Materiály pro buněčnou a tkáňovou transplantaci. RNDr. Pavla Jendelová PhD. Ústav experimentální medicíny AVČR Ústav neurověd, UK 2. lékařská fakulta
Regenerativní medicína Buněčná terapie Genová terapie Produkce růstových faktorů
Počet publikací (WOS)
Tkáňové inženýrství Biomateriálové inženýrství Transplantační medicína
Počet citací (WOS)
Kmenové buňky - definice sebeobnovující se „nezralé“ buňky, které se mohou vyvinout v plně funkční diferencované buňky Hlavní kategorie kmenových buněk • embryonální • fetální • „dospělé“ nebo somatické kmenové buňky • indukované pluripotentní
Dvě vlastnosti, které jsou esenciální pro obě kategorie: • schopnost sebeobnovy (schopnost generovat identické kopie sebe sama) • schopnost diferencovat se (schopnost dát vznik různým diferencovaným buněčným typům)
Kmenové buňky a jejich zdroje
EMBRYO X FETUS X DOSPĚLÝ JEDINEC Embryonální kmenové buňky (největší potenciál, zdroj embrya z in vitro fertilizace nebo přenos jader, etický problém) Fetální neurální kmenové buňky (dokáží nahradit nervové buňky, zdroj potraty, etický problém, nedostatečné množství), Indukované pluripotentní buňky (jako embryonální, genová manipulace z dospělé buňky pacienta) Z dospělých jedinců: Kmenové buňky kostní dřeně, tukové a čichové buňky (používají se, zdroj pacient sám, podpůrná funkce) Kmenové buňky pupečníkové krve (malé možnosti použití, omezeně např. u některých sourozenců) Zvířecí buňky – xenotransplantáty (používají se jako přechodné náhrady nebo v bioreaktorech)
Funkce kmenových buněk
Pluripotentní kmenové buňky Embryonální kmenové buňky
Diferenciace embryonálních kmenových buněk
Lidské embryonální buňky – diferenciace ve zkumavce
Je experimentování s lidskými embryonálními kmenovými buňkami v České republice legální?
ANO
Zákon o výzkumu na lidských embryonálních kmenových buňkách a souvisejících činnostech a o změně některých souvisejících zákonů Schválen Poslaneckou sněmovnou dne 26. dubna 2006 Platný od 1. června 2006 jako zákon č. 227/2006 Sb.
Povolení pro práci s lidskými embryonálními kmenovými buňkami Registr linií lidských embryonálních kmenových buněk
Embryonální kmenové buňky - legislativa Výzkum, tvorba embryonálních KB a terapeutické klonování povolen: (nepovoleno klonování člověka) Velká Británie, Belgie, Finsko, Španělsko, Švédsko Výzkum a tvorba embryonálních KB z IV fertilizace povolen: Bulharsko, Chorvatsko, Česká republika, Dánsko, Estonsko, Finsko, Francie, Gruzie, Řecko, Maďarsko, Irsko, Lotyšsko, Moldavsko, Nizozemí, Norsko, Portugalsko, Rumunsko, Rusko, Slovinsko, Švýcarsko, Turecko Německo, Itálie – zákaz derivace linií, povolen výzkum na dovezených linií Výzkum embryonálních KB a derivace linií není povolen Rakousko, Litva, Polsko, Slovensko
USA – 2011 prezident Obama povolil federální podporu výzkumu některé státy USA výzkum zakazují (např. Indiana, Louisiana, Severní a Jižní Dakota)
Indukované pluripotentní buňky
(účinnost 0.1%)
Selekce pomocí resistence na antibiotika pod specifickým promotorem typickým pro pluripotentní buňku (jako je Oct3/4, Nanog)
Výhody: -lze je derivovat přímo z buněk pacienta (jsou imunologicky kompatibilní) -možnost derivace přímo od pacienta s určitou nemocí -možnost diferenciace na typ buněk, které nemoc postihuje -tím je dána možnost hledání vhodných terapií in vitro -eticky akceptovatelná metoda
Výběr na základě morfologie Kolonie iPS
Zdroje reprogramovaných buněk
Integrace pluripotentních buněk do mozku také nemá 100% úspěšnost Cv
HuNu
iPS a hES v klinických studiích • 12.9. 2014 první pacientka (70 let) v Japonsku transplantovaná sítnicovým pigmentovým epitelem, vypěstovaným z její kožní buňky (přes iPS buňky • Studie GRNOPC1 Pacienti s míšní lézí v hrudní oblasti 7-14 dní po úrazu dostali prekurzory oligodendrocytů diferencované z ESC, 2 mil buněk do léze, imunosuprese 60 dní Studie zastavena po 5 pacientech z finančních důvodů
Embryonální kmenové buňky v klinických studiích Clinical Start Trials.gov (yr) NCT01344993 2011
NCT01345006 2011
NCT01469832 2011
NCT01625559 2012
Sponsor
Title
Condition
Intervention
Remarks
Advanced cell Safety and tolerability of transplantation of MA09- Advanced dry age related Sub-retinal A Phase I/II, open-label, technology hRPE cells in patients with advanced dry age related macular degeneration transplantation of multi-center, prospective (USA) macular degeneration human embryonic stem study. cell derived retinal pigmented epithelial cells. MA09-hRPE Advanced cell Transplantation of MA09-hRPE cells in patients with Stargardt's macular Sub-retinal A Phase I/II, open-label, technology stargardt's macular dystrophy dystrophy transplantation of multi-center, prospective (USA) MA09-hRPE study Advanced cell Safety and tolerability of transplantation of hESCStargardt's macular Sub-retinal A PhaseI/II, open-label, technology RPE cells in patients with stargardt's macular dystrophy transplantation of multi-center, prospective (USA) dystrophy MA09-hRPE study CHA Bio and diostech (Korea) CHA Bio and diostech (Korea)
Safety and tolerability of MA09-hRPE cells in patients with stargardt's macular dystrophy
Sub-retinal transplantation of MA09-hRPE Safety and tolerability of transplantation of MA09- Dry age Related macular Sub-retinal hRPE cells in patients with advanced dry age-related degeneration transplantation of macular degeneration (AMD) MA09-hRPE
A Phase I, open-label, prospective study in Korea A Phase I/IIa, open-label, single-center, prospective study in Korea
NCT01691261 2014
Pfizer (UK)
Implantation of human embryonic stem cell derived Age related macular retinal pigment epithelium in subjects with acute wet degeneration age related macular degeneration and recent rapid vision decline
Implantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium
Phase 1, open-label, safety and feasibility study in United Kingdom.
NCT02057900 2013
Assistance publique hôpitaux de Paris
Transplantation of human embryonic stem cellderived progenitors in severe heart failure (ESCORT)
Ischemic heart disease
Human embryonic stem cell-derived CD15+ Isl-1+ progenitors
Phase 1, open-label, feasibility and safety study in France
NCT02122159 2014
University of Research with retinal cells derived from embryonic California, Los stem cells for myopic macular degeneration Angeles
Myopic macular degeneration
MA09-hRPE cellular therapy
A Phase I/II, Open-label, prospective study to determine the safety and tolerability in United States
NCT01674829 2012
Stargardt's macular dystrophy
Fetální kmenové buňky
Neurální kmenové buňky
Tkáňově specifické multipotentní buňky Fetální a dospělý CNS Definovány jako buňky schopné sebeobnovy a diferenciace v neurony, astrocyty a oligodendrocyty
Fetální kmenové buňky Fetální tkáně získané přímo z potratů bude vždy nedostatek, proto se biotechnologické společnosti (Neuralstem, ReNeuron, Advanced Cell Technologies, Phenocell) soustřeďují na vytvoření a využití buněčných linií derivovaných z fetální tkáně nebo z iPS buněk. iPS-NPs Korová nebo krční oblast 10týdenního lidského fétu
4-hydroxy tamoxifenem indukovaný cMyc (cMycERTAM)
CTX03E03
Fetální plicní fibroblasty iMR90
Oct4, SOX2, Nanog a LIN28
Noggin, SB431542, bFGF a hBDNF
SPC-01,
Cocks et al., Stem Cell Therapy & Res, 2013
Polentes et al., Cell Transplantation, 2012
ReNeuron
StemCells
Velká Británie
Švýcarsko
Studie PISCES (Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke) Pacienti muži po iktu > 60let, 6 měsíců – 5 let po iktu 12 pacientů, postupné zvyšování dávky 2,4,10, 20 mil) produktu ReN001 (CTX) do oblasti iktu, 05/2014 report o 11 pacientech po ročním sledování bez imunosuprese Fáze II v 10 UK centrech pro 41 pacientů 8-12 týdnů po iktu (červen 2014)
Spinal Cord Injury Clinical Trial
Pacienti s míšní lézí 3-12 měsíců po úraze HuCNS-SC buňky z mozku aplikace přímo do míchy imunosuprese
Neuralstem
Lidské spinální kmenové buňky izolované z krční míchy 8 týdnů starého lidského fétu
Preklinické studie na prasetech (testováno podání a počet buněk
Ideálně 30 000 b v objemu 6-8ul
Neuralstem USA
Studie ALS
Studie Míšní poranění (srpen 2014)
3 Pacienti s ALS 20 injekcí po 400 000 b do cervikální a lumbální oblasti
8 pacientů, 5 let sledování
1 pacient vykazuje mírné zlepšení
1-2 roky po úrazu
léze na úrovni TH2-TH12
2 pacienti setrvalý stav 3 roky po podání buněk
Buňky NSI566 izolované z lidského 8 týdenního plodu.
Fetální kmenové buňky v terapii Clinical Trials.gov Start (yr) Sponsor
Title
Interventions
Cell source
NCT 01013194
2007
The Mediterranean Institute
Human fetal liver cell Transplantation in chronic Human fetal liver cell liver failure transplantation
NCT 01151124
2010
ReNeuron Limited. (UK)
Pilot Investigation of Stem Cells in Stroke
Surgical delivery of a neural stem CTX0E03 neural stem 1 cell line to the brain cells
NCT 01321333
2011
StemCells, Inc. (USA)
Study of HuCNS-SC in patients with thoracic spinal cord injury
Intramedullary spinal cord HuCNS-SC cells (Human transplantation of human CNS stem Central Nervous System cells Stem Cells)
NCT 01348451
2009
Neuralstem Inc. (USA)
Human neural stem cell Transplantation for the Surgical implantation of human Treatment of amyotrophic lateral sclerosis neural stem cells
Human spinal cord derived neural stem cells
NCT 01632527
2012
StemCells, Inc. (USA)
Study of HuCNS-SC in age-related macular degeneration
Transplanting HuCNS-SC cells directly into the subretinal space
HuCNS-SC cells
NCT 01640067
2011
Azienda Ospedaliera Santa Maria
Human neural stem cell Transplantation in Amyotrophic Lateral Sclerosis
Surgical microinjection of human neural stem cells
Human foetal neural stem cells
NCT 01730716
2013
Neuralstem Inc. (USA)
Dose escalation and safety study of neural stem Human spinal cord stem cell cell transplantation for the treatment of implantation amyotrophic lateral sclerosis
NCT 01772810
2014
Neuralstem Inc. (USA)
Safety study of human spinal cord-derived Human Spinal Cord-derived Neural Human spinal cord derived neural stem cell transplantation for the treatment Stem Cell Transplantation neural stem cells of Chronic SCI
NCT 01860794
2013
Bundang CHA Hospital Evaluation of safety and tolerability of fetal mesencephalic dopamine neuronal precursor cells for Parkinson's disease
Transplantation of fetal Fetal mesencephalic mesencephalic dopamine neuronal dopamine neuronal precursor cells precursor cells
NCT01898390
2012
University of Cambridge TRANSEURO open label transplant study in (UK) Parkinson's disease
Neural allo-transplantation with fetal ventral mesencephalic tissue
Fetal liver cells derived
Human spinal cord derived neural stem cells
Fetal ventral mesencephalic tissue
Buňky pupečníkové krve alogenní Odběr na porodním sále po
porodu a odstřižení dítěte, před porodem placenty Omezené množství Převážně pro transplantace dětských pacientů Uchování v BPK Méně imunogenní, příjemce nemusí mít úplnou HLA schodu U dospělých se může použít 2 nepříbuzných graftů Snaha o expanzi in vitro Zdroj různých typů progenitorových buněk
Buňky pupečníku
pupečníková žíla
Pupečníkové tepny
Pupečník je extra-embryonální orgán tvořený dvěma arteriemi a jednou žílou, které jsou obklopeny mukózní tkání – matrix (Wharton‘s jelly, WJ). WJ je želatinová tkáň tvořena myofibroblastům podobnými stromálními buňkami, kolagenními vlákny a proteoglykany WJ je jedním z nejdostupnějších zdrojů kmenových buněk – a to jak technicky tak eticky, mohou být získávány neinvazivně
Somatické kmenové buňky z dospělých jedinců • • • • • • • • • •
Mozek Kostní dřeň, periferní krev, cévy Tuková tkáň Kosterní svalstvo, Kožní epitel Trávicí trakt Rohovka, sítnice Dentální pulpa Játra Slinivka
Kmenové buňky z dospělého organizmu
Leri, Kajstura, Anversa, Physiol. Rev., 2005
Definice multipotentních Mesenchymových stromálních buněk ( MSC) Adherentní (CFU-F)
Připomínají fibroblasty Pozitivní na adhezní molekuly CD73, CD 90, CD105 Negativní na hematopoietické markery CD14 nebo 11a, CD 34 and CD 45, CD 19, HLA- II Schopnost diferenciace do osteo, adipo and chondrogeního fenotypu ( Dominici et al ,Cytotherapy, 2006)
Proč právě MSCs? Možné mechanismy, jak mohou transplantované MSC zlepšit regeneraci tkáně příjemce: •
MSCs jsou hypoimunogenní, nevyvolávají imunitní odpověď po allogenní transplantaci
•
Ovlivňují zrání dendritických buněk a modulují reakci T buněk
•
Uvolňují rozpustné látky, které navozují immunosupresivní prostředí
•
Produkují Galectin-1, který moduluje produkci cytokinů, potlačuje autoimunitní odpověď, inhibuje akutní a chronický zánět a produkci ECM.
•
MSCs se používají v léčbě akutní GVHD.
•
Mají neuroprotektivní účinek, brání rozvinují léze
Machová et al., 2014, BioMedical Engineering OnLine
Podání MSC zlepšuje mikrostrukturu šlachy
Využití MSC v léčbě obratlového defektu a fůze obratlů
mCT of vertebrae with defect
Impl. CEM-OSTETIC + MSCs
Vaněček et al. Eur Spine J 2012
Klíma et al. Physiol Res 2015
Lidské MSC modulují zánětlivou reakci po míšním poranění 10 days
28 days
14 days
Machová Urzíková et al. IJMS 2014
Běžící klinické studie s MSC z kostní dřeně
Klinické studie v ortopedii
Poté
Osteoindukce ve fúzi obratlů Kalcium trifosfát + MSCs Před
Poté
Revize totální endoprotézy kyčelního kloubu pomocí kalcium trifosfátu a autologních MSC
Klinická aplikace KB u diabetické nohy Jehlou 26G, do hloubky 2-3 cm, vpichy á 1-2ml, celkem cca 40 vpichů
Jirkovská, et al IKEM
KB v klinických studiích • Revaskularizace ischemických dolních končetin • Amyotrofická laterální skleróza • Iktus • Chrupavka a kost • Srdeční sval • Autoimunitní onemocnění • GVHD • Parkinsonova choroba • Míšní poranění
Transplantace diferencovaných buněk • • • • •
Léčba diabetu Léčba ischemických končetin a vředů Léčba popálenin Léčba chrupavek Léčba myokardu
Tkáňové inženýrství • „ Je interdisciplinární obor, který spojuje a aplikuje pojmy materiálového výzkumu a biologických věd s cílem vytvořit strukturální a funkční náhrady tkání“ (Langer & Vacanti)
Principy tkáňového inženýrství Odběr buněk Izolace buněk
Kultivace, proliferace Příprava nosiče (scaffoldu),
Osazení buňkami (3D buněčný konstrukt) Implantace scaffoldu Integrace scaffoldu a obnovení funkce tkáně
Chrupavka - historie • Implantát připraven z PLLA/PGA vláken s autologními chondrocyty • Kultivován in vivo na athymické myši • Při pokusu využít jej u lidí selhal
Chrupavka
Perioperační foto Chondrograft (chondrocyty ve fibrinovém lepidle) Vyrůstání buněk z chondrograftu Adler et al.
Kůže - Apligraf
Kůže –keratinocyty na pHEMA
Biomateriály jako nosiče buněk
Buňky
+
Biomateriály HEMA
Přemostění chronické léze Kompresní léze
posttraumatická kavita 5 neděl po indukci léze
Implantace hydrogelu Přemostění léze
Chronic SCI repair with HPMA-RGD hydrogel and MSCs Control
HE
1mm
Implanted hydrogel
3,5
1mm 3
NF160-p75
2,5 2 1,5 1 0,5 0 SCI
SCI+Hydrogel
SCI+Hydrogel+MSCs
RECA/GFP
Přírodní hydrogely na bázi ECM •
Napodobují extracelulární matrix (kolageny, fibronektin, laminin, proteoglykany)
•
Tkáňově specifické– homologní tkáň
•
Biologická aktivita – zbytkové růstové faktory
•
Injikovatelné – in situ polymerizace
•
Degradabilní Decelularizace: Prasečí míšní tkáně(SCM) Prasečí mozkové tkáně(BM) Prasečího mozkového měchýře (UBM) Lidské pupečníkové tkáně SCM
BM
Medberry,… Badylak et al., Biomaterials 34, 2013, 1033-
UBM
In vitro charakteristika ECM hydrogelů Decelularizovaná m.t.
H&E
Mozková tkáň
ECM
sGAG ug/mg
Collagen ug/mg
mícha
1.7
26.5
mozek
3.3
26.6
Močový měchýř
2.0
38.7
4h po osetí
24h po osetí
UBM
MSCs 5 dní ve 2D kultuře
50 mm
50 mm
z MSCs 4 dny v 3D kultuře
x
3D kultura phalloidin/DAPI
ECM hydrogely injikované do míšní hemisekce Neurofilamenta – NF160
Růst axonů v lézi SCM
2 týdny
UBM
500mm
500mm
SCM
4 týdny
Růst neurofilament v lézi 25
control
20
UBM
SC
area (%)
500mm
8 týdnů
SCM
15
10
5
0 500mm
50mm
2weeks
4weeks
8weeks
Budoucnost buněčné terapie • Musíme vypěstovat vhodné buňky pro klinické užití a v dostatečném množství. • Takové buňky musí zůstat tak stabilní, aby stále generovaly dostatečné množství požadovaných buněk, nebo aby produkovaly faktory podporující regeneraci, diferenciaci nebo neurogenesi. • Buňky po přenosu nesmějí vytvářet nádory, nebo vést k přenosu jiných onemocnění. • Tyto buňky musí mít i u člověka potenciál napravit anatomické a funkční defekty. • Umělé biomateriály budou sloužit jako nosiče a mosty, nanotechnologie umožní sledovaní buněk i vnášet potřebné látky.
Děkuji Vám za pozornost !
