Matkovicsné Varga Andrea okleveles vegyész

AZ ENZIM-SZUBSZTRÁT KÖLCSÖNHATÁSOK SZEREPE A 3-FOSZFOGLICERÁT KINÁZ DOMÉNZÁRÓDÁSÁBAN

Doktori (Ph.D.) értekezés

Matkovicsné Varga Andrea okleveles vegyész

Témavezetők: Kazinczyné Vas Mária, tudományos tanácsadó, az MTA doktora Náray-Szabó Gábor, egyetemi tanár, az MTA rendes tagja Készült: Magyar Tudományos Akadémia SzBK Enzimológiai Intézetében és Eötvös Loránd Tudományegyetem Kémia Doktori Iskolájában Vezetője: Inzelt György, egyetemi tanár Szintetikus Kémia, Anyagtudomány, Biomolekuláris Kémia Doktori Program keretében Programvezető: Horváth István Tamás, egyetemi tanár

Budapest, 2006

TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS

1

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

2

2.1. A FEHÉRJE SZERKEZETI DOMÉNEK FOGALMA ÉS JELENTŐSÉGÜK A FEHÉRJÉK MŰKÖDÉSÉBEN 2.2. A PGK MINT A DOMÉNSZERKEZETŰ FEHÉRJÉK EGYSZERŰ MODELLJE 2.3. A KATALIZÁLT ENZIMREAKCIÓ ÉS A PGK SZEREPE AZ ÉLŐ SZERVEZETBEN 2.4. A SZUBSZTRÁTOK KÖTŐDÉSI MÓDJA 2.4.1. A 3-PG kötőhely 2.4.2. Az 1,3-BPG lehetséges kötődési módja 2.4.3. A nukleotid kötőhely 2.4.4. A Mg2+ szerepe és feltételezett kötőhelye 2.5. A SZUBSZTRÁTKÖTŐDÉS DISSZOCIÁCIÓS ÁLLANDÓI, KÖTŐDÉSI ANTAGONIZMUS 2.6. A SZUBSZTRÁTOK HATÁSA AZ ENZIM KONFORMÁCIÓJÁRA 2.6.1. Szubsztrátok védőhatása az enzim kémiai módosításával szemben 2.6.2. NMR mérések a szubsztrátok enzimkonformáció-változtató hatásának vizsgálatára 2.6.3. Fluoreszcencia illetve foszforeszcencia mérések 2.6.4. A szubsztrátok enzimkonformáció-változtató hatásának összehasonlítása 2.6.5. Az enzimet különböző konformációban tartalmazó kristályszerkezeti adatok összevetése 2.6.6. A molekula alakját jellemző kisszögű röntgen-, illetve neutronszórási mérések 2.7. A KINETIKAI REAKCIÓMECHANIZMUS 2.8. ANIONOK AKTIVÁLÓ HATÁSA A PGK ÁLTAL KATALIZÁLT ENZIMREAKCIÓRA 2.9. A MŰKÖDÉS SZERKEZETI ALAPJAI: MOLEKULÁRIS CSUKLÓK ELHELYEZKEDÉSE A PGK

2 3 5 8 8 11 12 15 16 18 18 19 20 20 21 22 23 25

MOLEKULÁBAN

26 28

2.10. A DOMÉNEK EGYÜTTMŰKÖDÉSE 3. CÉLKITŰZÉS

31

4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

33

4.1. ANYAGOK 4.2. MÓDSZEREK 4.2.1. A fehérjeoldatok koncentrációjának meghatározása 4.2.2. A szubsztrátok koncentrációjának meghatározása

33 35 35 35

4.2.2.1. Az ADP koncentrációjának meghatározása 4.2.2.2. Az ATP koncentrációjának meghatározása 4.2.2.3. A 3-PG koncentrációjának meghatározása 4.2.2.4. Az 1,3-BPG koncentrációjának meghatározása

35 36 36 36

4.2.3. A PGK enzimaktivitásának meghatározása 4.2.3.1. 3-PG és MgATP szubsztrátokból kiinduló enzimreakció 4.2.3.2. 1,3-BPG és MgADP szubsztrátokból kiinduló enzimreakció

4.2.4. A PGK enzimkinetikai vizsgálata és az alkalmazott kinetikai egyenletek 4.2.4.1. Az aktivitás szubsztrátkoncentráció-függésének meghatározása 4.2.4.2. Anionok hatásának vizsgálata 4.2.4.3. Két gátlószer együttes hatásának vizsgálata

4.2.5. A PGK-ligandum kölcsönhatások egyensúlyi vizsgálata 4.2.5.1. Izotermális titráló mikrokalorimetria (ITC) 4.2.5.2. Kémiai módosítás közvetett módszere

4.2.6. Az enzimszerkezet stabilitásának vizsgálata 4.2.6.1. Differenciális pásztázó mikrokalorimetria (DSC) 4.2.6.2. Fluorimetria 4.2.6.3. CD-spektroszkópia

4.2.7. Molekuláris grafikai analízis

37 37 37

38 38 39 40

41 41 41

44 44 46 47

47

4.2.7.1. Atomi kölcsönhatások analízise 4.2.7.2. Ligandumkötés modellezése

47 48

5. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉSÜK

50

5.1. A MGADP ÉS MGATP ELTÉRŐ KÖTŐDŐDÉSI MÓDJA: A FÉMION SZEREPE 5.1.1. Kettősgátlás kísérletek nukleotid analógokkal, adenozinnal és anionokkal 5.1.2. A nukleotid kötődés jellemzése izotermális titráló kalorimetriás (ITC) kísérletekben

i

50 50 54

5.1.3. A fémion hatásának vizsgálata a PGK nukleotidkötésére pásztázó mikrokalorimetriás (DSC) módszerrel 56 5.1.4. MgATP és ATP PGK-val való kölcsönhatási módjának röntgenkrisztallográfiás meghatározása 58 5.2. AZ 1,3-BPG (INSTABIL SZUBSZTRÁT) LEHETSÉGES KÖTŐDÉSI MÓDJA: MOLEKULÁRIS MODELLEZÉS 61 5.3. ANION-ENZIM KÖLCSÖNHATÁS JELLEMZÉSE, ANIONKÖTŐHELYEK AZONOSÍTÁSA 63 5.3.1. Enzimkinetikai analízis – aktiválás és gátlás jelensége 63 5.3.2. Szubsztrátfelesleg aktiválás jelensége 67 5.3.3. Az anionok kötődésének jellemzése 69 5.3.3.1. Izotermális titráló kalorimetriás (ITC) módszerrel 5.3.3.2. SH reaktivitás közvetett módszerét alkalmazva

5.3.4. Anionok szerkezetstabilizáló hatásának vizsgálata DSC módszerrel 5.3.5. A lehetséges anionkötőhelyek azonosítása molekuláris modellezéssel 5.4. A MGATP-VEL, AZ 1,3-BPG-VEL, ILLETVE AZ AKTIVÁLÓ ANIONOKKAL KÖLCSÖNHATÓ OLDALLÁNCOK AZONOSÍTÁSA: HELYSPECIFIKUS MUTAGENEZIS 5.4.1. A Lys 215 és az Arg 38 cseréje pontmutációval és a mutánsok fizikai-kémiai jellemzése 5.4.2. A mutánsok enzimek működésének jellemzése 5.4.2.1. Szubsztráttelítési görbék meghatározása 5.4.2.2. A mutációk hatása az anionok által okozott aktiválás-gátlás jelenségre

5.5. A DOMÉN-DOMÉN KÖLCSÖNHATÁSOK JELLEMZÉSE MIKROKALORIMETRIÁVAL 5.5.1. Vad típusú enzim és a doménenként egyetlen triptofánt tartalmazó mutánsok vizsgálata

69 70

72 73 75 75 76 76 80

81 81

5.5.1.1. A vad típusú disznóizom és élesztő PGK hődenaturációja: a domének nagyfokú együttműködése 82 5.5.1.2. Az élesztő PGK mutánsainak eltérő hőstabilitása nem a domének együttműködésével áll összefüggésben 85

5.5.2. Biner és terner enzim-szubsztrát komplexek eltérő stabilitása 86 5.5.3. Doménzáródás a terner komplexben mehet végbe: inaktív CM-PGK-val végzett kísérletek 88 5.6. A DOMÉNZÁRÓDÁS MOLEKULASZERKEZETI ALAPJAI AZ ISMERT KRISTÁLYSZERKEZETEK ÖSSZEHASONLÍTÓ ELEMZÉSE ALAPJÁN 90 5.6.1. A PGK domének együttműködésének szerkezeti alapjai: a domének közötti régió vizsgálata 90 5.6.2. A szubsztrátok stabilizáló hatásának szerkezeti alapjai a biner komplexekben 92 5.6.2.1. A 3-PG stabilizáló hatásának molekuláris mechanizmusa 5.6.2.2. A MgADP és a MgATP eltérő stabilizációs hatása eltérő kötődési módjuknak köszönhető

5.6.3. A terner komplexek legnagyobb stabilitása a doménzáródásnak köszönhető 6. ÖSSZEFOGLALÁS

92 94

96 99

7. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉHEZ KAPCSOLÓDÓ KÖZLEMÉNYEK

103

8. IRODALMI HIVATKOZÁSOK

105

ii

Ábrák jegyzéke 1. ábra 2. ábra 3. ábra 4. ábra 5. ábra 6. ábra 7. ábra 8. ábra 9. ábra 10. ábra 11. ábra 12. ábra 13. ábra 14. ábra 15. ábra 16. ábra 17. ábra 18. ábra 19. ábra 20. ábra 21. ábra 22. ábra 23. ábra 24. ábra 25. ábra 26. ábra 27. ábra 28. ábra 29. ábra 30. ábra

A PGK molekula térszerkezete A PGK domén mozgásai az enzim működése során A 3-PG kötőhelyének térszerkezete, valamint az 1,3-BPG lehetséges kötődési módja A nukleotidok, illetve nukleotid analógok PGK-val való kölcsönhatása A βL konformációváltozása (A), valamint a 13-as és 14-es hélix relatív pozíciójának változása (B) a doménzáródás során Kettősgátláskísérletek különböző gátlószer-párokkal 3-PG, az 1,3-BPG, illetve analógjaik képlete Szerkezeti magyarázat a MgADP és az ATP analóg, MgAMP-PCP pirofoszfáttal szembeni különböző viselkedésére Különböző nukleotidok PGK-val való kölcsönhatásának jellemzése ITC módszerrel A nukleotidok hatása a PGK hődenaturációs folyamatára A PGK konformációjának összehasonlítása a különböző nukleotid komplexekben Az ATP (A ábra) és a MgATP (B ábra) kötődésének részletei A MgATP foszfátlánca kötődési módjának összevetése az ismert nukleotid-analógok (MgAMP-PNP, MgAMP-PCP), illetve a MgADP kötődési módjával Az 1-es, a 8-as, a 13-as, illetve a 14-es hélixek relatív pozíciójának megváltozása az enzimszerkezet záródása során A modellezett 1,3-BPG kölcsönhatásai a zárt aktív centrumban A pirofoszfát, a citrát és a foszfát ionok aktiváló és gátló hatása A szubsztrát 3-PG (B), a foszfát (A), valamint a citrát (C) kölcsönhatásai a 3-PG kötőhely konzervatív oldalláncaival A PGK aktivitásának szubsztrátkoncentráció függése Anionok, illetve 3-PG analógok hatása a PGK DTNB-vel szembeni módosítás sebességére A foszfát (A), illetve a 3-PG (B) modellezése a T. brucei PGK zárt konformációjú komplexébe A mutáció hatása a PGK hődenaturációjára, illetve reaktív tiol-csoportjai módosítására A Lys 215 és az Arg 38 mutációinak hatása a szubsztrátfeleslegaktiválásra a 3-PG és MgATP szubsztrátokból kiinduló reakcióban Lys 215 és az Arg 38 mutációinak hatása az 1,3-BPG és MgADP szubsztrátokból kiinduló reakcióban A pirofoszfát hatása az enzimaktivitásra a 3-PG és MgATP (A), illetve az 1,3-BPG és a MgADP (B) szubsztrátokból kiinduló enzimreakcióban A szubsztrátok hatása a sertésizom PGK hődenaturációs folyamatára A hődenaturációs görbék linearizálása A vad típusú és mutáns élesztő PGK-k hődenaturációs görbéi A domének közötti kölcsönhatások A domének közötti régió bemutatása a PGK biner komplexekben A βL, fő csukló működése a szubsztrátok egyidejű hatására

iii

4 5 10 13 27 52 53 53 55 57 58 59 60 61 63 64 66 68 70 73 76 77 78 80 83 84 84 91 95 97

Táblázatok jegyzéke 1. táblázat 2. táblázat 3. táblázat 4. táblázat 5. táblázat 6. táblázat 7. táblázat 8. táblázat 9. táblázat 10. táblázat 11. táblázat 12. táblázat 13. táblázat

Az N-domén „bázikus foltjá”-n végzett pontmutációk hatása a szubsztrátok kötődésére, illetve az enzimaktivitásra Az eddig közölt röntgenkrisztallográfiás PGK szerkezetek összefoglaló táblázata A nukleotid kötőhelyek számának meghatározása az irodalmi adatok tükrében A PGK szubsztrátjai, illetve szubsztrát-analógjainak enzimhez való kötődési állandói A helyspecifikus mutációk elvégzéséhez tervezett primerek A nukleotid kötődés disszociációs állandói és a kötődés termodinamikai paraméterei Az egyes PGK*Mg-nukleotid komplexekre jellemző „olvadási hőmérsékletek” A vizsgált anionok töltésviszonyai pH=7,5–ön A vizsgált anionok aktiváló és gátló hatását jellemző kinetikai paraméterek összefoglalása 3-PG, 1,3-BPG, analógjaik, illetve egyéb anionok tiol reaktivitás, illetve ITC titrálás módszerével meghatározott kötődési állandói (Kd) A vad típusú és a mutáns PGK-k kinetikai paramétereinek összefoglaló táblázata A disznóizom és az élesztő PGK hődenaturációjának átmeneti hőmérsékletei (Tm) és a kalorimetriás hő (Qt) értékek A disznóizom és az élesztő PGK hődenaturációs folyamatának aktiválási paraméterei

Rövidítések jegyzéke PGK [EC 2.7.2.3] GAPDH [EC 1.2.1.12] EDTA DTT CM-PGK hPGK E. coli T. brucei B. stearothermophilus T. maritima 3-PG 1,3-BPG 2,3-BPG G-3-P 2-PG 1,5-BPP AMP-PNP AMP-PCP HK G6PDH PK LDH DTNB PEP IPTG ANS TNP-ATP DSC ITC GuHCl G-6-P-L

3-foszfoglicerát kináz glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz etilén-diamin-tetraecetsav ditiotreitol karboxamidometilezett PGK humán PGK Escherichia coli Trypanosoma brucei Bacillus stearothermophilus Thermotoga maritima 3-foszfoglicerát 1,3-biszfoszfoglicerát 2,3-biszfoszfoglicerát glicerol-3-foszfát 2-foszfoglikolát 1,5-biszfoszfo-pentán β,γ-imido-adenozin-5’-trifoszfát β,γ-metilén-adenozin-5’-trifoszfát hexokináz glükóz-6-foszfát dehidrogenáz piruvát kináz tejsav dehidrogenáz 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoát) foszfoenol-piruvát izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid 8-anilino-naftalin szulfonsav 2’3’-O-(2,4,6-trinitrofenil)ATP differenciális pásztázó mikrokalorimetria izotermális titráló mikrokalorimetria guanidin-hidroklorid glükonsav-6-foszfát-lakton

iv

9 11 12 17 34 56 57 63 65 71 79 86 87

Köszönetnyilvánítás Köszönetemet fejezem ki témavezetőmnek, Kazinczyné Dr. Vas Máriának a munkám során nyújtott sokrétű és önzetlen segítségéért, útmutatásaiért. Köszönöm másik témavezetőmnek, Dr. Náray-Szabó Gábornak, hogy tanácsaival támogatta és figyelemmel kísérte munkámat. Köszönet illeti Pollnerné Dr. Flachner Beátát a kísérleti munka során nyújtott segítségéért, továbbá a fehérje kifejezés és termelés módszerének kidolgozásáért. Köszönetemet fejezem ki Dr. Kovári Zoltánnak, a röntgendiffrakciós szerkezetek megoldásáért, Dr. Osváth Szabolcsnak az élesztő PGK mutánsok előállítását, továbbá Barna Lászlónak és Gyimesi Gergelynek a molekuláris modellezés kivitelezéséért. Köszönöm Gráczer Éva és Szabó Judit kollégáimnak segítségüket és támogatásukat. Hálás vagyok az Intézet igazgatójának, Friedrich Péter akadémikusnak, hogy lehetőséget biztosított számomra, hogy kutatómunkámat a Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Központjának Enzimológiai Intézetében végezhettem. Köszönöm Závodszky Péter akadémikusnak, hogy lehetővé tette laboratóriumában a DNSszintű munkák kivitelezését és Hajdú István PhD hallgatónak e munkák során nyújtott sokoldalú segítségét. Köszönöm férjemnek, Matkovics Istvánnak a bátorítást, a türelmet és tanácsait.

v

1. BEVEZETÉS A tudomány nagy előrelépést tett azzal, hogy 2000-ben meghatározta az emberi DNS teljes bázissorrendjét. Ennek ismeretében az egyes fehérjék génjei is meghatározhatóak. Számukat kb. 80000-re várják. Ezek közül még igen sok az ismeretlen fehérje, azaz az ezeket kódoló gének jelentése még megfejtésre vár. A fehérjék azonosításában és működésének megértésében, illetve szerkezetének felderítésében ma egyre nagyobb szerep jut a különféle fizikai-kémiai és enzimológiai vizsgálatoknak. Szerkezet és működés kölcsönösen meghatározzák egymást. Adott szerkezetből következik a működés, és az adott funkció szabja meg a szükséges szerkezeti hátteret. A különböző in vitro enzimológiai vizsgálatok eredményeit tehát fontos kiegészíteni pl. a fehérjéről

készült

röntgenkrisztallográfiás

felvételekből

nyerhető

információkkal,

melyekkel együtt értelmezve teljesebb képet kaphatunk az enzimműködésről. Értekezésemben a fehérje doménszerkezet és az enzimműködés, valamint a szerkezeti stabilitás néhány kérdését, összefüggéseit vizsgáltam a glikolízis egyik enzimén, a 3-foszfoglicerát kinázon (PGK). Ez a két szerkezeti doménből felépülő tipikus kináz enzim már régen a kutatók érdeklődésének tárgya. Az élő szervezetben betöltött alapvető szerepén túlmenően széles körben modellként alkalmazzák a doménszerkezettel kapcsolatos kérdések vizsgálatára. A domének szerkezetének és együttműködésének egyre nyilvánvalóbb szerepe van az enzimműködésben. Röntgendiffrakciós adatokból tudjuk, hogy az enzimek aktív centruma általában a domének közötti mélyedésben helyezkedik el. A domének relatív elmozdulása, melyet a fehérjeszerkezet flexibilitása biztosít, ezen enzimek működésében alapvető jelentőségű. A doménzáródás során kerülhetnek a szubsztrátok reagáló csoportjai a katalízishez szükséges optimális környezetbe és megfelelő távolságra. Igen kevés információnk van azonban arról, hogy a domének közötti együttműködés molekuláris szinten pontosan hogyan is valósul meg, és hogyan vezet a katalízis által igényelt nagyléptékű doménmozgáshoz. Korábbi kutatások alapján feltételezhető, hogy a jól definiált

szerkezettel

bíró

domének

közötti

régió

biztosíthatja

a

domének

együttműködését. Értekezésemben azt a kérdést vizsgáltam, hogy a PGK esetén az enzim-szubsztrát kapcsolódás (kötődés) milyen szereppel bír a katalízishez szükséges doménzáródás elősegítésében, pl. kitüntetett hatással van-e a domének közötti régióra? Választ kerestem továbbá arra a kérdésre is, hogy a PGK működését szabályozó anionos ligandumok kötődése és a domén-mozgások milyen összefüggésben vannak? 1

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A fehérje szerkezeti domének fogalma és jelentőségük a fehérjék működésében A domének fogalma az immunglobulinok elsődleges szerkezetének tanulmányozása során merült föl először. Kutatók azt találták, hogy a könnyű és nehéz láncok több funkcionális egységből állnak, s ezeket stabil fragmensként tudták izolálni limitált proteolízist követően (1). Ezzel egyidőben fehérje krisztallográfusok egy sor kis globuláris fehérje térszerkezetét meghatározták. A szerkezetek elemzése azt mutatta, hogy a polipeptidláncok két vagy több jól elkülöníthető régióra bonthatók, melyek önálló szerkezeti és működési egységeknek tekinthetők, hasonlóan az immunglobulin doménekhez (2). A domén fogalmát később alkalmazták 300 vagy több aminosavból felépülő fehérjék esetén is. A szerkezeti adatokkal összevetve fokozatosan elfogadottá vált, hogy a domének általában 100-200 aminosavból álló szerkezeti és funkcionális működési egységei a globuláris fehérjéknek (3). Az enzimek aktív centrumai rendszerint a domének közötti mélyedésben helyezkednek el. Már az első röntgenkrisztallográfiás szerkezeti adatok ismeretében feltételezhető volt, hogy a reagáló szubsztrátok a domének összezáródása után kerülnek a reakció szempontjából optimális környezetbe, továbbá megfelelő térbeli közelségbe és orientációba. Erre ma már egy sor kísérleti példa is van (4-6). A domének záródása kizárja a vizet is az aktív centrumból, mely esetleg a szubsztrát (pl. kinázok esetén az ATP) hidrolízisét okozhatná. A domének relatív elmozdulásai tehát fontos szerepet játszanak az enzimműködésben. A doménhatárokon elhelyezkedő üregek elősegíthetik ezeket a mozgásokat, ezáltal a katalízis folyamatát (7). Azoknak a szerkezeti elveknek, ill. specifikus kölcsönhatásoknak a felkutatása is megkezdődött, melyek a doménzáródáshoz vezetnek (8-10). Már nagyon korán felismerték, hogy a doménzáródásnak gyorsnak kell lennie. Ez azt jelenti, hogy a nyitott és a zárt enzimforma között nem lehet magas energiagát. Éppen ezért a kutatók a doménmozgásokat az alacsony-energiájú konformációváltozások segítségével próbálták jellemezni (11, 12). Ezeket két csoportba osztották: elcsúszás (shear) és elfordulás (hinge). Az elcsúszó mozgást végző fehérjék általában szoros pakoltságúak, míg elfordulás olyan fehérjékben megy könnyen létre, melyekben a doméneket laza pakoltságú régiók

2

kötik össze. A csukló régiók megléte például nemcsak az elfordulásra jellemző, hisz az elcsúszás során is ilyen csukló részek kötik össze az egymáson elcsúszó rétegeket. Tulajdonképpen az különbözteti meg a két mozgást egymástól, hogy míg az elcsúszás során a határfelületek pakoltsága megmarad, elfordulás során a laza pakoltságú régiók szorosan pakolt határfelületté alakulnak. Már létezik egy adatbázis, mellyel molekuláris (domén)mozgások útját lehet szimulálni

adott

fehérjéről

rendelkezésre

álló

(eltérő

konformációs

állapotú)

krisztallográfiás szerkezetek segítségével (12). Ez a szerver képes kezelni nukleinsavakat és több láncból álló komplexeket is. Az adatbázis az utóbbi években tovább fejlődött és bővült (13-15). Jelenleg tehát képesek vagyunk a domén-mozgásokat szimulálni, azonban ezen mozgások részleteit nem tudjuk az oldallánc-kölcsönhatások szintjén leírni. Általános következtetések levonásához először egyedi esetekben kell tisztáznunk (pl. a jelen dolgozatban vizsgált PGK esetén) a domén-mozgások pontos mechanizmusát, a szubsztrátok hatását a doménmozgásokra, s a domének közötti régió szerkezetének szerepét a doménzáródásban.

2.2. A PGK mint a doménszerkezetű fehérjék egyszerű modellje A PGK viszonylag kis molekulatömegű (44,5 kDa), monomer szerkezetű, két szerkezeti doménből felépülő enzim (16), ezért alkalmas, egyszerű modellként szolgál a doménszerkezettel kapcsolatos kérdések tanulmányozására. Szekvenciája igen konzervatív (emlősök körében kb. 96%, élesztőhöz viszonyítva is kb. 60%), ami a térszerkezeti hasonlóságában is megmutatkozik. A szubsztrátkötőhelyeket alkotó aminosav oldalláncok még az eltérő eredetű PGK-k esetén is majdnem teljesen konzervatívok (17, 18). Lóizomból izolált natív PGK-ról született az első röntgendiffrakciós szerkezet 1979-ben (16). Ennek alapján állapították meg, hogy az enzim molekula szerkezetében két kb. azonos méretű domén különíthető el: a C-terminális és az N-terminális. A továbbiakban a krisztallográfusok azt is leírták, hogy az N-terminális domén a 3-PG (19), míg a C-terminális domén a MgATP (16), illetve a MgADP (20) kötésében vesz részt (1. ábra). A szerkezeti analógia alapján valószínűnek látszik az is, hogy az instabil szubsztrát, az 1,3-BPG (melyre még nincs szerkezeti adat) szintén a 3-PG kötőhelyen, az N-doménen kötődik.

3

1. ábra A PGK molekula térszerkezete Az ábrán a disznóizom PGK 3-PG-vel és a MgATP analóg MnAMP-PNP-vel alkotott terner komplexe látható (21). Az α-hélixeket piros hengerek, a β-redőket sárga nyilak jelölik.

Többféle kísérleti bizonyíték is van arra, hogy a nyitott konformációjú PGK doménjei mindkét szubsztrát jelenlétében elmozdulnak egymáshoz képest és záródnak. Tehát a katalizált foszfo-csoport átviteli reakció (ld. 2.3. fejezet) ebben a konformációban mehet végbe, ahol a szubsztrátok reagáló csoportjai megfelelő térbeli közelségbe kerülnek. Röntgenkrisztallográfiás adatokból ismert az enzimnek mind a nyitott (19, 20) mind pedig a zárt (22, 23) konformációja (2. ábra), bár az eltérő konformációjú szerkezeteket különböző eredetű PGK-k kristályosítása révén sikerült meghatározni. Kisszögű röntgenilletve neutronszórási mérések viszont ettől függetlenül bizonyították, hogy az oldatban működő enzim mindkét szubsztrát jelenlétében zárt konformációt vesz fel (4, 24) (2.6.6. fejezet). Nem tisztázott azonban, hogy a doménzáródást mindkét vagy esetleg már az egyik szubsztrát kötődése is kiváltja, továbbá, hogy milyen molekuláris történéseken keresztül zajlik a folyamat. A PGK igen alkalmas fehérje térszerkezet kialakulási- (renaturációs), illetve a fehérjelánc kitekeredési (denaturációs) folyamatainak vizsgálatára is viszonylag egyszerű, két doménből felépülő szerkezete miatt. Számos kísérletben vizsgálták meg a domének relatív stabilitását, mind a molekulából izolálva, mind a molekulán belül. A denaturációs kísérletek azonban nem adtak egyértelmű eredményt a domének relatív stabilitási viszonyáról (27, 28) (2.10. fejezet).

4

2. ábra A PGK domén mozgásai az enzim működése során Az ábrán a disznóizom PGK nyitott konformációjú terner komplexe (25), valamint a T. brucei PGK zárt konformációjú terner komplexe (26) látható. Az enzim polipeptidláncát piros szalagdiagram jelzi, a szubsztrátokat kék szín jelöli.

A domének relatív stabilitási viszonyában pedig a domének közötti együttműködés mértéke tükröződhet. Tisztázása tehát alkalmas lehet pl. olyan kérdések megválaszolására, hogy az egyik doménen kötődő szubsztrát stabilizálja-e a másik domén konformációját is. Ily módon képet kaphatunk a szubsztrátoknak a domének közötti együttműködésre gyakorolt hatásáról.

2.3. A katalizált enzimreakció és a PGK szerepe az élő szervezetben A PGK alapvető enzim minden élő sejt számára. Az univerzális energiatároló, az ATP keletkezésének folyamatát katalizálja az aerob szervezetek glikolízise, az anaerob szervezetek fermentációja során, továbbá nélkülözhetetlen a növények fotoszintéziséhez is. A glikolízisben a glükóz lebontásában vesz részt: az 1,3-biszfoszfoglicerát (1,3-BPG) savanhidrid kötésben lévő foszfo-csoportjának MgADP-re történő átvitelét katalizálja, melynek során 3-foszfoglicerát (3-PG) és MgATP keletkezik (1. egyenlet).

(1,3-BPG)

(3-PG) 1. egyenlet A PGK által katalizált reakió egyenlete

5

Az enzimreakció egyensúlyi állapotában (katalitikus enzimkoncentráció esetén) a szubsztrátos egyensúlyi elegyben a 3-PG és MgATP koncentrációja dominál (Keq=3*10-4 (29)), mert a reakciónak ez az iránya termodinamikailag sokkal kedvezőbb. A glikolízist aerob körülmények között a citrát-ciklus követi. Ez azt jelenti, hogy a piruvát bejut a mitokondriumba, s ott a piruvát dehidrogenáz enzim segítségével acetil-csoportja a koenzim-A-ra épül, majd az acetil-koenzim-A és az oxálacetát a citrát szintáz segítségével citráttá alakul, amit azután további, itt nem részletezett lépések követnek. A glikolízis és a hozzá csatlakozó citrátkör lényeges szerepét mutatja, hogy az utóbbihoz csatlakoznak az élő szervezet működéséhez szükséges további anyagcsereutak. Anaerob körülmények között azonban a piruvát nem lép be a citrát-körbe, hanem acetaldehiddé dekarboxileződik, majd etanollá redukálódik. Ez a folyamat a fermentáció. A növények fotoszintézisénél a sötétszakaszban jut szerephez a PGK. Itt nem lebontó folyamatról van szó, hanem a cukor felépítéséről. A ribulóz-1,5-biszfoszfátra egy CO2 molekula addícionálódik. A reakció elsődleges terméke a 3-PG, melyből a következő lépésben ATP jelenlétében PGK katalízisével 1,3-biszfoszfo-glicerát képződik, az ATPből pedig ADP keletkezik. A glükogenezis során is jelen van a PGK enzim. A glükogenezis célját tekintve a glikolízis fordított folyamata, ugyanis a glükóz felépítéséről van szó a piruvátból kiindulva. A természet azonban okos, hisz az energiaigényes lépéseket más, kisebb energiát igénylő folyamatokra cseréli. A PGK által katalizált reakció ezen anyagcsere úton is változatlanul szerepel: az enzim 3-PG-t és MgATP-t alakít át 1,3-BPG-vé és MgADPvé. Ezek a legalapvetőbb anyagcsere-folyamatok, melyeket már évtizedek óta ismerünk. A PGK sejten belüli további szerepéről azonban újabb és újabb eredmények születnek. A PGK néhány további érdekes funkciójáról is szeretnék néhány dolgot említeni. A kation transzportban jelentős szerepe van: a Na+ transzportjánál (30), valamint a Ca2+-pumpa (31) működése során. Az utóbbi munkában feltételezik, hogy a PGK - néhány további glikolitikus enzim mellett - kapcsolatban áll a szarkoplazmatikus retikulummal és ATP-t szolgáltat a pumpa működéséhez. A legújabb kutatási eredmények szerint a sejtmagban is megtalálható, ahol szerepet kap a DNS szintézisénél, transzkripciójánál, illetve javításánál (32). Figyelemre méltó, hogy a PGK funkcionális károsodása (pl. bizonyos természetes mutációk következtében) összefüggésbe hozható az emberi hemolitikus anémiával (33, 34). A hemolitikus anémia olyan betegség, mely X kromoszómához kötötten öröklődik. A 6

vörösvérsejtek működésében zavarok támadnak, s egy idő után képtelen lesz a sejt ellátni a funkcióját, végül elpusztul. Az utóbbi időben az emberi eredetű PGK a rákkutatással, azon belül pedig a tumor angiogenezissel kapcsolatban került előtérbe. A tumorsejtek energiaigényüket az angiogenezis előtt, a glikolízis során termelődött ATP-ből nyerik, amihez természetesen a PGK működése is szükséges. Ez a folyamat, mivel hipoxiás a sejt, a tejsavas erjedéshez vezet. A tumorsejtek folyamatos táplálást és oxigénellátást igényelnek. Továbbá meg kell szabadulniuk a szén-dioxidtól és anyagcseréjük hulladékától. Amíg a sejthalmaz átmérője kb. 1 mm alatt marad, diffúzió segítségével meg tudják oldani a sejtek ezeket az ellátási és felszámolási problémákat. Ha viszont túl szeretnék nőni ezt a határt más módszerre lesz szükségük, ez pedig saját vérkeringési rendszer kialakítása, azaz az angiogenezis. A kutatók megfigyelése szerint a daganatsejtben az angiogenezis során a glikolízis egyik energiatermelő lépését katalizáló enzim, a PGK diszulfid reduktázként működik (35) és a plazmint képes redukálni. Ily módon a PGK szerepet játszik a tumor angiogenezis inhibítor, az angiosztatin keletkezésében. In vivo, tumoros egereken végzett kísérletek valóban ezt látszanak alátámasztani. A PGK, tehát ellentétben a többi glikolitikus enzim csupán tumort tápláló hatásával, tumort csökkentő hatással is bír. Bár a közölt adatok látszólag elég egyértelműen bizonyítják a PGK diszulfid-reduktáz aktivitását és tumorellenes hatását, mindaddig ezen eredményt fenntartással kell kezelnünk, amíg nem születik ésszerű magyarázat a PGK tiol-reduktáz aktivitás mechanizmusáról. A legújabb adatok szerint ugyanis az aktív centrum közelében található két, szekvenciálisan szomszédos reaktív tiol-csoport ezen aktivitásban egyáltalán nem vesz részt, bár ez lett volna várható. Tehát elég paradox módon a plazmin redukciója – azaz a tiol-reduktáz aktivitás - független a PGK tiol csoportjaitól (36). A jelenséget először a doménzáródás okozta konformáció-változásokkal próbálták összefüggésbe hozni. Újabb közlemények azonban felvetnek két másik lehetséges mechanizmust, melyek során egy enzim képes egy másik enzim SH-csoportjait redukálni (37). Ezek közül a PGK esetén a legvalószínűbb, hogy egy glutaminsav vagy aszparaginsav segíti a plazmin S-S kötésének polarizációját, mely végső soron a kötés felbomlásához vezet. Ezen hipotézis bizonyítása azonban még várat magára. A PGK angiogenezist gátló hatásától eltérően, sokkal kézenfekvőbb magyarázat adódik a PGK-nak azon, csak nemrég közölt, de igen fontosnak látszó tulajdonságára, hogy képes előállítani bizonyos nukleotid analógok (antivirális ill. rákellenes gyógyszerek ill. gyógyszerjelöltek) aktív formáit a sejtben (38, 39). Ez összhangban van azzal a régen 7

ismert ténnyel, hogy a PGK a nukleotid szubsztrátokra sokkal kevésbé specifikus, mint a 3-PG-re, ill. az 1,3-BPG-re (40). A PGK-nak ezt az aktivitását vizsgálva már megállapították azt is, hogy a PGK a purinbázist tartalmazó nukleotidokat gyorsabban defoszforilálja, mint a pirimidinbázist tartalmazóakat (39), továbbá, hogy a pirimidin analógok közül viszont az L-analógokat alakítja át gyorsabban a D-analógokhoz viszonyítva. A PGK tehát mindamellett, hogy jó modell a domének együttműködésének vizsgálatára, figyelemreméltó enzim kémiai reakciómechanizmusának és in vivo betöltött szerepének sokrétűsége miatt is.

2.4. A szubsztrátok kötődési módja 2.4.1. A 3-PG kötőhely Az első, 3-PG-t kötő kristályszerkezet megszületése előtt NMR mérésekkel és helyspecifikus mutagenezissel próbálták feltérképezni a 3-PG szubsztrát kötőhelyét. Már az első NMR mérés kimutatta, hogy három His aminosavnak van szerepe a 3-PG kötésében (41), melyeket csak később azonosították (42): His 62/Ys≠62, 169/Ys167 és 172/Ys170. Eközben Blake és mti (43) bár nem tudták meghatározni a 3-PG kötődésének részleteit, de azt valószínűsítették, hogy a 3-PG az N-terminális doménen, az Arg 38 és az Arg 170 között kötődik. Ez a két aminosav, továbbá az Arg 21/Ys21, His 62/Ys62, Arg 65/Ys65, His 169/Ys167 és His 172/Ys170 alkotják az N-domén bázikus „foltját”. Ezen aminosavak helyspecifikus mutagenezissel történő cseréje megmutatta, hogy a 3-PG és a PGK kölcsönhatásában fontos szerepük van (ld. 1. táblázat). NMR mérések rámutattak, hogy a His-ek fontossági sorrendje a 3-PG kötésében: His 62/Ys62 > 169/Ys167 > 172/Ys170 (42), továbbá arra is, hogy a His 62 hidrogén kötés centrumként viselkedik a szubsztrát kötésében (44). A His 62/Ys62 Gln-ra történő cseréje gyakorlatilag alátámasztja ezt az eredményt (45). Az Arg 21/Ys21 mutációjának NMR-es vizsgálata rámutatott arra, hogy ezen oldallánc nem vesz részt a szubsztrátok kötésében, és a szubsztrátok Km értéke valószínűleg az enzim/szubsztrát H-híd rendszer részleges felbomlása miatt növekszik jelentősen (46). A mutációs munkák összességét tekintve azonban megállapítható, hogy az N-domén pontmutációi nagyobb mértékben károsítják a ≠

Az aminosav oldalláncok számozása az emlős PGK szekvenciájára vonatkozik valamennyi fejezetben, kivéve ha nincs külön jelezve, pl. Ys (Yeast), Bs (Bacillus stearothermophilus), Tm (Thermotoga maritima), Tb (Trypanosoma brucei).

8

3-PG-vel való kölcsönhatást, a MgATP-hez képest. Mindez azt sugallta, hogy a 3-PG az N-doménen kötődik. Az Arg 38/Ys38 Ala mutáns jellemzése pedig azt is megmutatta, hogy az Arg 38 az egyetlen esszenciális oldallánc az N-domén bázikus „foltjának” aminosavai között (45, 47) (ld. 1. táblázat kkat érték). 1. táblázat Az N-domén „bázikus foltjá”-n végzett pontmutációk hatása a szubsztrátok kötődésére, illetve az enzimaktivitásra (az adatokat 40, illetve 50mM szulfát jelenlétében mérték, kivéve az anionaktiválási kísérleteket, melyek alacsony ionerősségnél készültek)

Aminosav

Mutáció

21/Ys21

Arg→Ala

21

4

60%

eltűnik



8

3,6

25%

eltűnik

g

4,3

4

15%

eltűnik

 180

f

5

3,2

0,5-1%

c

1

1

200%

f

5,4

4,2

85%

eltűnik nem változik eltűnik

43,6

e

6

2,2

165%

eltűnik

6

e

5,4

2,2

165%

eltűnik

h

21

4,9

10-15%

eltűnik

 >50

e

5,7

2,2

165%

eltűnik

h

2,2

1

kicsit nő

csökken

 4

h

2,6

1

50-60%

csökken



h

2,6

1

50-60%

eltűnik



c

10,5

1,5

40%

eltűnik



a,g

7,8

3,5

20%

csökken

a,g

15

2,7

2,7

50%

eltűnik

c

19

2,3

55%

eltűnik



100%



2,3  4

38/Ys38

Arg→Ala

62/Ys62

His→Gln His→Ala Arg→Gln Arg→Met Arg→Met Arg→Ala Arg→Lys

122/Ys121 Arg→Met Arg→Lys His→Ser

170/Ys168 Arg→Met Arg→Lys

Arg→Gln 172/Ys170 His→Asp a

b

c

d

K d3−PG növekedés faktora

g

Arg→Met

169/Ys167

kkat

Anion aktiválás

c

Arg→Lys

65/Ys65

3− PG Km K mMgATP növekedés növekedés faktora faktora

b

e

 f

g

47 3

d

b b

h

(48), (42), (45), (44), (49), (47), (46), (50) (A mutáció feliratú oszlop hivatkozásai vonatkoznak az adott sorban leírt mutáció esetén a teljes sorra. Más esetben egy másik hivatkozással jeleztem ezt a megfelelő cellában. Az egyértelműen nagy hatásokat vastagon szedtem és aláhúztam.)

Az 1992-ben Harlos és mti által közölt 3-PG-t kötő kristályszerkezet (19) egyrészt alátámasztotta az N-doménen való kötődést, másrészt megmutatta a kötődés részleteit (3.A ábra). A kristályszerkezet alapján a 3-PG foszfát-csoportjának oxigénjei hidrogénkötéseket, illetve ionos kölcsönhatásokat alakítanak ki a His 62, Arg 65, Arg 122 és Arg 170 oldalláncaival. A hidroxil-csoport, mely a D-sztereospecifitásért felel, az Asp 23 és az Asn 25 oldalláncával alakít ki hidrogénkötést. A karboxil-csoport ionos kölcsönhatásba lép az Arg 38 oldalláncával. További kölcsönhatás alakul ki egy

9

vízmolekulán keresztül a 14-es hélix Gly 396 peptid N-atomjával. A kristályszerkezet alapján megfigyelhető a 3-PG kötés hatására a 13-as hélix rendeződése is (a másodlagos szerkezeti elemek számozását ld. az 1. ábrán), továbbá az, hogy az N-domén közelebb kerül a C-doménhez, amely kb. 7,7o-os záródást jelent (19). Ezt a 3-PG kötődési módot azóta már számos kristályszerkezet alátámasztotta (21-23, 25, 51) (ld. 2. táblázat), melyekből megállapítható, hogy az lényegében nem változik meg a nukleotid szubsztrát jelenlétében sem. A későbbiekben a T. maritima PGK-val közölt mindkét szubsztrátot (ill. analógot) kötő terner komplex már majdnem teljesen zárt szerkezetben kristályosodott (23). Az ebben a szerkezetben kötött 3-PG érdekes módon kölcsönhatást alakít ki a C-doménben elhelyezkedő konzervatív Lys 215/Tm197 aminosav oldalláncával is. Az eddig ismert számos PGK kristályszerkezetek közül csak a zárt szerkezetek azok, ahol ez a kölcsönhatás kialakul, ami annál is inkább figyelemre méltó, mert a Lys 215 teljesen konzervatív oldallánc és szerepe a katalízisben még nincs tisztázva. Az egyetlen feltételezés, hogy részt vesz a PGK aktivitását szabályozó anionok (2.8. fejezet) megkötésében, modellezés eredménye (52).

3. ábra A 3-PG kötőhelyének térszerkezete (A), valamint az 1,3-BPG lehetséges kötődési módja (B) Az A ábra a 3-PG kötődését (kék) mutatja a disznóizom PGK biner komplexében (19). A B ábrán az 1,3-BPG lehetséges kötődési módját a T. brucei PGK 3-PG*MgADP szerkezetében ((26), B lánc) kötött 3-PG, illetve foszfát*MgADP szerkezetében ((26), D lánc) kötött foszfát adja. (A két szerkezet összemásolása az ADP atomjai szerint történt.) A 3-PG-t zöld, a foszfátot piros golyós modell mutatja. A kölcsönhatásokat szaggatott vonal jelzi. A B ábrán a zárójelben lévő számok az emlős PGK szekvenciájára vonatkoznak.

10

2. táblázat Az eddig közölt röntgenkrisztallográfiás PGK szerkezetek összefoglaló táblázata

Enzimkomplex

Forrás

szubsztrátmentes 3-PG biner

lóizom disznóizom B. stearothermophilus disznóizom T. brucei T. maritima disznóizom disznóizom

MgADP biner 3-PG*MgAMP-PNP 3-PG*MgADP 3-PG*MgAMP-PNP 3-PG*MgADP 3-PG*MgAMP-PCP

DoménFelbontás (Å) PDB kód Hivatkozás konformáció nyitott 2,5 (16)  nyitott 2,0 (19)  nyitott

1,65

1PHP

(20)

nyitott zárt zárt nyitott nyitott

2,0 2,5 2,0 1,8 2,5

 13PK 1VPE 1HDI 1KF0

(21) (26) (23) (25) (51)

2.4.2. Az 1,3-BPG lehetséges kötődési módja Az 1,3-BPG szubsztrát kötődési módjára eddig nem született kristályszerkezeti adat, mivel az 1,3-BPG igen bomlékony anyag (t1/2= 6 h, pH=7,5, 10oC (53)). Azonban a T. brucei PGK terner komplexét foszfátból kristályosítva (26) „létre lehetett hozni” az 1,3-BPG-t, mégpedig a következő módon: ebben a kristályban az aszimmetrikus egység négy PGK molekulát tartalmaz, ez a négy molekula két aszimmetrikus dimerre bontható. Ezen dimerekben az egyik molekula a 3-PG*MgADP terner komplex, a másik pedig a foszfát*MgADP pszeudoterner komplex. A két szerkezetet az ADP atomjai szerint összemásolva (a valódi terner komplexet a pszeudoterner komplexszel) azt találták, hogy a kristályban kötődő foszfát éppen az 1,3-BPG 1-es foszfátja helyén található (3.B ábra). Ez tehát egy lehetséges módja az 1,3-BPG kötődésének. 1,3-BPG analógok kötődését vizsgálták oldatkísérletekben NMR módszerrel (54), ugyanis inhibítorokat kerestek a PGK működésének gátlásához. Azt találták, hogy minden vizsgált ligandum képes kétféle orientációban is kötődni az N-domén bázikus régiójához, azaz a 3-PG korábban megjósolt, majd röntgendiffrakciós szerkezetekben bizonyított kötőhelyére. Azonban az analógok kétféle orientációjú kötődése közül nagyobb valószínűségű az, amikor a 3-as foszfátnak megfelelő csoport kötődik a 3-PG foszfátjának (a 3-as foszfátnak) a helyére. A nagyobb negatív töltéssel rendelkező difluor-dimetán foszfonát csoportot tartalmazó analógok esetén ez a kötődési mód még inkább kedvező. Megállapították azt is, hogy az inhibítor akkor kötődik szorosan, ha a 3-as foszfát csoport kétszeres negatív töltésű, az 1-es pozíciójú foszfát (átadódó foszfát-csoport) pedig egyszeresen negatív töltést hordoz. Tehát a 3-as foszfát kölcsönhatásai az N-terminális domén pozitív töltésű oldalláncaival fontosabbak, nemcsak az 1,3-BPG, hanem a 3-PG kötődésében is. Ezt alátámasztja az a megfigyelés is, hogy a 3-PG vizsgált szubsztrátanalógjai közül a glicerol-3-foszfát (G-3-P, a 3-PG karboxil-csoportja hiányzik) 11

jobb inhibítora a PGK-nak, mint a 2-foszfo-glikolát (2-PG, a 3-PG hidroxil-csoportja hiányzik) (55), továbbá a glicerinsav (a 3-PG foszfát- és hidroxil-csoportja is hiányzik) alig gátol. Tehát az inhibítor karboxil-csoportja kevésbé fontos a gátlás (azaz az enzimmel való kölcsönhatás) szempontjából a 3-as foszfát-csoporthoz képest.

2.4.3. A nukleotid kötőhely Röntgenkrisztallográfiás analízis egyetlen nukleotid kötőhely létezését mutatta a MgADP (16, 20, 22, 25), a MgAMP-PNP (21, 23, 56), ill. a MgAMP-PCP (51) kötődése esetén. Az oldatkísérletek azonban nem egyértelműek, ugyanis ahogy a 3. táblázatból kitűnik, számos publikáció két, míg mások egy kötőhely létezését bizonyították egyensúlyi dialízis, gélszűrés, kémiai módosítás, NMR, illetve az enzim valamely reaktív csoportja kémiai módosításának módszerét alkalmazva. 3. táblázat A nukleotid kötőhelyek számának meghatározása az irodalmi adatok tükrében

Módszer Egyensúlyi dialízis Gélszűrés Kémiai módosítás NMR Fluorimetriás titrálás

1 kötőhely (57), (58)  (51), (55) (41), (60) (67), (68), (69)

2 kötőhely (59) (60), (61) (62) (63), (64), (65), (66) 

A 90-es években elvégzett NMR vizsgálatok (65, 66) megmutatták, hogy mi lehet az ellentmondások magyarázata. Eszerint 3-PG és Mg2+ távollétében az ATP vagy ADP a nukleotid szubsztrát valódi katalitikus helye helyett inkább alakít ki elektrosztatikus kölcsönhatást az N-terminális bázikus „foltjával”, azaz a 3-PG kötőhellyel, de azért kisebb valószínűséggel a kristályszerkezetekből ismert nukleotid kötőhelyen is kötődnek a fémionmentes nukleotidok az adenozin részükkel. Mg2+ jelenlétében az ATP és az ADP már inkább a molekula adenozin részével kötődik a PGK-hoz, s ezért a kötődésben főleg a hidrofób kölcsönhatások dominálnak. Tehát Mg2+ hatására csökken a nukleotidok affinitása az elektrosztatikus helyhez, s ha a Mg2+:ADP arány ≥ 1:1, akkor az elsődleges kötőhely a C-domén belső, hidrofób felszínén található katalitikus hely lesz. Munkám megkezdéséig nem volt olyan térszerkezeti adat, amely akár az ATP, akár az ADP kötődését mutatta volna meg fémion távollétében. Az ismert kristályszerkezetekben (ld. 2. táblázat) a MgADP kötődése igen jól jellemzett, mind az enzimmel alkotott biner komplexben (20), mind pedig 3-PG jelenlétében a terner komplexben (22, 25) (4.A ábra). A MgATP kötődéséről munkám 12

megkezdésekor még nem állt rendelkezésre megfelelő minőségű kristályszerkezet, viszont analógjait 3-PG-vel együtt több esetben is használták stabil (nem működő) terner komplexek kristályos állapotban való előállítására és szerkezet meghatározásra (21, 23, 51, 56). A MgATP analógokban a β- és γ-foszfocsoportot összekötő oxigént AMP-PNP esetén NH-csoport, míg AMP-PCP esetén CH2-csoport helyettesíti. A helyettesítés izosztérikus, azaz nincs jelentős különbség sem a kötésszögekben, sem a nukleotid egyéb fontos tulajdonságaiban (70). Az AMP-PNP, illetve az AMP-PCP PGK-hoz való kötődési módját a kristályszerkezetek alapján a 4.B, illetve a 4.C ábrák szemléltetik. A nukleotidok adenin és ribóz gyűrűje valamennyi szerkezetben (4. ábra) ugyanolyan módon, a βH, βG és βJ lemezek folytatása által alkotott mély, szűk hidrofób zsebben kötődik. A ribóz gyűrű két konformációja ismert az enzimhez kötött formában: C2’-endo (16), illetve O4’-endo (20, 21), azonban e két konformáció közötti energiakülönbség igen kicsi. Nukleotidok és nukleotid analógok vizsgálata rámutatott arra, hogy a PGK nem specifikus a ribóz gyűrű konfigurációjára és a ribóz gyűrű hidroxil-csoportjai pozíciójára (2’ ill. 3’). Azonban a purinbázisú nukleotidokat gyorsabban alakítja át a pirimidinbázisúakkal szemben (39, 40).

4. ábra A nukleotidok, illetve nukleotid analógok PGK-val való kölcsönhatása Az ábra a MgADP kötődését mutatja be a T. brucei PGK 3-PG*MgADP terner komplexében (26) (A), a MnAMP-PNP kötődését a disznóizom PGK*3-PG*MnAMP-PNP terner komplexében (21) (B), valamint a MgAMP-PCP kötődését a disznóizom PGK*3-PG*MgAMP-PCP terner komplexében (51) (C). A kölcsönhatásokat szaggatott vonal jelöli. Az A ábrán a zárójelben lévő számok az emlős PGK szekvenciájára vonatkoznak.

13

A nukleotidok foszfátláncai, szemben az adenin és ribóz gyűrű állandó kölcsönhatásaival, különböző kölcsönhatásokat alakítanak ki a fehérjével és a fémionnal egyaránt a rendelkezésünkre álló kristályszerkezetekben. A MgADP (20, 22) (4.A ábra) és a MgAMP-PNP (21, 23) (4.B ábra) foszfátlánca a 13-as hélix N-terminálisához kötődik, míg a másik analóg, MgAMP-PCP (4.C ábra) foszfátlánca pedig a 8-as hélix N-terminálisának aminosavaival alakít ki kölcsönhatásokat (51). Ezt a kötőhelyet csak ebben, a laboratóriumunk közreműködésével meghatározott szerkezetben figyelték meg, és a szerzők feltételezése szerint funkcionális szerepe lehet. A doménzáródás során ugyanis a 8-as és a 13-as hélix közelebb kerül egymáshoz (ld. 2.9. fejezet). Tehát amennyiben a természetes szubsztrát, a MgATP foszfátlánca képes lenne két kötőhely közötti fluktuálni, ez elősegítheti a doménzáródást. Ez igen figyelemre méltó feltételezést azonban még igazolni vagy cáfolni szükséges a MgATP-vel alkotott komplex szerkezeti és enzimológiai vizsgálatával. Az alábbiakban részletezem a nukleotidok foszfátláncának kölcsönhatásait a fehérje oldalláncaival, és a Mg2+ ionnal. A MgADP foszfátlánca elektrosztatikus és H-híd kölcsönhatásban van a 13-as hélix N-terminálisának peptid N atomjaival, és a C-terminális doménben lévő 219-es Lys (8-as hélix) és 336-os Asn (βJ) oldalláncaival. A Mg2+ ion mind az α-, mind a β-foszfáttal kölcsönhatásba lép, valamint az Asp 374 oldalláncával (13-as hélix) is (4. A ábra). A MgAMP-PNP lényegében ugyanazon fehérje oldalláncokkal alakít ki kölcsönhatást, mint a MgADP. A Mg2+ ion mindhárom foszfát-csoporttal kölcsönhatásban áll, de nincs kölcsönhatásban az Asp 374-el. (4.B ábra). A Mg2+ koordinációját oldatban is megvizsgálták (71), monoamin-króm(III) ATP-t használva. Ezek alapján megállapították, hogy a Mg2+ az ATP mindhárom foszfátjával kölcsönhat, mely jól egyezik az AMP-PNP-t tartalmazó kristályszerkezetben tapasztalttal. Mint már említettem, a MgAMP-PCP foszfátláncának kölcsönhatása a fentiektől, azaz a MgADP és a MgAMP-PNP kötődésétől teljesen eltérő, ugyanis a Mg2+ ion a β-foszfátján keresztül a 8-as hélix N-terminálisához köti (4.C ábra), melyben az Asp 218-as oldalláncnak lehet szerepe. Fontos megjegyezni, hogy az AMP-PCP γ-foszfátja kölcsönhatásban van a Lys 215-ös oldallánccal. Ezt a kölcsönhatást a T. maritima PGK*3-PG MgAMP-PNP majdnem teljesen zárt konformációjú terner komplexében figyelték meg először. A Lys 215/Tm197/Tb219-ös oldallánc a MgAMP-PNP γ-foszfátján kívül a 3-PG foszfátjával is kölcsönhat ebben a szerkezetben (ld. fent és 3.A ábra). Ennek alapján a Lys 215-ről

14

feltételezik, hogy katalitikus szerepe lehet (23). Amint tárgyaltam, e szerep bizonyítása megfelelő oldatkísérletekben azonban még munkám megkezdéséig nem történt meg. Fontos megjegyeznem, hogy

13

C-NMR méréseket alkalmazva szintén meghatározták

az oldott enzim által kötött MnADP és MnATP szerkezetét (72). Megállapították, hogy a kötött

nukleotidok

konformációja

jelentősen

különbözik

a

kristályszerkezetben

meghatározottól. Tudvalevő, hogy az oldat és a kristály két eléggé eltérő fizikai állapotot képvisel. Éppen ezért a fehérje ezen két állapota között megfigyelt eltéréseket mindig alaposan meg kell vizsgálni, hogy az okokat feltárhassuk. A működőképes enzim szerkezetére vonatkozóan csak így tehetünk lényeges megállapítást. Ez utóbbi NMR-es munka sajnos ábrán nem mutatta be, milyen mértékű az eltérés a megfelelő nukleotidok között, csak egy táblázatban foglalták össze az adatokat, amely nem eléggé szemléletes. Mivel jelenleg csak a nagy felbontású kristályszerkezetek képesek átfogóan feltárni az enzim-szubsztrát kölcsönhatások részleteit, ezért fontos, hogy az oldott enzimmel elvégezhető

különböző

ligandumkötődés,

típusú

kalorimetria,

független CD,

kísérletekkel

pontmutáció)

(enzimkinetika,

igazoljuk

vagy

gátlás,

cáfoljuk

a

kristályszerkezeti adatokat. Az értekezésben bemutatott munkám során ezt az elvet igyekeztem követni.

2.4.4. A Mg2+ szerepe és feltételezett kötőhelye A fémion-nukleotid komplex a PGK igazi szubsztrátja (73). A fémion szerepét a szubsztrátszerű nukleotid kötődésben Fairbrother és mti valamint Graham és mti is alátámasztották (65, 66), hiszen Mg2+ jelenlétében kötődik a nukleotid elsődlegesen az adenozin részével a C-doménen lévő hidrofób zsebbe, ami a feltételezhető katalitikus hely. Ez a kötőhely azonos a röntgenszerkezetekből ismerttel. A kétértékű fémion szerepe a foszfo-csoport átviteli reakciókban általánosan az lehet, hogy az átadódó foszfo-csoport P-atomját elekropozitívabbá tegye a partner szubsztrát O-atomja nukleofil támadásához, továbbá szerepe lehet az átmeneti állapot stabilizálásában is, esetleg együtt más pozitív töltésű aminosav oldalláncokkal (74). PGK esetén a fémion szerepének vizsgálatára Rh(III)ATP szubsztrátot alkalmazva NMR módszerrel jellemezték az enzim aktivitását (75). Az eredmények a fémion egy újabb lehetséges, katalízis alatt betöltött szerepét mutatták meg. Eszerint a fémion azáltal segíthet a szubsztrátok megfelelő orientációját kialakítani a foszfo-transzferhez, hogy mindkét szubsztrátot egyszerre koordinálja. Ezzel

15

összhangban van az is, hogy a 3-PG-t a fémion belső koordinációs szférájában találták a CrATP*3-PG terner komplex NMR-es vizsgálatánál Serpersu és mti (76).

13

mérések

konformációja

szerint

az

enzimen

kötött

MnATP

és

a

MnADP

C relaxációs

összehasonlításakor a Mn 2,4 Å-nyi elmozdulását figyelték meg (72). Hasonló, bár kisebb mértékű elmozdulásra utal a megfelelő kristályszerkezeti adatok összehasonlítása is. Tehát a fémion feltehetően elmozdul a katalízis alatt bekövetkező szerkezeti változások során, miközben ADP-ből ATP lesz, vagy fordítva. Érdekesség, hogy az élesztő PGK Rh(III)ATP-s komplexét használva, azt pepszinnel emésztve és fordított fázisú HPLC technikát használva két olyan peptidet találtak, mely a Rh-nukleotidot kötötte: az egyik az 5-ös hélix (amely megfelel a disznóizom PGK-nál a két domént összekötő 7-es hélixnek), a másik pedig a C-terminális peptid (77). Az egyik feltételezett koordináló helyet a C-terminális peptidben a Glu 400 ill. a Glu 403 konzervatív aminosavak alkothatják. Ezen kísérletes eredmény magyarázatára született egy hipotézis, miszerint a fémion szerepe az, hogy a C-terminális peptidet az N-domén felé irányítsa, ezzel alakítva ki a zárt aktív centrumot. E hipotézist mindeddig sem szerkezeti adat, sem funkcionális vizsgálat nem erősítette meg. Egyébként a C-terminális peptid

fontosságát

(esszenciális,

0,1%

az

enzimaktivitás

a

deléciójakor)

az

enzimaktivitásban már korábban leírták (78, 79). A fémion erősíti az ADP kötődését (57, 66, 80), az ATP kötődésének változásáról azonban ellentmondásos adatok állnak rendelkezésre. Néhány 1H-NMR-es mérés azt mutatja, hogy a fém-ATP komplex szorosabban kötődik, mint a fémionmentes ATP (65, 80). Más egyensúlyi dialízis (57), illetve

31

P-NMR mérések (63) szerint a fémion nem

erősíti az ATP kötődését. A fontosabb meghatározott disszociációs állandókat a 4. táblázat tartalmazza.

2.5. A szubsztrátkötődés disszociációs állandói, kötődési antagonizmus A szubsztrátkötődés disszociációs állandóit a 4. táblázatban foglaltam össze. Legerősebben az 1,3-BPG kötődik, mely kötődési állandója nM-os nagyságrendű. A 3-PG és a MgADP kötődése nagyjából összemérhető, µM-os tartományba esik. A szubsztrátok közül a leggyengébben a MgATP kötődik. Az 1,3-BPG extrém szoros kötődését egyébként az is bizonyítja, hogy a szubsztrátokkal összemérhető koncentrációjú PGK-t alkalmazva az enzimreakció látszólagos egyensúlyi állapota (Keq – vö. Irodalmi áttekintés, 2.3. fejezet) 1-hez közeli érték lesz (29), szemben a 10-4-es értékkel, amelyet katalitikus

16

enzimkoncentráció esetén tapasztalhatunk. Ennek oka, hogy a PGK gyakorlatilag „kiköti” a reakcióelegyből az igen szorosan kötődő 1,3-BPG-t. 4. táblázat A PGK szubsztrátjai, illetve szubsztrát-analógjainak enzimhez való kötődési állandói (Kd, mM) A Kd értékek meghatározása ANS jelölés segítségével (68), a szubsztrátok az enzim jódacetamiddal történő kémiai módosításával szembeni védőhatásának mértékéből (55), egyensúlyi dialízissel (57), fluorimetriás kiszorítás módszerével a fluoreszcens analóg TNP-ATP-t alkalmazva (69), illetve az utóbbi két módszer valamelyikével (58) történt.

Ligandum

3-PG

1,3-BPG G-3-P Ligandum

Második ligandum Mg2+ és nukleotidok 0,25±0,08 (MgATP) (68) 0,20±0,10 (MgADP) (68) 0,12±0,05 (MgAMP) (68) 0,03±0,01 (adenozin) (68)

 0,032±0,003 (61) 0,03±0,01 (68) 0,00005±0,00002 (61) 0,00005±0,00001 (68) 0,40±0,10 (68) 

ATP

0,21±0,03 (57) 0,33±0,15 (69)

ADP

0,27±0,04 (57) 0,41±0,12 (58) 0,34±0,05 (58)

AMP



Adenozin

1,05±0,20 (55) 0,65±0,05 (57)

 

Második ligandum Mg2+ és 3-PG ill. G-3-P Mg2+ 0,15±0,03 (55) 0,51±0,22 (3-PG) (69) 0,23±0,03 (57) 0,38±0,06 (3-PG) (58) 0,27±0,09 (69) 2,39±0,68 (1,3-BPG) (69) 0,04±0,01 (55) 0,34±0,13 (3-PG) (69) 0,06±0,01 (57) 0,38±0,05 (3-PG) (58) 0,048±0,006 (69) 0,058± 0,001(G-3-P) (69) 0,29±0,05 (55)  0,36±0,05 (57) 



Kutatók megfigyelték, hogy MgATP, MgADP, ill. MgAMP jelenlétében a 3-PG Kd értéke megnő, adenozin jelenlétében azonban nem változik (ld. 4. táblázat) (68). Ez természetesen abban az esetben is igaz, ha a nukleotidok kötődési állandóját vizsgáljuk, a másik szubsztrát, pl. 3-PG jelenlétében (58, 69). Ezt a jelenséget, azaz azt, hogy az egyik szubsztrát gyengíti a másik kötődését, szubsztrát antagonizmusnak nevezték el (69). Szubsztrát antagonizmus nem lép fel azonban a negatív töltésű karboxil-csoportot nem tartalmazó 3-PG analóg a G-3-P jelenlétében (69), továbbá a negatívan töltött foszfát-csoportot nem tartalmazó adenozin esetén (68). Ebből látszólag az következne, hogy a jelenség a negatívan töltött csoportok taszításával magyarázható, s a szubsztrátok ezért gátolják egymás kötődését. Azonban ennek ellene mond az, hogy a Mg2+ mentes ADP esetén 3-PG jelenlétében a kötődés gyengülését nem tapasztalták (58). Mivel a karboxil-csoportot nem tartalmazó 3-PG analóg, a G-3-P jelenlétében az antagonizmus jelensége megszűnik, megállapítható, hogy a 3-PG szubsztrát részéről annak 17

karboxil-csoportja felelős az antagonizmusért. Az adenozin jelenlétében megszűnő antagonizmus pedig arra utal, hogy a nukleotidok részéről azok foszfátlánca felelős az antagonizmusért. A szerzők a jelenséget a rendelkezésükre álló kristályszerkezetek fényében próbálták magyarázni. Eszerint az elmélet szerint a 3-PG hatására a 13-as hélix rendeződik (19), s a MgADP biner komplexben megfigyelték a β-foszfát 13-as hélixszel való kölcsönhatását (20), ugyanezt feltételezik a MgATP-re is. Tehát az egyik szubsztrát kötődése közvetett módon, a 13-as hélixen keresztül közvetített konformáció-változás által gyengítheti a másik szubsztrát kötődését. Az 1,3-BPG hatására egyébként még nagyobb mértékben gyengül a foszfátlánccal rendelkező nukleotidok PGK-hoz való kötődése, mint a 3-PG hatására (69), mely nem meglepő, hisz az 1,3-BPG enzimkonformáció-változtató hatása valószínűleg nagyobb mértékű, mint a 3-PG-jé (ld. 2.6.4. fejezet). Az antagonizmus jelenségét nemcsak oldatban, hanem kristályban is megvizsgálták egykristály-mikrospektrofotometria

segítségével

(58).

Két

nyitott

szerkezetű

enzimkristályt (a 3-PG biner és a 3-PG*MgAMP-PCP terner komplexet) titráltak mind ADP-vel, mind ATP-vel Mg2+ jelen- illetve távollétében. A meghatározáshoz módszerként egy színes analóg, a TNP-ATP jelenlétében végzett kiszorításos titrálást alkalmazták. A szubsztrát antagonizmus itt tapasztalt hiánya az oldatkísérletekkel ellentétben rámutatott arra, hogy az antagonizmus csak akkor jelentkezik, ha az enzim zárt konformációjú. A szubsztrát antagonizmus jelensége rávilágított arra, hogy a két szubsztrát különkülön doménen elhelyezkedő kötőhelyei a fehérjeszerkezeten keresztül kapcsolatban állnak egymással, azaz a PGK-nál működnek a domének közötti kölcsönhatások. Ezek mikéntjének vizsgálata és a doménzáródással való kapcsolatának megállapítása azonban további vizsgálatokat igényel.

2.6. A szubsztrátok hatása az enzim konformációjára 2.6.1. Szubsztrátok védőhatása az enzim kémiai módosításával szemben Már régen ismert, hogy a 3-PG (81, 82) és más anionok (81) nagymértékben védik a PGK-t proteolízisével szemben. Azt is megfigyelték, hogy az anionok minél nagyobb töltéssel rendelkeztek, annál nagyobb védőhatást fejtettek ki. A 3-PG védőhatása a PGK limitált proteolízisével szemben a szubsztrát enzim-konformációra gyakorolt hatásával magyarázható (82). A 3-PG védőhatását számos más kísérletben, többek között az enzim reaktív csoportjai kémiai módosításával szemben (55, 83-85) is tapasztalták. Arról, hogy az egyes szubsztrátok védőhatása hogyan viszonyul a két szubsztrát együttes 18

védőhatásához, megoszlanak a vélemények. A biner és a terner enzim-szubsztrát komplexeket

összevetve

kimutatták

(83),

hogy

hasonló

mértékű

védőhatással

jellemezhetők a kémiai módosítással szemben. Azonban mások a terner komplex egyértelműen nagyobb stabilitását mutatták ki az egyes biner komplexekhez viszonyítva (85, 86).

2.6.2. NMR mérések a szubsztrátok enzimkonformáció-változtató hatásának vizsgálatára Szubsztrátok konformációs hatásáról számol be az első 1H-NMR mérések egyike (41), mely még a PGK szekvenciájának ismerete előtt született. Megvizsgálták a biner és a terner enzimkomplexekben a szubsztrátok hatását. Megállapították, hogy a szubsztrátok együttes konformációs hatása nem szignifikánsan nagyobb, mint az egyes szubsztrátok hatásának összege. A méréseket később kiterjesztették szubsztrát analógokra, ill. különböző anionokra. 31

P-NMR mérések alapján (87) megállapították, hogy a 3-PG nemcsak a kötésében

részt vevő His-ek, hanem a domének közötti régióban elhelyezkedő Phe jelét is befolyásolja. Ez pedig konformációs hatásának tulajdonítható, hisz a 3-PG kötőhely távol van a két domén közötti régiótól. Fairbrother és mti a későbbiekben már 2D-s NMR spektroszkópiát is alkalmazva megmutatták, hogy a korábbiakban leírt domének közötti régióban elhelyezkedő Phe jelét a 3-PG úgy képes befolyásolni, hogy kötődésének hatására az 1-es és az 5-ös, valamint az 5-ös és a 14-es hélix relatív orientációja megváltozik (az 5-ös hélix megfelel a disznóizom PGK-nál a 7-es hélixnek) (88). A nukleotid kötés hatására ez az aminosav kevésbé perturbálódik. Ezzel a megfigyeléssel összhangban az 1-es és a 7-es hélixek egymáshoz képest való elmozdulását észlelték 3-PG kötődés hatására a kristályszerkezetek összehasonlítása alapján is (19, 22). Tehát elmondható, hogy a 3-PG kötés hatására konformációs változás történik a domének közötti régióban, mely különbözik a MgATP által okozott hatástól és ez utóbbi szubsztrát hatása kisebb mértékű. Ez egyébként összhangban van a Photo-CIDNP mérésekkel (89), melyek szintén a szubsztrátok domének közötti régióra történő konformációs hatását támasztják alá.

19

2.6.3. Fluoreszcencia illetve foszforeszcencia mérések Az élesztő PGK C-doménjében elhelyezkedő 2 Trp fluoreszcenciás jelét felhasználva Wasylewski és mti (90) megállapították, hogy a szubsztrátok kötődése befolyásolja a C-doménben lévő Trp konformációs dinamikáját. Ezzel összhangban Cioni és mti Trp foszforeszcencia mérései rámutattak arra, hogy az egyes szubsztrátok, függetlenül attól, hogy az N- ill. a C-doménen kötődnek, megváltoztatják a C-domén konformációját (91). Ezzel szemben Mouawad és mti fluoreszcencia anizotrópia mérései azt mutatták, hogy az N-doménen kötődő 3-PG nem, csak a C-doménen kötődő MgADP csökkenti a C-doménben lévő Trp forgási energiagátját (92). Mutagenezissel az N-doménbe beépített Trp oldalláncok (93) segítségével a szubsztrátoknak már nemcsak a C-, hanem az N-doménre kifejtett konformációs hatását is tudták vizsgálni. Eredményeik szerint a szubsztrátok által okozott konformáció-változás nemcsak azt a domént érintette, amelyikhez a szubsztrát kötődött, hanem az általa okozott konformáció-változás átterjedt a másik doménre is. Legnagyobb hatást ezen szerzők is mindkét szubsztrát együttes jelenlétében tapasztalták, egyezésben Pickover és mti (4), valamint Haran és mti-val (94) (ld. 2.6.6. fejezet). Kicsit többet tudunk meg a szubsztrátok hatásának jellegéről azon munkákból, melyek során mind a C-, mind az N- domént megjelölték: a C-domént ANS-sel, illetve az N-domént azáltal, hogy a benne lévő Cys-t (az élesztő PGK egyetlen Cys oldalláncát) kromofór reagenssel módosították. Ebből nemcsak az derült ki, hogy a szubsztrátok enzimkonformáció-változtató hatása a másik doménre is átterjed, hanem az is valószínűnek látszik, hogy a 3-PG az N-domént stabilizálja, a C-domént viszont labilizálja. Ezzel szemben a MgATP mindkét domént stabilizálja (95). A szerzők szerint a katalitikus aktivitás feltétele lehet a domének közötti régió labilizálása, mely inkább lehetővé teszi, mint irányítja a doménzáródást. Ez egyébként összhangban van Adams és Pain kalorimetriás méréseiből levont következtetéssel is (96).

2.6.4. A szubsztrátok enzimkonformáció-változtató hatásának összehasonlítása Cheung és mti azt a megállapítást tették, hogy az 1,3-BPG gyakorol a legnagyobb hatást az enzim konformációjára (93). A 3-PG-hez viszonyított nagyobb hatás az 1-es pozícióban lévő foszfát csoport hozzájárulására utal, hiszen ez az egyetlen csoport, amiben a két szubsztrát molekulája különbözik (ld. 1. egyenlet). Ez összhangban van Scopes és Algar kromatográfiás méréseivel is (97). Cheung és mti a MgATP és a MgAMP-PNP

20

esetén nagyobb konformáció-változtató hatást tapasztaltak, mint a Mg2+-mentes nukleotidok kötődése esetén (93). Ez arra utal, hogy Mg2+ jelenlétében a nukleotidok más módon kötődnek. Mikrokalorimetriás

mérésekben

is

vizsgálták

a

szubsztrátoknak

az

enzim

konformációjára gyakorolt hatását. Az élesztő PGK biner komplexek esetén azt találták, hogy a szubsztrátok stabilizáló hatásának növekvő sorrendje: MgATP < 3-PG < MgADP (98). Érdekes megjegyezni, hogy a hidegtűrő PGK hődenaturációjakor szubsztrát távollétében a kalorimetriás átmenet egy jól elkülöníthető hőlabilabb és egy hőstabilabb átmenetre bomlik (99). Azonban a nem működő terner komplex (3-PG*MgADP) esetén egy átmenetet figyelhetünk meg, mely arra utal, hogy a valószínűleg külön-külön kitekeredő domének közötti együttműködés mindkét szubsztrát jelenlétében megnő, s ezáltal egyetlen kooperatív átmenet során „olvad meg” a PGK.

2.6.5. Az enzimet különböző konformációban tartalmazó kristályszerkezeti adatok összevetése 3-PG szubsztrát hatására kb. 8o-os doménzáródás következik be disznóizom eredetű PGK-t kristályosítva (19), amely jól észrevehető elmozdulását jelenti a doméneknek a lóizom PGK szubsztrátmentes szerkezetéhez viszonyítva. A MgADP B. stearo PGK biner komplex esetén ugyan 4-5o-os záródást írtak le (20), ez azonban alig észrevehető a megfelelő

kristályszerkezetek

összemásolásakor.

Közel

egy

időben

két

olyan

kristályszerkezetet is közöltek, mely a PGK-t zárt konformációban mutatta. Az egyik egy majdnem teljesen zárt, mely a T. maritima PGK 3-PG*MgAMP-PNP terner komplexét tartalmazza (23). A másik a T. brucei PGK 3PG és MgADP szubsztrátokkal alkotott terner komplexe, mely kb. 32o-os záródást mutatott (22). Ez utóbbi komplex az enzimreakció végbemeneteléhez megfelelő távolságban tartalmazza a két szubsztrátot, s az átmenő foszfátot is be tudták modellezni a szerkezetbe. Ennek a komplexnek a zártsági foka jellemzi talán legjobban az átmeneti állapotot. A disznóizom PGK terner komplexei meglepő módon csak nyitott állapotban kristályosodtak. Ez nagy valószínűséggel a fajspecifikus kristályrácserőknek tulajdonítható, melyek a nem-konzervatív oldalláncok között alakultak ki és a nyitott szerkezetet stabilizálták (100). Ennek alapján még nem zárható ki az sem, hogy a disznóizom PGK 3-PG biner komplex szerkezete esetleg jobban záródik oldott állapotban, mint a kristályban tapasztaltuk. A kristályszerkezeti adatok

21

alapján tehát nem dönthető el egyértelműen, hogy mindkét szubsztrát együttes hatása eredményezi-e a doménzáródást.

2.6.6. A molekula alakját jellemző kisszögű röntgen-, illetve neutronszórási mérések Az oldatban végezhető kisszögű röntgenszórás-mérések a molekula alakját jellemző girációs sugárról nyújtanak információt. A PGK esetén eléggé ellentmondásos adatok állnak rendelkezésünkre a MgATP hatásáról, továbbá arról, hogy mindkét szubsztrát jelenléte szükséges-e a doménzáródáshoz. Pickover és mti (4) kisszögű röntgenszórási, valamint Haran és mti fluoreszcencia energia transzfer (94) mérései szerint a 3-PG önmagában csak részlegesen zárja a domének közötti régiót, hasonlóan a MgATP-hez, azonban a teljes doménzáródáshoz mindkét szubsztrát jelenléte kell. Ezzel szemben Roustan és mti-nak ultracentrifugálási kísérletei (101), valamint Ptitsyn és mti-nak kisszögű röntgenszórási mérései (102), továbbá Henderson és mti-nak kisszögű neutronszórási mérései (103) szerint a MgATP önmagában is zárja a két domén közötti csatornát, mégpedig hasonló mértékben, mint a két szubsztrát együttesen. Az ellentmondások ellenére abban minden szerző megegyezik, hogy mindkét szubsztrát jelenlétében bekövetkezik a doménzáródás (4, 24, 103). A kisszögű röntgenszórásos kísérletek közvetlenül bizonyították a doménzáródás és az enzimaktivitás szoros összefüggését is. A jódacetamiddal kémiailag módosított (CM-) PGK a szubsztrátokat a módosítatlan enzimhez hasonlóan köti, azonban teljesen inaktívnak bizonyult (55). Ez utóbbival összhangban, a kisszögű röntgenszórásos kísérletek szerint a CM-PGK doménjei még mindkét szubsztrát jelenlétében sem képesek összezáródni (24). Összegezve a szubsztrátok konformáció-változtató hatásáról eddig tárgyaltakat, megállapítható, hogy a szubsztrátok kötődése hatására a PGK konformációja jelentősen megváltozik. Azonban az, hogy a két szubsztrát hatása milyen mértékben adódik össze, még

nincs

eldöntve.

Továbbá

még

senki

nem térképezte

fel,

hogy

ez

a

konformációváltozás milyen úton terjed át a másik doménre. Amennyiben ezt sikerülne a PGK esetében feltárni, úgy nemcsak a PGK doménzáródásának mechanizmusát, hanem esetleg más, hasonló szerkezetű enzimek szerkezetének záródási mechanizmusát is megérthetnénk.

22

2.7. A kinetikai reakciómechanizmus A szubsztrátok PGK-hoz való kötődése szekvenciális random kinetikai mechanizmus szerint zajlik az enzimreakció mindkét irányában, azaz a 3-PG és a MgATP (104), valamint az 1,3-BPG és a MgADP (105) szubsztrátokból kiinduló enzimreakcióban. Ez azt jelenti, hogy a termékek keletkezéséhez mindkét szubsztrát előzetes kötődése szükséges (szekvenciális), azonban egyik szubsztrát kötődése sem előfeltétele a másik szubsztrát kötődésének (random). A foszfo-csoport átadási reakció (enzimreakció) inverzióval zajlik (106), melyet O-izotópos jelölés alkalmazásával bizonyítottak. Az inverzióval lejátszódó reakciók rendszerint asszociatív mechanizmus szerint (107) mennek végbe, azaz nem képződik kovalens foszfo-enzim intermedier, hanem a foszfo-csoport átadása közvetlenül megy végbe az egyik reakciópartnerről (szubsztrátról) a másikra. Ennek az a jellemzője, hogy az enzim aktív (zárt) konformációjában a támadó-csoport atomja, illetve a reagáló-csoport atomjának távolsága nem nagyobb, mint 4,9 Å. A PGK által katalizált reakció részletes mechanizmusát főleg a 3-PG és MgATP szubsztrátokból kiinduló enzimreakcióban vizsgálták, az 1,3-BPG instabilitása miatt. Már 1978-ban született egy hipotézis, miszerint a termék 1,3-BPG disszociációja az enzimreakció sebességmeghatározó lépése (61). Ez a hipotézis azon alapult, hogy az 1,3-BPG Kd értékét (50nM) kb. 100-1000-szer kisebbnek találták a többi szubsztrátéhoz viszonyítva. Feltételezve, hogy az (enzim-szubsztrát) asszociáció gyors, diffúzió-limitált folyamat, azaz a kon=108-109 M-1s-1, akkor a Kd érték alapján a koff, azaz az 1,3-BPG disszociációjának sebességi állandója 50 s-1-nek adódna. Ez az érték kisebb, mint az enzimreakció sebességére mért 900 s-1 (104). Ebből egyrészt következik, hogy valószínűleg az 1,3-BPG disszociációja az enzimreakció sebességmeghatározó lépése, másrészt magyarázatra szorul, hogy vajon miért lehet mégis gyorsabb az enzimreakció, mint ez a disszociációs lépés. A szerző a steady-state mérésekben tapasztalt szubsztrátok feleslege, illetve az anionok által okozott aktiválást (104) (ld. még 2.8. fejezet) összefüggésbe hozta az 1,3-BPG disszociációjának gyorsításával, miszerint az aktiválás oly módon történik, hogy az anionok a termék 1,3-BPG disszociációját segítenék elő pl. az 1-es foszfátjának kiszorítása által. Az enzim kinetikájának részletesebb, egyetlen katalitikus ciklus alatti vizsgálata (a ms-os időskálán) még közelebbi információt adhat a mechanizmusról, annak elemi lépéseiről. Erre azonban egészen 1995-ig kellett várni. A méréseket krioenzimológiai körülmények között végezték, miután meggyőződtek róla, hogy a PGK által katalizált

23

reakció szobahőmérsékleten mérhetetlenül gyors, ezért így annak részleteire nem tudnak fényt deríteni. Mind az egyensúlyi, mind a tranziens kinetikai méréseik arra utaltak, hogy 1,3-BPG-t tartalmazó intermedier halmozódik fel a katalízis alatt (108). Azonban a tranziens kinetikában kapott, a ms-os időskálán is mérhetetlenül gyors változást valahogyan mérhetővé kellett tenni. Az alkalmazott oldószer cseréje (etilénglikol→metanol) nyújtott megoldást a problémára (109). A kinetikai adatok globális illesztésével föl tudtak állítani egy leegyszerűsített sémát a katalízis folyamatára:

Ezen az útvonalon 4 típusú lépés különíthető el: a szubsztrátok gyors kötődése (K1 és K5), fehérje konformáció-változás (azaz a doménzáródás, k2 és k-2), foszfo-transzfer (gyors reakcióegyensúly, K3; melyet egyébként független 31P NMR vizsgálatok tanúsítanak (29)), valamint a termékek (1,3-BPG és MgADP) távozása (k4). Ekkor még azt gondolták, hogy a reakció során E*1,3-BPG*MgADP intermedier halmozódik föl. Később azonban a méréseket kiterjesztve (110), azaz a 3-PG és MgATP szubsztrátokból kiinduló reakciót a használt enzimkoncentrációval összemérhető 3-PG koncentráció mellett követve, majd a rendszert kb. 100 ms után MgADP hozzáadásával megzavarva egyszerű exponenciálissal leírható kinetikát tapasztaltak. Ebből a szerzők arra következtettek, hogy nem a PGK*1,3-BPG*MgADP, hanem a PGK*1,3-BPG komplex az enzimreakció alatt felhalmozódó intermedier, hiszen MgADP-vel megzavarva a rendszert, az kötődött a PGK*1,3-BPG

biner

komplexhez,

s

lejátszódott

az

enzimreakció

a

MgATP

keletkezésének irányában. A szerzők azt feltételezik, hogy a PGK*1,3-BPG*MgADP komplex zárt szerkezetű, mely csak kis mértékű konformáció-változáson megy keresztül, hogy a MgADP disszociációja megtörténhessen. Ennek a hipotézisnek a bizonyítása azonban még várat magára. Hiszen ez azt jelentené, hogy az 1,3-BPG önmagában is zárja a két domén közötti régiót, melyet más módszerrel még nem bizonyítottak. Azt a feltételezésüket azonban, hogy a MgADP a zárt szerkezetből „backdoor” mechanizmussal távozik nem tudom elképzelni, ugyanis más enzimeknél bár működik ilyen mechanizmus (pl. miozin), azonban ezek esetében a kis méretű foszfát távozik a „back door”-on keresztül, nem pedig a MgADP. Összefoglalva: a 3-PG és MgATP szubsztrátokból kiinduló enzimreakcióban az 1,3-BPG disszociációja a folyamat sebességmeghatározó lépése, a fő intermedier pedig a PGK*1,3-BPG komplex. Fontos megjegyezni, hogy a MgADP-vel végzett perturbációs

24

mérés során betekintést nyerhettünk az ellentétes irányú, azaz az 1,3-BPG és MgADP szubsztrátokból kiinduló enzimreakcióba is, melyről mindezidáig igen kevés adat állt rendelkezésünkre. Ebben a reakcióban a k-2-vel jellemzett folyamat, azaz a PGK*3-PG*MgATP zárt konformációjú enzim-szubsztrát komplex szerkezetének nyitását találták a sebességmeghatározó lépésnek, melynek bizonyítása azonban még további vizsgálatokat igényel.

2.8. Anionok aktiváló hatása a PGK által katalizált enzimreakcióra A PGK különleges, a Michaelis-Menten kinetikától eltérő enzimkinetikai viselkedése már igen régen ismert: a szubsztráttelítési görbék a szokásos kettősreciprok ábrázolásban (Lineweawer-Burk) nem adnak egyenest, a kapott görbe azonban két különböző meredekségű egyenessel közelíthető (104, 111). Ma már az enzim röntgendiffrakciós szerkezetének ismeretében tudjuk, hogy ez a jelenség nem magyarázható két független aktív centrum létezésével, ahogyan ezt korábban értelmezték (29, 59). Viszont kísérleti tény, hogy a szubsztrátok feleslege aktiválja a PGK-t. A többértékű anionok alacsony koncentrációban szintén aktiválják az enzimet (104). Az

N-domén

bázikus

„foltja”

aminosavainak

katalitikus,

ill.

esetleges

anionaktiválásban betöltött szerepének vizsgálatára számos mutációt végeztek (45, 47-50). Valamennyi elkészített mutáns (kivéve a His 62/Ys62 Gln (45)) elvesztette a szubsztrátfelesleg- ill. anionaktiválás képességét (ld. 1. táblázat). Azonban ezen mutációk hatására az anionaktiválás eltűnése mellett a szubsztrátok Km értékei nőttek, továbbá a mutánsok specifikus aktivitása is csökkent. Ebből Sherman és mti arra következtettek, hogy az aktiváló hely a katalitikus helyhez közel helyezkedik el az enzimszerkezetben (45). Az Arg 122/Ys120 és az Arg 170/Ys168 esetében (50) az is elmondható, hogy ezen aminosavak esetén nem annyira a töltésük, hanem H-híd rendszer megváltozása a 3-PG szubsztrát környezetében okozza az anionaktiválás eltűnését. Szilágyi és Vas felállítottak egy hipotézist az anionaktiválás mechanizmusára, mely a szubsztrátfelesleg- és az anionaktiválás jelenségét összekapcsolja (52). Ez azért lehetséges, mert a szubsztrátok maguk is anionok. A hipotézis szerint a szubsztrátok illetve más anionok számára léteznie kell az aktív centrumon kívüli, a szubsztrátok kötőhelyeivel nem átfedő aktiválóhelynek. Ez a hely a nyitott konformációjú enzimben valószínűleg csak elemeiben létezik, és csupán az enzim doménzáródásakor alakul ki. Kialakításában mind az N-, mind a C-terminális doménhez tartozó aminosavak részt

25

vesznek. A hipotézissel összhangban van, hogy a két domén közötti régióban elhelyezkedő Glu 192/Ys190 mutációja (112) hatására megszűnt az anionaktiválás. Ennek a Glu-nak a His 390/Ys388 oldallánccal való kölcsönhatása ugyanis fontos lehet a nyitott és zárt szerkezet közötti konformációs átmenet szabályozásában (113), azaz a doménzáródásban. Ezt támasztja alá az is, hogy a His 390/Ys388 mutációjának hatására szintén megfigyelték az anionaktiválás csökkenését (114). Az anionaktiválás mechanizmusára felvetett hipotézis szerint (52) az aktiváló anionok közvetlenül a termék 1,3-biszfoszfoglicerát kötésének gyengítésével (61), és/vagy közvetve, a doménzáródás energiagátjának csökkentésével fejtik ki hatásukat (elősegítve ezzel mind a doménzáródást, mind pedig a domének nyílását). A hipotézis az aktív centrumtól elkülönülő, csupán a működő enzimben kialakuló aktiváló anionkötőhelyet feltételezve először tudta kvantitatív módon, egzakt kinetikai egyenletekkel leírni (52) a szubsztrátfelesleg aktiválás és az anionaktiválás már régóta ismert (104) kinetikáját. Az aktiváló anionkötőhely elhelyezkedését illetően azonban a szerzők csupán feltételezéssel éltek. A

többértékű

anionokat

magasabb

koncentrációban

alkalmazva

viszont

az

enzimműködés gátlása figyelhető meg (104, 115, 116), ami egyértelműen azzal magyarázható, hogy ilyenkor az anionok kiszorítják a szintén anionos szubsztrátokat az aktív centrumból.

2.9. A működés szerkezeti alapjai: molekuláris csuklók elhelyezkedése a PGK molekulában Már 1979-ben Banks és mti feltételezték, hogy a két doménnek össze kell záródnia, hogy a katalitikus reakció lejátszódhasson. Azonban egészen 1997-ig nem született egyetlen olyan kristályszerkezet sem, mely az enzimet zárt konformációban mutatta volna. A zárt kristályszerkezetek (22, 23) megszületésével több közleményben is vizsgálták a molekuláris csuklók elhelyezkedését az enzimmolekulában a rendelkezésre álló nyitott és zárt röntgendiffrakciós adatok alapján. Először két fő csukló régiót azonosítottak, a doméneket összekötő 7-es hélix N- és C-terminálisainál. A szerkezeti adatok alapján valószínű, hogy az N csukló régió függetlenül aktiválódik az egyik szubsztrát, a 3-PG kötésére (19), míg a C csukló régió szintén függetlenül, de a nukleotid kötődés hatására aktiválódik. Ezt egy enzim-inhibítor komplex

szerkezete

alapján

tételezik

26

fel

(117).

Később

laboratóriumunk

közreműködésével készült munkában azonosítottak egy harmadik csukló régiót is (25). Ennek a csukló régiónak a központi eleme az L jelű β-redő, amely a 13-as és a 14-es hélixet köti össze, és a két domén között helyezkedik el (1. ábra). A 13-as hélix a C-terminális domén szerves részét képezi, míg a 14-es hélix az N-terminális doménnel együtt mozdul a katalízis során. A βL látványos konformáció-változása (5.A ábra) elvezet a 13-as és 14-es hélix relatív helyzetének megváltozásához (5.B ábra), ami egyben a C- és N-domén helyzetét is megváltoztatja. Ennek alapján a szerzők feltételezik, hogy a konzervatív oldalláncokból álló L β-lemeznél lévő csukló régió elsődleges szereppel bír a doménmozgások irányításában és ez „vezérli” a 7-es hélix nem annyira konzervatív csukló régióit is (25).

5. ábra A βL konformációváltozása (A), valamint a 13-as és 14-es hélix relatív pozíciójának változása (B) a doménzáródás során Az ábrákon narancssárga színnel a disznóizom PGK 3-PG*MnAMP-PNP (21), piros színnel a disznóizom PGK 3-PG*MgADP (25) nyitott szerkezetű komplexei, kék színnel a T. maritima PGK 3-PG*MgAMP-PNP (23), zöld színnel a T. brucei PGK 3-PG*MgADP (26) zárt szerkezetű komplexei láthatóak. Az A ábrán a szerkezeteket a C-domén β-redői, a B ábrán pedig a 13-as hélix peptidgerinc atomjai szerint másoltam össze.

27

A rendelkezésre álló nyitott és zárt kristályszerkezeteket Szilágyi és mti (25) részletesebben is összehasonlították, melyből kiderült, hogy a 8-as és 14-es hélix közötti csatorna a doménzáródás során záródik. A 8-as hélix többé-kevésbé a C-doméntől függetlenül mozdul el, bár a C-domén részét képezi. Működik egy csukló régió a 8-as hélix N-terminálisa és a βG lemez C-terminálisa között is. Ezt a csuklót feltehetően a nukleotid kötése szabályozza. A 8-as hélix elmozdul a C-doménhez képest. Ez a mozgás is hozzájárul ahhoz, hogy a 8-as hélix parallel elhelyezkedésű lesz a 14-es hélixszel, mely az N-domén részét képezi. Ezáltal zárul ez a csatorna a két domén között, melyet már May és mti (21) is feltételeztek. A nukleotid – fehérje kölcsönhatásokat a nyitott és a zárt szerkezetekben összehasonlítva Szilágyi és mti arra következtettek, hogy a 8-as és 13-as hélixek relatív pozícióját néhány, a nukleotid kötés hatására kialakuló kölcsönhatás szabályozhatja. A doménzáródás során nemcsak közelebb kerül a két hélix egymáshoz, hanem konformációjuk is megváltozik. A csukló régiók elhelyezkedésének megállapítása a molekulában azonban csak az első lépés afelé, hogy működésüket megértsük. A csuklók működését nagy valószínűséggel bizonyos konzervatív aminosav oldalláncok kölcsönhatásainak változása irányítja. A doménzáródás a PGK működéséhez elengedhetetlennek látszik, hiszen a két szubsztrát reaktív csoportjai a nyitott szerkezetben kb. 12-15 Å távolságra vannak egymástól (118). A molekuláris csukló régiók működésének megértéséhez a konzervatív aminosavak kölcsönhatásainak összehasonlító vizsgálatára lenne szükség, amely rávilágíthat a PGK doménzáródás mikéntjére és annak részleteire.

2.10. A domének együttműködése A

fehérjelánc

térszerkezet

kialakulási-

(renaturációs),

illetve

kitekeredési

(denaturációs) folyamatainak vizsgálatai igen alkalmasak arra, hogy információt kapjuk a domének közötti kölcsönhatás mértékéről, hiszen ha a szerkezeti domének nem állnak kölcsönhatásban egymással, akkor önálló térszerkezet-kialakulási egységnek tekinthetők. Előállították több esetben is az önálló doméneket (119, 120), illetve a doméneknek nagyjából megfelelő fragmenseket (82, 121), valamint olyan Trp mutánsokat (28), melyekkel szelektíven tudták követni az egyes domének viselkedését. Hődenaturációs mérésekből megállapították, hogy a C-domén stabilabb, mint az N-domén (122-126), azonban a GuHCl segítségével végzett denaturációs kísérletek nem adtak egyértelmű eredményt a domének relatív stabilitási viszonyáról. Az élesztő PGK esetén ugyanis azt

28

találták, hogy az N-domén a stabilabb (28, 127, 128), a lóizomból (27), vagy disznóizomból (129, 130) izolált, valamint a termofil (131) PGK esetén pedig a C-domén nagyobb stabilitását tapasztalták. Az élesztő PGK hődenaturációját megvizsgálva a szerzők egyetlen kooperatív hőátmenetet figyeltek meg (122), mely a domének nagyfokú együttműködésére utalt. A domének közötti kölcsönhatások csökkenésének tulajdonították viszont azt a tényt, hogy az élesztő PGK hidegdenaturációja során (122) a két domén kitekeredését jól el lehetett különíteni. Az egyes doméneket előállítva (119), stabilitásukat megvizsgálva kiderült, hogy a C-domén az N-doménhez képest kevésbé stabil hidegdenaturáció esetén (125, 132). A hődenaturáció során viszont a C-domén a stabilabb. Kísérleteik alapján megállapították, hogy a domének együttműködéséért a két domén közötti hidrofób kölcsönhatások felelősek, melyek a hőmérséklet csökkenésével nagyságrendekkel gyengülnek (122, 132). Így lehetséges az, hogy magas hőmérsékleten, amikor a hidrofób kölcsönhatások erősek, a két domén együttműködése nagyobb mértékű, mint alacsony hőmérsékleten. Az élesztő PGK esetén 12 aminosav deléciója a C-terminálisról is alátámasztotta ezt a magyarázatot, ugyanis a szerkezet alapján megmutatták, hogy ezek közül egy konzervatív leucin egy hidrofób zseb részét képezi (132), melynek szerepe lehet a két domén közötti régió stabilizálásában. A domének közötti régióban mutált élesztő PGK (123, 133), valamint a hidegkedvelő PGK hődenaturációjának vizsgálata során (99) már jól elkülönült egymástól a két domén kitekeredése, szemben a vad típusú élesztő PGK esetén tapasztalttal. Fontos megjegyezni, hogy míg az egyik esetben a 3-PG (133), a másik esetben a 3-PG és MgADP együttes jelenlétében (99) a két átmenet helyett egy kooperatív átmenet jellemezte a fehérje kitekeredési folyamatát, ami azzal magyarázható, hogy a szubsztrátok hatására a domének közötti kölcsönhatás mértéke megnőtt. A termofil T. maritima PGK esetén az enzim hődenaturációs átmenetét fel lehetett bontani 3 átmenetre, mégpedig a domén-domén kölcsönhatás felbomlását (1. átmenet) követően a két domén szerkezetének szekvenciális kitekeredésére (126). Az ellentétes irányú, renaturációs folyamat esetén szintén a két domén szekvenciális feltekeredését feltételezve volt kvantitatívan jól leírható a disznóizom PGK reaktiválása és renaturációs időgörbéje is (129). Visszatérve az élesztő PGK vizsgálatához, az enzim doménjeinek kooperatív viselkedését több független hődenaturációs kísérletben is megfigyelték (98, 123, 124), annak ellenére, hogy az egyes domének stabilitása eltérő. A domének együttműködésének leírására Brandts és mti egy termodinamikai modellt javasoltak. Eszerint egy két doménes fehérjében a domének közötti kölcsönhatás (∆GAB) elég nagy lehet ahhoz, hogy az egyes 29

domének stabilitásának különbségét áthidalja. Számításaikat a PGK-ra is elvégezve a kölcsönhatási energia több kcal/mol-nak adódott. Ehhez a modellhez szükségük volt egy referencia állapotra, mely a két domén azon feltekeredett állapotára jellemző, amikor nincs kölcsönhatás közöttük. Ezt két módon lehetett elérni: egyrészt mutációkkal, melyek a két domén közötti kölcsönhatást gyengítik (123), másrészt az izolált domének vizsgálatával (120). A domének közötti kölcsönhatás mértéke azonban nemcsak a PGK stabilizálásában fontos. Érdekes az is, hogy milyen szereppel bír a katalitikus ciklusban a domének közötti kommunikációban. Ehhez kapcsolódó kérdés az is, hogy a szubsztrátok milyen hatással vannak a domének közötti kölcsönhatás mértékére. Ennek ismeretében derülhetne fény arra is, hogy a katalitikus aktivitásnak feltétele-e a domének közötti régió szubsztrátok általi labilizálása (95, 96) vagy esetleg stabilizálása és hogy ez a változás megengedi vagy inkább irányítja a doménzáródást.

30

3. CÉLKITŰZÉS Munkám során a domének együttműködése mikéntjét és szerepét kívántam tisztázni a két doménből felépülő PGK esetén. Amint az Irodalmi áttekintésben bemutattam, a PGK-t széles

körben

alkalmazzák

modellként

a

domének

közötti

kölcsönhatások

tanulmányozására. A munkához jó alapot szolgáltat, hogy a PGK működése enzimkinetikailag és a kémiai reakciómechanizmus szempontjából már jól jellemzett. Továbbá különböző konformációs állapotairól már nagy felbontású kristályszerkezetek állnak rendelkezésünkre. Kísérleti adatokból azt is tudjuk, hogy az enzim-szubsztrát kapcsolódás

elengedhetetlen

a

domének

együttműködése

során

megvalósuló

doménzáródáshoz. Nem tisztázott azonban, hogy a külön-külön doménen kötődő szubsztrátok egyike vagy másika, illetve mindkettő együttesen idézi-e elő a doménzáródáshoz szükséges nagy léptékű konformáció változást. Magáról a konformáció változás mikéntjéről, valamint a molekuláris csuklók elhelyezkedéséről már nagy vonalakban van ugyan elképzelésünk, de még nem ismert, hogy az egyes doméneken kötődő szubsztrátok pontosan milyen atomi szintű kölcsönhatásokon keresztül irányítják a kötőhelyüktől távol eső csukló-régiók működését. Értekezésemben ezekre a kérdésre kívántam választ adni. Mindenekelőtt azonban tisztázni kellett az egyes szubsztrátok kötődési módját leíró bizonytalanságokat. Ennek alapján a következő munkatervet követtem: 1.

A nukleotid trifoszfát, MgATP még nem ismert kötődési módjának jellemzése és a Mg2+ szerepének tisztázása a krisztallográfiás analízist kiegészítő enzimológiai módszerekkel (melyek a kristályos és oldott enzim eltérő viselkedésére is rávilágíthatnak): •

kinetikai kettősgátlás-kísérletekkel,

•

izotermális kalorimetriás titrálással és

•

differenciális pásztázó mikrokalorimetriás stabilitás-vizsgálatokkal;

2.

Az instabil 1,3-BPG szubsztrát kötődési módjának meghatározása molekuláris modellezéssel;

3.

Az enzimaktivitást szabályozó (aktiváló és gátló) anionok komplex hatásmechanizmusának és a doménzáródással való kapcsolatának felderítése: •

kötődés-vizsgálatokkal,

•

mikrokalorimetriás stabilitás-vizsgálatokkal,

31

•

enzimkinetikai analízissel, különös tekintettel az 1,3-BPG és MgADP szubsztrátokkal működő enzim esetére és

•

lehetséges

kötőhelyük

megállapítása

kristályszerkezeti

analízissel

és

molekuláris modellezéssel; 4.

A MgATP-vel, az 1,3-BPG-vel, illetve az aktiváló anionokkal potenciálisan kölcsönható oldalláncok azonosítása helyspecifikus mutagenezissel és a mutáns fehérjék jellemzése egyensúlyi kötődési kísérletekkel és enzimkinetikai analízissel;

5.

További célként tűztem ki a szubsztrátok domének együttműködésére gyakorolt (pl. az egyik doménről a másikra átterjedő) hatásának vizsgálatát mikrokalorimetriás, illetve fluorimetriás hőátmenetek meghatározásával, az egyes doménekben jelenlévő, illetve mutagenezissel szelektíven beépített fluoreszcens Trp oldalláncok segítségével •

a szubsztrátmentes enzim,

•

az egyes szubsztrátokkal külön-külön alkotott biner komplexek,

•

a mindkét szubsztrát jelenlétében képződő terner komplexek, és

•

a kémiailag módosított, inaktív, de a szubsztrátokat jól kötő CM-PGK esetén, ahol a domének katalitikus együttműködése nem valósul meg;

6.

A fenti kísérleti eredményekre támaszkodva a rendelkezésre álló 12 különböző nagy felbontású PGK kristályszerkezet (ez különböző biner és terner enzimszubsztrát komplexeket, továbbá különböző konformációs állapotú, nyitott és zárt szerkezeteket jelent) atomi koordinátái szisztematikus összehasonlításával kívántam a domének együttműködésének és a doménzáródás mechanizmusának egy lehetséges atomi szintű leírását adni. Ehhez fel kellett térképezni a konzervatív oldalláncok

kölcsönhatásait,

illetve

módszerrel.

32

azok

változásait

molekuláris

grafikai

4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Anyagok A

kísérletekhez

különböző

eredetű

PGK

enzimeket

használtam.

Egyrészt

disznóizomból izoláltam (19), és ammónium-szulfát, valamint 1 mM EDTA és 2 mM DTT jelenlétében mikrokristály szuszpenzió formájában tároltam. Aktivitása, 3-PG-t és MgATP-t használva szubsztrátként 500 és 700 kat/mol között változott. A karboxamidometilezett, CM-PGK-t a disznóizom PGK jódacetamiddal való reakciója során állítottam elő Dékány és Vas közleményében leírtak szerint (134). Az alkilezés az adott körülmények között szelektíven a PGK két SH-csoportját (C378 és C379) érinti, melyek a 13-as hélixben találhatóak. A reakciót 10 mM DTT hozzáadásával állítottam le, majd a reagensfelesleget dialízissel távolítottam el. A vad típusú élesztő PGK-t a Sigma-tól vásároltuk. Az élesztő PGK két mutánsát (135) Osváth Szabolcs (SOTE Biofizikai Intézet, Budapest) állította elő. A mutánsok az N- illetve a C-terminális doménben tartalmaztak szelektíven 1-1 Trp oldalláncot: a W380F,W333F,Y122W hármas mutáns, melyet az egyszerűség kedvéért W122-nek nevezek; és a W308F egyszeres mutáns, melyet a továbbiakban W333-nak nevezek. Mindkét

mutáns

6

His-ből

álló

ún.

His

tag-et

tartalmazott

az

enzim

C-terminálisán. A humán PGK génjét pET11c vektorba klónozva P. J. Hoggtól kaptuk (University of New South Wales, Sydney, Ausztrália). A hPGK-t E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL törzs sejtjeiben overexpresszáltuk. Ezután a sejteket szonikálással feltártam, majd a disznóizom

PGK

izolálásánál

is

alkalmazott

(NH4)2SO4-os

frakcionálás

után

CM-sepharose oszlopon tisztítottam. A hPGK E. coli sejtekben történő kifejezését és az alább leírt helyspecifikus mutációkat Flachner Beáta segítségével viteleztem ki. A 38-as és a 215-ös pozícióban lévő aminosavakat kódoló bázisokat a QuikChange helyspecifikus mutációs kit segítségével cseréltük ki. Az alkalmazott primereket az 5. táblázat tartalmazza. A mutációkat DNS szekvenáltatással ellenőriztük. A 3-PG és MgATP szubsztrátokból kiinduló reakció kinetikai vizsgálatához (4.2.3.1. fejezet) szükséges segédenzimet, a glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenázt (GAPDH) (350 kat/mol) disznóizomból izoláltam (136), és a PGK-hoz hasonló körülmények között tároltam. Az 1,3-BPG és MgADP szubsztrátokból kiinduló reakcióban (4.2.3.2. fejezet) alkalmazott hexokináz (HK) segédenzimet liofilizált por, a glükóz-6-foszfát dehidrogenáz

33

(G6PDH) segédenzimet (NH4)2SO4-os kristályszuszpenzió formájában a Sigmától vásároltuk. A G6PDH segédenzimet a szennyező PGK-tól Superose12 oszlopon (Pharmacia) eltérő molekulatömegük alapján választottam el. A piruvát kináz (PK) és a tejsav dehidrogenáz (LDH) kristályszuszpenzióit a Boehringertől vásároltuk. 5. táblázat: A helyspecifikus mutációk elvégzéséhez tervezett primerek A második oszlop a megfelelő aminosavat kódoló bázishármasban történt 1 vagy 2 báziscserét mutatja. Az új bázishármas, mely kb. a primer közepén helyezkedik el, az új aminosavat kódolja.

Mutáció

Báziscsere

Primerek (a második sor a reverz komplementer láncot jelenti)

R38A

AGG→GCG

5’ CAAACAACCAGGCGATTAAGGCTGCTGTCC 3’ 5’ GGACAGCAGCCTTAATCGCCTGGTTGTTTG 3’

K215A

AAA→AGA

5’ CATCCTGGGCGGAGCTGCAGTTGCAGACAAGATC 3’ 5’ GATCTTGTCTGCAACTGCAGCTCCGCCCAGGATG 3’

Minden kísérlet, kivéve az enzimkinetikai méréseket 50 mM Tris-HCl pufferben (pH=7,5) történt, mely 1 mM EDTA-t és 1 mM DTT-t tartalmazott. Az enzimkinetikai méréseket, ahol biztosítani kellett az alacsony ionerősséget, 20 mM Tris-HCl pufferben, EDTA távollétében (pH=7,5) végeztem, mely 1 mM DTT-t tartalmazott. Az enzimeket mindig az adott méréstípus által meghatározott pufferrel szemben dializáltam és –80oC-on tároltam (PGK esetén 20 mg/ml (0,4 mM), a segédenzimeket pedig kb. 5 mg/ml koncentrációban lefagyasztva). Ilyen körülmények között a PGK aktivitása több hónap elteltével sem csökken. A DTNB-vel (4.2.5.2. fejezet), illetve a jódacetamiddal történő kémiai módosítást megelőzően a DTT-t dialízissel eltávolítottam, hogy a DTNB, ill. a jódacetamid ne a DTT-vel reagáljon, hanem a fehérjével. Az izotermális titráló mikrokalorimetriához előkészített enzimek dialízisénél a DTT-t 5 mM merkaptoetanollal helyettesítettem. Valamennyi kísérletet 20 oC-on végeztem. A 3-PG, annak analógjai (2-PG, 2,3-BPG), az ATP, az ADP, az AMP, és az adenozin Na-sója Boehringer gyártmány volt, az AMP-PNP-t és az AMP-PCP-t a Sigmától vásároltuk. Az ATP-ből és az ADP-ből a MgATP ill. MgADP-t MgCl2 (Sigma) hozzáadásával állítottam elő. A nukleotidok fémkomplexeinek disszociációs állandóit rendre 0,1 mM ill. 0,6 mM-nak vettem, átlagolva az irodalmi adatokat (73, 137-140). Az AMP-PNP és az AMP-PCP Mg-komplexeit hasonló módon állítottam elő az irodalomban leírt Kd értékek alapján, melyek rendre: 0,09 és 0,08 mM (70). Az alkalmazott NADH, PEP, NADP és glükóz Sigma gyártmány volt. Az 1,3-BPG-t glicerinaldehid-3-foszfátból (G-3-P) preparáltuk Negelein enzimatikus módszerének (141) Furfine és mts-a általi módosításával (142), melyhez a G-3-P-t dietilacetál-diciklohexil ammónium só

34

formájában a Boehringertől vásároltuk. Az Ellmann féle reagenst (DTNB) a Servától vásároltuk. Az IPTG-t (Fermentas), a klóramfenikolt és az ampicillint (Sigma) a fermentációhoz használtuk. A QuikChange mutagenezis kitet a Stratagene-től vásároltuk. A primereket a Szegedi Biológiai Központban állították elő. A többi használt vegyszer is analitikai tisztaságú volt.

4.2. Módszerek 4.2.1. A fehérjeoldatok koncentrációjának meghatározása A fehérjekoncentráció meghatározások során az ε280 értéket, azaz a fehérje moláris abszorpciós koefficiensét 280 nm-en Pace és mti szerint (143) M-1cm-1 egységekben számítottuk: a disznóizom, illetve a hPGK esetén 27900, a vad típusú élesztő PGK esetén 21400, a W122 mutáns esetén 14400 és a W333 mutáns esetén 15900 értékeket kaptunk. Az 1 mg/ml-es oldatok abszorbanciáját 280 nm-nél 1 cm fényúton kísérletileg is meghatározták és a disznóizom PGK, az élesztő PGK és a GAPDH esetén rendre 0,69 (40), 0,49 (40) és 1,0 (144) értékeket közöltek. A monomer PGK és a tetramer GAPDH molekulatömege (rendre 44,5 kDa (52) és 145 kDa (145)) ismeretében a kísérleti adatokból is kiszámítottam a megfelelő moláris abszorpciós koefficiens értékeket, melyek jól egyeznek a Pace és mti szerint számítottakkal. A többi segédenzimből kb. 5 mg/ml-es törzsoldatot készítettem. A G6PDH esetén a számolt abszorpciós koefficiens Pace és mti alapján (143): 69790 M-1cm-1, az enzim molekulatömege 54,3 kDa

4.2.2. A szubsztrátok koncentrációjának meghatározása 4.2.2.1. Az ADP koncentrációjának meghatározása Enzimatikusan: A meghatározáshoz a piruvát kináz által katalizált reakciót használtam, tejsav dehidrogenázt alkalmazva segédenzimként: PK MgADP + PEP → piruvát + MgATP

2. egyenlet

piruvát + NADH LDH  → tejsav + NAD

3. egyenlet

A MgADP szubsztrátot alacsony koncentrációban alkalmaztam (kb. 0,1 mM), hogy teljes mennyiségében átalakuljon, az enzimeket pedig nagy fölöslegben (kb. 10-4 mM koncentrációban), hogy a reakció gyorsan végbemenjen. A kísérlet során a NADH abszorbanciájában bekövetkező teljes változást regisztráltam 340 nm-nél (εNADH, 35

340nm

=

6220 M-1cm-1). A NADH koncentrációjának változása az egyenletek szerint megegyezik az elegyben lévő ADP koncentrációjával, hiszen az összes elreagált. Spektrofotometriásan: A meghatározás 260 nm-nél, az ε = 15000 M-1cm-1 moláris abszorpciós koefficiens alapján történt. 4.2.2.2. Az ATP koncentrációjának meghatározása Enzimatikusan: A meghatározáshoz a PGK által katalizált reakciót használtam, segédenzimként a GAPDH-t alkalmazva. A reakcióegyenletek megtalálhatók a 4.2.3. fejezetben. A reakcióelegy annyiban tér el az enzimaktivitás meghatározásához használt elegytől, hogy a MgATP szubsztrátot alacsony koncentrációban (kb. 0,1 mM) alkalmaztam, hogy teljes mennyiségében átalakuljon. A reakcióelegy az enzimeket kb. 10-4 mM koncentrációban tartalmazta, hogy a reakció gyorsan végbemenjen. A kísérlet során a NADH abszorbanciájában bekövetkező teljes változást regisztráltam 340 nm-nél, hasonlóan a 4.2.2.1. pontban leírtakhoz. Spektrofotometriásan: A meghatározás 260 nm-nél, az ε=15400 M-1s-1 moláris abszorpciós koefficiens felhasználásával történt. 4.2.2.3. A 3-PG koncentrációjának meghatározása A meghatározás enzimatikusan történt, melyhez a 4.2.2.2. pontban leírt rendszert és elvet alkalmaztam, csupán itt a 3-PG-t alkalmaztam viszonylag kis koncentrációban (kb. 0,1 mM), hogy teljes mennyiségében át tudjon alakulni a rendszerben. 4.2.2.4. Az 1,3-BPG koncentrációjának meghatározása Az 1,3-BPG koncentrációjának meghatározása enzimatikusan történt: 1,3-BPG +NADH + H+ GAPDH  → G-3-P + NAD + Pi

4. egyenlet

A reakció során a NADH oxidációját követtem 340 nm hullámhosszon. Az 1,3-BPG-t kb. 0,1 mM koncentrációban alkalmaztam, hogy a reakcióban teljes mennyisége átalakuljon.

36

4.2.3. A PGK enzimaktivitásának meghatározása 4.2.3.1. 3-PG és MgATP szubsztrátokból kiinduló enzimreakció A PGK aktivitását a 3-PG és a MgATP szubsztrátokból kiindulva GAPDH segédenzimet használva mértem a NADH oxidációjának spektrofotometriás követésével 340 nm-nél (55). Ebben a rendszerben a PGK reakcióban keletkező 1,3-BPG reagál tovább a GAPDH segédenzimmel katalizált reakcióban (ld. 5. és 6. egyenletek). Ez utóbbi reakció résztvevő partnere még a NADH, amely a spektrális jelet szolgáltatja az egész folyamat követéséhez. Ahhoz, hogy ténylegesen a PGK aktivitást határozzuk meg, az szükséges, hogy a konszekutív reakcióban a PGK által katalizált folyamat legyen a sebességmeghatározó. PGK MgATP + 3-PG  → MgADP + 1,3-BPG

5. egyenlet

1,3-BPG +NADH + H+ GAPDH  → G-3-P + NAD + Pi

6. egyenlet

4.2.3.2. 1,3-BPG és MgADP szubsztrátokból kiinduló enzimreakció A PGK aktivitását az 1,3-BPG és a MgADP szubsztrátokból kiindulva HK és G6PDH segédenzimeket használva mértem a NADP redukciójának spektrofotometriás követésével 340 nm-nél (105). Ebben a rendszerben a PGK reakcióban keletkező MgATP a reagál tovább a HK és G6PDH segédenzimekkel katalizált reakciókban (ld. 7-9. egyenletek). A harmadik reakció résztvevő partnere a NADP, amely oxidációjával keletkező NADPH (εNADPH,

340nm

= 6220 M-1cm-1) a spektrális jelet szolgáltatja az egész folyamat

követéséhez. Esetenként a jóval érzékenyebb fluorimetriás módszert használtam a folyamat követésére. A gerjesztés 355 nm-en történt, a NADPH emisszióját pedig 455 nm-en követtem. Ahhoz, hogy ténylegesen a PGK aktivitást határozzuk meg, az szükséges, hogy a konszekutív reakcióban a PGK által katalizált folyamat legyen a sebességmeghatározó. PGK MgADP + 1,3-BPG  → MgATP + 3-PG

7. egyenlet

HK MgATP + glükóz → MgADP + G-6-P

8. egyenlet

G-6-P+ NADP+ G6 PDH  → NADPH + H+ + G-6-P-L

9. egyenlet

37

4.2.4. A PGK enzimkinetikai vizsgálata és az alkalmazott kinetikai egyenletek 4.2.4.1. Az aktivitás szubsztrátkoncentráció-függésének meghatározása A kísérletekben az egyik szubsztrátot állandó (telítési) koncentrációban alkalmaztam, miközben a másik szubsztrát koncentrációját változtattam. Az így kapott görbékből a 2-2 szubsztrát párra (3-PG és MgATP; 1,3-BPG és MgADP) meghatároztam az enzimszubsztrát kölcsönhatást jellemző kinetikai paramétereket, melyeket a következőekben fogok részletezni. A) A 3-PG és MgATP szubsztrátokból kiinduló reakció A Szilágyi és Vas által korábban leírt (52) kétkötőhelyes modellt alkalmaztam a szubsztrátfelesleg aktiválás jellemzésére: v = vS ⋅

[S]

S K kat + [S]

+ vS ⋅ ( a − 1 ) ⋅

[S]

⋅

[S]

S S K kat + [S] K akt + [S]

10. egyenlet

Az egyenlet első tagja írja le a katalitikus hely telítődését a szubsztráttal, vagyis az aktivitást az aktiválás hiányában. Eszerint vS jelöli a katalitikus hely telítésekor mérhető hipotetikus aktivitást, ha aktiválás nem lépne föl. Az egyenlet második tagja írja le az S S aktiváló hely telítődéséből adódó aktivitás-növekedést. K kat és K akt rendre a katalitikus és

az aktiváló helyek megfelelő disszociációs állandók (a szubsztrátok kötődésének gyors egyensúlya miatt), míg a az aktiválási faktort jelöli. Ha a szubsztrát mind a katalitikus, mind az aktiváló helyet telíti, akkor az aktivitás a ⋅ v S lesz. Ezzel az egyenlettel illesztve a szubsztrát (S) koncentrációjának függvényében mért kísérleti aktivitás ( v ) értékeket, S S meghatározhatjuk az adott szubsztrátra jellemző K kat és K akt paramétereket és az

aktiválási faktor ( a ) értékét. Az R38A és a K215A mutánsok esetén a szubsztráttelítési görbéket a Michaelis-Menten egyenlettel illesztettem. B) Az 1,3-BPG és MgADP szubsztrátokból kiinduló reakció A szubsztráttelítési görbéket a Michaelis-Menten féle kinetikai egyenlettel írtam le. Az 1,3-BPG

Km

értékének

meghatározásához

az

enzimaktivitás

mérésekor

a

spektrofotometriásnál jóval érzékenyebb fluorimetriás módszert alkalmaztam. Erre azért volt szükség, mert az alacsony 1,3-BPG koncentrációknál (1-2 µM alatt) még a szubsztrát teljes elfogyásakor mérhető teljes fényelnyelés-változás is nagyon kicsi. Tehát az alacsony szubsztrátkoncentrációknál az aktivitást jellemző kezdeti egyenes meredekségét csak pontatlanul lehet megállapítani. Az 1,3-BPG rendkívül alacsony Km-jének közvetlen méréssel történő meghatározása még az érzékenyebb fluorimetriás módszerrel sem 38

bizonyul elég pontosnak. Azonban, ha az enzimreakciót 3-PG hozzáadásával gátoljuk, azaz az 1,3-BPG-t kiszorítjuk a kötőhelyéről, az 1,3-BPG Km-je látszólag megnő, amely már megfelelő pontossággal meghatározható. Mivel a gátlás kompetitív, a 3-PG KI-je, azaz gátlási állandója ismeretében, a valódi Km kiszámítható a következő képlet szerint:

Km =

K mapp K I [I] + K I

11. egyenlet

4.2.4.2. Anionok hatásának vizsgálata A kísérletekben az enzim aktivitását állandó szubsztrátkoncentráció mellett határoztam meg anionok jelen- illetve távollétében. Mivel a vizsgált anionok (pirofoszfát, citrát és foszfát)

a

segédenzimeket

gátolhatják,

ezért

azokat

a

szokásosnál

magasabb

koncentrációban alkalmaztam. A szükséges koncentrációt mindig az adott kísérletben határoztam meg úgy, hogy az aktivitásmérő elegyhez adott segédenzim(ek) mennyiségét addig növeltem, amíg a PGK aktivitásának további növekedését már nem tapasztaltam.

Az aktiválás-gátlás görbék kvantitatív kinetikai leírása Az anion koncentráció függvényében végzett kinetikai mérések leírása a következő egyenlettel történt, amely az anionok hatásának leírására korábban használt egyenlet (52) módosított formája: v = vo + vo (a − 1)

[L] A K akt

n  [ L]  [L] − vo + vo (a − 1) A  A n + [L]  K akt + [L] K inh + [L]

12. egyenlet

Itt vo az enzim aktivitása anion (az L ligandum) távollétében egy adott szubsztrát koncentráció mellett, a pedig az aktiválási faktor, és azt mutatja meg, hogy a ligandum kötődésének hatására annak végtelen koncentrációjánál az aktivitás hányszorosára emelkedne, amennyiben egyéb hatás (pl. gátlás) nem lépne fel. Ebből következik, hogy az a mindig egynél nagyobb érték. A vo (a − 1) koefficiens az aktiváló hely telítéséből

származó nettó aktivitásnövekedésnek felel meg, továbbra is feltételezve, hogy a ligandum csak az aktiváló helyhez kötődik. A 12. egyenlet harmadik, negatív előjelű tagja felel meg a gátlásnak. Az egyenlet több, egymással kölcsönhatásban lévő gátlóhelyet tételez fel az enzim szerkezetében, ezt jelzi az n hatványkitevő. Ezzel az egyenlettel illesztve az L koncentrációjának függvényében meghatározott kísérleti aktivitás ( v ) értékeket, meghatározhatjuk a vizsgált ligandumra az aktiváló és gátlóhely(ek)hez tartozó A A látszólagos disszociációs állandókat ( K akt , K inh ) és az a, valamint az n paraméterek

39

értékét. Az n az ún. Hill koefficiens értéke, mely megadja a gátlóhelyek minimális számát. A valódi állandókat az alábbi egyenletekkel lehet kiszámolni a látszólagos állandókból, feltételezve, hogy az anionok kompetitív módon kiszorítják a szubsztrátokat, mind az aktiváló, mind pedig a gátlóhelyről: K

A akt

K

A inh

=

=

A S K akt, app K akt

13. egyenlet

[S] + K aktS

A S K inh, app K kat

14. egyenlet

[S] + K katS

4.2.4.3. Két gátlószer együttes hatásának vizsgálata A kettősgátláskísérletekben az enzim aktivitását állandó szubsztrátkoncentráció mellett, két különböző gátlószer jelenlétében mértem. Az egyik gátlószer jelen-, illetve távollétében ismételtem meg a méréseket, miközben a másik gátlószer koncentrációját változtattam. A kísérleti eredményeket Yonetani & Theorell (146) ábrázolásban elemeztem. Az aktivitási elegy anionokat, ill. adenozint, nukleotidokat, valamint nukleotid analógokat is tartalmazott, ezért különösen kellett arra figyelni, hogy elegendő segédenzim legyen jelen az enzimreakió lejátszódásakor. Az anionok, illetve a nukleotid szubsztrátok és szubsztrátanalógok jelenlétében végzett kinetikai mérések (ld. 4.2.4.2. fejezet is) értékelésénél kvantitatív módon figyelembe vettem azt is, hogy nemcsak a nukleotidok, hanem az anionok is képeznek komplexet a Mg2+-nal. Az anionaktiválás-gátlás és a kettősgátlás kísérletekben használt anionok tehát elvonhatják a Mg2+-ot az ATP-től, s ezáltal csökkenhet az enzimaktivitás, mivel az ATP nem szubsztrát, csak a MgATP. A számolás során két egyensúlyi egyenletet kellett figyelembe venni: az egyik a Mg2+ ATP-vel alkotott komplexére (4.1. fejezet), a másik pedig a Mg2+-nak a kísérletben szintén jelen lévő anionnal képzett komplexére vonatkozik. Az utóbbi esetben a következő disszociációs állandókat vettem figyelembe: Kd,Mgcitrát=0,66 mM (147), Kd,Mgpirofoszfát=0,43 mM, Kd,Mgfoszfát=15,8 mM (148). Az így felállított egyenletekből kiszámoltam a MgATP egyensúlyi koncentrációját, majd a kinetikai mérések értékelésénél ezt a koncentrációt vettem figyelembe, mint szubsztrát koncentrációt. Az anionkoncentráció függvényében történt mérések esetén minden egyes mérési pontban más és más mértékben kellett korrekcióba vennem a MgATP komplex koncentrációjának csökkenését és ennek hatását az enzimaktivitásra. Ezen mérték

40

megállapításához segítségül vettem a PGK aktivitás ismert (általam is mért) MgATP telítési görbéjét, amelyről pontosan leolvashattam, hogy a MgATP koncentráció csökkenése milyen mértékű aktivitás csökkenéssel jár az adott esetben. Az így megállapított faktorral korrigált aktivitásértékek szerepelnek az ábrákon (pl. 6. ábra). Azért volt célszerű ily módon figyelembe venni a MgATP koncentrációjának csökkenését, mert a kísérletekben nem lehet határtalanul emelni a Mg2+ koncentrációját a Clkoncentráció emelése nélkül, amely anion szintén hatással lenne az aktivitásra.

4.2.5. A PGK-ligandum kölcsönhatások egyensúlyi vizsgálata 4.2.5.1. Izotermális titráló mikrokalorimetria (ITC) A méréseket MicroCal VP-ITC típusú mikrokaloriméterrel (MicroCal Inc.) viteleztük ki a Veszprémi Egyetemen Gugolya Zoltán és Vonderviszt Ferenc közreműködésével. A fehérje- és a titráló ligandum mintákat ugyanazzal a pufferrel szemben dializáltuk, a pH-t 7,5-re állítottuk be és a mérés előtt ellenőriztük. Az állandó hőmérséklet fontossága miatt a mintákat a mérés előtt 1-2 órán át 20 oC-on termosztáltuk, továbbá gondosan légtelenítettük a vákuumban történő keveréssel. A minta-cella kb. 0,5-1 mM koncentrációban tartalmazta a PGK-t, a referencia-cellában a fehérjét azzal a pufferrel helyettesítettük, amellyel szemben dializáltuk. A minta és a referenciacellában lévő oldatok titrálását 5 µl térfogatú titráló ligandum injektálásával végeztük 3 percenként ismételve az injektálást (kb. 60 lépésben). A cellák térfogata 1,42 ml. A mérés során a ligandum fehérjéhez való kötődése során jelentkező hőváltozást detektáltuk. A puffer titrálásakor kapott kis hőeffektust korrekcióban vettük a fehérjeoldat titrálásakor kapott érték meghatározásánál. Az adatokat 1:1 sztöchiometria feltételezésével analizáltuk MicroCal Origin 5.0 programot használva. 4.2.5.2. Kémiai módosítás közvetett módszere Felhasználva azt a tényt, hogy a PGK-hoz kötődő ligandumok (szubsztrátok és anionok) nagymértékben csökkentik az enzim gyorsan reagáló SH-csoportjainak a reakciókészségét (85), az SH-módosítás sebességének ligandum koncentráció függéséből – azaz közvetett módon – határoztam meg az illető ligandum kötődési állandóját. A módszer megbízhatóságát mutatja, hogy az ily módon meghatározott kötődési állandók jó egyezést mutatnak az egyensúlyi dialízissel korábban meghatározott (57) kötődési állandókkal. 41

A kísérletekben reagensként DTNB-t használtam, amelyet az enzim SH-csoportjaihoz viszonyítva legalább 5-10-szeres moláris feleslegben alkalmaztam. Az abszorbanciában bekövetkező növekedést mértem spektrofotometriásan 412 nm-es hullámhossznál, mely a keletkező tiolát-anionnak (ε=14150 M-1s-1) tulajdonítható (15. egyenlet). A reakció lejátszódása során, a szabadon hozzáférhető tiol oldalláncok (PGK mólonként 2) gyorsan elreagálnak, az eltemetett tiol oldalláncok (PGK mólonként 5) reakciója elhanyagolható (85). A gyorsan reagáló SH-csoportokat azonosították: Cys 378 és Cys 379 (149, 150). A reagáló tiol-csoportok ε412=14150 M-1cm-1 (151) alapján számított mennyisége a kísérletekben közelítőleg 1,5-2 mol / mol PGK-nak adódott.

(DTNB) 15. egyenlet: Az tiol csoportok DTNB-vel (5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoát)) történő kémiai módosításának egyenlete A reakció másodrendű, de visszavezethető egy elsőrendű reakciónak megfelelő kinetikára, ugyanis a kinetikai egyenletben szereplő DTNB koncentrációja megfelelő felesleg alkalmazása esetén a kísérlet során gyakorlatilag nem változik.

Szubsztrátok és egyéb ligandumok (pl. anionok) Kd értékeinek meghatározására alkalmazott egyenletek: Minden számításban 1:1 sztöchiometriát alkalmaztam a következő kötődési egyenletnek megfelelően:

Y=

[EL] [E]össz

=

[L] K d + [L]

16. egyenlet,

ahol Y az enzim szubsztráttal való telítődésének mértéke,

[E]össz

jelenti a teljes

enzimkoncentrációt, mely megegyezik azon kötőhelyek számával, melyek az L ligandummal telítődnek. [EL] az enzim-ligandum komplex koncentrációja, K d pedig a disszociációs állandó. Míg az Y értéke 0 és 1, addig [L] értéke 0 és ∞ között változik. Ahogy már korábban leírtam, az enzim kémiai módosításával szembeni védőhatás mértéke arányos a keletkezett enzim-ligandum komplex mennyiségével [EL] , melyből a K d

42

számolható, mégpedig a mért sebességi állandók következő egyenlettel történő illesztéséből: k mért = k max −

(k max − k min ) ⋅ [L] K d + [L]

17. egyenlet,

azaz a telítés mértéke: Y=

k max − k mért k max − k min

18. egyenlet,

ahol k max ligandum távollétében, illetve k min az enzim ligandummal való telítésekor mérhető tiol-módosítás sebességi állandója, k mért

pedig a különböző ligandum

koncentrációknál mért sebességi állandó. A szabad ligandum koncentráció [L] egyenlőnek vehető a kísérletben alkalmazottal, mert az alkalmazott PGK koncentrációnál (7-10 µM) a ligandum enzimen kötött mennyisége elhanyagolható. Az 1,3-BPG szubsztrát K d értékének meghatározását 3-PG jelenlétében végeztem, ugyanis az 1,3-BPG nagyon szorosan kötődik, azaz a DTNB-s reakció követésére alkalmazott enzimkoncentrációknál már sztöchiometrikus mennyiségű 1,3-BPG is teljes egészében kötve marad az enzimen. Kihasználva azonban azt a tényt, hogy a 3-PG kompetitíven képes kiszorítani az 1,3-BPG-t a kötőhelyéről, 3-PG jelenlétében az 1,3-BPG K d -jét látszólag növelni lehet. Ez a K dapp már a DTNB-s reakcióval kísérletesen meghatározható. 3-PG jelenlétében a 17. egyenletben szereplő K d

a K dapp -sel

helyettesíthető. Mivel tisztán kompetitív helyettesítésről van szó, a valódi K d és a látszólagos értéke, a K dapp között a következő összefüggés áll fenn:  [V]  K dapp = K d 1 +   KV 

Kd =

19. egyenlet,

K dapp K V

20. egyenlet,

[V] + K V ahol [V ] a kompetítor (3-PG) koncentrációja, KV pedig az enzimhez való disszociációs állandója. A 3-PG Kd-je ismeretében tehát az 1,3-BPG K d -je a 20. egyenlet segítségével számolható.

43

4.2.6. Az enzimszerkezet stabilitásának vizsgálata 4.2.6.1. Differenciális pásztázó mikrokalorimetria (DSC) A PGK hő hatására bekövetkező denaturációját DSC kísérletekben vizsgáltam. A méréseket MicroCal VP-DSC típusú mikrokaloriméteren (MicroCal) viteleztem ki, melynek cellatérfogata 0,51 ml. A felfűtési sebesség 1

o

C/perc–nek választottam.

Amennyiben a felfűtési sebesség nem ennyi volt a kísérletben, azt a megfelelő ábra aláírásában jeleztem. A fehérjekoncentráció minden kísérletben 0,003 mM (0,13 mg/ml) volt. A minta cella a fehérjeoldatot, a referencia cella pedig azt a puffert tartalmazta, mellyel szemben a fehérjeoldatot előzetesen dializáltuk. A mérés alatt a készülék a mintaés referencia-cella hőmérsékletét 0,1 °C pontossággal azonos hőmérsékleten tartotta, miközben a hőmérsékletet egy meghatározott program szerint (például 1 °C/perc) változtatta. Ehhez azonban a készüléknek hőenergiát kellett befektetni. Ezzel a módszerrel a fehérje szerkezet hő hatására történő felbomlásához szükséges hőmennyiséget (Qt), másrészt pedig a natív → denaturált átalakulást jellemző „olvadási” hőmérsékletet (Tm) lehet meghatározni. A hőmérséklet emelése során a fehérje szerkezete denaturálódik. Minél magasabb hőmérsékleten következik be ez a folyamat, annál stabilabb a fehérje szerkezete. Mivel a ligandumok kötődése általában függ a hőmérséklettől, ezért a különböző ligandumok szerkezetre gyakorolt hatásának vizsgálatánál fontos, hogy az enzim a felfűtés alatt is telítve legyen az adott ligandummal. Ezért ellenőriztem, hogy az adott hőmérséklet-tartományban a ligandumok mely koncentrációnál fejtik ki a maximális hatásukat. A Tm Mg2+-koncentrációtól való függését (10. ábra) a következő egyenlettel vettük figyelembe, melyet a mérési adatainkra illesztettünk (hasonlóan a 17. egyenlethez):

Tmért = Tmax −

(Tmax − Tmin ) [Mg 2+ ]

21. egyenlet,

K + [Mg 2+ ]

ahol Tmax Mg2+ távollétében, Tmin Mg2+ jelenlétében mért olvadási hőmérséklet, Tmért pedig a különböző Mg2+ koncentrációknál kapott olvadási hőmérséklet. K az enzim-Mg2+ komplex disszociációs állandója. A mérési adatok kvantitatív értékeléséhez kétállapotú irreverzibilis modellt alkalmaztam (152): 44

k

N → D

22. egyenlet,

ahol N és D a fehérje natív és denaturált formája, k pedig az elsőrendű sebességi állandó. Az elsőrendű sebességi állandó (k) a kalorimetriásan meghatározott hőkapacitás görbe alakjával áll összefüggésben, mégpedig a következő egyenlet szerint (152):

k=

vCp

23. egyenlet,

Qt − Q

ahol v a felfűtési sebesség, Cp a kísérletileg mért hőkapacitás, Qt a folyamatot kísérő teljes hőváltozás (ez megegyezik a hőátmenetet leíró kalorimetriás görbe alatti területtel), Q pedig az adott hőmérsékletig bekövetkező hőváltozás. Az ily módon kapott sebességi állandót a hőmérséklet függvényében analizáltam az Arrhenius összefüggés szerint:

k = A exp(− E / RT )

24. egyenlet,

ahol A a preexponenciális faktor, E pedig az aktiválási energia, R az egyetemes gázállandó, T pedig az abszolút hőmérséklet. A és E termodinamikai mennyiségekkel fölírva: k BT

A=

és

h

E = ∆G ‡

25. egyenlet,

ahol kB a Boltzmann állandó, h a Planck állandó és ∆G ‡ a PGK molekula kitekeredési folyamatának aktiválási szabadentalpiája. Bár a preexponenciális faktor kifejezése csak gázfázisra érvényes, és elhanyagolja az oldószer-hatást, ezt az összefüggést egy közelítésnek tekintettük, mely az aktiválási energiagátat jellemzi. A folyamat aktiválási ‡

entalpiájának ( ∆H ) és az aktiválási entrópiájának ( ∆S ‡ ) meghatározásához az Arrhenius egyenletet a következőképpen kell átalakítani: ln

k k ∆S ‡ ∆H ‡ = ln B + − T R RT h

26. egyenlet

Az ln(k/T) versus 1/T ábrázolás egyenest ad, melynek a meredeksége és az ordináta metszete rendre megadja a ∆H ‡ és a ∆S ‡ értékeket. A kalorimetriás adatokat egy másik típusú átalakítás után is ábrázoltam (152): ln ln

Qt E E = − Qt − Q RTm RT

27. egyenlet

ahol a Tm az átmeneti hőmérséklet. Az lnln(Qt/Qt-Q) versus 1/T ábrázolás egyenest adott. A fluorimetriás hőátmenet (ld. alább) mérések analízisét ehhez hasonló módon végeztem el. 45

4.2.6.2. Fluorimetria A fluorimetriás vizsgálathoz kettős monokromátorral ellátott Peltier termosztáttal felszerelt SPEX Fluoromax-3 spektrofluorimétert használtam. A fehérjék többségében a fluoreszcencia főként a triptofánnak köszönhető. Emellett a tirozin viselkedhet még fluoreszcensként, de jóval kisebb az általa kibocsátott fény intenzitása. Így ha a fehérjékben nincs triptofán, és a tirozinok száma is csekély, fluoreszcenciás analízis nem adhat megbízható eredményt. A disznóizom PGK-ban 4 triptofán aminosav helyezkedik el a C-doménben (25), ezek megfelelő módon gerjesztődnek és viszonylag erős jelet adnak, a mindkét doménben jelenlévő tirozin aminosavak által adott jel elhanyagolható. Az élesztő PGK-ban két Trp található (113), mégpedig a C-doménben. Az élesztő PGK Trp mutánsai esetén egy-egy Trp található az egyes doménekben: W122 (N-doménben a 122-es oldallánc), ill. W333 (C-doménben a 333-as számú oldallánc). A denaturáció során a fehérje jellemző fluoreszcenciája jelentősen változik, mivel a fehérjelánc kitekeredése során a Trp-ok környezete megváltozik. Tehát a denaturáció folyamata fluorimetriásan követhető. A fluoreszcenciás mérések során elvégeztem a fehérje felfűtését 1 oC/perc sebességgel (hasonlóan a kalorimetriás mérésekhez), az alkalmazott enzimkoncentráció is megfelelt a mikrokalorimetriás méréseknek (azaz 0,003 mM). A kísérletek során a gerjesztési hullámhossz 295 nm volt, az emissziót két különböző hullámhosszon (320, ill.360 nm-en) detektáltam. A gerjesztési és emissziós rések szélessége 3 nm, míg a küvetta fényúthossza (a gerjesztő sugárzás esetén) 1 cm, illetve (az emissziós sugárzás esetén) 4 mm volt. A hőmérséklet függvényében mért adatokat a következő egyenlet (153) szerint alakítottam át FN vs. T formába:

FN =

( I U + m UT ) − I ( I U + m UT ) − ( I N − m NT )

28. egyenlet

ahol FN a natív forma részaránya a teljes fehérje-mennyiséghez képest, I a fluoreszcencia intenzitás T hőmérsékletnél, IN és IU a metszete, mN and mU pedig a meredeksége az átmenet előtti és utáni alapvonalnak. FN egy 1 és 0 közé eső szám, mely megadja a natív állapotú fehérje relatív mennyiségét. Ez a szám fluoreszcenciás vagy más spektroszkópiás mérésekből származtatható. Ennek segítségével az ordinátán feltüntetett FN=0,5 értéknek megfelelő hőmérséklet az abszcisszán a natív → denaturált átmenetre jellemző (Tm). A fluorimetriás görbék kvantitatív analízise a következő egyenlet szerint történt:

46

FN =

[N]0 [N]

=

Qt

29. egyenlet,

Qt − Q

ahol FN egy 1 és 0 közé eső szám, mely megadja a natív állapotú fehérje relatív mennyiségét (ld. 28. egyenlet), [N]0 és [N] a natív állapotú fehérje relatív moláris mennyisége rendre a kiindulási, illetve adott hőmérsékleteknél. A fluorimetriás adatokból az ln(ln([N]0/[N])) vs. 1/T egyeneseket ábrázoltam a 27. egyenlet alapján. 4.2.6.3. CD-spektroszkópia CD spektroszkópia segítségével ellenőriztem, hogy a hPGK mutánsok megfelelő másodlagos ill. harmadlagos szerkezettel rendelkeznek-e. A méréseket JASCO 720 spekropolariméteren végeztem a távoli (200-260 nm) ill. a közeli (260-350 nm) UV tartományban 20 oC-on. A távoli UV esetén, mely a másodlagos szerkezeti elemekről nyújt felvilágosítást, a hPGK koncentráció 0,4 mg/ml (~0,009 mM), a cellahossz 0,1 cm, míg a közeli UV tartományban, mely a harmadlagos szerkezetet jellemzi, a PGK koncentráció 2,5 mg/ml (~0,056 mM) és a cellahossz 1 cm volt.

4.2.7. Molekuláris grafikai analízis 4.2.7.1. Atomi kölcsönhatások analízise A PGK röntgendiffrakcióval meghatározott (12 db) szerkezete atomi szintű részleteinek megjelenítésére és analízisére az Insight II (Biosym/MSI, San Diego, CA, USA) szoftvert használtam. Az összehasonlító vizsgálatokhoz a következő pdb kódokkal jelzett szerkezetek álltak rendelkezésemre: 1PHP (B. stearothermophilus PGK*MgADP (20)), 1VJC (disznóizom PGK PGK*MgATP; hivatkozást ld. a publikációs listában), 1HDI (disznóizom PGK*3-PG*MgADP (25)), 1KF0 (disznóizom PGK*3-PG*MgAMPPCP (51)), 13PK (T. brucei PGK*3-PG*MgADP (22)), 1VPE (T. maritima PGK*3-PG*MgAMP-PNP (23)), 3PGK (szubsztrátmentes élesztő PGK (113)) és az 1QPG (R65Q élesztő mutáns PGK*3-PG*MgAMP-PNP (56)). A disznóizom PGK*3-PG biner komplex (19), a disznóizom PGK*3-PG*MgAMP-PNP (21), az élesztő PGK*3-PG biner komplex (154) és a szubsztrátmentes disznóizom PGK (51) pdb koordinátáit a szerzőktől kaptam. Három lépésben térképeztem fel a PGK térszerkezetének fenntartásáért felelős molekuláris kölcsönhatásokat. Elsőként azonosítottam a konzervatív oldalláncokat, melyeket 168 PGK szekvencia összerendezésével kaptam (a szekvenciákat és az 47

összerendezést az ExPASy Molecular Biology Server segítségével készítettem). A második lépésben valamennyi szerkezetben megkerestem a peptid H-kötéseket, valamint a konzervatív oldalláncok egymással, illetve peptid N- vagy O-atomokkal alkotott hidrofób, elektrosztatikus kölcsönhatásait és H-kötéseit. Az atomi távolságok felső határaként a Hkötéseknél 3,5, a hidrofób kölcsönhatásoknál 4,5, az ionos kölcsönhatások esetén pedig 4 Å-t vettem. A kapott kölcsönhatások elemzésénél először azokat választottam ki, melyek mind a 12 vizsgált szerkezetben megtalálhatók, majd második lépésként csak azokat vettem figyelembe, melyek az egyes szubsztrátok kötődésének hatására kialakuló új kölcsönhatások. Harmadik lépésként a kiválasztott kölcsönhatásokat megjelenítettem és páronként összehasonlítottam a szerkezeteket az N-, vagy a C-terminális domén szerkezetét felépítő β-redők szerinti összemásolásával. Az összemásolás a PGK szekvenciák összerendezése (25) alapján történt, melyet kiegészítettem az élesztő és a B. stearothermophilus PGK-k szekvenciájával. 4.2.7.2. Ligandumkötés modellezése Az 1,3-BPG és a különböző anionok a PGK enzim szerkezetébe történő modellezését a GOLD modellezőprogram 2.2 verziójával (155) viteleztük ki Barna László és Gyimesi Gergely segítségével. A T. brucei PGK (PDB kód:13PK) B láncát, mint célfehérjeláncot használtuk a modellezéshez. Először, az 1,3-BPG szubsztrátként történő modellezéséhez minden heteroatomot eltávolítottunk (beleértve a szerkezetben eredetileg kötött 3-PG szubsztrátot), kivéve az ADP-t, a Mg2+-t, valamint a Mg2+-t koordináló vízmolekulákat. Ez utóbbiakat a Mg2+ körül több különböző pozícióban is el lehetett helyezni az 1,3-BPG modellezésekor. Az 1,3-BPG és az anionok parciális töltés-eloszlását a MOPAC program segítségével számoltuk. A pH=7,5-nek megfelelő számú hidrogénekkel láttuk el a fehérjét és a különböző ligandumokat. A fehérjét nem, azonban a ligandumot flexibilisen kezeli a GOLD program. Az Arg 65 αC-atomja szolgált középpontjául annak a 19 Å sugarú gömbnek, melyen belül a ligandum kötődési helyét kerestük. Ez gyakorlatilag a teljes PGK molekulát magában foglalja. Minden ligandumkötési ciklust 20-szor ismételtünk meg a következő paraméterek felhasználásával: pop size 100, maxops 200000, early termination off, score, gold. A modellezés során kapott legjobban illeszkedő 1,3-BPG-t hozzárendeltük a kiindulási szerkezethez és az anionokkal folytattuk a modellezést. Egyes

48

esetekben néhány, Mg2+-nal koordináló vízmolekulát eltávolítottunk a szerkezetből és így is elvégeztük a megfelelő ligandum modellezését. A mérések kvantitatív kiértékelését a SigmaPlot 6.0, a Microsoft Excel és a Microcal Inc. DSC 5.0 Origin szoftver segítségével végeztem. A PGK szerkezeteket az Insight II (2000L verzió, Biosym/MSI, San Diego, CA) segítségével jelenítettem meg.

49

5. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉSÜK 5.1. A MgADP és MgATP eltérő kötődődési módja: a fémion szerepe 5.1.1.

Kettősgátlás

kísérletek

nukleotid

analógokkal,

adenozinnal

és

anionokkal Az Irodalmi áttekintésben bemutatottak alapján a nukleotid szubsztrátok közül különösen a MgATP PGK-hoz való kötődési módja volt kérdéses. Valószínűnek látszott, hogy foszfátláncának enzimmel való kölcsönhatása különbözik a MgADP-jétől, de hogy miképpen, az nem volt ismert. A fémion Mg2+ ebben betöltött szerepe sem volt tisztázva. Mivel a MgADP kompetitív gátlószerként működik a MgATP szubsztráttal szemben, ezért kézenfekvőnek látszott, hogy a szintén gátló adenozin és pirofoszfát anion hozzáadásával kettősgátlás kísérletet végezzek. A kinetikai kettősgátlás kísérletek ugyanis alkalmasak annak eldöntésére, hogy két gátló anyag azonos vagy különböző helyre kötődik az enzim felszínén. Ily módon tehát azt kívántam eldönteni, hogy a MgADP inkább az adenozin vagy inkább a foszfát részével kötődve szorítja-e ki a szubsztrát MgATP-t. Összehasonlításképpen szintén kettősgátlás kísérletben a MgATP analóg MgAMP-PNP-t alkalmaztam a MgADP helyett, adenozinnal vagy pirofoszfáttal együtt. Az eredményeket Yonetani & Theorell (146) ábrázolásban elemeztem, mely a 6. ábrán látható. A baloldali kísérletsorozatban a MgADP-t (mint egyik gátlószert) adtam az aktivitási

elegyhez,

különböző

második

inhibítorral

együtt.

A

jobboldali

kísérletsorozatban pedig a MgAMP-PNP-vel (illetve a MgAMP-PCP-vel is) végeztem hasonló kísérletet. A 6.A és a 6.D ábrán a párhuzamos egyenesek azt jelzik, hogy akár a MgADP-t, akár a MgAMP-PNP-t alkalmaztam adenozinnal mint második gátlószerrel együtt, egymás hatását mindig kioltották. Ez azt jelenti, hogy a két gátlószer azonos helyre kötődik az enzimszerkezetben, azaz mind a MgADP, mind a MgAMP-PNP az adenozin kötőhelyéért versengenek. Ezek a kísérletek tehát teljes összhangban vannak a kristályszerkezeti adatokkal, melyek szerint a MgADP és a MgAMP-PNP adenozin részükkel azonos módon kötődnek az enzimhez Nagyon érdekes különbségek figyelhetők meg a 6.B és a 6.E ábrán. A vizsgált anion, illetve a MgADP nagymértékben befolyásolják egymás gátló hatását, melyet az mutat, hogy a kapott egyenesek a koordinátarendszer negyedik negyedében metszik egymást (6.B ábra). Ugyanaz az anion és a MgAMP-PNP pedig közel additív inhibítorok, azaz hatásuk 50

majdnem teljesen független egymástól, mivel az egyenesek az abszcisszához közeli pontban metszik egymást (6.E ábra). Hasonló eredményt kaptam, ha a MgAMP-PNP helyett a MgAMP-PCP-t, illetve akár a pirofoszfátot, akár a citrátot alkalmaztam anionként. Ez a kísérlet arra utal, hogy a difoszfát MgADP, illetve a trifoszfát MgATP analógok (és feltehetően a MgATP) foszfátláncának kölcsönhatásai különböznek az enzim aktív centrumában. Az eredmény csak részben támasztja alá a kristályszerkezeti adatokat. A 4. ábra valóban mutat bizonyos különbséget a MgADP és a MgAMP-PNP foszfátlánca enzimmel való kölcsönhatásában. Azonban a két ATP analóg (MgAMP-PNP és MgAMPPCP) kötődési módja a kristályszerkezetben drámaian különbözik, ugyanakkor a kettősgátlás kísérletekben hasonlóan viselkedtek. Ez az eredmény azt sugallja, hogy az enzim oldatában (a kristálytól eltérően) a két ATP-analóg foszfátláncának enzimmel való kölcsönhatása hasonló lehet. A MgADP és az anionok egymást befolyásoló gátló hatása nem magyarázható azzal az NMR-es kísérletek (156) és gátláskísérletek (az anionok mindegyike kompetitív inhibítor a 3-PG-vel szemben (104)) által bizonyított ténnyel, hogy az anionok a „bázikus folt” közelében kötődnek, mely a 3-PG foszfátját köti (19). Kell tehát léteznie máshol is anionkötőhelynek. Ez következik abból a kísérletből is, mely a 6.C és a 6.F ábrán látható. Itt az előzőekben használt pirofoszfát aniont egy 3-PG analóggal, a 2-foszfoglikoláttal (2-PG) helyettesítettem. A 3-PG analóg minden nukleotiddal szemben ugyanolyan módon viselkedett, azaz az egyenesek a koordinátarendszer harmadik negyedében, közel az abszcisszához metszették egymást. Ez azt jelenti, hogy majdnem teljesen független egymástól a két inhibítor hatása, azaz az enzimszerkezetben különböző helyre kötődnek. A 2-PG helyett más 3-PG analógot használva (pl. G-3-P) is hasonló eredményt kaptam (az analógok képletét ld. a 7. ábrán). Ez egyrészt azzal magyarázható, hogy a 3-PG analógok a 3-PG helyére kötődve alig befolyásolják a nukleotidok kötődését. Másrészt az anionokkal elvégzett kísérlet és ez utóbbi összevetéséből az is következik, hogy az egyszerű anionok ezekben a kísérletekben nem a 3-PG kötőhelyen kötődnek, tehát valóban ezen a kötőhelyen kívül lennie kell még egy anionkötőhelynek az enzim aktív centrumában. Ez a hely

valószínűleg

a

T.

brucei

PGK

pszeudoterner

komplexében

megfigyelt

foszfátkötőhellyel azonos (26), és azonos lehet az 1,3-BPG 1-es foszfátjának kötőhelyével is (ld. részletesebben az 5.3.1. fejezetben). A 6.B és 6.E ábrán látható kísérletekben az alkalmazott pirofoszfát, illetve citrát anion helyett a foszfát anion hatását vizsgálva, mind a MgADP, mind a MgAMP-PNP esetén azt tapasztaltam, hogy a két-két gátlószerpárra a gátlás típusa megegyezik, mégpedig additív. 51

Ez azt jelenti, hogy a foszfát ion az enzimszerkezetben kötődve sem a MgADP, sem a MgAMP-PNP gátló hatását nem befolyásolja. Ez valószínűleg azért lehetséges, mert a foszfát (a pirofoszfáthoz, illetve a citráthoz képest) viszonylag kis molekula, emiatt térben nem kerül közel a MgADP foszfátláncához, ellentétben pl. a pirofoszfáttal (ld. 8. ábra).

6. ábra Kettősgátláskísérletek különböző gátlószer-párokkal A kísérletben 50 nM PGK aktivitását mértem, 0,5 mM 3-PG (kivéve a B ábrát, ahol 10 mM 3-PG-t alkalmaztam) és 0,5 (A, B és C) vagy 0,15 mM (D, E és F) ATP jelenlétében. Minden esetben 12,5 mM MgCl2 is volt a reakcióelegyben. Az enzimaktivitást a MgADP (A, B és C), illetve a MgAMP-PNP (D, E és F) koncentrációk függvényében mértem. A mérések során egy második inhibítor távollétében (z) és 10 (S) és 20 mM („) adenozin (narancssárga, A), 35 (S) és 45 mM („) pirofoszfát (sötétkék, B), 20 (S) és 50 mM („) 2-foszfoglikolát (rózsaszín, C), 10 mM adenozin (narancssárga, S) és 0,75 mM MgADP (barna, „) (D), 25 (S) és 30 mM („) pirofoszfát (sötétkék, F), 70 (S) és 100 mM („) 2-foszfoglikolát (rózsaszín, F) jelenlétében végeztem a kísérleteket. Az ábrázolás megfelel a Yonetani-Theorell féle ábrázolásnak (146).

52

7. ábra 3-PG, az 1,3-BPG, illetve analógjaik képlete

Összefoglalva, a kinetikai kettősgátlás kísérletek arra utaltak, hogy legalább két anionkötőhely létezik a PGK aktív centrumában, és egyértelműen megmutatták, hogy a MgATP analógok foszfátláncának (és feltehetően a MgATP-jének is) a működő enzimmel való kölcsönhatása különbözik a MgADP foszfátláncáétól.

8. ábra Szerkezeti magyarázat a MgADP és a MgATP analóg, MgAMP-PCP pirofoszfáttal szembeni különböző viselkedésére Az ábra egyrészt a T. brucei PGK zárt konformációjú 3-PG*MgADP komplexének aktív centrumát (zöld) (26), másrészt a disznóizom PGK nyitott szerkezetű komplexéből a MgAMP-PCP-t (piros) (51) mutatja. A két szerkezetet a C-domén β-redőinek peptidgerinc atomjai szerint másoltam össze. Az ábrán látható pirofoszfátot (sötétkék) a T. brucei PGK MgADP*foszfát pszeudoterner komplexében (26) kötött foszfátra (sárga) szuperponáltam. (A T. brucei PGK terner komplex szerkezeteket a MgADP atomjai szerint másoltam össze.)

53

5.1.2. A nukleotid kötődés jellemzése izotermális titráló kalorimetriás (ITC) kísérletekben A nukleotid kötődés sztöchiometriájának és energetikai paramétereinek közvetlen meghatározására alkalmas módszer az ITC. Ezek a paraméterek ugyan a nem működő enzim esetén vizsgálhatóak csak (az enzimreakciót is jelentős hőeffektus kíséri), de érzékenyen változnak a nukleotid enzimmel való kölcsönhatásának módja szerint. Lehetőséget teremt továbbá, hogy a fémion (Mg2+) kötődésre gyakorolt hatását vizsgálhassuk, hiszen a kísérletet el lehet végezni fémion távollétében is. A nukleotidokkal [MgADP (A), MgATP (B), MgAMP-PNP (C) és ATP (D)] meghatározott titrálási görbék a 9. ábrán láthatók. Minden görbe esetén a legjobb illeszkedést az 1:1 sztöchiometriát feltételező modell adta, összhangban a korábbi egyensúlyi dialízis kísérletekkel (57), illetve az enzim röntgendiffrakciós adataival, ugyanis a különböző kristályszerkezetekben (MgADP

(20),

illetve

MgAMP-PNP

(21,

23)

esetén

egyaránt)

egyetlen

nukleotidkötőhelyet mutattak ki. A görbék illesztésével kapott paramétereket a 6. táblázat tartalmazza. A Ka állandókból számolt Kd értékek jó egyezést mutatnak a korábban más módszerekkel már meghatározott disszociációs állandókkal (51, 57, 58, 69). A mérések alapján megállapítható, hogy a MgADP sokkal szorosabban kötődik a PGK-hoz, mint a MgATP (összhangban korábbi kísérletekkel (57, 58, 69)). Termodinamikai szempontból összehasonlítva megállapítható, hogy a MgADP kötődése entalpia vezérelt exoterm folyamat, amely a töltött csoportok közötti erős, elektrosztatikus kölcsönhatásra utal. A MgATP kötődése inkább entrópia vezérelt és kevésbé exoterm. Ez utóbbi tulajdonság a kötött MgATP foszfátjainak mozgékonyságával magyarázható (vö. kristályszerkezet, 5.1.4. fejezet). A MgAMP-PNP nagyon hasonló módon viselkedik, mint a MgATP. Tehát ilyen szempontból ez a szintén oldott enzimmel végzett kísérlet jól kiegészíti a kettősgátlás kísérleteket. Felhívnám a figyelmet azonban arra, hogy a Mg2+ hatásának vizsgálatakor, ha a MgATP kötődését vetjük össze az ATP kötődésével, jelentős különbséget vehetünk észre annak termodinamikai paramétereiben, bár Kd értékük azonos. Ezt a különbséget a Mg2+ okozhatja. A Mg2+-mentes ATP kötődése entalpia vezérelt folyamat (valószínűleg az erősebb ionos kölcsönhatások miatt), ellentétben a MgATP entrópia vezérelt kötődésével. Ez utóbbi megállapítás jó példa arra, hogy két ligandum, bár azonos affinitással kötődik az enzimhez, kötődésük természetében nagy különbségek lehetnek, melyeket ezzel a titráló módszerrel igen jól meg lehet különböztetni.

54

Az ITC-s kísérlet tehát rámutatott arra, hogy a MgADP és MgATP eltérő kölcsönhatási módja a foszfátláncuk eltérő (inkább entalpia-, vagy inkább entrópiavezérelt) kölcsönhatásának tulajdonítható. Az a tény, hogy fémion távollétében az ATP kötés entalpiavezérelt, erősen ionos kölcsönhatás, összhangban van azokkal az NMR-s oldatkísérletekkel, melyek bizonyították, hogy fémion távollétében a nukleotid kisebb valószínűséggel kötődik a hidrofób nukleotid kötőhelyre az aktív centrumba (65, 66).

9. ábra Különböző nukleotidok PGK-val való kölcsönhatásának jellemzése ITC módszerrel PGK különböző koncentrációjú oldatait (0,5-1,5 mM) 12-25 mM MgCl2 jelen-, vagy távollétében titráltuk 8,5 mM MgADP-vel (A, barna), 10 mM MgATP-vel (B, zöld), 20 mM MgAMP-PNP-vel (C, sötétkék), illetve 10 mM Mg2+ mentes ATP-vel (D, rózsaszín). A kísérleti pontokra illesztett görbe (folytonos vonal) az egy kötőhelyet feltételező modellnek felel meg. A B ábrán néhány kezdeti pontot (zöld {, alacsony PGK:ATP aránynál) kihagytam, melyek valószínűleg nem a PGK-ra jellemző hőváltozást mutatnak. Az 1:1 sztöchiometriát feltételező görbékből számolt paramétereket a 6. táblázat tartalmazza.

55

6. táblázat A nukleotid kötődés disszociációs állandói és a kötődés termodinamikai paraméterei A termodinamikai paramétereket 1:1 sztöchiometria alkalmazásával kaptuk izotermális titráló kalorimetriás (ITC) módszerrel. A ∆G értékeket a megfelelő asszociációs állandókból (Ka) számoltam.

Nukleotidok MgADP MgATP MgAMP-PNP ATP

Ka*10-5 (M-1) 1,86±0,22 0,38±0,05 0,28±0,06 0,35±0,04

∆H (cal*mol-1) -3178±49 -1355±280 -1147±145 -3939±184

Kd (mM) 0,054 0,263 0,357 0,286

T∆S (cal*mol-1) 2533±26 3302±78 3627±158 996±197

∆G (cal*mol-1) -5718 -4797 -4619 -4748

5.1.3. A fémion hatásának vizsgálata a PGK nukleotidkötésére pásztázó mikrokalorimetriás (DSC) módszerrel A PGK szubsztrátjai, így a nukleotidok is stabilizálják az enzim szerkezetét, amint azt hőinaktivációs (85), valamint hődenaturációs mérések (98, 99) is mutatják. A nukleotidok eltérő kölcsönhatása a PGK-val megmutatkozhat a térszerkezet-stabilizáló hatásukban is. Ezért megvizsgáltam és összehasonlítottam a MgATP, valamint a MgADP stabilizáló hatását mikrokalorimetriás kísérletekben. Vizsgálatokat végeztem Mg2+ jelen- illetve távollétében is a nukleotidok telítési koncentrációinál. Mg2+ távollétében az ATP, illetve az ADP védőhatása az enzim hődenaturációjával szemben nagyon hasonló: a Tm, azaz az a hőmérséklet, ahol az enzimmolekulák fele már kitekeredett állapotban van 2,7±0,3 oC-kal magasabb a szubsztrátmentes enzimhez viszonyítva (ld. 10. ábrán az ordinátán lévő üres mérési pontok és 7. táblázat). Az 10. ábrán az is megfigyelhető, hogy a szabad, tehát a nukleotiddal komplexet nem képező Mg2+ növekvő koncentrációja egyre jobban destabilizálja a PGK szerkezetét, valószínűleg oly módon, hogy aspecifikus kölcsönhatásba lép az enzimmel. Ezt az aspecifikus kölcsönhatást korrekcióba kell vennünk ahhoz, hogy ténylegesen a fémnukleotid komplexek védőhatását tudjuk meghatározni. Ezért meghatároztam a Mg2+ koncentráció függvényében, telítési nukleotid koncentrációnál a PGK-fém-nukleotid komplexekre jellemző Tm értékeket, majd azokat nulla Mg2+ koncentrációra extrapoláltam (ld. 7. táblázat). Így határoztam meg a fém-nukleotid komplexek valódi védőhatását. A 10. ábrán látható kísérleti pontokra illesztett görbéből az derült ki, hogy a MgATP védőhatása (hibahatáron belül) megegyezik a fémionmentes ATP, illetve ADP enzimszerkezetre gyakorolt védőhatásával (azaz a mért és az extrapolált Tm értékek hibahatáron belül megegyeznek, és kb. 2,7 oC-kal magasabbak a szubsztrátmentes enzimhez képest, ld. 7. táblázat). Az előbbiekhez képest 1,9 oC-kal magasabb, extrapolált Tm érték adódott a MgADP esetén. Ez azt jelenti, hogy a MgADP összesen 4,6 oC-kal emeli meg a PGK-ra

56

jellemző Tm értéket. Azaz a MgADP-nek a fémionmentes nukleotidokkal, illetve a MgATP-vel szemben nagyobb a PGK szerkezetére gyakorolt stabilizáló hatása. Itt kell megjegyeznem, hogy a MgAMP-PNP, illetve a MgAMP-PCP védőhatása nagyon hasonló a MgATP esetén tapasztalthoz.

10. ábra A nukleotidok hatása a PGK hődenaturációs folyamatára A DSC kísérleteket különböző Mg2+ koncentrációknál nukleotidok távollétében (fekete), valamint 10 mM ATP (zöld), illetve 10 mM ADP (barna) jelenlétében végeztük el. Az abszcisszán látható Mg2+ koncentrációk számolásánál figyelembe vettem a Mg2+-nak mind az ATP-vel, mind az ADP-vel, mind a mérés során jelenlévő EDTA-val való komplexálását. Az ehhez szükséges állandók rendre: 0,1, 0,6 és 2,5*10-9 mM. A kísérleti pontokra az Anyagok és Módszerekben leírt 21. egyenletet illesztve, a Mg2+ aspecifikus kötődési állandójára 21,3±5,0 mM-t kaptunk. Az ábrán látható üres jelek a Mg2+ távollétében mért értékeket mutatják, és a nulla Mg2+ koncentrációra extrapolált értékekkel együtt a 7. táblázatban vannak feltüntetve. 7. táblázat Az egyes PGK*Mg-nukleotid komplexekre jellemző „olvadási hőmérsékletek” (Tm, oC)

 ATP ADP

Mért maximális védőhatás Mg2+ távollétében 53,0±0,2 55,8±0,2 55,7±0,2

Mg2+ jelenlétében mért érték extrapolálása [Mg2+]=0-ra 53,0±0,1 55,6±0,4 57,6±0,4

∆Tm (oC)  0,2 1,9

Magyarázatot ld. a 10. ábra aláírásában

Összefoglalva, a DSC kalorimetriás kísérletek, összhangban a kinetikai kettősgátlás és az ITC-s kötődési vizsgálatokkal, szintén kimutatták a MgADP és a MgATP eltérő kötődési módját. Nevezetesen azt, hogy a kristályszerkezettel is egyezően (23, 26, 157) a Mg2+ speciálisan járul hozzá a MgADP kötődéséhez, s ezáltal az enzim szerkezetét is stabilizálja. A Mg2+-nak viszont nincs ilyen hatása az ATP kötődésére, mely összhangban van azzal, hogy az ATP és a MgATP enzimhez való kötődésének Kd-je is azonos. Mindebből az is következik, hogy a Mg2+ okozza a nukleotid difoszfát, illetve a trifoszfát

57

eltérő kötődési módját. E megállapításomat munkámmal párhuzamosan elkészült kristályszerkezetek is igazolták (ld. alább).

5.1.4.

MgATP

és

ATP

PGK-val

való

kölcsönhatási

módjának

röntgenkrisztallográfiás meghatározása Laboratóriumunk és az ELTE TTK Elméleti Kémiai Tanszékének együttműködése során Kovári Zoltán és Náray-Szabó Gábor meghatározták a PGK-nak mind a MgATP-vel (2,1 Å felbontás), mind az ATP-vel (1,9 Å felbontás) alkotott biner komplexe kristályszerkezetét. Mindkét biner komplex szerkezete nyitott konformációjú (11.A ábra), és

a

szerkezetek

nyitottabbak

a

PGK*3-PG*MgAMP-PNP

(21),

illetve

a

PGK*3-PG*MgAMP-PCP (51) esetén tapasztaltaknál (11.B ábra), ami összefüggésben áll azzal, hogy a 3-PG kismértékű (8o-os) záródását okozza a szerkezetnek (19). Ez utóbbi terner komplexek azért nyitott szerkezetűek, mert mint a részletes analízis kimutatta, a nem-konzervatív oldalláncok között fellépő kritályrácserők a nyitott szerkezetet stabilizálják (100). Megemlítem még, hogy az ATP-t kötő szerkezet, mely 3-PG távollétében készült egy foszfát iont is köt (11.A ábra), mégpedig a 3-PG foszfátjának kötőhelyén (19).

11. ábra A PGK konformációjának összehasonlítása a különböző nukleotid komplexekben A PGK molekulát az αC-atomokat összekötő vonallal ábrázoltam, a szubsztrátokat pedig golyós modellel. Az A ábra az ATP biner (rózsaszín), illetve a MgATP biner (zöld) komplexeket mutatja, a B ábrán a disznóizom PGK 3-PG*MgAMP-PCP terner komplexe (piros, (51)) mellett a MgATP biner komplex (zöld) látható. A szerkezeteket az A ábrán a C-domén, a B ábrán az N-domén β-redőinek peptidgerinc atomjai szerint másoltam össze.

A PGK*ATP és a PGK*MgATP kristályszerkezetekben mindkét nukleotid az adenozin zsebben kötődik, azonban foszfátláncuk konformációja nemcsak egymástól, de az eddig megismert nukleotidok foszfátláncától is eltér (12. ábra). A PGK*ATP 58

komplexben megfigyelt fémionmentes ATP kötődési mód összhangban van azon NMR mérésekkel, melyek szerint a fémionmentes nukleotidok kisebb valószínűséggel ugyan, de kötődnek a hidrofób nukleotid kötőhelyre (65, 66). Mg2+ távollétében az ATP foszfátlánca a 13-as hélix felé hajlik (12.A ábra). Az ATP γ-foszfátja kölcsönhatásba kerül ezen hélixben lévő Asp 374 és Thr 375 peptid N-atomjaival, továbbá elektrosztatikus kölcsönhatást alakít ki a 13-as hélix N-terminális végének pozitív töltésű dipólusával. ITC kalorimetriás titrálás során szintén az ATP ionos, azaz entalpiavezérelt kölcsönhatását mutattuk ki (ld. 5.1.2. fejezet).

12. ábra Az ATP (A ábra) és a MgATP (B ábra) kötődésének részletei A szubsztrátokat golyós modellel (ATP-A ábra, rózsaszín; MgATP-B ábra, zöld), a hélixeket szalagmodellel ábrázoltam. A kölcsönható oldalláncok és a hélixek fekete színűek. A kölcsönhatásokat szaggatott vonal jelöli.

A MgATP pozíciója és kölcsönhatásai, mint már említettem teljesen különböznek nemcsak a fémionmentes ATP, hanem az eddig ismert nukleotidok kölcsönhatásaitól is (12.B ábra). A γ-foszfát messze van a 13-as hélixtől és inkább a 8-as hélix felé hajlik, azonban nem áll kölcsönhatásban ez utóbbival sem; csak egy vízmolekulával lép kölcsönhatásba. A β-foszfát (szintén egy vízmolekulán keresztül) már H-kötést alakít ki az Asp 218 oldalláncával, mely a 8-as hélixben található. A Mg2+ mind a β-, mind a γ-foszfáttal komplex kötésben van, azonban a fehérjével nem kerül kölcsönhatásba. Az α-foszfát ismert kölcsönhatása a Lys 219 oldallánccal (20, 21, 23, 51) ebben a szerkezetben is megtalálható. Tehát összefoglalva, a MgATP kristályszerkezetben tapasztalt kötődési módja eltér mind a MgATP analóg MgAMP-PNP, mind a MgAMP-PCP esetén tapasztalttól (13.A ábra), továbbá teljesen különbözik a MgADP kötődésétől is (13.B ábra). Ez utóbbit alátámasztják mind az ITC-s, mind a DSC-s kísérleti adataim is (ld. 5.1.2. és 5.1.3. fejezet). 59

13. ábra A MgATP foszfátlánca kötődési módjának összevetése az ismert nukleotid-analógok (MgAMP-PNP, MgAMP-PCP, A), illetve a MgADP (B) kötődési módjával Az A ábra a MgAMP-PNP (kék, disznóizom terner komplex, (21)), illetve a MgAMP-PCP (piros, disznóizom terner komplex, (51)) kötődési módját mutatja, összehasonlításként a MgATP-t zölddel jelöltem. A B ábrán a zöld MgATP mellett a MgADP (barna, B. stearothermophilus PGK biner komplex, (20)) kötődési módját mutatom be. A nukleotidokat golyós modell jelöli, a hélixeket pedig szalagdiagram. Ez utóbbiak, továbbá a kölcsönható oldalláncok feketével láthatók. Az adott nukleotidra jellemző kölcsönhatásokat a megfelelő színű szaggatott vonal jelöli. A szerkezeteket a kötött nukleotidok adenozin gyűrűje szerint másoltam össze.

A B-faktorok összevetéséből megállapítható, hogy a MgATP foszfátláncának mozgékonysága nagyobb, mint a MgADP-jé, hiszen a fémion a MgATP foszfátjainak mozgékonyságát nem korlátozza. Mindez összhangban van a MgADP szorosabb kötődésével és az enzim szerkezetét stabilizáló hatásával (ld. feljebb). A MgATP foszfátláncának MgAMP-PCP-hez és MgAMP-PNP-hez hasonlóan nagy flexibilitása alátámasztja azt a korábbi feltételezést (51), miszerint a nukleotid trifoszfátlánca fluktuálhat a 8-as és 13-as hélix N-terminálisa között. Ez a hipotézis nemcsak kristályszerkezeti adatokon és az azokból meghatározott B-faktorokon alapul. Mellette szól az is, hogy bár a kristályszerkezet egyetlen kiragadott konformációját mutatja a nukleotidnak, a fentiekben tárgyalt oldatkísérleteinkből szintén az következik, hogy a MgAMP-PNP és a MgAMP-PCP oldatban egymáshoz és a MgATP-hez hasonló módon viselkedik. Ezt támasztja alá az a kettősgátlás-kísérlet is, melyben akár a MgAMP-PNP-t, akár a MgAMP-PCP-t alkalmazva a gátlás típusa ugyanaz volt (ld. 5.1.1. fejezet), továbbá az ITC-s kötődési kísérlet, amely a MgAMP-PNP és a MgATP hasonló jellegű kötődését mutatta meg. DSC kísérleteim szintén a MgATP és analógjai hasonló mértékű stabilizációs hatását bizonyítják. A MgATP foszfátlánca két kötőhely közötti fluktuációjának fontos szerepe lehet a katalízisben és/vagy a doménzáródásban, pl. a 8-as és a 13-as hélixeket közelítheti egymáshoz (14. ábra), ami a zárt aktív centrum kialakulásához vezethet. E hipotézis

60

ellenőrzésére a 8-as hélixben elhelyezkedő Lys 215 aminosav (vö. 13.B ábra) helyspecifikus mutagenezisét terveztük (ld. 5.4. fejezet).

14. ábra Az 1-es, a 8-as, a 13-as, illetve a 14-es hélixek relatív pozíciójának megváltozása az enzimszerkezet záródása során A disznóizom PGK 3-PG*MgAMP-PNP nyitott konformációjú terner komplexét (piros, (21)) és a T. maritima PGK 3-PG*MgAMP-PNP zárt konformációjú terner komplexét (kék, (23)) az A ábrán a 13-as hélix, a B ábrán az 1-es hélix peptidgerinc atomjai szerint másoltam össze. A hélixeket szalagdiagram, a molekula egészét pedig az αC-atomokat összekötő vonallal jeleztem.

5.2. Az 1,3-BPG (instabil szubsztrát) lehetséges kötődési módja: molekuláris modellezés Mivel röntgenkrisztallográfiás adat nem áll rendelkezésre az 1,3-BPG PGK-val való kölcsönhatásáról, továbbá 1,3-BPG analógok NMR spektroszkópiás vizsgálatával nem születtek egyértelmű eredmények (54), ezért modellezést végeztünk az 1,3-BPG kötődési módjának meghatározására. Egyrészt a B. stearothermophilus PGK*MgADP biner 61

komplexének

nyitott

szerkezetébe

(nincs

bemutatva),

valamint

a

T.

brucei

PGK*MgADP*3PG terner komplexének zárt szerkezetébe (15.A ábra), miután ez utóbbi szerkezetből eltávolítottuk a 3-PG-t. Mindkét esetben a 3-PG helyén kaptuk meg a kötődő 1,3-BPG-t. Azonban csak az utóbbi zárt szerkezetbe modellezett szubsztrát adott érdekes felvilágosítást az 1-es foszfát csoport kötődési módjáról. A kapott lehetséges kötődési módokat atomi szinten elemezve azt tapasztaltam, hogy az 1,3-BPG 1-es foszfátja kölcsönhatásban áll az N-terminális domén 1-es hélixében található Arg 38/Bs36/Tb39 oldalláncával, melyet már Bernstein és Hol is feltételeztek (26). Az 1-es foszfát nemcsak ezzel az Arg-nel, hanem a C-terminális domén 8-as hélixében található Lys 215/Tb219 oldallánccal is kölcsönhat, mely csak a zárt szerkezetre jellemző. (A B. stearo PGK nyitott szerkezetű kristályában ez a kölcsönhatás természetesen nem alakulhat ki a több mint 20 Å távolságra elhelyezkedő Lys 215/Bs197-tel). Az 1-es foszfát egyik O-atomja kölcsönhatásba kerül a Gly 396/Tb399 peptid N atomjával is, mely a 14-es hélixben található. Ez utóbbi, a 14-es hélixszel való kölcsönhatás nincs meg a Bernstein és Hol által feltételezett 1,3-BPG kötődési módja esetén (26). Érdekes párhuzam, hogy a 3-PG-t kötő biner PGK komplexben a 3-PG karboxil-csoportja kölcsönhatásban van egy vízmolekulán keresztül ugyanezzel a Gly 396 N-atomjával (19). A modellezett 1,3-BPG esetén vízmolekulán keresztüli kölcsönhatás alakul ki viszont a másik Gly 373/Tb376 N-atomjával, mely a 13-as hélixben található. További kölcsönhatás alakul még ki a vízmolekula közvetítésével a Mg2+ ionnal is. A modellezés további érdekessége, hogy az 1,3-BPG 1-es foszfátját több, egymástól kissé különböző orientációban és kölcsönhatásban mutatta meg (15.B ábra). Ebből arra következtethetünk, hogy a MgATP-hez hasonlóan, foszfátja mozoghat még a zárt szerkezetben is. A mozgás által az 1-es, a 13-as, illetve a 14-es hélixeket közelítheti egymáshoz (ld. 14. ábra), s ezáltal segítheti elő a doménzáródást. Tehát míg a MgATP a 8-as és a 13-as hélix közelítésével segítheti elő a doménzáródást, addig az 1,3-BPG-nek ugyanilyen szerepet tulajdoníthatunk, pl. a 13-as és 14-es hélixek vonatkozásában. Nem zárhatjuk ki azt sem, hogy az 1,3-BPG (melyről ismert az enzimszerkezetre kifejtett nagy hatása, ld. Irodalmi áttekintés, 2.6.4. fejezet) esetleg már önmagában képes a zárt konformációt stabilizálni, és így a közel kerülő Lys 215-tel is kölcsönhatásba kerülni. Ez esetben a MgATP-hez hasonlóan szintén közelítheti a 8-as hélixet is a domének közötti régió másik három (1-es, 13-as és 14-es) hélixéhez. A hipotézisek ellenőrzésére helyspecifikus mutánsokkal végeztem további vizsgálatokat (5.4. fejezet).

62

15. ábra A modellezett 1,3-BPG kölcsönhatásai a zárt aktív centrumban Az A ábra részletesen mutatja be a modellezett 1,3-BPG (kék) kötődését a T. brucei PGK zárt konformációjú aktív centrumában (zöld). A szerkezetben kötött MgADP-t zöld golyós modellel ábrázoltam. A hélixeket szalagdiagram jelzi, a kölcsönhatások szaggatott vonalakkal láthatók. A B ábrán három 1,3-BPG kötődési módot (kék, piros, fekete) láthatunk, melyek az 1-es foszfát pozíciójában különböznek, ezért annak kölcsönhatásait emeltem ki csak az ábrán. A modellezések során a vízmolekulák pozíciója változott, az adott 1,3-BPG-hez tartozó vízmolekulát az 1,3-BPG-nek megfelelő színnel jelöltem.

5.3. Anion-enzim kölcsönhatás jellemzése, anionkötőhelyek azonosítása 5.3.1. Enzimkinetikai analízis – aktiválás és gátlás jelensége Az aktiváló anionok azáltal gyorsítják az enzimreakciót, hogy elősegítik a doménzáródást, illetve kötőhelyük lényegében a doménzáródás során alakul ki (52). Fontosnak látszott ezért, hogy kísérletet tegyünk az aktiváló anionok (és anionos szubsztrátok) kötőhelyének azonosítására és jellemzésére, hiszen ezáltal is remélhettük, hogy közelebb kerülünk a doménzáródás mechanizmusának megértéséhez. Mindezek alapján különböző méretű és töltésű anionokkal (ld. 8. táblázat) végeztem egyrészt kinetikai vizsgálatokat, másrészt kötődési kísérleteket (ld. 5.3.3. fejezet). 8. táblázat A vizsgált anionok töltésviszonyai pH=7,5–ön

Anion pirofoszfát citrát foszfát

A

3-PG

és

a

MgATP

Bruttó töltés -3,16 -2,97 -1,66

szubsztrátokkal

való

enzimreakcióban

állandó

szubsztrátkoncentráció mellett az anionkoncentráció függvényében mérve (az irodalmi

63

adatokkal egyezően) megfigyeltem, hogy az anionok alacsony koncentrációban aktiváló, magasabb koncentrációban gátló hatásúak az enzim működésére (52, 104). Az aktiváló koncentrációtartomány megfelel az adott anion fiziológiás koncentrációtartományának. Az anionok által okozott aktiválás általános jelentőségét kiemeli, hogy ez a jelenség igen gyakori azon enzimek körében, melyek anionos szubsztrátokat alakítanak át (158-161). Az anionok közül a pirofoszfát mutatkozott a legspecifikusabbnak mind az aktiválást, mind a gátlást tekintve, ezt követte a citrát, majd a foszfát (16. ábra). Ez összefüggésben lehet azzal, hogy minél nagyobb az anionok töltése, illetve mérete (vö. pirofoszfát-foszfát) (ld. 8. táblázat), annál specifikusabb kölcsönhatást alakítanak ki a PGK-val. Ez a tény egyébként összhangban van korábbi, szubsztrátanalógokkal végzett ugyanilyen típusú kísérletekkel (52), ugyanis ebben az esetben a kisebb töltéssel rendelkező analógok (glicerol-3-foszfát, glicerol-2-foszfát, 1 töltött csoport) kisebb mértékben aktiválták a PGK-t, mint a nagyobb töltésű analógok (pl. 2,3-BPG, 3 töltött csoport). Ezzel összhangban a később bemutatandó kötődési kísérleteim (ld. 5.3.3. fejezet) a nagyobb töltéssel rendelkező anionok PGK-val való erősebb, specifikusabb kölcsönhatását mutatták.

16. ábra A pirofoszfát, a citrát és a foszfát ionok aktiváló és gátló hatása 20 nM PGK aktivitását mértem különböző anionok (pirofoszfát-kék, citrát-zöld, foszfát-piros) koncentrációjának függvényében 0,5 mM 3-PG és 0,5 mM MgATP (0,6 mM ATP és 1 mM MgCl2) jelenlétében. A szaggatott vonal mutatja azt az illesztett görbét, mely egyetlen gátlóhely feltételezésével írná le a gátlást a foszfát esetében. A betétábrán a görbék eleje kinagyítva látható.

A kinetikai görbék kvantitatív kinetikai analízisénél kiderült, hogy a korábban meghatározott egyetlen gátló kötőhellyel ((52), ld. 16. ábra, foszfát esetén szaggatott

64

vonallal jelezve) szemben csak két, egymással együttműködő gátlóhely feltételezésével tudtam kielégítően leírni azokat (ld. 9. táblázat). Citrát jelenlétében különböző szubsztrátkoncentráció-összeállításoknál is meghatározva a kinetikai görbéket (nincs bemutatva) szintén erre a megállapításra jutottam. 9. táblázat A vizsgált anionok aktiváló és gátló hatását jellemző kinetikai paraméterek összefoglalása A 16. ábrán látható kísérleti pontokat illesztettem az Anyagok és Módszerekben leírt 12. egyenlettel. A valódi állandókat a 13., illetve a 14. egyenlet segítségével számoltam.

Anion

n

a

pirofoszfát citrát foszfát

2,0±0,2 1,8±0,2 1,5±0,1

33,3±8,4 17,0±2,5 12,0±2,1

app K akt

(mM) 23,2±7,5 15,7±2,8 42,2±10,2

K akt (mM) 21,4±6,5 14,5±1,9 39,0±8,2

app K inh

(mM) 20,1±5,1 53,3±9,2 315±60

K inh (mM) 0,4±0,1 1,2±0,2 6,6±1,2

Az anionok kötőhelyeinek feltérképezésére megvizsgáltam a rendelkezésre álló, nagy sókoncentrációjú oldatból növesztett kristályok röntgenkrisztallográfiás szerkezeti adatait. A kristályszerkezetek közül az egyik, a fentebb említett (5.1.4. fejezet, 11.A ábra) PGK*ATP biner komplex tartalmaz egy kötött foszfát iont (17.A ábra, (1) jelű foszfát). Ez a hely azonos a a 3-PG foszfátjának kötőhelyével a 17.B ábrával (19) való összevetés alapján. A szubsztrátmentes enzimről egy 2,7 Å felbontású szerkezet is elkészült laboratóriumunk közreműködésével, melyet citrátból kristályosítottak (Kovári, NáraySzabó és Vas, leközletlen adat). Ezen PGK szerkezetben a 3-PG kötőhelyén látható egy kötött citrát molekula (17.C ábra). E két szerkezet tehát azt mutatja, hogy a szubsztrátmentes enzimben a 3-PG szubsztrát helyén van egy anionkötőhely, ami természetszerűleg akadályozhatja a 3-PG szubsztrát kötődését és ezáltal gátolhatja az enzim működését. Kérdés azonban, hogy hol lehet a másik gátló anionkötőhely az enzimszerkezetben. A választ a T. brucei PGK*MgADP*foszfát pszeudoterner komplex (26) szerkezetének vizsgálata adta meg. Ez egy majdnem zárt kristályszerkezet (csupán 6o-kal nyitottabb, mint ugyanezen PGK*3-PG*MgADP teljesen zárt szerkezetű komplexe). A foszfát ion ebben a szerkezetben nem a 3-PG foszfátjának kötőhelyén, hanem az 1,3-BPG 1-es foszfátjának valószínűsített kötőhelyén (átadódó foszfo-csoport helye) található (ld. 17.A ábra, (2) jelű foszfát). Ez utóbbi foszfátkötőhely feltehetően csak a zárt szerkezetű enzimben alakul ki, ugyanis a kötésében résztvevő Gly 373 peptid N-atom és az aminosav oldalláncok (Arg 38, Lys 215) valószínűleg csak a szerkezet záródása során kerülnek elég közel a kölcsönhatások kialakulásához. Ezen a helyen kötődő anion szintén gátolhatja az

65

enzimreakciót, mivel feltételezhetően a reakcióban átadódó foszfo-csoport helyét foglalja el (ld. 3.B ábra).

17. ábra A szubsztrát 3-PG (B), a foszfát (A), valamint a citrát (C) kölcsönhatásai a 3-PG kötőhely konzervatív oldalláncaival A 3-PG-t (kék, (19)) és a citrátot (zöld) kötő szerkezetek a disznóizom PGK biner komplexei, az A ábrán látható (1) jelű foszfát (piros) az ATP biner komplexben, míg a (2) jelű foszfát (piros) a T. brucei PGK MgADP-t is tartalmazó pszeudoterner komplexében (26) kristályosodott. A kölcsönhatásokat szaggatott vonallal jelöltem.

Összefoglalva tehát a PGK enzim szerkezetében két anionkötőhely biztosan létezik. A szerkezeti adatokat a gátláskísérletekkel összevetve nagyon valószínű, hogy mindkét kötőhely gátló jellegű. Ezek egyike, mely azonos a 3-PG szubsztrát kötőhelyével a szubsztrátmentes, nyitott konformációjú enzimben is jelen van. A másik anionkötőhely feltehetően csak az enzim záródása során alakul ki. Bár a korábbi hipotézis (52) alapján az aktiváló anionkötőhely a doménzáródás során alakul ki, ez a kötőhely mégis inkább gátlóhelynek látszik, mivel az anion az átadódó foszfát helyére kötődve gátolhatja az enzimreakciót. Kinetikai kísérleteim is egyértelműen két gátló anionkötőhely jelenlétére utalnak. Mindent összevetve, az aktiváló anionkötőhelyről azonban továbbra sincs szerkezeti információnk, továbbá arról sem, hogy összesen hány anion tud kötődni az enzimmolekulához. A kérdés vizsgálatára alkalmas közvetlen kísérleti módszer az ITC kalorimetria, melynek segítségével ezt a kérdést tovább vizsgáltam (ld. 5.3.3. fejezet). További érdekes és meglepő eredmény, hogy az 1,3-BPG és a MgADP szubsztrátokból kiinduló enzimreakcióban az anionok aktiváló hatását nem, csak gátló hatását tapasztaltam (24. ábra). Csak gyanítható, de nincs rá egyértelmű magyarázat, hogy az aktiválás hiánya az enzim 1,3-BPG-vel való különleges kölcsönhatásának tulajdonítható, mint pl. már korábban bemutattam, az 1,3-BPG modellezése során az 1-es foszfátja mozgékonyságát figyeltem meg (ld. 5.2. fejezet, 15.B ábra). Egy lehetséges magyarázat pl. ha az 1,3-BPG kötődése már önmagában elősegítené a doménzáródást, és

66

természetszerűleg ez nem igényelne anionaktiválást. Ez a kérdés azonban jelenleg még nincs eldöntve, további összetett kísérleti munkát és elméleti modellezést igényel.

5.3.2. Szubsztrátfelesleg aktiválás jelensége A 3-PG és MgATP szubsztrátokból kiinduló enzimreakcióban az élesztő PGK-nál (104, 111) megfigyelték, majd később a disznóizom PGK esetén kvantitatív módon leírták (52) a szubsztrátfelesleg aktiválás jelenségét. Érdekes kérdés ezért, hogy ha az anionok aktiváló hatása nem jelentkezik az 1,3-BPG és MgADP szubsztrátokból kiinduló enzimreakcióban, akkor vajon jelentkezik-e a szubsztrátok feleslegének aktiváló hatása ebben a reakcióirányban? A kérdés vizsgálata azért is fontos, mert az irodalomban ellentmondásos adatokat találtam az 1,3-BPG és a MgADP esetleges aktiváló szerepére (105, 162), ami annak tudható be, hogy az enzimreakciónak ez az iránya az 1,3-BPG instabilitása és a PGK-val való rendkívül erős kölcsönhatása miatt sok buktatót rejt magában. Az enzimreakció mindkét irányában történő kinetikai vizsgálatokra nemcsak ezért volt szükség, hanem azért is, mert a disznóizom PGK-val elkezdett vizsgálatokról időközben áttértünk a hozzá szekvenciálisan 97 %-ban hasonló humán PGK-val való munkára. Ez adott lehetőséget az irányított mutagenezis kísérletekre (ld. 5.4. fejezet), mivel a humán PGK plazmidja állt rendelkezésünkre. Bár kristályszerkezet még nem született a humán PGK-val, de szekvenciája alapján várható volt, hogy tulajdonságaiban nagyon hasonló a sertésizom PGK-hoz. Az alábbi kinetikai mérések ezt is mutatják. Először a 3-PG és a MgATP szubsztrátokból kiinduló reakciót vetettem össze a két enzim esetén. Az enzimreakció

szubsztrátkoncentráció-függését

mérve

megállapítottam,

hogy

a

szubsztrátok feleslege aktiválja az enzimet, mind a disznóizom, mind a humán PGK esetén. Egy tipikus MgATP telítési görbe az 18.A ábrán látható. A másik szubsztrát, a 3-PG vizsgálata esetén is hasonló jellegű görbét kaptam (nincs bemutatva). A kapott kinetikai görbék a disznóizom és a humán PGK-ra hibahatáron belül megegyeznek, ahogyan a kinetikai állandók is (ld. 11. táblázat). Ez a megfigyelés nem meglepő, ugyanis a humán és a disznóizom PGK szekvenciája 417 aminosavából 405 teljesen megegyezik, 10 hasonló karakterű és csak 2 aminosav különbözik teljesen, melyeknek a szerkezetfenntartás szempontjából nincs szerepe.

67

18. ábra A PGK aktivitásának szubsztrátkoncentráció függése 8 nM disznóizom PGK (fekete) és ugyanilyen koncentrációjú hPGK (zöld) aktivitását mértem a MgATP koncentráció függvényében (A ábra), 2,5 mM 3-PG jelenlétében. A kísérleti pontokra illesztett görbe egyenlete megtalálható az Anyagok és Módszerek fejezetben (10. egyenlet). A B ábrán 1,2 nM hPGK aktivitását mértem a MgADP koncentráció függvényében (barna) 0,18 mM 1,3-BPG jelenlétében. A kísérleti pontokat a Michaelis-Menten kinetikai egyenlettel illesztettem.

Az 1,3-BPG és MgADP szubsztrátokból kiinduló enzimreakció vizsgálatát csak a humán PGK-ra végeztem el, hiszen a 3-PG és MgATP szubsztrátokból kiinduló reakcióban sem volt különbség a két enzimforma között. Ebben a reakcióban nem tapasztaltam szubsztrátfelesleg aktiválást és a kinetikai görbéket a Michaelis-Menten kinetika segítségével lehetett leírni. A MgADP szubsztráttal mért telítési görbe az 18.B ábrán látható. A mért kinetikai állandókat a 11. táblázat tartalmazza. A szubsztrátfelesleg aktiválás hiánya az előző fejezetben bemutatott anionaktiválás hiányával együtt alátámasztja azt a korábbi hipotézist, miszerint a két jelenség összefügg (52). Felmerül azonban a kérdés, hogy mindez hogyan magyarázható? Minthogy

az

anion

(szubsztrátfelesleg)

aktiválás

mechanizmusára

is

csak

feltételezésekkel tudunk élni, így annak hiányára sem könnyű ésszerű magyarázatot adni. A 3-PG és MgATP szubsztrátokból kiinduló reakciónál valószínű, hogy az 1,3-BPG disszociációja a sebességmeghatározó lépése a folyamatnak (ld. (104), Irodalmi áttekintés, 2.7. fejezet). Ezért kézenfekvő magyarázat, hogy az aktiváló anion (szubsztrát) az 1,3-BPG disszociációjának elősegítésével gyorsítja az enzimreakciót. Az 1,3-BPG disszociáció gyorsítása összefügghet azzal is, hogy az aktiváló anion közvetve, a doménzáródás/nyitás energiagátját is csökkentheti és ezáltal is kifejthet aktiváló hatást. Azonban az 1,3-BPG és MgADP szubsztrátokból kiinduló reakcióban a termékek közül egyik sem kötődik olyan szorosan, mint az 1,3-BPG és így nem a termékek disszociációja 68

lehet a sebességmeghatározó lépés (110). Itt valószínűleg az a magyarázat az anionaktiválás hiányára, s ezzel együtt a 3-PG és MgATP szubsztrátokból kiinduló enzimreakcióhoz viszonyított nagyobb specifikus aktivitás értékre (ld. 11. táblázat), hogy az 1,3-BPG önmagában is aktiválhatja az enzimreakciót, pl. oly módon, hogy 1-es foszfátjának mozgásával befolyásolhatja a domének közötti régióban lévő négy kritikus hélix (ld. 14. ábra) egymáshoz viszonyított helyzetét és ezáltal elősegíti a doménzáródást/nyitást (ld. még 5.4.2. fejezet). Ez azért is lehetséges, mert a többi anionhoz képest nagy a töltése, nagyon szorosan is kötődik (Kd=0,000056 mM), tehát nagyon specifikusan aktiválhat.

5.3.3. Az anionok kötődésének jellemzése 5.3.3.1. Izotermális titráló kalorimetriás (ITC) módszerrel Kísérletet tettem az aktiváló kötőhely azonosítására és jellemzésére az izotermális titrálás módszerével, amely alkalmas arra, hogy a ligandumkötés sztöchiometriáját meghatározzuk. Megvizsgáltuk a 3-PG, illetve az anionok közül a citrát és a pirofoszfát kötődését ITC módszerrel (ld. 10. táblázat). A kísérleti pontok illesztésével a sztöchiometria 0,7-1 között változott, ami azt jelenti, hogy a 3-PG-nek és az anionoknak (hasonlóan a nukleotidokhoz, illetve nukleotid analógokhoz, ld. 5.1.2. fejezet) csupán egyetlen kötőhelyét lehetett kimutatni a szubsztrátmentes enzimet titrálva. Ez a kötőhely, mivel szubsztrátok nincsenek jelen, azaz a szerkezet nyitott, nagy valószínűséggel azonos a 3-PG kötőhellyel, amely lényegében az anionok egyik gátlóhelye a működő enzimnél (ld. 5.3.1. fejezet). Kísérletet tettünk arra is, hogy az anionoknak a szubsztrátkötőhelyen kívüli kötődését kimutassuk, mégpedig oly módon, hogy a PGK nem működő terner komplexeit titráltuk az anionnal. Ez a módszer alkalmasnak tűnt az aktiváló anion kötőhely kimutatására mindkét szubsztrát jelenlétében, a zárt konformációjú PGK esetében. Méréseink azonban negatív eredményt szolgáltattak a további anionok kötődését illetően. Ennek oka az lehet, hogy az aktiváló anionok az aktiválóhelyen nagyon lazán kötődnek (anion aktiválás-gátlás kísérletek alapján a Kd érték közelítőleg 10-20 mM lehet), amelynek kimutatására kísérletileg megvalósíthatatlanul magas PGK koncentrációra lett volna szükség. Túl nagy koncentrációjú anionnal végezve a titrálást, az anion kiszoríthatja a szubsztrátokat is azok kötőhelyéről, s így megint csak nem az aktiválóhelyen való kötődést mérjük.

69

5.3.3.2. SH reaktivitás közvetett módszerét alkalmazva Az anionok, illetve 3-PG analógok (melyek maguk is anionok) kötődését az ITC-s kísérletekkel párhuzamosan a PGK SH-csoportjainak módosítása módszerével is meghatároztam (19. ábra). A meghatározott Kd értékek (a módszer elvét ld. 4.2.5.2. fejezet) hibahatáron belül egyeznek az ITC-s titrálással meghatározottal (10. táblázat). Ebből a kísérletből azonban nemcsak a megfelelő ligandum disszociációs állandóiról (Kd) kapunk felvilágosítást, hanem arról is, hogy az egyes ligandumokkal telítve az enzimet azok milyen mértékben védenek a kémiai módosítással szemben. Mivel a két reaktív SH-csoport a 13-as hélixben (ld. 1. ábra) helyezkedik el, így a védelem mértékéből ezen hélix konformációs állapotára, rendezettségére következtethetünk. Kristályszerkezeti adatok arra utalnak, hogy ezen hélix rendezettsége nagymértékben változik az egyes szubsztrát komplexekben. Ezért érdekesnek látszott megvizsgálni, hogy vajon az anionkötődés is befolyásolja-e a 13-as hélix rendezettségét. A relatív védőhatást a thiolmódosítással szemben (ld. 10. táblázat, relatív k értékek) oly módon lehet meghatározni, hogy az egyes ligandumok telítési koncentrációjánál kapott kmin sebességi állandó értékeit hasonlítjuk a ligandum távollétében mért kmax értékhez. A vizsgált szubsztrátok és anionok Kd, illetve relatív k értékeit a 10. táblázat, az analógok képletét a 7. ábra mutatja (ld. 5.1.1. fejezet).

19. ábra Anionok, illetve 3-PG analógok hatása a PGK DTNB-vel szembeni módosítás sebességére Az ábra a 3-PG (fekete), a 2,3-BPG (narancssárga), a pirofoszfát (kék), illetve a 2-PG (rózsaszín) hatását mutatja be. A kísérleti pontok illesztéséből megkaphatóak a Kd értékek (17. egyenlet). Ligandum távollétében az ordinátán feltüntetett k érték a kmax, végtelen ligandum koncentrációra extrapolált érték a kmin.

70

A 10. táblázat alapján elmondható, hogy az analógok közül az 1,3-BPG analóg 2,3-BPG kötődik a legszorosabban, az anionok közül pedig a pirofoszfát. Ez utóbbi kötődésének erőssége azonban egy nagyságrenddel kisebb, mint 3-PG vagy a 2,3-BPG kötődése és inkább a 2-PG kötődésével mérhető össze. Az anionok közül a foszfát kötődése a leggyengébb. Az aktiválás-gátlás kísérletekben alkalmazott három anion (ld. 5.3.1. fejezet) közül ez a legkisebb méretű és legkisebb töltésű, s ez összefüggésben állhat azzal, hogy aktiváló és gátló hatása is kevésbé specifikus a pirofoszfáthoz, illetve a citráthoz viszonyítva. Összehasonlításként az 1,3-BPG Kd értékét is feltüntettem a táblázatban, mely az összes állandóhoz képest a legkisebb érték, azaz a legszorosabb kötődésre utal. 10. táblázat 3-PG, 1,3-BPG, analógjaik, illetve egyéb anionok tiol reaktivitás, illetve ITC titrálás módszerével meghatározott kötődési állandói (Kd), relatív védőhatásuk (relatív k = kmax/kmin), illetve a megfelelő biner komplexek DSC-mérések alapján meghatározott stabilitási adatai

Ligandum  D-3-PG D-G-3-P 2-PG 1,3-BPG 2,3-BPG 1,5-BPP MgATP MgADP Pirofoszfát Citrát Foszfát

Kd (mM)  0,027 (0,033) 0,085 0,20 0,000056 0,020  (0,27) (0,054) 0,10 (0,10) 0,36 (0,31) 6,97

Relatív k 1 0,28 0,25 0,39 0,08 0,19    0,46 0,36 0,59

Tm (oC) 53,0 58,2 58,5 54,2  56,9 55,4 55,6 57,6 55,6 55,8 55,2

∆Tm (oC)  5,2 5,5 1,2  3,9 2,4 2,6 4,6 2,6 2,8 2,2

Kd értékek mérési hibája < 10%, a relatív k értéké ±0,05 a kalorimetriásan meghatározott Tm értékeké pedig ±0,2oC. A zárójelben lévő Kd értékeket ITC módszerrel határoztuk meg.

A tiol módosítással szembeni relatív védőhatás mértéke is 1-2 kivételtől eltekintve közelítőleg olyan sorrendet mutat, mint a Kd értékek, de az analógok szerkezetével is párhuzamba állítható. Pl. a G-3-P és a 2,3-BPG, melyek a legjobb analógjai a 3-PG-nek (7. ábra), illetve az 1,3-BPG-nek, a 3-PG-hez viszonyítva legalább ugyanolyan mértékben védi a PGK reaktív SH-csoportjait (10. táblázat). A 2-PG, illetve az anionok védőhatása már kisebb mértékű. A 2-PG kisebb védőhatása azzal magyarázható, hogy egy rövidebb analóg, nem kötődik szubsztrát-szerűen (163) az anionok esetén pedig azért érthető ez az eredmény, mert nem tudnak olyan specifikus módon kötődni, mint a szubsztrát 3-PG.

71

5.3.4. Anionok szerkezetstabilizáló hatásának vizsgálata DSC módszerrel Felmerül a kérdés, hogy az anionok 13-as hélixre kifejtett lokális hatásán túl vajon képesek-e a teljes PGK molekula szerkezetét is stabilizálni és hatásuk sorrendje követi-e kötődési erősségük, illetve töltöttségük sorrendjét? A kérdés vizsgálatára DSC kísérleteket végeztem, melyek alapján további információkat vártam az anion-enzim kölcsönhatásról (a mért Tm értékeket a 10. táblázat tartalmazza). Az eredmények egyértelmű összefüggést mutatnak az anionos ligandumok szerkezetstabilizáló hatása és kötődésük erőssége között. A kísérletből az is kiderült, hogy a 3-PG foszfát és hidroxil-csoportja felelős a PGK szerkezetének nagymértékű stabilizálásáért, ugyanis a glicerol-3-foszfát (G-3-P) esetén mért „olvadási hőmérséklet” gyakorlatilag megegyezik a 3-PG esetén kapott értékkel. Ez összhangban van korábbi gátláskísérletekkel is (55). Sorrendben a következő, kisebb hatású analóg a 2,3-BPG, melyben a 3-PG hidroxil-csoportja helyett egy foszfát csoportot találunk. A mikrokalorimetriás mérés alapján megfigyelt stabilizáló hatás mértéke jól egybevág a PGK SH-csoportjainak módosításával szemben tapasztalttal (5.3.3. fejezet). Az egyszerű anionok védőhatásának mértéke hasonló az 1,5-BPP analógéhoz, mely az 1,3-BPG-nek egy „rossz” analógja. Tudjuk, hogy az 1,3-BPG nagyon szorosan kötődik, ezért azt várnánk, hogy nagy stabilizáló hatással bír. Az 1,3-BPG enzimszerkezet stabilizáló hatását azonban nem lehet ilyen kísérletben jellemezni, mivel igen bomlékony anyag. Más módszerrel azonban már korábban kimutatták az 1,3-BPG nagy szerkezetstabilizáló hatását (ld. Irodalmi áttekintés, 2.6.4. fejezet). Visszatérve az 1,5-BPP-hez, ennek szerkezete az 1,3-BPG-jéhez képest jóval egyszerűbb (7. ábra). Valószínűleg ez okozza, hogy az enzimre gyakorolt szerkezetstabilizáló hatásának mértéke összehasonlítható az anionok esetén mérttel, illetve a szintén „rossz” analóg 2-PG stabilizáló hatásával. Összefoglalva, a fenti adatok érdekes összefüggéseket tártak ugyan fel az anionok PGK-val való kölcsönhatásáról, azonban nem vittek közelebb annak a kérdésnek a megválaszolásához, hogy hova is kötődhet az aktiváló anion az enzimszerkezetben. Lényegében az anionoknak a szubsztrátmentes enzimben csupán egyetlen kötőhelyét lehetett kimutatni, mely feltehetően azonos a 3-PG foszfátjának több bázikus oldallánc által alkotott erős anionkötőhelyével, azaz a gátló helyek egyike lehet.

72

5.3.5. A lehetséges anionkötőhelyek azonosítása molekuláris modellezéssel A további lehetséges anionkötőhely(ek) azonosítására modellezést végeztünk. A modellezés tárgyául a T. brucei PGK terner komplex zárt szerkezetét választottuk. A kinetikai kísérletben vizsgált anionokat, illetve a szubsztrát 3-PG-t mint aktiváló aniont is modelleztük. A modellezés alapján a kristályszerkezetben azonosított két gátló kötőhely (ld. 5.3.1. fejezet) mellett további három lehetséges kötőhelyet azonosítottunk (A modellezett foszfát, illetve a modellezett 3-PG kötődését a 20.A, B ábra mutatja be).

20. ábra A foszfát (A), illetve a 3-PG (B) modellezése a T. brucei PGK zárt konformációjú komplexébe Az ábrákon a modellezett anionokat narancssárga pálcika modellel, a szubsztrátként korábban modellezett 1,3-BPG-t kék pálcika modellel, a MgADP-t zöld golyós modellel ábrázoltam. Az anionok kölcsönhatásait a zöld színű aminosav oldalláncokkal szaggatott vonal jelzi. Azokat az oldalláncokat, melyek a szubsztrátkötésben nem, csak az anionkötésben vesznek részt, vékony narancssárga pálcika modellel ábrázoltam. A szubsztrátok oldalláncokkal való kölcsönhatásait ezen az ábrán nem tüntettem fel.

Az egyik kötőhely (1) a zárt szerkezetben az aktív centrumon kívül esik. Ezen a kötőhelyen az anionok, illetve a 3-PG is az Arg 65/Tb65 és a Lys 215/Tb219 aminosavak oldalláncaival hat kölcsön. Ez valószínűleg aktiválóhely, mely csak a doménzáródás során jöhet létre, ahogy korábban feltételezték (52). Az Arg 65 anionaktiválásbeli szerepét már korábbi mutációs kísérletek is megmutatták (49, 50). Az itt kötődő aktiváló anion gyorsíthatja az enzimreakciót egyrészt a doménzáródás energiagátjának csökkentésével, másrészt versenghet az Asp 218/Tb222 negatív töltésű oldalláncával. Ez a zárt szerkezetben egyébként sóhidat képez az Arg 65/Tb65-tel, ezzel stabilizálva a zárt szerkezetet. Egy másik kötőhely (2) található az N-domén külső felszínén lévő kicsi, de jól meghatározott üregben. Ezen a kötőhelyen az anion a 3-PG szubsztrátszerű kötődésében résztvevő His 62/Tb62 és az Arg 122/Tb135 mellett még kölcsönhatást alakít ki a konzervatív Arg 21/Tb22 oldalláncával, illetve a Glu 127/Tb140 oldalláncával is. Ezen

73

aminosavak közül az Arg 21-nek van egyértelműen szerepe az anionaktiválásban mutagenezis vizsgálatok alapján (45, 46). A His 62 (45, 47) és az Arg 122 (50) mutációi esetén nem egyértelműek az eredmények. Mindezek alapján nem dönthető el, hogy ennek az anionkötőhelynek vajon milyen szerepe van az enzim működésében. Amint fentebb említettem lehet aktiváló hely, melyre mutációs kísérletek utalnak. Másrészt gátló hely is lehet, hiszen az itt kötődő anion kölcsönhat a 3-PG szubsztrátot kötő oldalláncokkal is. Ebben az esetben azt lehet elképzelni, hogy ez az anion verseng a 3-PG-vel a His 62 és Arg 122 oldalláncaival való kölcsönhatásban, ezáltal gyengíti a szubsztrát foszfocsoportjának kölcsönhatásait. A harmadik kötőhelyet (3) abban az esetben tudtuk kimutatni, amikor az aktív centrumból eltávolítottuk a vízmolekulákat. Ekkor az anion közel kötődött az 1,3-BPG 1-es foszfát helyéhez. Mint már említettem az 1,3-BPG 1-es foszfátja mozoghat még a zárt szerkezetben is (5.2. fejezet), tehát érthető, hogy még egy foszfát molekula képes kötődni a zárt szerkezetben az 1,3-BPG mellett. Természetesen, modellezéssel azt nem lehet megállapítani, hogy az adott helyen kötődő anionnak mi lehet a funkciója, azaz aktivál-e vagy gátol. A (3) pozícióban kötődő anion pl. a 3-PG és MgATP szubsztrátokból kiinduló enzimreakcióban képződő termék, az 1,3-BPG kötődését gyengítve elősegítheti annak disszociációját. Ez utóbbi jelenségre, azaz, hogy az anion segítheti az enzimreakció termékének disszociációját, számos példa van az irodalomban (164-166). Az eddigi mutációs kísérletek csupán a (2) anionkötőhely létezését támasztják alá, azonban a modellezés által lehetőségként felvetett (1)-es és (3)-as helyen lévő aminosavoldalláncok anionkötésbeli szerepére nincs még egyértelmű bizonyíték. Ezért mutációkat terveztem a Lys 215, illetve az Arg 38 aminosavak helyspecifikus cseréjére. A mutáns fehérjék fizikai-kémiai és funkcionális jellemzésével kívántam kísérleti bizonyítékot kapni egyrészt az anionkötőhelyek enzimaktivitásban betöltött szerepéről, másrészt arról, hogy vajon a szóban forgó oldalláncok aktiváló, vagy gátló kötőhely részeit alkotják-e?

74

5.4. A MgATP-vel, az 1,3-BPG-vel, illetve az aktiváló anionokkal kölcsönható oldalláncok azonosítása: helyspecifikus mutagenezis 5.4.1. A Lys 215 és az Arg 38 cseréje pontmutációval és a mutánsok fizikaikémiai jellemzése Az 1-es hélixben elhelyezkedő Arg 38 és a 8-as hélixben lévő Lys 215 (14. ábra) teljesen konzervatív oldalláncok, az adatbázisból ismert kb. 160 PGK szekvencia mindegyikében megtalálhatóak. Ez a tény arra utal, hogy az enzim működésében és/vagy szerkezetében fontos szerepük lehet. Az Arg 38-nak a katalízisben alapvető szerepét Ala-ra történő mutációjával már igazolták (45, 47), azonban a Lys 215 vonatkozásában még eddig nem történt ilyen kísérlet, holott a T. maritima PGK zárt szerkezetében (23) mindkét szubsztráttal (analóggal) kölcsönhatást alakít ki (ld. Irodalmi áttekintés 2.4. fejezet). Munkám megkezdésekor az anionaktiválás vonatkozásában is ugyanez állt fenn: bár az Arg 38 Ala-ra történő mutációjakor eltűnt az anionaktiválás (47), azonban a két oldallánc együttes szerepét (pl. 3-as számú modellezett foszfát ion esetén, 20.A ábra) az anionaktiválásban még nem vizsgálták. Az előbbi fejezetekben bemutatott kísérleti és modellezési eredményeim is felvetették azt a lehetőséget, hogy a nukleotid szubsztrát (MgATP) a Lys 215-tel, az ellentétes irányú enzimreakció szubsztrátja, az 1,3-BPG pedig mind a Lys 215-tel, mind az Arg 38-cal kölcsönhatásba kerül. A Lys 215 esetleges katalitikus szerepének igazolása azért is izgalmas kérdés, mert a nyitott konformációjú inaktív enzimben a katalitikus helyétől távol helyezkedik el és csak a szerkezet záródásakor mozdul el legalább 10 Å-nyit (14.B ábra), ezáltal kerülve az aktív centrumba. Mindez indokolta a Lys 215 és Arg 38 szerepének vizsgálatát mutációs kísérletekben. Mindkét aminosavat Ala-ra cseréltük ki pontmutációval. Mindenekelőtt ellenőriznem kellett, hogy a mutánsok polipeptidlánca jól feltekeredett állapotban van-e. Összevetve a mutánsokra mind a távoli, mind a közeli UV tartományban felvett CD spektrumokat a vad típusú PGK-éval (nincs bemutatva), nem tapasztaltható lényeges különbség közöttük. Ez kizárja a nagy mértékű konformációs változás lehetőségét a mutáció hatására. DSC kalorimetriás módszerrel is vizsgáltam a mutánsok szerkezetét. Valamennyi mutáns hődenaturációját kooperatív hőátmenet jellemezte, ami szintén azt jelzi, hogy a mutáns fehérjék jól feltekeredett szerkezettel rendelkeznek. A Tm érték csak az R38A mutáns esetén tér el szignifikánsan a vad típusú fehérjéétől, mely 4-5 oC-kal alacsonyabb 75

„olvadási hőmérsékletet” jelent (21.A ábra). Ez egy sokkal flexibilisebb szerkezetre utal a vad típusú enzimhez viszonyítva. Ezzel összhangban, az enzim reaktív SH-csoportjainak DTNB-vel való módosítása során azt tapasztaltuk, hogy a vad típusú, illetve a K215A mutáns enzim esetén megfigyelt két gyorsan reagáló SH-csoporttal szemben (21.B ábra), az R38A mutáns esetén kb. 5 SH-csoport reagál viszonylag gyorsan. Ez azt mutatja, hogy a reaktív SH-csoportok környezetében lokális konformáció változások következnek be a mutáció hatására. Ezeket a változásokat azonban korábbi NMR mérések során nem észlelték, amikor a 3-PG kötőhely közelében lévő His-ek kémiai eltolódásainak perturbációit vizsgálták (47).

21. ábra A mutáció hatása a PGK hődenaturációjára, illetve reaktív tiol-csoportjai módosítására A vad típusú hPGK (fekete), valamint a K215A (piros) és az R38A (kék) mutánsok hődenaturációs görbéi (A), valamint ugyanezen fehérjék reaktív SH-csoportjai kémiai módosításának időgörbéi (B) láthatók az ábrán. Az A ábrán látható Tm értékek rendre 54,7, 53,6, és 49,0 oC. A B ábrán 9 µM PGK 0,05 mM DTNB-vel történő módosítását követtük 412 nm-en. Az ordinátán látható reagáló tiol-csoportok számát az ε412nm=14150 M-1cm-1 koefficiens segítségével határoztam meg (151).

5.4.2. A mutánsok enzimek működésének jellemzése 5.4.2.1. Szubsztráttelítési görbék meghatározása A zárt konformációjú PGK kristályszerkezeti adatai ismeretében felmerül a kérdés, van-e közvetlen szerepe a Lys 215-nek a katalízisben. Esetleges katalitikus szerepén kívül érdekes lenne tudni azt is, hogy vajon van-e szerepe a doménzáródás elősegítésében is (ld. 2.4.3. fejezet). Mindkét kérdés vizsgálatára alkalmasnak látszott ezen oldallánc neutrális Ala-ra (K215A) cseréje és a mutáns jellemzése enzimkinetikai kísérletekben. Az Arg 38 Ala-ra való cserét ugyan már elvégezték (R38A), ezáltal bizonyítva katalitikus szerepét, 76

azonban az 1,3-BPG és MgADP szubsztrátokból kiinduló enzimreakcióban ennek a mutánsnak a viselkedését nem jellemezték. A Lys 215 és az Arg 38 mutánsok esetén megvizsgáltam az enzimreakció szubsztrátkoncentráció függését az enzimreakció mindkét irányában. A 3-PG és MgATP szubsztrátokból kiinduló enzimreakcióban a K215A mutáns esetén az enzimaktivitás 1500-2000-ed részére csökkent a vad típusú enzimhez viszonyítva, igazolván a Lys 215 oldallánc közvetlen katalitikus szerepét. Az aktivitás értékeket az 11. táblázat tartalmazza. Az R38A mutáns esetén hasonló nagyságrendű csökkenést tapasztaltunk, mint az irodalomban leírt (47). Ezt az aminosavat találták esszenciálisnak eddig a PGK katalízisében. Mint már említettem, a mutánsok szerkezete nem különbözött lényegesen a vad típusú enzimétől (ld. 5.4.1. fejezet), tehát ez nem lehetett oka a drasztikus aktivitás vesztésnek. A drasztikus aktivitásvesztés mellett a Lys 215 aminosav mutációja megszüntette a vad típusú enzimre jellemző szubsztrátfelesleg-aktiválás jelenségét is és a 3-PG és a MgATP szubsztrátokból kiinduló enzimreakcióban a szubsztráttelítési görbéket az egyszerű Michaelis-Menten kinetikával lehetett jellemezni (22. ábra). Hasonló viselkedést tapasztaltunk az R38A mutáns esetén is.

22. ábra A Lys 215 és az Arg 38 mutációinak hatása a szubsztátfelesleg-aktiválásra a 3-PG és MgATP szubsztrátokból kiinduló reakcióban 8 nM vad típusú hPGK (fekete) és 3,8 µM K215A (piros), illetve 4,5 µM R38A (kék) mutánsok aktivitását mértem az A ábrán 10 mM ATP és 12,5 mM MgCl2 jelenlétében a 3-PG különböző koncentrációinál, a B ábrán 10 mM 3-PG (az R38A mutáns esetén 15 mM) és 12,5 mM MgCl2 jelenlétében a MgATP különböző koncentrációinál. A kísérleti pontokat a vad típusú PGK esetén az Anyagok és Módszerekben leírt 10. egyenlettel, a mutánsok esetén pedig a Michaelis-Menten egyenlettel illesztettem.

77

Az 1,3-BPG és MgADP szubsztrátokból kiinduló reakció sebességét a mutációk természetesen hasonló mértékben csökkentették, mint ahogy azt a 3-PG és MgATP-ből kiinduló reakcióban tapasztaltam. A vad típusú enzimhez hasonlóan, a vizsgált mutánsok esetében sem tapasztaltam a szubsztrátfelesleg-aktiválás jelenségét. A kapott görbéket az egyszerű Michaelis-Menten típusú telítési hiperbolával jól lehetett jellemezni. Az R38A, illetve a K215A mutánsok Lineweaver-Burk féle ábrázolásban kapott egyenesei a 23. ábrán láthatók. A 3-PG Km értéke csak kicsit (kb. 4-szeresére) nőtt a K215A mutáns esetén, míg az R38A mutáció hatására jelentősen (kb. 40-szeresére) (Km értékeket ld. 11. táblázat). Ez utóbbi nagyságrendileg egyezik az irodalomban leírt, szulfát távollétében mérttel (47). A MgATP Km értéke viszont a K215A mutáns esetén nő nagyobb mértékben, kb. 20-szorosára. Az 1,3-BPG Km értékének növekedése a K215A mutáns esetében hasonló mértékű a MgATP Km értékében tapasztalt növekedéshez, azonban az R38A mutáns esetén nő a legnagyobb mértékben (kb. 600-szoros növekedés). A MgADP Km értéke a hibahatáron belül nem változik a mutáció hatására.

23. ábra Lys 215 és az Arg 38 mutációinak hatása az 1,3-BPG és MgADP szubsztrátokból kiinduló reakcióban Az A ábrán 0,2 µM R38A (kék) mutáns aktivitását mértem 1 mM ADP és 15 mM MgCl2, továbbá 10 mM 3-PG jelen- (●), illetve távollétében (○), a B ábrán 0,44 nM vad típusú hPGK (fekete), illetve 1,8 µM K215A (piros) mutáns aktivitását mértem szintén 1 mM ADP és 15 mM MgCl2, továbbá 10 mM 3-PG jelenlétében az 1,3-BPG különböző koncentrációinál fluorimetriás módszerrel (magyarázatot ld. Anyagok és Módszerek). A kísérleti pontokat a Lineweaver-Burk féle egyenlettel illesztettem. Az 1,3-BPG Km értékeinek számolásánál a 3-PG KI értékeit a vad típusú enzim, a K215A, illetve az R38A mutáns esetében rendre: 0,05, 0,4, 4,5 mM-nak vettem. Az R38A mutáns esetén a közvetlenül mért Km érték megegyezik a 10 mM 3-PG jelenlétében mért Km értékből számolttal. Azonos kkat értékre normalizáltam valamennyi adatsort.

78

A K215A mutáns esetén hasonló mértékben megnövekedett MgATP és 1,3-BPG szubsztrátok Km értékei alátámasztják a Lys 215 szerepét a katalízis alatt. Továbbá arra engednek következtetni, hogy a Lys 215 az enzimreakcióban átadódó foszfo-csoportot (MgATP γ-foszfátja, illetve az 1,3-BPG 1-es foszfátja) stabilizálja. Az R38A mutánsról szintén elmondható ugyanez (ld. 11. táblázat Km értékei). 11. táblázat A vad típusú és a mutáns PGK-k kinetikai paramétereinek összefoglaló táblázata A kkat értékek min-1, a Km , illetve Kkat értékek mM egységben értendők.

hPGK

K215A

PGK formák K215A/hPGK

R38A

R38A/hPGK

50000±3000

29±3

0,0006

27±2

0,0005

0,11±0,03

2,47±0,2

23

0,96±0,07

9

0,10±0,02 b 0,05±0,01

0,41±0,04

4

4,5±0,4

45

0,22±0,09

0,51±0,15

2,3

0,13±0,09

1

158000±25000

47±5

0,0003

360±20

0,0023

K mMgADP

0,12±0,02

0,15±0,03

1

0,10±0,03

1

1,3BPG Km

(5±2) 10-4

(3,8±0,3) 10-3

8

0,29±0,01

580

K dMgATP

0,33±0,15

1,45±0,15

4,4

0,59±0,20

1,8

K dMgADP

0,029±0,004

0,045±0,007

1

0,035±0,009

1

K d3PG

0,035±0,008

0,039±0,01

1

0,94±0,30

26

K d1,3BPG

(5,6±2,4) 10-5 (5,2±1,9) 10-5

1

(9±2) 10-3

161

Állandók

Kötődési a b

MgATP K kat vagy

K mMgATP 3PG vagy K kat 3 PG Km

K IPPi 1,3-BPG*MgADP

Kinetikai

3-PG*MgATP

kkat( vs a)

kkat (Vmax)

a

10 mM MgATP jelenlétében 2,5 mM MgATP jelenlétében

Megvizsgálva a szubsztrátoknak az egyes biner komplexekre jellemző kötődési, Kd értékeinek változását a mutáció hatására, azt tapasztaltuk, hogy a MgATP Kd értéke 4-5-szörösére nőtt a K215A mutáns esetén, mely azt valószínűsíti, hogy a MgATP γ-foszfátja már a biner komplexben, azaz a másik szubsztrát, a 3-PG távollétében is kölcsönhatásba léphet a Lys 215 oldalláncával. Ez a mutáció tehát alátámasztja azt a hipotézist, miszerint a MgATP foszfátláncának flexibilitása révén fluktuálva a két alternatív kötőhely (8-as és 13-as hélix) között, a 8-as hélixben lévő Lys 215-tel

79

kölcsönhatásba léphet, s ezáltal közelítheti egymáshoz a 8-as és a 13-as hélixet, azaz elősegítheti a doménzáródást (5.1.4. fejezet). A mutációk közül az R38A mutáció hatására nőtt jelentős mértékben a 3-PG, illetve az 1,3-BPG Kd értéke. Ez azt mutatja, hogy a biner komplexekben ezek a szubsztrátok kölcsönhatásban vannak az Arg 38-as oldallánccal. Ez a kísérlet tehát alátámasztja az általunk modellezéssel meghatározott 1,3-BPG kötődési módját (5.2. fejezet). 5.4.2.2. A mutációk hatása az anionok által okozott aktiválás-gátlás jelenségre A mutációs kísérletek szintén közelebb vezettek a lehetséges aktiváló anionkötőhelyek azonosításához is, azaz az anionaktiválás mechanizmusának megértéséhez. Elsőként a 3-PG és MgATP szubsztrátokból kiinduló enzimreakcióban tanulmányoztam a K215A és az R38A mutációk hatását. A vad típusú humán PGK esetén (összhangban a disznóizom PGK ezen tulajdonságával) a többértékű anionok alacsony koncentrációban aktiváló, magasabb koncentrációban gátló hatásúak az enzimműködésre (pirofoszfát esetén disznóizom PGK-ra vonatkozik a 16. ábra, míg humán PGK-ra a 24.A ábra).

24. ábra A pirofoszfát hatása az enzimaktivitásra a 3-PG és MgATP (A), illetve az 1,3-BPG és a MgADP (B) szubsztrátokból kiinduló enzimreakcióban Az A ábrán 10,7 nM vad típusú hPGK (fekete) és 4,2 µM K215A (piros) mutáns aktivitását mértem 0,5 mM 3-PG és 0,5 mM MgATP (0,6 mM ATP és 1 mM MgCl2) koncentráció mellett pirofoszfát jelen-, illetve távollétében. A B ábrán 0,3 nM vad típusú hPGK (fekete) és 1,1 µM K215A (piros) hPGK mutáns aktivitását mértem 0,01 mM 1,3-BPG és 0,13 mM MgADP (0,15 mM ADP és 5 mM MgCl2) koncentráció mellett pirofoszfát jelen-, illetve távollétében. A kísérleti pontokat az A ábrán a vad típusú PGK esetén az Anyagok és Módszerekben leírt 12. egyenlettel, a mutánsok, illetve a B ábrán a vad típusú hPGK esetén szintén ezzel az egyenlettel illesztettem, az a faktort 1-nek véve.

80

A mutánsokkal, a pirofoszfát függvényében végzett kinetikai kísérleteim alapján megállapítható, hogy a mutációk hatására az enzim elvesztette az anionaktiválás képességét (ld. 24.A ábra), azonban az aniongátlást alig befolyásolták az aminosav cserék (ld. 11. táblázat K IPPi értékei). Az R38A ezen tulajdonsága összhangban van a már korábban leírttal (47). Megállapítható az is, hogy a mutációk (K215A, R38A) hatására az enzimek az anionok általi

aktiválhatóság

mellett

elvesztették

a

szubsztrátfelesleg

által

okozott

aktiválhatóságukat is (22. ábra), mely arra utal, hogy ez a két jelenség szorosan összefügg, ahogyan ezt már korábban is feltételezték (52). A kísérletek tehát amellett szólnak, hogy a Lys 215 és Arg 38 aminosavak valóban részt vesznek az aktiváló anionkötésben. Ezek szerint az általunk modellezéssel meghatározott (1) és (3) anionkötőhely (20. ábra) aktiválóhely lehet. Az a tény, hogy a Lys 215 és az Arg 38 esszenciálisak az anionaktiváláshoz, arra utal, hogy az aktiváló anionkötőhely közel van az átadódó foszfát kötőhelyéhez, s a működő enzimben a katalízis alatt ez a két hely átfedhet. Ez alátámasztja azt a tényt, hogy az 1,3-BPG és MgADP szubsztrátokból kiinduló reakcióban sem a szubsztrátok feleslege, sem az anionok nem aktiválják az enzimet (24.B ábra), mivel az 1,3-BPG egyszerre töltheti be a szubsztrát és az aktiváló anion (1-es foszfátja) szerepét.

5.5. A domén-domén kölcsönhatások jellemzése mikrokalorimetriával 5.5.1. Vad típusú enzim és a doménenként egyetlen triptofánt tartalmazó mutánsok vizsgálata Amint az Irodalmi áttekintésben tárgyaltam (2.10. fejezet), fehérje-denaturációs kísérletek alkalmasak arra, hogy a szerkezeti domének közötti együttműködés mértékére következtethessünk. Ezt a módszert alkalmaztam a két domén kölcsönhatása mértékének meghatározására. Mikrokalorimetriás és fluorimetriás módszerrel megvizsgáltam a vad típusú disznóizom és élesztő PGK, továbbá az élesztő PGK két Trp mutánsának hődenaturációját. A disznóizom PGK a C-doménjében tartalmaz 4 Trp aminosavat (25), az élesztő PGK-ban ezekből csupán két Trp található meg (113). Az élesztő PGK mutáns W122 csak az N-terminális doménben tartalmaz 1 Trp-t, a W333 mutáns pedig a C-doménben tartalmaz egyetlen Trp-t. A kísérlet gondolatmenete az volt, hogy amennyiben a domének között nem túl erős a kölcsönhatás, akkor azok egymástól megkülönböztethető hőmérsékleten (Tm) fognak „megolvadni”. Így az egyes doménekben

81

külön-külön fluoreszcens Trp-jelölést tartalmazó mutánsok fluorimetriásan meghatározott hőátmenete különbözni fog akár a mutáns, akár a vad típusú enzimek DSC kalorimetriával meghatározott hőátmenetétől, mely utóbbi az egész molekula „megolvadásáról” ad felvilágosítást. Továbbá, ha ilyen különbséget tapasztalunk, akkor remélhető az is, hogy az intakt enzimmolekulában lévő két domén relatív szerkezeti stabilitásáról is kapunk információt, melyről az irodalomban ellentmondásos adatokat találunk (ld. 2.10. fejezet). 5.5.1.1. A vad típusú disznóizom és élesztő PGK hődenaturációja: a domének nagyfokú együttműködése A disznóizom PGK hődenaturációs görbéit szubsztrátok jelen-, illetve távollétében DSC (25.B ábra), illetve fluorimetriás módszerrel (25.C ábra) határoztam meg. A DSC mérésnél minden esetben egyetlen, kicsit aszimmetrikus átmenetet figyeltem meg. Ezeket a méréseket az élesztő PGK, illetve annak két mutánsa esetén is elvégeztem szubsztrátok jelen-, illetve távollétében (27. ábra). A meghatározott Tm értékeket, illetve a kalorimetriás átmenetet jellemző hőmennyiséget (Qt) az 12. táblázat tartalmazza. Látható, hogy a szubsztrátok védik a PGK szerkezetét a hődenaturációval szemben, melyet később tárgyalok. A disznóizom PGK hődenaturációja irreverzibilis folyamat, hasonlóan az élesztő enzimhez (98, 167). A fehérjeminták másodszori felfűtésekor ugyanis nem kaptam hőátmenetet. Ezen kívül a mért Tm értékek erősen függenek az alkalmazott felfűtési sebességtől, azaz a hődenaturáció folyamata kinetikai kontroll alatt álló, nemegyensúlyi folyamat hasonlóan az élesztő PGK esetén tapasztalthoz (167). A hődenaturáció mechanizmusa valószínűleg komplexszebb, mint az egyszerű kétállapotú irreverzibilis natív → denaturált átmenettel korábban élesztő PGK-ra leírt modell (167). A mérési adatokat analizálva a korábban Sanchez-Ruiz és mti által leírt irreverzibilis kinetikai modell szerint (152), azt tapasztaltam, hogy az adatok, bár egyenessel közelíthetők (ld. 26. ábra), azonban mégis eltérnek a kétállapotú irreverzibilis modelltől. Ezt támasztja alá az is, hogy a különböző felfűtési sebességek esetén nem volt lehetséges egyenessel illeszteni valamennyi mérést (168). A fő cél azonban nem a hődenaturáció mechanizmusának feltárása volt számomra, hanem az, hogy vajon a két domén kitekeredése elkülöníthető-e, még ha igen kis mértékben is. Ezért megvizsgáltam a hőátmeneteket a Trp fluoreszcencia jelének változását követve (25.C ábra) is. Adott felfűtési sebesség mellett a kísérleti hibahatáron

82

belül azonos Tm értékeket kaptam a fluoreszcenciás (25.C ábra) és a DSC (25.B ábra) kísérletekben. Ezeket az adatokat a 12. táblázat foglalja össze. A fluorimetriás és a kalorimetriás átmeneteket jellemző Tm értékek jó egyezése azt jelenti, hogy a disznóizom PGK esetén a C-domén szerkezetének kitekeredése nem különíthető el a teljes molekula kitekeredésétől, azaz a két domén nagyon kooperatív módon tekeredik ki. A vad típusú élesztő PGK esetén is hasonló következtetésre jutottam (vö. 27.A,B ábra).

25. ábra A szubsztrátok hatása a sertésizom PGK hődenaturációs folyamatára Karboxamidometilezett (A) és módosítatlan (B,C) disznóizom PGK hődenaturációs görbéit mértem szubsztrátok távollétében (fekete), illetve 10 mM MgATP (zöld), 10 mM MgADP (rózsaszín), 10 mM 3-PG (kék), illetve 10 mM 3PG és 10 mM MgADP (piros) jelenlétében DSC kalorimetriás (A,B), illetve fluorimetriás (C) módszerrel. A felfűtési sebesség valamennyi kísérletben 1 oC/perc volt.

83

26. ábra A hődenaturációs görbék linearizálása Az A ábrán disznóizom PGK 1,5 (U), 0,7 (…), 0,4 ({) és 0,1 (V) oC/perc felfűtési sebességgel, szubsztrátok távollétében mért DSC görbéit számoltam át a 26. egyenlet szerint, a B ábrán vad típusú disznóizom (z,{), vad típusú élesztő („,…), W122 (¡,‘), illetve W333 (S,U) mutáns 1 oC/perc felfűtési sebességgel, szubsztrátok távollétében mért kalorimetriás (tömör jel), illetve fluorimetriás (üres jel) görbéit számoltam át a 27. egyenlet szerint. Az eredeti adatok a 25. és a 27. ábrán láthatók. Az aktiválási paramétereket az A ábrán látható linearizálási mód alapján számoltam. Az aktiválási paramétereket a 13. táblázat tartalmazza.

27. ábra A vad típusú és mutáns élesztő PGK-k hődenaturációs görbéi A vad típusú élesztő PGK (fekete), és a W122 (kék), illetve a W333 (piros) mutánsok hődenaturációját mértem DSC (A,C), illetve fluorimetriás (B,D) módszerrel 10 mM 3-PG jelen- (C,D), illetve távollétében (A,B) 1 oC/perc felfűtési sebességgel.

84

5.5.1.2.

Az

élesztő

PGK

mutánsainak

eltérő

hőstabilitása

nem

a

domének

együttműködésével áll összefüggésben A fenti kísérletek a teljes PGK molekula, illetve a molekulán belüli C-domén kitekeredéséről adtak felvilágosítást. Annak érdekében, hogy mind az N-, mind C-domén kitekeredését közvetlenül is tudjam követni a molekulán belül, megvizsgáltam az élesztő PGK két, egyetlen Trp-t tartalmazó mutánsok hődenaturációját DSC, illetve fluorimetriás módszerrel követve. A Trp aminosav az egyik mutáns esetén az N-doménben (W122), a másik mutáns esetén a C-doménben (W333) helyezkedett el, ahogyan azt Mas és mti is alkalmazták (28, 169). A korábbi mérésekkel összhangban (28, 169), ezek a mutánsok teljesen aktívnak bizonyultak, tehát a mutáció nem befolyásolta az enzimműködést. A mutánsok stabilitása csak kis mértékben csökkent a GuHCl indukálta egyensúlyi denaturáció során (28, 135) is. Korábban azt feltételezték, hogy a mutánsok szekvenciális modell szerint tekerednek ki, mégpedig először a C-domén, majd ezt követi az N-domén denaturációja. Az N-domén teljes kitekeredését ugyanis csak a második átmenetnél figyelték meg (28). Azonban mások a C-domén nagyobb stabilitását találták az izolált N- és C-domént megvizsgálva (135). Mindezek alapján, ha a két domén szekvenciálisan tekeredik ki nemcsak a GuHCl indukálta, hanem a hődenaturáció során is, akkor arra a megfigyelésre kellett volna jutnunk a hődenaturáció vizsgálata során, hogy a fluorimetriás átmenetet jellemző Tm érték a W122, illetve a W333 mutáns esetén ellentétes irányban tér el a vad típusú enzim kalorimetriás átmenetét jellemző Tm értéktől. Az eredmények azonban egyértelműen azt mutatták, hogy a mutánsokra kísérletileg meghatározott Tm értékek hibahatáron belül megegyeznek a kalorimetriás (27.A ábra), illetve a fluorimetriás (27.B ábra) módszerrel vizsgálva (12. táblázat). Mindez tovább erősíti azt a megállapítást, mely szerint a PGK két doménje nagyon kooperatív módon „olvad meg” a hődenaturáció során mind a disznóizom, mind az élesztő PGK-t tekintve. A vad típusú disznóizom, a vad típusú élesztő PGK, valamint az élesztő PGK W333 mutánsa esetén a hődenaturációs átmenetek kvantitatív analízise egyeneseket adott (26. ábra), összhangban az irreverzibilis denaturációra korábban leírt kinetikai modellel (152). Érdekes azonban megfigyelni, hogy szubsztrátok távollétében a W122 mutáns esetén a kétállapotú kooperatív átmenettől szignifikáns eltérést tapasztaltam (26.B ábra), ami főként a különösen érzékeny fluorimetriás módszernél jól megfigyelhető. A W122-es mutáns viselkedése összhangban van az N-domén korábban feltételezett kétlépéses

85

denaturációjával (28, 170). Ha az N-domén két lépésben is tekeredik ki, ettől függetlenül elképzelhető, hogy a két domén kitekeredése még ekkor is nagyon kooperatív módon zajlik. 12. táblázat A disznóizom (A táblázat) és az élesztő (B táblázat) PGK hődenaturációjának átmeneti hőmérsékletei (Tm) és a kalorimetriás hő (Qt) értékek szubsztrátok jelen- és távollétében. A Tm értékek oCban, a Qt értékek kcal/mol egységben értendők. A Tm, k a kalorimetriás, a Tm, f a fluorimetriás átmeneti hőmérsékleteket jelentik.

A) Ligandum  MgATP MgADP 3-PG 3-PG+MgADP a

Disznóizom PGK Tm, k 53,0 54,8 55,6a 56,9 57,6a 58,2 59,1

Módosítatlan Tm, f 53,1

Qt 114

Tm, k 46,5

Qt 85

55,3

125

47,6

91

57,0

139

48,7

98

57,5

147

52,4

110

58,6

175

51,1

105

59,8a

CM-

extrapolált érték, a Mg2+ destabilizáló hatását figyelembe véve (ld. 5.1.3. fejezet)

B) Ligandum  MgATP MgADP 3-PG 3-PG+MgADP

Tm, k 56,4 59,2 60,7 60,1 62,8

Vad típusú Tm, f 56,2 59,8 61,4 60,0 63,4

Qt 110 127 140 150 157

Élesztő PGK W122 Tm, k Tm, f 47,5 48,5 49,4 51,3 51,5 52,3 51,4 51,7 53,7 54,0

Qt 49 60 73 79 89

Tm, k 52,6 56,0 57,0 56,6 58,9

W333 Tm, f 52,9 55,7 57,5 57,2 59,6

Qt 103 126 130 131 150

A Tm értékek hibája ± 0,2-0,3 oC, a Qt értékek hibája ± 5-10 kcal/mol.

Ez a disznóizom és az élesztő PGK-nál, illetve annak mutánsainál tapasztalt kooperatív denaturációs mechanizmus nagy mértékben eltér a korábban disznóizom PGK renaturációjánál tapasztalt szekvenciális mechanizmustól (130). Azonban ez nem ellentmondás, hiszen a denaturáció a natív szerkezetből indul ki, szerkezettel rendelkező doménekkel és domének közötti kölcsönhatásokkal, mely erős kölcsönhatásokat jelent a két domén között. A renaturáció esetén a denaturált állapotból kiindulva nincsenek meg ezek a domének közötti kölcsönhatások, tehát nem is várható, hogy a renaturáció során a domének nagyfokú együttműködésének következményeként a két domén egyidejű térszerkezet-kialakulását feltételezze.

5.5.2. Biner és terner enzim-szubsztrát komplexek eltérő stabilitása A szubsztrátok enzimszerkezetet stabilizáló hatása a különböző biner és terner komplexekben összefüggésben lehet azon konformációs hatásukkal, amely a domének 86

záródását idézi elő. Ezért megvizsgáltam, hogy a szubsztrátok milyen mértékben fokozzák a PGK hőstabilitását. Mind a hődenaturációt jellemző Tm értékek, mind a kalorimetriás hő (Qt) szignifikánsan nő a szubsztrátkötődés hatására, mutatva a szubsztrátok határozott védőhatását a PGK hődenaturációjával szemben (25. ábra). A folyamat ugyan irreverzibilis, de a kétállapotú irreverzibilis modelltől az eltérés nem túl nagy (26. ábra). Ez csak úgy lehetséges, ha a reverzibilisen kitekeredett állapotú molekulák nem halmozódnak fel mérhető mennyiségben, például keletkezésük sokkal lassabb, mint átalakulásuk egy irreverzibilis lépés utáni teljesen kitekeredett állapotba. Ily módon (kivéve az élesztő PGK W122 mutáns esetét szubsztrátok távollétében) meg tudtam határozni a denaturáció kinetikájának aktiválási paramétereit olyan egyenesek segítségével, mint amilyet a 26.A ábrán mutatok be. A számolt adatokat a 13. táblázat tartalmazza. 13. táblázat A disznóizom és az élesztő PGK hődenaturációs folyamatának aktiválási paraméterei. A ∆H‡ (kcal mol-1) és ∆S‡ (cal mol-1) értékeket a 26.A ábrán látható egyenesekből számoltam, mégpedig a kalorimetriás mérésekből. ∆H‡ értékeket a vizsgált hőmérséklettartományban hőmérséklettől függetlennek tekintettem. A számított ∆G‡ (kcal mol-1) értékek 25 oC-ra vonatkoznak. A ∆H‡, illetve a ∆S‡ értékek hibája ± 10-15%.

A) Ligandum  MgATP MgADP 3-PG 3-PG+MgADP

Disznóizom PGK ∆H‡ 129 160 204 174 241

Nem módosított ∆S‡ 329 418 551 457 658

B) Ligandum  MgATP MgADP 3-PG 3-PG+MgADP

‡

∆H 124 131 149 199 247

Vad típusú ∆S‡ 310 326 380 530 671

‡

∆G 32,0 33,5 35,8 40,8 47,5

∆G‡ 31,0 35,1 39,6 37,3 44,9

CM∆S‡ 333 359 328 307 339

∆H‡ 128 137 127 122 132

Élesztő PGK W122 ‡ ∆H ∆S‡   120 303 138 357 161 428 174 465

‡

∆G  29,1 31,3 33,4 35,3

‡

∆H 165 197 190 224 242

∆G‡ 28,9 29,9 29,4 30,6 30,8

W333 ∆S‡ 438 530 509 612 663

∆G‡ 33,9 38,5 38,2 41,6 44,7

Megfigyelhető, hogy a szubsztrátok mind az aktiválási entalpiát (∆H‡), mind az aktiválási entrópiát (∆S‡) befolyásolják, mégpedig oly módon, mely végső soron elvezet az aktiválási szabadentalpia (∆G‡) növekedéséhez, mellyel kvantitatíven tudtam jellemezni a stabilizáció mértékét. A szubsztrátok közül a 3-PG-nek és közel hasonlóan a MgADP-nek volt a legnagyobb védőhatása, a MgATP pedig kevésbé stabilizálta az

87

enzimszerkezetet. Mindezek alapján nemcsak az lényeges, hogy a szubsztrátok jelenlétében hasonló kooperatív mechanizmus szerint zajlik a PGK denaturációja, hanem az is elmondható, hogy a biner komplexekben az egyes szubsztrátok nemcsak azt a domént stabilizálják, melyen kötődnek, hanem a másikat is (a két domén hőátmenete szubsztrátok jelenlétében sem válik szét), ezzel még jobban erősítve a domének kooperatív viselkedését a hődenaturáció során. A PGK hődenaturációval szemben mutatott stabilitása tovább növekszik a terner komplexekben a biner komplexekhez viszonyítva (25.B ábra, 12. és 13. táblázat). Ezekben a kísérletekben a nem működő terner komplexet vizsgáltam, hogy elkerülhessem az enzimreakció lejátszódásakor esetleg fellépő hőváltozást, így a 3-PG mellett a MgATP-t MgADP-vel helyettesítettem. Az eredményeket tőlünk függetlenül a későbbiekben Zecchinon és mti (171) a hidegtűrő PGK-val végzett kísérleteikkel megerősítették.

5.5.3. Doménzáródás a terner komplexben mehet végbe: inaktív CM-PGK-val végzett kísérletek Mint már említettem a terner enzim-szubsztrát komplexek mutatják a legnagyobb stabilitást a biner komplexek, illetve a szubsztrátmentes enzim stabilitásához viszonyítva. Kérdésként merül fel, hogy a szubsztrátok enzimkonformációra gyakorolt hatása egyszerűen additív-e a terner komplexekben és ennek köszönhető a megnövekedett stabilitás, vagy esetleg a doménzáródás hatására egy további konformációs hatással is számolnunk kell. Ezt a kérdést a fenti kalorimetriás kísérletekből természetesen nem lehet megválaszolni. Azonban lehetőségem volt összehasonlításképpen megvizsgálni a szubsztrátok hatását egy olyan inaktív PGK molekula esetén is, amely a szubsztrátokat változatlanul köti, de a doménzáródás nem következik be. Ilyen inaktív enzimet a PGK molekula 13-as hélixe két SH-csoportjának jódacetamiddal való alkilezésével nyertünk. Kisszögű röntgenszórási kísérletek (24) bizonyítják, hogy ez az acetamido-csoporttal módosított PGK (CM-PGK) terner komplexe nyitott szerkezetű, míg a nem módosított enzim terner komplexe zárt szerkezetű oldatban. A CM-PGK kalorimetriás átmeneteit megvizsgálva, s összevetve a nem módosított PGK hőátmeneteivel (ld. 25.A,B ábra) azt tapasztaltam, hogy a módosított enzim csúcsai szélesebbek, mely kevésbé kooperatív átmenetre utal. Megfigyelhető stabilitáscsökkenés is a nem módosított enzimhez képest, mely mind a nagy mértékben csökkent Tm értékekben, mind a kalorimetriás hő (Qt) értékeiben megmutatkozik (ld. 12. táblázat). Az

88

adatokat hasonló módon értékelve, mint ahogyan a 26. ábrán látható, meghatározhatók a módosított enzimre vonatkozó aktiválási paraméterek is (ld. 13. táblázat), melyek szintén szignifikánsan alacsonyabbak a nem módosított enzimhez viszonyítva. A kísérlet azt is mutatja, hogy a PGK molekula 13-as hélixének megfelelő konformációja nagyon fontos szerepet tölt be a molekula stabilitásában. Korábbi, disznóizom PGK-val végzett vizsgálatok azt feltételezik, hogy a kémiai módosítás módosítja a 13-as hélix konformációs állapotát, s ezáltal a két domén közötti fontos stabilizáló kölcsönhatások bomlanak fel (51). A szubsztrátok stabilizáló hatását megvizsgálva a módosított PGK esetén is azt tapasztaltam, hogy a szubsztrátok stabilizálják a módosított enzim szerkezetét is, mely összhangban van azzal, hogy ugyanolyan erősen kötik a szubsztrátokat, mint a nem módosított PGK (55). A biner komplexek stabilizáló hatásának sorrendje megegyezik a nem módosított enzimnél tapasztalttal (25. ábra, 12. táblázat). Van azonban egy lényeges különbség a két enzim között: a CM-PGK terner komplexének stabilitását összevetve a biner komplexek stabilitásával nem a terner komplex mutatja a legnagyobb stabilitást. Ez a jelenség csak azzal állhat összefüggésben, hogy a CM-PGK esetén a terner komplex nyitott szerkezetű oldatban, ahogy az kisszögű röntgenszórási kísérletekből kiderült (24). Összefoglalva tehát, eredményeim azt mutatják, hogy a legnagyobb konformációs stabilitás a natív, terner enzim-szubsztrát komplexre jellemző. A szubsztrátok védőhatása a terner komplexekben a legnagyobb (a biner komplexekhez viszonyítva), mely a CM-PGK esetén megszűnik, amelyben a módosítás miatt nem jöhet létre doménzáródás. Ennek alapján tehát párhuzam vonható a terner komplex legnagyobb stabilitása és a doménzáródás között. A továbbiakban kristályszerkezeti adatok alapján vizsgáltam meg, hogy milyen atomi kölcsönhatások magyarázhatják a PGK domének együttműködését és a terner komplex legnagyobb stabilitását. Mindezt azzal a céllal tettem, hogy felderítsem a doménzáródás szerkezeti alapjait.

89

5.6. A doménzáródás molekulaszerkezeti alapjai az ismert kristályszerkezetek összehasonlító elemzése alapján 5.6.1. A PGK domének együttműködésének szerkezeti alapjai: a domének közötti régió vizsgálata Ahhoz, hogy megértsük a PGK kooperatív viselkedését, meg kell vizsgálnunk a domének

közötti

kölcsönhatásokat.

A

rendelkezésemre

álló

12

különböző

kristályszerkezetben háromféle molekuláris kölcsönhatást vizsgáltam meg: peptid N-, illetve O-atomok közötti H-kötéseket (a), konzervatív aminosav oldalláncok közötti, illetve konzervatív oldalláncok és peptid N-, illetve O-atomok közötti elektrosztatikus kölcsönhatásokat és H-kötéseket (b), valamint hidrofób kölcsönhatásokat (c). Először azokat a kölcsönhatásokat elemeztem, melyek az összes szerkezetben megtalálhatók, függetlenül attól, hogy milyen fajból származik a szerkezet, illetve milyen konformációs állapotú (nyitott vagy zárt), továbbá köt-e szubsztrátokat vagy sem. A peptid N-és O-atomok közötti kölcsönhatások között (28. ábra) vannak speciálisak, melyek szomszédos másodlagos szerkezeti elemeket kötnek a korábban meghatározott, a domének közötti régióban elhelyezkedő 7-es hélix C- , illetve N-terminális végén lévő csuklókhoz (22), továbbá az L jelű β redőhöz, mely feltehetően a fő csukló régió szerepét tölti be (25) (28. B és C ábra). Az N-csuklónál lévő H-kötések (28.C ábra) kölcsönhatást alakítanak ki a polipeptidlánc C- és N-terminális végei között, mely egy speciális tulajdonsága a PGK-nak. Fontos kiemelni azt a korábbi kísérletet is, melynek során előállították a PGK N-doménjét. Ez csak abban az esetben tartotta meg 3-PG kötő képességét, ha a Cterminális néhány aminosavát is tartalmazta egy linker régióval az N-doménhez kötve (120). Ez is arra utal, hogy a C-terminális néhány aminosava az N-domén szerves részét képezi és nagyon fontos szerepet tölt be annak konformációja kialakításában. A peptid Hkötések az 5-ös és a 7-es hélix között is kialakulnak. Szeretném kiemelni ezeknek a Hkötéseknek a konzervatív voltát, melyek nemcsak stabilizálják ezt a régiót, hanem fontos szerepet töltenek be mindkét domén és a 7-es hélix megfelelő relatív pozíciójának kialakításában. Ahogyan majd a későbbiekben bemutatom, vannak az állandó H-kötések mellett olyanok, melyek a szubsztrátkötődés hatására alakulnak ki, továbbá kialakulásuk függ az enzimmolekula konformációs állapotától is. Míg ezek a kialakuló H-kötések az enzim különböző konformációs állapotait stabilizálják, addig az állandó H-kötések 90

valószínűleg megengedik a domének rigid (merev) testként való relatív elfordulását a 7-es hélixhez képest.

28. ábra A domének közötti kölcsönhatások A szubsztrátmentes disznóizom PGK szerkezetét (A) szalagdiagram mutatja, a B ábrán a C-csukló, a C ábrán az N-csukló részletei láthatók. A D és E ábrán a domének közötti régió szerkezete látható a fő csukló régióval, a βL-el együtt. Az A, B és C ábrán a polipetidláncot pálcika modellel is jeleztem, a H-kötések szaggatott vonallal láthatók. A domének közötti régió konzervatív oldalláncainak (pálcika modell) hidrofób (D), valamint elektrosztatikus kölcsönhatásait és H-kötéseit (E) szaggatott vonal jelzi.

91

A domének közötti régióban nem alakulnak ki peptid H-kötések, azonban ez a régió konzervatív aminosavakból épül fel. Ezen konzervatív aminosavaknak hidrofób kölcsönhatásai (28.D ábra), valamint elektrosztatikus kölcsönhatásai, illetve H-kötései (28.E ábra) valamennyi szerkezetben megtalálhatók, függetlenül attól, hogy a szerkezet köt-e szubsztrátokat, illetve, hogy nyitott vagy éppen zárt szerkezetű. Megállapítható, hogy a domének közötti régióban egy kiterjedt hidrofób klaszter adja a domének közötti kölcsönhatások nagy részét. Ez összhangban van azzal a korábbi megállapítással, hogy hidegdenaturáció során a domének kitekeredése jól elkülöníthető, míg hődenaturáció során a domének nagyfokú együttműködése figyelhető meg. A hidrofób kölcsönhatások erőssége ugyanis a hőmérséklet csökkenésével csökken, tehát valószínűleg

ilyen

típusú

kölcsönhatások

játszanak

szerepet

a

domének

együttműködésében (122, 132). Ez a hidrofób klaszter az elektrosztatikus, illetve Hkötésekkel együtt egy „jól szervezett” régiót alkot a két domén között, melynek fontos szerepe lehet mind a konformációs változás közvetítésében a két domén között, mind pedig a domének tapasztalt együttműködésében a mikrokalorimetriás kísérleteimben.

5.6.2. A szubsztrátok stabilizáló hatásának szerkezeti alapjai a biner komplexekben 5.6.2.1. A 3-PG stabilizáló hatásának molekuláris mechanizmusa A szubsztrátok közül a 3-PG stabilizációs hatása mutatkozott a legnagyobbnak az enzim hődenaturációjával szemben (az 1,3-BPG hatását nem lehetett DSC módszerrel vizsgálni), mely eredmény korábbi spektroszkópiás és kémiai módosításos mérésekkel összhangban van. A 3-PG enzimkonformáció változtató hatásának atomi szintű leírásához meg kellett keresnem azokat a kölcsönhatásokat, melyek a 3-PG kötődésének hatására alakulnak ki. A rendelkezésre álló kristályszerkezetek között találhatunk biner komplexet a disznóizom PGK-val (19), valamint különböző fajokból származó terner komplexeket (21-23, 25, 26, 51). Ezen szerkezetek alapján a 3-PG enzimkonformáció-változtató hatásának útja levezethető. Valamennyi aminosav oldallánc, mely kölcsönhat a 3-PG-vel, az N-domén különböző szerkezeti elemeihez tartozik, ezek a βA, βB, βD és a βE lemez, valamint az 1-es és az 5-ös hélix. Tehát a 3-PG ezeket a szerkezeti elemeket összefogva, nagymértékben növelheti az N-domén stabilitását. 92

Kalorimetriás méréseink arra utalnak, hogy a 3-PG nemcsak az N-domént stabilizálja, hanem a teljes molekulát is. A 3-PG ezen konformációs hatását valószínűleg elősegítik a domének közötti régióban az előzőekben bemutatott kölcsönhatások, de ezeken kívül levezethetők az N-doméntől a C-domén felé terjedő hatások is (29.A ábra). A 3-PG foszfát-csoportja és az Arg 170 (5-ös hélix) között kialakuló kölcsönhatás hatására az 5-ös hélix elmozdul, mely maga után vonja a 165-ös Phe (28.D ábra) gyűrűjének mintegy 2 Å-nyi elmozdulását. Ez az elmozdulás a 192-es Glu-on (7-es hélix) keresztül eljut a 390-es His aminosavig (28.E ábra), mely már 3,5 Å-nyit mozdul el. Mivel ez utóbbi aminosav a βL-ben helyezkedik el, ezért ennek a β redőnek a konformációja is megváltozik. Ez a konformációs változás pedig közvetlenül kapcsolatban van a doménmozgásokkal, hiszen már korábban megállapították, hogy a fő csukló régió a βL-ben helyezkedik el (25). Ez egy lehetséges magyarázat a 3-PG hatására bekövetkező kb. 8o–os doménzáródásra (19). A βL új konformációját egy új H-kötés stabilizálja: a konzervatív Ser 392(OH) és a Gly 394(N) között kialakuló (29.A ábra). Ez utóbbi minden 3-PG-t kötő szerkezetre jellemző. Mindezen változások elvezetnek a Thr 393 (βL) peptid O atomjának mintegy 2 Å-nyi elmozdulásához, mely így már H-kötés távolságnyira kerül az Arg 38 guanidino-csoportjához. Az Arg 38 így végeredményben kapcsolatot teremt az N- és Cdomén között, miközben a 3-PG-vel is kölcsönhat. A 3-PG által a βL-ben okozott konformációváltozás továbbterjed a C-doménre is, a βL és a βK közötti H-kötés rendszeren keresztül (28.B ábra). Mindezek után a 13-as hélixben (szekvenciálisan a βK és a βL közötti) lévő Thr 375 oldallánca kölcsönhatásba kerül a 3-PG-t kötő komplexekben a Gly 337 peptid N-atomjával. A Val 339 peptid N-je és Thr 351(OH) (12-es hélix) közötti kölcsönhatás tovább erősíti a C-doménnel való kapcsolatot (29.A ábra). Fontos megjegyezni, hogy a Gly 337 és a Val 339 abban a βJ és 12-es hélix közötti loop-ban találhatóak, mely a nukleotid kötőhely közelében van. Az utóbbi kölcsönhatás a nukleotid szubsztrátot kötő biner komplexekben is megtalálható, nincs meg azonban a szubsztrátmentes enzimben. Tehát a 3-PG által okozott konformációváltozás útja levezethető, mely az N-doméntől a C-domén nukleotid kötőzsebéig vezet el, s ily módon magyarázható a 3-PG teljes enzimmolekulát stabilizáló hatása.

93

5.6.2.2. A MgADP és a MgATP eltérő stabilizációs hatása eltérő kötődési módjuknak köszönhető A két nukleotid eltérő stabilizációs hatása nagy valószínűséggel eltérő kötődési módjuknak köszönhető, ahogyan arra már korábbi kémiai módosításos (55), továbbá foszforeszcencia mérések (91) utaltak (ld. Irodalmi áttekintés 2.6.1. és 2.6.3. fejezet), és saját kinetikai és kötődési kísérleteim is bizonyítottak (ld. 5.1. fejezet). Két MgADP-t kötő kristályszerkezetet vizsgáltam: a B. stearothermophilus PGK*MgADP biner (20), illetve a T. brucei PGK*MgADP*3-PG terner komplexet (26). Bár ez a két komplex különböző fajú PGK-t tartalmaz, azonban a MgADP kötődési módja nagyon hasonló a két komplexben. A MgATP-vel csak egyetlen, mégpedig biner komplex állt rendelkezésemre (ld. 5.1.4. fejezet), de ATP analógokkal több szerkezet is található a PDB adatbankban (21, 23, 51, 56). Mint már az Irodalmi áttekintésben említettem, az adenin és a ribóz gyűrű helyzete és kölcsönhatásai a C-doménnel minden esetben nagyon hasonlóak. Azonban a nukleotid difoszfátok, illetve trifoszfátok foszfátláncának helyzete és kölcsönhatásai igen nagy eltérést mutatnak, nemcsak a kristályban, hanem oldatban is (ld. 5.1. fejezet). A MgATP kötődési módja foszfátláncának mozgékonyságát tételezi fel, míg a MgADP foszfátláncának jól meghatározott elhelyezkedése van a PGK szerkezetben. A MgADP és a MgATP kötődési módját a 29.B és C ábrán mutatom be. A nukleotid adenin része kötődésének hatására a βq lemezzel, a ribóz gyűrű kötődésével pedig a βJ és a 12-es hélix közötti loop régióval alakul ki kölcsönhatás. A nukleotidok α-foszfátja pedig valamennyi szerkezetben a 8-as hélixben lévő Lys 219/Bs201 oldalláncával hat kölcsön. Tehát a nukleotidok kötődésének közös vonása, hogy ezeket a másodlagos szerkezeti elemeket összefogja a C-doménben. Azonban vannak további kölcsönhatások, melyek különböznek a két nukleotid esetén. A MgATP-vel szemben, a MgADP mind az α, mind a β-foszfátot a Mg2+-on keresztül egy, a 13-as hélixben lévő Asp-hoz köti (Asp 374/Bs352, 29.B ábra). A β-foszfát közvetlen kölcsönhatásban áll ugyanebben a hélixben található Ser 375(Thr)/Bs353 (OH)val. Ezt a többszörös kölcsönhatást még tovább erősíti a 13-as hélix pozitív töltésű N-terminálisa, illetve a negatívan töltött foszfátok közötti H-kötések és elektrosztatikus kölcsönhatások. A fenti kölcsönhatások azt eredményezik, hogy a 13-as hélix a nukleotid kötődésének hatására rendezettebbé válik (20). Mindezeken kívül a MgADP β-foszfát egyik O atomja a βJ-ben található Asn 336/Bs316 oldalláncával is kölcsönhat (29.B ábra).

94

Ezen fent említett kölcsönhatások egyike sem jelentkezik a MgATP-vel való kölcsönhatás eredményeképp (29.C ábra), ezért a 13-as hélix ebben a biner komplexben nem teljesen rendezett.

29. ábra A domének közötti régió bemutatása a PGK biner komplexekben Az A és a C ábrán rendre a disznóizom PGK 3-PG biner (19), illetve MgATP biner (hivatkozást ld. Publikációs jegyzék), a B ábrán pedig a B. stearothermophilus PGK MgADP-vel alkotott biner (20) komplexe látható. Az oldalláncok számozása minden ábrán a saját fajnak megfelelő. A fontos másodlagos szerkezeti elemeket szalagdiagram jelzi, a 28. ábrának megfelelő színnel. A szubsztrátokat golyós modell mutatja. Lilával jelöltem a szubsztrátkötő oldalláncokon túl azokat, melyek között a szubsztrát kötődésének hatására új kölcsönhatások alakulnak ki. A kölcsönhatásokat szaggatott vonal jelzi, a C ábrán lévő nyilak pedig a B ábrának megfelelő oldalláncok között mutatják azt, hogy nincs kölcsönhatás.

A MgADP-vel kölcsönható aminosavak további, a szerkezetben távolabb lévő aminosavakkal is kialakítanak kölcsönhatást. Például a fentebb említett Asn 336/Bs316 oldallánca a nukleotid mellett a már szintén említett és a nukleotid kötésében résztvevő Lys 219/Bs201 oldalláncával is kölcsönhat. További kölcsönhatás alakul ki még az Asn 336/Bs316 (ND2) és a Gly 371/Bs349 peptid O-je között (29.B ábra). Ezen kölcsönhatások egyike sem található meg a MgATP biner komplexben (29.C ábra). 95

Összefoglalva tehát a MgADP nagyobb konformációváltozást okozó hatásáért valószínűleg a fentebb említett kölcsönhatások felelősek, melyek hatására nemcsak a 13-as hélix rendeződik, hanem a MgADP hatására a J jelű β-redő kölcsönhatásba kerül a 8-as hélix N-terminálisa mellett a βK és a 13-as hélix közötti loop-al is (Gly 371/Bs349). Még meg kell említenem, hogy egy új kölcsönhatás kialakul a MgADP hatására, ami a MgATP esetében nem jön létre: a Ser 392/Bs370 (OH) (βL) és a 398/Bs376 (OH) (14-es hélix, N-domén) között (29.B ábra). Tehát összefoglalva a fent említett kölcsönhatások alapján levezethető konformációs hatás magyarázza nemcsak a kalorimetriás mérésekből megállapított kooperatív, domének közötti kölcsönhatást, hanem a MgADP nagyobb konformációs hatását a MgATP-vel szemben.

5.6.3. A terner komplexek legnagyobb stabilitása a doménzáródásnak köszönhető A két zárt konformációjú terner komplex, a T. brucei (26) és a T. maritima (23) PGK szerkezetében a szubsztrátok (3-PG, MgADP, MgAMP-PNP) hatására kialakuló kölcsönhatások együtt találhatók meg és együttes hatásukra csak néhány új kölcsönhatás alakul ki. A domének közötti régiót tekintve a zárt szerkezetben kialakul két H-kötés, amelyek nem teljesen azonosak a két zárt szerkezetben. A T. brucei PGK esetén a Gly 372/Bs350/Tm353/Tb375 peptid N atomja és a Ser 392/Bs370/Tm373/Tb395 peptid O atomja, valamint az előbb említett Gly 372 N-atomja és a Gly 394/Bs372/Tm375/Tb397 peptid O atomja között (30.C ábra) alakul ki kötés. Az első kölcsönhatás a βL és a hozzá legközelebb eső β lemez, a βK között teremt szorosabb kapcsolatot, a második a 13-as hélix N-terminálisát köti össze a βL végével. Ennek eredményeképpen a βL redő alakja alapvetően megváltozik (5. ábra). A biner komplexekben kialakuló kölcsönhatások együttes hatására alakul ki ez a zárt szerkezetű terner komplexekben megfigyelhető új konformációja a βL-nek, mely felfogható úgy is, mintha a PGK szerkezetében a terner komplexben egy kettős molekuláris kapcsoló működne a βL-nél, mely a két szubsztrát együttes ellenőrzése alatt áll. Ha összevetjük a terner komplexben újonnan kialakuló kölcsönhatásokat a biner komplexekben lévőkkel (30. ábra), azt figyelhetjük meg, hogy ezek a H-kötések mintegy a H-kötés rendszer kiterjesztéseként kötik még szorosabbra a két domén közötti régióban a fő csukló régió körül csoportosuló szerkezeti elemeket, ezzel megszabva a βL zárt szerkezetre jellemző konformációját. 96

30. ábra A βL, fő csukló működése a szubsztrátok egyidejű hatására Az A ábrán a disznóizom PGK 3-PG biner (kék, (19)), a B ábrán a B. stearothermophilus PGK MgADP biner (zöld, (20)), a C ábrán a T. brucei PGK 3-PG*MgADP terner (piros, (26)), a D ábrán pedig a T. maritima PGK 3-PG*MgAMP-PNP terner (narancssárga, (23)) komplexeiből a βL redőt és környezetét mutatom be. A βL-t és a szekvenciálisan következő 14-es hélixet szalagdiagram jelöli, a βJ és a βK peptidgerinc atomjai is láthatók. A kötött szubsztrátokat, illetve szubsztrát-analógokat golyós modell jelöli. Az állandó H-kötéseket szaggatott vonallal, az egyes szubsztrátok hatására külön-külön kialakulókat pedig a szubsztrátoknak megfelelő színű nyíllal jelöltem (kék-3-PG, zöld-MgADP). A C és a D ábrán a doménzáródás hatására kialakuló új kölcsönhatásokat fekete nyilak jelzik.

A másik, majdnem teljesen zárt szerkezetű terner komplex, a T. maritima PGK*3-PG*MgAMP-PNP komplexében hasonló módon levezethető a két szubsztrát együttes hatására bekövetkező konformáció-változása a βL-nek, azonban ebben a komplexben egy kicsit más kölcsönhatásokon keresztül valósul meg. Már a 3-PG biner komplexben az Arg 38 és a Thr 393 közötti kölcsönhatás ebben a komplexben tovább erősödik,

mégpedig

azáltal,

hogy

az

Arg

38/Bs36/Tm36/Tb39

oldallánca

a

Thr 393/Bs371/Tm374/Tb396 hidroxil-csoportjával is kölcsönhatásba lép (30.D ábra). A záródás hatására alakul ki kölcsönhatás a Gly 372/Bs350/Tm353/Tb375 peptid N-je és a Ser 392/Bs370/Tm373/Tb395 peptid O-je között, mely a T. brucei PGK zárt szerkezetű komplexében is megtalálható. Ez a kölcsönhatás fogja össze a βL és a βK lemezeket. 97

Fontos különbség a két zárt szerkezet között, hogy a T. brucei PGK komplexében a Gly 372/Bs350/Tm353/Tb375 peptid N atomja és a Gly 394/Bs372/Tm375/Tb397 peptid O atomja közötti kölcsönhatás helyett a T. maritima PGK zárt szerkezetű komplexében a két, fentiekkel szekvenciálisan szomszédos Gly 373/Bs351/Tm354/Tb376 peptid N atomja és a Thr 393/Bs371/Tm374/Tb396 peptid O atomja között alakul ki H-kötés. Valószínűleg azért alakul ki alternatív módon ez utóbbi kölcsönhatás, mert míg a MgADP hatására

kialakul

a

Ser

392/Bs370/Tm373/Tb395

(OH)

(βL)

és

a

398/Bs376/Tm379/Tb401 (OH) közötti kapcsolat, addig ez az AMP-PNP-t kötő szerkezetekben nem található meg. Ésszerű azonban feltételezni, hogy a fentebb említett Gly 373/Bs351/Tm354/Tb376 peptid N atomja és a Thr 393/Bs371/Tm374/Tb396 peptid O atomja között kialakuló alternatív H-kötést a T. maritima PGK szerkezetében elősegíti az, hogy a szerkezetben kötött AMP-PNP mind a β-, mind a γ-foszfátjával kölcsönhatásban áll a Gly 373/Tm354 peptid N atomjával. Mindezek alapján a kettős molekuláris kapcsoló ebben a szerkezetben is megfigyelhető: a nukleotid hatására közvetlenül

kapcsolat

alakul

ki

a

Thr

393/Bs371/Tm374/Tb396

peptid

O atomjával (βL), pontosan azzal az aminosavval, melyen keresztül a 3-PG konformációs hatása is továbbítódik az Arg 38/Bs36/Tm36/Tb39-en keresztül. A két zárt szerkezetű enzim kölcsönhatásainak összehasonlítása tehát felhívja a figyelmet arra, hogy a βL-nél lévő csukló régió nagyon mozgékony és különböző konformációkat vesz fel a nyitott és a zárt konformációjú enzimben. Azonosítottak más csukló régiókat is a 7-es hélix N-, illetve C-terminálisánál (19, 117), azonban levezethető, hogy a fő csukló régió a βL-ben mozgatja közvetve a 7-es hélix csuklóit a domének közötti régió állandó kölcsönhatásain keresztül. A doménzáródás következményeként a fentieken kívül még néhány új kölcsönhatás alakul ki a domének újonnan keletkező érintkezési felszínén. Például ilyen a Asp 218/Bs200/Tm200/Tb222 és az Arg 65/Bs62/Tm62/Tb65 kialakuló ionos kölcsönhatás. Ezek a kötések még további stabilitást kölcsönöznek a zárt szerkezetnek. Ez a szerkezeti magyarázata annak a kalorimetriás kísérleteimben kapott eredménynek, hogy a mindkét szubsztrátot kötő terner komplexek hőstabilitása a legnagyobb (5.5.3. fejezet).

98

6. ÖSSZEFOGLALÁS Kísérleteim a katalízishez szükséges doménzáródás mechanizmusának felderítését szolgálták egy konkrét enzim, a 3-foszfoglicerát kináz (PGK) esetén. Eredményeim több tekintetben, különösen a szubsztrátok hatását illetően új információt jelentenek a doménzáródás komplex folyamatának megértésében. Főbb megállapításaim a következők: 1. A nukleotid szubsztrátokkal végzett kinetikai kettősgátlás, izotermális titráló

kalorimetriás (ITC) és differenciális pásztázó mikrokalorimetriás (DSC) vizsgálataim egyértelműen bizonyították, hogy a MgATP és a MgADP adenozin részükkel azonos, de foszfátláncukkal eltérő kölcsönhatásokat alakítanak ki az enzimmel. Ez mutatkozik meg például abban az ITC-s kísérleti eredményben, hogy míg a MgATP kötődése inkább entrópia-, addig a MgADP-jé inkább entalpia-vezérelt folyamat. Az eltérő kölcsönhatások a DSC-s kísérletek tanúsága szerint azt is eredményezik, hogy a MgADP az enzimet sokkal jobban védi a hődenaturációval szemben, mint a MgATP. Ezek a különbségek a nukleotidokkal komplexet képező Mg2+ speciális hatásának tulajdoníthatóak, amint azt mindkét típusú kalorimetriás kísérleteim is megmutatták. A Mg2+ mentes ATP és ADP hasonló mértékű védőhatást fejtenek ki a PGK szerkezetére és kötődési állandójuk értéke is hasonló. A fenti eredmények az oldatban lévő enzimre vonatkoznak, és összhangban vannak a munkámmal párhuzamosan meghatározott kristályszerkezeti adatokkal. Ez utóbbiak azt mutatták meg, hogy a MgATP foszfátlánca nincs olyan módon rögzítve az enzim oldalláncaihoz, mint a MgADP-jé. Ezt a kristályszerkezeti információt összevetve az ITC által szolgáltatott adatokkal levonhatjuk azt a következtetést, hogy a MgATP entrópiavezérelt kötődése foszfátlánca flexibilitásának tulajdonítható. Vannak azonban látszólagos különbségek is az oldatkísérletek és a meglévő kristályszerkezetek között. A MgATP analóg MgAMP-PCP és a MgAMP-PNP-vel meghatározott kristályszerkezetek a két analóg foszfátláncának látványosan eltérő kötődési módját mutatták. Azonban a kinetikai kettősgátlás és DSC kalorimetriás oldatkísérleteimben a kétféle analóg és a MgATP hasonló viselkedését tapasztaltam. Mindebből arra következtetek, hogy a kristályos és az oldott enzim közötti különbségek csak látszólagosak: míg oldatban a MgATP és analógjai foszfátláncának valódi flexibilitása nyilvánulhat meg, addig kristályban a több lehetséges konformációs állapot egyike vagy másika rögzül. 99

2. Modellezéssel meghatároztam az 1,3-biszfoszfo-glicerát (1,3-BPG) szubsztrát PGK-

hoz való kötődési módját. Az 1,3-BPG a 3-foszfo-glicerát (3-PG) ismert helyén kötődik. Ezen túlmenően a modellezés az 1,3-BPG-nek a foszfotranszferben közvetlenül részt vevő 1-es foszfátját több, egymástól kissé különböző orientációban és kölcsönhatásban mutatta meg. 3. A 3-PG és MgATP szubsztrátokkal működő PGK aktivitását szabályozó (aktiváló

vagy gátló) fiziológiás anionok (pirofoszfát, citrát, foszfát) enzimmel való kölcsönhatását kinetikai, ITC, DSC, illetve tiol-reaktivitás vizsgálatokkal jellemezve megállapítottam, hogy az anionok töltésével és méretével arányos az enzim működésére és szerkezetére kifejtett hatásuk. Kinetikai (kettősgátlás, aktiválás-gátlás) kísérleteimből az is következik, hogy a működő enzimben az anionoknak két különböző gátlóhelye van. Ezt az eredményt a kristályszerkezeti adatokkal összevetve megállapítható, hogy a két anionkötőhely egyike azonos a 3-PG szubsztrát foszfátjának (azaz az 1,3-BPG 3-as foszfátjának), a másik pedig az 1,3-BPG 1-es foszfátjának kötőhelyével. Próbálkozást tettem a kinetikai kísérletek alapján egyértelműen létező aktiváló anionkötőhely kimutatására is. Ez azonban nem vezetett eredményre, ami az aktiváló anion PGK-val való gyenge kölcsönhatásának tulajdonítható. Ezért modellezéssel határoztam meg az aktiváló anionok lehetséges kötőhelyét. Ily módon három anionkötőhelyet tudtam kimutatni az enzimmolekula felszínén, melyek szerepét mutációs kísérletekkel azonosítottam. Különböző típusú kinetikai kísérleteket végeztem az eddig kevéssé vizsgált 1,3-BPG és MgADP szubsztrátokból kiinduló enzimreakció tanulmányozására is. Megállapítottam, hogy ezt a reakciót sem az anionok, sem a szubsztrátok feleslege nem aktiválja. Feltételezhetően az 1,3-BPG már önmagában képes az aktiváló szerepet betölteni. 4. A fenti, szubsztrátokra, illetve anionokra vonatkozó megállapítások felvetették azt a

lehetőséget, hogy a MgATP foszfátláncának, illetve az 1,3-BPG 1-es foszfátjának flexibilitása, továbbá az aktiváló anionok kötődése fontos szerepet játszik az enzim aktív konformációjának kialakításában, azaz a doménzáródásban. A kristályszerkezeti adatok szerint a 8-as hélixbeli Lys 215, illetve az 1-es hélixbeli Arg 38 azok az oldalláncok, melyeknek szerepe van a MgATP foszfátjaival, az 1,3-BPG 1-es foszfátjával és/vagy az aktiváló anionokkal való kölcsönhatásban. Ezen oldalláncoknak nemcsak közvetlen, hanem közvetett szerepe is lehet a katalízisben a doménzáródás szabályozásán keresztül. 100

A feltételezés igazolására/cáfolására mindkét oldalláncot helyspecifikus mutagenezissel alaninra cseréltem. A K215A mutáns aktivitása (hasonlóan az R38A mutánséhoz) 1500-2000-ed részére csökkent a vad típusú enzimhez viszonyítva, azaz egyértelművé vált, hogy a Lys 215 az Arg 38 mellett fontos katalitikus oldallánc. A Km értékek alapján azt mondhatjuk, hogy míg az Arg 38-nak a 3-PG-vel, illetve 1,3-BPG-vel, addig a Lys 215-nek a MgATP-vel alkotott Michaelis komplex képzésben van nagyobb szerepe. Mindkét mutáns esetén szembetűnő, hogy a vad típusú enzimre jellemző tulajdonság, az anionok általi aktiválhatóság teljesen eltűnik. Ez a megfigyelés igazolta a modellezés eredményét, továbbá megmutatta, hogy a lehetséges anionkötőhelyek közül kettő biztosan aktiváló lehet, amelyek kialakításában a Lys 215 és az Arg 38 vesznek részt. A K215A mutánsnak a MgATP-vel, míg az R38A mutánsnak az 1,3-BPG-vel való kölcsönhatása (Kd) már nagymértékben gyengül a másik szubsztrát távollétében is, a nem működő biner komplexekben, azaz az enzim nyitott konformációjában. Ez az eredmény egyrészt alátámasztja azt a feltételezést, hogy a vad típusú enzim esetén a MgATP foszfátlánca a 8-as hélixben lévő Lys 215-tel kölcsönhatásba lépve flexibilitása által közelítheti ezt a hélixet a 13-as hélixhez és ezáltal segítheti elő mind a doménzáródást, mind az aktív centrum megfelelő geometriájának kialakulását. Másrészt az 1,3-BPG az 1-es hélixben lévő Arg 38-cal kölcsönhatva, 1-es foszfátjának mozgékonysága révén ezt a hélixet közelebb viheti a 13-as és a 14-es hélixekhez. Ezek a mozgások fontos szerepet tölthetnek be ezen négy hélix (14. ábra) relatív helyzetének kialakításában, amely az enzim aktív konformációjához szükséges. 5. A DSC mérésekkel meghatározott hőkapacitás görbék kooperatív jellege arra utal,

hogy a PGK két doménje között igen szoros együttműködés létezik. Méréseim azt is megmutatták, hogy a szubsztrátok terner komplexben tapasztalt szerkezetstabilizáló hatása nagyobb, mint az egyes biner komplexekben tapasztalt hatás. Ez a jelenség nem áll fenn a kémiailag módosított, inaktív (CM-) PGK esetén, amelynél korábban bizonyítást nyert, hogy a szubsztrátok együttes kötődésekor nem megy végbe a doménzáródás. Ebből az következik, hogy csak a mindkét szubsztrátot kötő, natív terner komplexben mehet végbe a domének összezáródása. 6. A különböző enzim-szubsztrát komplexek kristályszerkezeti adatait felhasználva

molekuláris grafikai módszerrel feltérképeztem az atomi kölcsönhatások szintjén az egyes 101

szubsztrátok lehetséges hozzájárulását a fehérjemolekula konformációs stabilitásához és a zárt konformáció kialakulásához. A szerkezeti adatok alapján érthetővé vált, hogy az egyes szubsztrátok külön-külön a biner komplexekben nagymértékben stabilizálják a megfelelő domént, amihez kötődnek, mivel kötődésükkel lényegében összetartják az egyes domének másodlagos szerkezeti elemeit. Ebből az analízisből az is kiderült, hogy a két szubsztrát együttes kötődésekor a terner komplexben csupán néhány további H-híd kötés alakul ki a PGK fő csukló régiójaként számontartott L jelű β-redőnél a két domén között. Ez kiterjesztése az egyes biner komplexekben már kezdeményeiben meglévő H-kötés rendszernek és lényegesen megváltoztatja a β-redő konformációját (5.A ábra). Ez a molekuláris folyamat eredményezi a két domén relatív poziciójának megváltozását, azaz a domének összezáródását. Ehhez a folyamathoz járulhatnak hozzá az átmenő foszfocsoportot tartalmazó szubsztrátok (MgATP ill. 1,3-BPG) azáltal, hogy mozgékony foszfátjaik segítségével, a fentiekben leírt módon közelítik egymáshoz az aktív centrumot kialakító négy különböző hélixet (14. ábra). Tehát szoros összefüggés van a szubsztrátok szerkezetstabilizáló hatása és a doménzáródás bekövetkezése között. A doménzáródás folyamatának legfontosabb mozzanata a két szubsztrát együttes hatására kialakuló speciális H-kötés rendszer, ami kettős molekuláris kapcsolóként fogható fel (30. ábra). Ez mozgatja a PGK fő csukló régióját, azaz alakítja ki az L jelű β-redő doménzáródáshoz szükséges optimális konformációját.

102

7. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉHEZ KAPCSOLÓDÓ KÖZLEMÉNYEK 1. Referált tudományos folyóiratban megjelent közlemények:

(az első szerző(k) neve aláhúzva) Beáta Flachner, Zoltán Kovári, Andrea Varga, Zoltán Gugolya, Ferenc Vonderviszt, Gábor Náray-Szabó and Mária Vas (2004) Role of phosphate chain mobility of MgATP in completing the 3-phosphoglycerate kinase catalytic site: binding, kinetic and crystallographic studies with ATP and MgATP Biochemistry 43, 3436-3449 Andrea Varga, Beáta Flachner, Éva Gráczer, Szabolcs Osváth, Andrea N. Szilágyi and Mária Vas (2005) Correlation between conformational stability of the ternary enzyme-substrate complex and domain closure of 3-phosphoglycerate kinase FEBS Journal 272, 1867-1885

Beáta Flachner, Andrea Varga, Judit Szabó, László Barna, István Hajdú, Gergely Gyimesi, Péter Závodszky and Mária Vas (2005) Substrate-assisted movement of the catalytic Lys 215 during domain closure: site-directed mutagenesis studies of human 3-phosphoglycerate kinase Biochemistry 44, 16853-16865 Andrea Varga, Beáta Flachner, Peter Konarev, Éva Gráczer, Judit Szabó, Dmitri Svergun, Péter Závodszky and Mária Vas (2006) Substrate-induced double sided H-bond network as a means of domain closure in 3-phosphoglycerate kinase FEBS Letters 580, 2698-2706

103

2. Konferencia kiadványok, konferencia összefoglalók:

(aláhúzva az előadás, illetve poszter előadója) Varga Andrea, Flachner Beáta, Kovári Zoltán, Náray-Szabó Gábor és Kazinczyné Vas Mária A fiziológiás anionok szabályozó hatása a foszfoglicerát kináz aktivitására és stabilitására: anionkötőhelyek az enzim aktív centrumában A Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztálya 8. munkaértekezlete Tihany, Magyarország 2003 (poszter előadás)

Flachner Beáta, Kovári Zoltán, Varga Andrea, Gugolya Zoltán, Vonderviszt Ferenc, Náray-Szabó Gábor és Kazinczyné Vas Mária A Mg2+ alapvető szerepe az ATP és ADP foszfoglicerát kinázzal való specifikus kölcsönhatásában A Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztálya 8. munkaértekezlete Tihany, Magyarország 2003 (poszter előadás) Andrea Varga, Beáta Flachner, Szabolcs Osváth, Andrea N. Szilágyi and Mária Vas Role of domain-domain interaction in folding and function of 3-phosphoglycerate kinase A Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztálya 9. munkaértekezlete Sopron, Magyarország 2004 (poszter előadás) Andrea Varga, Beáta Flachner, Szabolcs Osváth, Andrea N. Szilágyi and Mária Vas Role of domain-domain interaction in folding and function of 3-phosphoglycerate kinase 29th Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies (FEBS) Varsó, Lengyelország 2004 (poszter előadás), FEBS Journal 271, Supplement 1, 63-64 (Abstract)

Beáta Flachner, Andrea Varga, Judit Szabó, István Hajdú, Péter Závodszky and Mária Vas (2005) Site-directed mutagenesis studies revealed the functional role of the conserved Lys 215 in the domain closure dependent phospho-transfer catalysed by human 3-phosphoglycerate kinase (hPGK) 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference Budapest, Magyarország 2005 (poszter előadás), FEBS Journal 272, Supplement 1, 8 (Abstract) Andrea Varga, Beáta Flachner, Judit Szabó, László Barna, István Hajdú, Gergely Gyimesi, Péter Závodszky and Mária Vas Substrate-assisted movement of the catalytic Lys 215 during domain closure: site-directed mutagenesis studies of human 3-phosphoglycerate kinase (PGK) Straub napok, Szeged, 2005 (szóbeli előadás)

104

8. IRODALMI HIVATKOZÁSOK 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20.

Porter, R. R. (1973) Structural studies of immunoglobulins Science 180, 713-716. Wetlaufer, D. B. (1973) Nucleation, rapid folding, and globular intrachain regions in proteins Proc Natl Acad Sci U S A 70, 697-701. Coggins, J. R., and Hardie, D. G. (1986) The domain as the fundamental unit of protein structure and evolution, Elsevier, Amszterdam, New York, Oxford. Pickover, C. A., McKay, D. B., Engelman, D. M., and Steitz, T. A. (1979) Substrate binding closes the cleft between the domains of yeast phosphoglycerate kinase J. Biol. Chem. 254, 11323-11329. Sinev, M. A., Sineva, E. V., Ittah, V., and Haas, E. (1996) Domain closure in adenylate kinase Biochemistry 35, 6425-37. Forstner, M., Kriechbaum, M., Laggner, P., and Wallimann, T. (1998) Structural changes of creatine kinase upon substrate binding Biophys J 75, 1016-23. Hubbard, S. J., and Argos, P. (1996) A functional role for protein cavities in domain: domain motions J Mol Biol 261, 289-300. Gerstein, M., Schulz, G., and Chothia, C. (1993) Domain closure in adenylate kinase. Joints on either side of two helices close like neighboring fingers J Mol Biol 229, 494-501. Hayward, S. (1999) Structural principles governing domain motions in proteins Proteins 36, 425-35. Hayward, S. (2004) Identification of specific interactions that drive ligand-induced closure in five enzymes with classic domain movements J Mol Biol 339, 1001-21. Gerstein, M., Lesk, A. M., and Chothia, C. (1994) Structural mechanisms for domain movements in proteins Biochemistry 32, 6739-6749. Gerstein, M., and Krebs, W. (1998) A database of macromolecule motions Nucleic Acid Res. 26, 4280-4290. Echols, N., Milburn, D., and Gerstein, M. (2003) MolMovDB: analysis and visualization of conformational change and structural flexibility Nucleic Acids Res 31, 478-82. Gerstein, M., and Echols, N. (2004) Exploring the range of protein flexibility, from a structural proteomics perspective Curr Opin Chem Biol 8, 14-9. Flores, S., Echols, N., Milburn, D., Hespenheide, B., Keating, K., Lu, J., Wells, S., Yu, E. Z., Thorpe, M., and Gerstein, M. (2006) The Database of Macromolecular Motions: new features added at the decade mark Nucleic Acids Res 34, D296-301. Banks, R. D., Blake, C. C. F., Evans, P. R., Haser, R., Rice, D. W., Hardy, G. W., Merrett, M., and Phillips, A. W. (1979) Sequence, structure and activity of phosphoglycerate kinase: a possible hinge-bending enzyme Nature 279, 773-777. Mori, N., Singer-Sam, J., and Riggs, A. D. (1986) Evolutionary conservation of the substrate binding cleft of 3-phosphoglycerate kinases FEBS Lett. 204, 313-317. Mas, M. T., Chen, C. Y., Hitzeman, R. A., and Riggs, A. D. (1986) Active humanyeast chimeric phosphoglycerate kinases engineered by domain interchange Science 233, 788-90. Harlos, K., Vas, M., and Blake, C. C. F. (1992) Crystal structure of the binary complex of pig muscle phosphoglycerate kinase and its substrate 3-phospho-Dglycerate Proteins 12, 133-144. Davies, G. J., Gamblin, S. J., Littlechild, J. A., Dauter, Z., Wilson, K. S., and Watson, H. C. (1994) Structure of the ADP complex of the 3-phosphoglycerate kinase from Bacillus stearothermophilus at 1.65 A Acta Crystallogr. D50, 202209.

105

21.

22. 23.

24. 25.

26. 27. 28.

29. 30. 31. 32. 33. 34.

35.

May, A., Vas, M., Harlos, K., and Blake, C. C. F. (1996) 2.0 A resolution structure of a ternary complex of pig muscle phosphoglycerate kinase containing 3phospho-D-glycerate and the nucleotide Mn adenylylimidodiphosphate Proteins 24, 292-303. Bernstein, B. E., Michels, P. A. M., and Hol, W. G. J. (1997) Synergistic effects of substrate-induced conformational changes in phosphoglycerate kinase activation Nature 385, 275-278. Auerbach, G., Huber, R., Grättinger, M., Zaiss, K., Schurig, H., Jaenicke, R., and Jacob, U. (1997) Closed structure of phosphoglycerate kinase from Thermotoga maritima reveals the catalytic mechanism and determinants of thermal stability Structure 5, 1475-1483. Sinev, M. A., Razgulyaev, O. I., Vas, M., Timchenko, A. A., and Ptitsyn, O. B. (1989) Correlation between enzyme activity and hinge-bending domain displacement in 3-phosphoglycerate kinase Eur. J. Biochem. 180, 61-66. Szilágyi, A. N., Ghosh, M., Garman, E., and Vas, M. (2001) A 1.8 A resolution structure of pig muscle 3-phosphoglycerate kinase with bound MgADP and 3phosphoglycerate in open conformation: new insight into the role of the nucleotide in domain closure J Mol Biol 306, 499-511. Bernstein, B. E., and Hol, W. G. (1998) Crystal structures of substrates and products bound to the phosphoglycerate kinase active site reveal the catalytic mechanism Biochemistry 37, 4429-4436. Betton, J. M., Desmadril, M., and Yon, J. M. (1989) Detection of intermediates in the unfolding transition of phosphoglycerate kinase using limited proteolysis. Biochemistry 28, 5421-5428. Sherman, M. A., Beechem, J. M., and Mas, M. T. (1995) Probing intradomain and interdomain conformational changes during equilibrium unfolding of phosphoglycerate kinase: fluorescence and circular dichroism study of tryptophan mutants Biochemistry 34, 13934-13942. Nageswara-Rao, B. D., Cohn, M., and Scopes, R. K. (1978) 31P NMR study of bound reactants and products of yeast 3-phosphoglycerate kinase at equilibrium and the effect of sulfate ion J. Biol. Chem. 253, 8056-8060. Segel, G. B., Feig, S. A., Glader, B. E., Muller, A., Dutcher, P., and Nathan, D. G. (1975) Energy metabolism in human erythrocytes: the role of phosphoglycerate kinase in cation transport Blood 46, 271-8. Xu, K. Y., Zweier, J. L., and Becker, L. C. (1995) Functional coupling between glycolysis and sarcoplasmic reticulum Ca2+ transport Circ Res 77, 88-97. Vishwanatha, J. K., Jindal, H. K., and Davis, R. G. (1992) The role of primer recognition proteins in DNA replication: association with nuclear matrix in HeLa cells J Cell Sci 101, 25-34. Martinov, M. V., Plotnikov, A. G., Vitvitsky, V. M., and Ataullakhanov, F. I. (2000) Deficiencies of glycolytic enzymes as a possible cause of hemolytic anemia Biochim Biophys Acta 1474, 75-87. Noel, N., Flanagan, J., Kalko, S. G., Bajo, M. J., Manu Mdel, M., Fuster, J. L., Beutler, E., and Corrons, J. L. (2006) Two new phosphoglycerate kinase mutations associated with chronic haemolytic anaemia and neurological dysfunction in two patients from Spain Br J Haematol 132, 523-9. Lay, A. J., Jiang, X. M., Kisker, O., Flynn, E., Underwood, A., Condron, R., and Hogg, P. J. (2000) Phosphoglycerate kinase acts in tumour angiogenesis as a disulphide reductase Nature 408, 869-73.

106

36. 37. 38.

39. 40. 41. 42.

43. 44. 45.

46. 47.

48. 49.

50. 51.

Lay, A. J., Jiang, X. M., Daly, E., Sun, L., and Hogg, P. J. (2002) Plasmin reduction by phosphoglycerate kinase is a thiol-independent process J Biol Chem 277, 9062-8. Hogg, P. J. (2003) Disulfide bonds as switches for protein function Trends Biochem Sci 28, 210-4. Krishnan, P., Gullen, E. A., Lam, W., Dutschman, G. E., Grill, S. P., and Cheng, Y. C. (2003) Novel role of 3-phosphoglycerate kinase, a glycolytic enzyme, in the activation of L-nucleoside analogs, a new class of anticancer and antiviral agents J Biol Chem 278, 36726-32. Gallois-Montbrun, S., Faraj, A., Seclaman, E., Sommadossi, J. P., Deville-Bonne, D., and Veron, M. (2004) Broad specificity of human phosphoglycerate kinase for antiviral nucleoside analogs Biochem Pharmacol 68, 1749-56. Krietsch, W. K., and Bücher, T. (1970) 3-phosphoglycerate kinase from rabbit sceletal muscle and yeast Eur. J. Biochem. 17, 568-575. Tanswell, P., Westhead, E. W., and Williams, R. J. P. (1976) Nuclear-magneticresonance study of the active-site structure of yeast phosphoglycerate kinase Eur. J. Biochem. 63, 249-262. Fairbrother, W. J., Walker, P. A., Minard, P., Littlechild, J. A., Watson, H., and Williams, R. J. P. (1989) NMR analysis of site-specific mutants of yeast phosphoglycerate kinase. An investigation of the triose-binding site Eur. J. Biochem. 183, 57-67. Blake, C. C. F., and Rice, D. W. (1981) Phosphoglycerate kinase Phil. Trans. Roy. Soc. Lond. A 293, 93-104. Fairbrother, W. J., Hall, L., Littlechild, J. A., Walker, P. A., Watson, H. C., and Williams, R. J. (1989) Site-directed mutagenesis of histidine 62 in the 'basic patch' region of yeast phosphoglycerate kinase FEBS Lett. 258, 247-250. Sherman, M. A., Szpikowska, B. K., Dean, S. A., Mathiowetz, A. M., McQueen, N. L., and Mas, M. T. (1990) Probing the role of arginines and histidines in the catalytic function and activation of yeast 3-phosphoglycerate kinase by sitedirected mutagenesis J. Biol. Chem. 265, 10659-10665. Walker, P. A., Joao, H. C., Littlechild, J. A., Williams, R. J., and Watson, H. C. (1992) Characterisation of yeast phosphoglycerate kinase modified by mutagenesis at residue 21 Eur J Biochem 207, 29-37. Sherman, M. A., Fairbrother, W. J., and Mas, M. T. (1992) Characterization of the structure and properties of the His62-->Ala and Arg 38-->Ala mutants of yeast phosphoglycerate kinase: an investigation of the catalytic and activatory sites by site-directed mutagenesis and NMR Protein Sci. 1, 752-760. Walker, P. A., Littlechild, J. A., Hall, L., and Watson, H. C. (1989) Site-directed mutagenesis of yeast phosphoglycerate kinase. The 'basic-patch' residue arginine 168 Eur. J. Biochem. 183, 49-55. Sherman, M. A., Dean, S. A., Mathiowetz, A. M., and Mas, M. T. (1991) Sitedirected mutations of arginine 65 at the periphery of the active site cleft of yeast 3phosphoglycerate kinase enhance the catalytic activity and eliminate aniondependent activation Protein Eng. 4, 935-940. Barber, M. D., Gamblin, S. J., Watson, H., and Littlechild, J. A. (1993) Sitedirected mutagenesis of yeast phosphoglycerate kinase. Arginines 65, 121 and 168 FEBS Lett. 320, 193-197. Kovári, Z., Flachner, B., Náray-Szabó, G., and Vas, M. (2002) Crystallographic and thiol-reactivity studies on the complex of pig muscle phosphoglycerate kinase

107

52. 53. 54. 55.

56. 57. 58.

59. 60. 61. 62. 63. 64.

65. 66. 67.

with ATP analogues: correlation between nucleotide binding mode and helix flexibility Biochemistry 41, 8796-806. Szilágyi, A. N., and Vas, M. (1998) Anion activation of 3-phosphoglycerate kinase requires domain closure Biochemistry 37, 8551-8563. Vas, M., Lakatos, S., Hajdu, J., and Friedrich, P. (1981) Kinetic behaviour and oligomeric state of 3-phosphoglyceroyl-D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Biochimie 63, 89-96. Jakeman, D. L., Ivory, A. J., Blackburn, G. M., and Williamson, M. P. (2003) Orientation of 1,3-bisphosphoglycerate analogs bound to phosphoglycerate kinase J Biol Chem 278, 10957-62. Tompa, P., Hong, P. T., and Vas, M. (1986) The phosphate group of 3phosphoglycerate accounts for conformational changes occurring on binding to 3phosphoglycerate kinase. Enzyme inhibition and thiol reactivity studies. Eur. J. Biochem. 154, 643-649. McPhillips, T. M., Hsu, B. T., Sherman, M. A., Mas, M. T., and Rees, D. C. (1996) Structure of the R65Q mutant of yeast 3-phosphoglycerate kinase complexed with Mg-AMP-PNP and 3-phospho-D-glycerate Biochemistry 35, 4118-4127. Molnár, M., and Vas, M. (1993) Mg2+ affects the binding of ADP but not ATP to 3-phosphoglycerate kinase. Correlation between equilibrium dialysis binding and enzyme kinetic data Biochem. J. 293, 595-599. Merli, A., Szilágyi, A. N., Flachner, B., Rossi, G. L., and Vas, M. (2002) Nucleotide Binding to Pig Muscle 3-Phosphoglycerate Kinase in the Crystal and in Solution: Relationship between Substrate Antagonism and Interdomain Communication Biochemistry 41, 111-119. Larsson-Raznikiewicz, M. (1973) Graphical analyses on binding of ligands to a two-sited system. Theoretical treatments exemplified on yeast phosphoglycerate kinase Arch. Biochem. Biophys. 158, 754-762. Tanswell, P., Westhead, E. W., and Williams, R. J. P. (1974) Inhibition of yeast phosphoglycerate kinase by lanthanide-ATP complexes. FEBS Lett. 48, 60-63. Scopes, R. K. (1978) Binding of substrates and other anions to yeast phosphoglycerate kinase. Eur. J. Biochem. 91, 119-129. Wiksell, E., and Larsson-Raznikiewicz, M. (1987) Affinity labeling of phosphoglycerate kinase by 5'-[p-(fluorosulfonyl)benzoyl]-1,N6-ethenoadenosine J. Biol. Chem. 262, 14472-14478. Ray, B. D., and Nageswara-Rao, B. D. (1988) 31P NMR studies of enzyme-bound substrate complexes of yeast 3-phosphoglycerate kinase. 1. Effects of sulfate and pH. Mg(II) affinity at the two ATP sites Biochemistry 27, 5574-5578. Ray, B. D., Moore, J. M., and Nageswara-Rao, B. D. (1990) 31P NMR studies of enzyme-bound substrate complexes of yeast 3-phosphoglycerate kinase: III. Two ADP binding sites and their Mg(II) affinity; effects of vanadate and arsenate on enzymic complexes with ADP and 3-P-glycerate J. Inorg. Biochem. 40, 47-57. Fairbrother, W. J., Graham, H. C., and Williams, R. J. P. (1990) The roles of ATP4and Mg2+ in control steps of phosphoglycerate kinase Eur. J. Biochem. 190, 407414. Graham, H. C., and Williams, R. J. P. (1991) The roles of ADP2- and Mg2+ in control steps of phosphoglycerate kinase Eur. J. Biochem. 197, 81-91. Wiksell, E., and Larsson-Raznikiewicz, M. (1982) Substrate binding to phosphoglycerate kinase monitored by 1-anilino-8-naphthalenesulfonate J. Biol. Chem. 257, 12672-12677.

108

68. 69. 70. 71. 72.

73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82. 83. 84.

Vas, M., and Batke, J. (1984) Adenine nucleotides affect the binding of 3phosphoglycerate to pig muscle 3-phosphoglycerate kinase. Eur. J. Biochem. 139, 115-123. Vas, M., Merli, A., and Rossi, G. L. (1994) Antagonistic binding of substrates to 3phosphoglycerate kinase monitored by the fluorescent analogue 2'(3')-O-(2,4,6trinitrophenyl)adenosine 5'-triphosphate. Biochem. J. 301, 885-891. Yount, R. G., D. Babcock, Ballantyne, W., and Ojala, D. (1971) Adenylyl Imidodiphosphate, an Adenosine Triphosphate Analog Conatining a P-N-P Linkage Biochemistry 10, 2484-2489. Lester, L. M., Rusch, L. A., Robinson, G. J., and Speckhard, D. C. (1998) Mapping the active sites of 3-phosphoglycerate kinase and glycerol kinase with monoammine chromium(III) ATP Biochemistry 37, 5349-55. Raghunathan, V., Chau, M. H., Ray, B. D., and Rao, B. D. (1999) Structural characterization of manganese(II)-nucleotide complexes bound to yeast 3phosphoglycerate kinase: 13C relaxation measurements using [U-13C]ATP and [U-13C]ADP Biochemistry 38, 15597-605. Larsson-Raznikiewicz, M. (1964) Kinetic studies on the reaction catalysed by phosphoglycerate kinase: I. The effect of Mg2+ and adenosine-5'-triphosphate Biochim. Biophys. Acta 85, 60-68. Cullis, P. M. (1987) Acyl group transfer - phosphoryl transfer in Enzyme mechanism (Page, M. I., and Williams, A., Eds.) pp 206, The Royal Society of Chemistry, London. Pappu, K. M., Gregory, J. D., and Serpersu, E. H. (1994) Substrate activity of Rh(III)ATP with phosphoglycerate kinase and the role of the metal ion in catalysis Arch Biochem Biophys 311, 503-8. Serpersu, E. H., Summitt, L. L., and Gregory, J. D. (1992) Inactivation of yeast phosphoglycerate kinase by Cr-ATP complexes and its implications on the conformation of the enzyme active site. J Inorg Biochem. 48, 203-215. Pappu, K. M., Kunnumal, B., and Serpersu, E. H. (1997) A new metal-binding site for yeast phosphoglycerate kinase as determined by the use of a metal-ATP analog Biophys J 72, 928-935. Ritco-Vonsovici, M., Mouratou, B., Minard, P., Desmadril, M., Yon, J. M., Andrieux, M., Leroy, E., and Guittet, E. (1995) Role of the C-terminal helix in the folding and stability of yeast phosphoglycerate kinase Biochemistry 34, 833-841. Mas, M. T., and Resplandor, Z. E. (1988) Structure-function relationships in 3phosphoglycerate kinase: role of the carboxy-terminal peptide Proteins 4, 56-62. Chapman, B. E., O'Sullivan, W. J., Scopes, R. K., and Reed, G. H. (1977) Magnetic resonance studies on manganese-nucleotide complexes of phosphoglycerate kinase Biochemistry 16, 1005-1010. Wrobel, J. A., and Stinson, R. A. (1981) The effects of anions, substrates, metal ions and sulfhydryl reagents on the proteolytic susceptibility of yeast phosphoglycerate kinase Biochim Biophys Acta 662, 236-45. Jiang, S. X., and Vas, M. (1988) Limited proteolysis of 3-phosphoglycerate kinase without loss of enzymic activity FEBS Lett. 231, 151-154. Hjelmgren, T., Strid, L., and Arvidsson, L. (1976) An essential arginyl residue in phosphoglycerate kinase from yeast FEBS Lett 68, 137-40. Desmadril, M., Minard, P., Ballery, N., Gaillard-Miran, S., Hall, L., and Yon, J. M. (1991) Conformational changes in yeast phosphoglycerate kinase upon ligand binding: fluorescence of a linked probe and chemical reactivity of genetically introduced cysteinyl residues. Proteins 10, 315-324.

109

85. 86.

87. 88. 89. 90. 91. 92.

93. 94.

95. 96. 97. 98. 99.

100.

Cserpán, I., and Vas, M. (1983) Effects of substrates on the heat stability and on the reactivities of thiol groups of 3-phosphoglycerate kinase Eur. J. Biochem. 131, 157-162. Desvages, G., Roustan, C., Fattoum, A., and Pradel, L. A. (1980) Structural studies on yeast 3-phosphoglycerate kinase. Identification by immuno-affinity chromatography of one glutamyl residue essential for yeast 3-phosphoglycerate kinase activity. Its location in the primary structure Eur J Biochem 105, 259-66. Wilson, H. R., Williams, R. J. P., Littlechild, J. A., and Watson, H. C. (1988) NMR analysis of the interdomain region of yeast phosphoglycerate kinase Eur. J. Biochem. 170, 529-538. Fairbrother, W. J., Bowen, D., Hall, L., and Williams, R. J. (1989) One- and twodimensional NMR studies of yeast phosphoglycerate kinase. Eur. J. Biochem. 184, 617-625. Scheffler, J. E., and Cohn, M. (1986) Photochemically induced dynamic nuclear polarization NMR study of yeast and horse muscle phosphoglycerate kinase Biochemistry 25, 3788-96. Wasylewski, Z., and Eftink, M. R. (1987) Frequency domain fluorescence studies of yeast phosphoglycerate kinase and its ternary complex Eur J Biochem 167, 5138. Cioni, P., Puntoni, A., and Strambini, G. B. (1993) Tryptophan phosphorescence as a monitor of the solution structure of phosphoglycerate kinase from yeast Biophys Chem 46, 47-55. Mouawad, L., Desmadril, M., Perahia, D., Yon, J. M., and Brochon, J. C. (1990) The effects of ligands on the conformation of phosphoglycerate kinase: fluorescence anisotropy decay and theoretical interpretation Biopolymers 30, 11511160. Cheung, C. W., and Mas, M. T. (1996) Substrate-induced conformational changes in yeast 3-phosphoglycerate kinase monitored by fluorescence of single tryptophan probes Protein Sci. 5, 1144-1149. Haran, G., Haas, E., Szpikowska, B. K., and Mas, M. T. (1992) Domain motions in phosphoglycerate kinase: determination of interdomain distance distributions by site-specific labeling and time-resolved fluorescence energy transfer Proc Natl Acad Sci U S A 89, 11764-8. Dryden, D. T., Varley, P. G., and Pain, R. H. (1992) A study of the hinge-bending mechanism of yeast 3-phosphoglycerate kinase. Eur. J. Biochem. 208, 115-123. Adams, B., and H., P. R. (1986) The effect of substrates on the inter-domain interactions of the hinge-bending enzyme 3-phosphoglycerate kinase. FEBS Lett 196, 361-364. Scopes, R. K., and Algar, E. (1979) Yeast phosphoglycerate kinase -- evidence from affinity elution studies for conformational changes on binding of substrates FEBS Lett 106, 239-42. Hu, C. Q., and Sturtevant, J. M. (1987) Thermodynamic study of yeast phosphoglycerate kinase Biochemistry 26, 178-82. Bentahir, M., Feller, G., Aittaleb, M., Lamotte-Brasseur, J., Himri, T., Chessa, J. P., and Gerday, C. (2000) Structural, kinetic, and calorimetric characterization of the cold-active phosphoglycerate kinase from the antarctic Pseudomonas sp. TACII18 J Biol Chem 275, 11147-53. Kovári, Z., and Vas, M. (2004) Protein conformer selection by sequencedependent packing contacts in crystals of 3-phosphoglycerate kinase Proteins 55, 198-209.

110

101. 102. 103. 104. 105. 106. 107. 108.

109. 110.

111.

112. 113.

114. 115. 116.

Roustan, C., Fattoum, A., Jeanneau, R., and Pradel, L. A. (1980) Yeast 3phosphoglycerate kinase: sulfate and substrate binding, their effect on the conformational state of the enzyme Biochemistry 19, 5168-75. Ptitsyn, O. B., Pavlov, M. Y., Sinev, M. A., and Timchenko, A. A. (1986) Study of domain displacements in proteins by diffuse x-ray scattering in Multidomain proteins (Patthy, L., and Friedrich, P., Eds.) pp 9-25, Akadémiai Kiadó, Budapest. Henderson, S. J., Serpersu, E. H., Gerhardt, B. S., and Bunick, G. J. (1994) Conformational changes in yeast phosphoglycerate kinase upon substrate binding Biophys Chem 53, 95-104. Scopes, R. K. (1978) The steady-state kinetics of yeast phosphoglycerate kinase. Anomalous kinetic plots and the effects of salts on activity Eur. J. Biochem. 85, 503-516. Lavoinne, A., Marchand, J. C., Chedeville, A., and Matray, F. (1983) Kinetic studies of the reaction mechanism of rat liver phosphoglycerate kinase in the direction of ADP utilization Biochimie 65, 211-20. Webb, M. R., and Trentham, D. R. (1980) Analysis of chiral inorganic (160, 170, 180) thiophosphate and the stereochemistry of the 3-phosphoglycerate kinase reaction J. Biol. Chem. 255, 1775-1779. Mildvan, A. S. (1981) Conformations and arrangement of substrates at active sites of ATP-utilizing enzymes Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 293, 65-74. Schmidt, P. P., Travers, F., and Barman, T. (1995) Transient and equilibrium kinetic studies on yeast 3-phosphoglycerate kinase. Evidence that an intermediate containing 1,3-bisphosphoglycerate accumulates in the steady state Biochemistry 34, 824-832. Geerlof, A., Schmidt, P. P., Travers, F., and Barman, T. (1997) Cryoenzymic studies on yeast 3-phosphoglycerate kinase. Attempt to obtain the kinetics of the hinge-bending motion Biochemistry 36, 5538-5545. Geerlof, A., Travers, F., Barman, T., and Lionne, C. (2005) Perturbation of Yeast 3-Phosphoglycerate Kinase Reaction Mixtures with ADP: Transient Kinetics of Formation of ATP from Bound 1,3-Bisphosphoglycerate Biochemistry 44, 1494855. Larsson-Raznikiewicz, M. (1967) Kinetic studies on the reaction catalyzed by phosphoglycerate kinase. II. The kinetic relationships between 3phosphoglycerate, MgATP2-and activating metal ion Biochim. Biophys. Acta 132, 33-40. Mas, M. T., Resplandor, Z. E., and Riggs, A. D. (1987) Site-directed mutagenesis of glutamate-190 in the hinge region of yeast 3-phosphoglycerate kinase: implications for the mechanism of domain movement Biochemistry 26, 5369-5377. Watson, H. C., Walker, N. P. C., Shaw, P. J., Bryant, T. N., Wendell, P. L., Fothergill, L., Perkin, R. E., Conroy, S. C., Dobson, M. J., Tuite, M. F., Kingsman, A. J., and Kingsman, S. M. (1982) Sequence and structure of yeast phosphoglycerate kinase EMBO J. 1, 1635-1640. Mas, M. T., Bailey, J. M., and Resplandor, Z. E. (1988) Site-directed mutagenesis of histidine-388 in the hinge region of yeast 3-phosphoglycerate kinase: effects on catalytic activity and activation by sulfate Biochemistry 27, 1168-1172. Raznikiewicz, M. L., and Schierbeck, B. (1977) Activation and inhibition of the phosphoglycerate kinase reaction by ATP Biochim Biophys Acta 481, 283-7. Khamis, M. M., and Larsson-Raznikiewicz, M. (1981) Activation and inhibition of phosphoglycerate kinase by sulphate ion Biochim. Biophys. Acta 657, 190-194.

111

117.

118. 119.

120. 121. 122. 123. 124.

125. 126.

127.

128.

129. 130.

Bernstein, B. E., Williams, D. M., Bressi, J. C., Kuhn, P., Gelb, M. H., Blackburn, G. M., and Hol, W. G. J. (1998) A Bisubstrate Analog Induces Unexpected Conformational Changes in Phosphoglycerate Kinase from Trypanosoma brucei J. Mol. Biol. 279, 1137-1148. Blake, C. C. F., Rice, D. W., and Cohen, F. E. (1986) A "helix-scissors" mechanism for the hinge-bending conformational change in phosphoglycerate kinase Int J Pept Protein Res 27, 443-448. Minard, P., Hall, L., Betton, J. M., Missiakas, D., and Yon, J. M. (1989) Efficient expression and characterization of isolated structural domains of yeast phosphoglycerate kinase generated by site-directed mutagenesis. Protein Eng. 3, 55-60. Sherman, M. A., Chen, Y., and Mas, M. T. (1997) An engineered amino-terminal domain of yeast phosphoglycerate kinase with native-like structure Protein Sci. 6, 882-891. Pecorari, F., Minard, P., Desmadril, M., and Yon, J. M. (1993) Structure and functional complementation of engineered fragments from yeast phosphoglycerate kinase Protein Eng. 6, 313-325. Griko, Y. V., Venyaminov, S. Y., and Privalov, P. L. (1989) Heat and cold denaturation of phosphoglycerate kinase (interaction of domains). FEBS Lett. 244, 276-278. Brandts, J. F., Hu, C. Q., Lin, L. N., and Mas, M. T. (1989) A simple model for proteins with interacting domains. Applications to scanning calorimetry data Biochemistry 28, 8588-96. Freire, E., Murphy, K. P., Sanchez-Ruiz, J. M., Galisteo, M. L., and Privalov, P. L. (1992) The molecular basis of cooperativity in protein folding. Thermodynamic dissection of interdomain interactions in phosphoglycerate kinase Biochemistry 31, 250-256. Gast, K., Damaschun, G., Desmadril, M., Minard, P., Müller-Frohne, M., Pfeil, W., and Zirwer, D. (1995) Cold denaturation of yeast phosphoglycerate kinase: which domain is more stable? FEBS Lett. 358, 247-250. Zaiss, K., and Jaenicke, R. (1999) Thermodynamic study of phosphoglycerate kinase from Thermotoga maritima and its isolated domains: reversible thermal unfolding monitored by differential scanning calorimetry and circular dichroism spectroscopy Biochemistry 38, 4633-9. Beechem, J. M., Sherman, M. A., and Mas, M. T. (1995) Sequential domain unfolding in phosphoglycerate kinase: fluorescence intensity and anisotropy stopped-flow kinetics of several tryptophan mutants Biochemistry 34, 1394313948. Lillo, M. P., Szpikowska, B. K., Mas, M. T., Sutin, J. D., and Beechem, J. M. (1997) Real-time measurement of multiple intramolecular distances during protein folding reactions: A multisite stopped-flow fluorescence energy-transfer study of yeast phosphoglycerate kinase Biochemistry 36, 11273-11281. Szilágyi, A. N., and Vas, M. (1998) Sequential domain refolding of pig muscle 3phosphoglycerate kinase: kinetic analysis of reactivation Fold Des 3, 565-75. Szilágyi, A. N., Kotova, N. V., Semisotnov, G. V., and Vas, M. (2001) Incomplete refolding of a fragment of the N-terminal domain of pig muscle 3phosphoglycerate kinase that lacks a subdomain: Comparison with refolding of the complementary C-terminal fragment Eur J Biochem 268, 1851-60.

112

131. 132. 133. 134. 135. 136. 137. 138.

139. 140.

141. 142. 143. 144. 145. 146. 147. 148.

Parker, M. J., Spencer, J., Jackson, G. S., Burston, S. G., Hosszu, L. L. P., Craven, C. J., Waltho, P., and Clarke, A. R. (1996) Domain behaviour during refolding of a thermostable phosphoglycerate kinase Biochemistry 35, 15740-15752. Receveur, V., Garcia, P., Durand, D., Vachette, P., and Desmadril, M. (2000) Role of hydrophobic interactions in yeast phosphoglycerate kinase stability Proteins 38, 226-38. Johnson, C. M., Cooper, A., and Brown, A. J. (1991) A comparison of the reactivity and stability of wild type and His388Gln mutant phosphoglycerate kinase from yeast Eur J Biochem 202, 1157-64. Dékány, K., and Vas, M. (1984) Inactivation of pig muscle 3-phosphoglycerate kinase by thiol modification depends on reagent size Eur. J. Biochem. 139, 125130. Osváth, S., Sabelko, J. J., and Gruebele, M. (2003) Tuning the heterogeneous early folding dynamics of phosphoglycerate kinase J Mol Biol 333, 187-99. Elődi, P., and Szörényi, E. (1956) Crystallisation and comparative studies of Dglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from muscle of various mammals Acta Physiol. Acad. Sci. Hung. 9, 339-350. Burton, K. (1959) Formation constants for complexes of adenosine di- or triphosphate with magnesium or calcium ions Biochem. J. 71, 388-395. Gupta, R. K., Gupta, P., Yashok, W. P., and Rose, Z. B. (1983) Measurement of the dissociation constant of MgATP at physiological nucleotide levels by a combination of 31P NMR and optical absorbance spectroscopy Biochem. Biophys. Res. Comm. 117, 210-216. Miller, C., Frey, C. M., and Stuehr, J. E. (1972) Interactions of divalent metal ions with inorganic and nucleotide phosphates. I. Thermodynamics. J. Am. Chem. Soc. 94, 8898-8904. Zhang, W., Truttmann, A. C., Luthi, D., and McGuigan, J. A. (1997) Apparent Mg2+-adenosine 5-triphosphate dissociation constant measured with Mg2+ macroelectrodes under conditions pertinent to 31P NMR ionized magnesium determinations Anal Biochem 251, 246-50. Negelein, E., and Brömel, H. (1939) Biochem. Z. 301, 135-. Furfine, C. S., and Velick, S. F. (1965) The Acyl-Enzyme Intermediate and the Kinetic Mechanism of the Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase Reaction J Biol Chem 240, 844-55. Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., and Gray, T. (1995) How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein Protein Sci. 4, 2411-2423. Fox, I. B., and Dandliker, W. B. (1956) The coenzyme content of rabbit muscle Dglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase J. Biol. Chem. 221, 1005-1017. Elődi, P. (1958) Comparative studies on D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases Acta Phys. Acad. Sci. Hung. 13, 199-206. Yonetani, T., and Theorell, H. (1964) Studies on liver alcohol dehydrogenase complexes. III. Multiple inhibition kinetics in the presence of two competitive inhibitors Arch. Biochem. Biophys. 106, 243-351. Smith, R. M., and Martell, A. E. (1977) Critical Stability Constans, Vol. Other organic ligands, Plenum Press, New York and London. Smith, R. M., and Martell, A. E. (1976) Critical Stability Constans, Vol. Inorganic complexes, Plenum Press, New York and London.

113

149. 150.

151. 152. 153. 154.

155. 156. 157. 158.

159. 160.

161. 162. 163. 164. 165. 166.

Vas, M., and Csanady, G. (1987) The two fast-reacting thiols of 3phosphoglycerate kinase are structurally juxtaposed. Chemical modification with bifunctional reagents Eur J Biochem 163, 365-8. Minard, P., Desmadril, M., Ballery, N., Perahia, D., Mouawad, L., Hall, L., and Yon, J. M. (1989) Study of the fast-reacting cysteines in phosphoglycerate kinase using chemical modification and site-directed mutagenesis. Eur. J. Biochem. 185, 419-423. Riddles, P. W., Blakeley, R. L., and Zerner, B. (1983) Reassessment of Ellman's reagent Methods Enzymol 91, 49-60. Sanchez-Ruiz, J. M., Lopez-Lacomba, J. L., Cortijo, M., and Mateo, P. L. (1988) Differential scanning calorimetry of the irreversible thermal denaturation of thermolysin. Biochemistry 27, 1648-52. Wang, C., Lascu, I., and Giartosio, A. (1998) Bovine serum fetuin is unfolded through a molten globule state Biochemistry 37, 8457-64. Chandra, N. R., Muirhead, H., Holbrook, J. J., Bernstein, B. E., Hol, W. G., and Sessions, R. B. (1998) A general method of domain closure is applied to phosphoglycerate kinase and the result compared with the crystal structure of a closed conformation of the enzyme Proteins 30, 372-380. Verdonk, M. L., Cole, J. C., Hartshorn, M. J., Murray, C. W., and Taylor, R. D. (2003) Improved protein-ligand docking using GOLD Proteins 52, 609-23. Joao, H. C., and Williams, R. J. P. (1993) The anatomy of a kinase and the control of phosphate transfer Eur. J. Biochem. 216, 1-18. Davies, G. J., Gamblin, S. J., Littlechild, J. A., and Watson, H. C. (1993) The structure of a thermally stable 3-phosphoglycerate kinase and a comparison with its mesophilic equivalent. Proteins 15, 283-289. Oikonomakos, N. G., Zographos, S. E., Tsitsanou, K. E., Johnson, L. N., and Acharya, K. R. (1996) Activator anion binding site in pyridoxal phosphorylase b: the binding of phosphite, phosphate, and fluorophosphate in the crystal Protein Sci 5, 2416-28. Ravel, P., Craescu, C. T., Arous, N., Rosa, J., and Garel, M. C. (1997) Critical role of human bisphosphoglycerate mutase Cys22 in the phosphatase activator-binding site J. Biol. Chem. 272, 14045-14050. Mizuguchi, H., Cook, P. F., Hasemann, C. A., and Uyeda, K. (1997) Chemical mechanism of the fructose-6-phosphate,2-kinase reaction from the pH dependence of kinetic parameters of site-directed mutants of active site basic residues Biochemistry 36, 8775-84. Contessi, S., Tanfani, F., Scire, A., Mavelli, I., and Lippe, G. (2001) Effects of Fe(III) binding to the nucleotide-independent site of F1-ATPase: enzyme thermostability and response to activating anions FEBS Lett 506, 221-4. Ali, M., and Brownstone, Y. S. (1976) A study of phosphoglycerate kinase in human erythrocytes. II. Kinetic properties Biochim. Biophys. Acta 445, 89-103. Vas, M. (1990) Modelling of substrate binding to 3-phosphoglycerate kinase with analogues of 3-phosphoglycerate Eur J Biochem 194, 639-45. Chegwidden, W. R., and Watts, D. C. (1984) Anion activation of monkey muscle creatine kinase Int J Biochem 16, 1171-4. Kasho, V. N., and Boyer, P. D. (1984) Relationships of inosine triphosphate and bicarbonate effects on F1 ATPase to the binding change mechanism J Bioenerg Biomembr 16, 407-19. Roveri, O. A., and Calcaterra, N. B. (1985) Steady-state kinetics of F1-ATPase. Mechanism of anion activation FEBS Lett 192, 123-7.

114

167. 168.

169.

170. 171.

Galisteo, M. L., Mateo, P. L., and Sanchez-Ruiz, J. M. (1991) Kinetic study on the irreversible thermal denaturation of yeast phosphoglycerate kinase Biochemistry 30, 2061-6. Kurganov, B. I., Lyubarev, A. E., Sanchez-Ruiz, J. M., and Shnyrov, V. L. (1997) Analysis of differential scanning calorimetry data for proteins: Criteria of validity of one-step mechanism of irreversible protein denaturation. Biophys. Chem. 69, 125-135. Szpikowska, B. K., Beechem, J. M., Sherman, M. A., and Mas, M. T. (1994) Equilibrium unfolding of yeast phosphoglycerate kinase and its mutants lacking one or both native tryptophans: a circular dichroism and steady-state and timeresolved fluorescence study Biochemistry 33, 2217-2225. Szpikowska, B. K., and Mas, M. T. (1996) Urea-induced equilibrium unfolding of single tryptophan mutants of yeast phosphoglycerate kinase: evidence for a stable intermediate Arch. Biochem. Biophys. 335, 173-182. Zecchinon, L., Oriol, A., Netzel, U., Svennberg, J., Gerardin-Otthiers, N., and Feller, G. (2005) Stability domains, substrate-induced conformational changes, and hinge-bending motions in a psychrophilic phosphoglycerate kinase. A microcalorimetric study J Biol Chem 280, 41307-14.

115

RÖVID ÖSSZEFOGLALÁS A több doménből felépülő enzimek működésének megértéséhez fontos tisztázni a domének közötti együttműködés és az ezt kísérő doménmozgások molekuláris mechanizmusát. A kérdéskörhöz tartozik, hogy az enzimen kötődő szubsztrátok milyen molekuláris kölcsönhatások által járulnak hozzá a fehérjeszerkezet flexibilitása által megengedett doménzáródáshoz. A fenti kérdések vizsgálatára modellként a két szerkezeti doménből felépülő 3-foszfoglicerát kinázt (PGK) választottam, mely a glikolízis egyik ATP termelő lépését katalizálja. Munkám megkezdésekor a kristályszerkezetek alapján a PGK domének mozgását irányító molekuláris csuklók elhelyezkedéséről volt már elképzelés. Azt is

tudtuk,

hogy

az

enzim-szubsztrát

kapcsolódás

elengedhetetlen

a

domének

együttműködése során megvalósuló doménzáródáshoz. Célul tűztem ki annak felderítését, hogy a külön-külön doménen kötődő szubsztrátok milyen atomi szintű kölcsönhatásokon keresztül irányítják a kötőhelyüktől távol eső csuklókat. Ehhez tisztázni kellett az egyes szubsztrátok, így a MgATP, az 1,3-biszfoszfo-glicerát (1,3-BPG) és az enzimaktivitást szabályozó (aktiváló) anionok kötődési módjának bizonytalanságait is. A nukleotid szubsztrátokkal végzett kinetikai kettősgátlás, izotermális titráló kalorimetriás (ITC) és differenciális pásztázó mikrokalorimetriás (DSC) vizsgálataim bizonyították, hogy a MgATP és a MgADP foszfátláncukkal eltérő kölcsönhatásokat alakítanak ki az enzimmel. Mindez a Mg2+ speciális hatásának tulajdonítható. A MgATP entrópiavezérelt kötődése és a kristályszerkezeti adatok felvetették a foszfátlánc mozgékonyságát a biner komplexben. Modellezéssel meghatároztam, hogy egyrészt a kötött 1,3-BPG 1-es foszfátja is mozgékony, másrészt az anionok három különböző helyen is kötődhetnek az enzimen. A kísérleti és modellezési eredményeket az R38A és a K215A mutáns fehérjék vizsgálata igazolta. Rámutatott arra is, hogy a MgATP és 1,3-BPG foszfátjainak flexibilitása fontos szerepet tölthet be az aktív centrumot alkotó négy különböző hélix relatív helyzetének kialakításában a doménzáródás során. DSC méréseim közelebb vittek a doménzáródás mechanizmusának megértéséhez, mivel a domének igen szoros együttműködését, továbbá mindkét szubsztrát kötődésének szükségességét is jelezték. A fenti oldatkísérletekből az enzim-szubsztrát kölcsönhatásokra kapott információkat és a különböző enzim-szubsztrát komplexek kristályszerkezeti adatait felhasználva molekuláris grafikai analízissel megállapítottam, hogy egy speciális H-kötés rendszer (kettős molekuláris kapcsoló) alakul ki a szubsztrátok hatására, amely mozgatja a PGK fő csukló régióját, az L jelű β-redőben a doménzáródás során.

I

II

SHORT SUMMARY To understand the action of multidomain enzymes is important to clarify the molecular mechanism of domain-domain communication and the domain movements. It is also important to identify the molecular contacts, through which the enzyme bound substrates contribute to domain closure allowed by protein structural flexibility. For such studies 3-phosphoglycerate kinase (PGK) was used as a model, the enzyme, which catalyses one of the ATP producing step of glycolysis. Before my work, based on the known crystal structures the position of hinges responsible for domain movements has been localized in the enzyme molecule. It was also known, that enzyme-substrate interactions are essential for the cooperation of the two domains that leads domain closure. The aim of my work was to explore the exact molecular mechanism by which each substrate, binding on separate domains, act together on the operation of molecular hinges, located faraway from the substrate binding sites. For this purpose it was needed to clarify the binding modes of substrates, like MgATP and 1,3-bisphosphoglycerate (1,3-BPG) as well as of the regulatory (activating) anions. Kinetic double inhibition experiments, isothermal titration calorimetric (ITC) and differential scanning calorimetric (DSC) measurements with the nucleotide substrates evidenced different binding modes of the phosphate chain of MgATP and MgADP. This can be attributed to the specific effect of Mg2+. The mobility of MgATP phosphate chain in the binary complex is proposed by the entropy-driven binding of MgATP and the crystal structural data. Molecular modelling studies proved the mobility of the 1-phosphate of 1,3-BPG on one hand and the existence of three different binding sites for the regulating (activating) anions on the other hand. The results of the experimental and modelling studies were evidenced by the experiments with R38A and K215A mutant proteins. This also pointed out, that the flexibility of phosphates of MgATP and of 1,3-BPG could play an important role in rearrangement of four different helices in the active site during domain closure. DSC calorimetric experiments helped to understand better the molecular mechanism of domain closure. These measurements clearly indicated the strong cooperativity between the two domains and the necessity of both substrates for domain closure. Based on the experimental and crystal structural data as well as on molecular graphical analysis a special H-bonding network (a double molecular switch) was identified to be responsible for the operation of the main molecular hinge of PGK at the β-strand L during domain closure under the concerted action of the two substrates.

III