MEKANISME INFEKSI DAN IDENTIFIKASI DUA ISOLAT Rhizoctonia spp. PENYEBAB HAWAR DAUN PADA Toona sureni MUHAMMAD ALAM FIRMANSYAH

MEKANISME INFEKSI DAN IDENTIFIKASI DUA ISOLAT Rhizoctonia spp. PENYEBAB HAWAR DAUN PADA Toona sureni

MUHAMMAD ALAM FIRMANSYAH

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2005

SURAT PERNYATAAN Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa segala pernyataan dalam tesis ini yang berjudul: Mekanisme Infeksi dan Identifikasi Dua Isolat Rhizoctonia spp. Penyebab Hawar Daun pada Toona sureni merupakan gagasan atau hasil penelitian tesis saya sendiri dengan bimbingan dari komisi pembimbing saya, kecuali yang dengan jelas ditunjukkan rujukannya. Tesis ini belum pernah diajukan untuk memperoleh gelar pada program sejenis di perguruan tinggi lainnya.

Semua data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan secara jelas dan dapat diperiksa kebenarannya.

Bogor, Desember 2005

Muhammad Alam Firmansyah E05102025.1

ABSTRACT Muhammad Alam Firmansyah. The Identification and Infection Mechanism of Two Isolates of Rhizoctonia spp. Causing Leaf Blight on Toona sureni. Under Supervision of Achmad as chairman and Bonny Poernomo Wahyu Soekarno, and Arief Budi Witarto as member. The study on the infection mechanism of two isolates of Rhizoctonia spp. that cause leaf blight disease on Toona sureni was conducted to measure the disease intensity and percentage of leaf damages that controlled by tannin. Two Rhizoctonia spp isolates were identified to know the species. The enzyme activities of both isolates were assayed by DNS and Bernfeld method. Than both isolates were induced on the T. sureni leaves by smearing the pathogen solution which consists of Potato Broth Media and 106/ml pathogen’s hyphae. Tannin solution with concentration of 0,5%, 1%, 2%, 3% and control (water) were sprayed on the leaves surface every two days. The percentage of disease sign on the leaves was measured every two days for one month. This study applied a factorial experimental design. All tannin solution treatments seem to have effects on reducing disease intensity and leaf death percentage. No poisonous impacts on the seedling were observed. The highest tannin concentrations which reduce disease activity were 3% for both isolates. It reduced disease by stopping the fungal enzymatic activity of cellulolitic and pectinolitic. The highest increasing of disease intensity and the percentage of leaf death was found in the control treatment. The worst damage of the leaves was caused by Mamay’s isolate. Key words : Toona sureni, Rhizoctonia spp. Isolates, Enzymatic activity, Tannin

ABSTRAK Muhammad Alam Fir mansyah. Mekanisme Infeksi dan Identifikasi Dua Isolat Rhizoctonia spp. Penyebab Hawar Daun pada Toona sureni. dibimbing oleh Achmad, sebagai ketua, Bonny Poernomo Wahyu Soekarno, dan Arief Budi Witarto sebagai anggota. Penelitian tentang mekanisme infeksi dua isolat Rhizoctonia spp. yang menyebabkan penyakit hawar daun pada Toona sureni dilakukan dengan menghitung intensitas penyakit dan persentase kerusakan daun yang dapat dikendalikan oleh tanin. Dua isolat Rhizoctonia spp diidentifikasi untuk mengetahui sampai tingkat spesies. Aktivitas enzim kedua isolat kemudian diuji dengan menggunakan metode DNS dan Bernfeld. Kenudian kedua isolat diinokulasi dengan cara dioles pada permukaan daun. Larutan patogen yang dioles mengandung Media Kentang Cair dengan ka ndungan hifa 106/ml. Larutan tannin dengan konsentrasi 0,5%, 1%, 2%, 3% dan 0% (sebagai kontrol) disemprotkan pada permukaan daun T.sureni setiap dua hari sekali. Persentase tanda penyakit pada permukaan daun kemudian dihitung setiap dua hari sekali selama satu bulan. Penelitian ini menggunakan rancangan percobaan faktorial dalam waktu. Semua perlakuan tanin menunjukkan perbedaan nyata terhadap intensitas penyakit dan berpengaruh terhadap penghambatan intensitas penyakit. Tidak ada efek racun akibat tanin pada persemaian yang diiamati. Konsentarasi tanin terbesar dalam penghambatan penyakit adalah konsentrasi tanin 3% pada perlakuan kedua isolat. Tanin menghambat penyakit dengan cara menghambat aktivitas enzim selulase dan pektinase fungi. Intensitas penyakit terbesar ditemukan pada perlakuan kontrol yang diolesi penyakit. Intensitas terbesar disebabkan Isolat I. Kata Kunci: Toona sureni, Rhizoctonia spp., Aktivitas Enzim, Tanin

MEKANISME INFEKSI DAN IDENTIFIKASI DUA ISOLAT Rhizoctonia spp. PENYEBAB HAWAR DAUN PADA Toona sureni

MUHAMMAD ALAM FIRMANSYAH

Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Pengetahuan Kehutanan

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2005

JUDUL

: Mekanisme

Infeksi

dan

Identifikasi

Dua

Isolat

Rhizoctonia spp. Penyebab Hawar Daun pada Toona sureni NAMA

: MUHAMMAD ALAM FIRMANSYAH

NRP

: E05102025 1.

Menyetujui : 1. Komisi Pembimbing,

Dr. Ir. Achmad, MS Ketua

Dr. Ir. Bonny Poernomo W.S. MSi Anggota

Dr. Arief Budi Witarto, M.Eng. Anggota Mengetahui,

2. Ketua Program Studi Ilmu Pengetahuan Kehutanan

3. Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Dede Hermawan, MSc

Prof. Dr. Ir. Syafrida Manuwoto, MSc

Tanggal Ujian : 28 November 2005

Tanggal Lulus : 28 Desember 2005

PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan ke -khadirat Allah SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tulisan ini. Penulis menyadari bahwa tesis ini tidak akan selesai tanpa dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada : 1. Dr. Ir. Achmad, MS, Dr. Ir. Bonny Poernomo Wahyu Soekarno, MSi, dan Dr. Arief Budi Witarto, M.Eng atas kesabaran dan bimbingannya selama ini. 2. Dr. Ir. Abdul Munif, MSc.Agr selaku penguji luar komisi yang telah memberikan saran dan masukannya. 3. Direktorat Pembinaan Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional atas donasinya pada penelitian saya. 4. Pimpinan Laboratorium Patologi Hutan, Fakultas Kehutanan, Ir. Elis Nina Herliyana, MSi, dan Laboratorium Mikologi Proteksi Tumbuhan, Fakultas Pertanian, Dr. Ir. Widodo atas segala dorongan dan bimbingannya selama penelitian. 5. Pak Kosim, bu Yunik, mba Peppy, mba Emi, mba Ika, mba Eliza, Isti, Tyas, Ola, Ayu, Iik, Simon, Deni, Nanang, dan semua anggota lab.mikologi yang telah membantu proses penelitian selama di labarotorium mikologi. 6. Pak Budi, bu Ekowati, mas Hadi, mas Irwan, bu Eni dan bu Rina atas diskusidiskusi ilmiah dan ”gemblengan” mental selama di LIPI.

7. Lucy, Anang, Aka, Ope, Lendi, Jenal, Bu Tutin, Litta, Uswah, Ika, Iqbal, Oemar, pak Awan, dan teman-teman LIPI dan Lab Patologi hutan atas persahabatan hangat dan bantuan teknisnya. 8. Pak Fajar Ade Putra, pak Deni, pak Didin, pak Jaenuri, Syarif, Ridwan, dan Agus atas persahabat ”spiritualnya”. 9. Pak Nanang Imam Firdaus, Farid Muliana, dan Abduh, yang telah ”memperlancar” proses analisis data dan ujian akhir. 10. Rekan-rekan mahasiswa jurusan IPK, Ento-fito dan teman-teman yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah membantu dalam penelitian ini. Semoga tulisan ini menjadi amal sholeh atas pengorbanan ayahanda saya yang saya cintai sampai saya kelak menutup mata , almarhum Abdul Halim Adam yang telah mengorbankan waktu dan tenaganya sampai hembusan nafasnya yang terakhir, ibu yang terus berdo’a, mendorong dan memberi semangat, Bang Agam, dan Mia. Mudah-mudahan Allah membalas dengan kebaikan dan kasih sayangNya . Penulis mengharapkan semoga tulisan ini bermanfaat bagi penulis sendiri dan juga bagi yang memerlukan. Penulis berharap saran dan kritikan yang membangun atas segala kekurangan tulisan ini.

Bogor, 12 Desember 2005

Penulis

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor, Jawa Barat pada tanggal 18 November 1979 dari ayah Abdul Halim Adam (alm) dan ibu Pony Rohaya. Penulis merupakan putra kedua dari tiga bersaudara. Pendidikan sarjana ditempuh di Jurusan Konservasi Sumberdaya Hutan, Fakultas Kehutanan, Institut Pertanian Bogor dan lulus sebagai lulusan terbaik Fakultas Kehutanan pada tahun 2002. Pada tahun 2002 penulis diterima di Program Studi Ilmu Pengetahuan Kehutanan pada Sekolah Pascasarjana IPB. Penulis bekerja di Yayasan ILNA sejak tahun 2001 dan bekerja sebagai dosen honorer di IPB sejak tahun 2003.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL .............................................................

vii

DAFTAR GAMBAR .........................................................

viii

DAFTAR LAMPIRAN.......................................................

ix

PENDAHULUAN Latar Belakang ..........................................................................

1

Tujuan Penelitian ......................................................................

2

Manfaat Penelitian....................................................................

3

Hipotesis....................................................................................

3

TINJAUAN PUSTAKA Toona sureni Merr. ...................................................................

4

Rhizoctonia solani Kuhn ...........................................................

5

Siklus Hidup Rhizoctonia solani Kuhn.....................................

6

Mekanisme Serangan Patogen..................................................

7

BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Percobaan............................... ...................

10

Penyediaan Inokulum Fungi.....................................................

10

Identifikasi Fungi......................................................................

11

Aktivitas Selulolitik dan Pektolitik Fungi Patogen...................

11

Optimasi Enzim.........................................................................

12

Uji Mekanisme Infeksi Secara Umum......................................

13

HASIL PENELITIAN Identifikasi Penyebab Penyakit.................................................

17


19

Optimasi Enzim.........................................................................

20

Uji Mekanisme Infeksi..............................................................

23

PEMBAHASAN Identifikasi Penyebab Penyakit.................................................

31


32

Uji Mekanisme Infeksi..............................................................

33

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan...................................................................................

37

Saran..........................................................................................

37

DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN

DAFTAR TABEL No.

Uraian

Halaman

1. Katagori Tingkat Infeksi ...................................................................

14

2. Tabel Besarnya Nilai Intensitas Serangan (%) Pada Kelompok Perlakuan Tanpa Olesan Isolat Patogen Pada Berbagai Konsentrasi Tanin..................................................................................................

25

3. Tabel Besarnya Nilai Intensitas Serangan (%) Pada Kelompok Perlakuan Olesan Isolat I Patogen Pada Berbagai Konsentrasi Tanin..................................................................................................

26

4. Tabel Besarnya Nilai Intensitas Serangan (%) Pada Kelompok Perlakuan Olesan Isolat II Patogen Pada Berbagai Konsentrasi Tanin..................................................................................................

28

5. Sidik Ragam Pengaruh Inokulasi (A), Konsentrasi Tanin (B), Waktu (C), Interaksi A&B, Interaksi A&C, Interaksi B&C, Interaksi Ketiganya (ABC), Serta Interaksi Ketiganya dengan Ulangan Terhadap Intensitas Serangan Penyakit Hawar Daun pada Akhir Pengamatan.......................................................................................

30

DAFTAR GAMBAR No. 1

Uraian

Halaman

Perkembangan Miselia Isolat I. A. minggu ke -1; B. minggu ke-3..................................................................... .........

17

2

Perkembangan Miselia Isolat II. Minggu ke -1..............................

18

3

Hifa Patogen Di bawah Mikroskop dengan Perbesaran 1000x. Anak Panah Hijau Menunjukkan Sel Monilloid, Anak Panah Merah Menunjukkan Penggentingan pada Percabangan, dan Anak Panah Hitam Menunjukkan Dinding Sel.......................

18

4

Aktivitas selulase (mmol/ml/jam)..................................................

19

5

Aktivitas pektinase (mmol/ml/jam) ...............................................

20

6

Profil Pertumbuhan Fungi pada Media Pektin dan CMC, A. Media Pektin yang Tidak Ditumbuhi Fungi; B. Media Pektin yang Ditumbuhi Fungi, Zona Bening (Tanda panah) Menunjukkan Terjadinya Degradasi Pektin Karena Aktivitas Enzim Pektinase; C. Media CMC yang Ditumbuhi Fungi; D. Media CMC yang Tidak Ditumbuhi Fungi ...................

21

7

Aktivitas selulase pada pH yang berbeda ......................................

22

8

Aktivitas pektinase pada pH yang berbeda....................................

23

9

Rumah Benih dan Benih Suren......................................................

23

10

Gejala yang Ditimbulkan pada Daun Suren yang Dioleskan Isolat (Ditandai dengan Panah Putih). Tanda Berupa Hifa Putih (Panah Merah) ......................................................................

24

Kurva Intensitas Serangan (%) Pada Kelompok Perlakuan Tanpa Olesan Isolat Patogen Pada Berbagai Konsentrasi Tanin ...

26

Kurva Intensitas Serangan (%) Pada Kelompok Perlakuan Olesan Isolat I Patogen Pada Berbagai Konsentrasi Tanin ...........

27

Kurva Intensitas Serangan (%) Pada Kelompok Perlakuan Olesan Isolat II Patogen Pada Berbagai Konsentrasi Tanin ..........

28

Pertumbuhan R. solani pada Tanin dengan Berbagai Konsentrasi; A. 0%; B.0,1%; C.0,3%; D.0,5%; E. 1%; F. 2%; G. 3% .............................................................................................

36

11

12 13

14

DAFTAR LAMPIRAN

No.

Uraian

Halaman

1. Komposisi Media PDA dan Pektin (per liter) ...................................

41

2. Prosedur Uji Aktivitas Selulase.........................................................

41

3. Pengujian Aktivitas Poligalakturonase..............................................

42

4. Hasil Olah Data dengan SAS ...........................................................

43

PENDAHULUAN Latar Belakang Tumbuhan suren (Toona sureni Merr.) merupakan tumbuhan serbaguna dan memiliki potensi sosial ekonomi yang tinggi, serta memiliki kualitas kayu yang cukup baik, tahan lama, cepat tumbuh, dan pengerjaan yang mudah, dengan daur yang ditentukan selama 25 – 30 tahun. Kayu yang dihasilkan dipakai untuk bahan baku meubel, ukir-ukiran, papan hias, lantai kayu, tong minyak, kotak rokok, pensil, beberapa alat musik (Edmonds, 1993). Selain itu Heyne (1987) menyatakan bahwa jenis tumbuhan ini digunakan antara lain untuk kayu pertukangan. Manfaat lain di setiap daerah cukup beragam. Di Jawa dan Bali, kayu suren dikerjakan untuk membuat peti-peti, kotak, lemari pakaian, dan meja tulis karena memiliki warna yang menarik, yaitu warna kemerah-merahan dan berurat indah, serta berbau harum. Khusus di Semarang, kayu suren ini dipakai untuk kotak cerutu. Di Sumatera Barat banyak digunakan untuk pembuatan perahu dan papan. Di Ambon dimanfaatkan untuk kayu penyangga di bawah atap. Manfaat lainnya yang dapat diambil dari suren adalah sebagai obat tradisional. Obat-obatan tersebut dapat dimanfaatkan untuk menyembuhkan disentri, demam, obat pengelat (obat kuat), dan penyakit perut lainnya. Dengan semua manfaat tersebut, jenis ini disarankan ditanam pada pembangunan Hutan Tanaman Industri (HTI). Keberhasilan program pembangunan HTI tergantung pada beberapa faktor, di antaranya adalah penyediaan benih yang sehat dalam jumlah yang cukup. Namun dalam penyediaan benih ini ada beberapa hambatan yang perlu

diperhatikan, khususnya masalah penyakit tumbuhan. Salah satu penyakit tumbuhan pada suren adalah penyakit hawar daun. Serangan

patogen

terutama

terhadap

daun

dapat

menyebabkan

terganggunya fungsi fisiologis dari tumbuhan terutama pada fase semai dan serangan lebih lanjut dapat menyebabkan kematian. Serangan yang tidak terlalu parah dapat menyebabkan penurunan kualitas kayu atau terhambatnya pertumbuhan (Achmad, 1991). Mekanisme penyerangan patogen penting untuk dikaji karena dapat dimanfaatkan untuk memanipulasi kondisi lingkungan persemaian sehingga dapat meningkatkan ketahanan tanaman. Menurut Agrios (1997), patogen menyerang inang dengan melibatkan beberapa mekanisme, seperti tekanan mekanik, senjata kimia yang dapat berupa enzim atau toksin, atau zat pengatur tumbuh. Selanjutnya Agrios (1997) mengemukakan keterlibatan enzim-enzim pektolitik, selulolitik, dan proteolitik dalam proses infeksi penyakit daun. Kemudian gejala yang terjadi adalah terjadinya luka yang terlokalisasi pada daun inang yang menyebabkan kematian dan kerusakan sel jaringan. Perolehan informasi tentang jenis patogen yang menyerang daun benih suren, jenis serta karakteristik enzim yang dikeluarkannya merupakan langkah awal yang dilakukan untuk mengenali karakter penyakit ini. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi sampai tingkat spesies patogen hawar daun yang menyerang benih suren, menguji jenis enzim yang dikeluarkannya, mengetahui aktivitas dan karakter enzim yang dikeluarkannya, serta mekanisme umum infeksi patogen tersebut.

Manfaat Penelitian Hasil-hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi sumber informasi untuk menyusun strategi pengelolaan penyakit hawar daun benih suren di persemaian. Selain itu uji enzim yang dilakukan diharapkan mendapatkan informasi jenis dan sifat enzim yang dikeluarkan oleh patogen. Hipotesis 1.

Patogen yang menyerang suren merupakan jenis Rhizoctonia solani.

2.

Fungi patogen menghasilkan enzim selulolitik dan pektolitik sebagai mekanisme infeksi.

TINJAUAN PUSTAKA Toona sureni Merr. Suren (Toona sureni Merr.) termasuk dalam famili Meliaceae. Jenis ini dikenal dengan nama perdagangan suren. Suren terdapat hampir di seluruh daerah pulau Jawa dan Bali. Penyebaran jenis ini juga terdapat di Sumatera Barat dan Ambon (Heyne, 1987). Di penjuru dunia, penyebaran alami jenis ini selain di Indonesia terdapat juga di regional Asia Tenggara dan Asia Selatan seperti di Srilanka, India, Myanmar, Malaysia, Laos, Pakistan, Nepal, dan Philipina. Selain itu juga terdapat di bagian Timur Australia dan di daerah Pasifik yaitu di Hawaii (Edmonds, 1993). Suren berbentuk pohon dengan ukuran sedang sampai besar dan mencapai tinggi 40 – 60 meter dan di daerah pegunungan diameternya sampai 300 cm, berbatang besar dan berbanir pada bagian bawahnya. Kulit batangnya beralur dangkal, berwarna abu-abu tua sampai abu-abu kecoklatan, berbau seperti kayu cendana. Batangnya mengeluarkan getah yang tidak berbau. Tajuknya lebar, lebat dan agak gepeng setengah kerucut. Perakarannya bercabang dan terdapat dekat permukaan tanah. Biji bersayap pada kedua sisinya (Sutarno, 1996). Prosea (1997) menyatakan berat jenis rata-rata tanaman ini adalah 0,39 (0,27 – 0,67), dengan kelas awet IV/V, serta kelas kuat IV. Teras kayu berwarna merah pucat sampai coklat merah, lambat laun menjadi warna coklat merah tua dan mudah dibedakan dengan kayu gubal yang berwarna putih kelabu atau kemerah-merahan. Teksturnya agak kasar dan tidak rata, permukaannya mengkilap, kekerasan lunak sampai agak keras, serta memiliki riap tumbuh yang jelas.

Jumlah biji suren 64.000 – 468.000/kg biji. Perkecambahan suren 45% dari biji yang disimpan selama 3 bulan. Viabilitas biji biasanya tahan hanya selama 2 – 3 bulan. Perbanyakan berakar 60% pada suren yang berumur 2 – 4 tahun dari stek batang yang dirangsang dengan indolebutyric acid (IBA). Di alam suren memperbanyak diri dengan bijinya ynag bersayap dan disebarkan oleh angin. Karena bijinya halus, maka penanaman langsung tidak dianjurka n karena kemungkinan besar bijinya akan hanyut sehingga perlu disemaikan terlebih dahulu (Sutarno, 1996). Rhizoctonia solani Kuhn Morfologi hifa vegetatif merupakan dasar dalam identifikasi R. solani. Cara identifikasi yang dilakukan sebelum tahun 1970 ini kurang teliti karena banyak fungi yang mirip dengan fungi ini dianggap R. solani. Semula fungi ini dimasukkan ke dalam kelas Deuteromycetes dengan ordo Agonomycetales, tetapi hasil penelitian yang terakhir menunjukkan bahwa R. solani merupakan stadium “imperfect” fungi Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk sehingga masuk ke dalam

kelas

Basidiomycetes

dengan

ordo

Tulasnellales

dan

famili

Ceratobasidiaceae (Alexopoulos dan Mims, 1979). Alexopoulos dan Mims (1979) mengemukakan beberapa ciri khas R. solani sebagai berikut: Miselium tumbuhnya relatif cepat dan percabangan terjadi dekat dengan sel-sel hifa yang bersepta (bersekat), hifanya berwarna coklat muda sampai tua. Cabang hifa terjadi pada bagian ujung sel hifa (normal). Menghasilkan gumpalan massa hifa yang mengeras yang dinamakan sklerotium yang ukuran dan bentuk serta teksturnya hampir seragam dan berdiameter kurang dari 1 mm. R. solani Menghasilkan sel-sel moniloid dan bersifat patogenik

terhadap banyak spesies tumbuhan. Stadium “perfect” berupa fungi T. cucumeris yang termasuk kelas Basidiomycetes. Memiliki sel yang berinti banyak pada hifa yang aktif. Menurut Ogoshi (1975) ciri khas R. solani yang berdiameter hifa vegetatif 8 – 12 mikrometer; percabangan tegak lurus; pada hifa dewasa mempunyai suatu stadium perfek yaitu T. cucumeris (Frank) Donk. Menurut Agrios (1997) fungi ini mempunyai dua macam siklus hidup, yaitu siklus hidup pada tingkat “imperfect” dan tingkat “perfect”. Pada tingkat “imperfect” R. solani hanya membentuk miselia steril, sedangka n pada tingkat perfect yaitu T. cucumeris menghasilkan basidiospora yang dibentuk dalam basidium. Siklus Hidup Rhizoctonia solani Kuhn R. solani dikenal sebagai patogen yang dapat bertahan hidup di dalam tanah dalam bentuk sklerotium atau miselium dorman. Dapat juga bertahan hidup pada biji dan umbi. Dengan demikian R. solani merupakan patogen yang bersifat tular tanah dan tular benih (Walker, 1975). Sklerotium R. solani merupakan tubuh istirahat yang unsur hifanya jelas terlihat, jaringannya berupa prosenkima dengan unsur hifa yang longgar. Lamanya sklerotium bertahan hidup di dalam tanah bervariasi, bergantung pada keadaan tanahnya. Chao et al. (1986) mengemukakan, bahwa sklerotium dapat bertahan hidup pada tanah kering selama 21 bulan sedang pada tanah basah selama 130 bulan. Fungi bersifat patogenik apabila suhu tanah rendah dan virulensinya berkurang dengan meningkatnya suhu. Suhu optimum untuk terjadinya penyakit

pada kentang, buncis, kapas, dan kubis berturut -turut adalah 18oC, 17 – 23o C, dan 23o C (Walker, 1975; Chao, 1986). Anastomosis merupakan salah satu dari tiga bentuk mekanisme rekombinasi variasi formasi (Heterokaryon) pada R. solani selain reproduksi binukleat dan mutasi. Adanya variasi adalah untuk dapat memperpanjang daya tahan hidup. Anastomosis merupakan salah satu cara reproduksi aseksual yaitu terjadinya fusi antara hifa yang bersentuhan yang kompatibel atau peleburan antara hifa untuk membentuk reproduksi. Terjadi hanya diantara isolat R. solani yang sama dalam satu kelompok anastomosis (Agrios, 1997; Hawksworth et al., 1983). Bruehl (1987) selanjutnya menyatakan bahwa antara isolat yang berbeda kelompok anastomosisnya selain tidak akan terjadi anastomosis juga tidak akan terjadi pertukaran genetik. Kondisi

hifa

R.

solani

yang

bersifat

multinukleat

memberikan

kemungkinan terbentuknya heterokariosis. Hal inilah yang mengakibatkan fungi ini mempunyai keragaman genetik yang sangat besar. Variabilitas yang besar berkaitan erat dengan patogenitas, daya tahan dalam tanah, juga ekobiologi fungi tersebut. Mekanisme Serangan Patogen Patogen menyerang inang dengan melibatkan beberapa

me kanisme.

Mekanisme serangan patogen biotrof atau nekrotrof, mencakup kekuatan mekanik atau senjata struktural, enzim, toksin, zat pengatur tumbuh, keseimbangan metabolik, materi genetik, serta lingkungan ionik dan pH (Williams, 1979). Kekuatan mekanik atau senjata struktural terutama digunakan oleh patogen yang dalam proses infeksinya perlu menembus permukaan utuh inang (Brown, 1980).

Enzim-enzim hidrolitik yang menghidrolisis pektin, selulosa, lemak, dan protein menjadi monomernya, berperan dalam patogenesis. Fungi patogen nekrotrof sering mensekresikan enzim ekstraseluler yang mencukupi untuk memaserasi jaringan pada stadia infeksi lanjut. Di antara enzim hidrolitik, pektinase merupakan enzim yang dihasilkan oleh hampir seluruh fungi nekrotrof. Enzim ini memegang peranan penting dalam maserasi jaringan pada panyakit yang disertai gejala busuk lunak (Williams, 1979). Aktivitas suatu enzim hidrolitik sering didukung oleh beberapa enzim. Sebagai contoh, glukanase, glukan-selobiohidrolase (CBH), dan β-glukosidase (βG) merupakan senzim-enzim yang berperan dalam degradasi selulosa. Glukanase sendiri terdiri atas eksoglukanase dan endoglukanase (EG). Enzim-enzim pektin metil esterase (PME), poligalakturonase (PG), pektin metil galaktorunase (PMG), pektin transeliminase (PTE) dan ‘pectic acid’ transeliminase (PATE) merupakan pendukung aktivitas pektolitik (Goodman dkk 1986; Dahm dan Strzelczyk, 1987). Pada kasus yang melibatkan patogen biotrof, jaringan terinfeksi sering menjadi ‘sink’ metabolit yang mengubah arah pergerakan fotosintat dari bagian lain ke jaringan yang terinfeksi tersebut. Kondisi ini memperlihatkan terjadinya gangguan terhadap keseimbangan metabolit akibat infeksi patogen (Williams, 1979). Pada jaringan tempat terjadinya patogenesis, aspek lingkungan yang penting pada tempat terjadinya interaksi patogen – inang tersebut adalah kondisi ionik medium untuk berlangsungnya proses molekuler dalam patogenesis. Dera jat keasaman (pH) medium beserta karakteristik ioniknya merupakan hal penting

yang menentukan efektivitas aktivitas enzim, toksin, atau ZPT, yang selanjutnya mempengaruhi keberlangsungan proses infeksi (Williams, 1979).

BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Percobaan Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Kehutanan PAU IPB, Laboratorium Mikologi Departemen Proteksi Tumbuhan IPB, dan Laboratorium LIPI Bioteknologi. Penelitian berlangsung dari Januari 2004 sampai Maret 2005. Penyediaan Inokulum Fungi Fungi patogen diperoleh melalui isolasi dari inang yang terinfeksi penyakit daun. Inang yang terinfeksi berasal dari persemaian Pokpolandak milik Perum Perhutani di Cianjur. Pengambilan sampel dilakukan sebanyak dua kali pengambilan sehingga didapat dua isolat patogen. Pengambilan pertama dilakukan pada bulan Maret 2003, sementara pengambilan kedua dilakukan pada bulan Mei 2004. Patogen diisolasi dari jaringan daun benih suren yang menunjukkan gejala penyakit daun. Daun yang menunjukkan gejala penyakit dipotong persegi ukuran 0,5 x 0,5 cm meliputi bagian sakit dan sehat. Potongan tersebut dibersihkan dengan larutan natrium hipoklorit 1 % lalu dibilas tiga kali dengan air steril kemudian dikeringkan dengan kertas saring steril. Kemudian dibiakkan di dalam media PDA (Patato Dextrose Agar). Patogen yang telah tumbuh dalam beberapa hari dimurnikan kembali dengan media MA (Martin Agar ). Patogen yang telah tumbuh dalam beberapa hari dimurnikan kembali di dalam media PDA.

Identifikasi Fungi Fungi patogen yang telah tumbuh dalam beberapa hari dimurnikan kembali dan diidentifikasi. Identifikasi fisiologi fungi dilakukan dengan menggunakan buku kunci Barnet dan Ogoshi dan Sneh (1991). Proses identifikasi dilakukan dengan menggunakan mikroskop perbesaran 200x – 1000x. Sebelum diidentifikasi, fungi terlebih dahulu diwarnai dengan 2 jenis pewarna, yaitu larutan laktofenol blue dan Safranin O. Aktivitas Selulolitik dan Pektolitik Fungi Patogen Enzim merupakan salah satu senjata patogen untuk menyerang jaringan tumbuhan inang. Enzim penghidrolisis selulosa dan pektin diketahui penting perannya dalam patogenesis tumbuhan. Pada penelitian ini dianalisis aktivitas enzim-enzim selulolitik, yang diwakili oleh aktivitas FP -ase (Filter Paper -ase) atau selulase-C1, dan pektolitik, yaitu aktivitas poligalakturonase, isolat patogen. Glukosa dan asam galakturonat monohidrat berturut-turut digunakan sebagai standar pada penentuan aktivitas selulase-C1 dan poligalakturonase. Prosedur ekstrasi dan pengukuran aktivitas enzim selulolitik dan pektolitik selengkapnya berturut-turut disajikan pada Tabel Lampiran 2 dan 3. Uji lain untuk mendeteksi produksi pektinase fungi patogen dilakukan dengan menumbuhkan kedua jenis fungi tersebut pada media pektin (Atlas, 1993) dan diinkubasi selama 10 hari. Produksi pektinase ditandai antara lain oleh berubahnya warna media dari hijau kecoklatan menjadi merah.

Optimasi Enzim Metode yang digunakan untuk mengetahui nilai optimal kerja enzim umumnya terdiri dari tahapan-tahapan : A) ekstraksi, B) pengendapan, C) karakterisasi enzim secara umum. A. Ekstraksi Patogen ditumbuhkan pada media cair yang terdiri dari unsur-unsur selulosa (CMC) dan pektin. Sebagai kontrol dan perbandingan digunakan media PDB dan MEB. Enzim yang diektraksi bersifat ekstraseluler sehingga setelah 10 hari, enzim diektraksi dengan cara memisahkan media dan patogen. i. Presipitasi Presipitasi atau pengendapan merupakan proses awal dalam pemurnian enzim. Proses ini selain bertujuan untuk memekatkan enzim juga bertujuan unt uk fraksinasi komponen protein enzim berdasarkan sifat-sifat ioniknya. Untuk memisahkan partikel non enzim (contoh : media) dengan enzim maka larutan tiap sampel ditambahkan dengan garam yang dalam percobaan ini menggunakan amonium sulfat. Setiap sampel ada kandungan 20%, 40%, 60% dan 80% amonium sulfat yang dilarutkan. Kemudian masing-masing sampel dengan berbagai tingkatan konsentrasi amonium sulfat disentrifugasi 12.000 rpm selama 15 menit. Setelah disentrifugasi, maka akan terlihat dua jenis zat yang terpisah dalam bentuk pelet (padat) dan supernatan (cair). Keduanya dipisahkan. Bentuk padat (pelet) dicampur dengan 10 mM buffer fosfat sebanyak 1 ml dalam eppendorf.

C. Karakterisasi Enzim Karakterisasi dilakukan dengan memberikan perlakuan-perlakuan tertentu dari pekatan enzim. Perlakuan-perlakuan tersebut dilakukan supaya mengetahui sifat-sifat enzim yang akan dikarakterisasi. Perlakuan-perlakuan tersebut antara lain adalah pH dan suhu. Uji Mekanisme Infeksi Secara Umum Percobaan disusun dalam rancanga n acak lengkap dengan ulangan masingmasing perlakuan sebanyak 4 kali. Satuan percobaannya adalah satu benih suren yang masing-masing ditanam pada satu wadah tanam. Jumlah dari keseluruhan satuan percobaan adalah 60 benih. Benih tersebut dibagi menjadi tig a kelompok perlakuan yaitu perlakuan dengan isolat I, perlakuan isolat II dan perlakuan tanpa isolat. Masing-masing kelompok tersebut dilakukan pengujian penyemprotan tanin dengan 5 taraf yaitu 0%, 0,5%, 1%, 2%, dan 3%. Fungsi tanin sebagai zat inhibitor dari enzim selulase dan pektinase. Langkah-langkah pengujian adalah sebagai berikut : A. Pembiakan Inokulum. Biakan murni fungi kembali dibiakkan di dalam media PDB (Patato Dextrose Broth). Selama 5 hari biakan diinkubasi pada suhu ruang dan dishaker dengan kecepatan 150 rpm. B. Penghitungan Kepadatan Hifa. Setelah 5 hari, kepadatan hifa fungi dihitung dengan metode Haemacytometer. Setelah nilai kepadatan didapat, biakan diencerkan sampai kepadatannya mencapai 106/ml biakan. Kemudian larutan siap dioleskan pada permukaan daun.

C. Inokulasi Biakan. Fungi diinokulasi pada daun benih sehat dengan cara dioleskan dengan menggunakan kuas pada setiap daun pada pukul 20.00. Sebelum dioleskan biakan fungi, daun suren sehat disemprot terlebih dahulu dengan larutan tanin pada berbagai taraf. Penyemprotan ini terus dilakukan setelah dioleskan selama satu bulan setiap 2 hari sekali. Unit perlakuan ditempatkan pada bedeng yang sama dengan ukuran 3 x 6 m dan diberi atap plastik yang dilapisi dengan paranet dengan intensitas cahaya 65%. D. Pengamatan Gejala Penyakit. Gejala serangan yang diamati meliputi beberapa peubah yaitu waktu awal terbentuknya hawar sebagai awal terjadinya infeksi dan jumlah daun yang terserang. Perhitungan intensitas serangan penyakit dengan menggunakan kategori infeksi menurut Unterstenhfer (1976) yaitu seperti terlihat pada Tabel I. Tabel 1. Kategori Tingkat Infeksi (Unterstenhöfer, 1976) Skoring

Keterangan

0

Tidak ada infeksi

1

> 0 – 1/8 dari jumlah anak daun terserang penyakit hawar daun

2

> 1/8 – ¼ dari jumlah anak daun terserang penyakit hawar daun

3

> ¼ – ½ dari jumlah anak daun terserang penyakit hawar daun

4

> ½ – ¾ dari jumlah anak daun terserang penyakit hawar daun

5

> ¾ dari jumlah anak daun terserang penyakit hawar daun

Berdasarkan hasil pengelompokkan dengan cara di atas, dihitung intensitas serangan penyakit hawar daun menurut Townsend dan Heuberger (1943) dalam Unterstenhfer (1976) dengan rumus berikut :

P=

∑(n.v) ×100% N.Z

P = Intensitas serangan (%) n = Jumlah daun untuk setiap katagori v = Nilai numerik katagoris serangan N = Jumlah daun yang diamati Z = Nilai numerik untuk kategori tertinggi E. Pengukuran Suhu dan Kelembaban. Pengukuran suhu dan kelembaban pada bedeng dilakukan setiap hari pada pagi hari (pukul 06.00 – 07.00 WIB), siang (pukul 12.00 – 13.00 WIB) dan sore (pukul 19.00 – 20.00 WIB) dengan menggunakan higrotermometer. F. Analisis Data. Analisis statistik untuk penelitian ini menggunakan rancangan faktorial dalam waktu dengan rancangan lingkungan rancangan acak lengkap. Menurut Mattjik dan Sumertajaya (2002), model yang digunakan adalah sebagai berikut:

Yijkl = µ + αi + βj + αβij + δijk + ωl + γkl + αωil + βωjl + αβωijl + εijkl Keterangan : Yijkl

= Nilai respon (Intensitas serangan / daun yang mati) pada faktor Isolat taraf ke-i, faktor Tanin taraf ke-j, ulangan ke -k dan waktu pengamatan ke-l

µ

= Rataan Umum

αi

= Pengaruh faktor Isolat taraf ke -i

βj

= Pengaruh faktor Tanin taraf ke -j

αβ ij

= Pengaruh interaksi faktor Isolat taraf ke-I dengan faktor Tanin taraf ke-j

δ ijk

= Komponen acak perlakuan

ωl

= Pengaruh waktu pengamatan ke-l

γ kl

= Komponen acak waktu pengamatan

αω il

= Pengaruh interaksi faktor Isolat taraf ke -i dengan waktu pengamatan ke-l

βω jl

= Pengaruh interaksi faktor Tanin taraf ke -j dengan waktu pengamatan ke-l

αβω ijl = Pengaruh interaksi faktor Isolat taraf ke -i, faktor Tanin taraf ke-j, dengan waktu pengamatan ke-l εijkl

= Komponen acak dari interaksi waktu dengan perlakuan Selanjutnya dilakukan penghitungan dengan menggunakan sidik ragam

dan kemudian dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan. Untuk memperjelas faktor pengaruh perlakuan baik isolat, tanin, dan waktu

terhadap

intensitas

penyakit,

data

kemudian

diolah

dengan

menggunakan metode penyesuaian kurva kuadrat terkecil (least square curve fitting method) dengan mempertiumbangkan koefisiensi determinasi (r2) terbesar (Mattjik and Sumertajaya, 2002).

HASIL PENELITIAN Identifikasi Penyebab Penyakit. Hasil pengamatan secara makroskopis maupun mikroskopis terhadap kedua isolat patogen dari daun suren yang terserang penyakit, menunjukkan kalau keduanya berupa koloni yang terdiri dari serabut benang tipis. Serabut benang tipis tersebut adalah kumpulan miselia yang disebut miselium. Pada isolat I terlihat gumpalan-gumpalan kecil putih pada hari ke-3. Kemudian gumpalangumpalan tersebut berubah menjadi berwarna coklat dan menyebar tidak merata di permukaan miselium. Sementara isolat II tidak terlihat adanya gumpalangumpalan tersebut. Gambar 1 dan 2 memperjelas pengamatan secara makroskopis.

A

B

Gambar 1. Perkembangan Miselia Isolat I. A. minggu ke-1; B. minggu ke-3 Pada Gambar 1 (miselium isolat I minggu ke-1) miselium berupa gumpalangumpalan coklat kehitaman sudah terbentuk. Gumpalan-gumpalan tersebut kemudian berkembang lebih banyak dan tersebar merata di seluruh permukaan miselium. Miselium yang berwarna putih pada minggu ke -1 kemudian berubah warnanya menjadi lebih coklat pada minggu ke-3.

Gambar 2. Perkembangan Miselia Isolat II. Minggu ke-1 Miselium isolat II (Gambar 2) pada minggu ke-1 tidak membentuk gumpala ngumpalan seperti isolat I. Secara Mikroskopis (Gambar 3), kedua isolat fungi ini memiliki ciri-ciri antara lain percabangan hifa yang tampak tegak lurus, memiliki sekat (septa), tidak terdapat spora atau konidia serta tidak ditemukannya sambungan apit (clamp connection ). Selain itu ditemukan juga sel monilloid dengan perbandingan diameter : panjang, 1:1. Diameter hifa kedua isolat 3 – 17 µm dengan panjang sel 50 – 250 µm.

10 µm 10 µm

Gambar 3. Hifa Patogen Isolat II (kiri) dan Isolat I (kanan) Di bawah Mikr oskop dengan Perbesaran 1000x. Panah Hijau Menunjukkan Sel Monilloid, Panah Merah Menunjukkan Penggentingan pada Percabangan, dan Panah Hitam Menunjukkan Dinding Sel.

Aktivitas Selulolitik dan Pektolitik Fungi Patogen Hasil pengamatan menunjukkan bahwa serangan fungi pada daun suren menunjukkan adanya aktivitas selulase. Hal ini terbukti dengan terdeteksinya glukosa. Glukosa terlihat pada yang pelet diuji dengan metode filter paper-ase (FP-ase). Sebelum diuji, pelet diencerkan dengan 10 mM buffer fosfat da n didialisis. Enzim merupakan salah satu senjata patogen untuk menyerang jaringan tumbuhan inang. Enzim penghidrolisis selulosa dan pektin diketahui penting perannya dalam patogenesis tumbuhan. Hasil lengkap pengujian FP -ase dengan kadar ammonium sulfat yang berbeda ditunjukkan pada gambar berikut ini :

mmol/ml

Aktivitas Selulase 55 50 45 40 35 30

Pelet

25 20 15 10 5 0 20

40 60 % Amonium Sulfat

80

Spr natan natan

Gambar 4. Aktivitas selulase (mmol/ml/jam) Gambar 4 menunjukkan aktivitas selulase pada berbagai konsentrasi ammonium sulfat. Aktivitas selulase terbesar pada pelet terlihat pada konsentrasi ammonium sulfat 80%. Sementara aktivitas selulase terbesar pada supernatan terlihat pada konsentrasi ammonium sulfat 20 – 40%. Hal ini menunjukkan terjadinya pengendapan enzim pada pelet ketika konsentrasi ammonium sulfat sebesar 80%.

Sementara hasil lengkap pengujian aktivitas pektinase dengan kadar ammonium sulfat yang berbeda ditunjukkan pada Gambar 5.

mmol/ml

Uji Aktivitas Pektinase Pellet

300 280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

Spr natan

20

40

60

80 natan

% Amonium Sulfat

Gambar 5. Aktivitas pektinase (mmol/ml/jam) Aktivitas pektinase terbesar pada pelet terlihat pada konsentrasi ammonium sulfat 80%. Sementara aktivitas pektinase terbesar pada supernatan terlihat pada konsentrasi ammonium sulfat 20%. Hal ini menunjukkan terjadinya pengendapan enzim pada pelet ketika konsentrasi ammonium sulfat sebesar 80%. Selanjutnya untuk memisahkan enzim dengan media, dilakukan dengan mengendapkannya pada konsentrasi ammonium sulfat 80%. Optimasi Enzim B. Ekstraksi Patogen ditumbuhkan pada media CMC dan pektin. Setelah 10 hari, pertumbuhan patogen membentuk kumpulan miselia yang padat sehingga terbentuk lapisan tersendiri. Selain itu pada media pektin terbentuk lapisan yang berbeda warna sehingga ada lapisan yang terlihat transparan.

Enzim diektraksi dengan cara memisahkan media dan patogen. Profil gambar pertumbuhan patogen pada media tersebut di atas dapat dilihat pada gambar di bawah ini :

A

B

C

D

Gambar 6. Profil Pertumbuhan Fungi pada Media Pektin dan CMC, A. Media Pektin yang Tidak Ditumbuhi Fungi; B. Media Pektin yang Ditumbuhi Fungi, Zona Bening (Tanda panah) Menunjukkan Terjadinya Degradasi Pektin Karena Aktivitas Enzim Pektinase; C. Media CMC yang Ditumbuhi Fungi; D. Media CMC yang Tidak Ditumbuhi Fungi. Gambar 6 menunjukkan profil perkembangan fungi pada media pektin dan media yang mengandung CMC disertai perbandingannya pada media pektin dan media yang mengandung CMC yang tidak ditumbuhi fungi. Bagian A adalah media pektin yang tidak ditumbuhi fungi, sementara B adalah media pektin yang ditumbuhi fungi. Terlihat zona transparan pada media pektin yang ditumbuhi fungi menandakan terjadinya degradasi pektin. Bagian C adalah media yang mengandung CMC yang ditumbuhi fungi sementara bagian D tidak ditumbuhi fungi.

i. Presipitasi Presipitasi atau pengendapan enzim dengan menggunakan amonium sulfat telah dijelaskan. Pada penjelasan tersebut terlihat bahwa aktivitas enzim terbesar terlihat pada konsentrasi amonium sulfat 80% untuk kedua jenis enzim. D. Karakterisasi Enzim Karakterisasi enzim dilakuan dengan cara menguji aktivitas enzim pada berbagai tingkat pH. Pengujian didahului dengan melakukan pengendapan enzim dengan amonium sulfat 80%. Hasil yang didapat dari optimasi enzim selulase pada beberapa tingkatan pH disajikan Gambar 7 sebagai berikut: Aktifitas Selulase 10 9 8 mmol/ml

7 6 5 4 3 2 1 0 2

3

4

5

6

7

8

9

pH

Gambar 7. Aktivitas selulase pada pH yang berbeda Pada gambar tersebut terlihat aktivitas enzim selulase terus meningkat sampai kisaran pH 5. Aktivitas selulase kemudian menurun setelah melawati kisaran pH 5. Sedangkan hasil pengujian enzim pektinase pada beberapa tingkat keasaman (pH) menunjukkan bahwa aktivitas enzim pektinase meningkat tajam pada kisaran pH 3 – 5. Aktivitas enzim pektinase tertinggi dicapai pada pH 4, sementara peningkatan keasaman di atas pH 5 menyebabkan penurunan aktivitas enzim pektinase secara nyata (Gambar 8).

Aktivitas Pektinase Berdasar pH

mmol/ml

250 225 200 175 150 125 100 75 50 25 0 2

3

4

5

6

7

8

pH

Gambar 8. Aktivitas pektinase pada pH yang berbeda Uji Mekanisme Infeksi G. Pengamatan Gejala Penyakit. Pengamatan dilakukan selama 1 bulan pada rumah benih suren. Rumah benih dikondisikan sehomogen mungkin. Benih suren yang diuji dapat dilihat pada Gambar 9 berikut ini. Suren dikelompokkan berdasarkan perlakuan yang dikondisikan sehomogen mungkin.

Gambar 9. Rumah Benih dan Benih Suren.

Hasil pengamatan menunjukkan serangan hawar terjadi pada semua kelompok perlakuan. Perbedaannya terlihat jelas pada waktu timbulnya gejala dan intensitas serangan patogen (Gambar 10).

Gambar 10. Gejala yang Ditimbulkan pada Daun Suren yang Dioleskan Isolat I (Ditandai dengan Panah Putih). Tanda Berupa Miselium Putih (Panah Merah). Pada gambar 10 terlihat perkembangan penyakit yang diawali dengan timbulnya bercak kuning yang berkembang dengan cepat. Tanda penyakit berupa miselium putih pada permukaan daun terlihat dengan jelas. Bercak kuning yang ditimbulkan tersebut merupakan gejala nekrotik. Kemudian dilanjutkan dengan kematian jaringan secara cepat. Pada kelompok perlakuan yang terdiri dari 0% tanin, gejala sudah terlihat pada hari kedua dan kemudian mematikan seluruh jaringan daun dalam 2 hari. Hal ini ditandai dengan gugurnya daun tersebut. Kelompok pengujian yang tidak dioles dengan kedua isolat juga menunjukkan timbulnya gejala penyakit. Perbedaan dengan kedua kelompok lainnya adalah waktu timbulnya gejala dan intensitas serangan yang ditimbulkan oleh patogen. Kelompok pengujian yang tidak dioles oleh kedua isolat menunjukkan perkembangan intensitas penyakit yang sangat lambat dan waktu timbulnya gejala relatif lebih lama daripada kelompok pengujian yang dioles oleh kedua isolat.

H. Pengaruh Tanin Terhadap Intensitas Serangan Intensitas serangan patogen penyakit hawar daun yang menyerang suren yang tidak diolesi kedua isolat dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Tabel Besarnya Nilai Intensitas Serangan (%) Pada Kelompok Perlakuan Tanpa Olesan Isolat Patogen Pada Berbagai Konsentrasi Tanin.

Hari 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Nilai Intensitas Serangan (%) Pada Konsentrasi Tanin 0% Tanin 0.5% Tanin 1% Tanin 2% Tanin 3% Tanin 0,67 0,00 0,00 0,00 0,00 2,00 0,00 2,14 0,00 3,08 3,33 3,64 4,29 0,65 5,38 4,67 11,82 9,29 2,58 13,08 6,67 16,36 9,29 3,23 14,62 8,67 18,18 9,29 3,23 15,38 12,67 19,09 10,71 4,52 17,69 14,67 19,09 13,57 6,45 20,00 18,67 19,09 13,57 6,45 20,00 20,67 19,09 13,57 6,45 20,00 22,00 20,91 21,43 11,61 20,00 23,33 23,64 28,57 17,42 23,08 24,67 26,36 30,71 20,00 25,38 24,67 28,18 32,86 21,94 25,38 24,67 29,09 33,57 22,58 25,38

Tabel 2 menjelaskan perkembangan intensitas serangan patogen hawar daun pada suren yang tidak diolesi kedua isolat. Pada tabel tersebut terlihat adanya perkembangan penyakit yang relatif sama dari hari ke-2 pengamatan sampai akhir pengamatan untuk setiap taraf perlakuan tanin. Pada akhir pengamatan kisaran intensitas serangan untuk setiap taraf perlakuan tanin antara 24 – 34%. Pola perkembangan intensitas penyakit diperjelas dengan grafik perkembangan di bawah ini (Gambar 11). Pada gambar tersebut terlihat perbedaan intensitas yang tidak terlalu nyata di akhir pengamatan. Pola perkembangan intensitas penyakitnya pun relatif sama.

40.00 Intensitas Serangan (%)

35.00 30.00 25.00 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 0

5

10

15

20

25

30

Waktu (hari)

Gambar 11. Kurva Intensitas Serangan (%) Pada Kelompok Perlakuan Tanpa Olesan Isolat Patogen Pada Berbagai Konsentrasi Tanin. ( ) 0 % Tanin, ( ) 0,5% Tanin, ( ) 1% Tanin, ( ) 2% Tanin, ( ) 3% Tanin. Sementara intensitas serangan patogen penyakit hawar daun yang menyerang suren yang diolesi isolat I dapat dilihat pada tabel berikut ini: Tabel 3. Tabel Besarnya Nilai Intensitas Serangan (%) Pada Kelompok Perlakuan Olesan Isolat I Patogen Pada Berbagai Konsentrasi Tanin. Hari 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30


Pada Tabel 3 terlihat adanya pola penghambatan penyakit pada perlakuan tanin 3% sementara perkembangan intensitas penyakit pada perlakuan tanin 0% sangat cepat dan tinggi. Hal ini dapat diperjelas pada grafik di bawah ini (Gambar 12) dimana pada akhir pengamatan kisaran intensitas penyakitnya sangat jauh berbeda.

Intensitas Serangan (%)

80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 0

5

10

15

20

25

30

Waktu (hari)

Gambar 12. Kurva Intensitas Serangan (%) Pada Kelompok Perlakuan Olesan Isolat I Patogen Pada Berbagai Konsentrasi Tanin. ( ) 0 % Tanin, ( ) 0,5% Tanin, ( ) 1% Tanin, ( ) 2% Tanin, ( ) 3% Tanin. Pada Gambar 12 terlihat pola intensitas serangan patogen isolat I yang berbeda pada setiap taraf perlakuan tanin. Tanin dengan konsentrasi 3% sangat menghambat intensitas serangan dengan kisaran intensitas pada akhir pengamatan 25,19%. Sementara pada perlakuan yang tidak diberi tanin, intensitas serangannya di akhir pengamatan sangat tinggi yaitu 75,71%. Sementara intensitas serangan patogen penyakit hawar daun yang menyerang suren yang diolesi isolat II dapa t dilihat pada tabel berikut ini:

Tabel 4. Tabel Besarnya Nilai Intensitas Serangan (%) Pada Kelompok Perlakuan Olesan Isolat II Patogen Pada Berbagai Konsentrasi Tanin.

Hari 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30


Pada Tabel 4 terlihat adanya pola penghambatan penyakit pada perlakuan tanin 3% sementara perkembangan intensitas penyakit pada perlakuan tanin 0% sangat cepat dan tinggi. Hal ini dapat diperjelas pada Gambar 13 di bawah ini, dimana pada akhir pengamatan kisaran intensitas penyakitnya sangat jauh berbeda. 80.00 Intensitas Serangan (%)

70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 0

5

10

15

20

25

30

Waktu (hari)

Gambar 13. Kurva Intensitas Serangan (%) Pada Kelompok Perlakuan Olesan Isolat II Patogen Pada Berbagai Konsentrasi Tanin. ( ) 0 % Tanin, ( ) 0,5% Tanin, ( ) 1% Tanin, ( ) 2% Tanin, ( ) 3% Tanin.

Pada Gambar 13 terlihat pola intensitas serangan patogen isolat II yang berbeda pada setiap taraf perlakuan tanin. Tanin dengan konsentrasi 3% sangat menghambat intensitas serangan dengan kisaran intensitas pada akhir pengamatan 6,09%. Sementara pada perlakuan yang tidak diberi tanin, intensitas serangannya di akhir pengamatan sangat tinggi yaitu 75%. Berdasarkan hasil pengolahan data yang telah dilakukan, diketahui bahwa faktor inokulasi (A) dengan cara pengolesan berpengaruh sangat nyata terhadap intensitas serangan penyakit hawar daun yang ditimbulkan. Sedangkan faktor penyemprotan tanin (B) pada berbagai konsentrasi juga berpengaruh sangat nyata terhadap penghambatan intensitas penyakit. Pengaruh waktu (C) juga memberikan penga ruh sangat nyata terhadap perkembangan intensitas penyakit. Interaksi ketiga faktor (A, B, dan C) atau interaksi dua faktor (A dengan B, A dengan C, atau B dengan C) semuanya berpengaruh sangat nyata terhadap intensitas penyakit. Hal ini membuktikan bahwa semua perlakuan memberikan suatu pengaruh yang sangat nyata terhadap perkembangan intensitas penyakit. Pengaruh tersebut dapat berupa penghambatan atau peningkatan intensitas penyakit. Hal ini diperjelas dengan tabel sidik ragam di bawah ini (Tabel 5).

Tabel 5. Sidik Ragam Pengaruh Inokulasi (A), Konsentrasi Tanin (B), Waktu (C), Interaksi A&B, Interaksi A&C, Interaksi B&C, Interaksi Ketiganya (ABC), Serta Interaksi Ketiganya dengan Ulangan terhadap Intensitas Serangan Penyakit Hawar Daun pada Akhir Pengamatan Sumber Keragaman

DB

Jumlah Kuadrat

Kuadrat Tengah

F Hitung

Pr > f

Faktor inokulasi (A)

2

23814.62914867

11907.31457433

419.47

0.0001

Faktor konsentrasi Tanin (B)

4

59474.74644289

14868.68661072

523.80

0.0001

Faktor interaksi antara A dan B (A*B)

8

36076.75419244

4509.59427406

158.86

0.0001

Pengaruh ulangan (R) terhadap interaksi (A*B)

45

34367.23227333

763.71627274

26.90

0.0001

14

73844.03822733

5274.57415910

185.81

0.0001

Pengaruh Waktu (C) R(C) 42

1773.51225622

42.22648229

1.49

0.0271

Faktor interaksi A dan C (A*C)

28

6736.18882800

240.57817243

8.48

0.0001

Faktor interaksi B dan C (B*C)

56

12228.38233711

218.36397031

7.69

0.0001

Faktor interaksi A, B, dan C (A*B*C)

112

6737.62734756

60.15738703

2.12

0.0001

588

16691.23067044

28.38644672

899

271744.34172400

Error

Total

. Selanjutnya hasil uji jarak berganda Duncan semakin memperjelas pengaruh faktor isolat, tanin, dan waktu.

PEMBAHASAN Identifikasi Penyebab Penyakit. Berdasarkan hasil pengamatan secara makroskopis yang meliputi gejalagejala dan tanda yang timbul pada tanaman inang dan pertumbuhan kolaninya di media PDA yang menghasilkan kumpulan benang tipis putih maka patogen ini dimasukkan kedalam kingdom Fungi. Kumpulan benang tipis putih tersebut dinamakan juga miselium. Menurut Agrios (1988), tubuh jamur disebut miselium, dan cabang-cabang tunggal atau filamen dari miselium disebut hifa. Beberapa jenis jamur diameter hifanya hanya 0,5 µm, sedangkan jamur yang lain tebalnya dapat lebih dari 100µm. Panjang miselium pada beberapa jenis jamur hanya beberapa mikrometer, tetapi ada jenis jamur lain yang dapat menghasilkan benang miselium sepanjang beberapa meter. Secara mikroskopis, fungi ini termasuk sub divisi Deuteromycotina. Penentuan sub divisi ini dasarkan pada sifat miselium yang mempunyai sekat atau septa, tidak ditemukannya struktur dan organ reproduksi seksual, dan tidak ada sambungan apit. Lebih jauh lagi, fungi ini diketemukan tidak diketahui atau tidak biasa membentuk spora seksual dan aseksual. Berdasarkan ciri-ciri tersebut maka fungi ini dikelompokkan kedalam kelas Agonomycetes, bangsa Agonomycetales. Dua genus yang penting dalam kelas ini adalah Rhizoctonia dan Sclerotium (Agrios, 1988; Semangun, 1996). Penampakkan makroskopis yang penting dari kedua kelas ini adalah terbentuknya gumpalan-gumpalan kecil putih yang kemudian berubah menjadi berwarna coklat dan menyebar tidak merata di permukaan miselium. Gumpalan-gumpalan tersebut dinamakan juga sklerotium.

Pengamatan lebih jauh secara mikroskopis menunjukkan kalau kedua isolat fungi ini dimasukkan kedalam jenis Rhizoctonia solani. Ciri-cirinya ditunjukkan dengan ditemukannya percabangan hifa yang tampak et gak lurus dengan penggentingan cabang pada pangkal cabang, ditemukannya sel monilloid dengan perbandingan diameter : panjang, 1:1. Diameter hifa kedua isolat 3 – 17 µm dengan panjang sel 50 – 250 µm Sneh B., Burpee L., dan Ogoshi A. (1994). Selanjutnya mereka juga menjelaskan bahwa R solani tidak harus menghasilkan sklerotium. Pernyataan ini menguatkan penggolongan isolat II kedalam jenis Rhizoctonia solani. Aktivitas Selulolitik dan Pektolitik Fungi Patogen Hasil

pengamatan

menunjukkan

bahwa

kedua

isolat R.

solani

menunjukkan adanya aktivitas selulase dan pektinase. Hal ini ditunjukkan dari hasil uji analisis aktivitas enzim. Salah satu cara patogen menembus jaringan inangnya adalah dengan cara menghasilkan enzim yang dapat mendegradasi dinding sel inang. Agrios (1988) menambahkan bahwa proses penetrasi oleh fungi dan tumbuhan tingkat tinggi parasit pada inang yang mempunyai penghalang hamper selalu dibantu oleh enzim yang disekresikan oleh patogen pada tempat terjadinya penetrasi, sehingga melunakkan atau melarutkan penghalang tersebut. Komponen terbesar dinding sel baik lapisan primer, sekunder, maupun lamella tengah adalah pektin dan selulosa. Sehingga untuk menembus dinding sel mutlak diperlukan enzim yang dapat mendegradasi kedua komponen tersebut. Dari hasil uji aktivitas enzim ditemukan bahwa kedua isolat menghasilkan enzim selulase dan pektinase. Kedua enzim tersebut digunakan sebagai senjata yang dapat digunakan untuk menembus dinding sel daun suren.

Uji Mekanisme Infeksi I.

Pengamatan Gejala Penyakit. Penyakit hawar daun terjadi pada semua kelompok perlakuan termasuk

kelompok yang tidak diolesi isolat. Perbedaan antar perlakuan adalah kecepatan mulai awal timbulnya gejala sampai gugurnya daun akibat terputusnya lapisan absisi pada pangkal daun. Ini me mbuktikan bahwa patogen sudah berada di alam dan sudah menginokulasi benih sebelum perlakuan diberikan. Gejala penyakit hawar daun pada suren diawali dengan menguningnya organ daun secara keseluruhan dan terjadi dengan cepat. Kemudian dilanjutkan dengan be rgugurannya daun. Menurut Agrios (1988), kejadian seperti ini dikenal dengan istilah Hawar (Blight). Agrios (1988) menambahkan bahwa penyebab penyakit ini pada umumnya disebabkan oleh jamur. Cirinya ditandai dengan nekrosis secara lokal atau nekrosis secara umum atau membunuh jaringan tumbuhan, hipotrofi, dan hipoplasia (kerdil) organ-organ tumbuhan atau keseluruhan tumbuhan, dan hiperplasia (pertumbuhan lebih) bagian tumbuhan atau keseluruhan tumbuhan. Perkembangan gejala penyakit berbeda pada setiap kelompok perlakuan. Kelompok yang tidak diolesi isolat, perkembangan gejala penyakitnya relatif sama untuk setiap taraf konsentrasi tanin (0, 0,5, 1, 2, 3%). Perkembangannya lambat dan tidak teratur. Gugurnya daun pun relatif lebih lama sejak timbulnya gejala a wal. Hal ini adalah mekanisme alami yang terjadi di alam. Sementara kelompok yang diolesi Isolat I dan II, perkembangan gejalanya relatif lebih cepat dan gugurnya daun pun relatif lebih cepat jaraknya dari awal timbulnya gejala. Rata-rata hari ke-2 sudah terlihat gejala yang cukup serius

bahkan kematian yang ditandai dengan gugurnya daun. Tetapi kecepatannya semakin berkurang seiring dengan bertambahnya konsentrasi tanin. Perlakuan konsentrasi tanin 3% adalah yang paling lama menimbulkan gejala dan kecepata nya rata -rata sama dengan kelompok perlakuan yang tidak diolesi isolat. Hasil ini membuktikan bahwa tanin dapat menghambat timbulnya gejala yang ditimbulkan oleh isolat I dan II. B.

Pengaruh Tanin Terhadap Intensitas Serangan Berdasarkan hasil pengolahan data yang telah dilakukan, semua perlakuan

menunjukkan perbedaan yang sangat nyata terhadap timbulnya intensitas penyakit. Faktor perlakuan pengolesan isolat menunjukkan perbedaan yang sangat nyata dibanding perlakuan tanpa pengolesan. Begitu juga dengan penyemprotan tanin pada berbagai konsentrasi ternyata memberikan pengaruh yang sangat nyata terhadap intensitas penyakit. Peningkatan intensitas penyakit bertambah terus seiring pertambahan waktu. Sehingga faktor waktu juga berpengaruh sangat nyata terhadap intensitas penyakit. Faktor interaksi ketiga faktor tersebut juga memberikan pengaruh terhadap intensitas penyakit. Selanjutnya dari hasil uji jarak berganda Duncan diketahui bahwa serangan isolat yang paling ganas adalah isolat I diikuti kemudian dengan isolat II. Kelompok perlakuan yang tidak diolesi penyakit tetap menimbulkan penyakit hanya jaraknya cukup jauh dengan isolat II. Inilah yang menyebabkan kurva intensitas serangan penyakit kelompok perlakuan tanpa diolesi penyakit (Gambar 10) tidak terlalu teratur. Walau diberi perlakuan tanin tetap menimbulkan penyakit karena penyakitnya sudah terbentuk sebelum perlakuan. Tetapi perkembangannya sangat lambat. Besar intensitas penyakitnya rata -rata sama dengan persentase

intensitas penyakit perlakuan tanin 2 – 3% pada perlakuan pengolesan dengan isolat I dan II. Sehingga dapat dilihat efek penghambatan tanin yang sangat nyata pada perlakuan isolat I dan II. Selanjutnya dari uji jarak berganda Duncan diketahui juga bahwa perlakuan tanin 3% adalah yang paling menghambat intensitas penyakit sehingga intensitasnya sangat rendah baik perlakuan isolat I maupun perlakuan isolat II. Sementara intensitas yang ditimbulkan kedua isolat pada perlakuan tanin 0% sangat besar. Selisih yang sangat besar ini membuktikan fa ktor penghambatan oleh tanin dalam proses mekanisme serangan awal. Agrios (1988) menjelaskan bahwa dalam proses awal serangan, patogen mensekresikan enzim, toksin, zat pengatur tumbuh, dan/atau polisakarida. Tetapi untuk merombak zat penyusun dinding sel mutlak diperlukan satu atau beberapa enzim. Selanjutnya, Achmad (1997) menemukan bahwa R. solani mensekresikan selulase-C1 dan pektinase dalam aktivitasnya pada media CMS dan media pektin. Selulase -C1 adalah salah satu senyawa enzim selulase dan menggambar kan secara umum aktivitas enzim selulase. Sehingga dapat diketahui bahwa salah satu alat bantu R. solani dalam menginfeksi inangnya adalah enzim selulase dan pektinasi. Maka apabila enzim tersebut terhambat atau tidak bekerja maka kemampuan R. solani dalam menginfeksi akan jauh berkurang. Hal ini diperkuat dengan pernyataan Porter dan Schwartz (1962) yang berhasil mengisolasi zat penghambat enzim selulase dan pektinase dari daun anggur dan setelah diteliti ternyata zat tersebut bernama tanin. Bell dkk (1962), Bell dkk (1960), Bell dan Etchells (1958) memperkuat fungsi tanin sebagai zat inhibitor enzim selulase dan pektinase

dengan mengisolasi tanin dari tanaman lain dan menguji kemampuannya dalam menghambat enzim tersebut. Tidak ada efek negatif atau efek racun yang terjadi pada ujicoba pendahuluan terhadap benih suren. Selain itu tanin juga tidak mempengaruhi pertumbuhan R. solani pada media PDA selama 10 hari. Hal ini bisa dilihat pada gambar berikut

A

B

Gambar 14.

C

D

E

F

G

Pertumbuhan R. solani Isolat II pada Tanin dengan Berbagai Konsentrasi; A. 0%; B.0,1%; C.0,3%; D.0,5%; E. 1%; F. 2%; G. 3%.

Dari Gambar 14 terlihat jelas bahwa tanin tidak mempengaruhi pertumbuhan R. solani pada media PDA bahkan setelah 10 hari. Sementara Agrios (1988) menyatakan bahwa infeksi terjadi setelah 2 sampai 4 hari setelah inokulasi ditandai dengan munculnya gejala. Hal ini diperkuat dengan hasil penelitian yang menunjukkan bahwa rata -rata gejala sudah muncul dalam 2 hari setelah inokulasi terutama pada perlakuan dengan konsentrasi tanin yang rendah.

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Dua Isolat Patogen Hawar Daun yang menyerang semai Suren yang diambil pada waktu yang berbeda memiliki cir i yang sama. Satu-satunya perbedaan adalah isolat II tidak menghasilkan sklerotium. Kedua isolat tersebut diidentifikasi secara makroskopis dan mikroskopis sebagai Rhizoctonia solani. Kedua isolat menghasilkan enzim selulase dan pektinase. Isolat yang paling ganas menyerang adalah isolat I. Tanin berfungsi menghambat intensitas penyakit. Konsentrasi tanin yang paling menghambat adalah pada konsentrasi 3%. Penghambatan terjadi pada kedua isolat. Saran Saran dari penelitian ini adalah untuk meneruskan penelitian ini dengan menggunakan tanin alami yang langsung diekstrak dari beberapa jenis daun sehingga diharapkan ditemukannya pestisida alami. Tanin tersebut diujicoba pada semai Suren yang diinokulasi penyakit. Selain itu perlu diujicoba pada jenis tanaman lain baik isolatnya maupun kemampuan tanin dalam mengkontrol penyakit yang ditimbulkan. Penelitian tentang mekanisme serangan perlu didalami untuk mengetahui proses yang terjadi ketika inokulasi, penetrasi, dan infeksi pertama kali terjadi. Perlu dikaji apa kah hanya enzim saja yang disekresikan oleh R. solani atau ada zat lain yang dikeluarkan atau modifikasi hifa yang mampu melakukan penetrasi terhadap permukaan terluar dari tumbuhan.

DAFTAR PUSTAKA

Achmad. 1991. Perlindungan Hutan. Fakultas Kehutanan. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Agrios G. N. 1988. Ilmu Penyakit Tumbuhan Edisi Ketiga (terjemahan). Gadjah Mada University Press. Bulak Sumur. Yogyakarta. Agrios G. N. 1997. Plant Pathology. 4rd ed, Academic Press. San Diego, New York, Berkeley, Boston, London, Sydney, Tokyo, Toronto. Alexopoulus C. J., dan Mims C. W. 1979. Introductory Mycology, 3rd ed. John Willey & Sons., New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore. Atlas R. M. 1993. Handbook of Microbiological Media. CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo. Bell T. A. and Etchells J. L. 1958. Pectinase Inhibitor in Grape Leaves. Botan. Gaz. 119 : 192 – 196. Bell T.A., Aurand L. W. and Etchells J. L. 1960. Cellulase Inhibitor in Grape Leaves. Botan. Gaz. 122 : 143 – 148. Bell T. A., Etchells J. L., Williams, C. F. and Porter, W. L. 1962. Inhibition of Pectinase and Cellulase by Certain Plants. Botan. Gaz. 123 : 220 – 223. Brown J. F. 1980. The infection process and host – pathogen relationship. Hlm. 238 – 253 dalam Plant Protection. JF Brown (Peny.). Australian ViceChancellors’ Committee, Melbourne. Bruehl G. W. 1987. Soilborne Plant Pathogens. MacMillan Publishing Company. New York. Chao W. L, Nelson E. B., Harman G. E., dan Hoch H. C. 1986. Colonization of the rhizosphere by biological control agent applied to seeds. Phytopathol. 76: 60 – 65. Dahm H. dan Strzelczyk E. 1987. Cellulolytic and pectolytic activity of Cylindrocarpon destructans (Zins.) Scholt. isolates pathogenic and non pathogenic to fir (Abies alba Mill.) and pine (Pinus sylvestris L.). J Phytopathol. 118: 76 – 83. Edmonds Jennifer M. 1993. The Potential Value of Toona Species (Meliaceae) as Multipurpose and Plantation Trees in Southeast Asia. Commonwealth Forestry Review Vol. 72. University of Oxford. Oxford. Goodman R. N., Kiraly Z., dan Wood K. R. 1986. The Physiology and Biochemistry of Plant Disease. Univ. Missouri Press, Colombia.

Grossmann F. 1958. Uber die Hemmung Pektolytischer Enzyme von Fusarium oxysporum f. Lycopersici durch Gerbstoffe. Naturwiss. 45, 113. Hawksworth D. L., Sutton B. C., dan Ainsworth G. C. 1983. Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi. 7th ed. Commonwealth Mycological Institute. Kew Surrey. Heyne K. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia Jilid II. Badan Penelitian dan Pengembangan Departemen Kehutanan. Jakarta. Mattjik A. A., Sumertajaya, I M., 2002. Perancangan Percobaan dengan Aplikasi SAS dan Minitab. IPB Press. Bogor. Ogoshi A. 1975. Grouping of Rhizoctonia solani Kuhn and their perfect stages. Plant Protection Research 8:93 – 103. Porter W. L., Schwartz, J. H. 1961. Probable Identity of the Pectinase Inhibitor in Grape Leaves. Journal of Food Science Vol. 26, 6, 600 – 605. Prosea. 1997. Seri Manual: Pe doman Identifikasi Jenis Kayu di Lapangan. Yayasan Prosea Bogor. Pusdiklat Pegawai dan SDM Kehutanan. Bogor. Semangun H. 1996. Pengantar Ilmu Penyakit Tumbuhan. University Press. Yogyakarta.

Gajah Mada

Sneh B., Burpee L., and Ogoshi A. 1991. Ide ntification of Rhizoctonia Species. The American Phytopathological Society. APS Press. USA. Sutarno H. 1996. Paket Modul Partisipatif: Pemberdayaan Jenis Pohon dalam Sistem Wanatani. Seri Pengembangan PROSEA 5(2).1. Prosea Indonesia – Yayasan Prosea. Bogor. Unterstenhöfer G. 1976. The Basic Principles of Crop Protection Field Trials. Pflanzenschutz-Nachricten. Bayer. Leverkusen. Germany. Vol 29 : 153 – 169. Walker J. C. 1975. Plant Pathology. Mc. Graw-Hill Book Company Inc. New York. Williams P. H. 1979. How fungi induce disease. Hlm. 163 – 179 dalam Plant Disease. An Advanced Treatise, Vol IV: How Pathogens Induce Disease. JG Horsfaal dan EB Cowling (Peny.). Academic Press, New York.

LAMPIRAN

Tabel Lampiran 1. Komposisi Media PDA dan Pektin (per liter) Patato Dextrose Agar (PDA) - Ekstrak Kentang

200,0

g

- Dekstrosa

20,0

g

- Agar

20,0

g

Pektin - Pektin

30,0

g

- Ekstrak ragi

5,0

g

- Bromtimol biru (larutan 0,1%)

1,0

ml

- CaCl2.2H 2O (larutan 10,0%)

0,6

ml

Media Czapek (CMC) - NaNO3

2

g

- KCl

0,5

g

- K2HPO4

1

g

- MgSO4.7H2 0

0,5

g

- FeSO4.7H2 0

0,01

g

- Selulosa (CMC)

10

g

- Sukrosa

30

g

- Air Destilata

1

l

Tabel Lampiran 2. Prosedur Uji Aktivitas Selulase Pengujian aktivitas FP-ase dapat mencerminkan aktivitas umum selulase. Untuk pengujiannya digunakan substrat berupa serat yang masih bersifat kristal, sehingga melibatkan aktivitas enzim C1 yang berperan sebagai pengaktif selulosa kristal menjadi selulosa reaktif.

1. Kertas saring Whatma n no. 1 digunting seberat 50 g kemudian dimasukkan ke dalam wadah dan ditambahkan 1 ml buffer sitrat (pH 5,5) serta 1 ml enzim kasar. 2. Wadah beserta isinya didiamkan pada suhu 55 o C selama 1 jam. 3. Kadar gula pereduksi terlarut ditentukan dengan metode DNS, yaitu menggunakan pereaksi DNS (dinitro salisilat), dengan prosedur berikut : a. Ke dalam tabung reaksi dituang 1 ml filtrat ditambah 3 ml pereaksi DNS. b. Tabung reaksi beserta isinya dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit sampai terbentuk warna kuning kecoklatan, kemudian didiamkan dalam suhu kamar sampai dingin. c. Absorbansinya

diukur

pada

panjang

gelombang

550

nm.

Konsentrasi gula terlarut ditentukan dengan membandingkan terhadap kurva absorbansi standar. Pembuatan kurva standar : 1. Disiapkan larutan glukosa dengan konsentrasi antara 0,05 – 0,20 mg/ml. 2. Absorbansi tiap larutan diukur pada panjang gelombang 550 nm; air destilata digunakan sebagai blanko. 3. Ditentukan persamaan linear absorbansi terhadap konsentrasi (Y = a + bX; Y = absorbansi, X = konsentrasi) dan dibuat kurvanya. Pembuatan pereaksi DNS : 1. Pereaksi DNS (3,5-asam dinitrosalisilat) sebanyak 10,6 g dan 19,8 g NaOH dilarutkan dalam 1416 ml air destilata. 2. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 306 g NaK-Tartrat dan 7,6 ml fenol yang telah dicairkan pada suhu 55 o C dan 8,3 g Na-matabisulfit. Satu unit aktivitas FP-ase didefinisikan sebagai 1 µmol glukosa (gula pereduksi) yang dihasilkan dari hidrolisis selulosa kristal (kertas saring Whatman no.1) oleh 1 ml filtrat selulase selama 1 menit, pada kondisi optimum.

Tabel Lampiran 3. Pengujian aktivitas poligalakturonase 1. Buat 1 ml sodium polypektat 0,6% (dalam Buffer sitrat 50 mM dengan pH 4,5). Kemudian inkubasi selama 3 menit pada suhu ruang. 2. Kedalam larutan sodium polypektat ditambahkan enzim kasar sebanyak 0,5 ml. Kemudian larutan ini diinkubasi selama 30 menit pada suhu 30oC. 3. Larutan ditambahkan pereaksi Bernfeld dan didihkan pada air mendidih selama 10 menit. 4. Larutan dibaca absorbansinya pada absorban 530 nm. Pembuatan Pereaksi Bernfeld : 1. 1 g 3,5-dinitrosalicylic acid dilarutkan dalam 20 ml NaOH 2 N dan 50 ml air. 2. Campur larutkan dinitrosalicylic acid dengan garam Rochele (Sodium Potasium Tartrat Monohydrate) 30 g. 3. Encerkan dengan air sampai 100 ml. 4. Larutan harus disimpan di botol gelap pada suhu 4o C. Pembuatan kurva standar : Digunakan asam galakturonat monohidrat sebagai senyawa standar, dengan kisaran konsentrasi 2,0 – 20,0 mg/ml. Perhitungan aktivitas PG (dalam µmol unit enzim/menit/g substrat) : Vs x Cst x fp x 1000 mc x ti x Mst Vs

= volume yang diambil untuk titrasi (ml).

Cst

= konsentrasi yang setara dengan pembacaan pada kurva standar

(mg/ml). fp

= faktor pengenceran

ti

waktu inkubasi. mc = bobot subsrat yang diekstraksi (g)

M st = BM standar

=

Tabel Lampiran 4. Hasil Olah Data dengan SAS General Linear Models Procedure Class Level Information Class A B C R

Levels 3 5 15 4

Values 0 1 2 0 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4

Number of observations in data set = 900 General Linear Models Procedure Dependent Variable: Y Source F Model Model 0.0001 0.0001 Error Corrected Total

DF

Sum of Squares

Mean Square

F Value

311 311

255053.11105356 255053.11105356

820.1 820.1 0646641 0646641

28.89 28.89

588 899

16691.23067044 271744.34172400

28.38644672

RR--SSqquuaare r

C.V.

Root MSE

0.938577 0.938577

32.60152

5.32789327

Source F

DF

Type I SS

Mean Square

F Value

AA 0.0001 0.0001 BB 0.0001 0.0001 A*B A*B 0.0001 0.0001 R(A*B) 0.0001 CC 0.0001 0.0001 R(C) 0.0271 A*C A*C 0.0001 0.0001 B*C B*C 0.0001 0.0001 A*B*C A*B*C 0.0001 0.0001

22

23814.62914867 23814.62914867

11907.31457433 11907.31457433

419.47 419.47

44

59474.74644289 59474.74644289

14868.68661072 14868.68661072

523.80 523.80

88

36076.75419244 36076.75419244

4509.59427406 4509.59427406

158.86 158.86

Mean

Pr >

Y

16.34246667

45

34367.23227333

763.71627274

26.90

14 14

73844.03822733 73844.03822733

5274.57415910 5274.57415910

185.81 185.81

42

1773.51225622

42.22648229

1.49

28 28

6736.18882800 6736.18882800

240.57817243 240.57817243

8.48 8.48

56 56

12228.38233711 12228.38233711

218.36397031 218.36397031

7.69 7.69

112 112

6737.62734756 6737.62734756

60.15738703 60.15738703

2.12 2.12

General Linear Models Procedure Duncan's Multiple Range Test for variable: Y NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 42 MSE= 792.48 Number of Means 2 3 Critical Range 4.639 4.878 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping A B C

Mean 22.142 17.246 9.639

N 300 300 300

A 2 1 0

Alpha= 0.05 df= 42 MSE= 792.48 Number of Means 2 3 4 5 Critical Range 5.988 6.297 6.499 6.645 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping A B

Mean 30.905 16.787

N 180 180

B 0 2

Pr >

C C C

B B B B

16.317

180

1

10.572

180

3

7.131

180

4

Alpha= 0.05 df= 42 MSE= 42.22648 Number of Means 2 3 4 5 6 7 8 Critical Range 2.394 2.518 2.598 2.657 2.701 2.737 2.765 Number of Means 9 10 11 12 13 14 15 Critical Range 2.789 2.810 2.827 2.8 42 2.854 2.866 2.875 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping A A A A B A B B C D D E D E E F F G F G G G G H I I I

Mean 29.182

N C 60 15

28.568

60

14

27.523

60

13

25.903 23.038 20.473

60 60 60

12 11 10

18.903

60

9

16.793 13.397

60 60

8 7

11.473

60

6

10.486

60

5

8.967 6.247 3.139

60 60 60

4 3 2

1.045

60

1

MEKANISME INFEKSI DAN IDENTIFIKASI DUA ISOLAT Rhizoctonia spp. PENYEBAB HAWAR DAUN PADA Toona sureni MUHAMMAD ALAM FIRMANSYAH

Recommend Documents