METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Dalam penelitian ini contoh uji yang digunakan dibedakan atas contoh uji daun dan kayu. Penelitian terhadap daun dan kayu dilakukan di Ruang Analisis Genetika, Laboratorium Silvikultur, Fakultas Kehutanan dan Laboratorium Biologi Molekuler Pusat Antar Universitas (PAU), Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilakukan dari bulan September 2006 sampai bulan April 2007.
Bahan dan Alat Bahan Bahan tanaman yang digunakan adalah berupa daun dan kayu yang berasal dari Areal Produksi Benih (APB) dan Tempat Penimbunan Kayu (TPK) milik Kesatuan Pemangkuan Hutan (KPH) Perum Perhutani yang masih produktif di tiga propinsi, yaitu Jawa Barat-Banten (KPH Banten, KPH Indramayu dan KPH Ciamis), Jawa Tengah (KPH Kendal, KPH Cepu, KPH Randublatung dan KPH Kebonharjo) dan Jawa Timur (KPH Ngawi dan KPH Bojonegoro). Untuk lebih lengkapnya rincian contoh uji baik daun maupun kayu jati disajikan pada Tabel 2. Tabel 2. Rincian pengambilan contoh uji baik daun maupun kayu jati No.
Lokasi TPK
APB
dan
KPH Perum Perhutani
1
Jawa Barat-Banten
Banten Ciamis Indramayu
2
Jawa Tengah
3
Jawa Timur
Kendal Cepu Randublatung Kebonharjo Ngawi Bojonegoro
Jumlah sampel Daun kayu 5 5 5 + 4 *(induk sama dengan kayu) 5 5 5 5 5 5
4* (induk sama dengan kayu) -
Jumlah total contoh uji 49 4 Keterangan = * : Berasal dari pohon induk yang sama dan penelitian dilakukan terpisah
Pengambilan contoh uji untuk kayu dan daun jati dilakukan secara terpisah. Pengambilan contoh uji daun dilakukan di APB, sedangkan contoh uji dari kayu tidak dilakukan pada APB, karena berdasarkan peraturan yang ada tidak boleh dilakukan penebangan pada areal APB, karena didalamnya terdapat pohon induk yang dianggap dapat mewakili struktur genetik. Oleh karena itu pengambilan contoh uji kayu dilakukan di luar areal APB yaitu mencari areal atau petak yang didalamnya terdapat Kelas Umur (KU) yang sudah tua dan sedang dilakukan penebangan. Lokasi pengambilan contoh uji daum dan kayu jati disajikan pada Gambar 5.
H
B
F
I
A
G C
(Keterangan:
D
E
A=KPH Banten, B=KPH Indramayu, C=KPH Ciamis, D=KPH Kendal, E=KPH Randublatung, F= KPH Cepu, G= KPH Ngawi, H= KPH Kebonharjo, I= KPH Bojonegoro)
Gambar 5. Lokasi KPH pengambilan sampel
Alat Alat-alat yang digunakan untuk pengambilan sampel di lapangan adalah tally sheet, kertas label, alat tulis, plastik klip, gunting dan silika gel. Sedangkan alat-alat yang digunakan untuk elektroforesis dan analisis DNA di laboratorium adalah : mortar dan pestel, sarung tangan, pipet, pipet mikro, sentrifugasi, vortex,
spatula, tube, cetakan gel, bak elektroforesis, tray, microwave, power supply, pH meter, gelas piala, gelas ukur, timbangan analitik, pengaduk magnet, lemari pendingin, water bath, ultraviolet transilluminator dan kamera digital.
Metodologi Prosedur pengambilan daun jati Proses pengambilan daun jati dilakukan dengan menggunakan beberapa prosedur. Prosedur tersebut adalah sebagai berikut : 1. Mengambil daun dari setiap individu pohon sebanyak 1-2 helai daun 2. Daun tersebut selanjutnya dimasukkan ke dalam plastik klips yang berisi silika gel dengan perbandingan 1:5 3. Pohon yang daunnya diambil diukur tinggi, diameter dan letak geografisnya dengan menggunakan alat ukur 4. Data mengenai tinggi, diameter dan letak geografis dicatat ke dalam tallysheet 5. Data-data penunjang lain seperti tahun tanam, kelas umur, bonita, nomor. petak dan sejarah penanaman dicatat pada tallysheet.
Prosedur pengambilan kayu jati Seperti halnya dengan prosedur pengambilan daun, proses pengambilan kayu jati juga terdiri dari beberapa prosedur. Prosedur untuk pengambilan kayu jati adalah sebagai berikut : 1. Kayu yang diambil adalah kayu yang berasal dari log kayu atau kayu yang tidak terpakai (berupa piringan kayu) dengan ukuran atau berbentuk melingkar, persegi atau balok sesuai dengan kondisi log kayu yang didapatkan di lapangan 2. Kayu yang diambil dari log, dilakukan pengukuran diameter
dengan
menggunakan alat ukur 3. Data mengenai diameter log kayu dicatat ke dalam tallysheet 4. Data-data penunjang lain seperti tahun tanam, kelas umur, bonita, No. petak dan sejarah kayu dicatat pada tallysheet.
Analisis DNA di Laboratorium Ada beberapa tahapan yang harus dilakukan dalam melakukan analisis DNA. Secara umum, bagan prosedur penelitian mengenai analisa DNA di Laboratorium dapat dilihat pada Gambar 6.
PENGAMBILAN SAMPEL
EKSTRAKSI DNA
ELEKTROFORESIS
PCR-SCREENING PRIMER
RAPD
ELEKTROFORESIS
PEWARNAAN (STAINING)
PEMOTRETAN HASIL AMPLIFIKASI
INTERPRETASI DAN PENGOLAHAN ANALISIS DATA
DESKRIPTIF
POPGENE
NTSYS
TABULASI FRAGMEN
Gambar 6. Prosedur penelitian analisis DNA di Laboratorium
1. Ekstraksi DNA dari Daun Prosedur yang dilakukan dalam ekstraksi DNA dari daun adalah menggunakan metode Promega. Susunan buffer dari Promega terdapat pada Lampiran 7. Menurut Promega (2005) disebutkan bahwa terdapat beberapa langkah dalam melakukan ekstraksi DNA. Secara umum rincian prosedur ekstraksi DNA dari daun disajikan pada Gambar 7.
Daun
Daun jati digerus lalu di vortex dan diinkubasi selama 1 jam di dalam waterbath Memasukkan 200µL Protein Precipititation Solution, selanjutnya disentrifuse, kemudian supernatant diambil dan dimasukkan ke dalam microtube baru dan ditambahkan 600 µL isopropanol dan disentrifuse kembali
DNA
Memasukkan 60 µL Etanol (di ulang sebanyak 2 kali)
DNA
Melakukan pengikatan DNA dengan cara menambahkan 100 µL DNA Rehydration Solution kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 65°C
DNA
Melakukan uji kualitas DNA
ELEKTROFORESIS Gambar 7. Ekstraksi DNA pada daun jati dengan menggunakan metode Promega DNA hasil ekstraksi yang telah dielektroforesis kemudian diwarnai dengan menggunakan larutan Ethidium Bromide (EtBr) selama kurang lebih 15 menit. Keberadaan pita DNA dapat dilihat dengan menggunakan alat ultraviolet transilluminator. 2. Ekstraksi DNA dari Kayu Prosedur yang dilakukan dalam proses ekstraksi DNA kayu jati digunakan menggunakan metode Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB). Susunan buffer CTAB terdapat pada Lampiran 8. Prosedur ekstraksi DNA kayu jati berdasarkan metode Promega adalah sama seperti dengan prosedur ekstraksi DNA dari daun. Rincian tahapan ekstraksi DNA kayu jati berdasarkan metode CTAB dapat dilihat pada Gambar 8. Sama halnya pada sampel daun, DNA hasil ekstraksi yang telah dielektroforesis diwarnai dengan menggunakan larutan Ethidium Bromide (EtBr) selama kurang lebih 15 menit. Keberadaan pita DNA dapat dilihat dengan menggunakan alat ultraviolet transilluminator.
Kayu jati dibor dalam keadaan steril (ruang khusus) lalu diambil 3 bagian (gubal, transisi dan teras )pada setiap contoh uji kayu KAYU Masing-masing bagian dari contoh uji diambil serbuk kayunya sebanyak 0,2 gram dan dimasukkan ke dalam tube Posisi Sampel Serbuk kayu selanjutnya digerus dan divortex, lalu diinkubasi selama 1 jam (dalam keadaan dishaker secara terus menerus) Tube yang berisi serbuk kayu selanjutnya ditambahkan Chloroform IAA sebanyak 300 µL dan larutan Fenol 20 µL, lalu disentrifuse dan diulang kembali (2 kali) Tube kemudian ditambahkan larutan NaCl 300 µL dan Isopropanol dingin 500 µL DNA
DNA
Tube selanjutnya ditambahkan larutan Etanol 300 µL, kegiatan ini dilakukan sebanyak 2 kali
Dilakukan uji kualitas DNA
ELEKTROFORESIS Gambar 8. Ekstraksi DNA pada kayu jati dengan menggunakan Metode CTAB 3. Seleksi Primer Primer adalah rantai pendek DNA yang dihasilkan secara buatan biasanya terdiri antara 10-25 basa nukleotida (Finkeldey, 2005). Primer berfungsi sebagai titik awal terjadinya proses amplifikasi DNA. Sepasang primer yang sekuen targetnya ada pada rantai DNA nantinya digunakan dalam proses PCR. Segmen DNA diantara kedua titik pertemuan primer akan diamplifikasi dalam reaksi PCR. Primer berfungsi sebagai titik awal sintesis DNA oleh enzim Taq polymerase yang diperoleh dari bakteri Thermus aquaticus. Enzim ini juga dikenal dengan Taq DNA Polymerase. Enzim ini sesuai untuk proses amplifikasi karena dapat bertahan pada suhu tinggi sampai 95ºC meskipun suhu optimum bagi aktifitas enzim adalah 72ºC.
Pada penelitian ini dilakukan seleksi primer (screening primer) terhadap 30 primer produksi dari Operon Technology yaitu primer dari golongan OPO dan OPY. Primer dari golongan OPO yang digunakan untuk seleksi primer adalah primer yang memiliki kode O.1, O.2, O.4, O.5, O.6, O.7, O.8, O.9, O.10, O.11, O.12, O.13, O.14, O.15, O.16, O.18, O.19 dan O.20. Sedangkan primer dari golongan OPY yang digunakan dalam seleksi primer adalah dari golongan Y.2, Y.3, Y.6, Y.8, Y.9, Y. 11, Y.12, Y.13, Y.14, Y.15, Y.16 dan Y.17. 4. Amplifikasi DNA melalui RAPD DNA hasil ekstraksi baik daun dan kayu diamplifikasi dengan menggunakan mesin PCR dengan teknik RAPD. DNA yang akan digunakan sebelumnya dilakukan pengenceran terlebih dahulu, dengan tujuan untuk menghindari hablurnya pita DNA pada saat elektroforesis. Pengenceran dilakukan dengan mengambil DNA tersebut sebanyak 1 uL dan ditambahkan 99 uL H2O yang telah diautoklaf (aquabidest). Namun besarnya perbandingan antara DNA dengan aquabidest tergantung dari tebal tipisnya DNA genomik hasil ekstraksi. Proses amplifikasi DNA (RAPD), pada intinya adalah proses perbanyakan DNA secara enzimatis. Pada tahap ini terdapat tiga proses, yaitu (1) proses denaturasi DNA pada suhu 950 C, (2) proses penempelan DNA (annealing) dan (3) proses ekstensi. Pada suhu tinggi pita ganda tersebut berpisah menjadi dua utas tunggal. Apabila pita ganda DNA telah terpisah, maka pada tahap kedua terjadi penempelan primer pada kedua ujung DNA sebagai titik awal pembacaan dan perbanyakan basa-basa DNA. Selanjutnya dilakukan proses pemanjangan dan pembentukan utas DNA yang baru (ekstensi). Adapun
bahan-bahan yang
dicampurkan dalam satu microtube pada proses amplifikasi RAPD disajikan pada Tabel 3. Tabel 3. Komposisi Bahan dalam Proses Amplifikasi RAPD No 1 2 3 4
Bahan Kimia H2 O Enzim Taq DNA polymerase Primer oligonukleid DNA pekat
1 x Reaksi 2.0 uL 7.5 uL 1.2 uL 2.0 uL
Proses PCR dilakukan dengan menggunakan primer hasil seleksi. Hasil proses PCR kemudian dianalisis dengan melakukan elektroforesis yaitu menggunakan 2 % gel agarose dalam larutan buffer 1x TAE dan distaining di dalam Ethidium Bromide. Pengaturan suhu pada mesin PTC-100 untuk proses RAPD didasarkan pada penelitian Parthiban et al. (2001) dalam ITTO (2003) seperti yang disajikan dalam Tabel 4. Tabel 4. Tahapan-tahapan suhu dalam proses RAPD Tahapan Suhu Waktu 95°C 15 menit Initial denaturation 95°C 1 menit Denaturation Annealing 36°C 1 menit 72°C 2 menit Extension 72°C 10 menit Final Extension 4°C Stand By infinity Sumber : Parthiban et al. (2001) dalam (ITTO, 2003)
Jumlah Siklus 1 45 45 45 1
Analisis Data 1. Analisis Variasi Genetik Hasil elektroforesis akan menunjukkan beberapa pita atau band. Sebelum melakukan analisis diperlukan data scoring dari pita yang muncul pada setiap lokus. Scoring dimulai dari lokus yang paling atas yaitu DNA yang memiliki berat molekul paling ringan. Pita yang muncul diberi nilai 1 (satu) dan pola pita yang tidak muncul diberi tanda 0 (nol) seperti disajikan dalam Gambar 9. Hasil scoring kemudian dianalisis dengan menggunakan software POPGENE versi 3.2 dan NTSYS 2.02 (Rohlf , 1998).
Lokus 1
2
3
4
5
Individu 6 7
8
9
10
11
L-1 L-2 L-3 L-4
Lokus L-1 L-2 L-3 L-4
1 1 1 1 1
2 1 1 1 0
3 1 1 0 1
4 1 0 1 1
5 1 1 0 1
Individu 6 0 1 0 1
7 1 1 1 0
8 0 1 1 1
9 1 0 0 1
10 0 1 0 1
11 1 1 1 1
Gambar 9. Cara penilaian pita dengan sistem skoring (1 = ada pita, 0 = tidak ada pita) Parameter genetik yang diukur dalam penelitian ini adalah variasi genetik di dalam populasi dan antar populasi. Untuk keragaman genetik di dalam populasi parameter yang diukur adalah : 1. Persentase Lokus Polimorfik (PLP) = ((N(LP)/((N(LP) +(N(LM))) x 100% Keterangan : N(LP) : jumlah lokus polimorfik N(LM) : jumlah lokus monomorfik
2. Jumlah alel yang diamati (na) = jumlah semua lokus/jumlah lokus yang diamati 3. Jumlah alel yang efektif (ne) = 1 / Σ(jumlah frekuensi alel (p))2 4. Heterozigitas harapan (He)
= 1- Σ(jumlah frekuensi alel (p))2
Sedangkan parameter yang diamati untuk keragaman genetik antar populasi digunakan cluster analysis untuk menduga ada tidaknya hubungan kekerabatan berdasarkan jarak genetik yang diperoleh.
2. Analisis Fragmen pada Kayu Hasil analisis pada kayu nantinya dipakai untuk menduga berapa besar DNA yang ada serta tingkat degradasi DNA pada kayu tersebut. Contoh ilustrasi analisis fragmen DNA pada kayu jati disajikan pada Tabel 5. Tabel 5. Fragmen dominan secara manual dan hasil tabulasi Fragmen
Ukuran Basa (bp)
1 2 3 4 5 6 7 Total % Fragmen
100 300 500 1000 1500 2000 2500 5400 100%
Kontrol (Daun)
x x 1900
S1
x x x x x 400 400 X 100 % 1900
Keterangan = S1-S4 : Sampel kayu no 1 sampai no 4 : DNA yang muncul band atau pitanya X : DNA yang tidak muncul band atau pitanya
S2
S3
S4
