou a s jedním roztokem) se provede alespoňdvojmo, aby bylo mož né odhadnout rozptyl výsledků. S každým experimentem se provede slepý pokus. Provede se s půdou a s 0,01M roztokem CaCl2 bez zkouš ené látky a se stejnou hmotností a objemem jako v experimentu. Stejnému zkuš ebnímu postupu se podrobí kontrolní vzorek zkouš ené látky v 0,01M roztoku CaCl2 (bez půdy), který slouží jako pojistka proti neč ekaným výsledkům. Procento absorpce se vypoč te pro kaž dý č as ( Ati ) a pro kaž dý interval ( Ati ) (podle potř eby) a vynese se proti č asu. Rovněžse vypočtou distribuč ní koeficient Kd v rovnováze a adsorpč ní koeficient normalizovaný na obsah organického uhlíku Kou (pro nepolární organické chemické látky). Výsledky zkouš ky adsorpč ní kinetiky Pro popis sorpč ního chování v půděje zpravidla dostatečněpř esný lineární model Kd (35, 78), který je výrazem vlastní mobility chemických látek v půdě . Např íklad chemické látky s Kd 1 cm 3·g-1 jsou v zásadě považovány za zcela mobilní. Podobně byla MacCallem et al (16) vyvinuto klasifikač ní schéma mobility založené na hodnotách Kou. Kromě
toho existuje klasifikační schéma vymývatelnosti založ ené na vztahu mezi 1 Kou a DT-50 (1, 32, 79). Podle studií statistických chyb (61) nelze z poklesu koncentrace ve vodné fázi př esněodhadnout hodnoty Kd nižš í než0,3 cm 3·g-1, a to ani př i nejpř íznivě jš ím (z hlediska správnosti) pomě ru půda/roztok, tj. př i pomě ru 1:1. V takovém př ípaděse doporučuje analýza obou fází – půdy i roztoku. S ohledem na výš e uvedené poznámky se doporuč uje pokračovat ve studii adsorpč ního chování chemické látky v půděa její př ípadné mobility stanovením Freundlichových adsorpčních isotherm pro ty systémy, u nichžje př esné stanovení Kd mož né postupem, popsaným v této zkuš ební metodě . Př esné stanovení je možné, je-li souč in hodnoty Kd a pomě ru půda/roztok > 0,3 př i měř ení založ eném na poklesu koncentrace ve vodné fázi (nepř ímá metoda), nebo je-li > 0,1 př i analýze obou fází (př ímá metoda) (61). XVIII.1.9.4 Stupeň3 – adsorpční isothermy a desorpč ní kinetika/desorpč ní isothermy XVIII.1.9.4.1 Adsorpční isothermy Použ ije se pět koncentrací zkouš ené látky, nejlépe v rozsahu dvou ř ádů; př i volběkoncentrací se zohlední rozpustnost ve vodě a výsledná rovnovážná koncentrace ve vodné fázi. V průbě hu zkouš ky se u každé půdy použ ije tentýžpomě r půda/roztok. Adsorpč ní zkouš ka se provede výš e uvedenou metodou pouze s tím rozdílem, že se vodná fáze analyzuje pouze jednou po uplynutí doby, která je nezbytná pro dosažení rovnováhy a která byla stanovena dř íve ve stupni 2. Stanoví se rovnovážné koncentrace v roztoku a adsorbované množ ství se vypočte z úbytku zkouš ené látky v roztoku nebo př ímou metodou. Adsorbované množství na jednotku množ ství půdy se vynese jako funkce rovnovážné koncentrace zkouš ené látky (viz oddíl Data a zprávy). Výsledky z experimentu pro stanovení adsorpčních isotherm Z dosud navrž ených matematických modelů adsorpč ních isotherm se k popisu adsorpčních procesůpouž ívá Freundlichova isotherma nejčastě ji. Podrobně jš í informace o interpretaci a významu adsorpč ních modelůjsou uvedeny v literatuř e (41, 45, 80, 81, 82). Poznámka: Je tř eba poznamenat, že hodnoty KF (Freundlichových adsorpč ních koeficientů) pro různé látky lze porovnávat pouze tehdy, jsou-li hodnoty KF vyjádř eny ve stejných jednotkách (83). XVIII.1.9.4.2 Desorpční kinetika Úč elem tohoto experimentu je vyš etř it, zda je chemická látka adsorbována na půděvratněnebo nevratně. Tato informace je důležitá, neboťdesorpční proces hraje také důležitou roli v chování chemické látky v půdě . Desorpč ní data jsou kromětoho užiteč ným vstupem pro poč ítačové modelování vyluhování a pro simulaci vyplavování rozpuš tě ných látek. Je-li studie desorpce požadována, doporuč uje se, aby byla níže popsaná studie provedena na kaž dém systému, na kterém bylo v př edchozím experimentu pro studii adsorpční kinetiky mož né provést př esné stanovení Kd. Podobnějako u studie adsorpč ní kinetiky existují dvěmož nosti, jak postupovat př i experimentu pro studium desorpční kinetiky: a) paralelní metoda a b) sériová metoda. Volba metodiky, podle které bude 1
DT-50: doba rozkladu 50 % zkouš ené látky.
postupováno, se ponechává na experimentátorovi, který bude muset zváž it dostupné laboratorní vybavení a prostř edky. a) Paralelní metoda: pro kaž dou půdu zvolenou pro pokroč ení do studie desorpce se př ipraví tolik vzorků se stejným pomě rem půda/roztok, kolik bude č asů, v nichžse má studovat desorpční kinetika. Zvolí se nejlépe stejné č asové intervaly, jako u experimentu pro studium adsorpč ní kinetiky; celkový čas se vš ak prodlouž í podle potř eby, aby v systému bylo dosaženo rovnováhy. S každým experimentem (s jednou půdou a s jedním roztokem) se provede slepý pokus. Provede se s půdou a s 0,01M roztokem CaCl2 bez zkouš ené látky se stejnou hmotností a objemem jako v experimentu. Stejnému zkuš ebnímu postupu se podrobí kontrolní vzorek zkouš ené látky v 0,01M roztoku CaCl2 (bez půdy). Vš echny smě si půdy s roztokem se protř epávají do ustavení adsorpční rovnováhy (která se zjiš ť uje postupem uvedeným dř íve ve stupni 2). Poté se fáze oddě lí centrifugací a vodná fáze se pokud mož no kvantitativně odebere. Objem odebraného roztoku se nahradí stejným objemem 0,01M CaCl2 bez zkouš ené látky a nová smě s se opět protř epává. Kupř íkladu po 2 h se pokud možno kvantitativně odebere a změ ř í vodná fáze první zkuš ební nádoby, totéžse provede s vodnou fází druhé zkuš ební nádoby po 4 h, s vodnou fází tř etí zkuš ební nádoby po 6 h atd., aždo dosaž ení desorpč ní rovnováhy. b) Sériová metoda: po experimentu pro stanovení adsorpč ní kinetiky se smě s zcentrifuguje a vodná fáze se pokud možno kvantitativně odebere. Objem odebraného roztoku se nahradí stejným objemem 0,01M CaCl 2 bez zkouš ené látky. Nová smě s se protř epává aždo ustavení desorpční rovnováhy. Bě hem této doby se ve stanovených časových intervalech smě s centrifuguje za úč elem oddě lení fází. Malý podíl vodné fáze se ihned analyzuje na zkouš enou látku; v experimentu se poté pokrač uje s původní směsí. Objem každého jednotlivého podílu by měl být menš í než1 % celkového objemu. Ke smě si se př idá stejný objem č erstvého 0,01M roztoku CaCl2 , aby se zachoval pomě r půda/roztok, a v protř epávání se pokrač uje po dalš íč asový interval. Procento desorpce se vypoč te pro kaž dý čas ( Dti ) a pro kaž dý interval ( Dti ) (podle potř eb studie) a vynese se proti č asu. Rovněžse vypoč te hodnota desorpč ního koeficientu Kdes v rovnováze. Vš echny př ísluš né rovnice jsou uvedeny v oddíle Data a zprávy a v dodatku 5. Výsledky z experimentu pro studium desorpč ní kinetiky Společný graf kř ivek závislostí procenta desorpce Dti a adsorpce Ati na č ase umož ní posoudit vratnost adsorpč ního procesu. Je-li desorpční rovnováhy dosaž eno do dvojnásobku č asu potř ebného pro adsorpční rovnováhu a je-li celková desorpce vyš š í než75 % adsorbovaného množství, považuje se adsorpce za vratnou. XVIII.1.9.4.3 Desorpč ní isothermy Freundlichovy desorpč ní isothermy se vyš etř ují na půdách použitých ke stanovení adsorpč ních isotherm. Zkouš ka desorpce se provede způsobem popsaným v oddíle Desorpč ní kinetika, pouze s tím rozdílem, ž e se vodná fáze analyzuje pouze jednou, a to v desorpč ní rovnováze. Vypoč te se
desorbované množ ství zkouš ené látky. Množ ství zkouš ené látky, které zůstalo adsorbované na půděpo dosažení desorpční rovnováhy se vynese jako funkce rovnováž né koncentrace zkouš ené látky v roztoku (viz oddíl Data a zprávy a dodatek 5). XVIII.2 DATA A ZPRÁVY Data z analýzy se př edloží ve formětabulky (viz dodatek 6). Uvedou se jednotlivá mě ř ení a vypoč tené průmě rné hodnoty. Př edloží se grafy adsorpč ních isotherm. Výpoč ty se provedou níž e uvedeným způsobem. Pro úč ely zkouš ky se př edpokládá, že hmotnost 1 cm 3 vodného roztoku je 1 g. Pomě r půda/roztok můž e být vyjádř en stejným č íslem pro rozmě r hmot./hmot. i pro rozmě r hmot./obj. XVIII.2.1 ADSORPCE Adsorpce ( Ati ) je definována jako procentuální podíl látky z celkového množství látky na zač átku zkouš ky, který se za zkuš ebních podmínek naadsorboval na půdě . Je-li zkouš ená látka stálá a neadsorbuje se významněna stě nách nádoby, vypoč te se Ati pro každý č as z rovnice: mp ( ti ) 100 Ati % m0 ads
kde: Ati mads p (t ) i
=
kde: Cpads (eq)
=
ads Cvod (eq)
=
mads p (eq)
=
(3)
procento adsorpce v č ase t i (%);
množství zkouš ené látky adsorbované na půdě vč ase ti (µg); m0 = množství zkouš ené látky ve zkumavce na zač átku zkouš ky (µg); Podrobné informace o způsobu výpoč tu procenta adsorpce Ati pro paralelní a sériovou metodu jsou uvedeny v dodatku 5. Distribuční koeficient Kd je pomě r mezi množ stvím látky v půděa hmotnostní koncentrací látky ve vodném roztoku za zkuš ebních podmínek a př i dosaž ení adsorpč ní rovnováhy. C ads (eq) mpads (eq) V0 K d pads ads cm 3 g 1 (4) Cvod (eq) mvod (eq) mpůda
ads
=
mv (eq)
=
mpůda
=
v0
=
množství látky adsorbované na půděv adsorpční rovnováze (µg·g-1) hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v adsorpč ní rovnováze (µg·cm -3). Tato koncentrace se stanoví analyticky a zohlední se hodnoty ze slepých pokusů množství zkouš ené látky adsorbované na půdě v adsorpč ní rovnováze (µg) množství zkouš ené látky v roztoku v adsorpční rovnováze (µg) množství půdní fáze vyjádř ené v suché hmotnosti půdy (g) poč áteční objem vodné fáze v kontaktu s půdou
(cm 3). Vztah mezi Aeq a Kd je dán rovnicí: Aeq V0 Kd cm3 g 1 (5) 100 Aeq m půda kde: Aeq = procento adsorpce v adsorpč ní rovnováze, %. Vztah adsorpč ního koeficientu normalizovaného na obsah organického uhlíku Kou, distribuč ního koeficientu Kd a obsahu organického uhlíku v půdním vzorku je následující: 100 3 1 Kou Kd cm g (6) % ou kde: % ou = procentuální obsah organického uhlíku v půdním vzorku (g·g-1). Koeficient Kou je jedinou velič inou, která charakterizuje rozdě lení hlavně anorganických nepolárních látek mezi organickým uhlíkem v půděnebo sedimentu a vodou. Adsorpce těchto chemických látek koreluje s obsahem pevného sorbujícího organického materiálu (7); hodnoty Kou závisí na specifických charakteristikách humózních frakcí, jejichžsorpč ní kapacit se významněliš í z důvodu původu, vzniku atd. XVIII.2.1.1 Adsorpč ní isothermy Rovnice Freundlichových adsorpčních isotherm vyjadř ují vztah mezi adsorbovaným množstvím zkouš ené látky a koncentrací zkouš ené látky v roztoku v rovnováze (rovnice 8). Data se zpracovávají jako v oddíle o adsorpci a pro kaž dou zkuš ební nádobu se vypoč te množství zkouš ené látky adsorbované na půděpo ads adsorpč ní zkouš ce ( Cp (eq) ), jinde označ eno jako x/m). Př edpokládá se, ž e rovnováhy bylo dosaž eno a ž e Cpads (eq) př edstavuje rovnovážnou hodnotu: ads ads C0 Cvod (eq) V0 mp (eq) ads (7) Cp (eq) g g 1 mpùda mpùda Freundlichova adsorpční rovnice má tento tvar (8): ads Cpads (eq) K Fads Cvod (eq)
1
n
g g 1
(8)
nebo v lineární formě: ads log Cpads (eq) log K Fads 1 n log Cvod (eq) (9) kde: = Freundlichův adsorpč ní koeficient; má rozmě r KFads 3 -1 cm ·g pouze tehdy, je-li 1/n = 1; v ostatních př ípadech se smě rnice 1/n projeví v rozmě ru 1n K Fads g1-1 n cm 3 g -1 n = regresní konstanta; 1/n se zpravidla pohybuje od 0,7 do 1,0, cožznamená, že jsou sorpč ní data č asto nelineární.
Rovnice (8) a (9) se vyjádř í graficky a hodnoty K Fads a 1/n se zjistí regresní analýzou s ohledem na rovnici 9. Vypoč te se rovněžkorelační koeficient r2 prolož ení logaritmické rovnice. Př íklad takové kř ivky je uveden na obrázku 2. A Pů da
A Půda
A Vod
Obrázek 2
A Vod
Freundlichovy adsorpční kř ivky, normální a linearizovaná forma
XVIII.2.1.2 Hmotnostní bilance Hmotnostní bilance (MB) je definována jako procentuální podíl látky z nominálního množství látky na začátku zkouš ky, který lze znovu analyticky vyzískat po adsorpč ní zkouš ce. Zpracování dat se bude liš it podle toho, zda je rozpouš tě dlo neomezeně mísitelné s vodou. V př ípaděrozpouš tě del mísitelných s vodou mohou být data zpracována pro stanovení množství látky znovu získané extrakcí rozpouš tědlem stejným způsobem, jako v oddíle o desorpci. Je-li rozpouš tědlo mísitelné s vodou omezeně , musí být provedeno stanovení množství znovu získané látky. Hmotnostní bilance pro adsorpci se vypoč te níž e uvedeným způsobem; jako mE se označ í souč et množství zkuš ební látky extrahovaných organickým rozpouš tě dlem z půdy a ze stěn zkuš ební nádoby: ads Vrec Cvod (eq) mE 100 % (10) MB = V0 C0 kde: MB mE
= =
C0
=
Vrec
=
hmotnostní bilance (%) celkové množ ství zkouš ené látky extrahované z půdy a ze stě n zkuš ební nádoby ve dvou krocích (µg) poč áteč ní hmotnostní koncentrace zkuš ebního roztoku v kontaktu s půdou (µg·cm -3) objem supernatantu vyzískaný po dosaž ení adsorpč ní rovnováhy (cm -3)
XVIII.2.2 DESORPCE Desorpce (D) je definována jako podíl zkuš ební látky z dř íve adsorbovaného množ ství, který se za zkuš ebních podmínek desorboval: des mv (ti ) Dti ads 100 % (11) mp (eq) kde:
Dti
=
mdes vod (t i )
=
procento desorpce v č ase t i (%)
množství zkouš ené látky desorbované z půdy vč ase t i (µg) des = množ ství zkouš ené látky adsorbované na půdě mpùda (eq) v adsorpč ní rovnováze (µg) Podrobné informace o způsobu výpoč tu procenta desorpce Dti pro paralelní a sériovou metodu jsou uvedeny v dodatku 5. Zdánlivý desorpč ní koeficient (Kdes) je za zkuš ebních podmínek pomě r mezi množstvím zkouš ené látky, která zůstala v půděa hmotnostní koncentrací desorbované látky ve vodném roztoku po dosažení desorpč ní rovnováhy: mads (eq) mdes (eq) VT p vod K des cm 3 g 1 (12) des mvod (eq) mpùda kde: Kdes = desorpč ní koeficient (cm3·g-1) = celkové množství zkouš ené látky desorbované mdes vod (eq) z půdy v desorpč ní rovnováze (µg) VT = celkový objem vodné fáze v kontaktu s půdou bě hem zkouš ky desorpč ní kinetiky (cm3 ) Návod pro výpoč et hodnoty mdes vod (eq) je uveden v dodatku 5 v oddíle o desorpci. Poznámka: Provede-li se př edcházející adsorpč ní zkouš ka paralelní metodou, je objem VT v rovnici 12 roven V0. XVIII.2.2.1 Desorpční isothermy Rovnice Freundlichových desorpčních isotherm vyjadř ují vztah mezi množstvím zkouš ené látky, které zůstalo adsorbované na půdě a koncentrací zkouš ené látky v roztoku v desorpční rovnováze (rovnice 16). Pro každou zkuš ební nádobu se množství zkouš ené látky, které zůstalo v desorpč ní rovnováze adsorbované na půdě , vypoč te takto: ads des m (eq) m vod (eq) Cpdes (eq) p g g1 (13) mpůda des množství mvod (eq) je definováno takto:
V0 des A mdes mvod g vod (eq) mm (eq) F Vr kde: Cpdes (eq)
=
mdes m (eq)
=
mAvod
=
mdes vod (eq)
=
(14)
množství zkouš ené látky, které zůstalo adsorbované na půdě v desorpč ní rovnováze (µg·g-1) analyticky stanovené množství látky ve vodné fázi v desorpč ní rovnováze (µg) množství látky, které zbylo (anižse adsorbovalo) po ustavení adsorpč ní rovnováhy, a to v důsledku nekvantitativní výmě ny objemu vodné fáze, (µg) množství látky v roztoku v adsorpční rovnováze (µg)
V0 VR A ads mvod mvod (eq) V0 Vr F
=
(15)
objem roztoku odebraného ze zkuš ební nádoby ke stanovení zkouš ené látky v desorpč ní rovnováze (cm3) VR = objem supernatantu odebraného ze zkuš ební nádoby po dosaž ení adsorpč ní rovnováhy a nahrazeného stejným objemem 0,01M roztoku CaCl2 (cm3) Freundlichova desorpční rovnice vypadá takto (16): des 1n C des C des (16) g g1 p (eq) K F vod (eq) a v lineární formě: des log Cpdes (eq) log K Fdes 1 n log Cvod (eq) (17) kde: = Freundlichův desorpč ní koeficient KFdes n = regresní konstanta des = hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi Cvod (eq) v desorpč ní rovnováze (µg·cm-3). Rovnice 16 a 17 se vyjádř í graficky a hodnoty K Fdes a 1/n se zjistí regresní analýzou s ohledem na rovnici 17. Poznámka: Je-li Freundlichův adsorpč ní nebo desorpční exponent 1/n roven 1, bude Freundlichova adsorpč ní nebo desorpč ní konstanta (KF ads a KF des) rovna adsorpč ní resp. desorpč ní rovnovážné konstantě(K d resp. Kdes) a kř ivky závislosti Cs na Caq budou lineární. Nejsou-li exponenty rovny 1, kř ivky závislosti Cp na Cvod budou nelineární a adsorpč ní a desorpční konstanty se budou podél isotherem liš it. XVIII.2.2.2 Zpráva o zkouš ce Protokol o zkouš ce by měl obsahovat následující informace: — úplná identifikace použ itých půdních vzorkůvč etně : — země pisné informace o lokalitě(země pisná š íř ka, zeměpisná délka), — datum odbě ru vzorku, — využ ití půdy (např . zemědě lská půda, lesní půda atd.), — hloubka odběru vzorků, — obsah písku/prachových č ástic/jílu, — pH (v 0,01M CaCl 2) — obsah organického uhlíku, — obsah organického materiálu, — obsah dusíku, — pomě r C/N, — kationtová výmě nná kapacita (mmol/kg), — vš echny informace týkající se sběru a uchovávání vzorků, — podle potř eby vš echny informace pro interpretaci adsorpce/desorpce zkouš ené látky, — odkaz na metody reference použ ité pro stanovení jednotlivých parametrů,
— — — — —
XVIII.3
podle potř eby informace o zkouš ené látce, teplota př i experimentu, parametry centrifugace, analytický postup použitý př i analýze zkouš ené látky, odůvodnění jakéhokoli použ ití solubilizačního č inidla př i př ípravě zásobního roztoku zkouš ené látky, — vysvě tlení korekcí provedených ve výpoč tech, je-li to důlež ité, — data podle formulář e (dodatek 6) a grafická znázorně ní, — vš echny informace a pozorování už iteč né pro interpretaci výsledků zkouš ky. LITERATURA (1) Kukowski H. and Brümmer G., (1987). Investigations on the Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02 045, Part II. (2) Fränzle O., Kuhnt G., Vetter L., (1987). Selection of Representative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02 045, Part I. (3) Kuhnt G., Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994. (4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995 (June 1995). (5) US Environment Protection Agency: Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988. (6) US Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 835Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, 0PPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996. (7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Determining a Sorption Constant (Kou) for an Organic Chemical in Soil and Sediments. (8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987. (9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Application for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air. (10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 1988): Criteria for registration of pesticides as especially dangerous to health or especially harmful to the environment. (11) BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, Biological Research Centre for Agriculture and Forestry, Braunschweig, Germany. (12) Calvet R., (1989), „Evaluation of adsorption coefficients and the prediction of the mobilities of pesticides in soils“, in Methodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).
(13) Calvet R., (1980), „Adsorption-Desorption Phenomena“ in Interactions between herbicides and the soil. (R. J. Hance ed.), Academic Press, London, str. 83 – 122. (14) Hasset J. J., Banwart W.L., (1989), „The sorption of nonpolar organics by soils and sediments“ in Reactions and Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, str. 31 – 44. (15) van Genuchten M. Th., Davidson J. M., Wierenga P. J., (1974), „An evaluation of kinetic and equilibrium equations for the prediction of pesticide movement through porous media“. Soil Sci. Soc. Am. Proc., Vol. 38(1), str. 29 – 35. (16) McCall P. J., Laskowski D. A., Swann R. L., Dishburger H. J., (1981), „Measurement of sorption coefficients of organic chemicals and their use, in environmental fate analysis“, in Test Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC. (17) Lambert S. M., Porter P. E., Schieferrstein R. H., (1965), „Movement and sorption of chemicals applied to the soil“. Weeds, 13, str. 185 – 190. (18) Rhodes R. C., Belasco I. J., Pease H. L., (1970) „Determination of mobility and adsorption of agrochemicals in soils“. J. Agric. Food Chem., 18, str. 524 – 528. (19) Russell M. H., (1995), „Recommended approaches to assess pesticide mobility in soil“ in Environmental Behavior of Agrochemicals (ed. T. R. Roberts, P. C. Kearney). John Wiley & Sons Ltd. (20) Esser H. O., Hemingway R. J., Klein W., Sharp D. B., Vonk J. W., Holland P. T., (1988), „Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides“, IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, str. 901 – 932. (21) Guth J. A., Burkhard N., D. O. Eberle, (1976), „Experimental models for studying the persistence of pesticides in soils“. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, str. 137 – 157, BCPC, Surrey, UK. (22) Furminge C. G. L., Osgerby J. M., (1967), „Persistence of herbicides in soil“. J. Sci. Fd. Agric., 18, str. 269 – 273. (23) Burkhard N., Guth J. A., (1981), „Chemical hydrolysis of 2-Chloro4,6-bis(alkylamino)-1,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption“. Pestic. Sci. 12, str. 45 – 52. (24) Guth J. A., Gerber H. R., Schlaepfer T., (1977), „Effect of adsorption, movement and persistence on the biological availability of soil-applied pesticides“. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, str. 961 – 971. (25) Osgerby J. M., (1973), „Process affecting herbicide action in soil“. Pestic. Sci., 4, str. 247 – 258. (26) Guth J. A., (1972), „Adsorptions- und Einwascheverhalten von Pflanzenschutzmitteln in Böden“. Schr. Reihe Ver. Wass. -BodenLufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, str. 143 – 154. (27) Hamaker J. W., (1975), „The interpretation of soil leaching experiments“, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque, V. H. Freed), str. 135 – 172, Plenum Press, NY.
(28) Helling C. S., (1971), „Pesticide mobility in soils“. Soil Sci. Soc. Amer. Proc., 35, str. 732 – 210. (29) Hamaker J. W., (1972), „Diffusion and volatilization“ in Organic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring and J. W. Hamaker eds), Vol. I, str. 49 – 143. (30) Burkhard N., Guth J. A., (1981), „Rate of volatilisation of pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results with those determined in a laboratory model system“. Pestic. Sci. 12, str. 37 – 44. (31) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R.F., Enfield C.G., (1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses“, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, str. 297 – 325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC. (32) Gustafson D. I., (1989), „Groundwater ubiquity score: a simple method for assessing pesticide leachability“. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), str. 339 – 357. (33) Leistra M., Dekkers W. A., (1976). „Computed effects of adsorption kinetics on pesticide movement in soils“. J. Soil Sci., 28, str. 340 – 350. (34) Bromilov R. H., Leistra M., (1980), „Measured and simulated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils“. Pest. Sci., 11, str. 389 – 395. (35) Green R. E., Karickoff S. W., (1990), „Sorption estimates for modeling“, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., Book Series no. 2, str. 80 – 101, (36) Lambert S. M., (1967), „Functional relationship between sorption in soil and chemical structure“. J. Agri. Food Chem., 15, str. 572 – 576. (37) Hance R. J., (1969), „An empirical relationship between chemical structure and the sorption of some herbicides by soils“. J. Agri. Food Chem., 17, str. 667 – 668. (38) Briggs G. G. (1969), „Molecular structure of herbicides and their sorption by soils“. Nature, 223, 1288. (39) Briggs G. G. (1981). „Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor“. J. Agric. Food Chem., 29, str. 1050 – 1059. (40) Sabljic A., (1984), „Predictions of the nature and strength of soil sorption of organic polutance by molecular topology“. J. Agric. Food Chem., 32, str. 243 – 246. (41) Bailey G. W., White J. L., (1970), „Factors influencing the adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil“. Residue Rev., 32, str. 29 – 92. (42) Bailey G. W., J. L. White, Y. Rothberg., (1968), „Adsorption of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate“. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 32: str. 222 – 234.
(43) Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils“. Chemosphere 10, str. 833 – 846. (44) Paya-Perez A., Riaz M., Larsen B., (1989), „Soil Sorption of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners“. Environ. Toxicol. Safety 21, str. 1 – 17. (45) Hamaker J. W., Thompson J. M., (1972), „Adsorption in organic chemicals“ in Organic Chemicals in the Soil Environment (Goring C. A. I., Hamaker J. W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, str. 49 – 143. (46) Deli J., Warren G. F., 1971, „Adsorption, desorption and leaching of diphenamid in soils“. Weed Sci. 19: str. 67 – 69. (47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J. M., Santelmann, (1975), „Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils“. Weed Sci., Vol. 23, str. 454 – 457. (48) Haues M. H. B., Stacey M., Thompson J. M., (1968), „Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic preparations“ in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p.75, International. Atomic Energy Agency, Vienna. (49) Pionke H. B., Deangelis R. J., (1980), „Methods for distributing pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase“, CREAMS, in A Field Scale Model for Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Management Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report. (50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality – General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition (1994). (51) Scheffer F., Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition. (52) Black, Evans D. D., White J. L., Ensminger L. E., Clark F. E., eds. „Methods of Soil Analysis“, Vol 1 a 2, American Society of Agronomy, Madison, WI, 1982. (53) ISO/DIS 10381-1 Soil Quality — Sampling — Part 1: Guidance on the design of sampling programmes. (54) ISO/DIS 10381-2 Soil Quality — Sampling — Part 2: Guidance on sampling techniques. (55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality — Sampling — Part 3: Guidance on safety of sampling. (56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality — Sampling — Part 4: Guidance on the investigation of natural and cultivated soils. (57) ISO/DIS 10381-5 Soil Quality — Sampling — Part 5: Guidance on the investigation of soil contamination of urban and industrial sites. (58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. (59) Green R. E., Yamane V. K., (1970), „Precision in pesticide adsorption measurements“. Soil Sci. Am. Proc., 34, str. 353 – 354. (60) Grover R., Hance R. J. (1970), „Effect of ratio of soil to water on adsorption of linuron and atrazine“. Soil Sci., str. 109 – 138.
(61) Boesten, J. J. T. I, „Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in pesticide/soil system“. Pest. Sci. 1990, 30, str. 31 – 41. (62) Boesten, J. J. T. I. „Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in relation to OECD guideline 106„. Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26 – 29 April 1994. (63) Bastide J., Cantier J. M., et Coste C., (1980), „Comportement de substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure chimique“. Weed Res. 21, str. 227 – 231. (64) Brown D. S., Flagg E. W., (1981), „Empirical prediction of organic pollutants sorption in natural sediments“. J. Environ.Qual., 10(3), str. 382 – 386. (65) Chiou C. T., Porter P. E., Schmedding D. W., (1983), „Partition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water“. Environ. Sci. Technol., 17(4), str. 227 – 231. (66) Gerstl Z., Mingelgrin U., (1984), „Sorption of organic substances by soils and sediments“. J. Environ. Sci. Health, B19 (3), str. 297 – 312. (67) Vowles P. D., Mantoura R. F. C., (1987), „Sediment-water partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons“. Chemosphere, 16(1), str. 109 – 116. (68) Lyman W. J., Reehl W. F.and Rosenblatt D. H. (1990). Handbook of Chemical Property Estimation Methods. Environmental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC. (69) Keniga E. E., Goring, C. A. I. (1980). „Relationship between water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and concentration of chemicals in the biota“ in Aquatic Toxicology (eds J.G. Eaton, et al.), str.78 – 115, ASTM STP 707, Philadelphia. (70) Chiou C. T., Peters L. J., Freed V. H., (1979), „A physical concept of soil-water equilibria for non-ionic organic compounds“. Science, Vol. 206, str. 831 – 832. (71) Hassett J. J., Banwart W. I., Wood S. G., Means J. C., (1981), „Sorption of /-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption“. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, str. 38 – 42. (72) Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils“. Chemosphere, Vol. 10(8), str. 833 – 846. (73) Moreale A., van Bladel R., (1981), „Adsorption de 13 herbicides et insecticides par le sol. Relation solubilitE-reactivitE“. Revue de l'Agric., 34 (4), str. 319 – 322. (74) Müller M., Kördel W. (1996), „Comparison of screening methods for the determination/estimation of adsorption coefficients on soil“. Chemosphere, 32(12), str. 2493 – 2504. (75) Kördel W., Kotthoff G., Müller M. (1995), „HPLC — screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil — results of a ring test“. Chemosphere 30 (7), str. 1373 – 1384.
(76) Kördel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), „HPLC — screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil — comparison of different stationary phases“. Chemosphere 27 (12), str. 2341 – 2352. (77) Hance, R. J., (1967), „The Speed of Attainment of Sorption Equilibria in Some Systems Involving Herbicides“. Weed Res., Vol. 7, str. 29 – 36. (78) Koskinen W. C., Harper S. S., (1990), „The retention processes: mechanisms“ in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin. (79) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R. F., Enfield C. G. (1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural use“, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, str.297 – 325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC. (80) Giles C. H., (1970), „Interpretation and use of sorption isotherm“ in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37, str. 14 – 32. (81) Giles, C. H.; McEwan J. H.; Nakhwa, S.N., Smith, D, (1960), „Studies in adsorption: XI. A system of classification of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of soil“. J. Chem. Soc., str. 3973 – 93. (82) Calvet R., TercE M., Arvien J. C., (1980), „Adsorption des pesticides par les sols et leurs constituants: 3. CaractEristiques gEnErales de l'adsorptio“. Ann. Agron. 31: str. 239 – 251. (83) Bedbur E., (1996), „Anomalies in the Freundlich equatio“, Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environment, 13 – 15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK. (84) Guth, J. A., (1985), „Adsorption/desorptio“, in Joint International Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment, July 1 – 3, Canterbury, UK. (85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
DODATEK 1 SCHÉMA ZKOUŠKY
Př edpo klad
Navrž ení vhodné analytické metody
Je realizovatelná?
Ne
Zkouš ka se nerealizuje
Ano Př edbě ž ná studie
2 pů dy
Stupeň1
Volba optimálního pomě ru půda/roztok
Stanovení rovnováž ného č asu
Je dosaž eno rovnováž ného plata? Ano
Ově ř ení adsorpce na stě nách nádoby
Ově ř ení stálosti z množ stevní bilance výchozí látky
Je-li množ stevní bilance < 90 %, je zkuš ební lá tka nestálá po dobu zkouš ky. Zkou š ka můž e pokrač ovat, budou-li analyzovány obě fáze (p ů da a vodný roztok)
Stupeň2
Adsorpč ní kinetika
5 pů d
Kd ·(mpůda/V0 ) > 0,3 (nepř ímou metodou: mě ř ením úbytku v roztoku) K d·( m půda/V0 ) > 0,1 (p ř ímou metodou: m ě ř ením obou fází)
Stupeň3
podle potř eby
Adsorpč ní isotermy
Desorpč ní kinetika
Desorpč ní isotermy
DODATEK 2 VLIV SPRÁVNOSTI ANALYTICKÉ METODY A ZMĚNY KONCENTRACE NA SPRÁVNOST VÝSLEDKŮADSORPČNÍ STUDIE Z následující tabulky (84) je zř ejmé, ž e je-li rozdíl mezi počáteč ní hmotností zkouš ené látky (m0 = 110 µg) a její rovnovážnou hmotností v roztoku (mads aq (eq) = 100 µg), je důsledkem 5% chyby mě ř ení rovnováž né koncentrace 50% chyba ve výpočtu hmotnosti zkouš ené látky adsorbované na půdě(m adss (eq)) a 52,4% chyba ve výpočtu Kd . Množ ství půdy mpůda = 10 g
Objem roztoku
V 0 = 100 cm3
mvads (eq) C ads (eq) vod -3 (μg) (μg·cm ) PRO A = 9 %
m0 = 110 µg nebo C0 = 1,100 µg·cm-3
100
m0 = 110 µg nebo C0 = 1,100 µg ·cm-3
skutečná hodnota 1% 5% 10 %
0,500
50,5 0,505 52,5 0,525 55,0 0,550 PRO A = 99 % 1,100
0,011
1,111 1,155 1,21
0,01111 0,01155 0,0121
m0 = 110 µg nebo C0 = 1,100 µg·cm-3
mads (eq)* p
skutečná hodnota 1% 5% 9%
1,000
101 1,010 105 1,050 109 1,090 PRO A = 55 % 50,0
R
skutečná hodnota 1% 5% 10 %
(μg)
C pads (eq)* -1 (μg·g )
10
1,00
9 5 1
0,90 0,50 0,10
60,0
6,00
59,5 57,5 55,0
5,95 5,75 5,50
108,9
10,89
108,889 108,845 108,790
10,8889 10,8845 10,8790
R
skuteč ná hodnota 10 % 50 % 90 % skuteč ná hodnota 0,8 % 4,0 % 8,3 % skuteč ná hodnota 0,01 % 0,05 % 0,10 %
K d*
R
1 0,891 0,476 0,092
10,9 % 52,4 % 90,8 %
12,00 11,78 10,95 10,00
1,8 % 8,8 % 16,7 %
990 980 942 899
1,0 % 4,8 % 9,2 %
kde: *
ads C0 Cvod (eq) V0 mpads (eq) V0 m (eq) m0 m (eq), C (eq) , K d ads mbodem m vod (eq) mbodem ads p
ads vod
ads p
mads p (eq)
=
množ ství zkouš ené látky v půděv rovnováze, µg
mads v (eq)
=
množ ství zkouš ené látky ve vodné fázi v rovnováze, µg
Cpads (eq)
=
množ ství zkouš ené látky v půděv rovnováze, µg·g-1
Cvads (eq)
=
R
=
množ ství zkouš ené látky ve vodné fázi v rovnováze, -3 µg·cm analytická chyba stanovení mads v (eq) vypoč tená chyba vyplývající z analytické chyby R.
R
=
DODATEK 3 METODY ODHADU Kd 1. Metody odhadu umož ňují př edpově dě t Kd na základěkorelací např íklad s hodnotami Pov (12, 39, 63 – 68), s daty o rozpustnosti (12, 19, 21, 39, 68 – 73) nebo s daty o polaritězískanými př i použ ití HPLC s obrácenou fází (74 – 76). Jak je patrné z tabulky 1 a 2, vypoč tou se z takových rovnic hodnoty Kou nebo Kom a poté nepř ímo hodnoty Kd z rovnic: 100 K 100 K ou K d cm 3 g1 K om d cm3 g 1 %ou 1, 724 %ou 2. Tyto korelace jsou založeny na dvou př edpokladech: 1) adsorpci látky nejvíce ovlivňuje organický materiál v půděa 2) mechanismus interakce je př eváž něnepolární. V důsledku toho tyto korelace 1) nejsou použ itelné na polární látky (nebo jsou použ itelné jen do urč ité míry) a 2) nejsou použ itelné v př ípadech, kdy je obsah organického materiálu v půděvelmi malý (12). Kromětoho, ač koli byla zjiš těna uspokojivá korelace mezi Pov a adsorpcí
3.
(19), nelze totéžř íci o korelaci mezi rozpustností ve voděa mírou adsorpce (19, 21); v tomto ohledu jsou tyto studie protichůdné. Ně které př íklady korelace mezi adsorpč ním koeficientem a rozdě lovacím poměrem oktanol/voda nebo rozpustností ve vodějsou uvedeny v tabulkách 1 a 2. Tabulka 1. Př íklady korelací mezi adsorpč ním distribučním koeficientem a rozdě lovacím koeficientem oktanol/voda; dalš í př íklady jsou uvedeny v literatuř e (12, 68) Látky Substituovaná močovina Chlorované aromatické slouč eniny Různé pesticidy
Korelace log K om = 0,69 + 0,52 log Pov log K ou = -0,779 + 0,904 log Pov
Aromatické uhlovodíky
log K ou = -2,53 + 1,15 log Pov
Tabulka 2.
log K om = 4,4 + 0,72 log Pov
Autoř i Briggs (1981) (39) Chiou et al. (1983) (65) Gerstl a Mingelgrin (1984) (66) Vowles a Mantoura (1987) (67)
Př íklady korelací mezi adsorpč ním distribučním koeficientem a rozpustností ve vodě ; dalš í př íklady jsou uvedeny v literatuř e (68, 69)
Sloučeniny Různé pesticidy Chlorované alifatické a aromatické látky α-Naftol Cyklické, alifatické a aromatické látky Různé látky
Korelace log K om = 3,8 – 0,561 log Sv
Autoř i Gerstl a Mingelgrin (1984) (66) log K om = (4,040 ± 0,038) – (0,557 Chiou et al. ± 0,012) log Sv (1979) (70) log K ou = 4,273 – 0,686 log Sv Hasset et al. (1981) (71) log K ou = -1,405 – 0,921 log Sv - Karickhoff (1981) 0,00953 (mp-25) (72) log K om = 2,75 – 0,45 log Sv Moreale van Blade (1982) (73)
DODATEK 4 VÝPOČTY PRO STANOVENÍ PARAMETRŮCENTRIFUGACE 1. Centrifugační doba se za př edpokladu, že jsou č ástice kulové, vypoč te podle následující rovnice: R 9 t 2 2 ln (1) b R 2 t rp p vod Pro zjednoduš ení nejsou parametry uvedeny v základních jednotkách SI (ale v jednotkách soustavy CGS). kde: ω = úhlová rychlost (= 2 π·(rpm)/60), rad·s-1 rpm = poč et otáček za minutu η = viskozita roztoku, g·s-1·cm -1 rp = poloměr č ástic, cm ρp = hustota půdy, g·cm -3 ρvod = hustota roztoku, g·cm-3 Rt = vzdálenost od stř edu rotoru centrifugy k hladině roztoku v centrifugač ní kyvetě , cm Rb = vzdálenost od stř edu rotoru centrifugy ke dnu centrifugač ní kyvety, cm
R b – Rt
2.
3.
4.
5.
=
výš ka sloupce smě si kyvetě, cm.
půda/roztok
v centrifugační
V praxi se k zajiš tě ní úplného oddě lení volí dvojnásobek vypoč teného č asu. Rovnici (1) lze dále zjednoduš it, jestliž e se položí viskozita (η) a hustota (ρvod) roztoku rovny viskozitěa hustotěvody př i 25 °C; tedy η= 8,95 × 10-3 -1 -1 -3 g·s ·cm a ρvod = 1,0 g·cm . Centrifugační doba je poté dána rovnicí (2): 3, 7 R t ln b 2 2 (2) rp p 1 R t rpm Z rovnice 2 vyplývá, ž e pro účely oddě lení č ástic o určité velikosti (v naš em př ípaděo poloměru 0,1 µm) jsou pro stanovení parametrůcentrifugace, tj. doby (t) a počtu otáč ek za minutu (rpm), důlež ité dvěcharakteristiky: 1) hustota půdy a 2) výš ka sloupce směsi v centrifugač ní kyvetě(Rb – R t), tj. vzdálenost, kterou půdní č ástice urazí mezi hladinou v kyvetěa jejím dnem; výš ka sloupce smě si v kyvetě bude př i pevně stanoveném objemu samozř ejmězáviset na druhé mocniněpolomě ru kyvety. Na obrázku 1 jsou znázorně ny změny centrifugač ní doby (t) v závislosti na centrifugač ní rychlosti (rpm) pro různé hustoty půdy (ρp) (obrázek 1a) a pro různé výš ky sloupce směsi v centrifugač ních kyvetách (obrázek 1b). Z obrázku 1a je zř ejmý vliv hustoty půdy; např . př i obvyklých 3 000 ot./min je centrifugační doba př ibliž ně240 min pro hustotu půdy 1,2 g·cm-3, ale pouze 50 min pro 2,0 g·cm-3. Podobněje podle obrázku 1b př i obvyklých 3 000 ot./min centrifugač ní doba př ibliž ně50 min pro výš ku sloupce smě si 10 cm a pouze 7 min pro výš ku sloupce 1 cm. Je vš ak důležité nalézt optimální poměr mezi centrifugací, která vyžaduje co nejmenš í výš ku sloupce, a snadností, s jakou můž e experimentátor oddě lovat fáze po centrifugaci. Kromětoho je př i stanovování experimentálních podmínek př i oddě lování fází půda/roztok důlež ité poč ítat s mož nou př ítomností tř etí „pseudofáze“, koloidu. Koloidní č ástice s velikostí menš í než0,2 µm mohou mít znač ný vliv na celý mechanismus adsorpce látky v půdní suspenzi. Př i centrifugaci, jak je popsána výš e, zůstanou koloidní částice ve vodné fázi a analyzují se společněs vodnou fází. Informace o jejich vlivu se tedy ztratí. Má-li laboratoř , která studii provádí, zař ízení pro ultracentrifugaci nebo ultrafiltraci, mohla by být adsorpce/desorpce studována hloubě ji vč etně informací o adsorpci látky na koloidních č ásticích. V takovém př ípaděse k oddě lení tř í fází – půdy, koloidních částic a roztoku, použ ije ultracentrifugace př i 60 000 ot./min nebo ultrafiltrace na filtru zachycujícím č ástice o velikosti 100 000 daltonů. Protokol o zkouš ce by mě l být také odpovídajícím způsobem pozmě ně n, mají-li být analyzovány vš echny tř i fáze.
Centrifugač ní doba (min)
den
ρs = hustota půdy
/ / /
hod
/ /
Centrifugač ní rychlost (ot./min)
Obrázek 1a
Změ ny centrifugač ní doby (t) v závislosti na centrifugač ní rychlosti (ot./min) pro různé hustoty půdy (ρp). Rt = 10 cm, Rb – R t = 10 cm, η= 8,95 × 10-3 g·s -1 cm -1 a ρvod = 1,0 g·cm3 př i 25 °C.
Centrifugač ní do ba (min)
den
hod
Centrifugač ní rychlost (ot./min)
Obrázek 1b
Změ na centrifugační doby (t) v závislosti na centrifugační rychlosti (ot./min) pro různé výš ky sloupce smě si v centrifugač ní kyvetě (Rb – Rt ) = L; Rt = 10 cm, η= 8,95 × 10-3 g·s -1·cm -1, ρvod = 1,0 g·cm-3 př i 25 °C a ρp = 2,0 g·cm-3.
DODATEK 5 VÝPOČET ADSORPCE A (%) A DESORPCE D (%) Časové schéma průbě hu experimentu je následující: Čas t
U vš ech výpočtůse př edpokládá, ž e zkouš ená látka je stálá a ž e se významně neadsorbuje na stě nách nádoby. ADSORPCE (A%) a) Paralelní metoda Procento adsorpce se vypoč te pro kaž dou zkuš ební nádobu (i) pro kaž dý č as (ti ) podle následující rovnice: mads 100 p (ti ) Ati (1) 3 % m0 Velič iny v této rovnici lze vyčíslit takto: m0 C 0 V0 g ads mpads (ti ) m0 Cvod (ti ) V0
kde: Ati
=
(2)
g
(3)
procento adsorpce (%) v čase ti
množství zkouš ené látky na půděv čase t i, kdy je provádě na analýza (µg) m0 = množství zkouš ené látky v nádoběna zač átku zkouš ky (µg) C0 = poč áteč ní hmotnostní koncentrace zkuš ebního roztoku -3 v kontaktu s půdou (µg·cm ) ads = hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi v č ase t i, Cvod (ti ) -3 kdy je provádě na analýza, (µg·cm ); Tato koncentrace se stanoví analyticky a koriguje se na hodnoty ze slepých pokusů V0 = poč áteč ní objem zkuš ebního roztoku v kontaktu s půdou (cm 3). ads Hodnoty adsorpčního procenta Ati nebo Cvod (ti ) se vynesou proti č asu a zjistí se doba, po nížse ustavila sorpč ní rovnováha. Př íklady takových kř ivek jsou uvedeny na obrázcích 1 a 2.
mads p (ti )
3
=
Rovnice je použ itelná jak pro př ímou, tak pro nepř ímou metodu. Vš echny ostatní metody jsou použ itelné pouze pro nepř ímou metodu.
Procento adsorpce Ati (%)
Čas ti (h) (ustavování rovnováhy)
Obrázek 1 ads Cvod (eq)
Koncentrace C vod
ads
-3
(µg·cm )
ads Cvod (eq)
Kř ivka ustavování adsorpční rovnováhy
ads C vod (eq)
Čas ti (h) (ustavování rovnováhy)
Obrázek 2. Závislost hmotnostní koncentrace látky ve vodné fázi (Cvod) na č ase b) Sériová metoda V následujících rovnicích je zohledněno, ž e se př i studii adsorpce provádě jí měř ení zkouš ené látky v malých podílech vodné fáze v urč itých časových intervalech. — Pro každý č asový interval se množství látky adsorbované na půdě vypočte takto: — pro první časový interval t1 = t1 – t0
V0 mpads ( t1 ) m0 mmads ( t1 ) A va —
(4)
pro druhý č asový interval t 2 = t2 – t1
V0 mads t 2 ) mads p ( m (t1 ) v A a
ads V0 vaA m ( t ) m 2 vA a
(5)
pro tř etí časový interval t 3 = t3 – t 2
—
V0 vaA ads V0 2 vaA mpads ( t3 ) mmads ( t2 ) m ( t ) A m 3 A va va —
(6)
pro n-tý časový interval t n = tn – t n-1
A A V0 V0 n 2 va ads n 1 va mpads (t n ) mmads (tn 1 ) m ( t ) m n (7) A A va va
—
Procento adsorpce v kaž dém č asové intervalu Ati se vypoč te z následující rovnice: ads mp ( ti ) Ati 100 % (8) 4 m0 zatímco procento adsorpce ( Ati ) v č ase ti je dáno rovnicí: ti
m
j ti
Ati
—
ads p
( j)
m0
100 %
(9) 4
Hodnoty procenta adsorpce Ati nebo Ati (podle potř eb studie) se vynesou proti č asu a stanoví se doba, po nížse ustavila sorpční rovnováha. Vč ase ustavení rovnováhy teq : — je množ ství zkouš ené látky adsorbované na půdě : n
m (eq) mpads ( ti ) ads p
—
(10) 4
ti 1
množství zkouš ené látky v roztoku: n
ads mads ti ) vod (eq) m0 mp (
(11) 4
ti 1
—
a procento adsorpce v rovnováze: ads mp (eq) Aeq 100 % m0
(12) 4
Výš e uvedené velič iny jsou definovány takto: mpads (t1 ), mpads (t2 ), ..., mpads (t n ) = množství látky adsorbované na půděza č asový interval t1 , t2 ,…, tn , (µg) ads
ads
ads
mm (t1 ), mm (t2 ), ..., mm (t n )
4
= množství látky namě ř ené v okamž iku t 1, t2, …,tn, (µg)
v podílu
Rovnice je použ itelná jak pro př ímou, tak pro nepř ímou metodu. Vš echny ostatní metody jsou použ itelné pouze pro nepř ímou metodu
( vaA )
mpads (eq)
= množství zkouš ené látky adsorbované na půdě v adsorpč ní rovnováze, (µg)
ads mvod (eq)
= množství zkouš ené látky v roztoku v adsorpční rovnováze, (µg)
va
= objem podílu, ve kterém je látka stanovována, (cm 3)
Ati
= procento adsorpce intervalu ti , (%)
Aeq
= procento adsorpce v adsorpč ní rovnováze
A
odpovídající
časovému
DESORPCE (%) Časem t 0, v němžse zahájí experiment pro studium desorpč ní kinetiky, je okamžik, kdy je co největš í objem roztoku zkouš ené látky (po dosaž ení adsorpč ní rovnováhy) nahrazen stejným objemem 0,01M roztoku CaCl2. a) Paralelní metoda Vč ase ti se změř í množ ství zkouš ené látky ve vodné fázi odebrané ze i zkuš ební nádoby i ( Vr ) a desorbované množství se vypoč te z rovnice:
V0 des mdes vod (t i ) mm (t i ) i Vr
A mvod
(13)
ads V desorpč ní rovnováze platí, ž e t i = teq , a tedy mads vod (t i ) = m vod (eq) . Množ ství zkuš ební látky desorbované během časového intervalu ( ti ) je dáno rovnicí:
i 1
des des des mvod ( ti ) mvod (ti ) mvod ( j)
(14)
j 1
Procento desorpce se vypočte takto: — v čase ti z rovnice: des mvod (t i ) Dti ads 100 % mp (eq)
(15)
a bě hem č asového intervalu ( ti ) z rovnice:
—
m (ti ) Dti vod 100 % ads mp (eq) des
(16)
kde: Dti
=
procento desorpce v čase ti , (%)
Dti
=
procento desorpce za č asový interval t i , (%)
mvod (ti )
des
=
množství zkouš ené látky desorbované v č ase ti, (µg)
mvod (t i )
=
množství
des
zkouš ené
látky
desorbované
bě hem
mdes m (ti )
=
A
mvod
=
č asového intervalu t i , (µg) množství zkouš ené látky analyticky změ ř ené v čase i ti v roztoku o objemu Vr , který byl odebrán k analýze, (µg) množství látky, které zbylo (anižse adsorbovalo) po ustavení adsorpční rovnováhy, a to v důsledku nekvantitativní výmě ny objemu vodné fáze, (µg)
V0 VR A ads mvod mvod (eq) V0 mads v (eq)
b)
(17)
=
množství zkouš ené látky v roztoku v adsorpční rovnováze, (µg) VR = objem supernatantu odebraného ze zkuš ební nádoby po dosažení adsorpč ní rovnováhy a nahrazeného stejným objemem 0,01M roztoku CaCl2 (cm3) = objem roztoku odebraného ze zkuš ební nádoby (i) ke Vri stanovení zkouš ené látky v experimentu pro studium desorpč ní kinetiky (cm3). Hodnoty procenta desorpce Dti nebo Dti (podle potř eb studie) se vynesou proti č asu a stanoví se doba, po nížse ustavila desorpč ní rovnováha. Sériová metoda V následujících rovnicích je zohledně no, ž e byla př i př edcházející studii adsorpce provádě na měř ení zkouš ené látky v malých podílech vaA vodné fáze (sériová metoda v bodě1.9 Provedení zkouš ky) Př edpokládá se, že a) objem supernatantu odebraného ze zkuš ební nádoby po experimentu pro studium adsorpč ní kinetiky byl nahrazen stejným objemem 0,01M roztoku CaCl2 (VR) a b) celkový objem vodné fáze v kontaktu s půdou (VT) bě hem experimentu pro studium desorpč ní kinetiky zůstává konstantní a je dán rovnicí: n
VT V0 vaA i
(18)
i1
—
—
Vč ase t i: množ ství zkouš ené látky se měř í v malých podílech ( vaD ) a desorbované množ ství se vypočte z následující rovnice: VT i 1 vaD VT A des des mvod (ti ) mm ( ti ) (19) D mvod V va T des v desorpční rovnováze platí, že ti = t eq, a tedy mdes vod ( t i ) = mvod (eq)
—
procento desorpce Dti se vypoč te z následující rovnice: des
mvod (t i ) Dti ads 100 % mp (eq)
(20)
—
Za č asový interval ( ti ): Pro kaž dý časový interval se desorbované množství látky vypoč te takto: pro první č asový interval t1 = t1 – t0
VT mdes t1 ) mmdes (t1 ) vod ( D va
A mvod
a
des mpdes (t1 ) mpvod (eq) mvod (t1 )
(21)
pro druhý časový interval t2 = t 2 – t1 VT vaD A VT vaD VT des des des mvod mvod (t2 ) mm (t2 ) v D mvod (t1 ) VT VT a —
a des ads des des mp (t 2 ) m p (eq) m vod (t1 ) m vod (t 2 )
(22)
pro n-tý č asový interval t n = tn – tn-1 m
des vod
VT des (t n ) mm (t n ) D va
VT n 1 vaD n 1 VT n i vaD des A m m ( t ) vod vod i i1, n1 VT VT
a n
ads des mdes ti ) p (t n ) mp (eq) m vod (
(23)
i 1, n 1
Procento desorpce za každý č asový interval Dti se nakonec vypoč te z následující rovnice: des mvod ( ti ) Dti ads 100 % (24) mp (eq) zatímco procento desorpce ( Dti ) v č ase ti je dáno rovnicí: ti
m
des vod
( j)
mdes (25) vod (t i ) Dti 100 ads 100 % m (eq) mp (eq) př ičemžjsou výš e použ ité velič iny definovány takto: des des des mp (t1 ), mp (t2 ), ..., mp (t n ) = množ ství látky, která zůstala adsorbovaná na půdě po časových intervalech t1 , t2 ,…, tn , (µg) des des des mvod ( t1 ), mvod ( t2 ), ..., mvod ( t n ) = množ ství látky desorbované za časové intervaly t1 , t2 ,…, tn , (µg) des des des mm (t1 ), mm (t2 ), ..., mm (t n ) = množ ství látky naměř ené v podílu vaD v okamžicích t1, t 2, …, tn, (µg) VT = celkový objem vodné fáze v kontaktu s půdou bě hem experimentu pro studium desorpč ní kineticky provedeného sériovou metodou (cm3) m Avod = množ ství látky, které zbylo (anižse adsorbovalo) po ustavení adsorpční jti ads p
rovnováhy, a to v důsledku nekvantitativní výmě ny objemu vodné fáze, (µg)
A mvod
n A V i VR 0 va i 1 n V 0 v Aa i i 1
VR
=
vaD
=
ads mvod (eq)
(26)
objem supernatantu odebraného ze zkuš ební nádoby po dosaž ení adsorpční rovnováhy a nahrazeného stejným objemem 0,01M roztoku CaCl2 (cm 3) objem alikvotu odebraného k analýze ze zkuš ební nádoby (i) bě hem experimentu pro studium desorpč ní kineticky provedeného sériovou metodou
vaD 0, 02 VT
(27)
DODATEK 6 ADSORPCE – DESORPCE V PŮDÁCH: FORMULÁŘE PRO PŘEDLOŽENÍ DAT Zkouš ená látka: Zkuš ební půda: Podíl suš iny v půdě(105 °C, 12 h):……………………………………………% Teplota:…………………………………………………………………………°C Použitelnost analytické metody Navážka půdy g Půda: suchá hmotnost g Objem roztoku CaCl2 cm 3 Nominální koncentrace př ipraveného roztoku µg·cm-3 Analytická koncentrace př ipraveného roztoku µg·cm-3 Podstata použ ité analytické metody: Kalibrace analytické metody:
Zkouš ená látka: Zkuš ební půda: Podíl suš iny v půdě(105 °C, 12 h):……………………………………………% Teplota:…………………………………………………………………………°C Použitá metodika analýzy: Nepř ímá □ Paralelní □ Sériová □ Př ímá □ Adsorpční zkouš ka: zkuš ební vzorky
Zkuš ební nádoba č. Navážka půdy Půda: suchá hmotnost Objem vody v naváž ce půdy (vypoč tený) Objem 0,01M roztoku CaCl 2 použitého k uvedení do rovnováhy s půdou Objem zásobního roztoku Celkový objem vodné fáze v kontaktu s půdou Poč áteč ní koncentrace zkouš eného roztoku Množství zkouš ené látky na začátku zkouš ky
Symbol
Jednotky
— mpůda
g g
V vp
cm
Čas (v průběhu ustavování rovnováhy)
Čas (v průběhu ustavování rovnováhy)
3
3
cm
cm3 3
V0
cm
C0
µg·cm -3
m0
µg
ads
Koncentrace zkouš ené látky ve vodné fázi, po korekci na slepý pokus
C vod (ti )
Namě ř ené množ ství zkouš ené látky
mvod (ti )
Po protř epávání a centrifugaci Nepřímá metoda Paralelní metoda -3 µg·cm
Sériová metoda
v podílu
ads
µg
ads p
µg
VaA Př ímá metoda
Množství zkouš ené látky adsorbované na půdě
m (t i )
Výpoč et adsorpce
Čas (v prů bě hu ustavování rovnováhy)
Čas (v průbě hu ustavování rovnováhy)
Adsorpce
Stř ední hodnota Adsorpč ní koeficient Stř ední hodnota Adsorpč ní koeficient Stř ední hodnota
Ati
%
At i
%
Kd
cm ·g
Kou
cm3·g- 1
3
-1
Zkouš ená látka: Zkuš ební půda: Podíl suš iny v půdě(105 °C, 12 h):……………………………………………% Teplota:…………………………………………………………………………°C Adsorpční zkouš ka: slepý pokus a kontrolní vzorky Symbol
Jednotky
Slepý pokus
Zkuš ební nádoba č . Navážka půdy g Množství vody v navážce půdy cm3 (vypoč tené) 3 Př idaný objem 0,01M roztoku CaCl 2 cm 3 Př idaný objem zásobního roztoku cm 0 zkuš ební látky Celkový objem vodné fáze (vypoč tený) cm3 Počáteční hodnota zkuš ební látky ve µg·cm -3 vodné fázi Po protřepávání a centrifugaci -3 Koncentrace ve vodné fázi µg·cm Poznámka: Podle potř eby lze př idat sloupce.
Slepý pokus
Kontrolní vzorek 0 —
0 —
—
—
0
Zkouš ená látka: Zkuš ební půda: Podíl suš iny v půdě(105 °C, 12 h):……………………………………………% Teplota:……………………………………………………………………………°C Množstevní bilance Zkuš ební nádoba č. Navážka půdy Půda: suchá hmotnost Objem vody v naváž ce půdy (vypoč tený) Objem 0,01M roztoku CaCl2 použitého k uvedení do rovnováhy s půdou Objem zásobního roztoku Celkový objem vodné fáze v kontaktu s půdou Poč áteč ní koncentrace zkouš eného roztoku Čas (v průbě hu ustavování rovnováhy)
Symbol
Jednotky
— mpůda Vvp
g g) ml ml
V0
cm3 cm3
C0
µg·cm
—
h
-3
Po protř epávání a centrifugaci Koncentrace zkouš ené látky ve vodné fázi v adsorpč ní rovnováze, po korekci na slepý pokus Rovnovážný čas
-3
C vod (eq)
µg·cm
teq
h
V rec V
cm3 cm3
ads
První př idání rozpouš tě dla Odebraný objem vodné fáze Př idaný objem rozpouš tě dla
První extrakce rozpouš tědlem Velikost signálu mě ř idla př i analýze rozpouš tě dla Koncentrace zkouš ené látky v rozpouš tědle Množství látky extrahované z půdy a stě n nádoby
SE1
rů zné
CE1
µg·cm-3
m E1
µg
Druhá extrakce rozpouš tě dlem Vrozp V´
Odebraný objem rozpouš tědla Př idaný objem rozpouš tě dla
cm3 cm3
Druhá extrakce rozpouš tě dlem Velikost signálu mě ř idla př i analýze rozpouš tě dlové fáze Koncentrace zkouš ené látky v rozpouš tědle Množství látky extrahované z půdy a stě n nádoby Celkové množ ství zkouš ené látky extrahované ve dvou krocích Hmotnostní bilance
SE2
rů zné
CE2
µg·cm-3
m E2
µg
mE
µg
MB
%
Zkouš ená látka: Zkuš ební půda: Podíl suš iny v půdě(105 °C, 12 h):……………………………………………% Teplota:…………………………………………………………………………°C Adsorpč ní isothermy Zkuš ební nádoba č . Navážka půdy Půda: suchá hmotnost Objem vody v naváž ce půdy (vypoč tený) Objem 0,01M roztoku CaCl2 použitého k uvedení do rovnováhy s půdou Př idaný objem zásobního roztoku Celkový objem vodné fáze v kontaktu s půdou (vypoč tený) Koncentrace roztoku Čas (v průběhu ustavování rovnováhy)
Symbol
Jednotky
— E Vvp
g g 3 cm cm3
V0
cm3 cm3
C0 —
µg·cm h
-3
Po protř epávání a centrifugaci Koncentrace látky ve vodné fázi, po C ads vod (eq) korekci na slepý pokus Teplota Adsorbované množ ství na jednotku C ads p (eq) množství pů dy
Regresní analýza: hodnota KFads : hodnota l/n: regresní koeficient r2:
-3
µg·cm
°C -1 µg·g
Zkouš ená látka: Zkuš ební půda: Podíl suš iny v půdě(105 °C, 12 h):……………………………………………% Teplota:…………………………………………………………………………°C Použitá metodika analýzy: Nepř ímá □ Paralelní □ Sériová □ Desorpční zkouš ka Symbol Jednotky Číslo zkuš ební nádoby z adsorpčního experimentu Množství látky adsorbované na půdě mads (eq) p v adsorpční rovnováze Odebraný objem vodné fáze VR nahrazený 0,01M CaCl2 Celkový objem vodné fáze PM V0 v kontaktu s půdou SM VT A Množství látky, které zbylo (anižse mvod adsorbovalo) po ustavení adsorpč ní rovnováhy, a to v důsledku nekvantitativní výměny objemu vodné fáze
Časový interval
µg cm3 3
cm 3 cm µg
Desorpč ní kinetika Naměř ené množství látky desorbované z půdy v č ase ti Objem roztoku odebraný ze PM zkuš ební nádoby (i) pro mě ř ení zkouš ené látky SM
mmdes (t i )
Množství látky desorbované z půdy vč ase ti (vypočtené) Množství látky desorbované z půdy během časového intervalu t i (vypoč tené)
µg 3
i
cm
Va
D
cm
mvod (ti )
des
µg
mdes (ti ) vod
µg
Vr
3
Procento desorpce Desorpce v čase ti
Dti
%
Desorpce za časový interval ti
Dt i
%
Zdánlivý desorpč ní koeficient
K des
PM: paralelní metoda SM: sériová metoda
Časový interval
Časový interval
Časový interval
XIX. METODA PRO STANOVENÍ ODHADU ADSORPČNÍHO KOEFICIENTU (K OU) PRO PŮDY A ČISTÍRENSKÉ KALY VYSOKOÚČINNOU KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ (HPLC) – metoda C.19 podle př ílohy smě rnice 2001/59/ES XIX.1 XIX.1.1
XIX.1.2
METODA Tato metoda je replikou metody OECD TG121 (2000). ÚVOD Sorpč ní chování látek v půdách a v č istírenských kalech můž e být popsáno parametry experimentálněstanovenými zkuš ební metodou C.18. Důležitým parametrem je adsorpč ní koeficient, který je definován jako poměr koncentrace látky v půděnebo kalu a koncentrace látky ve vodné fázi v rovnováze. Adsorpč ní koeficient normalizovaný na obsah organického uhlíku v půděKou je už itečným ukazatelem schopnosti chemické látky vázat se na organické látky v půděa v čistírenském kalu a umožňuje porovnat různé chemické látky. Tento parametr lze odhadnout z korelace s rozpustností ve vodě a s rozdě lovacím koeficientem oktanol/voda (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). Experimentální metoda popsaná v této zkouš ce používá k odhadu adsorpč ního koeficientu Kou v půdě a v č istírenských kalech vysokoúč innou kapalinovou chromatografii (8). Tyto odhady jsou spolehlivě jš í nežodhady z výpočtůpomocí metodiky QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship) (9). Jako metoda založ ená na odhadu nemůž e plně nahradit násadové experimenty stanovení adsorpč ní/desorpč ní rovnováhy podle metody C.18. Odhady Kou vš ak mohou být už iteč né pro volbu vhodných parametrů pro adsorpč ní/desorpč ní studie podle zkuš ební metody C.18, a to vypočtením Kd (distribuč ního koeficientu) nebo K F (Freundlichova adsorpč ního koeficientu) z rovnice 3 (viz bod 1.2). DEFINICE Kd : Distribuč ní koeficient je definován jako pomě r rovnovážných koncentrací C rozpuš těné látky ve dvoufázovém systému skládajícím se ze sorbentu (půda nebo č istírenský kal) a vodné fáze; je bezrozmě rný, jsou-li koncentrace v obou fázích vyjádř eny jako hmotnostní podíly. Je-li koncentrace ve vodné fázi vyjádř ena v jednotce hmotnosti na jednotku objemu, je jednotkou ml·g-1. Kd se můž e měnit s vlastnostmi sorbentu a může záviset na koncentraci. C Ckal K d pùda nebo (1) Cvod Cvod kde: Cpůda = koncentrace zkouš ené látky v půděv rovnováze (µg·g-1) Ckal = koncentrace zkouš ené látky v kalu v rovnováze (µg·g-1) Cvod = koncentrace zkouš ené látky ve vodné fázi v rovnováze (µg·g-1 , µg·ml-1). KF: Freundlichův adsorpč ní koeficient je definován jako koncentrace zkouš ené látky v půděnebo v č istírenském kalu (x/m), je-li rovnovážná koncentrace Cvod ve vodné fázi rovna jedné; vyjadř uje se v µg na gram sorbentu. Hodnota se můž e mě nit s vlastnostmi sorbentu. x 1 log log K F log Cvod (2) m n
kde: x/m
množ ství zkouš ené látky x (µg) adsorbované v rovnováze na urč itém množ ství sorbentu m (g) 1/n = smě rnice Freundlichovy adsorpč ní isothermy Cvod = koncentrace zkouš ené látky ve vodné fázi v rovnováze (µg·ml-1) x Př i Cvod = 1: log K F log m Kou : Distribuč ní koeficient (Kd) nebo Freundlichův adsorpční koeficient (KF) normalizovaný na obsah organického uhlíku (fou) v sorbentu; zejména u nedisociujících chemických látek je př ibliž ným ukazatelem míry adsorpce látky na sorbentu a umožňuje provést porovnání různých chemických látek. V závislosti na rozmě ru Kd a K F může být Kou bezrozměrný nebo může být jeho jednotkou ml . g-1 nebo µg . g-1 organického materiálu. K K Kou d (bezrozmě rný nebo v ml·g-1) nebo F (µg·g-1) (3) f ou f ou =
Vztah mezi Kou a Kd není vž dy lineární, hodnoty Kou se mohou pro jednotlivé půdy mě nit, avš ak jejich kolísání je ve srovnání s hodnotami Kd nebo KF silněomezeno. Adsorpční koeficient (Kou) lze odeč íst pomocí kapacitního faktoru (k') z kalibrač ní kř ivky log k' versus log Kou pro vybrané referenční slouč eniny. t t k R 0 (4) t0 kde: tR : retenční č asy zkouš ené a referenční látky pro HPLC (min) t0: mrtvá doba HPLC (min) (viz bod 1.8.2). Pov: Rozdě lovací koeficient oktanol/voda je definován jako pomě r koncentrací rozpuš těné látky v n-oktanolu a ve vodě ; je bezrozměrný. Coktanol Pov (= Kov) (5) C voda XIX.1.3
REFERENČNÍ LÁTKY Př e použitím metody by mě ly být známy strukturní vzorec, č istota a disociač ní konstanta (podle potř eby). Užiteč né jsou informace o rozpustnosti ve voděa v organických rozpouš tě dlech, o rozdě lovacím koeficientu oktanol-voda a o chování př i hydrolýze. Mají-li být uvedena do korelace namě ř ená retenč ní data z HPLC pro zkouš enou látku a její adsorpč ní koeficient, musí být vytvoř en kalibrační graf log Kou versus log k'. Použije se minimálněš est referenč ní bodů, alespoňpo jednom nad a pod oč ekávanou hodnotou pro zkouš enou látku. Správnost metody se významnězlepš í, budou-li použ ity referenč ní látky strukturněpř íbuzné se zkouš enou látkou. Nejsou-li taková data známa, ponechává se na experimentátorovi, aby vybral vhodné kalibrač ní látky. V takovém př ípaděby mě la být vybrána obecně jš í sada strukturně heterogenních látek. Látky a hodnoty K ou, které mohou být použ ity, jsou
XIX.1.4
uvedeny v dodatku, a to v tabulce 1 pro č istírenský kal a v tabulce 3 pro půdu. Volba jiných kalibrač ních látek by měla být zdůvodně na. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY HPLC se provádí na analytických kolonách plně ných komerčně dostupným kyanopropylem jako pevnou fází, obsahujícím lipofilní a polární slož ky. Použ ije se mírněpolární stacionární fáze na silikagelové matrici: – O – Si silikagel
XIX.1.5
– CH2 – CH2 – CH2 nepolární spacer
– CN polární slož ka
Podstata zkuš ební metody je obdobná jako ve zkuš ební metoděA.8 (rozdělovací koeficient, metoda HPLC). Př i průchodu kolonou v mobilní fázi zkouš ená látka interaguje se stacionární fází. V důsledku rozdě lování mezi mobilní a stacionární fází se postup zkouš ené látky zpomaluje. Dvojí slož ení stacionární fáze s polárními a nepolárními skupinami umož ňuje, aby polární a nepolární skupiny molekuly interagovaly podobným způsobem, jako je tomu u organického materiálu v půdě nebo č istírenském kalu. To umož ňuje stanovit vztah mezi retenč ním č asem na koloněa adsorpč ním koeficientem na organickém materiálu. Na sorpční chování zejména u polárních látek má významný vliv pH. V př ípadězemědě lských půd nebo nádrží s č istírenskými kaly se pH normálněpohybuje od pH 5,5 do 7,5. U disociujících látek se ve vhodném pufračním roztoku provedenou dvězkouš ky, a to jak s disociovanou formou, tak s nedisociovanou formou, avš ak pouze v př ípadě , že v rozmezí pH 5,5 až7,5 disociuje alespoň10 % zkouš ené slouč eniny. Vzhledem k tomu, že se k hodnocení použ ije pouze vztah mezi retencí na koloněHPLC a adsorpč ním koeficientem, není nutná žádná kvantitativní metoda, nýbržpouze stanovení retenč ního č asu. Je-li k dispozici vhodná sada referenč ních látek a lze-li realizovat standardní experimentální podmínky, je metoda rychlým a úč inným způsobem odhadu adsorpčního koeficientu Kou. POUŽITELNOST ZKOUŠKY Metoda HPLC je použ itelná pro chemické látky (radioizotopověznač ené i neznač ené), pro ně ž je k dispozici vhodný detekč ní systém (např . spektrofotometr, detektor radioaktivního zář ení) a ježjsou po dobu experimentu dostateč něstabilní. Můž e být zvláš těuž itečná pro chemické látky, jejichžstudium je v jiných experimentálních systémech obtíž né (tj. pro tě kavé látky, které nejsou rozpustné ve voděv koncentraci, kterou lze analyticky mě ř it, pro látky s vysokou afinitou k povrchu inkubač ních systémů). Metoda můž e být použ ita pro smě si, které dávají nerozliš itelný eluč ní pás. V takovém př ípaděse stanoví horní a dolní meze hodnot log Kou pro sloučeniny př ítomné ve smě si. Př i interpretaci výsledkůHPLC mohou ně kdy působit problémy neč istoty. Jejich vliv je vš ak malý, neboťzkouš ené látky lze jasněanalyticky identifikovat a od neč istot oddě lit. Metoda je validována pro látky uvedené v tabulce 1 v dodatku a byla rovně ž použita u ř ady jiných chemických látek z následujících chemických tř íd:
—
aromatické aminy (např . trifluralin (1-(dipropylamino)-2,6-dinitro-4-(trifluormethyl)benzen), 4-chloranilin, 3,5-dinitroanilin, 4-methylanilin, N-methylanilin, 1-nafylamin), — estery aromatických karoxylových kyselin (např . methyl-benzoát, ethyl-3,5-dinitrobenzoát), — aromatické uhlovodíky (např . toluen, xylen, ethylbenzen, nitrobenzen), — estery aryloxyfenoxypropanové kyseliny (např . diklofop-methyl, fenoxaprop-ethyl, fenoxaprop-P-ethyl), — benzimidazolové a imidazolové fungicidy (např . karbendazim, fuberidazol, triazoxid), — amidy karboxylových kyselin (např . 2-chlorbenzamid, N,N-dimethylbenzamid, 3,5-dinitrobenzamid, N-methylbenzamid, 2-nitrobenzamid, 3-nitrobenzamid), — chlorované uhlovodíky (např . endosulfan, DDT, hexachlorbenzen, kvintozen, 1,2,3-trichlorbenzen), — organofosforové insekticidy (např . azinfos-methyl, disulfoton, fenamifos, isofenfos, pyrazofos, sulprofos, triazofos), — fenoly (např . fenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentachlorfenol, 2,4,6-trichlorfenol, 1-naftol), — deriváty fenylmoč oviny (např . isoproturon, monolinuron, pencykuron), — pigmentová barviva (např . Acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct Red 81), — polyaromatické uhlovodíky (např . acenaften, naftalen), — 1,3,5-triazinové herbicidy (např . prometryn, propazin, simazin, terbutryn), — triazolové deriváty (např . tebukonazol, triadimefon, tradimenol, triapenthenol). Metoda není použ itelná u látek, které reagují s eluentem nebo stacionární fází. Není rovně ž použ itelná u látek, které interagují specifickým způsobem s anorganickými slož kami (např . tvoř í klastrové komplexy s minerály jílu). Metoda nemusí být použ itelná u povrchověaktivních látek, anorganických látek a mírných nebo silných organických kyselina a zásad. Lze stanovit Kou s hodnotami log Kou od 1,5 do 5,0. Disociující látky musí být měř eny s pufrovanou mobilní fázi, avš ak je tř eba dbát na to aby nedoš lo ke sráž ení slož ek pufru nebo zkouš ené látky. XIX.1.6 KRITÉRIA JAKOSTI XIX.1.6.1 Správnost Obvykle lze adsorpč ní koeficient zkouš ené látky stanovit v rozmezí ±0,5 ř ádu hodnoty stanovené násadovou rovnovážnou metodou (viz tabulka 1 v dodatku). Vyš š í míry správnosti lze dosáhnout, jsou-li použ ité referenč ní látky strukturněpř íbuzné se zkouš enou látkou. XIX.1.6.2 Opakovatelnost Stanovení se provedou alespoň dvojmo. Hodnoty log Kou získané z jednotlivých mě ř ení by mě ly ležet v rozmezí ±0,1. XIX.1.6.3 Reprodukovatelnost Dosud získané zkuš enosti s použ itím metody svě dč í o její validitě . Ově ř ování metody HPLC za použití 48 látek (př evážněpesticidů), u nichž
byla k dispozici spolehlivá data o Kou v půdě, vedlo ke korelač nímu koeficientu R = 0,95 (10, 11). Pro zlepš ení a validaci metody bylo proveden mezilaboratorní test za úč asti 11 laboratoř í (12). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2 v dodatku. XIX.1.7 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY XIX.1.7.1 Předběž ný odhad adsorpč ního koeficientu Rozdělovací pomě r oktanol-voda Pov (= Kow) a do urč ité míry i rozpustnost ve voděmohou být použ ity jako indikátory rozsahu adsorpce zejména u nedisociujících látek a mohou tedy být použity pro jeho př edběž né nalezení. Pro různé skupiny chemických látek byla publikována ř ada už iteč ných korelací (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). XIX.1.7.2 Přístroje a pomůcky Nezbytným vybavením je kapalinový chromatograf vybavený bezpulsním č erpadlem a vhodným detekč ním zař ízením. Doporučuje se použ ívat nástř ikový ventil se vstř ikovací smyč kou. Použ ije se komerční kyanopropylové chemicky vázané pryskyř ice na silikagelu (např . Hypersil a Zorbax CN). Mezi nástř ikem a analytickou kolonou může být umístěna ochranná př edkolona ze stejného materiálu. Kolony od různých dodavatelůse mohou podstatněliš it, pokud jde o úč innost. Pro orientaci by mě ly být dosaž eny následující kapacitní faktory: log k' > 0,0 pro log Kou = 3,0 a log k' > 0,4 pro log Kou = 2,0 př i použ ití smě si methanol/voda 55/45 % jako mobilní fáze. XIX.1.7.3 Mobilní fáze Bylo testováno několik mobilních fází a doporuč ují se následující dvě mobilní fáze: — methanol/voda (55/45 % obj.), — methanol/0,01M citrátový pufr pH 6,0 (55/45 % obj.). K př ípravěeluč ního rozpouš tě dla se použ ije methanol a voda nebo citrátový pufr č istoty pro HPLC. Smě s se př ed použ itím odplyní. Mě la by být provedena isokratická eluce. Nevyhovuje-li smě s methanol/voda, lze vyzkouš et smě si jiných organických rozpouš tě del s vodou, např . ethanol/voda nebo acetonitril/voda. U disociujících sloučenin se doporuč uje použití pufrač ního roztoku ke stabilizaci pH. Je nezbytné dbát na to, aby nedoš lo ke sráž ení solí a naruš ení kolony, ke kterému dochází u ně kterých smě sí organické fáze s pufrač ním roztokem. Nesmí být použ ity ž ádné př ísady, jako jsou iontověpárová č inidla, neboťmohou ovlivnit sorpč ní vlastnosti stacionární fáze. Takové změny stacionární fáze mohou být nevratné. Z tohoto důvodu musí být experimenty s použitím př ísad prováděny na zvláš tních kolonách. XIX.1.7.4 Rozpouš tě né látky Zkuš ební a referenč ní látky se rozpustí v mobilní fázi. XIX.1.8 PROVEDENÍ ZKOUŠKY XIX.1.8.1 Zkuš ební podmínky Bě hem měř ení se zaznamenává teplota. Pro zajiš tě ní konstantních podmínek bě hem kalibrace a př edbě ž ných měř ení a bě hem mě ř ení zkouš ené látky se velmi doporuč uje použ ití kolony s regulací teploty. XIX.1.8.2 Stanovení mrtvé doby t0 Pro stanovení mrtvé doby lze použ ít dvěrůzné metody (viz také bod 1.2). XIX.1.8.2.1 Stanovení mrtvé doby t0 pomocí homologické ř ady
Je ově ř eno, ž e tato metoda poskytuje spolehlivé a standardisované hodnoty t0. Podrobnosti viz zkuš ební metoda A.8: Rozdě lovací koeficient (n-oktanol/voda ) metodou za použití HPLC. XIX.1.8.2.2 Stanovení mrtvé doby t0 pomocí inertních látek, které nejsou kolonou zadrž ovány Tato technika je založ ena na nástř iku roztokůformamidu, moč oviny nebo dusič nanu sodného. Měř ení se provedou alespoňdvojmo. XIX.1.8.3 Stanovení retenčních č asůt R Referenč ní látky se vyberou tak, jak je uvedeno v bodě1.3. Pro stanovení jejich retenč ních č asůmohou být nastř íknuty jako směsný standard za př edpokladu, ž e je ově ř eno, ž e retenční č as ž ádného referenčního standardu není ovlivňován př ítomností jiných referenč ních standardů. Kalibrace by mě la být provádě na pravidelně , alespoňdvakrát denně, aby se zachytily nečekané změ ny úč innosti kolony. Nástř iky pro kalibraci by měly být provádě ny nejlépe př ed nástř ikem zkouš ené látky a po něm, aby se ově ř ilo, že nedoš lo ke změněretenčních č asů. Zkouš ené látky se nastř íknou oddě leně v co nejmenš ích množ stvích (aby se kolona nezahltila) a stanoví se jejich retenční č asy. S cílem zvýš it důvěryhodnost mě ř ení musí být provedena alespoň opakovaná stanovení. Hodnoty log Kou získané z jednotlivých měř ení by měly lež et v rozmezí ±0,25. XIX.1.8.4 Hodnocení Kapacitní faktory k' se vypočtou z mrtvé doby t0 a retenč ních časůt R vybraných referenč ních látek podle rovnice 4 (viz bod 1.2). Hodnoty log k' referenč ních látek se poté vynesou proti jejich hodnotám log Kou z násadových rovnovážných experimentů uvedených v tabulkách 1 a 3 v dodatku. Z této kř ivky se poté pomocí hodnoty log k' zkouš ené látky odečte její hodnota log Kou. Je-li z aktuálních výsledkůzř ejmé, že hodnota log Kou lež í mimo obor kalibrač ní kř ivky, zkouš ka se opakuje s vhodně jš ími referenč ními látkami. XIX.2 DATA A ZPRÁVY Zpráva musí obsahovat následující informace: — identita zkouš ené látky a referenčních látek, jejich čistota a podle potř eby hodnoty pKa , — popis zař ízení a pracovních podmínek, např . typ a velikost analytické (a ochranné) kolony, detekční zař ízení, mobilní fáze (pomě r slož ek a pH), rozpě tí teploty během mě ř ení, — mrtvá doba a použ ité metody jejího stanovení, — množ ství zkouš ené látky a referenčních látek zavedených do kolony, — retenční č asy referenčních sloučenin použitých ke kalibraci, — charakteristiky prolož ené regresní kř ivky (log k' versus log Kou) a graf regresní kř ivky, — průmě rná retenční data a odhad hodnoty log Kou zkouš ené slouč eniny. — chromatogramy. XIX.3
LITERATURA (1) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed.). (1990). Handbook of chemical property estimation methods, kap. 4, McGraw-Hill, New York.
(2)
J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the adsorption coefficient (Kou) for soils by HPLC. Chemosphere, 17, 1 67. (3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, str. 1050 – 1059. (4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, str. 227 – 231. (5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, str. 297 – 312. (6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical concept of soil water equilibria for nonionic organic compounds, Science, 106, str. 831 – 832. (7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, str. 833 – 846. (8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), str. 121 – 128. (9) M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. Chemosphere, 32(12), str. 2493 – 2504. (10) W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient in soilcomparison of different stationary phases, Chemosphere, 27(12), str. 2341 – 2352. (11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, str. 285 – 304. (12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), str. 1373 – 1384. DODATEK TABULKA 1 Porovnání hodnot Kou pro půdy a č istírenské kaly a hodnot vypoč tených skreeningovou metodou s HPLC 1, 2 Látka
Číslo CAS
Atrazin Linuron Fenthion Monuron Fenanthren Fenyl-benzoát Benzamid 4-Nitrobenzamid
1912-24-9 330-55-2 55-38-9 150-68-5 85-01-8 93-99-2 55-21-0 619-80-7
Log K ou pro čistírenské kaly 1,66 2,43 3,75 1,46 4,35 3,26 1,60 1,52
Log K ou pomocí HPLC 2,14 2,96 3,58 2,21 3,72 3,03 1,00 1,49
Log Kou pro půdy
0,48 0,53 0,17 0,75 0,63 0,23 0,60 0,03
1,81 2,59 3,31 1,99 4,09 2,87 1,26 1,93
Log Kou pomocí HPLC 2,20 2,89 3,40 2,26 3,52 2,94 1,25 1,66
0,39 0,30 0,09 0,27 0,57 0,07 0,01 0,27
Látka
Číslo CAS
Acetanilid Anilin 2,5-Dichloranilin
103-84-4 62-53-3 95-82-9
1
2
Log K ou pro čistírenské kaly 1,52 1,74 2,45
Log K ou pomocí HPLC 1,53 1,47 2,59
Log Kou pro půdy
0,01 0,27 0,14
1,26 2,07 2,55
Log Kou pomocí HPLC 1,69 1,64 2,58
0,08 0,43 0,03
W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), str. 121-128. W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludges. Chemosphere, 35 (1/2), str. 107-119.
TABULKA 2 Výsledky mezilaboratorního porovnávacího testu provedeného za účelem zlepš ení a validace metody s HPLC (11 zúč astně ných laboratoří)1 Látka Atrazin Monuron Triapenthenol Linuron Fenthion 1
Číslo CAS 1912-24-9 150-68-5 77608-88-3 330-55-2 55-38-9
Log Kou (OECD 106) 1,81 1,99 2,37 2,59 3,31
K ou Log K ou Metoda založená na HPLC 78 ± 16 1,89 100 ± 8 2,00 292 ± 58 2,47 465 ± 62 2,67 2062 ± 648 3,31
W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), str. 1373-1384.
TABULKA 3 Referenč ní látky doporučené pro skreeningovou metodu s HPLC na základě adsorpč ních dat pro půdu Referenční látka
Acetanilid Fenol 2-Nitrobenzamid N,N-Dimethylbenzamid 4-Methylbenzamid Methylbenzoát Atrazin Isoproturon 3-Nitrobenzamid Anilin 3,5-Dinitrobenzamid Karbendazim Triadimenol Triazoxide Triazofos Linuron Naftalen Endosulfan-diol Methiokarb Acid Yellow 219 1,2,3-Trichlorbenzen γ-HCH (lindan)
Číslo CAS
103-84-4 108-95-2 610-15-1 611-74-5 619-55-6 93-58-3 1912-24-9 34123-59-6 645-09-0 62-53-3 121-81-3 10605-21-7 55219-65-3 72459-58-6 24017-47-8 330-55-2 91-20-3 2157-19-9 2032-65-7 63405-85-6 87-61-6 58-89-9
Logaritmy stř edních hodnot z násadové rovnováž né metody 1,25 1,32 1,45 1,52 1,78 1,80 1,81 1,86 1,95 2,07 2,31 2,35 2,40 2,44 2,55 2,59 2,75 3,02 3,10 3,16 3,16 3,23
Počet hodnot K ou
Logaritmus smě rodatné odchylky
Zdroj
4 4 3 2 3 4 3 5 3 4 3 3 3 3 3 3 4 5 4 4 4 5
0,48 0,70 0,90 0,45 1,76 1,08 1,08 1,53 1,31 1,73 1,27 1,37 1,85 1,66 1,78 1,97 2,20 2,29 2,39 2,83 1,40 2,94
a) a) b) a) a) a) c) c) b) a) b) c) c) c) c) c) a) c) c) a) a) a)
Fenthion Direct Red 81 Pyrazofos a-Endosulfan Diklofop-methyl Fenanthren Basic Blue 41 (smě s)
55-38-9 3,31 3 2,49 c) 2610-11-9 3,43 4 2,68 a) 13457-18-6 3,65 3 2,70 c) 959-98-8 4,09 5 3,74 c) 51338-27-3 4,20 3 3,77 c) 85-01-8 4,09 4 3,83 a) 26850-47-5 4,89 4 4,46 a) 12270-13-2 DDT 50-29-3 5,63 1 — b) a) W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D Report No 106 01 044 (1994). b) B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Chemosphere, 22, str. 285-304. c) Data poskytnutá průmyslem.
XX. METODA PRO STANOVENÍ TOXICITY PRO REPRODUKCI U DAPHNIA MAGNA – metoda C.20 podle přílohy smě rnice 2001/59/ES XX.1
XX.1.1
XX.1.2
METODA Tato zkouš ka toxicity pro reprodukci je replikou metody OECD TG 211 (1998). ÚVOD Hlavním cílem zkouš ky je posoudit úč inky chemických látek na reprodukční schopnost druhu Daphnia magna. DEFINICE A JEDNOTKY Mateč né organismy: dafnie samič ího pohlaví, které jsou př ítomné na zač átku zkouš ky a jejich reprodukč ní schopnost je př edmě tem studie. Potomstvo: mladé dafnie pocházející z mateč ných organismův průbě hu zkouš ky. Nejniž š í koncentrace s pozorovanými úč inky (lowest observed effect concentration, LOEC): je nejniž š í zkouš ená koncentrace, př i nížje pro danou expozič ní dobu pozorován statisticky významný úč inek látky na reprodukci a na mortalitu matečných organismů (na úrovni pravděpodobnosti faleš něpozitivního hodnocení p < 0,05) ve srovnání s kontrolní skupinou, v průbě hu stanovené expoziční doby. Vš echny zkouš ené koncentrace vyš š í nežLOEC musí mít stejné nebo vážně jš í š kodlivé úč inky, nežúčinky pozorované př i koncentraci LOEC. Nelze-li tyto dvěpodmínky splnit, musí podrobněvysvětleno jak byla LOEC (a tedy i NOEC) zvolena. Koncentrace bez pozorovaných úč inků (no observed effect concentration, NOEC): je zkuš ební koncentrace bezprostř edněnižš í než LOEC, která př i srovnání s kontrolní skupinou nemá pro danou expoziční dobu statisticky významný úč inek (p < 0,05). ECx: je koncentrace zkouš ené látky rozpuš těné ve vodě , která pro danou expozič ní dobu vede k x% snížení reprodukce dafnií Daphnia magna. Imanentní růst populace: je míra růstu populace, v nížje zahrnuta reprodukční schopnost a mortalita specifická z hlediska stář í (20, 21, 22). V ustáleném stavu bude nulový. Pro rostoucí populaci bude kladný a pro sniž ující se populaci bude záporný. Je zř ejmé, že př i záporném růstu nelze druh zachovat a nakonec dojde k jeho vyhynutí. Mez detekovatelnosti: je nejniž š í koncentrace, v nížlze látku detekovat, nikoli vš ak stanovit.
XX.1.3
XX.1.4
XX.1.5
XX.1.6
Mez stanovitelnosti: je nejniž š í koncentrace, v nížlze látku kvantitativně namě ř it. Mortalita: organismus se zaznamená jako mrtvý, je-li nepohyblivý, tj. není-li schopen plavat nebo není-li u konč etin (př ívě sků) nebo u postabdomen pozorován pohyb do 15 s po lehkém zatř epání zkuš ební nádobou. (Použije-li se jiná definice, musí být uvedena společněs literární odkazem.) PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY Mladé samič í dafnie (mateč né organismy) na zač átku zkouš ky mladš í než 24 h se exponují zkouš ené látce př idané do vody v urč itém rozsahu koncentrací. Zkouš ka trvá 21 dní. Na konci zkouš ky se odhadne celkový poč et vylíhnutých živých potomkůpocházejících z jednoho matečného organismu, který př ežil do konce zkouš ky. To znamená, ž e nedospě lé dafnie pocházející z dospě lých dafnií, které v průběhu zkouš ky uhynuly, se z odhadůvyloučí. Reprodukč ní schopnost matečných organismůlze vyjádř it jiným způsobem (např . jako počet ž ivých potomkůpocházejících z jednoho mateč ného organismu za den, a to od prvního dne, kdy bylo potomstvo pozorováno), který se vš ak uvede doplňkověvedle celkového poč tu nedospě lých dafnií pocházejících z jedné mateč né dafnie živé na konci zkouš ky. Reprodukční schopnost organismů exponovaných zkouš ené látce se porovná s reprodukční schopností kontrolní skupiny (kontrolních skupin) s cílem stanovit nejniž š í koncentraci s pozorovanými úč inky (LOEC) a tím i koncentraci bez pozorovaných úč inků(NOEC). Kromětoho se data pokud mož no analyzují pomocí regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která vyvolává x% sníž ení reprodukční schopnosti, (tj. EC50, EC 20 nebo EC10). Musí být rovněžuvedeno př ežití matečných organismů a okamžik narození vylíhnutí prvních potomků. Zkoumány mohou být také jiné úč inky vyvolané látkou, které mají vliv na charakteristiky, jako jsou růst (např . vliv na délku) a př ípadněimanentní růst populace. INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE Mě ly by být k dispozici výsledky zkouš ky akutní toxicity (viz metoda C.2, č ást I) provedené u Daphnia magna. Výsledky mohou být už itečné pro volbu vhodného rozsahu zkuš ebních koncentrací ve zkouš kách toxicity pro reprodukci. Mě ly by být známy rozpustnost zkouš ené látky ve voděa tlak jejích par a mě la by být k dispozici spolehlivá analytická metoda kvantitativního stanovení látky ve zkuš ebních roztocích, a to s dolož eným výtěž kem a mezí stanovitelnosti. Už iteč nými informacemi o zkouš ené látce pro účely stanovení zkuš ebních podmínek mohou být strukturní vzorec, č istota látky, stálost na svě tle, pKa , P ov a výsledky zkouš ky snadné biologické rozlož itelnosti (viz metoda C.4). VALIDITA ZKOUŠKY Má-li být zkouš ka platná, musí být u kontrolní skupiny (kontrolních skupin) splně na následující kriteria reprodukč ní schopnosti: — mortalita mateč ných organismů(dafnií samič ího pohlaví) nesmí na konci zkouš ky př ekročit 20 %, — stř ední hodnota počtu ž ivých potomkůpocházejících z jednoho mateč ného organismu ž ivého na konci zkouš ky je ≥60. POPIS ZKUŠEBNÍ METODY
XX.1.6.1
XX.1.6.2
XX.1.6.3
Přístroje a pomůcky Zkuš ební nádoby nebo jiné př ístroje a pomůcky, které př ijdou do styku se zkuš ebními roztoky, by mě ly být skleně né nebo z jiného chemicky inertního materiálu. Zkuš ebními nádobami jsou obvykle skleněné kádinky. Kromětoho bude nezbytné některé nebo veš keré následující zař ízení: — př ístroj pro měř ení koncentrace kyslíku (s mikroelektrodou, nebo jiný vhodný př ístroj na mě ř ení koncentrace rozpuš tě ného kyslíku ve vzorcích malého objemu), — vhodný př ístroj pro regulaci teploty, — pH-metr, — vybavení pro stanovení tvrdosti vody, — zař ízení pro stanovení celkového organického uhlíku (TOC) ve vodě nebo zař ízení pro stanovení chemické spotř eby kyslíku (CHSK), — vhodné zař ízení pro ovládání rež imu osvě tlení a pro mě ř ení intenzity svě tla. Testovací organismy Ke zkouš ce se použije druh Daphnia magna Straus. Jiné druhy dafnií mohou být použity, pokud splňují př ípadná kritéria validity (kriterium validity týkající se reprodukční schopnosti kontrolních skupin by mě lo být relevantní pro daný druh dafnií). Použijí-li se jiné druhy dafnií, musí být jasněidentifikovány a jejich použ ití musí být zdůvodně no. Klon by mě l být identifikován nejlépe uvedením genotypu. Výzkum ukázal (1), ž e reprodukč ní schopnost klonu A (který pochází z institutu IRCHA ve Francii) (3) stabilněsplňuje kriterium validity, jímžje ≥60 potomkůna př ež ivš í mateč ný organismus př i kultivaci za podmínek popsaných v této metodě . Splňuje-li kultura dafnií prokazatelněkriteria validity pro tuto zkouš ku jsou př ijatelné i jiné klony. Na zač átku zkouš ky musí být dafnie 24 h staré a nesmí být první generací. Musí pocházet ze zdravé kultury (tj. nesmí vykazovat známky stresu projevující se vysokou mortalitou, př ítomnost jedincůsamčího pohlaví a epifií, zpož dění produkce prvních potomků, př ítomnost jinak zbarvených jedinců atd.). Organismy ze zásobní kultury musí být chovány v podmínkách podobných tě m, které mají být použ ity př i zkouš ce (osvě tlení, teplota, médium, krmení a počet dafnií na jednotku objemu). Liš í-li se kultivač ní médium pro dafnie, které má být použ ito př i zkouš ce, od média použ ívaného k rutinní kultivaci dafnií, doporuč uje se zař adit př ed zkouš kou obvykle tř ítýdenní aklimatizač ní období (tj. v délce odpovídající jedné generaci), aby nedoš lo u mateč ných organismůke stresu. Zkuš ební médium Doporuč uje se, aby bylo v této zkouš ce použito př esně definované médium. Tím se lze vyhnout použ ití př ísad, které je obtížné charakterizovat (např . moř ských ř as, půdy, extraktu atd.) a zvýš it vyhlídky mezilaboratorní standardizace. Jako vyhovující pro tento úč el byla shledána Elendtova média M4 (4) a M7. Př ijatelná jsou vš ak i jiná média (např . (5, 6)), splňuje-li př i jejich použití reprodukč ní schopnost kultury dafnií prokazatelněkriteria validity pro tuto zkouš ku. Použ ije-li se médium, které obsahuje nedostateč něcharakterizovatelné př ísady, měly by být tyto př ísady jasněspecifikovány a v protokolu o
XX.1.6.4
zkouš ce se uvedou informace o jejich slož ení, to zejména o obsahu organického uhlíku, neboťmůže př ispívat k dodávané stravě . Doporuč uje se, aby byl stanoven celkový organický uhlík (TOC) a/nebo chemická spotř eba kyslíku (CHSK) výchozí formy organické př ísady a aby byl odhadnut výsledný př íspě vek k TOC nebo CHSK ve zkuš ebním médiu. Doporuč uje se, aby byly úrovněTOC v médiu (tj. př ed př idáním ř as) niž š í -1 než2 mg·l (7). Př i zkouš ení látek obsahujících kovy je důlež ité si uvě domit, ž e vlastnosti zkuš ebního média (např . tvrdost, chelatač ní schopnosti) mohou mít vliv na toxicitu látky. Z tohoto důvodu je ž ádoucí, aby bylo médium př esně definováno. V současnosti jsou vš ak jedinými př esnědefinovanými médii, o nichžje známo, ž e jsou vhodná pro dlouhodobou kultivaci kultury druhu Daphnia magna, Elendtova média M4 a M7. Oběmédia obsahují chelatač ní č inidlo EDTA. Práce (2) ukázala, že provádí-li se zkouš ka v médiích M4 a M7, je „zdánlivá toxicita“ kadmia zpravidla niž š í než v médiu, které neobsahuje EDTA. Média M4 a M7 se tedy nedoporuč ují pro zkouš ení látek obsahujících kovy a neměla by se použ ívat ani jiná média obsahující č inidla známá svojí chelatační schopností. V př ípadě látek obsahujících kovy se doporuč uje použ ívat jiné médium, např íklad rekonstituovanou tvrdou sladkou vodu podle ASTM (7), která neobsahuje EDTA a do níž je př idán extrakt z ř as (8). Tato kombinace rekonstituované tvrdé sladké vody podle ASTM a extraktu z ř as je také vhodná pro dlouhodobou kultivaci druhu Daphnia magna (2) a pro zkouš ení na tomto druhu, př estož e vykazuje slabé chelatační účinky způsobené organickými složkami př idaného extraktu z ř as. Na zač átku zkouš ky a v jejím průbě hu by mě la být koncentrace rozpuš těného kyslíku vyš š í než3 mg·l-1. pH by mělo být v rozmezí 6 až9 a zpravidla by se nemě lo v žádné zkouš ce měnit o více než1,5. -1 Doporuč uje se tvrdost nad 140 mg·l (jako CaCO3). Ve zkouš kách př i této a vyš š í tvrdosti reprodukč ní schopnost prokazatelněvyhovovala kritériím validity (9, 10). Zkuš ební roztoky Zkuš ební roztoky o zvolených koncentracích se obvykle př ipraví ř edě ním zásobního roztoku. Zásobní roztoky se př ipraví nejlépe rozpuš těním látky ve zkuš ebním médiu. Pro př ípravu vhodněkoncentrovaného zásobního roztoku můž e být ně kdy nezbytné použ ití organických rozpouš tě del nebo dispergátorů, měla by vš ak být vynalož ena maximální snaha takové látky nepouž ívat. Ke vhodným rozpouš tě dlům patř í aceton, ethanol, methanol, dimethylformamid a triethylenglykol. Ke vhodným dispergátorům patř í Cremophor RH40, 0,01% methylcellulosa a HCO-40. V ž ádném př ípadě by vš ak nemě l být obsah zkuš ební látky ve zkuš ebních roztocích vyš š í než je její rozpustnost ve zkuš ebním médiu. K př ípravězásobního roztoku, který lze př esnědávkovat do vody, se použ ijí rozpouš tě dla. Př i doporuč ené koncentraci rozpouš tě dla v konečném zkuš ebním médiu (tj. ≤0,1 ml·l-1) nejsou výš e uvedená rozpouš tědla toxická a nezvyš ují rozpustnost látky ve vodě . Dispersanty mohou usnadnit př esné dávkování a dispergaci. Př i -1 doporuč ené koncentraci v konečném zkuš ebním médiu (tj. ≤0,1 ml·l )
XX.1.7
XX.1.8 XX.1.8.1 XX.1.8.1.1 XX.1.8.1.2
XX.1.8.1.3
XX.1.8.1.4
nejsou výš e uvedené dispergátory toxické a nezvyš ují rozpustnost látky ve vodě . USPOŘÁDÁNÍ ZKOUŠKY Expozice se rozvrhne pro jednotlivé zkuš ební nádoby a veš keré dalš í obsluhování zkuš ebních nádob se provádí náhodně . Nedodržení této zásady může vést k jednostrannému vychýlení, které můž e být považováno za úč inek koncentrace. Jsou-li např íklad experimentální jednotky obsluhovány v poř adí zahájení expozice nebo v poř adí koncentrací, mohl by ně jaký č asově podmíně ný efekt, např . únava obsluhy nebo jiné pochybení, vést k vyš š ím účinkům př i vyš š ích koncentracích. Mohou-li být dále výsledky ovlivněny počáteč ními podmínkami zkouš ky nebo okolními podmínkami, jako je např . umístění v laboratoř i, mě lo by být zváž eno blokové uspoř ádání zkouš ky. POSTUP Podmínky expozice Délka expozice Zkouš ka trvá 21 dní. Nasazování Mateč né organismy se umístí po jednom do zkuš ebních nádob s 50 až 100 ml média. Aby bylo mož né splnit pož adavky analytické metody použ ité pro stanovení koncentrace zkouš ené látky, můž e být v ně kterých př ípadech nezbytné použ ít vě tš í objemy, př ípustné je rovněžsdružování paralelních vzorkůk chemické analýze. Jsou-li použ ity objemy větš í než100 ml, může být nezbytné zvýš it krmné dávky podávané dafniím, aby se zajistila odpovídající dostupnost stravy a splnila kritéria validity. U průtokových zkouš ek mohou být z technických důvodů zvážena jiná uspoř ádání (např . čtyř i skupiny po 10 organismech ve větš ím zkuš ebním objemu), avš ak jakékoli změny uspoř ádání zkouš ky musí být ale uvedeny v závě rečné zprávě . Počet organismů U semistatických zkouš ek se nasadí jednotlivěalespoň10 organismůpro každou zkuš ební koncentraci a alespoň 10 organismů jednotlivě do zkuš ebních skupin. U průtokových zkouš ek se ukázalo vhodným rozdělit pro kaž dou koncentraci 40 organismůdo čtyřskupin po 10 organismech (1). Může být použit menš í poč et zkuš ebních organismů, př ič emžse doporuč uje na jednu koncentraci rozdě lit minimálně20 organismůdo dvou nebo více paralelních skupin o stejném poč tu organismů (např .č tyř i paralelní skupiny po pě ti dafniích). Je tř eba poznamenat, ž e u zkouš ek, př i nížse organismy nasazují jako skupiny, nebude mož né vyjádř it reprodukční schopnost jako poč et živých potomkůpocházejících z jednoho matečného organismu, který př ež il do konce zkouš ky v př ípadě , že mateč ný organismus uhyne. V takovém př ípaděse reprodukč ní schopnost vyjádř í jako „celkový počet ž ivých potomkůpocházejících z jednoho matečného organismu př ítomného na zač átku zkouš ky“. Krmení U semistatických zkouš ek se dafnie krmí nejlépe denně, alespoňvš ak tř ikrát týdně(tj. s výměnou média). Odchylky od této praxe (např .u průtokových zkouš ek) se uvedou ve zprávě.
Strava mateč ných organismůbě hem zkouš ky by mě la sestávat nejlépe z živých buněk ř as jednoho nebo více následujících druhů: Chlorella sp., Selenastrum capricornutum (nyní Pseudokirchneriella subcapitata (11)) a Scenedesmus subspicatus. Množ ství dodávané stravy by mělo vycházet z množ ství organického uhlíku (C) dodávaného na jeden mateč ný organismus. Výzkum (12) ukázal, ž e u druhu Daphnia magna je postačující pro dosaž ení dostateč ného potomstva nezbytného pro splnění kritérií validity množ ství stravy od 0,1 do 0,2 mg C na dafnii za den. Strava můž e být dodávána buď ve stejných dávkách po celou dobu zkouš ky, nebo podle pož adavku v nižš ích dávkách na začátku zkouš ky a poté ve zvyš ujících se dávkách s ohledem na růst mateč ných organismů. V takovém př ípaděby mě lo množství stravy po celou dobu zůstat v doporuč eném rozmezí 0,1 až0,2 mg C na dafnii za den. Použ ije-li se k urč ení potř ebného množ ství stravy zástupný ukazatel, jako je poč et buněk ř as nebo absorbance ve viditelném svě tle, musí každá laboratořvytvoř it vlastní nomogram vztahu zástupného ukazatele a obsahu uhlíku v kultuř e ř as (viz dodatek 2 s návodem na vytvoř ení nomogramu). Nomogramy by mě ly být ově ř ovány jednou ročněa častě ji v př ípadě , že se změ ní podmínky kultivace ř as. Absorbance ve viditelném svě tle byla shledána lepš ím zástupným ukazatelem celkového obsahu uhlíku, nežpočet buněk (13). Dafniím by mě la být dodávána koncentrovaná suspenze ř as, aby se minimalizoval objem kultivač ního média ř as uvádě ný do zkuš ební nádoby. Zkoncentrování ř as lze dosáhnout centrifugací a následnou resuspenzí v destilované vodě, v deionisované voděnebo v kultivač ním médiu dafnií. XX.1.8.1.5 Osvě tlení 16 hodin svě tla př i intenzitěnepř ekrač ující 15 až20 µE m -2·s-1. XX.1.8.1.6 Teplota Teplota zkuš ebního média by se mě la pohybovat v rozmezí 18 až22 °C. Vž ádné zkouš ce by vš ak teplota nemě la v tě chto mezích kolísat o více než2 °C (např . 18 až20, 19 až21 nebo 20 až22 °C). Pro účely sledování teploty můž e být vhodné použ ít dalš í zkuš ební nádobu. XX.1.8.1.7 Provzduš ňování Zkuš ební nádoby nesmí být v průbě hu zkouš ky provzduš ňovány. XX.1.8.2 Zkuš ební koncentrace Zpravidla se použ ije alespoň pě t zkuš ebních koncentrací tvoř ících geometrickou ř adu s faktorem nepř ekračujícím 3,2 a př imě ř ený poč et paralelních zkuš ebních skupin v rámci kaž dé zkuš ební koncentrace (viz bod 1.8.1.3). Použ ití méněnežpě ti koncentrací by mě lo být zdůvodně no. Látky by nemě ly být zkouš eny pro koncentrace vyš š í, nežje jejich rozpustnost ve zkuš ebním médiu. Př i volběrozsahu koncentrací by měly být zohledněny následující zásady: i) je-li cílem získat LOEC/NOEC, musí být nejnižš í zkuš ební koncentrace dostatečněnízká, aby nebyla plodnost př i této koncentraci významněniž š í, nežplodnost v kontrolní skupině. V opačném př ípaděbude muset být zkouš ka opakována se sníž enou nejnižš í koncentrací; ii) je-li cílem získat LOEC/NOEC, musí být nejvyš š í zkuš ební koncentrace dostateč ně vysoká, aby byla plodnost př i této
XX.1.8.3
XX.1.8.4
XX.1.8.5
koncentraci významně nižš í, nežplodnost v kontrolní skupině . V opačném př ípaděbude muset být zkouš ka opakována se zvýš enou nejvyš š í koncentrací; iii) má-li být pro úč inky na reprodukci odhadnuta EC x, doporuč uje se, aby byl použ it dostateč ný poč et koncentrací s cílem zjistit ECx s př ijatelným intervalem spolehlivosti. Je-li znám odhad EC50 pro účinky na reprodukci, doporuč uje se, aby byla nejvyš š í zkuš ební koncentrace vyš š í nežtato EC50. Jinak sice bude stále možné odhadnout EC50 , interval spolehlivosti vš ak bude velmi š iroký a nemusí být možné uspokojivé posouzení př imě ř enosti navrženého modelu; iv) do rozsahu zkuš ebních koncentrací by nejlépe neměly spadat koncentrace, které mají statisticky významný účinek na př ež ití dospě lců, neboťby mohl být změně n charakter zkouš ky z pouhé zkouš ky toxicity pro reprodukci na kombinovanou zkouš ku toxicity pro reprodukci a mortality, která vyžaduje daleko složitějš í statistickou analýzu. Př edcházející znalost toxicity zkouš ené látky (např . ze zkouš ek akutní toxicity nebo z orientač ních studií) by mě la pomoci př i volběvhodných zkuš ebních koncentrací. Použ ije-li se k usnadnění př ípravy zásobního roztoku rozpouš tědlo nebo dispergátor (viz bod 1.6.4), neměla by být jeho koneč ná koncentrace ve zkuš ební nádoběvyš š í než0,1 ml·l-1 a mě la by být ve vš ech zkuš ebních nádobách stejná. Kontrolní skupiny Kromězkuš ební série se nasadí jedna série kontrolních skupin pro kontrolu zkuš ebního média a podle potř eby jedna série kontrolních skupin obsahujících rozpouš tědlo nebo dispergátor. Použ ije-li se rozpouš tědlo nebo dispergátor, mě la by být jejich koncentrace stejná jako koncentrace v nádobách se zkouš enou látkou. Použije se vhodný poč et paralelních skupin (viz oddíl 1.8.1.3). V dobř e vedených zkouš kách by měl být variač ní koeficient stř edního poč tu ž ivých potomků narozených každému mateč nému organismu v kontrolní skupině(kontrolních skupinách) zpravidla ≤25 %, a to by mělo být uvedeno v plánu zkouš ek s oddě lenými jedinci. Obnovování zkuš ebního média Častost obnovování média bude záviset na stálosti zkouš ené látky, médium se vš ak obnovuje alespoň tř ikrát týdně. Není-li podle př edběž ných zkouš ek stálosti (viz bod 1.4) koncentrace zkouš ené látky po maximální dobu mezi obnoveními média (tj. po tř i dny) stálá (tj. nepohybuje se v intervalu 80 – 120 % nominální koncentrace nebo klesá pod 80 % namě ř ené poč áteční koncentrace), mě l by být zváženo č astě jš í obnovování média nebo průtoková zkouš ka. Př i obnovování média v semistatických zkouš kách se př ipraví druhá série zkuš ebních nádob a mateč né organismy se do nich př enesou např . skleněnou pipetou o vhodném průmě ru. Objem média př eneseného s dafniemi by mě l být co nejmenš í. Pozorování Výsledky pozorování prováděných během zkouš ky se zaznamenávají do př ehledu dat (viz př íklady v dodatcích 3 a 4). Jsou-li pož adována dalš í
XX.1.8.6
XX.1.8.7
XX.1.8.8
XX.1.8.9
měř ení (viz body 1.3 a 1.8.8), může být nezbytné provádět dalš í pozorování. Potomstvo Potomstvo pocházející z kaž dého mateč ného organismu se od jeho prvního výskytu nejlépe denněvybírá a poč ítá, aby nespotř ebovávalo potravu urč enou pro dospě lého jedince. Pro úč ely této metody je tř eba započ ítat pouze ž ivé potomstvo, avš ak zaznamenává se i př ítomnost potracených vajíč ek nebo mrtvého potomstva. Mortalita Mortalita mateč ných organismůse zaznamenává nejlépe denně , alespoň souč asněs poč ítáním potomstva. Dalš í parametry Tř ebaž e je tato metoda navrž ena hlavně k posouzení úč inků na reprodukci, je mož né, aby byly v míř e dostateč né pro statistickou analýzu kvantifikovány i jiné úč inky. Užiteč né je zvláš těměř ení růstu, neboť poskytuje informaci o mož ných subletálních úč incích. Tato pozorování mohou být už itečně jš í nežsamotné měř ení reprodukce. Doporuč uje se změ ř it na konci zkouš ky délku mateč ných organismů(tj. délku tě la bez zadeč kového hrotu). K parametrům, které lze mě ř it nebo vypoč ítávat patř í dále doba do narození prvních plůdků(a následnědalš ích potomků), poč et a velikost potomkůna jeden organismus, počet potracených plůdků, př ítomnost jedincůsamč ího pohlaví nebo efipií a imanentní růst populace. Častost analytických stanovení a mě ření Alespoňjednou týdněse mě ř í koncentrace kyslíku, teplota, tvrdost a pH vč erstvém a ve starém médiu, v kontrolních nádobách a u nejvyš š í zkuš ební koncentrace. Bě hem zkouš ky se v pravidelných intervalech stanoví koncentrace zkouš ené látky stanovují U semistatických zkouš ek (s obnovením média), u nichžse má zkuš ební koncentrace pohybovat v rozmezí ±20 % nominálních hodnot (tj. od 80 do 120 % – viz body 1.4 a 1.4.8), se doporuč uje analyzovat alespoňnejvyš š í a nejniž š í zkuš ební koncentrace na zač átku studie ihned po jejich př ípravě a př i obnovování, a to jednou bě hem prvního týdne zkouš ky (tj. analýzy se provedou na vzorku z téhožroztoku – př i jeho př ípravěa př i obnovování). Tato stanovení se poté opakují alespoňv týdenních intervalech. U zkouš ek, u nichžse nepř edpokládá, ž e se bude koncentrace zkouš ené látky pohybovat v rozmezí ±20 % nominální hodnoty, je nezbytné analyzovat vš echny zkuš ební koncentrace, a to ihned po jejich př ípravěa př i obnovování. U zkouš ek, u nichžnení namě ř ená počáteč ní koncentrace zkouš ené látky v rozsahu ±20 % nominální koncentrace, avš ak u nichžlze dostateč něprokázat, že poč áteč ní koncentrace jsou reprodukovatelné a stálé, (tj. od 80 do 120 % poč átečních koncentrací), by mohla být stanovení ve 2. a 3. týdnu zkouš ky omezena na nejvyš š í a nejniž š í zkuš ební koncentrace. Ve vš ech př ípadech je stanovení koncentrací zkouš ené látky př ed obnovením tř eba provést pro kaž dou koncentraci pouze u jedné paralelní nádoby. U průtokových zkouš ek je vhodný podobný vzorkovací režim, jako je popsán u semistatických zkouš ek (v tomto př ípaděse vš ak neprovádí měř ení „starých“ roztoků). Doporučuje se vš ak zvýš it poč et odbě rů v prvním týdnu (např . tř i sady měř ení) pro ujiš tě ní, že jsou zkuš ební
XX.2
XX.2.1
koncentrace stálé. V těchto typech zkouš ky se průtok ř edicí vody a zkouš ené látky kontroluje denně. Lze-li vš ak prokázat, že po celou dobu zkouš ky byla koncentrace zkouš ené látky uspokojivě udržována v rozmezí ±20 % nominální hodnoty, mohou být výsledky založ eny na nominálních nebo namě ř ených poč átečních hodnotách. Je-li odchylka od nominální nebo namě ř ené poč áteční koncentrace vě tš í než±20 %, vyjádř í se výsledky jako časově vážené průmě ry (viz dodatek 5). DATA A ZPRÁVY ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ Úč elem této zkouš ky je stanovit úč inek zkouš ené látky na celkový poč et ž ivých potomkůpocházejících z jednoho matečného organismu, který př ežil do konce zkouš ky. Celkový poč et potomkůna mateč ný organismus se vypočte pro každou zkuš ební nádobu (tj. pro každou paralelní nádobu). Jestliž e v kterékoli paralelní nádoběmateč ný organismus během zkouš ky uhyne nebo se zjistí, že jde o sameč ka, vylouč í se nádoba z experimentu. Analýza se poté provede se zmenš eným poč tem paralelních nádob. Pro odhad LOEC a tedy i NOEC vztahujících se k úč inkům chemické látky na reprodukč ní schopnosti je nezbytné vypoč íst stř ední hodnotu reprodukční schopnosti př es vš echny paralelní nádoby pro kaž dou koncentraci a spojený residuální rozptyl, a to lze provést analýzou rozptylu (ANOVA). Stř ední hodnota pro kaž dou koncentraci musí být poté porovnána se stř ední hodnotou pro kontrolní skupinu, a to vhodnou metodou mnohonásobného porovnání. Už iteč nými mohou být Dunnettův nebo Williamsův test (14, 15, 16, 17). Je nezbytné ověř it, že je splně n př edpoklad homogenity rozptylu nezbytný pro ANOVA. Doporuč uje se provést ově ř ení radě ji graficky nežformálním testem významnosti (18); vhodnou alternativou je Bartlettův test. Není-li tento př edpoklad splně n, měla by být př ed provedením ANOVA zváž ena transformace dat za úč elem homogenizace rozptylu, nebo by mě la být provedena váž ená ANOVA. Vypočte a uvede se velikost úč inku zjistitelná pomocí ANOVA (tj. nejmenš í významný rozdíl). Pro odhad koncentrace, která způsobuje 50% sníž ení reprodukční schopnosti (tj. EC50), se daty proloží vhodná kř ivka (vhodné kř ivky), jako např . logaritmická kř ivka, a to statistickou metodou, např . metodou nejmenš ích č tvercůnebo nelineární metodou nejmenš ích č tverců. Kř ivka by mě la být tak parametrizována, aby bylo možné př ímo odhadnout EC50 a její smě rodatnou odchylku. To značněusnadní výpočet intervalů spolehlivosti pro hodnotu EC50. Pokud nejsou dobré důvody pro upř ednostnění jiných intervalůspolehlivosti, uvede se oboustranný 95% interval spolehlivosti. Metoda proložení by měla pokud možno umož nit posouzení závaž nosti nedostatkůproložení. To lze provést graficky nebo rozdělením residuálního součtu čtvercůna složku „chyby v prolož ení“ a „náhodné chyby“ a provedením testu významnosti chyby v prolož ení. Vzhledem k tomu, ž e u expozic, jejichždůsledkem je vyš š í reprodukční schopnost, je vě tš í rozptyl poč tu vylíhnutých potomkůnežu expozic vedoucích k nejniž š í reprodukč ní schopnosti, je tř eba promyslet váž ení pozorovaných hodnot s cílem zohlednit různé rozptyly u různě exponovaných skupin (viz výchozí informace (18)).
XX.2.2 XX.2.2.1
XX.2.2.2
XX.2.2.3
XX.2.2.4
Př i analýze dat z rozhodujícího okružního testu (2) byl použ it následující model prokládající logaritmickou kř ivku; lze vš ak použít i jiné modely: c Y xb 1 x0 kde: Y: celkový poč et ž ivých potomkůna matečný organismus, který př ež il do konce zkouš ky (vypoč teno pro každou nádobu) x: koncentrace látky c: očekávaný poč et potomkůpř ix=0 x0: EC 50 v populaci b: smě rnice. Tento model bude pravděpodobněvhodný pro velký poč et situací, budou vš ak existovat zkouš ky, pro ně žbude nevhodný. Jak je uvedeno výš e, je tř eba ově ř it validitu modelu. V ně kterých př ípadech můž e být vhodně jš í model př edpokládající rozmezí, u něhož vedou niž š í koncentrace k pozitivním úč inkům (19). Lze rovně žodhadnout dalš í koncentrace s urč itým úč inkem, např . EC10 nebo EC20, může být vš ak dobré použ ít jinou parametrizaci modelu, nežje použ ita pro odhad EC 50. PROTOKOL O ZKOUŠCE Protokol o zkouš ce musí obsahovat následující informace: Zkouš ená látka: — fyzikální povaha a relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti, — údaje o chemické identitěvčetněúdaje o č istotě . Testovací druhy: — klon (byl-li geneticky popsán), dodavatel nebo zdroj (je-li znám) a použité kultivač ní podmínky. Byl-li použ it jiný druh nežDaphnia magna, musí to být uvedeno a zdůvodněno. Zkuš ební podmínky: — použitý zkuš ební postup (např . semistatická nebo průtoková metoda, objem, velikost obsádky v počtu dafnií na litr), — fotoperioda a intenzita svě tla, — uspoř ádání zkouš ky (např . počet paralelních nádob, poč et mateč ných organismůna jednu paralelní nádobu), — podrobnosti o použ itém kultivač ním médiu, — byly-li použ ity, př ídavky organických látek vč etnějejich složení, zdroje, metody př ípravy, TOC/CHSK výchozích preparátů, odhad výsledného TOC/CHSK ve zkuš ebním médiu, — podrobné informace o krmení, včetněmnož ství (v mg C na dafnii za den) a plánu (např . typ krmiva, vč etněspecifického názvu (druhu) u ř as a kmene, je-li znám, kultivační podmínky), — metoda př ípravy zásobních roztokůa č astost obnovení (jsou-li použity, uvedou se rozpouš tědlo nebo dispergátor a jejich koncentrace), Výsledky: — výsledky př ípadných př edbě žných studií stálosti zkouš ené látky, — nominální zkuš ební koncentrace a výsledky vš ech analýz pro stanovení koncentrace zkouš ené látky ve zkuš ebních nádobách (viz
XX.3
př íklad formulář e pro př ehled dat v dodatku 4); uvede se také výtě ž ek metody a mez stanovitelnosti, — kvalita vody ve zkuš ebních nádobách (tj. pH, teplota, koncentrace rozpuš tě ného kyslíku a TOC a/nebo CHSK a dále podle potř eby tvrdost) (viz př íklad formulář e pro př ehled dat v dodatku 3), — celkový poč et ž ivých potomkůna kaž dý matečný organismus (viz př íklad formulář e pro př ehled dat v dodatku 3), — počet uhynulých mateč ných organismůa den, kdy k úhynu doš lo (viz př íklad formulář e pro př ehled dat v dodatku 3), — variační koeficient kontrolní reprodukč ní schopnosti (založ ený na celkovém poč tu živých potomkůna mateč ný organismus, který př ež il do konce zkouš ky), — kř ivka závislosti celkovém poč tu ž ivých potomkůna mateč ný organismus, který př ežil do konce zkouš ky (pro každou paralelní nádobu), na koncentraci zkouš ené látky — nejnižš í koncentrace s pozorovanými úč inky (LOEC) na reprodukci včetněpopisu použ itých statistických metod a údaje o velikosti účinku, který by mohl být detekován, a koncentrace bez pozorovaných účinků (NOEC) na reprodukci; je-li k dispozici, uvede se LOEC/NOEC pro mortalitu mateč ných organismů, — je-li k dispozici, ECx pro reprodukci a interval spolehlivosti, dále graf kř ivky modelu použ itého pro její výpoč et, směrnice kř ivky závislosti dávka-reakce a její směrodatná odchylka, — jiné pozorované biologické úč inky a jiná mě ř ení: uvedou se jakékoli jiné biologické úč inky, které byly pozorovány nebo změř eny (např . růst mateč ných organismů) včetněpř iměř eného zdůvodně ní, — vysvě tlení jakékoli odchylky od této zkuš ební metody. LITERATURA (1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 20. – 21. bř ezen 1993. (2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring Test of the Daphnia magna Reproduction Test Pař íž1997. (3) Baird D. J., Barber J., Bradley M. C., Soares A. M. V. M., Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss. Ecotoxicol. Environ. Safety, 21, str. 257 – 265. (4) Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, str. 25 – 33. (5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio. (6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 47, str. 775 – 782. (7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729-88a.
(8)
(9)
(10)
(11) (12)
(13)
(14)
(15) (16)
(17) (18) (19)
(20) (21) (22)
American Society for Testing and Materials, Philadelphia P.A. 20 str. Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley M. C., Calow P. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Lokke, H. Tyle & F. BroRasmussen. Eds.), str. 144 – 148. Parkhurst B. R., Forte J. L., Wright G. P. (1981). Reproducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 26, str. 1 – 8. Cowgill U. M., Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), str. 185 – 196. Korshikov (1990). Pseudokirchneriella subcapitata Hindak, F-1990. Biologice Prace, 36, 209. Sims I. R., Watson S., Holmes D. (1993). Toward a standard Daphnia juvenile production test. Environ. Toxicol. Chem., 12, str. 2053 – 2058. Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, str. 459 – 466. Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, str. 1096 – 1121. Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, str. 482 – 491. Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, str. 103 – 117. Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28, str. 510 – 531. Draper N. R., Smith H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition, Wiley, N.Y. Brain P., Cousens R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, str. 93 – 96. Wilson E. O., Bossert, W. H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers. Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, str. 532. Meyer J. S., Ingersoll C. G., McDonald L. L., Boyce M. S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, str. 1156 – 1166.
DODATEK 1 PŘÍPRAVA PŘESNĚDEFINOVANÝCH ELENDTOVÝCH MÉDIÍ M7 A M4 Aklimatizace na Elendtova média M7 M4
Ně které laboratoř e narazily na obtíž e př i př ímém př enosu dafnií do médií M4 (1) a M7. Urč itého úspěchu vš ak bylo dosaženo postupnou aklimatizací, tj. př enesením z vlastního média do 30% Elendtova média, poté do 60% Elendtova média a nakonec do 100% Elendtova média. Délky doby aklimatizace mohou být ažjeden mě síc. PŘÍPRAVA Stopové prvky Ve voděvhodné č istoty, např . v deionisované nebo destilované voděnebo ve vodě př eč iš těné reverzní osmosou, se nejprve př ipraví samostatné zásobní roztoky (I) jednotlivých stopových prvků (I). Z tě chto oddě lených zásobních roztoků(I) se př ipraví jeden zásobní roztok (II) obsahující vš echny stopové prvky (smě sný roztok), tj.: Zásobní roztoky I (jednotlivá látka)
H3 BO3 MnCl 2·4H2O LiCl RbCl SrCl 2·6H2O NaBr Na 2MoO4 ·2H2 O CuCl2 ·2H2 O ZnCl 2 CoCl2 ·6H2 O KI Na 2SeO3 NH 4VO3 Na 2EDTA·2H 2O FeSO 4·7H2O
Množství př idané do vody (mg·l- 1)
57 190 7 210 6 120 1 420 3 040 320 1 260 335 260 200 65 43,8 11,5 5 000 1 991
Koncentrace Kombinovaný zásobní roztok II se (vzhledem k médiu př ipraví př idáním následujícího M4) množ ství zásobního roztoku I do (násobek) vody -1 (ml·l ) M4 M7 20 000 1,0 0,25 20 000 1,0 0,25 20 000 1,0 0,25 20 000 1,0 0,25 20 000 1,0 0,25 20 000 1,0 0,25 20 000 1,0 0,25 20 000 1,0 0,25 20 000 1,0 1,0 20 000 1,0 1,0 20 000 1,0 1,0 20 000 1,0 1,0 20 000 1,0 1,0 2 000 — — 2 000 n — —
Jak roztok Na2 EDTA, tak roztok FeSO4 se př ipraví samostatně , spojí se a ihned se autoklávují. Získají se: 2 litry roztoku Fe-EDTA 1 000 20,0 5,0
Média M4 a M7 Média M4 a M7 se př ipraví ze zásobního roztoku II, makroživin a vitaminů následujícím způsobem: Množství př idané do vody -1 (mg·l ) Zásobní roztok II obsahující kombinaci stopových prvků Zásobní roztok makrož ivin (jednotlivá látka) CaCl 2·2H2O 293 800 MgSO 4·7H2O 246 600 KCl 58 000 NaHCO 3 64 800 Na 2SiO 3·9H2O 50 000 NaNO3 2 740 KH 2PO4 1 430 K2 HPO4 1 840
Koncentrace (vzhledem k médiu M4) (násobek) 20
1 000 2 000 10 000 1 000 5 000 10 000 10 000 10 000
Množ ství zásobního roztoku př idané za účelem př ípravy média -1 (ml·l ) M4 M7 50 50
1,0 0,5 0,1 1,0 0,2 0,1 0,1 0,1
1,0 0,5 0,1 1,0 0,2 0,1 0,1 0,1
Množství př idané do vody (mg·l- 1)
Koncentrace (vzhledem k médiu M4) (násobek) 10 000
Množ ství zásobního roztoku př idané za účelem př ípravy média -1 (ml·l ) M4 M7 0,1 0,1
Kombinovaný vitaminový — zásobní roztok Kombinovaný vitaminový zásobní roztok se př ipraví př idáním 3 vitaminůdo 1 litru vody takto: Thiamin-hydrochlorid 750 10 000 — — Kyanokobalamin (B 12) 10 10 000 — — Biotin 7,5 10 000 — —
Kombinovaný vitaminový zásobní roztok se uchovává v malých hluboce zmrazených podílech. Vitaminy se př idají do média krátce př ed použ itím. Poznámky: Aby nedoš lo př i př ípravěkompletního média k vysráž ení solí, př idají se podíly zásobních roztokůdo asi 500 – 800 ml deionisované vody a objem se poté doplní na 1 litr. Poprvé byly informace o médiu M4 uvedeny v práci Elendt, B. P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, str. 25-33.
DODATEK 2 ANALÝZA CELKOVÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (TOC) A VYTVOŘENÍ NOMOGRAMU PRO OBSAH TOC V KRMIVU NA BÁZI ŘAS Je pochopitelné, ž e obsah uhlíku v krmivu na bázi ř as se nebude normálněmě ř it př ímo, ale stanoví se z korelací (tj. z nomogramů) se zástupnými ukazateli, jako jsou počet buněk ř as nebo absorbance ve viditelném světle. TOC by mě l být stanoven spíš e vysokoteplotní oxidací nežpomocí UV nebo persíranovou metodou. (Viz: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB). Pro úč ely vytvoř ení nomogramu se ř asy oddě lí od růstového média centrifugací a poté se resuspendují v destilované vodě . Zástupný ukazatel a koncentrace TOC se mě ř í v kaž dém vzorku trojmo. Provede se analýza slepého pokusu s destilovanou vodou a jeho koncentrace TOC se odeč te od koncentrace TOC ve vzorku s ř asami. Nomogram by měl být lineární v pož adovaném rozsahu koncentrací uhlíku. Př íklady jsou uvedeny níže. Upozornění: Tyto př íklady nelze pro úč ely př epoč tu použít; je důlež ité, aby si laboratoř e př ipravily vlastní nomogramy.
Chlorella vulgaris, var. viridis (CCAP 211/12). Regresní kř ivka vztahu koncentrace v mg suché hmotnosti na litr a množ ství uhlíku v mg C·na litr. Data z koncentrovaných suspenzí semikontinuálně dávkověkultivovaných buně k, resuspendovaných v destilované vodě . Koncentrace suš iny krmiva na bázi ř as, mg·l- 1
Korelač ní koeficient – 0,980
mg C/l koncentrovaného krmiva na bázi ř as
Chlorella vulgaris, var. viridis (CCAP 211/12). Regresní kř ivka vztahu poč tu buně k a množ ství uhlíku v mg C·na litr. Data z koncentrovaných suspenzí semikontinuálnědávkověkultivovaných buně k, resuspendovaných v destilované vodě .
poč et buně k/l (×108) zkoncentrovaného krmiva na bázi ř as
Korelač ní koeficient – 0,926
mg C/l koncentrovaného krmiva na bázi ř as
Chlorella vulgaris, var. viridis (CCAP 211/12). Regresní kř ivka vztahu absorbance a množ ství uhlíku v mg C·na litr (optická dráha 1 cm). Data z koncentrovaných suspenzí semikontinuálně dávkověkultivovaných buně k, resuspendovaných v destilované vodě . Absorbance koncentrovaného krmiva na bázi ř as zř edě ného 1:10 př i 440 nm
Korelač ní koeficient – 0,998
mg C/l koncentrovaného krmiva na bázi ř as
DODATEK 3 PŘÍKLAD FORMULÁŘE PŘEHLEDU DAT PRO ZAZNAMENÁNÍ OBNOVY MÉDIA, SLEDOVANÝCH FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH DAT, KRMENÍ, REPRODUKČNÍ SCHOPNOSTI DAFNIÍ A MORTALITY DOSPĚLCŮ Experiment č .: Datum zahájení: Klon: Médium: Typ krmiva: Zkouš ená látka: Nominální koncentrace: Den Obnovení (zaš krtně te) pH1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
média
-1
O2 mg·l (1) Teplota (°C)1
nové staré nové staré nové staré
Podání krmiva (zaš krtně te) 2 Počet ž ivých potomků Nádoba 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Celkem
Celkem Kumulativní mortalita 3 dospě lců 1 2
Uvede se, ve které nádoběbylo měř ení provedeno. Do př ísluš né buňky se zaznamenají potracené plůdky jako „AB“ (aborted broods).
3
Do př ísluš né buňky se zaznamená mortalita dospělcůjako „M“.
DODATEK 4 PŘÍKLAD FORMULÁŘE PŘEHLEDU DAT PRO ZAZNAMENÁNÍ VÝSLEDKŮ CHEMICKÉ ANALÝZY a)
Namě ř ené koncentrace Nominální koncentrace
b)
Vzorek z týdne 1 Čerstvé Staré médium médium
Vzorek z týdne 2 Čerstvé Staré médium médium
Vzorek z týdne 3 Čerstvé Staré médium médium
Namě ř ené koncentrace vyjádř ené v procentech nominální koncentrace Nominální koncentrace
Vzorek z týdne 1 Čerstvé Staré médium médium
Vzorek z týdne 2 Čerstvé Staré médium médium
Vzorek z týdne 3 Čerstvé Staré médium médium
DODATEK 5 VÝPOČET ČASOVĚVÁŽENÉ STŘEDNÍ HODNOTY Časověváž ená stř ední hodnota Vzhledem k tomu, ž e mezi výmě nami média můž e koncentrace zkouš ené látky klesat, je nezbytné zvážit, jaká koncentrace bude považována za reprezentativní pro rozsah koncentrací, jimžbyly dospě lé dafnie vystaveny. Výbě r by mě l být založ en na biologických i statistických úvahách. Vychází-li se např íklad z toho, ž e reprodukce je ovlivňována hlavněmaximální koncentrací, jížbyl organismus vystaven, měla by být tedy použ ita maximální koncentrace. Považuje-li se vš ak za významně jš í akumulované nebo dlouhodobé působení toxické látky, má vě tš í opodstatně ní průmě rná koncentrace. V takovém př ípaděje vhodným průmě rem časověvážená stř ední koncentrace, neboťzohledňuje č asové změny okamžité koncentrace.
Dny
Obrázek 1: Příklad č asověváž ené střední hodnoty
Na obrázku 1 je znázorně n př íklad (zjednoduš ené) zkouš ky trvající sedm dní s obnovou média v den 0, 2 a 4. — Tenká klikatá čára znázorňuje koncentraci v kterémkoli okamžiku. Má se za to, že pokles koncentrace sleduje proces exponenciálního rozkladu buně k. — Šest vyznač ených bodůpř edstavuje koncentrace namě ř ené na zač átku a na konci období mezi obnoveními média. — Silná plná čára vyznač uje hodnotu č asověváž ené stř ední hodnoty. Časověvážená stř ední hodnota je vypoč tena tak, aby se plocha pod č arou pro č asověváženou stř ední hodnotu rovnala ploš e pod č arou průbě hu koncentrace. Výpoč et pro výš e uvedený př íklad je ilustrován v tabulce 1. Tabulka 1: Výpoč et č asověváž ené střední hodnoty Obnovení Dny média č. 1 2 2 2 3 3 Celkový poč et dnů: 7
Konc0
Konc1
ln(Konc0)
ln(Konc1 )
Plocha
10 000 11 000 10 000
4,493 6,037 4,066
2,303 2,398 2,303
1,503 1,798 1,403 Celková plocha ČV stř ední hodnota
13,767 16,544 19,781 50,091 7,156
„Dny“ se rozumí poč et dnůmezi obnoveními média. „Konc0“ je namě ř ená koncentrace na zač átku období mezi obnoveními média. „Konc1“ je namě ř ená koncentrace na konci období mezi obnoveními média. „ln (Konc0)“ je př irozený logaritmus Konc0. „ln (Konc1)“ je př irozený logaritmus Konc1. „Plocha“ je plocha pod exponenciální kř ivkou pro každé období mezi obnoveními média. Vypoč te se z rovnice: Konc0 Konc1 Plocha Dny ln(Konc0 ) ln(Konc1 ) Časověvážená stř ední hodnota („ČV stř ední hodnota“) se vypoč te jako podíl „celkové plochy“ a „celkového počtu dnů“. Pro zkouš ku toxicity pro reprodukci na dafniích se tabulka pochopitelněrozš íř í tak, aby pokrývala 21 dnů. Je zř ejmé, že provádí-li se mě ř ení pouze na začátku a na konci období mezi obnoveními média, není mož né potvrdit, že proces rozkladu je skuteč něexponenciální. Jiná kř ivka by vedla k jinému způsobu výpoč tu „Plochy“. Exponenciální rozklad vš ak není nepř ijatelný a jemu odpovídající kř ivka je pravdě podobněnejideálně jš í, chybí-li jiné informace. Je vš ak nezbytné postupovat opatrně, není-li v médiu na konci období mezi jeho obnoveními zjiš těno žádné množ ství zkuš ební látky. Není-li mož né odhadnout, jak rychle látka z roztoku zmizela, není možné získat realistickou plochu pod kř ivkou a není tedy možné získat rozumnou č asověváž enou stř ední hodnotu.
XXI. METODA PRO STANOVENÍ TRANSFORMACI DUSÍKU
AKTIVITY
PŮDNÍCH
MIKROORGANISMŮ
PŘI
(metoda C.21 podle př ílohy směrnice 2004/73/ES ze dne 29. dubna 2004, kterou se po dvacáté deváté př izpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbliž ování právních a správních př edpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek) XXI.1. XXI.1.1
XXI.1.2
XXI.1.3 XXI.1.4
METODA Tato zkuš ební metoda odpovídá metoděOECD TG 216 (2000). ÚVOD Tato zkuš ební metoda popisuje laboratorní postup pro vyš etř ování dlouhodobých úč inků chemických látek po jednorázové expozici na aktivitu půdních mikroorganismůpř i transformaci dusíku. Je založena na podkladech a doporučeních národních i mezinárodních organizací (viz literatura 1 až7). Př i posuzování a hodnocení toxických vlastností zkouš ených látek můž e být nezbytné stanovit úč inky na aktivitu půdních mikroorganismů, např . jsou-li pož adovány údaje o vedlejš ích účincích př ípravkůna ochranu rostlin na půdní mikroflóru nebo očekává-li se expozice půdních mikroorganismůchemickým látkám jiným nežpř ípravkům na ochranu rostlin. Cílem zkouš ky na transformaci dusíku je zjistit účinky takových chemických látek na půdní mikroflóru. Pokud se zkouš ejí agrochemikálie (např . př ípravky na ochranu rostlin, hnojiva, chemické př ípravky pro lesnictví), provádí se jak zkouš ka na transformaci dusíku, tak zkouš ka na transformaci uhlíku. Pokud se zkouš ejí jiné chemické látky nežagrochemikálie, postač uje zkouš ka na transformaci dusíku. Nacházejí-li se vš ak u tě chto chemických látek hodnoty EC50 pro transformaci dusíku v rozpětí hodnot nacházených pro komerč nědostupné inhibitory nitrifikace (např . nitrapyrin), lze pro získání dalš ích informací provést zkouš ku na transformaci uhlíku. Půdy se skládají z živých a neživých složek, které se vyskytují ve forměslož itých a heterogenních směsí. Mikroorganismy hrají důlež itou roli v rozkladu a transformaci organických látek v úrodných půdách, př ičemžrůzné druhy př ispívají k různým aspektům úrodnosti půdy. Jakékoli dlouhodobé poruš ení tě chto biochemických procesůby mohlo poruš it koloběh živin a to by mohlo mít vliv na úrodnost půdy. K transformaci uhlíku a dusíku dochází u vš ech úrodných půd. Ač koliv se populace mikroorganismůodpově dných za tyto procesy u jednotlivých pů d liš í, jedná se v podstatěo totéžschéma transformace. Popsaná zkuš ební metoda slouž í ke zjiš tění dlouhodobých nepř íznivých úč inkůlátky na proces transformace dusíku v aerobních povrchových půdách. Tato metoda rovněžumožňuje odhadnout úč inky látek na transformaci uhlíku půdní mikroflórou. K tvorbědusičnanůdochází po rozpadu vazeb uhlík-dusík. Pokud je tedy u zkuš ebních a kontrolních půd zjiš těna stejná rychlost tvorby dusič nanů, je vysoce pravdě podobné, že hlavní schéma odbourávání uhlíku je neporuš ené a funkční. Substrát zvolený pro zkouš ku (práš ková vojtěš ková moučka) má př íznivý poměr uhlíku a dusíku (obvykle od 12/1 do 16/1). Je tedy sníž en nedostatek uhlíku v průbě hu zkouš ky, a dojde-li k poš kození populace mikroorganismůchemickou látkou, můž e k jejich obnovědojít opě t do 100 dnů. Zkouš ka, na nížje založ ena tato zkuš ební metoda, byla zprvu vyvinuta pro látky, u nichžlze př edvídat množství, které pronikne do půdy. Př íkladem jsou př ípravky na ochranu rostlin, u nichž je polní aplikač ní dávka známá. U agrochemikálií postač uje provést zkouš ku se dvěma úrovně mi dávky, které odpovídají př edpokládané nebo odhadované aplikační dávce. U agrochemikálií lze zkouš et úč inné slož ky nebo př ípravky v komerč ní úpravě . Použ ití zkouš ky vš ak není omezeno pouze na agrochemikálie. Změ nou množ ství zkouš ené látky aplikované na půdu a způsobu vyhodnocení dat lze zkouš ku využ ít také pro chemické látky, u nichžnení známo, v jakém množ ství proniknou do půdy. U jiných chemických látek nežagrochemikálií se tedy stanovuje úč inek ř ady koncentrací na transformaci dusíku. Data z těchto zkouš ek se použ ijí k sestrojení kř ivky závislosti odezvy na dávce a k výpočtu hodnot ECX, kde x je procentuální úč inek. DEFINICE Transformace dusíku: je koneč ný rozklad dusíkaté organické látky mikroorganismy cestou amonifikace a nitrifikace na př ísluš ný koneč ný anorganický produkt - dusič nan. ECx (Účinná koncentrace): je koncentrace zkouš ené látky v půdě, která vede k x-procentní inhibici transformace dusíku na dusičnan. EC50 (Medián úč inné koncentrace): je koncentrace zkouš ené látky v půdě , která vede k 50% inhibici transformace dusíku na dusičnan. REFERENČNÍ LÁTKY Žádné. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY
Do proseté půdy se vpraví práš ková rostlinná moučka a na půdu se poté aplikuje zkouš ená látka, nebo se půda ponechá nedotč ená (jako kontrola). Př i zkouš ení agrochemikálií se doporučuje provést zkouš ku s nejménědvěma koncentracemi zvolenými tak, aby byly v urč itém vztahu k nejvyš š í př edpokládané koncentrací na poli. Po 0, 7, 14 a 28 dnech inkubace se vzorky exponované a kontrolní půdy vyluhují vhodným rozpouš tě dlem a stanoví se obsah dusičnanů. Rychlost tvorby dusičnanů v exponovaných vzorcích se porovnává s rychlostí v kontrolních vzorcích a vypoč te se procentuální odchylka hodnot experimentálních vzorkůod kontrolních vzorků. Vš echny zkouš ky musí probíhat alespoň 28 dnů. Jsou-li 28. den rozdíly mezi experimentální a kontrolní půdou 25 % nebo větš í, v měř ení se pokrač uje aždo 100 dnů. Př i zkouš ení jiných látek nežagrochemikálií se do vzorkůpůdy př idá ř ada koncentrací zkouš ené látky a množství vzniklých dusič nanův experimentálních a kontrolních vzorcích se měř í po 28denní inkubaci. Výsledky zkouš ek s více koncentracemi se analyzují za použ ití regresního modelu a vypoč tou se hodnoty ECx (tj. EC 50, EC25 a/nebo EC10). Viz definice. XXI.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY Vyhodnocení výsledků zkouš ek u agrochemikálií se provádí s relativněmalými rozdíly (tj. průmě rná hodnota ±25%) mezi koncentracemi dusič nanův kontrolní a exponovaných vzorcích, takže velké kolísání u kontrolních vzorkůmůže vést k nesprávným výsledkům. Rozdíly mezi jednotlivými kontrolními vzorky by proto měly být menš í než±15 %. XXI.1.6 POPIS METODY XXI.1.6.1 Zkuš ební zař ízení Nádoby použité ve zkouš ce musí být z chemicky inertního materiálu. Měly by mít vhodný objem, která by měl odpovídat postupu použitému pro inkubaci půdy, tzn. buďinkubace celého množ ství půdy, nebo inkubace jednotlivých vzorkůp ů dy (viz oddíl 1.7.1.2). Je tř eba, aby během zkouš ky doš lo k co nejmenš ím ztrátám vody a aby byla umožně na výměna plynů(např . tím, ž e se nádoby zakryjí perforovanou polyethylenovou fólií). Př i zkouš ení tě kavých látek se použ ijí uzavř ené plynotěsné nádoby. Mě ly by být tak velké, aby př ibliž nějedna č tvrtina jejich objemu byla zaplně na vzorkem půdy. Použ ije se standardní laboratorní vybavení, které zahrnuje tř epačku: mechanickou tř epač ku nebo rovnocenné vybavení; odstř edivku (3 000 g) nebo filtrač ní zař ízení (za použiti filtrač ního papíru bez dusič nanů ); mě ř icí zař ízení pro stanovení dusič nanůs vhodnou citlivostí a reprodukovatelností. XXI.1.6.2 Výbě r a počet půd Použ ije se jedna pů da. P ů da by měla mít tyto charakteristiky: obsah písku: nejméně50 % a nejvýš e 75 %; pH: 5,5 - 7,5; obsah organického uhlíku: 0,5 - 1,5 %; stanoví se mikrobiální biomasa (viz literatura 8, 9) a její uhlík by mě l tvoř it nejméně1 % celkového organického uhlíku v půdě. Ve vě tš iněpř ípadůpř edstavuje půda s těmito charakteristikami nejkonzervativně jš í př ípad, neboť adsorpce zkouš ené chemické látky je minimální a její dostupnost pro mikroorganismy je maximální. V důsledku toho je zpravidla zkouš ení s dalš ími půdami zbytečné. Za určitých okolností vš ak může být použ ití dalš í půdy nezbytné, např . př i zamýš leném hlavním použ ití zkouš ené látky na urč ité druhy půd, jako jsou kyselé lesní půdy nebo v př ípaděelektrostaticky nabitých chemikálií. XXI.1.6.3 Odbě r a skladování vzorkůpůd XXI.1.6.3.1 Odběr K dispozici by měly být podrobné informace o historii místa, ze kterého je půda odebírána. Mezi tě mito informacemi musí být př esná poloha, vegetace, údaje o oš etř ování př ípravky na ochranu rostlin, použití organických a minerálních hnojiv, př ídavky biologického materiálu nebo náhodná kontaminace. Pro odbě r půdy by mělo být zvoleno místo, které umož ňuje dlouhodobé použ ívání. Vhodnými místy jsou trvalé pastviny, pole s jednoletými kulturními plodinami (kroměkukuř ice) nebo hustěoseté plochy zeleného hnojení. Místa vybraná pro odběr vzorkůby nemě la být minimálnějeden rok př ed odbě rem oš etř ována př ípravky na ochranu rostlin. Rovněžby neměla být alespoňš est mě sícůpoužita organická hnojiva. Použití minerálních hnojiv je př ípustné pouze tehdy, je-li to nezbytné pro plodiny, a vzorky půdy by nemě ly být odebírány dř íve nežpo tř ech mě sících po aplikaci. Nemě ly by být použ ívány půdy s hnojivy, o nichžje známo, že mají biocidní úč inky (např . kyanamid vápenatý). Vzorky by nemě ly být odebírány př i dlouhých obdobích sucha nebo zavodnění (delš ích než30 dnů) nebo po nich. Vzorky orných půd se odebírají z hloubky 0 až20 cm. U luk (pastvin) nebo jiných půd, u nichžpo delš í dobu (alespoňpo jedno vegetační období) nebyla provádě na orba,
XXI.1.6.3.2
XXI.1.6.4 XXI.1.6.4.1
XXI.1.6.4.2
XXI.1.6.4.3
XXI.1.6.5
XXI.1.6.6
XXI.1.7 XXI.1.7.1 XXI.1.7.1.1
můž e maximální hloubka odběru nepatrněpř ekrač ovat 20 cm (např . až25 cm). Vzorky půd by mě ly být př epravovány v takových nádobách a za takové teploty, aby bylo zaručeno, ž e se původní vlastnosti půdy významněnezmění. Skladování Upř ednostňuje se použ ití čerstvě odebrané půdy. Pokud je skladování půdy v laboratoř i nevyhnutelné, můž e být skladována v temnu př i (4 ± 2) °C maximálněpo dobu tř í mě síců. Během skladování půd musí být zajiš tě ny aerobní podmínky. Pokud jsou půdy odebírány z oblastí, v nichž jsou po dobu alespoňtř í měsícův roce zmrzlé, lze zváž it š estimě síč ní skladování př i -18 °C až-22 °C. Př ed kaž dým experimentem se stanoví mikrobiální biomasa skladovaných půd a uhlík pocházející z biomasy by mě l tvoř it nejméně1 % celkového organického uhlíku v půdě(viz oddíl 1.6.2). Zacházení s půdou a její př íprava pro zkouš ku Př edběž ná inkubace Pokud byla půda skladována (viz oddíl 1.6.3.2), doporuč uje se provést př edběž nou inkubaci v délce 2 až28 dnů. Teplota a vlhkost pů dy během př edběž né inkubace by měly být podobné podmínkám př i zkouš ce (viz oddíly 1.6.4.2 a 1.7.1.3). Fyzikálně-chemické charakteristiky Z půdy se ruč něodstraní velké kusy (např . kameny, části rostlin atd.) a poté se za vlhka, anižje půda nadmě rněvysouš ena, prosejí č ástice o velikosti 2 mm a menš í. Vlhkost vzorku půdy se upraví destilovanou nebo deionizovanou vodou na hodnotu 40 % až60 % maximální vodní kapacity. Obohacení organickým substrátem Půda by měla být obohacena vhodným organickým substrátem, např . zelenou travní mouč kou s vojtě š kou (hlavní slož ka: Medicago sativa) s pomě rem C/N od 12/1 do 16/1. Doporučená dávka vojtě š kové moučky je 5 g vojtě š ky na kilogram půdy (vztaž eno na suš inu). Příprava zkouš ené látky pro aplikaci na půdu Zkouš ená látka se obvykle aplikuje pomocí nosič e. Nosičem můž e být voda (u látek rozpustných ve vodě ) nebo inertní tuhá látka, např . jemný kř emič itý písek (velikost zrna: 0,1 - 0,5 mm). Jiné kapalné nosiče nežvoda (např . organická rozpouš tědla jako aceton, chloroform) by nemě ly být použ ívány, neboťmohou znič it mikroflóru. Použije-li se jako nosičpísek, můž e být obalen zkouš enou látkou rozpuš těnou nebo rozptýlenou ve vhodném rozpouš tě dle. V takovém př ípaděse rozpouš tědlo př ed smísením s půdou odstraní odpař ením. Pro optimální distribuci zkouš ené látky v půděse doporuč uje použít 10 g písku na kilogram půdy (vztaž eno na suš inu). Do kontrolních vzorkůse aplikuje pouze odpovídající množství vody a/nebo písku. Př i zkouš ení tě kavých chemických látek je tř eba pokud možno zabránit ztrátám př i aplikaci a pokusit se o homogenní rozptýlení látky v půdě(látka se např . nastř íkne do půdy na více místech). Zkuš ební koncentrace Př i zkouš ení agrochemikálií se použ ijí alespoňdvěkoncentrace. Niž š í koncentrace by měla odpovídat př inejmenš ím maximálnímu oč ekávanému množ ství látky, které se v reálných podmínkách dostane do půdy, zatímco vyš š í koncentrace by mě la být násobkem nižš í koncentrace. Výpočet koncentrace zkouš ené látky př idávané do půdy se provede za př edpokladu rovnomě rného zapravení do hloubky 5 cm a pro sypnou hustotu půdy 1,5. U agrochemikálií, které se aplikují př ímo do pů dy, nebo u chemikálií, u nichžlze množ ství, které se dostane do půdy, př edpově dět, jsou doporučenými zkuš ebními koncentracemi maximální př edpokládané koncentrace v životním prostř edí (Predicted Environmental Concentration, PEC) a jejich pě tinásobky. U látek, které se zpravidla aplikují do půdy několikrát za sezónu, se zkuš ební koncentrace odvodí ze souč inu PEC a oč ekávaného maximálního poč tu aplikací. Horní koncentrace by vš ak neměla př ekroč it desetinásobek maximální jednorázověaplikované dávky. U jiných látek nežagrochemikálií se použ ije geometrická ř ada nejméněpě ti koncentrací. V rozpě tí tě chto zkuš ebních koncentrací by se mě ly nacházet stanovované hodnoty ECx . PROVEDENÍ ZKOUŠKY Podmínky expozice Expozice a kontrola Př i zkouš ení agrochemikálií se půda rozdě lí na tř i díly o stejné hmotnosti. Dva díly se smísí s nosič em obsahujícím látku a tř etí díl se smísí pouze s nosičem (kontrola). Doporuč uje se, aby byla zkouš ka provedena s minimálnětř emi duplikátními vzorky exponovaných i neexponovaných půd. Př i zkouš ení jiných látek nežagrochemikálií se půda rozdě lí na š est dílůo stejné hmotnosti. Pě t vzorkůse smísí s nosič em obsahujícím zkouš enou látku a š estý vzorek se smísí pouze s nosič em bez chemické látky. Doporučuje se použ ít tř i duplikátní vzorky exponované i neexponované půdy. Je tř eba věnovat pozornost homogennímu rozptýlení zkouš ené látky v exponovaných vzorcích
půdy. Př i míš ení by nemě lo docházet k hutně ní nebo shlukování půdy. Inkubace vzorkůpůd Inkubaci vzorkůpůd lze provést dvěma způsoby: se souhrnným vzorkem exponované půdy a souhrnným vzorkem neexponované půdy, nebo se sériemi jednotlivých stejněvelkých dílčích vzorkůjak exponované, tak neexponované půdy. U těkavých látek se vš ak zkouš ka provádí pouze se sériemi jednotlivých dílčích vzorků. Pokud se inkubují souhrnné vzorky, př ipraví se velká množ ství exponované a neexponované půdy a bě hem zkouš ky se podle potř eby odebírají dílč í vzorky k analýze. Výchozí množství př ipravené pro exponované vzorky a kontrolní vzorky závisí na velikosti dílčích vzorků, poč tu duplikátních vzorkůpoužitých pro analýzu a na př edpokládaném poč tu intervalů, v nichžse odeberou vzorky. Půdy inkubované jako souhrnný vzorek se př ed odběrem dílčích vzorkůdůkladněpromísí. Pokud se inkubují série jednotlivých vzorkůpůd, rozdě lí se souhrnný vzorek exponované půdy a souhrnný vzorek neexponované půdy na pož adovaný poč et dílčích vzorků a ty se použ ijí podle potř eby. U experimentů, kdy lze př edpokládat více neždva intervaly odběru, by měl být př ipraven dostateč ný počet dílčích vzorků s ohledem na vš echny duplikátní vzorky a vš echny intervaly odbě ru. Alespoňtř i duplikátní vzorky zkuš ební půdy měly být inkubovány za aerobních podmínek (viz oddíl 1.7.1.1). U vš ech zkouš ek by měly být použ ity vhodné nádoby s dostatečným prostorem pod víkem, aby nenastaly anaerobní podmínky. U tě kavých látek se zkouš ka provádí pouze se sériemi jednotlivých dílčích vzorků. XXI.1.7.1.3 Podmínky zkouš ky a její trvání Zkouš ka se provádí v temnu př i pokojové teplotě(20 ± 2) °C. Vlhkost vzorku půdy se udržuje po dobu zkouš ky v rozmezí 40 % až60 % (±5 %) maximální vodní kapacity půdy (viz oddíl 1.6.4.2). Podle potř eby se př idává destilovaná nebo deionizovaná voda. Zkouš ky trvají nejméně28 dnů. Př i zkouš kách agrochemikálií se porovnávají rychlosti tvorby dusič nanův exponovaných a kontrolních vzorcích. Pokud se 28. dne tyto rychlosti liš í o více než 25 %, pokrač uje se ve zkouš ce do doby, nežrozdíl klesne na 25 % a méně , nebo do 100 dnů, podle toho, co nastane dř íve. U jiných látek nežagrochemikálií se zkouš ka ukonč í po 28 dnech. 28. den se stanoví množ ství dusič nanův exponovaných a kontrolních vzorcích a vypoč ítají se hodnoty ECx. XXI.1.7.2 Odbě ry vzorkůa analýzy půd XXI.1.7.2.1 Intervaly odběru vzorků Př i zkouš ení agrochemikálií se obsah dusič nanůve vzorcích analyzuje v 0., 7., 14. a 28. den. Pokud se zkouš ka prodlužuje, provede se dalš í mě ř ení ve 14-denních intervalech po 28. dni. Př i zkouš ení jiných látek nežagrochemikálií se použ ije alespoňpě t zkuš ebních koncentrací a obsah dusič nanůse ve vzorcích půd analyzuje na začátku expozič ní doby (den 0) a na jeho konci (po 28 dnech). Je-li to považováno za nezbytné, lze provést dalš í mezilehlé měř ení, např . v 7. den. Data získaná 28. den se použ ijí pro stanovení ECx chemické látky. Podle potř eby lze data ze dne 0 u kontrolních vzorkůpoužít ve zprávějako výchozí koncentraci dusič nanův pů dě. XXI.1.7.2.2 Analýza vzorkůpůd Pro každý č as odbě ru vzorkůse v exponovaných i kontrolních vzorcích stanoví obsah dusičnanů. Dusič nany se extrahují ze vzorkůtř epáním s vhodným extrakč ním roztokem, např . s 0,1 M roztokem chloridu draselného. Doporuč uje se použít 5 ml roztoku KCl na gram suš iny půdy. Př i optimální extrakci by mě ly být nádoby s půdou a extrakč ním roztokem naplněny nejvýš e z jedné poloviny. Směsi se extrahují tř epáním př i 150 ot./min. po dobu 60 minut. Směsi se odstř edí nebo zfiltrují a kapalná fáze se analyzuje na dusičnany. Kapalný extrakt zbavený pevných částic lze př ed analýzou skladovat př i (-20 ±5) °C po dobu š esti mě síců . XXI.2. DATA XXI.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ Př i zkouš ení agrochemikálií se zaznamená množství vytvoř ených dusič nanův každém duplikátním vzorku a průmě rné hodnoty se zaznamenají do tabulky. Rychlost př eměny dusíku se vyhodnotí vhodnými vš eobecně uznávanými statistickými metodami (např . F-testem na 5 % hladině významnosti). Množství vzniklých dusičnanůse vyjádř í v mg dusičnanůna kg suš iny půdy za den. Rychlost tvorby dusičnanůse pro každou expozici porovná s rychlostí získanou pro kontrolní vzorky a vypočte se odchylka od kontrolních vzorkův procentech. Př i zkouš ení jiných látek nežagrochemikálií se stanoví množství dusičnanův kaž dém duplikátním vzorku a pro úč ely odhadu hodnot ECx se sestrojí kř ivka závislosti odezvy na dávce. Množ ství dusič nanů(tj. množ ství dusičnanův mg na kg suš iny půdy) zjiš tě ná v exponovaných vzorcích po 28 dnech se porovnají s hodnotami zjiš těnými u kontrolních vzorků. Z tě chto údajůse pro každou zkuš ební koncentraci vypoč te velikost inhibice v procentech. Tyto hodnoty v procentech se vynesou do grafu proti koncentraci a poté se statistickými metodami vypočítají hodnoty ECx. Standardními metodami (viz literatura 10 až12) se rovně žvypoč ítají intervaly spolehlivosti (p = XXI.1.7.1.2
XXI.2.2
XXI.3.
0,95) pro vypočtené hodnoty ECx. Zkouš ené látky s vysokým obsahem dusič nanů mohou př ispívat k množství dusič nanu vytvoř eného př i zkouš ce. Pokud se zkouš í vysoké koncentrace tě chto látek (např . chemikálie, u nichžse očekává opakované použ ití), musí být součástí zkouš ky vhodné kontrolní vzorky (tj. půda a zkouš ená látka bez rostlinné mouč ky). Data z těchto kontrol musí být zohledně na př i výpoč tech ECx. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Pokud je př i hodnocení výsledkůzkouš ek s agrochemikáliemi př i jakémkoli odběru po 28 dnech rozdíl rychlosti tvorby dusič nanůpř i niž š í expozici (tj. př i maximální očekávané koncentraci) a rychlosti tvorby v kontrolách roven 25 % nebo niž š í, lze konstatovat, ž e zkouš ená látka nemá dlouhodobý vliv na transformaci dusíku v půdách. Pro hodnocení výsledkůzkouš ek jiných látek nežagrochemikálií se použ ijí hodnoty EC50, EC25 a/nebo EC10 . ZPRÁVY Protokol o zkouš ce musí obsahovat následující informace: Úplnou identifikaci použ ité půdy zahrnující tyto údaje: země pisná poloha místa (země pisná š íř ka a délka); informace a historii místa (tj. vegetační kryt, oš etř ení př ípravky na ochranu rostlin, použití hnojiv, náhodná kontaminace atd.); způsob využití (např . zemědě lská půda, les atd.); hloubka odběru vzorků(cm); obsah písku/prachu/jílu (v % suš iny); pH (ve vodě); obsah organického uhlíku (v % suš iny); obsah dusíku (v % suš iny); výchozí koncentrace dusičnanů(mg dusič nanůna kg suš iny); kapacita iontové výměny (mmol/kg); mikrobiální biomasa v procentech celkového organického uhlíku; odkaz na metody použité pro stanoveni každého z parametrů; vš echny informace týkající se odběru a skladování vzorkůpůd; podrobné údaje o p ř ípadné př edbě žné inkubaci půdy. Zkouš ená látka: fyzikální povaha a př ípadněfyzikálně -chemické vlastnosti; př ípadněúdaje o chemické identitě , včetněstrukturního vzorce, č istoty (tj. procentuální obsah účinné složky u př ípravkůna ochranu rostlin), obsahu dusíku. Substrát: zdroj substrátu; složení (tj. vojtě š ková mouč ka, zelená travní moučka s vojtě š kou); obsah uhlíku, dusíku (v % suš iny); velikost síta (mm). Zkuš ební podmínky: podrobné údaje o obohacení půdy organickým substrátem; poč et použ itých koncentrací zkouš ené látky, popř ípadězdůvodnění volby koncentrací; podrobné údaje o aplikaci zkouš ené látky na půdu; inkubač ní teplota; vlhkost půdy na zač átku zkouš ky a v jejím prů bě hu; použitá metoda inkubace půdy (tj. inkubace souhrnného vzorku, nebo inkubace jednotlivých dílčích vzorkůpůdy); poč et duplikátních vzorků; doby odbě ru vzorků; metoda použitá pro extrakci dusičnanůz půdy. Výsledky: postup analýzy a zař ízení použité pro stanovení dusičnanů; jednotlivé naměř ené hodnoty obsahu dusič nanůa jejich průmě rné hodnoty v tabulkové formě ; rozdíly mezi duplikátními vzorky u exponovaných a kontrolních vzorkůpůd; podle potř eby vysvě tlení oprav provedených př i výpoč tech; procentuální odchylka v rychlosti tvorby dusičnanůpro každou dobu odbě ru vzorků, popř ípaděhodnota EC50 s 95% intervalem spolehlivosti, jiné hodnoty ECx (tj. EC 25 nebo EC10 ) s intervaly spolehlivost a graf kř ivky závislosti odpovědi na dávce; statistické zpracování výsledků;
XXIA.
vš echny informace a pozorování už iteč né pro interpretaci výsledků. LITERATURA (1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1 - 16, 1994. (2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1 - 1 (2. vyd., 1990). (3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. 28. zář í, 1987. (4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, (vyd. M. R. Lynch), Pub. SETAC-Europe, Brussels. (5) ISO 14238 (1997). Soil Quality - Determination of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical Committee ISO/TC 190/SC 4. (6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18.-20. ledna 1995. (7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality - Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. (8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method. (9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method. (10) Litchfield, J. T., Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. Exper. Ther., 96,99-113. (11) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis, 3. vyd., Cambridge, London, New York. (12) Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.
XXII. METODA PRO STANOVENÍ AKTIVITY PŮDNÍCH MIKROORGANISMŮ PŘI TRANSFORMACI UHLÍKU (metoda C.22 podle př ílohy směrnice 2004/73/ES ze dne 29. dubna 2004, kterou se po dvacáté deváté př izpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbliž ování právních a správních př edpisů tikajících se klasifikace, balení a označ ování nebezpeč ných látek) XXII.1. XXII.1.1
METODA Tato metoda odpovídá metoděOECD TG 217 (2000). ÚVOD Tato zkuš ební metoda popisuje laboratorní postup pro vyš etř ování mož ných dlouhodobých úč inků jednorázové expozice př ípravkům na ochranu rostlin a popř ípadějiným chemický látkám na aktivitu pů dních mikroorganismů př i transformaci uhlíku. Je založ ena na pokladech a doporučeních národních i mezinárodních organizací (viz literatura 1 až6). Př i posuzování a hodnocení toxických vlastností zkouš ených látek můž e být nezbytné stanovit účinky na aktivitu půdních mikroorganismů, např . jsou-li pož adovány údaje o vedlejš ích účincích př ípravkůna ochranu rostlin na půdní mikroflóru nebo oč ekává-li se expozice pů dních mikroorganismů chemickým látkám jiným nežpř ípravkům na ochranu rostlin. Cílem zkouš ky na transformaci uhlíku je zjistit účinky takových chemických látek na půdní mikroflóru. Pokud se zkouš ejí agrochemikálie (např . př ípravky na ochranu rostlin, hnojiva, chemické př ípravky pro lesnictví), provádí se jak zkouš ka na transformaci uhlíku, tak zkouš ka na transformaci dusíku. Pokud se zkouš ejí jiné chemické látky nežagrochemikálie, postačuje zkouš ka na transformaci dusíku. Nacházejí-li se vš ak u těchto chemických látek hodnoty EC50 pro transformaci dusíku v rozpě tí hodnot nacházených pro komerčnědostupné inhibitory nitrifikace (např . nitrapyrin), lze pro získání dalš ích informaci provést zkouš ku na transformaci uhlíku. Půdy se skládají z živých a neživých složek, které se vyskytují ve forměslož itých a heterogenních směsí. Mikroorganismy hrají důlež itou roli v rozkladu a transformaci organických látek v úrodných půdách, př ičemžrůzné druhy př ispívají k různým aspektům úrodnosti půdy. Jakékoli dlouhodobé poruš ení tě chto biochemických procesůby mohlo poruš it koloběh živin a to by mohlo mít vliv na úrodnost půdy. K transformaci uhlíku a dusíku dochází u vš ech úrodných půd. Ač koliv se populace mikroorganismůodpově dných za tyto procesy u jednotlivých pů d liš í, jedná se v podstatěo totéžschéma transformace. Popsaná zkuš ební metoda slouž í ke zjiš tění dlouhodobých nepř íznivých úč inkůlátky na proces transformace uhlíku v aerobních povrchových půdách. Zkouš ka je citlivá na změ ny ve velikosti a aktivitěmikrobiální populace, která je odpovědná za transformaci uhlíku, neboťtyto populace
budou vystaveny jak chemickému stresu, tak nedostatku uhlíku. Použ ijí se písč ité půdy s nízkým obsahem organického materiálu. Tyto půdy se exponují zkouš ené látce a inkubují se za podmínek, které umož ňují rychlý mikrobiální metabolismus. Za tě chto podmínek se zdroje snadno dostupného uhlíku rychle vyčerpají. To způsobí nedostatek uhlíku, který vede k nejen k odumř ení mikrobiálních buně k, ale také indukuje klidové stadium a/nebo tvorbu sporů. Pokud se zkouš ka provádí déle než28 dnů, lze souhrn tě chto reakcí mě ř it v kontrolních vzorcích (neexponovaná půda) jako postupnou ztrátu metabolicky aktivní mikrobiální biomasy (viz literatura 7). Pokud je biomasa v půděs nedostatkem uhlíku za podmínek zkouš ky ovlivněna př ítomností chemické látky, pravdě podobně se nevrátí do téhož stavu jako kontrolní vzorek. Poruš ení stavu způsobené zkouš enou látkou kdykoliv bě hem zkouš ky tedy často př etrvává aždo konce zkouš ky. Zkouš ka, na nížje založ ena tato zkuš ební metoda, byla zprvu vyvinuta pro látky, u nichžlze př edvídat množství, které pronikne do půdy. Př íkladem jsou př ípravky na ochranu rostlin, u nichž je polní aplikač ní dávka známá. U agrochemikálií postač uje provést zkouš ku se dvěma úrovně mi dávky, které odpovídají př edpokládané nebo odhadované aplikační dávce. U agrochemikálií lze zkouš et účinné složky nebo př ípravky v komerční úpravě . Zkouš ka vš ak není omezena na chemické látky, jejichžkoncentraci v ž ivotním prostř edí lze př edpovědě t. Změnou množství zkouš ené látky aplikované na pů du a způsobu vyhodnocení dat lze zkouš ku využ ít také pro chemické látky, u nichžnení známo, v jakém množství proniknou do půdy. U jiných chemických látek nežagrochemikálií se proto stanovuje účinek ř ady koncentrací na transformaci uhlíku. Data z tě chto zkouš ek se použ ijí k sestrojení kř ivky závislosti odezvy na dávce a k výpočtu hodnot ECx, kde x je procentuální úč inek. XXII.1.2 DEFINICE Transformace uhlíku: je rozklad organického materiálu působením mikroorganismů, jehož výsledkem je anorganický koneč ný produkt oxid uhličitý. ECx (Účinná koncentrace): je koncentrace zkouš ené látky v půdě, která vede k x-procentní inhibici transformace uhlíku na oxid uhličitý. EC50 (Medián úč inné koncentrace): je koncentrace zkouš ené látky v půdě , která vede k 50% inhibici transformace uhlíku na oxid uhličitý. XXII.1.3 REFERENČNÍ LÁTKY Žádné. XXII.1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY Prosetá půda se buď exponuje zkuš ební látce, nebo se ponechá neexponovaná (kontrola). Př i zkouš ení agrochemikálií se doporuč uje provést zkouš ku s nejméně dvěma koncentracemi zvolenými tak, aby byly v urč itém vztahu k nejvyš š í př edpokládané koncentraci na poli. Po 0, 7, 14 a 28 dnech inkubace se vzorky exponované a kontrolní půdy smísí s glukosou a po následujících 12 h se měř í respirač ní rychlost vyvolaná glukosou. Respirač ní rychlost se vyjádř í jako uvolněný oxid uhlič itý (v mg oxidu uhličitého na kg suš iny za hodinu) nebo jako spotř ebovaný kyslík (v mg kyslíku na kg půdy za hodinu). Průmě rná respirač ní rychlost u exponovaných vzorkůp ů d se porovná s rychlostí u kontrolních vzorkůa vypočte se procentuální odchylka exponovaných vzorkůod kontrolních vzorků. Vš echny zkouš ky musí probíhat alespoň 28 dnů. Jsou-li 28. den rozdíly mezi experimentální a kontrolní půdou rovné 25 % nebo větš í, v mě ř ení se pokrač uje ve 14-denních intervalech nejdéle do 100 dnů . Př i zkouš ení jiných chemických látek nežagrochemikálií se do vzorkůpůdy př idá ř ada koncentrací zkouš ené látky a respirační rychlost vyvolaná glukosou (tj. průmě rné množství uvolně ného oxidu uhličitého nebo spotř ebovaného kyslíku) se změř í po 28 dnech. Výsledky zkouš ek s ř adou koncentrací se analyzují za použ ití regresního modelu a vypočtou se hodnoty ECx (tj. EC50 , EC25 a/nebo EC 10). Viz definice. XXII.1.5 VALIDITA ZKOUŠKY Vyhodnocení výsledků zkouš ek u agrochemikálií se provádí s relativněmalými rozdíly (tj. průmě rná hodnota ±25 %) mezi uvolně ným oxidem uhličitým nebo spotř ebovaným kyslíkem u kontrolních a exponovaných vzorků, takž e velké kolísání u kontrolních vzorkůmů že vést k nesprávným výsledkům. Rozdíly mezi jednotlivými kontrolními vzorky by proto měly být menš í než± 15 %. XXII.1.6 POPIS METODY XXII.1.6.1 Zkuš ební zařízení Nádoby použité ve zkouš ce musí být z chemicky inertního materiálu. Měly by mít vhodný objem, který by měl odpovídat postupu použitému pro inkubaci půdy, tzn. buď inkubace souhrnného vzorku půdy, nebo inkubace jednotlivých vzorkůpůdy (viz oddíl 1.7.1.2). Je tř eba, aby během zkouš ky doš lo k co nejmenš ím ztrátám vody a aby byla umožně na výměna plynů(např . tím, ž e se nádoby zakryjí perforovanou polyethylenovou fólií). Př i zkouš ení tě kavých látek se použijí
XXII.1.6.2
XXII.1.6.3 XXII.1.6.3.1
XXII.1.6.3.2
XXII.1.6.4 XXII.1.6.4.1
XXII.1.6.4.2
XXII.1.6.5
uzavř ené plynotěsné nádoby. Mě ly by být tak velké, aby př ibliž nějedna čtvrtina jejich objemu byla zaplněna vzorkem půdy. Pro stanovení respirace vyvolané glukosou jsou nezbytné inkubač ní systémy a př ístroje pro mě ř ení uvolňovaného oxidu uhlič itého nebo spotř eby kyslíku. Př íklady takových systémůlze nalézt v literatuř e 8 až11. Výbě r a počet půd Použ ije se jedna pů da. P ů da by měla mít tyto charakteristiky: obsah písku: nejméně50 % a nejvýš e 75 %; pH: 5,5 - 7,5; obsah organického uhlíku: 0,5 -1,5 %; stanoví se mikrobiální biomasa (viz literatura 12 a 13) a její obsah uhlíku by mě l tvoř it nejméně1 % celkového organického uhlíku v půdě. Ve vě tš iněpř ípadůpř edstavuje půda s těmito charakteristikami nejkonzervativně jš í př ípad, neboť adsorpce zkouš ené chemické látky je minimální a její dostupnost pro mikroorganismy je maximální. V důsledku toho je zpravidla zkouš ení s dalš ími půdami zbytečné. Za určitých okolností můž e být nezbytné nasazení dalš í půdy, např . př i zamýš leném hlavním použ ití zkouš ené látky na urč ité druhy půd, jako jsou kyselé lesní pů dy nebo v př ípaděelektrostaticky nabitých chemikálií. Odbě r a skladování vzorkůpůd Odbě r K dispozici by měly být podrobné informace o historii místa, ze kterého je půda odebírána. Mezi tě mito informacemi musí být př esná poloha, vegetace, údaje o oš etř ování př ípravky na ochranu rostlin, použití organických a minerálních hnojiv, př ídavky biologického materiálu nebo náhodná kontaminace. Pro odbě r půdy by mělo být zvoleno místo, které umož ňuje dlouhodobé použ ívání. Vhodnými místy jsou trvalé pastviny, pole s jednoletými kulturními plodinami (kroměkukuř ice) nebo hustěoseté plochy zeleného hnojení. Místa vybraná pro odběr vzorkůby nemě la být minimálnějeden rok př ed odbě rem oš etř ována př ípravky na ochranu rostlin. Rovněžby neměla být alespoňš est mě sícůpoužita organická hnojiva. Použití minerálních hnojiv je př ípustné pouze tehdy, je-li to nezbytné pro plodiny, a vzorky půdy by nemě ly být odebírány dř íve nežpo tř ech mě sících po aplikaci. Nemě ly by být použ ívány půdy s hnojivy, o nichžje známo, že mají biocidní úč inky (např . kyanamid vápenatý). Vzorky by nemě ly být odebírány př i dlouhých obdobích sucha nebo zavodnění (delš ích než30 dnů) nebo po nich. Vzorky orných půd se odebírají z hloubky 0 až20 cm. U luk (pastvin) nebo jiných půd, u nichžpo delš í dobu (alespoňpo jedno vegetační období) nebyla provádě na orba, můž e maximální hloubka odběru mírněpř ekrač ovat 20 cm (např . až25 cm). Vzorky půd by měly být př epravovány v takových nádobách a za takové teploty, aby bylo zaruč eno, ž e se původní vlastnosti půdy významněnezmění. Skladování Upř ednostňuje se použ ití čerstvě odebrané půdy. Pokud je skladování půdy v laboratoř i nevyhnutelné, můž e být skladována v temnu př i (4 ± 2) °C po dobu maximálnětř í mě síců. Během skladování půd musí být zajiš tě ny aerobní podmínky. Pokud jsou půdy odebírány z oblastí, v nichž jsou po dobu alespoňtř í měsícův roce zmrzlé, lze zváž it š estimě síč ní skladování př i -18 °C. Př ed každým experimentem se stanoví mikrobiální biomasa skladovaných půd a uhlík pocházející z biomasy by měl tvoř it nejméně1 % celkového organického uhlíku v půdě(viz oddíl 1.6.2). Zacházení s půdou a její př íprava pro zkouš ku Př edbě ž ná inkubace Pokud byla pů da skladována (viz oddíl 1.6.3.2 a 1.7.1.3), doporučuje se provést př edbě žnou inkubaci v délce 2 až28 dnů. Teplota a vlhkost půdy během př edbě žné inkubace by mě ly být podobné podmínkám př i zkouš ce (viz oddíly 1.6.4.2 a 1.7.1.3). Fyzikálně-chemické charakteristiky Z půdy se ruč něodstraní velké kusy (např . kameny, části rostlin atd.) a poté se za vlhka, anižje půda nadmě rněvysouš ena, prosejí č ástice o velikosti 2 mm a menš í. Vlhkost vzorku půdy se upraví destilovanou nebo deionizovanou vodou na hodnotu 40 % až60 % maximální vodní kapacity. Příprava zkouš ené látky pro aplikaci na půdu Zkouš ená látka se obvykle aplikuje pomocí nosič e. Nosičem můž e být voda (u látek rozpustných ve vodě ) nebo inertní tuhá látka, např . jemný kř emič itý písek (velikost zrna: 0,1 - 0,5 mm). Jiné kapalné nosiče nežvoda (např . organická rozpouš tědla jako aceton, chloroform) by nemě ly být použ ívány, neboťmohou znič it mikroflóru. Použije-li se jako nosičpísek, můž e být obalen zkouš enou látkou rozpuš těnou nebo rozptýlenou ve vhodném rozpouš tě dle. V takovém př ípaděse
rozpouš tědlo př ed smísením s půdou odstraní odpař ením. Pro optimální distribuci zkouš ené látky v půděse doporuč uje použít 10 g písku na kilogram půdy (vztaž eno na suš inu). Do kontrolních vzorkůse aplikuje pouze odpovídající množství vody a/nebo písku. Př i zkouš ení těkavých chemických látek je tř eba zabránit ztrátám př i aplikaci a pokusit se o homogenní rozptýlení látky v půdě(látka se např . nastř íkne do půdy na více místech). XXII.1.6.6 Zkuš ební koncentrace Př i zkouš ení př ípravkůna ochranu rostlin nebo jiných chemických látek, u nichžlze př edpovědě t koncentraci v životním prostř edí, se použijí alespoňdvěkoncentrace. Niž š í koncentrace by mě la odpovídat př inejmenš ím maximálnímu očekávanému množ ství látky, které v reálných podmínkách pronikne do půdy, zatímco vyš š í koncentrace by mě la být násobkem nižš í koncentrace. Výpočet koncentrace zkouš ené látky př idávané do půdy se provede za př edpokladu rovnoměrného zapravení do hloubky 5 cm a pro sypnou hustotu půdy 1,5. U agrochemikálií, které se aplikují př ímo do pů dy, nebo u chemikálií, u nichžlze množ ství, které se dostane do půdy, př edpově dět, jsou doporučenými zkuš ebními koncentracemi př edpokládané koncentrace v životním prostř edí (Predicted Environmental Concentration, PEC) a jejich pě tinásobky. U látek, které se zpravidla aplikují do půdy ně kolikrát za sezónu, se zkuš ební koncentrace odvodí ze součinu PEC a oč ekávaného maximálního poč tu aplikací. Horní koncentrace by vš ak neměla př ekroč it desetinásobek maximální jednorázověaplikované dávky. U jiných látek nežagrochemikálií se použije geometrická ř ada nejméněpě ti koncentrací. V rozpětí tě chto zkuš ebních koncentrací by se mě ly nacházet stanovované hodnoty ECx . XXII.1.7 PROVEDENÍ ZKOUŠKY XXII.1.7.1 Podmínky expozice XXII.1.7.1.1 Expozice a kontrola Př i zkouš ení agrochemikálií se půda rozdě lí na tř i díly o stejné hmotnosti. Dva díly se smísí s nosič em obsahujícím látku a tř etí díl se smísí pouze s nosičem (kontrola). Doporuč uje se, aby byla zkouš ka provedena s minimálnětř emi duplikátními vzorky exponovaných i neexponovaných půd. Př i zkouš ení jiných látek nežagrochemikálií se půda rozdě lí na š est dílůo stejné hmotnosti. Pě t vzorkůse smísí s nosič em obsahujícím zkouš enou látku a š estý vzorek se smísí pouze s nosič em bez chemické látky. Doporučuje se použ ít tř i duplikátní vzorky exponované i neexponované půdy. Je tř eba věnovat pozornost homogennímu rozptýlení zkouš ené látky v exponovaných vzorcích půdy. Př i míš ení by nemě lo docházet k hutně ní nebo shlukování půdy. XXII.1.7.1.2 Inkubace vzorkůpůd Inkubaci vzorkůpůd lze provést dvěma způsoby: se souhrnným vzorkem exponované půdy a souhrnným vzorkem neexponované půdy, nebo se sériemi jednotlivých stejněvelkých dílčích vzorkůjak exponované, tak neexponované půdy. U těkavých látek se vš ak zkouš ka provádí pouze se sériemi jednotlivých dílčích vzorků. Pokud se inkubují souhrnné vzorky, př ipraví se velká množ ství exponované a neexponované půdy a bě hem zkouš ky se podle potř eby odebírají dílč í vzorky k analýze. Výchozí množství př ipravené pro exponované vzorky a kontrolní vzorky závisí na velikosti dílčích vzorků, poč tu duplikátních vzorkůpoužitých pro analýzu a na př edpokládaném poč tu intervalů, v nichžse odeberou vzorky. Půdy inkubované jako souhrnný vzorek se př ed odběrem dílčích vzorkůdůkladněpromísí. Pokud se inkubují série jednotlivých vzorkůpůd, rozdě lí se souhrnný vzorek exponované půdy a souhrnný vzorek neexponované půdy na pož adovaný poč et dílčích vzorků a ty se použ ijí podle potř eby. U experimentů, kdy lze př edpokládat více neždva intervaly odběru, by měl být př ipraven dostateč ný počet dílčích vzorků s ohledem na vš echny duplikátní vzorky a vš echny intervaly odbě ru. Alespoňtř i duplikátní vzorky zkuš ební půdy měly být inkubovány za aerobních podmínek (viz oddíl 1.7.1.1). U vš ech zkouš ek by měly být použ ity vhodné nádoby s dostatečným prostorem pod víkem, aby nenastaly anaerobní podmínky. U tě kavých látek se zkouš ka provádí pouze se sériemi jednotlivých dílčích vzorků. XXII.1.7.1.3 Podmínky zkouš ky a její trvání Zkouš ka se provádí v temnu př i pokojové teplotě(20 ± 2) °C. Vlhkost vzorku půdy se udržuje po dobu zkouš ky v rozmezí 40 % až60 % (±5 %) maximální vodní kapacity půdy (viz oddíl 1.6.4.2). Podle potř eby se př idává destilovaná nebo deionizovaná voda. Zkouš ky trvají nejméně 28 dnů. Př i zkouš kách agrochemikálií se porovnávají množ ství uvolně ného oxidu uhlič itého nebo množ ství spotř ebovaného kyslíku u exponovaných a kontrolních vzorků. Pokud se 28. dne tyto rychlosti liš í o více než25 %, pokračuje se ve zkouš ce do doby, nežrozdíl klesne na 25 % a méně, nebo do 100 dnů, podle toho, co nastane dř íve. U jiných chemických látek nežagrochemikálií se zkouš ka ukončí po 28 dnech. 28. den se stanoví množ ství uvolně ného oxidu uhlič itého nebo množství spotř ebovaného kyslíku u exponovaných a kontrolních vzorkůa vypoč ítají se hodnoty ECx. XXII.1.7.2 Odbě ry vzorkůa analýzy půd
Intervaly odběru vzorků Př i zkouš ení agrochemikálií se rychlost respirace vyvolané glukosou ve vzorcích analyzuje 0., 7., 14. a 28. den. Pokud se zkouš ka prodluž uje, provede se dalš í mě ř ení ve 14denních intervalech po 28. dni. Př i zkouš ení jiných látek nežagrochemikálií se použ ije alespoňpě t zkuš ebních koncentrací a obsah respirace vyvolané glukosou se ve vzorcích půd analyzuje na zač átku expoziční doby (den 0) a na jeho konci (po 28 dnech). Je-li to považováno za nezbytné, lze provést dalš í mezilehlé mě ř ení, např . 7. den. Data získaná 28. den se použ ijí pro stanovení ECx chemické látky. V př ípadě potř eby lze data ze dne 0 u kontrolních vzorkůpouž ít k odhadu výchozího množství metabolicky aktivní mikrobiální biomasy v půdě. XXIL 1.7.2.2 Mě ř ení rychlostí respirace vyvolané glukosou Pro každý č as odběru vzorkůse v exponovaných i kontrolních vzorcích stanoví rychlost respirace vyvolané glukosou. Vzorky půd se smísí s dostateč ným množstvím glukosy, aby se ihned vyvolala maximální respirační odezva. Množství glukosy potř ebné pro vyvolání maximální respirač ní odezvy u dané půdy lze stanovit v orientač ní zkouš ce se sérií koncentrací glukosy (viz literatura 14). U písč itých půd s obsahem organického uhlíku od 0,5 do 1,5 % obvykle stač í 2 000 mg až4 000 mg glukosy na kg suš iny. Glukosu lze rozmělnit na práš ek s č istým kř emenným pískem (10 g písku na kg suš iny) a homogenněsmísit s půdou. Vzorky půdy obohacené glukosou se inkubují ve vhodné aparatuř e, která umož ňuje měř it respirační rychlosti př i (20 ± 2) °C buďkontinuálně , nebo kaž dou hodinu, nebo kaž dé dvěhodiny (viz oddíl 1.6.1). Měř ení uvolně ného oxidu uhličitého nebo spotř ebovaného kyslíku se provádí nepř etržitěpo dobu 12 h a mě ř ení se zahájí co nejdř íve, tj. do 1 až2 h po př idání glukosy. Změř í se celkové množ ství uvolně ného oxidu uhlič itého nebo celkové množ ství spotř ebovaného kyslíku za 12 h a stanoví se průměrná respirační rychlost. XX11.2. DATA XXII.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ Př i zkouš ení agrochemikálií se zaznamená množství uvolněného oxidu uhličitého nebo množ ství spotř ebovaného kyslíku u každého duplikátního vzorku a průmě rné hodnoty se zaznamenají do tabulky. Výsledky se vyhodnotí vhodnými vš eobecněuznávanými statistickými metodami (např . F-testem př i 5% hladiněvýznamnosti). Rychlosti respirace vyvolané glukosou se vyjádř í v mg oxidu uhličitého na kg suš iny za hodinu nebo v mg kyslíku na kg suš iny za hodinu. Průmě rná rychlost uvolň ování oxidu uhličitého nebo průměrná rychlost spotř eby kyslíku u kaž dé expozice se porovná s odpovídajícími hodnotami u kontrolních vzorkůa vypočte se procentuální odchylka exponovaných vzorkůod kontrolních vzorků. Př i zkouš ení jiných látek nežagrochemikálií se stanoví množství uvolněného oxidu uhličitého nebo množství spotř ebovaného kyslíku v každém duplikátním vzorku a pro účely odhadu hodnot ECx se sestrojí kř ivka závislosti odezvy na dávce. Rychlosti respirace vyvolané glukosou (tj. mg oxidu uhlič itého na kg suš iny za hodinu nebo mg kyslíku na kg suš iny za hodinu) zjiš tě né v exponovaných vzorcích po 28 dnech se porovnají s hodnotami zjiš tě nými u kontrolních vzorků. Z tě chto údajůse pro kaž dou zkuš ební koncentraci vypoč te velikost inhibice v procentech. Tyto hodnoty v procentech se vynesou proti koncentraci a poté se statistickými metodami vypoč ítají hodnoty ECx. Standardními metodami (viz literatura 15 až17) se rovně žvypoč ítají intervaly spolehlivosti (p = 0,95) pro vypoč tené hodnoty ECx . XXII.2.2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Pokud je př i hodnocení výsledkůzkouš ek s agrochemikáliemi př i kterémkoli odbě ru po 28 dnech rozdíl respiračních rychlostí př i nižš í expozici (tj. př i maximální oč ekávané koncentraci) a rychlosti u kontroly roven 25 % nebo nižš í, lze konstatovat, ž e zkouš ená látka nemá dlouhodobý vliv na transformaci uhlíku v půdách. Pro hodnocení výsledků zkouš ek jiných látek než agrochemikálií se použijí hodnoty EC50, EC25 a/nebo EC10. XXII.3. ZPRÁVY PROTOKOL O ZKOUŠCE Protokol o zkouš ce musí obsahovat následující informace: Úplnou identifikaci použ ité půdy zahrnující tyto údaje: země pisná poloha místa (země pisná š íř ka a délka); informace o historii místa (tj. vegetační kryt, oš etř ení př ípravky na ochranu rostlin, použití hnojiv, náhodná kontaminace atd.); způsob využití (např . zemědě lská půda, les atd.); hloubka odběru vzorků(cm); obsah písku/prachu/jílu (v % suš iny); pH (ve vodě); XXII.1.7.2.1
XXIIA
obsah organického uhlíku (v % suš iny hmotnosti); obsah dusíku (v % suš iny); kapacita iontové výměny (mmol/kg); výchozí mikrobiální biomasa v procentech celkového organického uhlíku; odkaz na metody použité pro stanovení každého z parametrů; vš echny informace týkající se odběru a skladování vzorkůpůd; podrobné údaje o p ř ípadné př edbě žné inkubaci půdy. Zkouš ená látka: fyzikální povaha a př ípadnějejí fyzikálně-chemické vlastnosti; př ípadněúdaje o chemické identitě , včetněstrukturního vzorce, č istoty (tj. procentuální obsah účinné složky u př ípravkůna ochranu rostlin), obsahu dusíku. Zkuš ební podmínky: podrobné údaje o obohacení půdy organickým substrátem; poč et použ itých koncentrací zkouš ené látky, popř ípadězdůvodnění volby koncentrací; podrobné údaje o aplikaci zkouš ené látky na půdu; inkubač ní teplota; vlhkost půdy na zač átku zkouš ky a v jejím prů bě hu; použitá metoda inkubace (tj. buď inkubace souhrnného vzorku půdy, nebo inkubace jednotlivých dílčích vzorkůpůdy); poč et duplikátních vzorků; doby odbě ru vzorků. Výsledky: metoda a zař ízení použité pro mě ř ení respirač ních rychlostí; data včetnějednotlivých hodnot a průměrných hodnot množ ství oxidu uhlič itého nebo kyslíku zpracovaná v tabulkové formě; rozdíly mezi duplikátními vzorky u exponovaných a kontrolních vzorkůpůd; v př ípaděpotř eby vysvětlení oprav provedených př i výpočtech; procentuální odchylka v rychlostech respirace vyvolané glukosou pro každou dobu odbě ru vzorků , popř ípaděhodnota EC 50 s 95% intervalem spolehlivosti, jiné hodnoty ECx, (tj. EC 25 nebo EC10) s intervaly spolehlivosti a graf kř ivky závislosti odpově di na dávce; př ípadné statistické vyhodnocení výsledků; vš echny informace a pozorování už iteč né pro interpretaci výsledků. LITERATURA (1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1 - 16, 1994. (2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1 - 1 (2. vyd., 1990). (3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987. (4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, vyd. M. R. Lynch, Pub. SETACEurope, Brussels. (5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18.-20. ledna, 1995. (6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality - Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. (7) Anderson, J. P. E. (1987). Handling and Storage of Soils for Pesticide Experiments. In: Pesticide Effects on Soil Microflora. Vyd. L. Somerville, M. P. Greaves, Chap. 3: 45 - 60. (8) Anderson, J. P. E. (1982). Soil Respiration. In: Methods of Soil Analysis - Part 2: Chemical and Microbiological Properties. Agronomy Monograph N° 9. Vyd. A. L. Page, R. H. Miller a D. R. Keeney. 41: 831 - 871. (9) ISO 11266-1 (1993). Soil Quality - Guidance on Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions. (10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality - Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions. (11) Heinemeyer, O., Insam, H., Kaiser, E. A., Walenzik, G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77 - 81. (12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method.
(13) (14)
(15) (16) (17)
ISO 14240-2 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method. Malkomes, H.-P. (1986). Einflul3 von Glukosemenge auf die Reaktion der KurzzeitAtmung im Boden gegen0ber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113 - 120. Litchfield, J. T., Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. Exper. Ther., 96,99-113. Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3. vyd., Cambridge, London, New York. Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.
XXIII. METODA PRO STANOVENÍ AEROBNÍ A ANAEROBNÍ TRANSFORMACE CHEMICKÉ LÁTKY V PŮDĚ (metoda C.23 podle př ílohy směrnice 2004/73/ES ze dne 29. dubna 2004, kterou se po dvacáté deváté př izpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbliž ování právních a správních př edpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek) XXIII.1. XXIII.I.1
XXIII.1.2
METODA Tato zkuš ební metoda odpovídá metoděOECD TG 307 (2002). ÚVOD Postup popsaný v této zkuš ební metoděje vyvinut pro účely hodnocení aerobní a anaerobní transformace chemické látky v půdě . Je založen na doporuč eních a smě rnicích národních a mezinárodních organizací (viz literatura 1 až9). Účelem experimentůje stanovit i) rychlost transformace zkouš ené látky a ii) povahu a rychlost tvorby a rozkladu transformačních produktů, kterým mohou být rostliny a půdní organismy vystaveny. Tyto studie jsou požadovány u chemických látek, které se aplikují př ímo do půdy nebo pravděpodobněmohou proniknout do půdního ekosystému. Výsledky těchto laboratorních studií mohou být také použ ity pro vypracování postupůodběru vzorkůa analýzy u podobných polních studií. Pro vyhodnocení způsobu transformace obvykle postačují aerobní a anaerobní studie s jedním druhem půdy (viz literatura 8,10 a 11). Rychlosti transformace se stanoví alespoňpro tř i dalš í půdy (viz literatura 8 a 10). Druhy zkuš ebních půd by měly být reprezentativní pro environmentální podmínky, v nichždojde k použ ití látky nebo k jejímu uvolnění. Např íklad chemické látky, k jejichžuvolnění můž e dojít v subtropickém ažtropickém klimatu, by měly být zkouš eny s ferrasoly nebo nitosoly (systém FAO). Tato metoda se rovněžtýká půd rýžových polí. DEFINICE Zkouš ená látka: jakákoli látka, aťjižvýchozí látka, nebo př ísluš né transformač ní produkty. Transformač ní produkty: vš echny látky vznikající př i biotických a abiotických transformačních reakcích zkouš ené látky, vč etněCO2 a látek, které jsou př ítomny ve vázaných reziduích. Vázaná rezidua: slouč eniny v půdě , rostliněnebo v ž ivoč ichu, které po extrakci zůstávají v matrici ve forměvýchozí látky nebo (jejího metabolitu (jejích metabolitů) nebo transformačních produktů. Metoda extrakce nesmí podstatněměnit samotné slouč eniny nebo strukturu matrice. Povahu vazeb lze č ásteč ně vyjasnit extrakcí spojenou se změ nami v matrici a nároč nými analytickými technikami. Dosud byly tímto způsobem vyjasněny např . kovalentní, iontové a adsorpč ní vazby a rovně žzáchyty. Tvorba vázaných reziduí obecněpodstatněsnižuje biologickou př ístupnost a dostupnost (viz literatura 12) [upraveno podle IUPAC 1984 (viz literatura 13)]. Aerobní transformace: reakce, ke kterým dochází za př ítomnosti kyslíku (viz literatura 14). Anaerobní transformace: reakce probíhající s vyloučením molekulárního kyslíku (viz literatura 14). Půda: smě s minerálních a organických chemických slož ek oživená malými organismy (vě tš inou mikroorganismy), př ičemžorganické složky obsahují sloučeniny s vysokým obsahem uhlíku a dusíku a vysokou molekulovou hmotností. Lze pracovat s dvěma formami pů dy: a) s neporuš enou pů dou, jak v průbě hu č asu vznikla, s charakteristickými vrstvami různých druhůpůdy; b) s poruš enou půdou, která se obvykle vyskytuje na obdělávaných polích v př ípadě , že se vzorky odebírají vyrýváním a používají se v této zkuš ební metodě(viz literatura 14). Mineralizace: úplný rozklad organické slouč eniny na CO2, H 2O za aerobních podmínek a na CH4, CO2 a H2O za anaerobních podmínek. V souvislosti s touto metodou, př i nížse použ ívají slouč eniny značené radioisotopy, se mineralizací rozumí rozsáhlý rozklad molekuly, př i němžse radioisotopy uhlíku oxidují za tvorby odpovídajícího množ ství 14CO2 (viz literatura 14). Poloč as: t0,5, je č as, za který dojde k 50% transformaci zkouš ené látky, jestliž e lze transformací
XXIII.1.3
XXIII.1.4
XXIII.1.5
XXIII.1.6
XXIII.1.7 XXIII.1.7.1
XXIII.1.7.2
XXIII.1.7.3
popsat kinetikou prvního ř ádu; nezávisí na poč áteč ní koncentraci. DT50 (doba odbourání 50): doba, za kterou se poč áteč ní koncentrace zkouš ené látky sníž í o 50 %; liš í se od poloč asu t0,5 , pokud transformace neprobíhá podle kinetiky prvního ř ádu. DT75 (doba odbourání 75): doba, za kterou se poč áteč ní koncentrace zkouš ené látky sníž í o 75 %. DT90 (doba odbourání 90): doba, za kterou se poč áteč ní koncentrace zkouš ené látky sníž í o 90 %. REFERENČNÍ LÁTKY Referenč ní látky se použijí pro charakterizaci a/nebo identifikaci transformačních produktů spektroskopickými a chromatografickými metodami. POUŽITELNOST ZKOUŠKY Tato je metoda je použitelná pro vš echny chemické látky (neznač ené nebo znač ené radioaktivními isotopy), pro ně žje k dispozici analytická metoda s dostateč nou správností a citlivostí. Je použ itelná pro mírnětě kavé a netě kavé slouč eniny rozpustné i nerozpustné ve vodě . Zkouš ka by neměla být použ ita u látek, které z půdy silnětěkají (např . fumiganty, organická rozpouš tě dla), a nelze je tedy v půděudrž et za experimentálních podmínek této zkouš ky. INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE Pro stanovení rychlosti transformace lze použ ít jak látky neznač ené radioisotopy, tak znač ené látky. Znač ený materiál je nezbytný pro studium způsobu transformace a pro stanovení látkové 14 13 bilance. Doporučuje se značení isotopem C, avš ak už itečné mohou být i jiné isotopy, např . C, 15 3 32 N, H, P. Značena by měla být pokud možno nejstabilnějš í část (nejstabilnějš íč ásti) molekuly. Pokud např íklad zkouš ená látka obsahuje jeden aromatický kruh, je tř eba, aby byl tento kruh označ en. Pokud zkouš ená látka obsahuje dva nebo více kruhů, můž e být nezbytné provést samostatné studie s cílem podchytit zbytky kaž dého z kruhů, a získat tak vhodné informace o tvorbětransformačních produktů.). Čistota látky by mě la být alespoň95 %. Př ed provedením zkouš ky na aerobní a anaerobní transformaci v půděby mě ly být k dispozici alespoňtyto informace o látce: a) rozpustnost ve vodě(metoda A.6) b) rozpustnost v organických rozpouš tě dlech; c) tlak par (metoda A.4) a Henryho konstanta; d) rozdělovací koeficient n-oktanol/voda (metoda A.8); e) chemická stabilita v temnu (hydrolýza) (metoda C.7); f) pK a, pokud u molekuly nastává protonace nebo deprotonace [smě rnice OECD 112] (viz literatura 16). Mezi dalš í už iteč né informace patř í údaje o toxicitězkouš ené látky pro půdní mikroorganismy [zkuš ební metody C.21 a C.22] (viz literatura 16). K dispozici by měly být analytické metody (vč etněextrakčních a izolač ních metod) pro kvantitativní stanovení a identifikaci zkouš ené látky a jejich transformač ních produktů. PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY Vzorky půdy se exponují zkuš ební látce a inkubují se v temnu v biometrických baňkách nebo v průtokových systémech za ř ízených laboratorních podmínek (př i konstantní teplotěa vlhkosti půdy). Ve vhodných intervalech se vzorky půd extrahují a analyzuje se obsah výchozí látky a transformačních produktů. Vhodným absorpč ním zař ízením se k analýze shromáž dí také těkavé 14 14 produkty. Prostř ednictvím materiálu znač eného isotopem C lze po zachycení uvolně ného CO2 mě ř it různé rychlosti mineralizace zkouš ené látky a dále lze stanovit látkovou bilanci vč etně tvorby vázaných reziduí v pů dě . KRITÉRIA JAKOSTI Výtě žnost Extrakce a analýza provedená alespoňu dvou duplikátních vzorkůpůdy ihned po př idání zkouš ené látky poskytne první informaci o opakovatelnosti analytické metody a o stejnomě rnosti aplikace zkouš ené látky. Výtě žnosti pozdě jš ích stupňů experimentu se zjistí z př ísluš ných látkových bilancí. Výtě ž nosti by se mě ly nacházet v rozmezí 90 % až110 % u znač ených chemických látek (viz literatura 8) a v rozmezí 70 až110 % u neznačených chemických látek (viz literatura 3). Opakovatelnost a citlivost analytické metody Opakovatelnost analytické metody (kroměúč innosti první extrakce) pro kvantitativní stanovení zkouš ené látky a transformač ních produktůlze ově ř it provedením analýzy duplikátních vzorků týchž extraktů půdy, která byla dostateč ně dlouho inkubována, aby doš lo k vytvoř ení transformačních produktů. Mez detekce (LOD) analytické metody pro zkouš enou látku a pro transformač ní produkty by měla být alespoň0,01 mg na kg půdy (pro zkouš enou látku) nebo 1 % aplikované dávky, podle toho, která z hodnot je nižš í. Rovně žby měla být specifikována mez kvantitativní stanovitelnosti (LOQ). Správnost dat o transformaci
Regresní analýza závislosti koncentrace zkouš ené látky na č ase poskytuje vhodné informace o spolehlivosti transformační kř ivky a umožňuje vypočítat intervaly spolehlivosti pro poloč asy (v př ípadězdánlivé kinetiky prvního ř ádu) nebo pro hodnoty DT 50, popř ípaděhodnot DT75 a DT 90. XXIII.1.8 POPIS METODY XXIII.1.8.1 Vybavení a chemická činidla Inkubač ními systémy jsou statické uzavř ené systémy nebo vhodné průtokové systémy (viz literatura 7 a 17). Př íklady vhodných průtokových inkubačních aparatur a biometrických baněk jsou uvedeny na obrázcích 1 a 2. Oba typy inkubač ních systémůmají své výhody a svá omezení (viz literatura 7 a 17). Pro zkouš ku je nezbytné standardní laboratorní vybavení, zejména: analytické př ístroje, jako jsou GLC, HPLC, TLC, včetněvhodných detekčních systémůpro analýzu znač ených nebo neznač ených látek nebo pro inverzní isotopovou zř eďovací metodu; př ístroje pro identifikaci látek (např . MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR atd.); kapalinový scintilační spektrometr; okyslič ovací zař ízení pro spalování radioaktivního materiálu; odstř edivka; extrakční aparatura (např . centrifugační zkumavky pro studenou extrakci a Soxhletův př ístroj pro kontinuální extrakci s refluxem); zař ízení pro zkoncentrování roztokůa extraktů(např . rotační odparka); vodní lázeň; mechanické míchací zař ízení (např . hně tací zař ízení, rotač ní mixér). Použ ijí se např . tato chemická č inidla: NaOH p.a, 2 M, nebo jiná vhodná zásada (např . KOH, ethanolamin); H 2SO4 p.a., 0,05 M; ethylenglykol p.a.; tuhý absorpční materiál, např . natronové vápno, a polyurethanové zátky; organická rozpouš tě dla č istoty p.a., např . aceton, methanol atd.; kapalný scintilátor. XXIII.1.8.2 Aplikace zkouš ené látky Za úč elem aplikace zkouš ené látky do pů dy a jejího rozptýlení lze zkouš enou látku rozpustit ve vodě(v deionizované nebo destilované vodě) nebo lze v př ípaděpotř eby použ ít co nejmenš í množ ství acetonu nebo jiných organických rozpouš tě del (viz literatura 6), ve kterých je zkouš ená látka dostatečněrozpustná a stabilní. Zvolené množství rozpouš tě dla vš ak nesmí mít významný vliv na mikrobiální aktivitu půdy (viz oddíly 1.5 a 1.9.2 až1.9.3). Rozpouš tě dla, která působí jako inhibitory mikrobiální aktivity, např . chloroform, dichloromethan a jiná halogenovaná rozpouš tědla, nesmě ji být použ ita. Látku lze do půdy př idat také např . ve směsi s kř emenným pískem (viz literatura 6) nebo ve formě malých dílč ích vzorkůzkuš ební půdy, které byly př edem vysuš eny na vzduchu a sterilizovány. Pokud se látka př idává pomocí rozpouš tě dla, mě lo by být rozpouš tědlo odpař eno ješ těpř ed tím, nežjsou k původním nesterilním vzorkům půdy př idány obohacené dílč í vzorky. U bě žněpoužívaných chemických látek, ježse dostávají do půdy prostř ednictvím země dělské aplikace kalůz čistíren odpadních vod, se zkouš ená látka nejprve př idá do kalu, který se poté vpraví do vzorku půdy (viz oddíly 1.9.2 a 1.9.3). Nedoporuč uje se použ ívat rutinněpř ípravky v komerč ní úpravě . Např íklad u š patněrozpustných látek vš ak může být použ ití př ípravku v komerč ní úpravěvhodnou alternativou. XXIII.1.8.3 Půdy XXIII.1.8.3.1 Výběr půd Pro stanovení způsobu transformace lze použ ít reprezentativní půdy; doporučují se písč itohlinitá, prachovitohlinitá, hlinitá nebo hlinitopísč itá pů da [podle klasifikace FAO a USDA (viz literatura 18)] o hodnotěpH 5,5 až8,0 a obsahu organického uhlíku 0,5 - 2,5 %, př ič emžmikrobiální biomasa by mě la tvoř it nejméně1 % celkového organického uhlíku (viz literatura 10). Pro studie transformačních rychlostí se použ iji alespoň tř i dalš í půdy reprezentující rozsah relevantních půd. Půdy by se mě ly liš it, pokud jde o obsah organického uhlíku, pH, obsah jílu a mikrobiální biomasy (viz literatura 10). U vš ech půd by mě ly být charakterizovány alespoňjejich: struktura (% písku, % prachu, % jílu) [podle klasifikace FAO a USDA (viz literatura 18)], pH, kationtová výměnná kapacita, organický uhlík, sypná hustota, schopnost zadržet vodu a mikrobiální biomasa (pouze pro aerobní studie). Schopnost půdy zadržet vodu lze mě ř it jako polní kapacitu, jako retenč ní vodní kapacitu nebo jako vodní sací tlak (pF). Vysvě tlení je uvedeno v dodatku 1. V protokolu o zkouš ce by mělo být uvedeno, zda byly schopnost půdy zadržet vodu a sypná hustota stanoveny u neporuš ených
polních vzorků, nebo poruš ených (zpracovaných) vzorků. Pro interpretaci výsledkůmohou být už itečné dalš í informace o vlastnostech půdy. Pro stanovení charakteristik půdy lze použít metody doporučené v literatuř e (viz literatura 19 až23). Mikrobiální biomasa se stanoví metodou respirace indukované substrátem (SIR) (viz literatura 25 a 26) nebo alternativními metodami (viz literatura 20). XXIII.1.8.3.2 Odbě r, př íprava a skladování půd K dispozici by mě ly být podrobné informace o historii místa, ze kterého je půda odebírána. Těmito informacemi jsou př esná poloha, vegetač ní kryt, údaje o oš etř ování chemickými látkami, použití organických a minerálních hnojiv, př ídavky biologického materiálu nebo jiná kontaminace. Pokud byla půda v př edchozích č tyř ech letech oš etř ena zkouš enou látkou nebo látkami s analogickou strukturou, neměla by být použita pro transformační studie (viz literatura 10 a 15). Půda by mě la být č erstvěodebraná z terénu (z A horizontu nebo z horní 20cm vrstvy) a mě la by být tak vlhká, aby bylo možné snadné prosévání. Kroměpůd z rýžových polí by půdy nemě ly být odebírány v prů běhu dlouhých období (více než30 dnů) sucha, mrazůnebo zavodnění nebo krátce po tě chto obdobích (viz literatura 14). Vzorky se př epravují způsobem, který minimalizuje změny obsahu vody v půdě , a uchovávají se v temnu za co nejvě tš ího př ístupu vzduchu. Pro tento účel je obecněvhodný volněuzavř ený polyethylenový sáč ek. Půda se zpracuje co nejdř íve po odbě ru. Př ed proséváním na sítu o velikosti 2 mm, př i němžse odstraní malé kameny, drobní živočichové a zbytky rostlin, se z půdy odstraní vegetace, větš í ž ivočichové a kameny. Př ed proséváním by nemělo dojít k nadměrnému vysuš ení a rozdrcení půdy (viz literatura 15). Pokud je v ziměobtíž né odebrat vzorky v terénu (zmrzlá půda, sněhová pokrývka), mohou být odebrány z půdy skladované ve skleníku pod vegetač ním pokryvem (např . zatravně né půdy nebo půdy s travní smě sí s jetelem). V kaž dém př ípaděse upř ednostňují studie s č erstvěodebranými půdami; pokud má být odebraná a zpracovaná půda př ed zahájením studie skladována, musí být skladována za odpovídajících podmínek a pouze po omezenou dobu (př i (4 ± 2) °C po dobu maximálnětř í měsíců), aby byla zachována mikrobiální aktivita. Z výsledkůnedávných výzkumů vyplývá, že půdy z mírného pásma lze skladovat př i -20 °C déle nežtř i měsíce (viz literatura 28 a 29), aniždojde k významné ztrátěmikrobiální aktivity. Podrobné pokyny pro odbě r, zpracování a skladování půd pro biotransformač ní experimenty lze nalézt v literatuř e (viz literatura 8, 10, 15, 26 a 27). Př ed tím, nežse zpracovaná půda použ ije ve zkouš ce, provede se její př edbě žná inkubace, aby se umož nilo klíč ení a odstranila se semena a aby se po změ nách podmínek, ke kterým doš lo od odběru nebo skladování po nastolení inkubačních podmínek, znovu ustavila rovnováha mikrobiálního metabolismu. Obecněpostač uje př edběž né inkubační období v délce od 2 do 28 dnů př i podmínkách teploty a vlhkosti blížících se podmínkám zkouš ky (viz literatura 15). Skladování a př edbě žná inkubace by dohromady nemě ly trvat déle nežtř i měsíce. XXIII.1.9 PROVEDENÍ ZKOUŠKY XXIII.1.9.1 Zkuš ební podmínky XXIII.1.9.1.1 Zkuš ební teplota V průbě hu celé zkouš ky by měly být půdy inkubovány v temnu př i stálé teplotě , která je reprezentativní pro klimatické podmínky, ve kterých dojde k použití látky nebo k jejímu uvolně ní. Pro zkouš ky vš ech látek, které se dostávají do půdy v mírném klimatickém pásu, se doporučuje teplota (20 ± 2) °C. Teplota musí být monitorována. V př ípaděchemických látek aplikovaných nebo uvolňovaných v chladném klimatickém pásu (např . v severských zemích, bě hem podzimu/zimy) se inkubují dalš í vzorky půdy, avš ak př i niž š í teplotě(např . př i (10 ± 2) °C). XXIII.1.9.1.2 Vlhkost Pro účely dostatečného provzduš ňování a výž ivy půdní mikroflóry by pů da neměla být ani př íliš vlhká, ani př ílišsuchá. Vlhkost půdy doporučená pro optimální růst mikroflóry se nachází v rozmezí od 40 % do 60 % retenč ní vodní kapacity a v rozmezí od 0,1 do 0,33 bar (viz literatura 6). Naposledy uvedený rozsah odpovídá rozsahu pF od 2,0 do 2,5. Typická vlhkost různých druhů půd je uvedena v dodatku 2. Pro transformač ní zkouš ky př i aerobních podmínkách se vlhkost nastaví a udržuje na hodnotěpF od 2,0 do 2,5 (viz literatura 3). Vlhkost půdy se vyjádř í jako hmotnost vody na jednotku hmotnosti suš iny půdy, pravidelněse kontroluje (např . kaž dé 2 týdny) vážením inkubač ních baněk a ztráta vody se vyrovnává př idáním vody (nejlépe sterilněfiltrované vody z vodovodu). Př i upravování vlhkosti je tř eba zabránit ztrátám zkouš ené látky a/nebo transformačních produktův důsledku těkání nebo př ípadné fotodegradace, nebo je tř eba tyto ztráty minimalizovat. V př ípadětransformačních zkouš ek za anaerobních podmínek a za podmínek rýžového pole se
půda nasytí vodou tak, ž e se zaplaví. Podmínky aerobní inkubace V průtokových systémech se aerobní podmínky udrž ují obč asným propláchnutím nebo nepř etržitým provětráváním zvlhč eným vzduchem. V biometrických baňkách se výmě na vzduchu udržuje difuzí. XXIII.1.9.1.4 Sterilní aerobní podmínky Za úč elem získání informací o možné abiotické transformaci zkouš ené látky lze vzorky půdy sterilizovat (metody sterilizace jsou uvedeny v literatuř e 16 a 29), exponovat je sterilní zkouš ené látce (např . př idáváním roztoku př es sterilní filtr) a provzduš ňovat je zvlhč eným sterilním vzduchem, jak je popsáno v oddíle 1.9.1.3. U p ů d z rýž ových polí se půda a voda sterilizuje a inkubace se provede způ sobem uvedeným v oddílu 1.9.1.6. XXIII.1.9.1.5 Podmínky anaerobní inkubace S cílem nastolit a udržovat anaerobní podmínky se půda, která byla exponována zkouš ené látce a inkubována za aerobních podmínek 30 dnůnebo jeden poločas nebo po dobu odpovídající DT50 (podle toho, co je kratš í), zaplaví vodou (vrstva vody 1 - 3 cm) a inkubač ní systém se propláchne inertním plynem (např . dusíkem nebo argonem). Aerobní podmínky př evažují v povrchových půdách a dokonce v podpovrchových půdách. Anaerobní podmínky se mohou vyskytovat jen př íležitostněběhem zaplavení půdy po vydatných srážkách, nebo jsou-li takové podmínky ustaveny na rýž ových polích. Zkuš ební systém musí umožňovat mě ř ení pH, koncentrace kyslíku a oxidačně -redukčního potenciálu a musí být vybaven zař ízením pro zachycování tě kavých produktů. Biometrický systém musí být uzavř ený, aby bylo zabráně no př ístupu vzduchu difuzí. XXIII.1.9.1.6 Inkubace za podmínek rýž ového pole Pro úč ely studia transformace v půdách rýž ových polí se půda zaplaví vrstvou vody o výš ce asi 1 5 cm a zkouš ená látka se aplikuje do vodné fáze (viz literatura 9). Doporuč ená tlouš ťka vrstvy půdy je alespoň5 cm. Systém se provzduš ňuje vzduchem jako za aerobních podmínek. Hodnota pH, koncentrace kyslíku a oxidač ně-redukč ní potenciál vodné vrstvy se monitorují a zaznamenávají. Př ed zahájením transformačních studií je nezbytné alespoňdvoutýdenní př edbě žné inkubační období (viz oddíl 1.8.3.2). XXIII.1.9.1.7 Délka zkouš ky Studie rychlosti a způsobu transformace by nemě ly za normálních podmínek trvat déle než120 dnů(viz literatura 3, 6 a 8), neboťpoté by podle oč ekávání mělo v umě lém laboratorním systému izolovaném od př irozeného doplňování postupnědocházet ke sniž ování mikrobiální aktivity půdy. Aerobní studie mohou být ukonč eny daleko dř íve nežza 120 dnů, pokud je v dané dobějasně dosaženo konečného transformač ního schématu a konečné mineralizace. Zkouš ku lze ukončit po 120 dnech, nebo pokud se transformovalo 90 % zkouš ené látky, avš ak pouze tehdy, vytvoř ilo-li se alespoň5 % CO 2. Pokud je to nezbytné pro popis rozkladu zkouš ené látky a tvorby a rozkladu hlavních transformačních produktů, lze studie prodlouž it (např . na 6 nebo 12 mě síců) (viz literatura 8). Delš í inkubační období by měla být zdůvodněna ve zprávěo zkouš ce a doplněna mě ř ením biomasy během těchto období a na jejich konci. XXIII.1.9.2 Provedení zkouš ky Do každé z inkubač ních baněk se vpraví asi 50 až200 g půdy (hmotnost suš iny) (viz obrázky 1 a 2 v dodatku 3) a půda se jednou z metod uvedených v oddílu 1.8.2 exponuje zkouš ené látce. Pokud se pro úč ely aplikace zkouš ené látky použijí organická rozpouš tě dla, odstraní se z půdy odpař ením. Půda se poté důkladněpromíchá š pachtlí nebo se baňka protř epe. Pokud se studie provádí za podmínek rýžového pole, půda a voda se po aplikaci zkouš ené látky důkladněpromísí. Malé podíly (např . 1 g) exponované půdy se analyzují na zkouš enou látku za úč elem kontroly rovnomě rnosti distribuce. Alternativní metody jsou uvedeny níž e. Aplikované množ ství by mě lo odpovídat nejvyš š ímu aplikovanému množ ství př ípravku na ochranu rostlin doporučenému podle pokynůk použ ití a rovnomě rnému zapravení do vhodné hloubky na poli (např . do horní 10cm vrstvy půdy. Výpočet výchozí koncentrace na základěplochy se provede takto: XXIII.1.9.1.3
A kg / ha .10 6 mg / kg C puda 4 2 l m .10 m / ha .d kg puda / m 3
-1
-1
C půda = výchozí koncentrace v půdě[mg-kg ]; A = aplikač ní dávka [kg.ha ]; l = tlouš ť ka půdní vrstvy na poli [m], d = sypná hustota suché půdy [kg-m-3]. Zhruba platí, že aplikační dávka 1 -1 -1 kg.ha vede ke koncentraci v půděpř ibližně1 mg.kg v 10cm vrstvě(př i př edpokládané sypné -3) hustotě1 g.cm .Např íklad u chemických látek aplikovaných na list nebo do pů dy bez zapravení se pro výpočet množ ství chemické látky, které je tř eba př idat do kaž dé baňky, použije hloubka vrstvy půdy 2,5 cm. U chemických látek zapravovaných do půdy je př ísluš ná hloubka
XXIII.1.9.3
XXIII.1.9.4
XXIII.2. XXIII.2.1
specifikována v pokynech pro použ ití. U chemických látek obecněby mělo být aplikované množ ství odhadnuto na základěhlavní cesty vstupu do půdy; jsou-li např íklad hlavní cestou vstupu do půdy kaly z č istíren odpadních vod, mě la by být chemická látka př idána do kalu v koncentraci, která odráží očekávanou koncentraci v kalu, a množ ství kalu zapravené do půdy by mě lo odpovídat normálnímu množství kalu zapravovanému do země dě lských půd. Pokud tato koncentrace není dostateč ná pro identifikaci hlavních transformač ních produktů, můž e napomoci inkubace samostatných půdních vzorkůobsahujících vyš š í koncentrace, avš ak nemě ly by být použ ívány nadměrné koncentrace, které mají vliv na mikrobiální funkce (viz oddíly 1.5 a 1.8.2). Jinou možností je expozice velké dávky půdy (tj. 1 až2 kg), její důkladné promísení vhodným míchacím zař ízením a př enesení malých podílůo hmotnosti 50 až200 g do inkubačních baněk (např . pomocí dě lič e vzorku). Malé podíly (např . 1 g) exponované půdy se analyzují na zkouš enou látku za účelem kontroly rovnoměrné distribuce. Takový postup se upř ednostňuje, neboť umož ňuje stejnoměrnějš í rozptýlení zkouš ené látky v půdě. Neexponované vzorky se inkubují za stejných podmínek (aerobních) jako vzorky exponované zkouš ené látce. Tyto vzorky se použijí pro stanovení biomasy během studií a na jejich konci. Pokud se látka aplikuje do pů dy rozpuš těná v organickém rozpouš tě dle (organických rozpouš tědlech), inkubují se vzorky půdy vystavené témužmnožství rozpouš tě dla (rozpouš tě del) za týchž(aerobních) podmínek jako vzorky exponované zkouš ené látce. Tyto vzorky se použijí pro stanovení biomasy na zač átku studií, v jejich průběhu a na jejich konci za účelem kontroly úč inkůrozpouš tě dla (rozpouš tě del) na mikrobiální biomasu. Baňky obsahující exponovanou půdu se buď zapojí do průtokového systému popsaného na obrázku 1, nebo se uzavř ou absorbč ní kolonou, jak je uvedeno na obrázku 2 (viz dodatek 3). Odbě r vzorkůa měř ení V př ísluš ných č asových intervalech se vyberou duplikátní inkubač ní baňky, vzorky půd se extrahují vhodnými rozpouš tě dly různé polarity a analyzují na zkouš enou látku a/nebo na transformační produkty. V dobř e založených studiích je k dispozici dostatečný počet baně k, aby bylo mož né ke kaž dému odběru vybrat dvěbaňky. V různých č asových intervalech (v 7denních intervalech bě hem prvního měsíce a po prvním mě síci v 17denních intervalech) bě hem inkubace každého vzorku půdy a dále na konci inkubace se také odeberou absorpč ní roztoky nebo tuhé absorpč ní materiály a analyzují se na tě kavé produkty. Kroměvzorku půdy odebraného ihned po aplikaci (vzorek ze dne 0) se provede alespoňdalš ích 5 odbě rů. Časové intervaly se zvolí tak, aby bylo možné stanovit schéma rozkladu zkouš ené látky a způsob tvorby a rozkladu transformačních produktů(např . po 0, 1, 3, 7 dnech; po 2, 3 týdnech; po 1, 2, 3 měsících atd.). 14 V př ípadězkouš ené látky značené isotopem C se spálením kvantitativněstanoví neextrahovatelná radioaktivita a pro každý vzorkovací interval se vypoč te látková bilance. V př ípaděanaerobní inkubace nebo inkubace za podmínek rýž ového pole se půda a vodná fáze analyzují na zkouš enou látku a transformač ní produkty buď společ ně, nebo se př ed extrakcí a analýzou oddě lí filtrací nebo centrifugací. Nepovinné zkouš ky Pro odhad vlivu teploty a vlhkosti půdy na rychlosti transformace zkouš ené látky a/nebo jejích transformačních produktův půděmohou být už itečné aerobní nesterilní studie př i dalš í teplotě nebo vlhkosti půdy. O dalš í charakterizaci neextrahovatelné radioaktivity se lze pokusit např íklad použitím metody extrakce tekutinou v nadkritickém stavu. DATA ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ Pro kaž dý vzorkovací interval se uvede množ ství zkouš ené látky, transformačních produktů, tě kavých látek (pouze v %) a neextrahovatelných látek v procentech výchozí koncentrace, popř ípaděv mg na kg půdy (na hmotnost suš iny). Pro každý vzorkovací interval se uvede látková bilance v procentech výchozí koncentrace. Grafické znázorně ní závislosti koncentrace zkouš ené látky na č ase umožní provést odhad jejího poloč asu transformace nebo hodnoty DT 50. Měly by být identifikovány hlavní transformač ní produkty a měly by být také sestrojeny kř ivky jejich závislosti na č ase, aby se ukázala rychlost jejich tvorby a rozkladu. Hlavním transformač ním produktem je jakýkoli produkt, který kdykoli během studie př edstavuje ≥10 % aplikované dávky. Zachycené tě kavé produkty jsou urč itým ukazatelem těkavosti zkouš ené látky a jejích transformačních produktůz půdy. Př esnějš í stanovení poloč asůnebo hodnot DT 50 a popř ípaděhodnot DT75 a DT 90 se provede výpoč tem za použití vhodného modelu kinetiky. Společněs hodnotami poloč asu a DT 50 se uvede popis použ itého modelu kinetiky, ř ád kinetiky a koeficient determinace (r2 ). Pokud není r2 < 0,7, upř ednostňuje se kinetika prvního ř ádu. Podle mož nosti se výpoč ty použ ijí také na hlavní
transformační produkty. Př íklady vhodných modelůjsou popsány v literatuř e 31 až35. V př ípaděstudií rychlosti prováděných př i různých teplotách se závislost rychlosti transformace na teplotěpopíš e v rozsahu experimentálních teplot pomocí Arrheniovy rovnice:
k A.e
XX111.2.2
XX111.3. XX111.3.1
B / T
B nebo ln k ln , T
kde ln A a B jsou regresní konstanty získané z úseku na ose y a ze směrnice regresní př ímky závislosti ln k na l/T, kde k je rychlostní konstanta př i teplotěT a T je teplota v Kelvinech. Je tř eba vě novat pozornost omezení rozsahu teplot, v ně mžplatí Arrheniova rovnice, jestliže transformaci určuje mikrobiální č innost. HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Př estož e se studie provádě jí v umě lém laboratorním systému, umož ňují výsledky odhadnout rychlost transformace zkouš ené látky a rovně ž rychlost tvorby a rozkladu transformačních produktůza polních podmínek (viz literatura 36 a 37). Studie transformač ního způsobu zkouš ené látky poskytuje informaci o způsobu, jakým se mě ní struktura aplikované látky v půděpůsobením chemických a mikrobiálních reakcí. ZPRÁVY PROTOKOL O ZKOUŠCE Protokol o zkouš ce musí obsahovat tyto údaje: Zkouš ená látka: obecný název, chemický název, č íslo CAS, strukturní vzorec (s uvedení polohy značícího atomu (značících atomů) př i použití radionuklidů) a relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti (viz oddíl 1.5); čistota zkouš ené látky (obsah neč istot); popř ípaděradiochemická čistota znač ené chemické látky a specifická aktivita; Referenč ní látky: chemický název a struktura referenčních látek použ itých k charakterizaci a/nebo identifikaci transformač ního produktu; Zkuš ební půdy: podrobné údaje o místěodběru; datum a postup odbě ru vzorkůpů dy; vlastnosti půdy, např . pH, obsah organického uhlíku, struktura (% písku, % prachu, % jílu), kationtová výmě nná kapacita, sypná hustota, schopnost zadrž et vodu a mikrobiální biomasa; doba skladování půdy a podmínky skladování (pokud byla skladována); Zkuš ební podmínky: datum provedení studií; množství aplikované zkouš ené látky; použitá rozpouš tě dla a metoda aplikace zkouš ené látky; hmotnost exponované půdy na zač átku zkouš ky a hmotnost půdy odebírané pro analýzu v kaž dém intervalu; popis použ itého inkubač ního systému; rychlosti průtoku vzduchu (pouze u průtokových systémů); zkuš ební teplota; vlhkost půdy bě hem inkubace; mikrobiální biomasa na zač átku aerobních studií, během nich a na jejich konci; pH, koncentrace kyslíku a oxidačně -redukční potenciál na zač átku anaerobních studií a studií za podmínek rýžového pole, během nich a na jejich konci; metoda (metody) extrakce; metody kvantitativního stanovení a identifikace zkouš ené látky a hlavních transformačních produktův půděa v absorpč ních materiálech; počet duplikátních vzorkůa počet kontrol. Výsledky: výsledky stanovení mikrobiální aktivity; opakovatelnost a citlivost použitých analytických metod; hodnoty výtěž nosti (hodnoty v % pro platnou studii jsou uvedeny v oddíle 1.7.1); tabulky s výsledky vyjádř enými v % výchozí aplikované dávky, popř ípaděv mg na kg půdy (vztaženo na hmotnost suš iny půdy); látková bilance bě hem studií a na jejich konci; charakterizace neextrahovatelné (vázané) radioaktivity nebo reziduí v p ů dě; kvantifikace uvolně ného COZ a dalš ích těkavých slouč enin; kř ivky závislostí koncentrací zkouš ené látky, popř ípaděhlavních transformač ních produktův
půděna čase; poločas nebo hodnoty DT50, DT75 a DT90 pro zkouš enou látku, popř ípaděi pro hlavní transformač ní produkty vč etněpř ísluš ných intervalůspolehlivosti; odhad rychlosti abiotického rozkladu za sterilních podmínek; posouzení kinetiky transformace pro zkouš enou látku, popř ípaděi pro hlavní transformač ní produkty; př ípadný návrh způsobu transformace; diskuse a interpretace výsledků ; nezpracovaná data (tj. chromatogramy jednotlivých vzorků, př íklady výpoč tu rychlostí transformace a metody použité pro identifikaci transformačních produktů). LITERATURA (1) US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate. (2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada. (3) Evropská unie (EU) (1995). Smě rnice Komise 95/36/ES ze dne 14. č ervence 1995, kterou se mění směrnice Rady 91/414/EHS o uvádě ní př ípravkůna ochranu rostlin na trh. Př íloha II č ást A a př íloha III č ást A: Rozpad a chování v ž ivotním prostř edí. (4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air. (5) BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden - Abbau, Umwandlung und Metabolismus. (6) ISO/DIS 11266 (1994). Soil Quality - Guidance on laboratory tests for biodegradation of organic chemicals in soil, Technical Committee ISO/TC 190/SC 4. (7) ISO 14239 (1997E). Soil Quality - Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions. (8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Vyd. Mark R. Lynch. (9) MAFF - Japan 2000 - Draft Guidelines for transformation studies of pesticides in soil Aerobic metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded). (10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Itálie, 18. - 20. ledna 1995. (11) Guth, J. A. (1980). The study of transformations. In: Interactions between Herbicides and the Soil (Vyd. R. J. Hance), Academic Press, 123 - 157. (12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley- VCH (1998). (13) T. R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984) (14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (př ijato 12. května 1981) (15) ISO 10381-6 (1993). Soil Quality - Sampling - Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. (16) Př íloha V směrnice 67/548/EHS (17) Guth, J. A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In: Progress in Pesticide Biochemistry. Vyd. D. H. Hutson, T. R. Roberts, J. Wiley & Sons. Vol 1, 85 -114. (18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) a Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962). (19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mineralogical Methods. Vyd. A. Klute, Agronomy Series No 9, 2. vydání. (20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Microbiological Properties. Vyd. A. L. Page, R. H. Miller, D. R. Kelney, Agronomy Series No 9, 2. vydání. (21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality - General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis, 1. vydání. (22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main. (23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart. (24) Anderson, J. P. E., Domsch, K. H. (1978). A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215 - 221. (25) ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: Fumigation-extraction method. -
XXIII4.
(26)
(27)
(28) (29)
(30) (31) (32)
(33)
(34)
(35)
(36) (37)
Anderson, J. P. E. (1987). Handling and storage of soils for pesticide experiments. In: Pesticide Effects on Soil Microflora. Vyd. L. Somerville, M. P. Greaves, Taylor & Francis, 45 - 60. Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation in the environment: Aerobic and bio-transformation of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the th 16 Symposium on Environmental Science of Pesticide, 105 - 120. Keuken O., Anderson J. P. E. (1996). Influence of storage on biochemical processes in soil. In: Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59 - 63 (SETAC-Europe). Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., Stenström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In: Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Europe). Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethylene oxide on soil microbial content and some chemical characteristics. Plant and Soil 102, 197-200. Anderson, J. P. E. (1975). Einfluss von Temperatur and Feuchte auf Verdampfung, Abbau and Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146. Hamaker, J. W. (1976). The application of mathematical modelling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181-199. Goring, C. A. I., Laskowski, D. A., Hamaker, J. W., Meikle, R. W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In: Environmental Dynamics of Pesticides. Vyd. R. Haque, V. H. Freed, 135 - 172. Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz Nachrichten Bayer 39, 188 - 204. Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. 1. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer 33, 47 - 60. Gustafson D. I., Holden L. R. (1990). Non-linear pesticide dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, 1032 - 1041. Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In: Interactions between Herbicides and the Soil. Vyd. R. J. Hance , Academic Press, 83 - 122.
DODATEK 1 TLAK VODY, POLNÍ KAPACITA (PK) A RETENČNÍ VODNÍ KAPACITA (RVK) Výš ka vodního sloupce [cm] 107 1,6.104 104 103 6.10 2 3,3.102 102 60 33 10 1 a
a
b
pF
bar
7 4,2 4 3 2,8 2,5 2 1,8 1,5 1 0
104 16 10 1 0,6 0,33 c 0,1 0,06 0,033 0,01 0,001
Poznámky Suchá půda Bod vadnutí
Rozpě tí polní kapacity
d
RVK (př ibližná hodnota) Půda nasycená vodou
pF = dekadický logaritmus výš ky vodního sloupce v cm. 1 bar = 105 Pa. c Odpovídá př ibližnému obsahu vody př i slož ení 10 % písku, 35 % hlíny a 45 % jílu. d Polní kapacita není konstanta, ale mě ní se v závislosti na druhu půdy od pF 1,5 do 2,5. Tlak vody se vyjadř uje v cm vodního sloupce nebo v jednotkách bar. Vzhledem k velkému rozpětí se sací tlak vyjadř uje jednoduš e jako hodnota pF, která je ekvivalentní logaritmu vodního sloupce v cm. Polní kapacita je definována jako množ ství vody, které př írodní pů da po delš ím deš tivém období nebo po dostateč ném zavlažení udrží proti gravitaci 2 dny. Stanovuje se u neporuš ené půdy v polním pokusu. Naměř ená hodnota tedy není použitelná pro laboratorní vzorky poruš ené půdy. Hodnoty PK stanovené u poruš ených půd mohou vykazovat vě tš í systematické odchylky. b
Retenční vodní kapacita (RVK) se stanovuje v laboratoř i u neporuš ené i poruš ené půdy tak, ž e se kapilárním vzlínáním nasytí sloupec půdy vodou. Využ ije se zejména u poruš ených půd, kdy mů že být RVK ažo 30 % vyš š í nežpolní kapacita (1). Také se stanovuje snadně ji nežspolehlivé hodnoty PK. DODATEK 2 VLHKOST PŮDY (v g vody na 100 g suš iny) U RŮZNÝCH DRUHŮPŮD Z RŮZNÝCH ZEMÍ Vlhkost půdy př i Druh půdy Země 1 RVK PF = 1,8 pF=2,5 Písč itá Německo 28,7 8,8 3,9 Hlinitopísčitá Německo 50,4 17,9 12,1 Hlinitopísčitá Švýcarsko 44,0 35,3 9,2 Prachovitohlinitá Švýcarsko 72,8 56,6 28,4 Jílovitohlinitá Brazílie 69,7 38,4 27,3 Jílovitohlinitá Japonsko 74,4 57,8 31,4 Písč itohlinitá Japonsko 82,4 59,2 36,0 Prachovitohlinitá USA 47,2 33,2 18,8 Písč itohlinitá USA 40,4 25,2 13,3 1 Retenč ní vodní kapacita DODATEK 3 Obrázek 1 Př íklad průtokové aparatury pro studium transformace chemických látek v půdě(viz literatura 1 a 2) 1: jehlový ventil 4: baňka pro studium metabolismu v 7, 8: zátka z hydroxidu sodného pů d ě(zalitá vodou pouze v př ípadě pro zachycení CO2 a jiných anaerobních podmínek a podmínek kyselých tě kavých látek rýž ového pole) 2: promývačka s vodou 5: baňka s ethylenglykolem pro 9: průtokomě r zachycení organických tě kavých sloučenin 3: ultramembrána (pouze ve 6: baňka s kyselinou sírovou pro sterilních podmínkách), zachycení alkalických těkavých velikost pórů0,2 µm sloučenin Obrázek 2 Příklad biometrické baňky pro studium transformace chemických látek v půdě(viz literatura 3)
(1) (2) (3)
Guth, J. A. (1980). The study of transformations. In: Interactions between Herbicides and the Soil. Vyd. R. J. Hance, Academic Press, 123 - 157. Guth, J. A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In: Progress in Pesticide Biochemistry. Vyd. D.H. Hutson, T.R. Roberts, J. Wiley & Sons. Vol 1, 85 - 114. Anderson, J. P. E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141 - 146.
XXIV. METODA PRO STANOVENÍ AEROBNÍ A ANAEROBNÍ TRANSFORMACE V SYSTÉMECH VODA-SEDIMENT (metoda C.24 podle př ílohy směrnice 2004/73/ES ze dne 29. dubna 2004, kterou se po dvacáté deváté př izpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbliž ování právních a správních př edpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek) XXIV.I. XXIV.1.1
METODA Tato zkuš ební metoda je replikou metody OECD TG 308 (2002). ÚVOD Chemické látky se mohou dostat do mělkých nebo hlubokých povrchových vod takovými cestami, jako jsou př ímá aplikace, unáš ení postř iku, odtok, ukládání odpadu, průmyslové, komunální nebo země dě lské emise a atmosférický spad. V této zkuš ební metoděje popsán laboratorní postup posouzení aerobní a anaerobní transformace organických chemických látek v systémech vodasediment. Je založena na doporuč eních a smě rnicích národních a mezinárodních organizací (viz
XXIV.1.2
XXIV.1.3
XXIV.1.4
literatura 1 až8). Tyto studie jsou požadovány u látek, které jsou aplikovány bezprostř ednědo vody nebo které se mohou dostat do vody výš e uvedenými cestami. Podmínky ve vrchní vodní fázi př írodních systémůvoda-sediment jsou často aerobní. Podmínky v povrchové vrstvěsedimentu mohou být buďaerobní, nebo anaerobní, zatímco podmínky hloubě ji v sedimentu jsou obvykle anaerobní. S cílem zahrnout vš echny tyto mož nosti je v tomto dokumentu popsána zkouš ka jak za aerobních podmínek, tak za anaerobních podmínek. Aerobní zkouš kou se simuluje aerobní vodní sloupec nad aerobní vrstvou sedimentu, pod nížlež í vrstva s anaerobním gradientem. Anaerobní zkouš ka simuluje zcela anaerobní systém voda-sediment. Pokud je z okolností zř ejmé, že je tř eba se odchýlit od těchto doporučení, např . použít nedotč ené stř ední vrstvy sedimentůnebo sedimenty, které mohly být exponovány zkouš enou látkou, existují jiné metody určené k tomuto účelu (viz literatura 9). DEFINICE Ve vš ech př ípadech je tř eba používat jednotky mezinárodní soustavy jednotek (SI). Zkouš ená látka: jakákoli látka, aťjižvýchozí látka, nebo př ísluš né transformač ní produkty. Transformač ní produkty: vš echny látky vznikající př i biotických a abiotických transformačních reakcích zkouš ené látky, vč etněCO2 a vázaných reziduí. Vázaná rezidua: „Vázaná rezidua“ jsou slouč eniny v půdě , rostliněnebo v živočichu, které po extrakci zůstávají v matrici ve forměvýchozí látky nebo jejího metabolitu (jejích metabolitů). Metoda extrakce nesmí podstatněměnit samotné sloučeniny nebo strukturu matrice. Povahu vazeb lze částečně vyjasnit extrakcí spojenou se změnami v matrici a nároč nými analytickými technikami. Dosud byly tímto způsobem vyjasněny např . kovalentní, iontové a adsorpční vazby a rovněžzáchyty. Tvorba vázaných reziduí obecněpodstatněsnižuje biologickou př ístupnost a dostupnost (viz literatura 10) [upraveno IUPAC 1984 (viz literatura 11)]. Aerobní transformace: (oxidač ní): reakce, ke kterým dochází za př ítomnosti kyslíku (viz literatura 12). Anaerobní transformace: (redukční): reakce probíhající s vyloučením molekulárního kyslíku (viz literatura 12). Sediment: je směs minerálních a organických chemických složek, př ičemžorganické složky obsahuji sloučeniny s vysokým obsahem uhlíku a dusíku a vysokou molekulovou hmotností. Ukládají se v povrchových vodách a vytvář ejí rozhraní s těmito vodami. Mineralizace: je úplný rozklad organické slouč eniny na CO2 a H2 O za aerobních podmínek a na CH4, CO2 a H2 O za anaerobních podmínek. V rámci této zkuš ební metody, př i nížse použ ívají slouč eniny značené radioisotopy, se mineralizací rozumí rozsáhlý rozklad molekuly, př i němžse znač ící atomy uhlíku kvantitativně oxidují nebo redukují, př ičemžse uvolňuje odpovídající množ ství 14 CO2 nebo 14 CH4 . Poloč as, t0,5, je čas, za který dojde k 50% transformaci zkouš ené látky, jestliže lze transformaci popsat kinetikou prvního ř ádu; nezávisí na poč áteč ní koncentraci. DT50 (doba odbourání 50): doba, za kterou se poč áteč ní koncentrace zkouš ené látky sníž í o 50 %. DT75 (doba odbourání 75): doba, za kterou se počáteční koncentrace zkouš ené látky sníží o 75 %. DT90 (doba odbourání 90): doba, za kterou se poč áteč ní koncentrace zkouš ené látky sníž í o 90 %. REFERENČNÍ LÁTKY Referenč ní látky by měly být použity pro identifikaci a kvantitativní stanovení transformačních produktůspektroskopickými a chromatografickými metodami. INFORMACE O ZKOUŠENÉ LÁTCE Pro stanovení rychlosti transformace lze použ ít jak látky neznač ené radioisotopy, tak znač ené látky, př ič emžznačené materiály jsou upř ednostňovány. Značený materiál je nezbytný pro studium způsobu transformace a pro stanoveni látkové bilance. Doporučuje se znač ení isotopem 14C, avš ak 13 15 3 32 už itečné mohou být i jiné isotopy, např . C, N , H, P. Znač ena by mě la být pokud možno nejstabilně jš í č ást (části) molekuly. Pokud např íklad látka obsahuje kruh, je tř eba tento kruh označ it; pokud látka obsahuje dva nebo více kruhů, můž e být nezbytné provést samostatné studie za úč elem stanovení osudu každého z označ ených kruhů, a získat tak vhodné informace o tvorbě transformačních produktů. Chemická a/nebo radiochemická č istota látky by měla být alespoň95 %. Př ed provedením zkouš ky by mě ly být k d ispozici tyto informace o látce: a) rozpustnost ve vodě(metoda A.6); b) rozpustnost v organických rozpouš tě dlech; c) tlak par (metoda A.4) a Henryho konstanta; d) rozdělovací koeficient n-oktanol/voda (metoda A.8); e) adsorpční koeficient (podle potř eby Kd , Kf nebo Koc (metoda C.18); f) hydrolýza (metoda C.7);
XXIV.1.5
XXIV.1.6
XXIV.1.7 XXIV.1.7.1
XXIV.1.7.2
XXIV.1.7.3
XXIV.1.8 XXIV.1.8.1
g) disociač ní konstanta (pK a) [smě rnice OECD 112] (viz literatura 13); h) chemická struktura zkouš ené látky a př ípadněpoloha značícího nuklidu. Poznámka: Ve zprávěse uvede teplota, př i které byla mě ř ení prováděna. Mezi dalš í už iteč né informace patř í údaje o toxicitězkouš ené látky pro pů dní mikroorganismy, údaje o snadné nebo vlastní biologické rozlož itelnosti a údaje o aerobní a anaerobní transformaci v půdě . K dispozici by měly být analytické metody (vč etněextrakčních a izolač ních metod) pro kvantitativní stanovení a identifikaci zkouš ené látky a jejích transformačních produktůve voděa sedimentu (viz oddíl 1.7.2). PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY V metoděpopsané v této zkouš ce se použ ívají aerobní i anaerobní systémy voda-sediment (viz dodatek 1), které umož ňují i) mě ř it rychlost transformace zkouš ené látky v systému voda-sediment, ii) mě ř it rychlost transformace zkouš ené látky v sedimentu, iii) mě ř it rychlost mineralizace zkouš ené látky a/nebo produktůjejí transformace (pokud se 14 použije zkouš ená látka znač ená isotopem C) iv) identifikaci a kvantitativní stanovení produktůtransformace ve voděa v sedimentu, vč etně látkové bilance (pokud se použije značená zkouš ená látka), v) mě ř it distribuci zkouš ené látky a produktůjejí transformace mezi dvě ma fázemi během inkubace v temnu (aby nedoš lo např . k vykvetení ř as) př i konstantní teplotě . Pokud to údaje umožň ují, stanoví se poloč asy a hodnoty DT50 , DT75 a DT90, které by vš ak neměly být př íliš extrapolovány mimo obor experimentálních hodnot (viz oddíl 1.2). Pro aerobní i anaerobní studie jsou nezbytné alespoňdva sedimenty a př ísluš né vodní fáze (viz literatura 7). V některých př ípadech by vš ak mě ly být použ ity více neždva systémy vodasediment, např . u chemických látek, které mohou být př ítomny ve sladkovodním i moř ském ekosystému. POUŽITELNOST ZKOUŠKY Tato je metoda je použitelná pro vš echny chemické látky (neznač ené nebo znač ené radioaktivními isotopy), pro ně žje k dispozici analytická metoda s dostateč nou správností a citlivostí. Je použ itelná pro mírnětě kavé a netě kavé sloučeniny rozpustné nebo š patněrozpustné ve vodě . Zkouš ka by neměla být použ ita u látek, které z vody silnětěkají (např . fumiganty, organická rozpouš tědla), a nelze je tedy ve voděnebo v sedimentu udržet za experimentálních podmínek této zkouš ky. Tato metoda je dosud použ ívána ke studiu transformace chemických látek ve sladkovodním systému voda-sediment, avš ak můž e být v zásaděpouž ita také na estuarní a moř ské systémy. Není vhodná k simulaci podmínek v tekoucích vodách (např .ř ekách) nebo na otevř eném moř i. KRITÉRIA JAKOSTI Výtě žnost Extrakce a analýza provedená alespoňu dvou duplikátních vzorkůsystému voda-sediment ihned po př idání zkouš ené látky poskytne první informaci o opakovatelnosti analytické metody a o stejnomě rnosti aplikace zkouš ené látky. Výtě žnosti pozdě jš ích stupňůexperimentu se zjistí z př ísluš ných látkových bilancí (pokud se použ ije znač ený materiál). Výtěž nosti by se mě ly nacházet v rozmezí 90 % až110 % u znač ených chemických látek (viz literatura 6) a v rozmezí 70 % až110 % u neznačených chemických látek. Opakovatelnost a citlivost analytické metody Opakovatelnost analytické metody (kroměúč innosti první extrakce) pro kvantitativního stanovení zkouš ené látky a transformač ních produktůlze ově ř it provedením analýzy duplikátních vzorků týchžextraktůvzorkůvody nebo sedimentu, které byly dostateč nědlouho inkubovány, aby doš lo k vytvoř ení transformačních produktů. Mez detekce analytické metody (LOD) pro zkouš enou látku a pro transformač ní produkty by měla být alespoň0,01 mg na kg vody nebo sedimentu (pro zkouš enou látku) nebo 1 % výchozího množ ství aplikovaného do zkuš ebního systému, podle toho, která z hodnot je niž š í. Rovně žby mě la být specifikována mez kvantitativní stanovitelnosti (LOQ). Správnost dat o transformaci Regresní analýza závislosti koncentrace zkouš ené látky na č ase poskytuje vhodné informace o správnosti transformační kř ivky a umož ňuje vypočítat intervaly spolehlivosti pro poloč asy (v př ípadězdánlivé kinetiky prvního ř ádu) nebo pro hodnoty DT 50 a popř ípaděhodnoty DT 75 a DT90 . POPIS METODY Zkuš ební systém a aparatura Studie se provede se skleněnými nádobami (např . baňkami, centrifugač ními kyvetami), pokud
z př edbě žných informací (např . z rozdělovacího koeficientu n-oktanol/voda, ze sorpčních dat atd.) nevyplývá, že látka můž e ulpívat na skle; v takovém př ípadělze zvážit použ ití náhradního materiálu (např . teflonu). Pokud je o zkouš ené látce známo, že ulpívá na skle, lze problém zmírnit jednou z následujících metod: stanovením hmotnosti zkouš ené látky a transformač ních produktůsorbovaných na skle; zajiš těním, aby se na konci zkouš ky omylo rozpouš tědlem veš keré laboratorní sklo; použitím komerč ní úpravy př ípravků(viz také oddíl 1.9.2); použitím větš ího množství pomocného rozpouš tě dla za účelem př idání zkouš ené látky do systému; pokud se použ ije pomocné rozpouš tědlo, nesmí š tě pit zkouš enou látku solvolýzou. Př íklady typických zkuš ebních aparatur, tj. prů tokové a biometrické systémy, jsou uvedeny v dodatcích 2 a 3 (viz literatura 14). Jiné užiteč né inkubační systémy jsou popsány v literatuř e (viz literatura 15). Experimentální aparatura by měla být konstruována tak, aby byla možná výmě na vzduchu nebo dusíku a zachycení těkavých produktů. Rozmě ry aparatury musí splňovat pož adavky zkouš ky (viz oddíl 1.9.1). Ventilace musí být zajiš tě na buďjemným probubláváním, nebo proháně ním vzduchu nebo dusíku nad hladinou vody. V druhém př ípaděse doporuč uje vodu seshora mírněpromíchávat, aby docházelo k lepš í distribuci kyslíku nebo dusíku ve vodě. Nemě l by se použít vzduch zbavený CO2, neboťby doš lo ke zvýš ení pH vody. V žádném př ípaděnení ž ádoucí, aby doš lo ke zvíř ení sedimentu, a je tomu tř eba pokud mož no zabránit. Slabětě kavé chemické látky se zkouš ejí v biometrickém systému za mírného promíchávání vodní hladiny. Lze rovněžpoužít uzavř ené nádobky s volným objemem pod víč kem vyplněným atmosférickým vzduchem nebo dusíkem a vnitř ní ampulky pro zachycování tě kavých produktů(viz literatura 16). U aerobních zkouš ek je nezbytná pravidelná výmě na plynu pod víč kem, aby se vyrovnávala spotř eba kyslíku biomasou. Mezi vhodné lapače pro shromaž ďování tě kavých transformačních produktůpatř í kromějiných roztok hydroxidu draselného nebo sodného o koncentraci 1 mol.dm-3 pro zachytávání oxidu uhličitého a ethylenglykol, ethanolamin nebo 2% parafin v xylenu pro organické slouč eniny. Vzhledem k tomu, ž e alkalické roztoky absorbují oxid uhličitý ze vzduchu urč eného k provzduš ň ování a oxid uhlič itý uvolňující se respirací v aerobních experimentech, musí být pravidelněvyměňovány, aby se nevyč erpala jejich absorpční kapacita. Tě kavé látky tvoř ící se za anaerobních podmínek, např . methan, lze zachytávat na molekulovém sítu. Takové tě kavé látky lze spálit např . na CO 2 v kř emenné trubičce za př ítomnosti CuO př i teplotě900 °C a vzniklý CO2 lze zachytit v absorbéru s alkálií (viz literatura 17). Pro chemickou analýzu zkouš ené látky a transformač ních produktůjsou nezbytné laboratorní př ístroje (např . př ístroje pro plynovou chromatografii s kapalinovou stacionární fází (GLC), vysokoúč innou kapalinovou chromatografii (HPLC), pro chromatografii na tenké vrstvě(TLC), hmotnostní spektrometrii (MS), kombinaci plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (GC-MS), kombinaci kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (LC-MS), jadernou magnetickou rezonanci (NMR) atd.), vč etnědetekč ních systémůpro detekci slouč enin značených nebo neznač ených radioisotopy. Pokud se použ ije materiál značený radioisotopy, je tř eba mít k dispozici scintilač ní spektrometr a zař ízení pro spalování za př ítomnosti oxidačního činidla (pro spalování vzorkůsedimentůpř ed radiometrickým mě ř ením). Dalš í standardní laboratorní vybavení pro fyzikálně-chemická a biologická stanovení (viz oddíl 1.8.2.2 tabulka 1), laboratorní sklo, chemikálie a č inidla se použijí podle potř eby. XXIV.1.8.2 Výběr a poč et vodních sedimentů Místa odběru by mě la být vybrána podle účelu zkouš ky v dané situaci. Př i výběru místa odběru vzorků musí být př ihlédnuto k historii př ípadných země dělských, průmyslových nebo komunálních vstupůdo povodí a do vod proti proudu. Sedimenty by nemě ly být použ ity, pokud byly v př edchozích 4 letech kontaminovány zkouš enou látkou nebo jejími strukturními analogy. XXIV.1.8.2.1 Výbě r sedimentů Pro aerobní studie se obvykle použijí dva sedimenty (viz literatura 7). Tyto dva vybrané sedimenty by se měly liš it co do obsahu organického uhlíku a textury. Jeden sediment by mě l mít vysoký obsah organického uhlíku (2,5 - 7,5 %) a jemnou texturu a druhý sediment by mě l mít nízký obsah organického uhlíku (0,5 - 2,5 %) a hrubou texturu. Obsah organického uhlíku by se měl zpravidla liš it alespoňo 2 %. „Jemná textura“ je definována obsahem složky (jíl + prach], ([jíl + prach] je minerální frakce sedimentu s velikostí č ástic < 50 µm) vyš š ím než50 % a „hrubá textura“ je definována obsahem slož ky [jíl + prach] nižš ím než50 %. Rozdíl v obsahu slož ek [jíl + prach] u obou sedimentůby mě l být zpravidla alespoň20 %. V př ípadě, ž e se může chemikálie dostat do moř ských vod, mě l by alespoňjeden systém voda-sediment pocházet z moř e. Pro př ísněanaerobní studii by mě ly být odebrány dva sedimenty (včetněpř ísluš né vody) z anaerobních zón povrchových vod (viz literatura 7). Se sedimentem i vodní fází by mělo být
zacházeno opatrněa měly by být př epravovány s vyloučením př ístupu kyslíku. Pro výbě r sedimentu mohou být důležité i jiné parametry, které by měly být zvažovány př ípad od př ípadu. Rozpě tí pH sedimentůje např íklad důlež ité pro zkouš ení chemikálií, u nichžtransformace a/nebo sorpce mohou záviset na pH. Závislost sorpce na pH by se mohla odráž et v hodnotěpK a zkouš ené látky. XXIV.1.8.2.2 Charakterizace vzorkůsystému voda-sediment Klíč ové parametry, které musí být jak u vody, tak u sedimentu mě ř eny a uvedeny ve zprávě(s odkazem na použ itou metodu), a fáze zkouš ky, ve které mají být mě ř eny, jsou shrnuty v níž e uvedené tabulce. Metody stanovení tě chto parametrůjsou pro informaci uvedeny v literatuř e 18 až 21. Kromětoho můž e být př ípad od př ípadu nezbytné měř it a uvádět dalš í parametry (např . u sladkovodního systému: obsah č ástic, alkalita, tvrdost, vodivost, NO3/PO 4 (pomě r jednotlivých hodnot); u sedimentů: kationtová výmě nná kapacita, retenční vodní kapacita, obsah uhlič itanů, celkový obsah dusíku a fosforu; u moř ských systémů: salinita). Pro posouzení oxidač něredukč ních podmínek, a zejména v souvislosti s anaerobní transformací, může být také užiteč ná analýza sedimentůa vody na dusič nany, sírany, biologicky dostupné ž elezo, popř ípaděna jiné akceptory elektronů. Měř ení parametrůpro charakterizaci vzorkůsystémůvoda-sediment (viz literatura 7, 22 a 23)
Parametr
odbě r v terénu
manipulace po odběru
Fáze zkuš ebního postupu zahájení zahájení aklimatizace zkouš ky
samotná zkouš ka
konec zkouš ky
Voda Původ/zdroj x Teplota x pH x x x x x TOC x x x Koncentrace O2 * x x x x x Oxidač ně-redukč ní x x x x potenciál* Sediment Původ/zdroj x Hloubka vrstvy x pH x x x x x Distribuce částic x TOC x x x x Mikrobiální x x x biomasa** Oxidač ně- redukční Pozorování x x x x potenciál* (barva/zápach) * Výsledky nedávných výzkumůukázaly, že měř ení koncentrace kyslíku ve voděa oxidač ně-redukč ního potenciálu vody nemají vypovídací hodnotu, pokud jde o mechanismus růstu a vývoje mikrobiální populace v povrchových vodách, a nemají ani př edpově dní hodnotu (viz literatura 24 a 25). Stanovení biochemické spotř eby kyslíku (BOD, př i odbě ru vzorkův terénu a př i zahájení a na konci zkouš ky) a koncentrace mikroa makrož ivin Ca, Mg a Mn ve vodě(př i zahájení a na konci zkouš ky) a měř ení celkového obsahu N a P v sedimentech (př i odbě ru vzorkův terénu a na konci zkouš ky) můž e být lepš ím nástrojem pro interpretaci a hodnoceni rychlosti a způsobůaerobní biotransformace. ** Metoda měř ení rychlosti mikrobiální respirace (viz literatura 26), fumigač ní metoda (viz literatura 27) nebo měř ení poč tu mikroorganismů(např . bakterií, aktinomycet, plísní a celkového počtu kolonií) pro aerobní studie; rychlost methanogeneze u anaerobních studií. XXIV.1.8.3 Odběr vzorků, manipulace s nimi a jejich skladování XXIV.1.8.3.1 Odbě r Vzorky sedimentu se odeberou podle návrhu smě rnice ISO pro odběr vzorkůsedimentů(viz literatura 8). Vzorky se odeberou z celé 5 až10 cm silné horní vrstvy sedimentu. Současněse sedimentem se odebere z téhožmísta nebo lokality př ísluš ný vzorek vody. U anaerobní studie musí být sediment a př ísluš ná voda odebrány a př epravovány s vylouč ením př ístupu kyslíku (viz literatura 28) (viz oddíl 1.8.2.1). V literatuř e je popsáno několik odbě rových zař ízení (viz literatura 8 a 23). XXIV.1.8.3.2 Manipulace
Sediment se oddělí od vody filtrací a poté se pomocí př ebytku vody z místa odbě ru prosévá za mokra na 2mm sítu; voda se odstraní. Poté se v inkubač ní baňce v pož adovaném pomě ru (viz oddíl 1.9.1) smísí známé množství sedimentu a vody a smě s se př ipraví pro aklimatizaci (viz oddíl 1.8.4). U anaerobní studie musí být vš echny kroky provádě ny s vylouč ením př ístupu kyslíku (viz literatura 29 až33). XXIV.1.8.3.3 Skladování V každém př ípaděse doporuč uje použ ívat č erstvěodebraný sediment a vodu; je-li vš ak skladování nezbytné, sediment s vodou se proseje výš e popsaným způsobem a zalitý vodou (vrstva vody 6 10 cm) se skladuje v temnu př i (4 ± 2) °C (viz literatura 4) maximálně4 týdny (viz literatura 7, 8 a 23). Vzorky pro aerobní studie se skladují za volného př ístupu vzduchu (např . v otevř ených nádobách), zatímco vzorky pro anaerobní studie se skladují s vylouč ením př ístupu kyslíku. Př i př epravěa skladování nesmí sediment a voda zmrznout a sediment nesmí být vysuš ován. XXIV.1.8.4 Př íprava vzorkůsystému sediment-voda ke zkouš ce Př ed př idáním zkouš ené látky musí probě hnout aklimatizace, př i nížmusí být vzorky sedimentuvody umístě ny v inkubač ní nádobě, která se použ ije př i hlavní zkouš ce; podmínky aklimatizace musí být totožné s podmínkami inkubace př i zkouš ce (viz oddíl 1.9.1). Doba aklimatizace je čas nezbytný pro dostateč nou stabilizaci systému, kterou lze posoudit podle pH, koncentrace kyslíku ve vodě , oxidač ně-redukč ního potenciálu sedimentu a vody a makroskopické separace fází. Doba aklimatizace není obvykle delš í nežjeden aždva týdny a nemě la by př ekroč it čtyř i týdny. Výsledky měř ení provedených během této doby se uvedou ve zprávě. XXIV.1.9 PROVEDENÍ ZKOUŠKY XXIV.1.9.1 Zkuš ební podmínky Zkouš ka se provede v inkubač ní aparatuř e (viz oddíl 1.8.1) př i pomě ru objemu vody a sedimentu 3:1 až4:1, s vrstvou sedimentu 2,5 cm (± 0,5 cm). Doporuč ené minimální množ ství sedimentu na inkubační nádobu je 50 g (hmotnost suš iny). Z nedávných studií vyplývá, ž e skladování př i 4 °C můž e vést k poklesu obsahu organického uhlíku v sedimentu, který by mohl př ípadněvést k poklesu mikrobiální aktivity. Zkouš ka se provádí v temnu za konstantní teploty v rozmezí 10 až30 °C. Vhodná je teplota (20 ± 2) °C. Podle potř eby lze př ípad od př ípadu v závislosti na zamě ř ení zkouš ky zvolit dalš í, niž š í teplotu (např . 10 °C). Inkubač ní teplota se sleduje a uvede se ve zprávě . XXIV.1.9.2 Úprava zkouš ené látky a její aplikace Použ ije se jedna zkuš ební koncentrace chemické látky. Zkouš ka s druhou koncentrací může být už itečná u chemických látek, které se dostávají do vod různými cestami, a vykazují tedy významně odliš né koncentrace, pokud lze nižš í koncentraci analyzovat s dostatečnou správností. U př ípravků na ochranu rostlin aplikovaných př ímo do vodního tělesa se použ ije maximální dávkování uvedené na etiketějako maximální aplikovaná dávka vypočtená podle plochy hladiny vody ve zkuš ební nádobě. Ve vš ech ostatních př ípadech se použije koncentrace založ ená na odhadech emise do ž ivotního prostř edí. Je tř eba spolehlivězajistit, aby byla aplikována dostateč ná koncentrace zkouš ené látky pro charakterizaci postupu transformace a tvorby a odbourávání transformačních produktů. V situaci, kdy se koncentrace zkouš ené látky na začátku studie blíž í mezím detekce a/nebo kdy by nebylo mož né detekovat hlavní transformač ní produkty, jsou-li př ítomny v množ ství odpovídajícím 10 % výchozí aplikované dávky, můž e být nezbytné aplikovat vyš š í dávky (např . 10krát vyš š í). Použité vyš š í koncentrace vš ak nesmí mít významné nepř íznivé účinky na mikrobiální aktivitu v systému voda-sediment. S cílem dosáhnout konstantní koncentrace v nádobách různých rozmě růmůž e být nezbytné upravit množství použitého materiálu, př ič emžse vychází z výš ky vodního sloupce v nádoběv pomě ru k hloubce vody v odbě rovém místě (př edpokládá se hloubka 100 cm, mož ná je vš ak i jiná hloubka). Př íklad výpoč tu je uveden v dodatku 4. V ideálním př ípaděse zkouš ená látka aplikuje do vodné fáze zkouš eného systému ve formě vodného roztoku. Je-li to nevyhnutelné, je př ípustné použít pro aplikaci a rozptýlení zkouš ené látky malé množ ství rozpouš tědla mísitelného s vodou (např . acetonu nebo ethanolu), avš ak jeho množ ství by nemě lo př ekročit 1 % (obj.) a rozpouš tě dlo by nemě lo mít nepř íznivé úč inky na mikrobiální aktivitu ve zkuš ebním systému. Př ípravěvodného roztoku zkouš ené látky je tř eba vě novat pozornost a k zajiš tě ní naprosté homogenity může být vhodné použít generátorové kolony a př edem př ipravené smě si. Po př idání vodného roztoku do zkuš ebního systému se doporučuje vodnou fázi mírněpromíchat tak, aby se sediment zvíř il co nejméně. Použ ití komerčních úprav př ípravkůse nedoporuč uje, neboťslož ky př ípravku mohou mít vliv na distribuci zkouš ené látky a/nebo transformačních produktů mezi vodu a sediment. U š patně rozpustných zkouš ených látek vš ak mů že být použití komerč ní úpravy vhodnou možností. Poč et inkubač ních nádob závisí na počtu intervalů, v nichžmají být provádě ny odbě ry (viz oddíl
1.9.3). Je tř eba nasadit dostateč ný počet zkuš ebních systémů, aby bylo možné v kaž dém intervalu vyhodnotit dva systémy. Použijí-li se pro kaž dý systém voda-sediment kontrolní systémy, neexponuji se zkouš ené látce. Kontrolní systémy lze použít pro stanovení mikrobiální biomasy sedimentu a celkového organického uhlíku ve voděna konci studie. Dva kontrolní systémy (tj. po jednom kontrolním systému z kaž dého systému voda-sediment) mohou být použ ity pro sledování pož adovaných parametr ův sedimentu a ve voděv průběhu aklimatizace (viz tabulka v oddílu 1.8.2.2). Dva dalš í kontrolní systémy musí být nasazeny za účelem mě ř ení nepř íznivých úč inkůna mikrobiální aktivitu ve zkuš ebním systému v př ípadě , ž e se zkouš ená látka aplikuje pomocí rozpouš tědla. XXIV.1.9.3 Délka zkouš ky a odbě ry vzorků Délka experimentu by neměla př ekročit 100 dnů(6) a experiment by měl trvat tak dlouho, dokud se nestanoví způsob rozkladu a distribuce ve vodě/sedimentu, nebo dokud se transformací a/nebo tě káním nevyč erpá 90 % zkouš ené látky. Odběr by mě l být proveden nejméněv š esti časech (včetněčasu 0), př ič emžvhodný režim odběrůa délka zkouš ky se stanoví nepovinnou orientač ní studií (viz oddíl 1.9.4), nejsou-li k dispozici vhodné údaje o zkouš ené látce z dř ívě jš ích studií. U hydrofobních zkouš ených látek mů že být potř eba dodatečným vzorkováním v průbě hu poč áteč ní fáze studie zjistit stupeňdistribuce mezi vodu a sediment. V př ísluš nou dobu se k analýze odebere celý obsah inkubačních nádob (vč etněduplikátních nádob). Sediment a voda nad sedimentem se analyzují zvláš ť. Může-li snadno docházet k rychlé opě tovné oxidaci produkt ů anaerobní transformace, mě ly by být během odběru a analýzy zachovány anaerobní podmínky. Voda se za minimálního zvíř ení sedimentu opatrněodebere. Vhodnými analytickými postupy se provedou extrakce a charakterizace zkouš ené látky a transformačních produktů. Je tř eba také pečlivěshromáž dit materiál, který můž e být adsorbován na inkubační nádoběnebo ve spojovacích trubič kách použ itých k zachycení těkavých látek. XXIV.1.9.4 Nepovinná orientač ní zkouš ka Pokud nelze délku etapy, kdy jsou odebírány vzorky, odhadnout z jiných relevantních studií zkouš ené látky, lze př ípadněprovést orientač ní zkouš ku, která se provede za týchžzkuš ebních podmínek, jaké jsou navrž eny pro hlavní studii. Př ísluš né podmínky a výsledky orientač ní zkouš ky, pokud byla provedena, by měly být v krátkosti uvedeny ve zprávě . XXIV.1.9.5 Mě ření a analýza Pro kaž dý čas odběru se provede měř ení koncentrace zkouš ené látky a transformač ních produktů ve voděa v sedimentu a výsledky se uvedou ve zprávě(jako koncentrace a v procentech aplikovaného množství). V zásaděby mě la být př i kaž dém odběru provedena identifikace transformačních produktů, které obsahují ≥10 % radioaktivity aplikované do celého systému voda-sediment, pokud nejsou dostateč né důvody proti tomu. Měly by být také identifikovány transformační produkty, jejichžkoncentrace v průběhu studie nepř etržitěroste, tř ebaže nedosahuje výš e uvedené meze, neboťto může znamenat, ž e se jedná o perzistentní produkty. Tento postup by mě l být zváž en př ípad od př ípadu a ve zprávěby mě l být odůvodně n. Pro každý č as odběru se uvedou výsledky ze systémůpro zachycování plynů/tě kavých látek (CO 2 a jiných tě kavých organických slouč enin). Uvede se rychlost mineralizace. Pro každý č as odběru se uvedou neextrahovatelná (vázaná) rezidua v sedimentu. XXIV.2. DATA XXIV.2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ Pro každý č as odběru se vypoč te celková látková bilance nebo výtě žnost (viz oddíl 1.7.1) př idané radioaktivity. Výsledky se uvedou v procentech př idané radioaktivity. Pro každý č as odbě ru se uvede distribuce radioaktivity mezi vodu a sediment (vyjádř eno v koncentracích a v procentech). Pro zkouš enou látku se vypočítá poloč as a hodnoty DT 50 a popř ípaděhodnoty DT75 a DT90 a intervaly spolehlivosti tě chto hodnot (viz oddíl 1.7.3). Vhodnými hodnotícími nástroji lze zjistit míru zániku zkouš ené látky ve voděa v sedimentu. Můž e jít o použití zdánlivé kinetiky prvního ř ádu, o techniky proložení empirické kř ivky za použ ití grafického nebo numerického ř eš ení a o slož itě jš í hodnocení, např . pomocí modelu s jednou nebo více slož kami. Dalš í podrobné informace lze získat z publikované literatury 35 až37). Vš echny př ístupy mají své silné a slabé stránky a znač něse liš í v komplexnosti. Př edpoklad kinetiky prvního ř ádu můž e být sice př íliš ným zjednoduš ením procesu rozkladu a distribuce, vede vš ak v ideálním př ípaděk hodnotám (rychlostní konstantěnebo poločasu), které jsou snadno srozumitelné a mají význam pro simulační modelování a výpoč et př edpokládaných koncentrací v ž ivotním prostř edí. Empirický př ístup nebo lineární transformace mohou vést k lepš ímu proložení dat kř ivkami, a tedy k lepš ímu odhadu poločasů, hodnot DT50 a popř ípaděDT 75 a DT90 . Použití odvozených konstant vš ak má své meze. Slož kové modely mohou poskytovat ř adu užiteč ných
XXIV.3. XXIV.3.1
XXIVA.
konstant, které jsou důlež ité pro posouzení rizika a pro popis rozkladu chemické látky v různých slož kách a pro její distribuci. Použ ijí se rovně žpro odhad rychlostních konstant tvorby a rozkladu hlavních transformačních produktů. V kaž dém př ípaděvš ak musí být volba metody odůvodně na a experimentátor by měl graficky nebo statisticky prokázat její oprávně nost. ZPRÁVY PROTOKOL O ZKOUŠCE Protokol musí obsahovat následující informace: Zkouš ená látka: obecný název, chemický název, číslo CAS, strukturní vzorec (s uvedením polohy značícího nuklidu u látek znač ených radionuklidy) a relevantní fyzikálně -chemické vlastnosti; čistota zkouš ené látky (obsah neč istot); popř ípaděradiochemická čistota znač ené chemické látky a molámí aktivita. Referenč ní látky: chemický název a struktura referenčních látek použ itých k charakterizaci a/nebo identifikaci transformač ního produktu. Zkuš ební sedimenty a vody: lokalita a popis odbě rového místa (odbě rových míst) sedimentu a vody, pokud možno vč etně dř ívějš í kontaminace; vš echny informace týkající se odbě ru, př ípadného skladování a aklimatizace systému vodasediment; charakteristiky vzorkůsystému voda-sediment, jak jsou uvedeny v tabulce v oddílu 1.8.2.2. Zkuš ební podmínky: použitý zkuš ební systém (např . průtokový systém, biometrický systém, způsob provzduš ňování, způsob míchání, objem vody, hmotnost sedimentu, tlouš ťka vrstvy vody i sedimentu, rozmě ry zkuš ebních nádob atd.); aplikace zkouš ené látky do systému: použitá zkuš ební koncentrace, počet duplikátních vzorkůa kontrol, způsob aplikace zkouš ené látky (např . př ípadné použ ití rozpouš tě dla) atd. inkubační teplota; doby odbě ru; metody extrakce a úč innosti extrakce, analytické metody. a meze detekce; metody charakterizace/identifikace transformačních produktů; odchylky od zkuš ebního postupu nebo zkuš ebních podmínek. Výsledky: původní číselná data reprezentativních analýz (vš echna původní data musí být uložena v archivu vedeném podle zásad správné laboratorní praxe); opakovatelnost a citlivost použitých analytických metod; hodnoty výtěž nosti (hodnoty v % pro platnou studii jsou uvedeny v oddíle 1.7.1); výsledky pro zkouš enou látku, popř ípaděi pro transformač ní produkty a neextrahovatelnou radioaktivitu, zpracované v tabulkové forměa vyjádř ené v % aplikované dávky a v mg-kg- 1 pro vodu, sediment a celý systém (pouze v %); látková bilance bě hem studií na jejich konci; grafické schéma transformace ve voděa sedimentu a v celém systému (včetněmineralizace); rychlosti mineralizace; poločas, hodnoty DT50 a popř ípaděDT 75 a DT 90 pro zkouš enou látku, popř ípaděi pro hlavní transformač ní produkty, včetněintervalůspolehlivosti, pro vodu, sediment a celý systém; charakteristika kinetiky transformace zkouš ené látky, popř ípaděi hlavních transformačních produktů; př ípadný návrh způsobu transformace; diskuse o výsledcích. LITERATURA (1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany. (2) Commission for registration of pesticides: Application for registration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The Netherlands. (3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United Kingdom. (4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). Guidelines for registration
(5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15)
(16)
(17) (18) (19)
(20) (21) (22)
(23)
(24)
(25) (26)
(27) (28) (29) (30)
(31)
of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) -Anaerobic and aerobic. Canada. 35 - 37. US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162 - 3, Anaerobic aquatic metabolism. SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Vyd. Dr. Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels. OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18. - 20. ledna 1995. ISO 5667-12. (1995). Water quality - Sampling - Part 12: Guidance on sampling of bottom sediments, Technical Committee ISO/TC 146/SC 6. US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 712-C-98080. DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998). T. R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984). OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil (př ijato 12. kvě tna 1981). OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals. Scholz, K., Fritz R., Anderson C., Spiteller M. (1988) Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. BCPC - Pests and Diseases, 3B-4, 149 - 158. Guth, J. A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In: Progress in Pesticide Biochemistry. Vyd. D. H. Hutson, T. R. Roberts, J. Wiley & Sons, Vol. 1, 85 - 114. Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inoculation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631 - 637. Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with 14 C-labelled model surfactants. Water Research 21, 661 - 667. Black, C. A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison. APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (17. vyd.). American Public Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C. Rowell, D. L. (1994). Soil Science Methods and Applications. Longman. Light, T. S. (1972). Standard solution for redox potential measurements. Anal. Chem. 44, 1038 - 1039. SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop „A Meeting of Experts on Guidelines for Static -Field Mesocosms Tests“, 3. - 4. června 1991. SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop „On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA)“, 8. - 10. listopadu 1993. Vyd. I. R. Hill, P. Matthiessen, F. Heimbach. Vink, J. P. M., van der Zee, S. E. A. T. M. (1997). Pesticide biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, 2858 - 2868. Vink, J. P. M., Schraa, G., van der Zee, S. E. A. T. M. (1999). Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329 - 338. Anderson, T. H., Domsch, K. H. (1985). Maintenance carbon requirements of activelymetabolising microbial populations under in-situ conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197 203. ISO-14240-2. (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method. Beelen, P. Van, F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sediment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13 - 21. Shelton, D. R., Tiedje, J. M. (1984). General method for determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850 - 857. Birch, R. R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W. E., Pagga, U., Steber, J., Reust, H., Bontinck, W. J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere, 19, 1527 - 1550. Pagga, U., Beimborn, D. B. (1993). Anaerobic biodegradation tests for organic compounds.
(32)
(33) (34)
(35)
(36)
(37)
Chemosphere, 27, 1499 - 1509. 14 Nuck, B. A., Federle, T. W. (1986). A batch test for assessing the mineralisation of Cradiolabelled compounds under realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597 - 3603. US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 712-C-98-090. Sijm, Haller, Schrap (1997). Influence of storage on sediment characteristics and drying sediment on sorption coefficients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, 961 - 968. Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz Nachrichten Bayer, 39, 187 - 203. Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues I. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer, 33, 47 - 60. Carlton, R.R., Allen, R. (1994). The use of a compartment model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water systems. Brighton Crop Protection Conference - Pest and Diseases, 1349 - 1354.
DODATEK 1 POKYNY K AEROBNÍM A ANAEROBNÍM ZKUŠEBNÍM SYSTÉMŮM Aerobní zkuš ební systém Aerobní zkuš ební systém popsaný v této zkuš ební metoděse skládá z aerobní vodní vrstvy (typická koncentrace kyslíku v rozmezí od 7 do 10 mg.l -1) a vrstvy sedimentu, která je na povrchu aerobní a pod povrchem anaerobní (typické průmě rné oxidač ně-redukč ní potenciály (En) v anaerobní zóněsedimentu jsou v rozmezí -80 až-190 mV). Nad vodní hladinu v kaž dé inkubační jednotce se zavádí zvlhč ený vzduch, aby se v prostoru pod víčkem udrž ovala dostateč ná koncentrace kyslíku. Anaerobní zkuš ební systém Pro anaerobní zkuš ební systém je zkuš ební postup v podstatětentýž, jako postup popsaný pro aerobní systém, liš í se vš ak tím, že nad hladinu vody v každé inkubační jednotce se zavádí zvlhčený dusík, aby se udržovala jeho koncentrace v prostoru pod víč kem. Sediment a voda jsou považ ovány za anaerobní, pokud je oxidač ně-redukč ní potenciál (E h) niž š í -100 mV. V anaerobní zkouš ce se mineralizace posuzuje na základěmě ř ení uvolněného oxidu uhličitého a methanu. DODATEK 2 PŘÍKLAD SKLENĚNÉ PRŮTOKOVÉ APARATURY DODATEK 3 PŘÍKLAD BIOMETRICKÉ APARATURY DODATEK 4 PŘÍKLAD VÝPOČTU DÁVKY APLIKOVANÉ DO ZKUŠEBNÍCH NÁDOB Vnitř ní průmě r válce: Výš ka vodního sloupce bez sedimentu: 2 Plocha hladiny: 3,142 x 4 Dávkování: 500 g zkouš ené látky na ha odpovídá 5 µg/cm2 Celkové množ ství v µg: 5 x 50,3 Př epoč et celkového množství na hloubku 100 cm: 12 x 251,5 ÷ 100 Objem vodního sloupce: 50,3 x 12 Koncentrace ve vodě: 30,18 ÷ 603
= 8 cm = 12 cm 2 = 50,3 cm = 251,5 µg = 30,18 µg = 603 ml = 0,050 [µg/ml nebo 50 µg/l
