Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích Biologická fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
Měření fotosyntetické aktivity rostlinných bičíkovců pomocí variabilní fluorescence během diurnální vertikální migrace
Vypracoval: Vojtěch Kasalický Vedoucí práce: Ondřej Prášil, PhD. České Budějovice 2003
PODĚKOVÁNÍ: Chtěl bych poděkovat svému školiteli, Ondřeji Prášilovi, za pomoc a trpělivost při bakalářské práci. Dále Danovi Fialovi, se kterým jsem uskutečnil většinu těch nejnáročnějších celodenních měření, Heleně Havelkové-Doušové za ochotu a pomoc zvláště v prvních krocích, Davidovi Pithartovi, jenž je “otcem” myšlenky projektu a všem lidem z Mikrobiologického ústavu AVČR v Třeboni, kteří mi vytvořili příjemné prostředí k práci, i přes několik mých šlápnutí mimo vyšlapané cesty. Průběh této bakalářské práce byl podporován grantem GAČR č.223/01/1113.
1
OBSAH: Úvod .................................................................................................... 2
Fotosyntéza a řasy .......................................................................................... 2 Stratifikace ve vodním sloupci ........................................................................ 2 Ekologické důsledky ....................................................................................... 3 Vertikální migrace........................................................................................... 3 Kryptomonády ................................................................................................ 4 Fotosyntetická aktivita.................................................................................... 5 Měření spotřeby uhlíku ........................................................................... 5 Měření vývoje kyslíku .............................................................................. 5
Variabilní fluorescence.................................................................................... 6 Parametry............................................................................................... 7 Fotoinhibice............................................................................................ 7 Primární produkce a fluorescenční měření............................................... 7
Cíle ................................................................................................................. 8
Metody................................................................................................. 9
Pěstování řasových kultur............................................................................... 9 Variabilní fluorescence.................................................................................... 9 Měření fluorescenčních spekter..................................................................... 10 Měření spektrálního složení a intensit záření ................................................ 10 Stanovení množství pigmentů ....................................................................... 10 Měření vývoje kyslíku.................................................................................... 10 Měření v terénu............................................................................................. 11 Měření v laboratoři........................................................................................ 11 Stojan na kyvety ........................................................................................... 12
Výsledky ............................................................................................ 14
Přizpůsobení měřícího přístroje..................................................................... 14 Výměna filtrů........................................................................................ 14 Jiná měřící světla.................................................................................. 14 Měřící parametry................................................................................... 15 Výsledná citlivost .................................................................................. 15 Nový detektor........................................................................................ 15
Spektra a taxonomie řas ............................................................................... 15 Měření variabilní fluorescence....................................................................... 17 První První První První
testovací měření v laboratoři......................................................... 17 měření na tůních ......................................................................... 18 měření s laboratorní kulturou skrytěnek....................................... 20 měření na experimentálních válcích.............................................. 20
Měření fotosyntetické aktivity ....................................................................... 21 Srovnávací měření ........................................................................................ 22
Diskuse: ............................................................................................. 23
Taxonomické rozlišení jednotlivých druhů .................................................... 23 Variabilní fluorescence v terénu .................................................................... 23 Zpomalení kinetiky dohasínání variabilní fluorescence ................................. 24 Povodně ........................................................................................................ 24 Vertikální migrace......................................................................................... 24 Kryptomonády .............................................................................................. 24 Další řasy a sinice......................................................................................... 25
Závěry: ............................................................................................... 26 Literatura:.......................................................................................... 27
1
ÚVOD Fotosyntéza a řasy Fotosyntéza je nejdůležitějším procesem přeměny anorganických látek na látky organické. Na fotosyntetickém výtěžku závisí téměř všechny živé organismy. Jednobuněčné řasy jsou odpovědné přibližně za jednu polovinu fotosyntetické produkce na Zemi. O mechanismech, které primární produkci řas ovlivňují, toho však v porovnání s vyššími rostlinami víme stále poměrně málo. Namátkou lze uvést C3, C4 a CAM strategie, fytohormony, regulace vodního režimu, receptory záření fytochrom a kryptochrom). Nicméně význam poznání řas a sinic stále roste. Nenápadná skupina Coccolithophoridae a velká skupina všudepřítomných rozsivek se staly hlavními diagnostickými skupinami pro analýzu sedimentů a geologických poměrů v oceánech a jsou jedním z důkazů zásadního významu řas pro vývoj života na naší planetě. Důkazem ekologického významu světového měřítka může být rozšíření řasy Caulerpa taxifolia u středomořského pobřeží, kde zcela nahradila původní druhy chaluh a dochází zde i ke změnám v zastoupení živočišných druhů. Rychlý růst (u sinic až několikrát za den) je výsadou jiných druhů fytoplanktonu, které vytvářejí dominantní porosty na volné vodě (vodní květy). Vodní květy bývají zpravidla velmi toxické a nebezpečné jak pro člověka tak i pro organismy normálně ve vodě žijící (Maršálek B, 2002). Pro člověka jsou z biotechnologického hlediska zajímavé cenné látky, např. karotenoidy a xantofyly (zeaxantin, betakaroten), z nichž se vyrábějí humánní i veterinární léčiva, filmy do fotaparátů a kamer, řasy jsou součástí jídelníčku (makroskopické řasy - suši) a úspěšně nahrazují i mnohé zemědělské plodiny.
Stratifikace ve vodním sloupci V moři, hlubších jezerech, umělých nádržích a tůních se vytvářejí podmínky pro vznik vrstev, které se od sebe liší chemickými a fyzikálními podmínkami, jež určují zastoupení organismů. Fyzikálně-chemické charakteristiky spolu úzce souvisejí a stává se, že limitujících faktorů je i několik. V hydrobiologii se obvykle rozděluje vodní sloupec na různé oblasti podle teploty a obsahu kyslíku (Odum, 1957). Podle stability a gradientu teploty označujeme vrstvy vodního sloupce: epilimnion, skočná vrstva a hypolimnion. V hypolimniu má voda největší hustotu a je teplotně stabilní během celého roku, 4°C (teplotní anomálie vody). Epilimnion je naopak horní teplá cirkulující vrstva. Skočná (termoklinní) vrstva pak představuje rychlý teplotní přechod mezi oběma zmíněnými vrstvami. Podle obsahu kyslíku odlišujeme vrstvu oxygenní a anoxickou. Obsah kyslíku je podmíněn přítomností fototrofních organismů schopných oxygenní fotosyntézy. Velký vliv na množství rozpuštěného kyslíku má také teplota vody a ve větších hloubkách intenzita dýchání přítomných organismů. Dalším důležitým pojmem je eufotická zóna. Ta je limitována kompenzační úrovní produktivity, kterou určuje intenzita pronikajícího účinného záření. Je to vlastně označení pro „produkční“ pásmo vodního sloupce. Živiny jsou koncetrované u dna (sedimentace) s exponenciálním úbytkem směrem k hladině (rovnice difuze). U hladiny je koncentrace živin řádově nižší než o několik metrů hlouběji.
2
A
B
Obr.1. Rozložení vrstev během letní teplotní stratifikace v jezeře (A). Ukázka koncentrace hlavních v závislosti na hloubce (B).
Ekologické důsledky Zpravidla na jaře a na podzim dochází v našich zeměpisných šířkách k promíchání celého vodního sloupce stojatých vod. Tato situace nastává, vyrovná-li se teplota horní vrstvy teplotě vrstvy spodní. Voda v celém jezeře pak má stejnou hustotu, u hladiny je však vlivem výměny tepla s proudícím vzduchem ochlazována a klesá ke dnu. Při tomto procesu se živiny dostávají ve větší koncentraci do horních vrstev. Jelikož v tomto období bývá dostatek slunečního svitu, dochází i k největšímu rozvoji sinic a řas. Na začátku léta se často voda v hlubších nádržích tepelně stratifikuje. Epilimnion je promícháván jen v rámci sebe sama (působením větru a deště), ztrácí kontakt se zdrojem živin v hlubších partiích a během letní produkční fáze může dojít k významnému vyčerpání živin a k omezení produkce. Nová produkce závisí na možnostech regenerace živin (zastoupení bakterií, tok energie mezi vodním prostředím a litorálem, produktivita okolních ekosystémů). Nezasahuje-li eufotická oblast do skočné vrstvy, vyčerpá se v hypolimniu zásoba kyslíku, protože není vytvářen žádnými fototrofními organismy. Vytvoří se anoxické prostředí, kde je sice dostatek živin, ale nejsou zde podmínky pro fotosyntézu. Proto bývá výskyt většiny nebičíkatých fototrofních organismů omezen jen na epilimnion. Nicméně i letní období je produktivní fází. Vodnímu sloupci dominují bičíkaté řasy, které se dokázaly stratifikaci přizpůsobit.
Vertikální migrace Rostlinní bičíkovci představují zajímavou ekologickou skupinu mikroskopických řas společenstva fytoplanktonu stojatých vod. Oproti nebičíkatým řasám bývají zvýhodněni možností pohybu ve vodním prostředí a tím možností rychle reagovat na vnější podněty změny světla a teploty. Pravidelná (diurnální) vertikální migrace pak umožňuje letní problém nedostatku živin v eufotické vrstvě eliminovat. Sommer a Gliwitz (1986) popisují, jak na konci světelné fáze dne kolonie Volvox opouštějí živinami vyčerpanou míchanou vrtsvu. Plaváním směrem ke dnu bohatému na živiny dosahují hloubek až okolo 35 metrů, ze kterých se brzy ráno vracejí zpět do eufotické zóny. Významnou ekologickou výhodou je zde tedy kombinace denní fotosyntetické aktivity v povrchových vrstvách a nočního čerpání živin (zvláště fosfátů) u dna. Toto časo-prostorové oddělení různých kroků buněčného metabolismu připomíná podobné strategie při fixaci uhlíku u tzv. C4 a CAM rostlin (Reinfelder a ostatní, 2000). Pobyt v hypolimniu také snižuje ztráty energie během noční fáze, neboť 3
chladné prostředí zpomaluje respirační procesy. Někteří autoři uvažují o možnosti vyhledávání specifických organických látek či fagocytóze bakterií vyskytujících se na dně (Gervais 1997). Vertikálně migrující populace se mohou také do určité míry vyhnout predaci zooplanktonem. V neposlední řadě krátkodobý pobyt u hladiny (pouze během světelné fáze) omezuje hydraulické vymývání populací povrchovým prouděním vody v průtočných tůních. Kolonie Volvox nejsou zdaleka jedinými migrátory. Patří sem ještě jiné druhy různých skupin řas (Euglenophycaea, Cryptophyceae, Dinophyceae, Raphidophyceae), jak je popsali Jones (1988) a Pithart a spol. (1997). Skupina z Mikrobiologického a Botanického ústavu AVČR v Třeboni se v rámci projektu GAČR zabývá vertikální migraci řas v aluviálních tůních řeky Lužnice a v laboratorních podmínkách. Pithart (1995) a Fiala (1999) zjistili, že mezi nejvýrazněji migrující řasy v těchto tůních patří kryptomonády. Jako experimentální organismus projektu jsme proto vybrali řasu Cryptomonas marssonii, která se zde vyskytuje nejčastěji.
Obr.2. Vertikální distribuce koncentrace buněk Gonyostumum semen, Trachelomonas volvocina a blíže neurčené sinice dne 29.srpna 1994 v poledne a o půlnoci. Výška vody 115 cm. Převzato z Pithart et al. 1997 .
Kryptomonády Kryptomonády (skrytěnky) tvoří poměrně netypickou skupinu řas. Všeobecně platí, že fotosyntéza je hlavním zdrojem energie řas. Kryptomonády se ale v případě nepříznivých světelných podmínek dokážou velkou měrou živit i heterotrofním způsobem (Gervais 1997, Lewitus et al. 1991). Koneckonců to potvrzuje i počet membrán, které obalují chloroplasty. Skrytěnky mají o jednu navíc oproti zeleným řasám. Přítomnost nukleomorfu dokládá, že svou fotosyntetickou schopnost získaly pohlcením již funkční eukaryotické řasy. Ze světlosběrných pigmentů jsou u fotosystému II (PSII) chlorofyly a a c2, což je řadí mezi hnědé řasy a rozsivky, dále phycoerythrin (sladkovodní) nebo phycocyanin (mořské), což by ukazovalo na blízký vztah k ruduchám a sinicím, nikdy se zde však nevyskytuje allophycocyanin. Navíc tato barviva nejsou seskupena ve phycobilisomu na stromální straně, nýbrž se nacházejí v lumen thylakoidů. Jediným světlosběrným pigmentem fotosystému I (PSI) je chlorofyl a (Lichtlé a spol., 1980).
4
C
D A
B
Obr.3. Skrytěnky. A – pohled v mikroskopu. B – schema vnitřních orgánu. C – struktura thylakoidních membrán. D – světlosběrných komplexů.
Fotosyntetická aktivita Pro zjištění fotosyntetické aktivity se v rostlinné fyziologii používá několik metod. Tyto metody se liší jak vlastní metodikou analýzy (metody elektrochemické, izotopové, fluorescenční - biofyzikální), tak místem ve fotosyntetické dráze, jehož aktivita je sledována (spotřeba anorganického uhlíku (aktivita enzymu RUBISCO), vývoj kyslíku (OEC, donorová strana PSII), variabilní fluorescence chlorofylu (redoxní stav plastochinonového poolu, akceptorová strana PSII)). Měření spotřeby uhlíku Nejcitlivější určení hrubého fotosyntetického výtěžku je měření pomocí inkorporace radioaktivního uhlíku 14C. Metoda je založená na tom, že při fotosyntetické fixaci uhlíku se zabudovávají dva isotopy uhlíku (12C a 14C) zhruba ve stejném poměru. Ke vzorku se přidá velmi malé množství radioaktivního (značeného 14C) substrátu. Vlastní fotosyntetickou produktivitu (tj. zabudování C) pak určíme jednoduchým matematickým vztahem (trojčlenkou) ze znalosti množství přidaného 14C, z množství dostupného 12C (úměrné alkalinitě), a z množství asimilovaného 14C: 12
C as = 12 C av
14
C as 14 C av
Tato metoda umožňuje velmi přesná měření. Používá se především v oceánografických a limnologických měřeních, kdy koncentrace biomasy je velmi nízká. Je ale náročná na čas, od desítek minut pro měření hrubé fotosyntézy po několik hodin pro čistou fotosyntézu a také je poměrně finančně náročná (radioaktivní substrát, scintilační lahvičky, likvidace radioaktivního odpadu…). Měření vývoje kyslíku Další možností je měření vývoje kyslíku O2. Zde existují dvě metody: isotopová, sledováním vývoje určitého isotopu kyslíku (převážně 18O) a elektrochemická či polarografická metoda. Isotopová varianta se v principu podobá
5
metodě zjišťování spotřeby C, přidává se obohacená voda H218O. I když tato metoda jako jediná umožňuje současné měření čisté i hrubé fotosyntetické produkce, není příliš rozšířená, neboť pro detekci vyžaduje složitý a drahý hmotový spektrometr. Daleko rozšířenější metodou je polarografické měření vývoje O2 tzv. kyslíkovou elektrodou. Při měření kyslíkovou elektrodou měříme čistou fotosyntetickou produkci, část uvolněného kyslíku je spotřebována dýchacím aparátem. Proto je třeba pro zjištění hrubé fotosyntézy zjistit okamžitou míru respirace. Celkově se hrubý fotosyntetický výtěžek dopočítává odečtením respirace od vývoje kyslíku (Walker D, 1987). Tato metoda je vhodná pro stanovení fotosyntetické produkce poměrně hustých suspenzí řas. V hydrobiologii se používají kyslíkové elektrody, které měří okamžitou koncentraci kyslíku ve vodním prostředí. Čistou primární produktivitu celého společenství je pak možné odhadnou z časového sledu měření během dne.
Variabilní fluorescence Velmi významnou metodou sledování přeměny světelné energie na chemickou je metoda měření variabilní fluorescence chlorofylu. Tuto základní biofyzikální charakteristiku chlorofylu v reakčním centru fotosyntetického aparátu objevil v roce 1934 H. Kautsky, který vlastním okem sledoval změny intenzity fluorescence v červené oblasti spektra po vystavení listu na světlo. Fluorescence nejprve rychle vzrostla, a pak během vteřin a minut postupně klesala a opět narůstala. S fluorescencí jako fyzikálně chemickým jevem se setkáváme u všech látek, které jsou schopny absorbovat záření. Jde o zářivou přeměnu energie při přechodu elektronů z excitovaného stavu do stavu základního. Variabilní (proměnná) fluorescence je však vlastností pouze fotosyntetického aparátu. U sinic, řas a vyšších rostlin je navíc dominantním zdrojem variabilní fluorescence komplex fotosystému II. Pokud na zelenou rostlinu posvítíme silným světlem, světlosběrné antény fotosystémů zachytí tuto světelnou energii a s určitou pravděpodobností jí dopraví k reakčnímu centru. Zde dojde k přenosu na chlorofyly reakčního centra (P680 u fotosystému II). Pokud jsou primární akceptor (plastochinon QA-) i donor (TyrZ) schopny přijmout nebo darovat elektron P680* (reakční centrum PSII otevřené), dojde k fotochemickému rozdělení náboje a fluorescenční výtěžek zůstává nízký. V opačném případě, kdy je reakční centrum v tzv. zavřeném stavu, k fotochemii nedochází a výtěžek zářivé i nezářivé disipace energie se zvýší. Výtěžek fluorescence je proto proměnný a z jeho úrovně lze nepřímo určit účinnost fotochemie. Fluorescencí chlorofylu se ztrácí přibližně 1-5% z pohlceného záření.
Obr.4. Možnosti přeměny světelné energie absorbované pigmenty u fototrofního organismu. 6
Variabilní fluorescence proto poměrně snadno a rychle (řádově minuty včetně přípravy měření) umožňuje získat informaci o některých fotosyntetických vlastnostech měřeného organismu (nebo celé populace) v nativním stavu. Další výhodou může být to, že se na měření spotřebuje minimální množství vzorku (3 ml) a při měření se nemusí použít žádné chemické látky (inhibitory apod.). Přesto tato metoda není příliš často používána v limnologii pro nedostatečnou citlivost komerčních přístrojů. V přirozených podmínkách vodních toků, jezer a tůní, kde se koncentrace chlorofylu pohybuje často kolem 5 µg chl/l, je použití běžného laboratorního fluorimetru obtížné. Metoda variabilní fluorescence se využívá jak při sledování reakce (dlouhodobé i okamžité) organismů na prostředí, ve kterém žijí, tak i při studiu světlosběrných antén, funkce přenašečů v elektronovém transportním systému nebo molekulárních mechanismů fotoadaptace a fotoinhibice. Parametry Údajů, které lze pomocí variabilní fluorescence zjistit, je mnoho. Pro lepší orientaci jsem se pokusil nejdůležitější z nich vysvětlit (viz příloha, upraveno z Roháček a Barták, 1999). Některé parametry jako například q0, NPQ, qCN a qTQ jsou vhodnější pro vyšší rostliny, které nejsou schopné reagovat na změny prostředí s rychlostí jednobuněčného organismu (pro adaptaci na tmu se u vyšších rostlin udává standard 10 min, zatímco u řas se jejich redoxní stav nemění po druhé minutě zastínění). Vzhledem k metodologickým potížím (zpočátku malá citlivost použité aparatury) jsem při svých měřeních zaznamenával většinou pouze parametry Fo, Fm a Fv, které poskytují dostatečné informace o aktuálním fyziologickém stavu organismu. Maximální fotosyntetická účinnost přeměny záření, Fv/Fm, pak udává účinnost fotochemie ve fotosytému II. Fotoinhibice Denní dynamika fotochemické účinnosti Fv/Fm byla již mnohokrát v literatuře popsána. Bylo zjištěno, že za vysokých ozářeností (v poledne) dochází k fotoinhibici, která se projevuje jako dočasný pokles relativní účinnosti přeměny energie světelné na chemickou. V tomto procesu dochází k výraznému poklesu (zhášení) výtěžku Fm. Někdy dojde i k méně výraznému nárůstu Fo. Zhášení se projeví i poklesem efektivního optického absorpčního průřezu antén fotosystému II (σPSII). Molekulární podstata zhášení, které má významnou úlohu při regulaci účinnosti fotosyntézy, není zcela známá. Patrně jde o souhrn procesů, mezi které zařazujeme např. „state-transitions“, procesy spojené s tzv. xanthofylovým cyklem, s agregací chlorofylů apod. Primární produkce a fluorescenční měření Z variabilní fluorescence nelze ještě primární produkci jednoduše vypočítat. Nejprve je třeba z fluorescenčních parametrů vypočítat rychlost lineárního transportu elektronů ve fotosyntéze (J):
J = φ P × I A × 0,5 Zde koeficient IA vyjadřuje množství absorbovaného světla a koeficient 0,5 zhruba vyjadřuje rozdělení zachycené energie mezi fotosystémy I a II. Koeficient IA zjistíme z absorbčního spektra vzorku a ze znalosti spektrálního složení a intensity světla, které dopadá na vzorek. Rychlost lineárního transportu elektronů J je pouze
7
relativní. V těch případech, kdy chceme znát absolutní rychlost fotosyntézy (moly fotosyntetického produktu za jednotku času), musíme jednak znát koeficient, který vyjadřuje účinnost přeměny elektronů na daný produkt (u fixace uhlíku je to tzv. fotosyntetický kvocient Pq) a pak také faktor, který vyjadřuje množství aktivních elektronových řetězců na jednotku objemu nebo pigmentu či biomasy. Nejzajímavější informace mohou poskytnout současná měření (odhady) fotosyntézy pomocí variabilní fluorescence a výměny plynů. Kombinací těchto měření lze zjistit vztahy mezi využitím světla, fixací CO2, vývojem kyslíku a aktivitou PSII. Zajímavé mohou být nové poznatky o alternativních uplatněních zachycené energie – Mehlerova reakce, tepelná disipace, fotorespirace, či fotoinhibiční procesy na různé úrovni. Změny vzájemných vztahů mezi alternativními drahami, využití fotosyntetické energie lze získat z tzv. fotosyntetických křivek, kdy vynášíme množství fotosytetického produktu (P) vůči intenzitě dopadajícího ozáření (E).
Cíle Obecným cílem mé bakalářské práce bylo měření fotosyntetických parametrů rostlinných bičíkovců v různých vrstvách vodního sloupce během denní migrace. Hlavní konkrétní cíle mojí bakalářské práce byly: 1) Uvést do provozu nový fluorimetr na měření variabilní fluorescence chlorofylu řas, sestavit provozní protokoly. Zjistit citlivost fluorimetru a případně ji přizpůsobit pro měření vzorků z tůně. 2) Sestavit měřící protokol pro rozlišení různých taxonomických skupin řas ve vzorcích. 3) Zjistit pomocí fluorescenčních technik denní průběh fotosyntetické aktivity řas v experimentálních tůních na Lužnici. 4) Zjistit pomocí fluorescenčních technik denní průběh fotosyntetické aktivity u laboratorní kultury skrytěnky Cryptomonas marssonii, u které byla prokázána diurnální vertikální migrace. 5)
Zjistit fluorescenční PI křivky u některé bičíkaté řasy.
8
METODY Pěstování řasových kultur Pro laboratorní pokusy jsem používal čisté kultury izolovaných kmenů ze sbírky autotrofních mikroorganismů CCALA (Culture Collection of Algal Laboratory) Botanického Ústavu AVČR, pobočka Třeboň. Řasy jsem pěstoval v doporučených mediích (BG 11, medium typu Šetlík-Simmer), které jsem měl k dispozici v laboratoři MBÚ AVČR v Třeboni. Řasy pro testovací měření Porphyridium cruentum, Chlamydomonas reinhardtii a Euglena gracilis jsem kultivoval kontinuální metodou v erlenmeyerových lahvích (míchání na třepačce, při pokojové teplotě a osvětlení cca 50 µmol kvant.m-2.sec-1) nebo v běžných kultivačních trubicích, sycených 2% CO2. Kultura řas Cryptomonas marssonii byla pěstována v mediu Jaworski. Vzhledem k tomu, že skrytěnky rostou v laboratorních podmínkách velmi pomalu, byly předpěstovány po několik týdnů v lahvích o objemu 2-5 l, umístěných v místnosti na okenním parapetu. Kultura řasy Chlamydomonas reinhardtii pro pokus s využitím několika metod měření fotosyntézy byla pěstovaná v mediu HSM (MM) s přídavkem ampicilinu pro omezení růstu bakterií. Bylo použito kontinulání kultivace v chemostatu při teplotě 30°C. Obr.5. Kultivační zařízení v laboratoři MBÚ AVČR v Třeboni. Termostat reguluje teplotu kultivace pomocí udržování stálé teploty ve vodní lázni. Stmívatelné zářivky Osram Dulux jsou řízeny pomocí počítačového programu. Podle typu kultivace lze provozovat chemostat pomocí peristaltické pumpy.
Variabilní fluorescence Variabilní fluorescence chlorofylu byla měřena přístrojem FL200 vyrobeným brněnskou firmou Photon-System-Instruments (PSI). Jedná se o přístroj vybavený citlivým detektorem s fotodiodou a soustavou dvou světelných budících jednotek umožňující nastavit plynule intenzitu jak měřících, tak saturačních záblesků a aktinického světla. Je rovněž schopný používat logaritmickou časovou matici, což umožňuje detailní měření kinetiky dohasínání variabilní fluorescence ihned po uzavření všech reakčních center. Pro potřeby našeho projektu byly světelné jednotky osazeny svítícími diodami různých spektrálních barev (modrá, zelená, oranžová). Použité měřící protokoly budou popsány podrobněji v další části práce. Protokoly umožňovaly naměření parametrů F0, FM(ST) (single turnover, zavření reakčních center fotosystému II (RC PSII) jedním zábleskem), FM(MT) (multiple turnover, zavření RC PSII víceobrátkovými záblesky) a FS. Indukci variabilní fluorescence předcházelo měření základní fluorescence F0 způsobené slabým měřícím světlem, které nevyvolává aktinický efekt. Saturační záblesk trval 35 µs, při měření reoxidace primárního akceptoru Qa- byl následován po 100 µs měřením dohasínání variabilní fluorescence v logaritmických časových intervalech (Trtílek a Nedbal., 1997).
9
Obr.6. Fluorimetr FL200-PS od firmy P.S.I., Brno. Je vidět kyvetu umístěnou v komůrce, 2 světelné jednotky proti sobě a detektor v kolmém směru. Vzadu je řídící jednotka s převodníkem dat.
Měření fluorescenčních spekter Fluorescenční excitační a emisní spektra řas byla měřena u nativních vzorků pomocí přístroje Aminco-Bowman Series 2 Luminescence Spectrometer model FA357 od firmy Thermo Spectronic. Tento přístroj umožňuje měření fluorescenčních spekter v široké spektrální oblasti excitace a emise. Měření excitačního spektra je založeno na principu sledování intensity emitované fluorescence chlorofylu při excitaci vzorku světlem různých vlnových délek. Před detektorem je umístěn monochromátor, který pouští na fotonásobič pouze záření zvolené vlnové délky. Jiný monochromátor, umístěný mezi lampou a vzorkem, umožňuje průběžně měnit vlnovou délku zdrojového záření, a tak změřit celé spektrum (viz obr.). Vliv citlivosti přístroje na získané spektrum byl odstraněn pomocí vnitřní korekční funkce programu, „Instrumental correction“.
Měření spektrálního složení a intensit záření Spektra použitých světelných zdrojů a intensity záření jsem měřil pomocí přenosného spektrometru Avantes s rozlišením 1 nm v oblasti vlnových délek 190800 nm, se světlovodičovou sondou a malým čidlem ve tvaru koule. Čidlo je přizpůsobeno měření ve vodě a díky své velikosti je jím možno měřit i v kyvetě. Intensita záření byla vypočítána integrací zjištěného spektra s korekcí pro danou vlnovou délku.
Stanovení množství pigmentů Pro stanovení koncentrace chlorofylu byla použita spektrofotometrická metoda. Vzorek řas jsem přefiltroval na filtr ze skelných vláken GF-A (Whatman) a extrahoval do 90% acetonu. Následovalo rozbití buněk a centrifugace při 4000 g.min-1. Chlorofyl byl stanoven spektrofotometricky při vlnových délkách, 630nm a 664 nm pro chlorofyly a a c, 647 nm a 664 nm pro chlorofyly a a b, s korekcí při 720nm na přístroji Shimadzu UV-3000. Pro výpočet množství chlorofylu byly použity tyto rovnice (Jeffrey et Humphrey 1975): chla = 11,61 × (A664 − A720 ) − 2,34 × (A647 − A720 )
chla = 11,43 × (A664 − A720 ) − 0,4 × (A630 − A720 )
chlb = 19,46 × (A647 − A720 ) − 4,29 × (A664 − A720 ) chlc2 = 24,88 × (A630 − A720 ) − 3,8 × (A664 − A720 )
Měření vývoje kyslíku Fotosyntetický vývoj kyslíku byl měřen ve speciální komůrce pomocí „kyslíkové“ elektrody. Jde o pár platinové a stříbrné elektrody, mezi kterými se udržuje polarografické napětí. Měří se velikost proudu, který je uměrný množství kyslíku spotřebovaného na platinové elektrodě. Změna proudu na elektrodě byla zaznamenávána pomocí AD převodníku a zesilovače „Oxycoder“ od brněnské firmy
10
P.S.I. Souběžně na Oxycoder byl připojen i PAM fluorimetr (firma Walz, SRN), kterým jsem měřil parametry Fo, FmST, Fm‘ST a Fs. Aktinické světlo bylo z halogenové žárovky o výkonu 250 W, jeho intenzitu jsem měnil pomocí neutrálních šedých filtrů. Saturační zábleskové světlo bylo z halogenového svítidla s fotografickou uzávěrkou. Data byla zpracována programem OxyWin. Měřil jsem čistou fotosyntézu na světle, respiraci během dvou minut ve tmě. Hrubá fotosyntézu jsem vypočetl jako rozdíl těchto dvou po sobě následujících měření.
Měření v terénu Měření probíhalo na tůni č. T1 v terénní stanici BÚ AVČR v lokalitě periodických tůní nivy horní Lužnice mezi obcemi Halámky a Dolní Lhota. K disposici byly přístroje FL200-PSI a spektrofotometr. Odběry byly každé dvě hodiny během světelné fáze dne a o půlnoci. Vzhledem k tomu, že na stanici není zaveden elektrický proud, musel jsem pro měření používat přenosný generátor Honda o výkonu 750W. Z něj jsem napájel jak osobní počítač (notebook Siemens) pro řízení experimentu, sběr, ukládání a zpracování dat, tak vlastní fluorimetr FL200. Vzorky jsme odebírali pomocí plastového válce typu Gervais, který je na spodu opatřen zátkou, a tak umožňuje odebrání vždy celého sloupce vody najednou. Tímto způsobem dochází k minimálnímu rozmíchání vody před i během odebírání vzorku. Za vzorek jsme považovali výšku 10 cm. Abychom postihli celý sloupec, zvolili jsme 5 hloubek v pravidelných rozestupech 40 cm. Jednalo se tedy o hloubky 10, 50, 90, 130 a 170 cm od hladiny. Celý odběr trval max. 7 minut, poté jsme lahvičky se vzorky překryli černým suknem a odnesli 30 m do chatky. Zde jsme vzorky filtrací pomocí ruční vývěvy 40x zahustili (filtr Whatman GF/F). Poté byl vzorek analyzován (viz výše). Od naměřených hodnot jsem odečetl pozadí, které bylo stanoveno pro každou sérii vzorku společné z přefiltrované vody.
Měření v laboratoři Měření se uskutečnila ve dvou laboratořích, na MBÚ a na BÚ v Třeboni. Měření v laboratoři fotosyntézy MBÚ byla prováděna na kulturách zelených řas Chlamydomonas reinhardtii, ruduchy Porphyridium cruentum, krásnoočka Euglena gracilis a na skrytěnkách druhu Cryptomonas marssonii. Řasy pro měření denní změny fluorescenčního výtěžku byly aklimovány na teplotu a dynamické světlo (max. 1000 µmol kvant.m-2.s-1) po dobu obvyklých 10 dní před měřením. Kultura řasy Cryptomonas marssonii byla pěstována stacionárním způsobem při teplotách 24°C a 12°C. Bylo využito možnosti probublávání CO2, zatímco u kultury řasy Chlamydomonas reinhardtii bylo bubláno pouze laboratorním vzduchem. Tato měření byla doplněna stanovením počtu a velikosti buněk (Multisizer III od firmy Beckman Coulter) a stanovením množství chlorofylu. V laboratoři BÚ v Třeboni byly k disposici dva plastové válce sestrojené v rámci projektu GAČR D. Pithartem a D. Fialou pro studium diurnální vertikální migrace. Válce jsou 2 m vysoké o průměru cca 250 mm. Nad válci jsou umístěny jako zdroj světla stmívatelné zářivky Osram Dulux se stejným průměrem jako válce. Průběh intensity jejich záření řídí počítač pomocí speciálního programu vyvinutého na MBÚ. Světelnou křivku lze snadno konfigurovat v programu MS Excel. Počítač také sbírá údaje z teplotních čidel, které jsou rozmístěny po 20 cm výšky válce. Každých 10 cm je zabudován kohoutek s možností odběru vzorku přímo z požadovaného místa vodního sloupce. Samotný odběr se provádí pomocí injekční jehly o velkém vnitřním průměru do připravené zkumavky. Válce jsou chlazené pomocí kryostatu (zpočátku ještě termostatu) a gumových hadic, které se ovíjejí 11
kolem válce. Celková intensita chlazení je regulovatelná kryostatem a množstvím závitů v daném místě. Během fluorescenčních měření byly válce teprve v polodokončeném stavu. Zároveň byla měřena teplota v různých hloubkách, případně se celé chladící zařízení na chvíli odstavilo.
Obr.7. Experimentální válec pro sledování vertikální migrace v Botanickém ústavu AVČR v Třeboni.
Stojan na kyvety Fluorescenční světelné křivky měly být původně měřeny na speciálním stojanu, který jsme navrhovali spolu s O. Prášilem a V. Tichým. Ten by umožňoval urychlení měření variabilní fluorescence pro vzorky vystavené na různých světelných intensitách. Nepracovalo by se s jedním, ale s více vzorky najednou, čímž by se předešlo pomalé adaptaci na zvyšující se intensitu záření a celkový čas měření se významně zkrátil. Jednoduchý stojan na 10 kyvet byl ze spodu opatřen modrými filtry pro odstranění vlivu aktinického světla na detektor a šedými filtry, které vytvářely rozdíly ve světelné intensitě. Pokud provádíme měření fotosyntetických PI křivek postupně, tj. ozářenosti zvyšujeme od nejmenších až k sytícím, můžeme získat údaje, které nemusí odpovídat skutečnému fyziologickému stavu zkoumaného organismu. Během měření totiž dochází k postupné adaptaci (k indukcí zhášení apod.) řas na zvyšující se intenzitu ozáření. Navíc jsou tato měření poměrně dlouhá (> 15 minut) a na konci měření proto nemusí být řasy v původním fyziologickém stavu. Proto jsem sestrojil stojan, který umožňuje naměřit celou PI křivku velice rychle. Vzorek je rozdělen do deseti stejných kyvet, na které zespodu svítí zdroj aktinického světla. Pod každou kyvetou je neutrální filtr s jinou propustností, takže na každý vzorek dopadá aktinické světlo jiné intenzity. Fluorescenční parametry chci měřit pomocí světlovodiče, který se zasouvá před každou kyvetu. Jako zdroj světla jsem nejprve zkusil použít vysokofrekvenční zářivku Osram Dulux (viz příloha 2). Ukázalo se však, že frekvence výbojů interferuje s měřícím protokolem. Dále jsem zkusil použít halogenovou lampu o výkonu 150 W. Abych odfiltroval červenou složku spektra halogenové lampy, musel jsem pod každou kyvetu umístit modré filtry (BG 39 od
12
firmy Shott). Zjistil jsem, že po těchto úpravách není intenzita aktinického světla saturující (max. 300 µmol kvant.m-2.sec-1). Proto jsme umístili pod každou kyvety 4 modré LED diody (typ L53MBC, Nightbright). Bohužel, ani tentokrát jsme nedosáhli saturace (max. 80 µmol kvant.m-2.sec-1). Nyní používáme vysokotlakou rtuťovou výbojku (75W, typ Osram HQI-TS NDLUVS), která umožňuje dosáhnout intenzit aktinického světla až 1000 µmol kvant.m-2.sec-1. Měření s touto lampou budu provádět až po odevzdání bakalářské práce.
Obr.8. Stojan na kyvety pro měření PI křivek.
13
VÝSLEDKY Přizpůsobení měřícího přístroje Relativně nízkou citlivost nového fluorimetru na počátku práce jsem postupně odstranil několika způsoby: Výměna filtrů Původní filtry jsem nahradil vhodnějšími novými filtry ze zásob v laboratoři : shortpass s max. 700 nm a červené sklo s hranou propustnosti 665 nm. Přestože jsem si myslel, že bude stačit pouze jeden z filtrů ukázalo se, že detektor je příliš citlivý a proniká přes něj velké množství šumu z nastavených oranžových měřících (max. 623 nm) a červených excitačních (max. kolem 650 nm) světel.
intensita záření (u mol kvant.m2.s-1)
Obr.9. Měřící komůrka, detector, světelná jednotka a umístění filtrů.
0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 400
450
500
550
600
650
700
vlnová délka (nm)
Obr.10. Emisní spektra měřících světel použitých při měření s fluorimetrem FL.200-PS. Modré (max. 458 nm), zelené (max. 518 nm) a oranžové (max. 623 nm).
Jiná měřící světla Měřící protokol jsem upravil tak, aby bylo možné ovládat a používat měřící (neaktinická) světla i jiných vlnových délek (modré a zelené) než umožňuje standardní protokol. Musel jsem provést určité zásahy do měřícího protokolu. Měřící modré světlo (max. 458 nm) jsem nazval b (místo původního A1) a jeho 14
vlastnosti upravil (min. a max. hodnoty časování byly nastaveny podle původního oranžového měřícího světla). Musel jsem se tedy seznámit s jazykem a strukturou řídícího programu. Stejné úpravy jsem provedl pro zelené měřící světlo g (max. 518 nm). V další práci jsem pak především využíval možnost měřit variabilní fluorescenci modrým světlem, které pro naší práci se sladkovodními řasami bylo daleko vhodnější. Měřící parametry Dále jsem upravil měřící protokol tak, abych zvýšil citlivost detekce. Software dodaný firmou poskytuje základní verzi měřících protokolů, které jsme však museli přizpůsobit konfiguraci přístroje. Prodloužil jsem délku měřícího záblesku (MeasuringFlash) na 4 µs, dobu mezi zábleskem a zapnutím detektoru (Measure Delay) na 6 µs. Firma nám dodala nový typ detektoru, který má pomalejší náběh, zato je 10x citlivější než dosud používaný u starší laboratorní verze přístroje. Dále jsem se pokusil minimalizovat vliv červeného saturačního záblesku (actinic flash, AF) posunutím začátku měření na 100 µs po záblesku. Tím jsem snížil jeho vliv na tři hodnoty od počátku měření. Odečítané pozadí od všech vzorků pak bylo 0.03 mV z hodnoty FM. Příklad jednoho z použitých měřících protokolů je uveden v příloze. Během testování jsem zjistil ještě další problém. Při kinetických měřeních docházelo v určitém časovém bodě k náhlé změně intensity signálu. Po konzultaci s výrobcem byl následně v květnu 2002 přístroj odvezen a problém odstraněn techniky firmy. Výsledná citlivost Citlivost detektoru jsem určoval na základě ředících řad vzorků o známé koncentraci chlorofylu. Prahem detekce pro mě byl signál, který měl intenzitu zhruba třikrát větší než byla velikost šumu a charakteristika naměřených hodnot se nelišila ve třech po sobě následujících měřeních. Původní citlivost před úpravami protokolu byla 154 µg chl.l-1, po provedení výše zmíněných úprav 15 µg chl.l-1. Nový detektor Od ledna 2003 je v laboratoři k dispozici nový detektor typu FAST. Ten umožňuje měřit rychlé kinetické indukce v jednotkách mikrosekund a tedy i měření efektivního absorbčního průřezu bez přidání herbicidu DCMU. Rovněž máme od roku 2003 k dispozici detektor se zvýšenou citlivostí (lavinová fotodioda), který má citlivost srovnatelnou s fotonásobičem. Tyto detektory plánuji použít v létě 2003 v terénních i laboratorních měřeních, které budou pokračováním mé bakalářské práce.
Spektra a taxonomie řas V rámci bakalářské práce jsem zkoušel připravit měřící protokoly, které by pomocí excitace fluorescence měřícím světlem o různých vlnových délkách (modrá 458 nm, zelená 518 nm, oranžová 623 nm) umožnily odlišit řasy různých taxonomických skupin, které se liší druhem světlosběrných pigmentů. Ve spolupráci s Dr.Pithartem jsem pro zástupce různých taxonů řas zjistil absorbční, excitační a emisní spektra. Dále jsem pomocí kalibrovaného spektrofotometru AVANTES změřil intenzity měřících světel fluorimetru FL200-PSI. Na základě těchto údajů jsem pak sestavil měřící protokol, který se skládal z měření fluorescence F0 po excitaci měřícími světly. Takto získané hodnoty lze porovnat s excitačními spektry a z poměrů určit
15
dominantní taxonomickou skupinu zkoumaných řas a sinic. Poměry hodnot získaných pro vlnové délky maxim excitačních světel byly porovnány s hodnotami F0 z fluorimetrického měření (viz obr.12).
Absorbční spektra
Absorbance
1.2 1
Chlam.rein
0.8
Crypt.mar. Eugl.grac.
0.6
Porph.cru.
0.4 0.2 0 400
500
600
700
vlnová délka (nm)
Excitační spektra
Fluorescence
1.2 1
Chlam.rein Crypt.mar. Eugl.grac. Porph.cru.
0.8 0.6 0.4 0.2 0 350
400
450
500
550
600
vlnová délka (nm)
E m is n í s p e k tr a 1 .2
Fluorescence
1 C h la m .re in
0 .8
C ry p t.m a r.
0 .6
E u g l.g ra c . P o rp h .c ru .
0 .4 0 .2 0 600
650
700
750
800
v ln o v á d é lk a (n m )
Obr.11. Absorbční, excitační a emisní spektra vybraných druhů řas. Chlam.rein… Chlamydomonas reihardtii, Crypt.mar…Cryptomonas marssonii, Eugl.grac…Euglena gracilis, Proph.cru…Porphyridium cruentum.
16
Výsledné poměry, bohužel, nepotvrdily teoretické předpoklady. Zvláště je tento nesoulad patrný u ruduchy Porphyridium cruentum. Rozdíly ve fluorescencenčním výtěžku na obou přístrojích mohou být způsobeny širším emisním spektrem měřících světel FL200 a/nebo širokou oblastí detekce signálu fluorescence. Fluorescence na AB2 (F) a PSI (Fo,Fm) poměr F blue green orange 1 0.25 0.46 Dicty-pul 1 0.41 0.64 Dun-bioc 1 0.30 0.25 Inter-par 1 0.29 0.45 Pedia-tetr 1 0.80 2.23 Porph-cru 1 0.60 0.54 Chan-sp.
poměr F0 blue green 1 0.23 1 0.27 1 0.26 1 0.25 1 1.02 1 0.53
orange 0.53 0.62 0.50 0.46 0.49 0.51
blue 1 1 1 1 1 1
poměr Fm green orange 0.24 0.46 0.28 0.52 0.30 0.44 0.26 0.44 0.99 0.36 0.67 0.40
Obr.12. Výsledné poměry fluorescenčních výtěžků pro 3 oblasti světla. F – fluorescence v maximech světel měřená na Aminco-Bowman 2000. Fo, Fm - fluorescence získaná fluorimetrem FL200-PSI. Hodnoty jsou vztažené na fluorescenci po excitaci modrým světlem (viz text). Dicty-pul…Dictyosphaerum pulcherum, Dunbioc…Dunaliella bioculata, Inter-par…Interphyllum paradoxum, Pedia-tetr…Pediastrum tetras, Porphcru…Porphyridium cruentum, Chan-sp…Chantransia sp.
Měření variabilní fluorescence První testovací měření v laboratoři První pokus měření variabilní fluorescence v laboratorních válcích byl naplánován na druhou polovinu května 2002. Účastnil jsem se pokusu spolu s Mgr. Danem Fialou z BÚ AVČR. Přivezenou vodou z tůní jsme napustili oba experimentální válce. Měření následovalo druhý den. Teploty byly po dobu měření stabilní ve všech třech sledovaných hloubkách (0.1 m, 1.1 m a 1.7 m) a jejich hodnoty byly 24, 23 respektive 13°C. Denní světelný režim jsme nastavili na 12/12 hod světlo/tma. Den začal v 11:35 hod LSEČ. Výsledný fluorescenční výtěžek a hodnoty ΦP0 získané během měření jsou uvedeny na obr.13. Toto měření především ověřilo schopnost fluorimetru měřit variabilní fluorescenci i při nízkých koncentracích chlorofylu. Hodnoty F0 a FM dosáhli maxima devátou hodinu od počátku měření. Může to být reakcí na změnu množství dopadajícího záření. Druhá možnost je pozůstatek vnímání přírodního cyklu, devátá hodina odpovídá 20:35 hod LSEČ, a maximum signálu (chlorofylu) se vztahuje k večernímu stmívání. Posunutím denního režimu o cca 4 hod jsme si možná zkomplikovali měření. V laboratorních válcích se nám podařilo udržet sice vyšší, ale stabilní teplotní gradient než je v přírodě po celou dobu měření. Na obou válcích jsme také pozorovali výrazný rozvoj perlooček Daphnia, běžně se vyskytujících v tůních, kterým zřejmě teplejší laboratorní podmínky vyhovovaly.
17
0.08
0.60
0.07 Fluorescence (rel.jedn.)
0.70
Fv/Fm
0.50 0.40 0.30 0.20
0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01
0.10
0
0.00 0:00
6:00 12:00 čas měření (h)
0:00
18:00
1.6m ST
1m ST
10cm ST
1.6m MT
1m MT
10cm MT
6:00 12:00 čas měření (h)
18:00
1.6m
1m
10cm
1.6m
1m
10cm
B
A
Obr.11. První měření na laboratorních válcích dne 23.května 2002. Bylo měřeno Fo a Fm (graf B) ve třech hloubkách – 10 cm, 1 a 1,6 m. Světlejší barvy pro určitou hloubku značí Fm. Výsledný poměr Fv/Fm (graf A) během dynamického světelného režimu.
První měření na tůních V koncem července 2002 jsme ve stejném obsazení uskutečnili terénní měření denní změny fotosyntetické aktivity PSII ve vodním sloupci v experimentální tůni u řeky Lužnice. Podařilo se mi provozovat aparaturu v terénních podmínkách s náhradním zdrojem elektrické energie. Měření i s přípravou zahrnovalo celkem čtyři dny – 3.den byl dnem měření. Výška vodního sloupce byla 180-190 cm a stejná byla průhlednost vody. Dno bylo bahnité, místy v pískové. Průběh změny poměru FV/FM v závislosti na denní době ukazuje obr. 12. 1000
0.60
Intenzita záření (umol kvant.m-
Fv/Fm (rel.jedn.)
0.45
2.s-1)
600 500 400 300
0.40
0.30 3:00 1 (170-180cm) 3 (90-100cm) 5 (10-20cm)
9:00
15:00 21:00 (130-140cm) Denní 2čas (h)
800 700
0.55
600
0.50
500 400
0.45
300
0.40
200
0.35
900
0.60
700
0.50
1000
0.65
800
0.55 Fv/Fm (rel.jedn.)
0.70
900
Intenzita záření (umol kvant.m-2.s-1)
0.65
100
0.35
0
0.30
3:00
200 100 0 3:00 9:00 15:00 1 (170-180cm)
21:00 3:00 2 (130-140cm)
4 (50-60cm)
Denní čas (h) 3 (90-100cm)
4 (50-60cm)
sluněční záření
5 (10-20cm)
sluněční záření
A
B
Obr.12. Měření v periodických tůních řeky Lužnice dne 25.července 2002. Porovnání denních hodnot Fv/Fm u dvou typů saturace RC PSII - multiple turnover (A) a single turnover (B). Světelná křivka znázorňuje měnící se intenzitu záření dopadajícího na hladinu. Korelace hodnot pro typ multiple turnover s intenzitou světla v příslušné hloubce: 170cm … p = 0,414, R2 = 0,137; 130 cm … p = 0,08, R2 = 0,488; 90 cm … p = 0,0014, R2 = 0,89; 50 cm … p = 0,038, R2 = 0,61; 10 cm … p = 0,0425, R2 = 0,594.
Denní fluorescenční charakteristiky získané dvěma typy saturace PSII jedním společným měřícím protokolem ukazují rozdílný průběh. Korelace hodnot s 18
množstvím dopadajícího záření vyšly téměř všechny průkazně pro saturaci typu multiple turnover. Během měření jsme zjišťovali koncentraci chlorofylu ve vodním sloupci. Ta se pohybovala mezi 0,06 µg chl.l-1 a 13,4 µg chl.l-1 (u dna). Hodnota bazální fluorescence chlorofylu Fo byla v rozmezí 0,006 mV až 0,42 mV.
chl a flouro [rel.]
0.06
0.04
0.02
0 0.00
5.00 10.00 chl a spektro [ug.l-1]
Obr.13. Korelace chlorofylu zjištěného spektrofotometricky a fluorometricky (F0). Korelační parametry vyšly p = 0,041, R2 = 0,354. Test je však příliš slabý, alpha = 0,53.
Analýza rychlosti dohasínání variabilní fluorescence ukázala výraznou změnu rychlosti reoxidace zredukovaného primárního akceptoru QA- během denního cyklu řas a to ve všech sledovaných hloubkách (viz obr. 19). Hodnoty rychlosti reoxidace klesly z původních cca 500 s-1 (hodnota za rozbřesku, 5:30 hod) na cca 25 s-1 brzy odpoledne (odběr 15:45 hod). Zpomalení jsme pozorovali již při odběru ve 12:30 a to především v nejspodnější vrstvě (170 cm). Při odběru v 18:30 jsme naopak zaznamenali vzestup rychlosti vQa na cca 400 s-1 pro měření z hloubek 90 a 130cm. Avšak při půlnočním odběru se tato rychlost opět snížila na 40 s-1 a 50 s-1. Tyto změny rychlosti přenosu elektronů ve fotosystému II jsou patrně vyvolány denní změnou ozářenosti (odpolední pokles), tak i patrně buněčným cyklem či přesměrováním metabolismu (chlororespirace) v nočních hodinách.
700 600
vqa (s-1)
500 400 300 200 100 0 -100 0:00
6:00
12:00
18:00
0:00
6:00
Denní čas (h) 1 (170-180cm)
2 (130-140cm)
3 (90-100cm)
4 (50-60cm)
5 (10-20cm)
Obr.14. Změna rychlosti dohasínání variabilní fluorescence během měření 25.července 2002. Patrný je výrazný pokles rychlosti po denním světelném maximu.
19
První měření s laboratorní kulturou skrytěnek Pro zjištění fotochemické aktivity PSII během dne u monokultury bičíkovců Cryptomonas marssonii, jsme naplánovali sérii pokusů na různých typech světelných režimů – kontinuálním a dynamickém (proměnnéms denním průběhem). Řasy jsme umístili do lahví o obsahu 5 l a svítili na ně zářivkami OSRAM Dulux. Časování jsme nastavili na 12/12 hod světlo/tma. Zjištěný denní průběh FV/FM je uveden na obr. 15. Výsledky měření v zastíněných a nezastíněných lahví ukazují, že bičíkaté řasy jsou do určité míry schopné se během několika hodin přizpůsobit změnám 0.70
0.70
0.65 Fv/Fm (rel.jed.)
Fv/Fm (rel.jed.)
0.65 0.60 0.55 0.50
0.60 0.55 0.50 0.45
0.45
0.40
0.40 0:00
0:00
6:00
12:00
18:00
6:00
0:00
12:00 čas (h)
18:00
0:00
čas (h)
dynam.nezast. kont.nezast.
dynam.zast. kont.zast.
A
dynam.nezast.
dynam.zast.
kont.nezast.
kont.zast.
B
Obr.15. Výsledné hodnoty Fv/Fm z laboratorního pokusu se skrytěnkou Cryptomonas marssonii. Byly použity dvě intenzity světla a dva světelné režimy (kontinuální a dynamické). Lze také porovnat dva druhy měřících záblesků (modré a zelené).
intenzity osvětlení. Pokud je však intenzita osvětlení příliš vysoká, může na vysokém světle dojít dlouhodobému snížení fotosyntetické aktivity. Ze srovnání měření různými měřícími světly (modré, zelené a oranžové) je vidět, že toto přizpůsobení bylo na úrovni celého fotosystému II. Výraznější pokles FV/FM při poledním odběru zaznamenaný zeleným měřícím světlem (max. 518 nm) by mohl odrážet větší význam phycoerythrinových pigmentů pro zachycování záření. První měření na experimentálních válcích Měření cirkadiálních změn fluorescence chlorofylu během migrace bičíkovců v laboratorních válcích proběhlo rovněž na BÚ AVČR ve spolupráci s Mgr. Danem Fialou. Ve válci byla rozmíchána voda z tůně zkoncentrovaná podle citlivosti fluorimetru. Ze vzorku jsme odstranili zooplankton, abychom omezili predaci a tím snižování koncentrace chlorofylu. Gradient teploty uvnitř válce byl po celou dobu experimentu stabilní s malým nárůstem během nejvyšších ozářeností u hladiny. Dynamický světelný režim jsme nastavili na 16/10 hod (odpovídal přirozeným změnám v daném ročním období v Třeboni). Fluorescenční měření probíhala od 9:00 prvého do 13:00 hod LSEČ druhého dne (viz obr. 16). Přestože jsme měřili celkem pět hloubek, jsou zde pro názornost ukázány pouze dvě. Už hloubka 60 cm totiž na rozdíl od hloubky 20 cm ukazuje nezávislost denního průběhu FV/FM na měnící se intenzitě světelného záření. Tento odlišný výsledek, než jsme získali terénním měřením na tůních, může být způsoben rozmícháním celého sloupce, čímž se zkombinovaly řasy adaptované na různou intensitu světla.
20
1200
0.45 0.40
Fv/Fm (rel.jedn.)
800
0.30 0.25
600
0.20
400
0.15 0.10
200
0.05 0.00 0:00
Intenzita záření (umol kvant.m-2.s-1)
1000
0.35
0 6:00
12:00
ST (20cm)
čas (h)
18:00 MT (20cm)
0:00 světlo
Obr.16. Změna Fv/Fm v hloubce 20 cm v laboratorních válcích. Korelace s měnící se intenzitou záření je ve 20 cm pro měření ST p < 0.001, R2 = 0.651 a pro měření MT p < 0.001, R2 = 0.56. V následující sledované hloubce je již korelace vysoce neprůkazná (p = 0.48, R2 = 0.046). Intenzita přítomného světla byla zřejmě pod jejich fluorescenčním aklimačním maximem.
Měření fotosyntetické aktivity V listopadu 2002 jsem spolu s D. Fialou prováděl pokus, který měl ověřit zjištěné charakteristiky denního průběhu FV/FM u řasy Cryptomonas marssonii a pokusit se zjistit, zda je přítomen vnitřní rytmus při adaptaci na přirozené světelné podmínky (dynamické světelné podmínky). Pokusili jsme se měřit fluorescenční PI křivky přímo v kyvetě. Kultura byla sycena mírným bubláním 2% CO2. Fluorescenční parametry FV/FM získané v různou denní dobu jsou na obr. 22. S intensitou světla koreluje pouze první den měření - p < 0.01 R2 = 0.875. Druhý den tato změna ustala a, přes prodloužení měření o jeden den, se již žádná podobná závislost na intenzitě záření neukázala. Dalším zjištěním bylo klesající množství chlorofylu v kultuře, podobně jako i počtu buněk u nezředěných kultur, zatímco v jedné lahvi s počáteční hodnotou 2.104 buněk/ml se počet po čtyřech dnech pokusu zvedl na 3,5.104 buněk/ml, fluorescenční měření však neukázala žádnou změnu fotosyntetické aktivity. 0.8
fluorescence (rel jedn.)
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0:00
12:00 Fo
0:00 èas (h) Fm
12:00 Fv
0:00
Fv/Fm
Obr.17. Záznam prvních dvou dnů měření fotosyntetické aktivity Fv/Fm pro kultury řasy Cryptomonas marssonii. První den je patrný vliv intenzity světla na průběh fotosyntetické aktivity (p < 0.005, R2 = 0.875), zatímco druhý den odpoledne dochází k prudkému poklesu jak Fo tak i Fm. Zřejmě řasy přešly na heterotrofní způsob získávání energie.
21
Vývoj fluorescenčního výtěžku ΦFo a ΦFm ukazuje možnou příčinu. Během narůstající intenzity záření se snižuje nejen hodnota ΦFm, ale také ΦFo, večer se obě naopak zvětšují. To může znamenat úpravu světlosběrných antén v neprospěch nadměrného zachycování záření a může to být důkazem pro přechod na heterotrofní způsob života.
Srovnávací měření Podrobnou informaci o fyziologickém stavu fotosyntetických vzorků za reálných podmínek poskytnou měření tzv. PI křivek, kdy se vynáší fotosyntetická aktivita vůči intenzitě absorbované či dopadající ozářenosti. Koncem ledna 2003 jsem u laboratorní monokultury řasy Chlamydomonas reinhardtii srovnával PI křivky ve čtyři významné okamžiky denního světelného cyklu (ráno, v poledne, večer a v noci). Fotosyntézu jsem vyjadřoval pomocí třech metod - jako aktivitu PSII měřenou pomocí variabilní fluorescence, jako vývoj kyslíku, jako asimilaci uhlíku (tato měření prováděla Ing. Helena Doušová).
2 rychlost vývoje kyslíku (rel.jedn.)
1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00
1.5 1 0.5 0 -0.5
0
500
1000
1500
2000
2500
0
Intensita [uEin/m2s] 0:00
8:00
14:00
20:00
Ek (umol kvant.m-2.s-1)
2 1.5 1 0.5 0 500
1000
1500
2000
8:00
14:00
20:00
14:00
20:00
B 60
800
50 40
600
30 20
400 200
10
0
0 6:00
12:00
18:00
0:00
čas (h)
2500
Intensita [uEi n/m2s] 0:00
8:00
2500
1000
0:00 0
1000 1500 2000 Intensita [umol kvant.m-2.s-1]
0:00
A
2.5 rychlost asimilace uhlíku (rel.jedn.)
500
Ek (umol kvant.m-2.s-1)
zavřená RC PS II (rel.jedn.)
1.20
fluor
C
ox
car
Obr.18. PI křivky naměřené během pokusu s řasou Chlamydomonas reinhardtii. A – množství zavřených RC PSII, B – fotosyntetický vývoj kyslíku (hrubá produkce), C – aktivita enzymu RUBISCO, přijímání uhlíku z okolí. Hodnoty kompenzační intenzity záření (Ek) v jednotlivých fází dne. Osa pro uhlík je napravo!
22
D
DISKUSE: Taxonomické rozlišení jednotlivých druhů Možnost rozlišení různých taxonů fototrofních mikroorganismů či alespoň jejich poměrného zastoupení pomocí optických metod bez nahlížení do mikroskopu je snem každého, kdo někdy počítal buňky. Excitační spektra řas a sinic přinášejí informaci o pigmentech aktivních při fotosyntéze, které se účastní přenosu excitonů na PS II. Měření pomocí fluorimetru přinášejí podobnou informaci: Ф(λ)Fo ~ Ex(λ)PSII. Nezdar svého snažení připisuji zvoleným měřícím světlům, která nevystihovala absorpční maxima pigmentů. Pravděpodobně se stalo, že emise modrého měřícího světla excitovala více pigmentů, a tak obě fluorescenční měření dospěla k různým výsledkům. Pro další měření bych navrhoval zvolit druhy měřících světel podle absorbčních charakteristik hlavních pigmentových skupin. Pomocí trojrozměrných excitačních a emisních spekter lze spolehlivě detekovat pouze řasy obsahující phycoerytrin vázaný ve phycobilisomech, neboť zde dochází při transportu excitonů ke ztrátě zachycené energie, která se vyzáří jako fluorescence při vlnové délce 580 nm. To umožňuje odlišit pouze zastoupení sinic a některých ruduch ve vzorku. Při metodice, kterou jsem si zvolil ve své práci, by byl tento způsob možný jen za předpokladu použití 2 detektorů, z nichž každý by byl vybaven vhodným filtrem, kterým bych určoval podíl Ф580nm a Ф685nm při excitacích vhodným modrým a zeleným světlem. Musely by se ale ověřit předpoklady, že poměr Ф580nm/Ф685nm při excitaci zeleným světlem je konstantní a zjistit průměrný poměr mezi obsahem chlorofylu a phycoerythrinů za přírodních světelných podmínek. Na tomto principu by se mohl sestrojit vhodný přístroj, který by mohl být využit pro detekci koncentrace sinic a ruduch pro vodárenské účely. Jiná cesta, kterou by bylo zajímavé sledovat, je porovnávání absorbčních a excitačních spekter. Z absorbčního spektra se dozvíme informaci o přítomnosti a množství jednotlivých pigmentů, kterou excitační spektra doplní informací o tom, které pigmenty se podílejí na přenosu energie na fotosystém II. Bylo by pak možné zjistit jejich přítomnost ve vzorku, určit světlosběrnou „aktivitu“ daného pigmentu a celkový soubor dat by mohl poskytnout širší možnosti pro spektro-fluorimetrickou taxonomii.
Variabilní fluorescence v terénu Podařilo se mi provozovat fluorimetr v terénních podmínkách při měření, které postihlo celých 24 hod. Bohužel situace v létě roku 2002 byla pro systematická měření nejméně příznivá za poslední léta: koncentrace řas byly velmi nízké, 3 µg chl.l-1 oproti uváděným 15 µg chl.l-1 (Pithart a Fiala, ústní sdělení), a tak při měření na Lužnici bylo potřeba vzorek ještě zkoncentrovat, abychom dosáhli prahu měřitelnosti. Doba adaptace na tmu se tak prodloužila z obvyklých 2 min na 1 hod. Tím ale docházelo ke změnám fyziologického stavu řas (state-transitions, relaxace Calvinova cyklu) a naměřené denní změny proto asi nevypovídají o skutečném stavu ve vodním sloupci. Přesto je část výsledků podobná těm, které již byly pozorovány při měření denního průběhu FV/FM, jak při měření v terénu např. u chaluh (G.Magnusson 1997), tak u laboratorních kultur řasy Dunaliela tertiolecta (Havelková-Doušová a ostatní, 2003). Jde o fotosyntetické výtěžky vypočítané z excitace typu multiple turnover. Je zde vidět rozdíl mezi dvěma způsoby zavření reakčních center. O konkrétním mechanismu, který způsobí, že fluorescenční výtěžek FM(MT) je odlišný od výtěžku FM(ST), se dodnes vedou diskuze. Takže toto zjištění je jen dalším příspěvkem do již otevřeného tématu.
23
Zpomalení kinetiky dohasínání variabilní fluorescence Zajímavým zjištěním během měření kinetiky variabilní fluorescence v tůních na Lužnici bylo náhlé zpomalení dohasínání variabilní fluorescence. S podobným průběhem, ale na jiné časové úrovni (s místo ms), se můžeme setkat po zapnutí silného aktinického světla. Zde je zvýšená hodnota FS způsobená stálou vysokou ozářeností, zatímco kinetika reoxidace primárního akceptoru QA- je měřená ve tmě. Zpomalení tedy nějakým způsobem souvisí s vnitřní regulací na úrovni thylakoidních membrán, světlosběrných antén nebo samotného fotosystému II a to jak na straně akceptorové, tak na straně donorové. Konečně tato změna by mohla být důsledkem přílišné relaxace fotochemického aparátu při měření až 1 hod od odběru. V průběhu této relaxace ve tmě mohlo dojít ke změně konformace reakčního centra nebo k odloučení antén LHC II a snížení pravděpodobnosti přenosu excitační energie mezi LHC II a vnitřní anténou PSII.
Povodně Pohromou, která výrazně poznamenala plánovaná měření v roce 2002 byly povodně na Lužnici. Hladina vody v oblasti horní Lužnice stoupla a sledované tůně se staly nepřístupné až do jara 2003. Z tohoto důvodu byla další měření přesunuta až na léto 2003. Výjimečná potopa se také nevyhnula laboratořím BÚ AVČR v Třeboni, kde jsou umístěny experimentální válce.
Vertikální migrace Přes nemalé množství experimentů jsem neměl příležitost sledovat vertikální migraci ani na terénní stanici, ani v pokusných válcích. Během pokusů s kulturou skrytěnek Cryptomonas marssonii, u kterých byla migrace prokázána, se mi společně s Danem Fialou podařilo sledovat zajímavý úkaz. Řasy tvořily v kultivačních lahvích o objemu 5 litrů hustá oblaka, kolonie. Přestože suspenze byly pravidelně rozmíchány před každým odběrem, řasy byly schopné během několika hodin znovu shluky vytvořit. Vytváření shluků u jinak nekoloniálních řas by mohl být podmíněn reakcí na určitý stres (vysoké intenzita světla, nedostatek živin). Největším úspěchem, kterého se podařilo D. Pithartovi a D. Fialovi dosáhnout na experimentálních válcích na jaře 2003, bylo vytvoření podobných, okem viditelných, shluků a jejich migrace ve vertikálním směru. Vytvoření shluků však prý následovalo rovněž až po zvýšení intenzity osvětlení. Tento oblak se ovšem za několik dní rozplynul (D. Pithart, ústní sdělení).
Kryptomonády Po roční práci se skrytěnkou Cryptomonas marssonii mohu říct, že nám tato řasa způsobila při pokusech nemalé obtíže. Kvůli její velmi nízké růstové rychlosti ji bylo nutné předpěstovat měsíce dopředu, čehož se ujala skupina z BÚ AVČR v čele s Janou Kviderovou. Tato skutečnost velmi znesnadňuje měření, neboť řasy se mohou vyskytovat již ve stacionární fázi růstu a při posuzování jejich fyziologického projevu je nutno počítat s alternativními zdroji energie. Jak již prokázali někteří autoři sledováním úbytku glycerolu z kultivačního média (např. Gervais, 1997, Lewitus et al. 1991), u skrytěnek je vyvinuta možnost výživy heterotrofním metabolismem. Z výsledků měření fotosyntetické aktivity je zřejmé, že tato možnost je hojně využívána. Fotosyntetická produkce se v té době prakticky zastaví. Tím si vysvětluji nezávislost FV/FM na světelné intenzitě. Sníží se míra absorbce světelné energie, ustane její přenos na fotosystém II a výrazně se sníží fluorescenční výtěžky F0 a FM (viz obr.17).
24
Další řasy a sinice Během terénního měření jsme přes celkově nízkou koncentraci chlorofylu zaznamenali výskyt dvou zajímavých druhů řas – Volvox sp. a Aphanizomenon flosaquae. Obě tyto kolonie byly dobře viditelné a před fluorescenčním měřením jsme je vždy ze vzorku odstranili. Jsou to zajímavá uskupení buněk a navíc v rodě Volvox se vyskytují migrující druhy. Aphanizomenon tvořil zase uskupení podobná vločkám. Ty stačily 3 až 4 do kyvety pro dostatečný signál.
25
ZÁVĚRY: Zprovoznil jsem přenosný fluorimetr vyrobený na zakázku firmou P.S.I. pro účely měření diurnální vertikální migrace bičíkatých řas a vytvořil měřící protokoly umožňující určení Fo, Fm a Fv. Ukázalo se, že pro měření v terénu a při nižších koncentracích chlorofylu je vhodnější typ měření MT. Během této práce se mi podařilo seznámit se s metodikou fotosyntetického vývoje kyslíku a s možnostmi měření variabilní fluorescence jako ukazatele fyziologického stavu organismu a míry primární produkce. Při laboratorní práci s kulturou bičíkatých řas se ukázalo, že skrytěnky (Cryptophyceae) nejsou příliš vhodné organismy pro laboratorní studium. Vzhledem k tomu, že se v přírodě vyskytují v hojné míře a mají unikátní typ světlosběrných antén, by ale bylo žádoucí propracovat jejich kultivaci pro možnosti pečlivějšího studia ekologického chování a strukturních analýz.
26
LITERATURA: ARVOLA L (1984) Vertical distribution of primary production and phytoplankton in two small lakes with different humus concentration in southern Finland. Holarct. Ecol. 7: 390-398 FIALA D (1999) Diurnal vertical migration of phytoplankton community in alluvial pools. Master thesis, Faculty of Sciences, Charles University, Prague. GERVAIS F (1997) Light-dependent growth, dark survival, and glucose uptake by cryptophytes isolated from freshwater chemocline. Journal of Phycology. 33 (1): 18-25 HAVELKOVÁ-DOUŠOVÁ H, PRASIL O, BEHRENFELD MJ (2003): Photoacclimation of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to natural light fluctuations simulating vertical mixing. Journal of Phycology. Submitted. JEFFREY SW, HUMPHREY GF (1975): New spectrophotometric equations for determining chlorophylls a, b, c1 and c2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochemie und Physiologie der Pflanzen. 167: 191-194 LEWITUS AJ, CARON DA, MILLER KR (1991) Effects of light and glycerol on the organization of the photosynthetic apparatus in the facultative heterotroph Pyrenomonas salina (Cryptophyceae). Journal of Phycology. 27 (5): 578-587 MAGNUSSON G (1997) Diurnal measurements of Fv/Fm used to improve productivity estimates in macroalgae. Mar Biol 130: 203-208 MARŠÁLEK B (2002) Sinice a jejich toxiny. http://www.sinice.cz/. TRTILEK M, KRAMER DM, KOBLIZEK M, NEDBAL L (1997): Dualmodulation LED kinetic fluorometer. Journal of Luminiscence. 72-74: 597-599 ODUM EP (1977) Základy ekologie. Transl. R.Obrtel a kol. Academia. Prague. PITHART D (1995): Ecological study of Cryptophyceae from two pools in the Lužnice River floodplain. Dissertation, Institute of Botany, Czech Academy of Sciences, pp.: 108 PITHART D (1997): Diurnal vertical migration study during a winter blooms of Cryptophyceae in a floodplain pool. Int. Revue ges. Hydrobiol. 82: 33-48 PITHART D, PECHAR L, MATTSON (1997): Summer bloom of Gonyostomum semen and its diurnal vertical migration in a floodplain pool. Algological Studies. 85: 119-133 REINFELDER JR, KRAEPIEL AML, MOREL FMM (2000): Unicellelar C4 photosynthesis in a marine diatom. Nature 407: 996-999 ROHÁČEK K, BARTÁK M (1999) Review: Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynth. 37 (3): 339-363 SOMMER U, GLIWITZ ZM (1986) Long range vertical migration of Volvox in tropical lake Cahora Bassa (Mozambique). Limnol.Oceanogr. 18(1): 15-30 WALKER D (1987): The use of the oxygen electrode and fluorescence probes in simple measurements of photosynthesis. Oxygraphics Limited. Great Britain.
27
Příloha 1. Vybrané charakteristiky a parametry měřené pomocí variabilní fluorescence chlorofylu. Název
Charakteristika
Význam
Způsob měření
relativně neměnná, reakční centra PSII jsou otevřená (qP=1)
zhruba odráží množství RC PSII a světlosběrných pigmentů
slabé měřící záblesky, které nezpůsobují aktinický efekt
dochází k uzavření všech reakčních center (qP=0)
zhruba odráží množství aktivních RC PSII a světlosběrných pigmentů
působením jednoho (single turnover, ST) nebo více silných saturačních záblesků (multiple turnover, MT)
rozdíl maximální a bazální fluorescence, kapacita
FV = FM − F0
zůstává relativně konstantní dokud se podmínky nezmění (qP>0, qN>0)
minimální fluorescence při konstantním aktinickém světle
F0 základní (minimální) fluorescence FM maximální fluorescence FV maximální variabilní fluorescence FS steady-state fluorescence
Symbol
ФP0
F0, FM, FV
všechny nefotochemické procesy v thylakoidní membráně jsou minimalizovány (qN=0)
F0’, FM’, FV’
všechny aktivní nefotochemické procesy jsou optimalizovány pro dané světlo (qN>0)
Název maximální kvantový výtěžek fotochemické přeměny energie na PSII poměr Fv/Fm
Фp
qP
vzorky adaptované na tmu
FV′ = FM′ − F0′
vzorky adaptované na světlo
Význam
je určen množstvím aktivních (otevřených) RC PSII, redoxním stavem plastochinonového poolu
ukazuje efektivitu s jakou je organismus v dané chvíli schopen využít dopadající energie
Φ P0 =
FV F = 1 − 0 ;0 < Φ P 0 < 1 FM FM
udává účinnost s jakou se dopadající energie přeměňuje na fotochemickou, jaké množství zachycené energie bylo využito ve fotosyntéze
ΦP =
FV′ F′ = 1 − 0 ;0 < Φ P < 1 FM′ FM′
Φ2 =
FM′ − FS ∆F = qP Φ P = FM′ FM′
efektivní kvantový výtěžek fotochemické přeměny energie na PSII
efektivní kvantový výtěžek fotochemické přeměny energie na PSII při dané ozářenosti fotochemické zhášení variabilní fluorescence
+ déle trvající aktinické světlo
Charakteristika
poměr Fv’/Fm’
Ф2
slabé měřící záblesky, které nezpůsobují aktinický efekt
Vzorec
0 ≤ Φ2 <1 informuje o procesech fotochemických
vyjadřuje relativní počet „zavřených“ RC PSII
28
qP =
FM′ − FS ∆F F − F0′ = 1− S = FV′ FV′ FM′ − F0′
0 ≤ qP < 1
qN
nefotochemické zhášení variabilní fluorescence
informuje o proceses, které zapříčiňují, že FM’ je menší než FM
vyjadřuje relativní množství nefotochemických procesů účastnících se nezářivé disipace excitonů – tepelná dissipace, xantofylový cyklus, state-transitions
29
qN =
FV − FV′ F′ F ′ − F0′ = 1− V = 1− M FV FV FM − F0
0 ≤ qN ≤ 1
Příloha 2. Záznam z měření fluorescenčních parametrů pomocí PAM. MR – měřící světlo, AR – aktinické světlo, FR – červené relaxační, SP – saturační puls. Převzato z Roháček a Barták 1999.
30
Příloha 3. Použité zdroje aktinického světla pro použití stojanu na kyvety k měření fluorescenčních PI křivek.
Stojan po osazení modrými LED světly.
31
Příloha 4. Porovnání absorbčních a excitačních spekter. Cryptomonas marssonii
Absorbance a Fluorescence
1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 400
450
500
550
600
vlnová délka (nm)
Chlamydomonas reinhardtii
Absorbance a Fluorescence
1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 400
450
500
550
vlnová délka (nm)
32
600
Příloha 5. Protokol k měření F0, FM(ST) a FM(MT).
;Qa-reoxidation, ST and MT protocol, blue measuring light MeasuringFlash=6us ActinicFlash=35us MeasurDelay=4us AuxDuration=1s PreFlash=10us include default.inc ; Include standard options, don't remove it ! M_Voltage=100 ; Intensity of measuring flash F_Voltage=100 ; Intensity of saturation flash A_Voltage=50 ; Intensity of actinic light ;********************************************************************* first=100us second=177.827941003892us stop=5s k=<200us,400us..800us> ; Define Fo measurment i=1ms j=i+[first,second..stop] ; Reoxidation Kinetics
=>F1,F2(ActinicFlash) k|j=>bm1
; Actinic Flash
; Measurement ST
l=k+stop n=stop+<1000us,1200us..1s> <stop+i>=>A2 l|n=>mbm1sub
; Measurement MT
33
