Materiály pro tkáňové inženýrství

Materiály pro tkáňové inženýrství - MTI

Materiály pro tkáňové inženýrství (II. Materiály pro tkáňové inženýrství) Materiály 1

Katedra netkaných textilií Fakulta textilní Technická univerzita v Liberci

Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky

Tkáňové inženýrství Interdisciplinární obor využívající znalostí inženýrství a přírodních věd k vývoji biologických náhrad sloužících k obnově, zachování nebo zlepšení funkcí tkání nebo orgánů (Langer et Vacanti, 1993) • Využití poznatků biologie, chemie, fyziky, inženýrství biomateriálů, počítačové technologie, medicíny, stereologie, statistiky …

Vysvětlení pojmů • In vitro – ve zkumavce • In vivo – v živém organismu • Scaffold – nosič, podpůrná struktura pro růst buněk, popř. tkání • Adheze – přilnutí buněk, podmíněno přítomností specifických receptorů na povrchu buněk (adhezní proteiny) • Proliferace – buněčné dělení • Diferenciace – vývoj nespecializované buňky (kmenové) v buňku strukturně i funkčně specializovanou • Kmenové buňky – nediferencované buňky se schopností přeměny v jakýkoliv jiný buněčný typ


Extracellular matrix Adhesion

Cell differentiation Cell proliferation

Požadavky na materiálové vlastnosti Biodegradabilita Určuje rychlost přirozené degradace tkáňového nosiče (scaffoldu)

Biocompatibilita Určuje komptabilitu daného materiálu s lidským organismem

Průměr vláken/velikost částic (adheze) Buněčná adheze určuje schompost materiálu na sebe vázat buněčný materiál.

Velikost mezivlákenných pórů (proliferace) Určuje schopnost buněčné kultury prorůstat do schaffoldu.

Hydrofilicita/hydrofobicita materiálu Důležitá vlastnost materiálu pro adhezi, proliferaci a diferenciaci


Scaffoldy obecně What is scaffold? Why and How to use it? A temporary arrangement erected around a building for convenience of workers

A supporting structure for growing cells and tissues.


Scaffold Requirements FUNKCE SCAFFOLDU

VLASTNOSTI SCAFFOLDU

1

Nevyvolával zánětlivé reakce nebo toxické reakce in vivo.

Musí být biokompatibilní, netoxický a nekarcinogenní.

2

Napomáhat v růstu 3-D tkáně.

Specifický tvar 3-D scaffoldu.

3

Rovnoměrné velká hustota nasazených buněk.

Vysoká pórovitost a propojení mezi póry.

4

Poskytnut vhodný povrch pro adhezi a rozprostření buněk.

Optimální chemické a povrchové vlastnosti použitého polymeru. Velký specifický povrch.

5

Podpořit proliferaci a migraci buněk celým scaffoldem.

Optimální velikost pórů umožňuje buňkám pohyb a komunikaci. Dynamické nasazení buněk.

6

Přímá orientace buněk.

Regulovatelná orientace vláken uvnitř scaffoldu; chemická úprava povrchu.

7

Umožňuje přísun živin a odstranění odpadních látek ze scaffoldu.

Vysoká porozita a propojení mezi póry; kromě toho elasticita materiálu.

8

Biologická vstřebatelnost scaffoldu.

Rychlost degradace se rovná rychlosti formování tkáně. Produkty degradace polymeru nesmí být toxické ani podporovat zánět in vivo.

9

Zachovat si tvar in vivo s dostatečnou mechanickou pevností.

Scaffold má podobné mechanické vlastnosti jako rozvíjející se tkáň.

!!! Biocompatibilní, biodegradabilní (pro většinu aplikací ovšem ne pro všechny), 3D otevřená porézní struktura, vhodné mechanické vlastnosti, dobrá sterilizovatelnost, dostatečná doba do rozkladu (pro biodegradabilní materiály)…


1. 2. 3. 4.

Izolace buněk Kultivace buněk (2D) Výroba scaffoldu Osazení scaffoldu a následná kultivace (3D) 5. Implantace

3. Výroba scaffoldu Požadavky: • “Biokompatibilita” (Cytokompatibilita) • Biodegradabilita (rychlost degradace úměrná rychlosti formování tkáně – řádově měsíce) • Mechanická podpora • Porézní struktura umožňující usazení buněk, jejich růst a migraci • Interkonektivita, propojení jednotlivých pórů je důležité pro výměnu tekutin, odvádění odpadních tekutin a vytváření nových tkání • 3D struktura • Drug delivery system (enkapsulace, koaxiální zvlákňování)


3. Výroba scaffoldu Materiály: a) Syntetické: Polyestery (PLA, PCL) vodorozpustné (PVA, PEO, PVP …) a) Biologické: • Přírodní polymery: kolagen, fibrin, chitosan, alginát, GAGs, HA, celulosa (biocelulosa) • Acelulární tkáňové scaffoldy: ECM

Poly(lactic acid) or PLA

Poly(glycolic acid) or PGA

Polycaprolactone or PCL Kopolymery: PLGA, PLCL


Syntetické biodegradabilní polymery používané v tkáňovém inženýrství


Biodegradabilní polymery 1) Biologické • Snadná buněčná adheze • Přirozené pro lidský organismus – nevyvolávají imunitní odpověď • Rozpad na netoxické produkty, které jsou z těla přirozenou cestou vyloučeny • Nedostatečná mechanická pevnost • Špatná reprodukovatelnost


Biologické materiály  • • •

Kolagen typ I Hlavní složka pojivové tkáně člověka zajišťující mechanickou podporu a flexibilitu tkáně (kůže, kosti) Fylogeneticky stálá sekvence aminokyselin a helikální struktura→nevyvolává imunologickou odezvu organismu Možnost modifikace (crosslink s PEO, RGD sekvence)

 GAGs • Lineární polysacharidy • Při vazbě na bílkoviny tvoří proteoglykany – základní součást ECM • Př.: kyselina hyaluronová (HA), chondroitinsulfát, dermatansulfát, keratansulfát, heparansulfát, heparin • Nejčastěji využívána HA – snadná chemická modifikace, náhrada chrupavky


Biologické materiály Chitosan Deacetylovaný derivát chitinu Osteoblasty, chodnrocyty (ve směsi s PEO) Dobré antibakteriální vlastnosti. Rozpustný v kyselinách. Špatná zvláknitelnost a reprodukovatelnost. Assoc. Prof. Karoline Schauer, Drexel University, Philadelphia.

Polyhydroxybutyrát (PHB) Produkován mikroorganismy ve stresových podmínkách Nejčatěji jako kopolymer s kyselinou hydroxyvalerovou (HVA)

Materiály pro tkáňové inženýrství - MTI Přírodní materiály pro tkáňové inženýrství

Hlavní složky přizené ECM (extracelulární matrice), jejich výskyt a funkce v těle.

Sell, S., A., et al.: Te Use of Natural Polymers in Tissue Engineering, Polymers 2010, 2, pg.524


Materiály pro výrobu scaffoldů Přírodní materiály

Kyselina hyaluronová je základní součástí synoviální (kloubní) tekutiny, “maziva” kloubů. Bez ní by naše klouby nemohly fungovat tak snadno, jak obvykle fungují. Navíc synoviální tekutina slouží jako poduška a jako zdroj živin pro buňky chrupavky, která se musí pravidelně obnovovat. Zdravý mladý jedinec vytváří kyselinu hyaluronovou z glukosaminů, které přijímá v potravě.

Schopnost tvorby hyaluronátu se s přibývajícím věkem snižuje.

http://galenus.cz/klouby-chrupavka.php

16


Materiály pro výrobu scaffoldů Přírodní materiály – kyselina hyaluronová

•V čem je kyselina hyaluronová zajímavá? Je přirozenou součástí lidského těla. Zajišťuje dokonalou hydrataci naší pokožky, je obsažena v našem oku, je součástí vaziva. Díky ní se naše klouby mohou hladce pohybovat. Právě proto, že se tato látka v našem těle přirozeně vyskytuje a je pro spoustu jeho funkcí nezbytná, nachází kyselina hyaluronová mnohostranné uplatnění ve farmaceutickém průmyslu. Každá kůže přirozeně obsahuje kyselinu hyaluronovou. Ta se nachází v retikulární vrstvě kůže a v nejhlubší vrstvě dermis (dermis se nachází pod epidermis nebo horní vrstvou naší pokožky). Retikulární vrstva obsahuje kolagen a elastin a kyselinu hyaluronovou, která se nachází mezi těmito vlákny a zajišťuje objem kůže. Dětská kůže je plná kyseliny hyaluronové, což vysvětluje jemnou a vlhkou kůži dětí. Jak stárneme, množství kyseliny hyaluronové v kůži klesá, lidský organismus ji produkuje méně. Kyselina hyaluronová hraje důležitou roli při zadržování vody v lidském organismu a „mazání“ – lubrikaci tkání a orgánů (klouby, cévy, srdce, mozek) Snížení HA bude vést k artritidě, kornatění cév, poruchám pulsu a mozkové atrofii. Sodium Hyaluronate low molecular Hyaluronic Acid http://askanesthetician.wordpress.com



•Zvýšené množství kyseliny hyaluronové obsahuje lidské embryo. V embryonální vývojové fázi narůstá plodu jakýsi ocásek, který pozdějším vývojem zase mizí. Nikdy však za sebou nezanechá jizvy nebo jiné defekty. Na základě tohoto poznatku se předpokládá, že právě kyselina hyaluronová zajišťuje optimální organizaci pojivové tkáně v místě srůstu, jednoduše řečeno hojení.

•Důležitou vlastností kyseliny je její vysoká afinita k vodě, proto má dokonalé hydratační účinky. Právě této vlastnosti využívá nejdůležitější produkt holdingu vyráběný z kyseliny hyaluronové – Hyodine. Po jeho aplikaci kyselina hyaluronová nasává vodu, která obsahuje i okolní růstové faktory. Dostatečně hydratované a vyživované místo kožního defektu se pak hojí lépe, bez vystouplých jizev. •Není to ale pouze unikátní přípravek Hyiodine, v němž nachází vysoce kvalitní kyselina hyaluronová vyráběná v Dolní Dobrouči uplatnění. Díky jedinečným hydratačním a elastickým vlastnostem nachází řadu uplatnění v oční chirurgii, při léčbě kloubů a některých druhů rakoviny i v kosmetice.



Nejčastější použití: Farmaceutický průmysl – např. oční kapky (HA v kapkách napomáhá obnovovat epitel rohovky oka) Kosmetický průmysl – na pokožku, na vlasy atd. (dodává elasticitu a chrání před vysoušením )

Potravinové doplňky

Největší český výrobce kyseliny hyaluronové CONTIPRO GROUP –DOLNÍ DOBROUČ

Vyrábí na biotechnologické bázi vysoce kvalitní syntetickou kyselinu hyaluronovou. Výrobek je naprosto čistý, geneticky shodný s „lidskou“ kyselinou hyaluronovou. molekulová hmotnost v rozmezí 300 – 2200kDa.



Gelatin is obtained by the thermal denaturation of collagen.

http://www.thewestminsterpractice.com

Želatina je získávána teplotní denaturací kolagenu Gelatinization of collagen. In addition to chain-breaking of a macromolecule by hydrolysis resulting in a decrease in molecular weight, another mode of protein degradation can occur through denaturation. In the case of collagen this is by interaction with water and is designated gelatinization, Figure 3. By heating collagen in water, the water molecules can gain sufficient energy to compete for the hydrogen bonds maintaining the triple helix configuration.

http://bsfp.media-security.ru/p2002/Report_02.htm

Želatina se získává vyvařením šlach, kůží, kostí a jiných jatečních odpadů bohatých na kolagen. Vařením se kolagen přeměňuje na glutin, což je látka, která má rosolovací schopnost a je nejpodstatnější složkou želatiny.

http://cool.conservation-us.org/coolaic/sg/bpg/annual/v10/bp10-09.html

http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.bioeng.4.101001.131546?journalCode=bioeng

20



Želatina

Materiály používané k výrobě želatiny: 27% kosti, 28% hovězí šlachy, 44% prasečí kůže, 1% jiný zdroj.

Základ cukrovinek HARIBO tvoří cukr, vepřová želatina z kůží a výtažky z ovoce a rostlin. Medvidci cca 6%bílkovin = velmi málo želatiny.

21


Kolagen

Kolagen je skleroprotein (protein vláknitého tvaru), extracelulární, ve vodě nerozpustná bílkovina, která je základní stavební hmotou pojivových tkání. Tvoří 25–30 % všech proteinů v těle savců, ve formě kolagenních vláken je složkou mezibuněčné hmoty. V současnosti je známo nejméně 27 rozdílných typů kolagenů. Kolagenové choroby tj. choroby charakteristické patologickými či degradačními formami kolagenu postihují např. srdce, cévy, svaly a kůži. Samotný kolagen hraje důležitou roli i při stárnutí organismu. Molekula kolagenu je tvořena hlavně aminokyselinami glycinem, prolinem, hydroxyprolinem a hydroxylysinem. Poslední dva vznikají posttranslační modifikací prolinu a lysinu za účasti kyseliny askorbové – vitaminu C. Kolagen se skládá z řetězců alfa 1 a alfa 2, které se jen málo liší pořadím aminokyselin. Řetězce tvoří trojitou spirálu, která se označuje jako tropokolagen. Je to základní jednotka kolagenu, dlouhá přibližně 256 nm.


Kolagen

Existuje celá řada typů, nejdůležitější je kolagen typu I, II, III, IV, a V. Nejrozšířenější je typ I, představuje 90 % kolagenu v organismech, je přítomen v pokožce, šlachách, kostech a zubech. Typ II se vyskytuje v chrupavkách. Typ III je kolagen embryonálního vývoje, později je nahrazen typem I. Typ IV se vyskytuje v bazální membráně epitelů. Kolagen typu V je charakteristický pro stěnu krevních cév. Kolagen I: Tento typ je nejdůležitějším a nejrozšířenějším typem kolagenu, který má i široké průmyslové využití. Je základem např. hemostatické plsti, chirurgických nití, kolagenových membrán, dále pak je součástí řady potravinových doplňků či kosmetických přípravků proti stárnutí pleti.Kolagen typ I tvoří typická 1-20 µm dlouhá kolagenní vlákna. Hlavní výskyt v lidském těle: kost, kůra vaječníku, pleura, perineurium, subserosa žlučníku, tuková tkáň, tunica adventitia cév (i kapilár), vazivová chrupavka, závěsný aparát zubu. Kolagen II: Jsou 20 nm dlouhé fibrily (neagregují ve vlákna). Hlavní výskyt v lidském těle: hyalinní a elastická chrupavka (i vazivová), tunica media (okolo hladkých svalových buněk)



Silk fibroin

Fibroin je druh bílkoviny tvořené Bourcem morušovým ve formě hedvábí. Bourec produkuje vlákno složené ze dvou hlavních bílkovin (sericin a fibroin). Sericin je lebkavý materiál, který obklopuje pevná vlákna fibroinu.

24


Materiály pro výrobu scaffoldů Kombinace syntetických a přírodních materiálů

25


Materiály pro výrobu scaffoldů Kombinace syntetických a přírodních materiálů

Popis produktu Pletená cévní protéza Ra K nestlačitelná je hadička vyrobená osnovní technologií pletení z polyesterového hedvábí. Přední stěna protézy je opatřena barevnou vodící stopou, která usnadňuje lékaři orientaci v operační ráně během implantace. Z vnější strany je ovinutá polyethylenovým vlascem, čímž je dosaženo nestlačitelnosti protézy. Na povrchu protézy je nanesena souvislá vrstva chemicky modifikovaného bovinního kolagenu I. Ten usnadňuje vhojování cévní protézy a nepropustnost stěny v době implantace. Pletené cévní protézy jsou indikovány pro všechny typy rekonstrukcí tepen, u nichž je vhodná cévní náhrada odpovídajícího průsvitu. Tyto typy protéz je možno použít v oblasti aortofemorální, ilikofemorální, fomoropopliteální nad kolenní kloub, v oblasti extrakranálních tepen a pro estraanatomické bypassy.

http://www.vup.cz/kdetail.php?id=10389 26


Syntetické materiály • • • •  • •

• •     •

Mechanická pevnost, odolnost Možnost modifikace tvaru a stupně degradace Hydrofobní povrch→špatná adheze buněk (zcela nepotvrzeno) Zkoumán vliv krystalinity na buněčnou adhezi Poly(α-hydroxy)kyseliny Esterové vazby odbourávány hydrolysou→ finální produkty mohou vyvolat zánětlivou reakci (vznikají kyselé produkty) PGA, PLA a jejich kopolymery – nejvíce užívané: odbourávány v těle na CO2 a H2O Polydioxanon (PDS) PCL-pomalejší degradace než PLA, PGA Poly(ortho)estery Polyanhydridy Polyfosfonáty Polyaminokyseliny Použití pro kontrolované uvolňování látek (léčiva, růstové faktory, enzymy)


Syntetické polymery pro tkáňové inženýrství

1. POLYESTERY Co jsou polyestery? Jsou to polymerní materiály, které obsahují esterovou skupinu Obecný vzorec esteru karboxylové kyseliny

Velmi často je zkratkou PES a označením „polyester“ označován polyetylentereftalát (PET), který je znám hlavně z textilního průmyslu a plastových lahví.

Strukturní vzorec PET

Drtivá většina biodegradabilních polymerů, které se v současnosti využívají a testují jako základní materiály pro tkáňové inženýrství pro výrobu scaffoldů, patří do skupiny právě polyesterů. Jsou to...



1. POLYESTERY PGA (polyglycolic acid) – kyselina polyglykolová – polymer kyseliny glykolové

PLA (polylactic acid) – kyseliny polymléčná – polymer kyseliny mléčné

PLGA (polyglycolic-co-lactic acid) – kopolymer kyseliny glykolové a mléčné

PCL (polycarpolactone) – polykaprolakton

PDO (polydioxanone) – polydioxanon a další Poly(3-hydroxybutyrate); Poly(3-hydroxyvalerate); Poly(valerolactone); Poly(tartronic acid); Poly(malonic acid)



1. POLYESTERY 1.1. Kyselina polyglykolová

Jedná se o tuhý termoplastický materiál s vysokou krystalinitou (46-50%). Skelný přechod 35-40°C; teplota tání 225-230°C. Kvůli vysoké krystalinitě není možné PGA rozpouštět ve většině organických rozpouštědel. Vyjímku tvoří vysoce fluorovaná organická rozpouštědla jako je například hexafluoro isopropanol. Ovšem například pro elektrostatické zvlákňování se používá často i chloroform či kombinace chlorofor/aceton. Běžné výrobní techniky jako je extruze, vstřikování, lisování mohou být použity k tvorbě scaffoldů různých tvarů. Avšak PGA je vysoce citlivé na hydrolitickou degradaci, proto je nutné pečlivě řídit výrobní podmínky.




http://www.uni-leipzig.de/~pharm/phatech/content/Forschung/bioabbaubare_zelltraeger.php

Porézní scaffoldy a pěny je také možné vyrábět, ale je nutné si uvědomit, že výsledné vlastnosti a degradační charakteristiky budou velmi závislé na typu výrobního procesu. Je možné použít technologie solvent casting (formování rozpouštědlem), particular leaching (vymávání částic). Například: Polyglycolide (PGA)/poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) scaffolds were fabricated by a solvent casting/particulate leaching method using hexafluoroisopropanol (HFIP) or acetone for material dissolution and NaCl particles as porogen. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17137316



1. POLYESTERY 1.1. Kyselina polyglykolová PGA je atraktivní jako biodegradabilní polymer v medicínských aplikacíh díky jeho degradačnímu produktu, kterým je kyselina glykolová. Kyselina glykolová je přirozený metabolit. Degradace probíhá ve dou fázích: i) difuze vody do amorních oblastí a jednoduché hydrolytické štěpení řetězce na esterové skupiny; ii) druhá fáze je převážně degradací krystalických oblastí polymeru, které se stává dominantní ve chvíli, kdy je většina amorfních částí již rozrušena. (Informace ze studií degradability chirurgických nití - Většina současných aplicí PGA je v šicích materiálech.)




Ačkoli je degradačním produktem vtřebatelná kyselina glykolová (přirozený metabolit), ve vysoké koncentraci může být lokálně způsobeno zvýšené okyselení a může dojít k poškození tkání (např zánětem). Za konečný rozpadový produkt kyseliny glykolové in-vivo je považována konverze na oxid uhličitý a vodu a následně jeho vyloučení z organismu přes dýchací systém či močí.



1. POLYESTERY 1.2. Kyselina polymléčná Kyselina polymléčná existuje ve třech isomerických formách d(-), l(+) a dl. Teplota skelného přechodu: 60 – 65°C Teplota tání: 150 – 160°C Poly(l)LA a poly(d)LA jsou semikrystalické pevné látky, s podobnou ryhlostí hydrolytické degradace PGA. Pro většinu aplikací je (l) isomer PLA vybírán, protože je přednostně metabolizován v těle. PLA je více hydrofóbní než PGA a je odolnější vůči hydrolytickým „útokům“ než PGA.

http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S010466322009000200003&script=sci_arttext



1. POLYESTERY 1.2. Kyselina polymléčná

PLA degraduje do formy kyseliny mléčné, která je normálně přítomná v těle. Produkty jsou finálně vylučovány jako voda a oxid uhličitý. Rychlost rozkladu PLA, je určena faktory, jako jsou parametry vytvořené struktury, krystalinita, molekulární hmotnost, morfologie, zatěžování, množství zbytkového monomeru, pórovitost a místo implantace.



1. POLYESTERY 1.3. Kopolymer kyseliny mléčné a polyglykolové

PLA-PGA kopolymery jsou užívány v tkáňovém inženýrství hlavně kostí. Uplatňují se ovšem zatím zejména jako šičí nitě. Rychlost rozpadu je dána i poměrem složek PLA a PGA v kopolymeru.



1. POLYESTERY 1.4. Polykaprolakton

PCL je jedním z nejpoužívanějších biodegradabilních syntetických polymerů v součaném tkáňovém inženýrství. Je to semikrystalický polymer s teplotou skelného přechodu okolo -60°C. Polymer má nízkou teplotu tání (59-64°C) a je kompatibilní s celou škálou dalších polymerů. PCL se rozkládá s mnohem menší rychlostí než PLA a proto se zejména využívá na dlouhotrvající implantované nosiče buněk či léků. Řízení rychlosti degradace může být ovlivňováno poměrem složek v kopolymeru např. PCL/PLA.



1. POLYESTERY 1.4. Polykaprolakton Degradace PCL probíhá také hydrolytickou degradací, ale převážně v lidském těle enzymatickou degradací.

Ring opening polymerization of ε-caprolactone to polycaprolactone

Neplést s polykaprolatamem (polycaprolactam), což je polyamid 6. Polymerizace kaprolaktamu na polyamid 6



1. POLYESTERY Poznámka: CHIRURGICKÉ

NITĚ

VSTŘEBATELNÉ (BIODEGRADOVATELNÉ) PGA, PLA, PDO, PCL NEVSTŘEBATELNÉ PET

Materiály pro tkáňové inženýrství

Recommend Documents