Risalah Pertemuan Ilmiah Penelilian dan Pengembangan Teknologi IsOIOpdan Radiasi, lax;
PENGUJIAN ISOLA T KLINIK Mycobacterium tuberculosis RESISTEN TERHADAP BEBERAPA ANTIBIOTIKA DENGAN METODE REAKSI BERANTAI POLIMERASE /POLYMERASECHAIN REACTION (PCR) Maria Lina R., Dadang, S., dan F. Suhadi Puslitbang Teknologi Isotop dan Radiasi, Batan, Jakarta
ABSTRAK PENGUJIAN ISOLAT KLINIK Mycobacteriumtuberculosi\'RESISTEN TERHADAP BEBERAPA ANTIBIOTIKA DENGAN METODE REAKSI BERANTAI POLIMERASE I POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Uji PCR menggunakan2 pasangprimer (Pt8 & Pt9 dan Pt3 & Pt6) untuk mendeteksi DNA 9 isolat bakteri M tuberculosisyang resistenterhadapbeberapamacam antibiotika seperti isoniazid, streptomisUl,isoniazid+ streptomisin,danisoniazid+ rifampisin,telah dilakukanTeknik PCR dilakukan untuk mengamplifIkasiDNA basil ekstraksisel 9 isolatM. tuberculosisresistenyang sudahdilisiskan. DNA 8 isolat menunjukkanbasil postifyaitu terdapatnyapita DNA padagel agarosasetelahdiampIifIkasidenganprimer Pt8 & Pt9, sedangkan satu isolat resistenmemberikanbasil negatif(tidak ada pita DNA). AmplifIkasi DNA dengan m,enggunakanprimer Pt3 & Pt6 memberikanbasil positif pada 2 isolat bakteri, sedangkan7 isolat bakteri resistenyang lain memberikanbasil negatif. DNA strain H37Rvyang diamplifikasi denganprimer Pt8 & Pt9 maupunprimer Pt3 & Pt6, juga menunjukkanbasil positif. Ukuran fragmen DNA basil amplifikasi dengan primer Pt8 & Pt9dan primer Pt3 & Pt6masing-masing adalah541dan 188bp.
ABSTRACT PCR (pOLYMERASE CHAIN REACTION) ASSAY ON ANTmIOTICS RESISTANT CLINICAL ISOLATES OF MycobacteriwntuberculosisTo detectthe DNA of 9 drug-resistantisolatesof M. tuberculosis such as isoniazid, streptomycin,isoniazid + streptomycin,and isoniazid + rifampisin- resistant isolates,the DNA amplificationby using PCR assaywas carriedout after lysing the bacterial cells. Two primer pairs for amplification used were Pt8 & Pt9 and Pt3 & Pt6. The amplified DNA target of 8 drug-resistant isolates and I drug-resistantisolate by means Pt8 & Pt9 primer, gave the positive mId negative results, respectively.Presenceof amplified DNA targetfragments!bandson agarosegel, showedthe positive resultsand vice versa.PCR processby using Pt3 & Pt6 primer revealedthe positive results on 2 drug- resistantisolates, whereasthere was no amplified DNA bandsfrom the other 7 isolates.DNA amplificationby using either Pt8 & Pt9 or Pt3 & Pt6 primersoccuredon H37RvstrainDNA. Size of the amplified DNA productswith Pt8 & Pt9 and Pt3 & Pt6 primerswere 541bp and 188 bp,respectively.
PENDAHULUAN Saat ini peningkatan kasus tuberkulosis suatu penyakit infeksi disebabkan bakteri Mycobacterium tuberculo,s'is sejalan denga11 peningkatan kasus tuberkulosis yang resisten terlladap a11tibiotika (obat anti tuberkulosis = oat) klmsusnya di negara berkembang temasuk Indonesia. Para peneliti memperkirakan :t 50 juta orang terinfeksi strain M tuberculosis yang resisten terlladap paling tidak satu macam oat (NCCR, Mei 1998), Mini-epiderni penyakit tuberkulosis / tbc disebabkan strain yang resisten oat ganda pemah dilaporkan terjadi di Amerika Serikat dan penyembuhan kasus tersebut dengan pengobatan terbaik l1anya mencapai 20 -40 % , (1). Di Medan pemah dilakukan penelitian yang menyatakan 96 % penderita mengandung kuman TB resisten terlladap satu atau lebih daTi 4 rll.,1Cam obat .yaitu etambutol, rifampisin, isoniazid, da11 streptornisin (2). Kegagala11 prograrn pengendalian penyakit tbc antara lain disebabkan kegagalan terapi kasus tuberkulosis yang resisten terlladap oat disamping kelemahan dalam diagnostik (3,4), Penderita yang telah menerima pengobatan tetapi gagal merespon obat
tersebut, masih dapat menularkan ke penderita lain ataupunke orangyang sedangdalamterapi. Resistensiterhadapantibiotika (oat) sepertiINH/ isoniazid, streptomisin,etambutol,rifampisin, dll dapat disebabkanoleh beberapalml, antara lain pengobatan yang tidak adekwat,ketidak patuhanberobat,pemakaian obat tunggal pada penderita tbc. Timbulnya resistensi terhadapoat pada M tuberculosis disebabkanmutasi randompada kromosombakteri. Prosesmutasi tersebut terjadi secaraspontanpada strain liar, bahkanterjadinya sebelumkODiakdenganobat(3). Sifat resistensiini juga disebabkankarenaadanya mutasi gen yang menyandi protein alan enzim tertentu dalam bakteri tersebut, misalnyaterjadinya reistensiterhadaprifampisin karena mutasi gen rpo/3yang menyandi RNA polimerase sub unit /3(5). Penggunaanmetode PCR (Polymerase Chain Reaction) untuk mendeteksi M tuberculosis telah banyak dikembangkandaD diaplikasikan (6). Sekwens DNA targetyang diamplifikasi dapat dianalisis dengan elektroforesisgel agarosa.Nmnun penggunaanpelacak DNA spesifikyang dilabel antaralain denganradioisotop r2 P) untuk menghibridisasiproduk amplifikasi tersebut 69
Risalah Pertemvan Ilm/3h Penel/lian dan Pengwbangan Teknologi Isolop dan Radiasi. 2{XJO
temyata iebii. sensitif dal. sp":sifik (7,3). Penguji&n dengan kultur pada 11 spesimen penderita tbc menunjukkan basil negatif sedangkan setelah diuji dengan PCR yang dilanjutkan dengan uji hibridisasi menggunakan pelacak yang dilabel dengall 32 P, 9
tuberculvsls kompieks, masing-rnasiI'g pada pasangan basa 105 sampai 124 dan 626 sampm 645 (10). Primer 2 merupakan pasangan primer Pt3 (5'GAACGGCTGATGACCAAACf-3') dan Pt6 (5'ACGT AGGCGAACCCTGCCCA-3'), masing-lnasing spesimen daTi jmnlah tersebut menunjukkan basil positif(8). terletak pacta pasangan basa 664 sampm 683 dan 832 sampai 851 daTi IS 986 (7). DNA sampel sebanyak 100 Penelitian telall dilakukan Ulltuk mengetallui ng (10~) ditmnballkan ke dalam cmnpurnn reaksi PCR apakall metode PCR juga dapat digunakan untuk (40j.ll) untuk tiap satu reaksi. Sebagai kontrol positif mendeteksi isolat M tuberculosis yang resisten terhadap digunakan DNA M. tuberculosis H37Rv. Campuran antibiotika (obat anti tuberkulosis). reaksi PCR terdiri daTi komponen-komponen seperti penelitian terdahulu (9) yaitu biller reaksi (10rnM TrisHCl + 50rnM KCl), 2,0 rnM MgCI2, 0,01 % gelatin, BAHAN DAN TATA KERJA dNTP (dATP,dCTP,dGTP,dTTP) rnasing-masing 0,2j.lM, primer Pt8 & Pt9 rnasing-rnasing 0,2j.lM, daD I Unit Taq .S'train Bakteri. Dalam penelitian ini digw1akan 9 polimerase. Penggunaan primer Pt3 & Pt9 masingbuah strain bakteri M. tuberculosis resisten terhadap masing 0,4j.lM dan Taq polimerase yang ditambahkan beberapa antibiotika berasal dari penderita tuberkuIosis adalah 2,5 Unit (7). Amplifikasi dilakukan dalam DNA yang diperoleh dari rumah sakit Persa11abatan.Strain thermocycler (perkin-Elmer) dengan tahap denaturasi yang resisten terhadap isoniazid / INH berjumlah 4 selama 1,5 menit pacta suhu 94°C, tahap annealing pacta sampel (isolat I a, I b, I c, I d), resisten streptomisin satu suhu 65°C selarna 2 menit dan tahap extension 3 menit, sampel (isolat S), resisten isoniazid + streptomisin satu suhu72°C. Banyaknya siklus yang digunakan 40 siklus. sampel (isolat I + S), dan resisten isoniazid + rifampisin Teknik Elektroforesis Gel Agarosa. Teknik ini 3 sampel (isolat IR.I, IR.2, IR.3). Metode untuk digunakan untuk mendeteksi DNA basil amplifikasi. menentukan resistensi yang digunakan adalah modified Produk PCR setelah ditambah dengan loading buffer absolute concentration (konsentrasi absolut yang dilnasukkan ke dalam sumur gel agarosa. Hae III 0X174 dimodifikasi). Strain bakteri resisten tersebut kemudian yang diencerkan daD juga ditambah dengan loading ditmnbuhkan dalmn medimn Lowenstein Jensen, SuI1U buffer dirnasukkanjuga ke dalam sumur tersebut sebagai c./37°C selanla :t I bulml. penanda ukuran molekul DNA (marker). Elektroforesis Persiapan DNA Bakteri .DNA yang dipersiapkan dilakukan selarna :t 1 jam dengan voltase 100V dalam untuk proses PCR dilakukan dengan metode fenollarutan biller THE (Tris-Borat-EDT A). kloroform sesuai dengan penelitian terdalluIu (9). Secara Visualisasi DNA. DNA 113sil amplifikasi yang singkat dapat dijelaskan sebagai berikut, DNA diisolasi telah dielektroforesis divisualisasi dengan mewamm dari kuIt11f bakteri dalmn medium agar miring DNA dalam gel menggunakan larutao etidium bromida. Lowenstein Jensen. Sel bakterr dari agar miring dibuat Dengan menggunakan UV transilluminator, pita DNA suspensi dengan menambal1kcw larutan NaCI 0,9 %, akan terlibat daD dapat diketahui ukurannya berdasarkan dipanaskan pada SuI1U 90°C untuk mematikan sel. penanda ukurnn molekul yang dinyatakan dengan base Suspensi disentriftlgasi, dicuci, dan dibuat pelet. relet pair (bp). bakteri diresuspensikan dengan biller TE (Tris-EDT N Ethylene Diamine Tetra Acetic) ditaInbah dengan lisosim, proteinase-K dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) untuk melisiskan sel. Larutan fenol-kloroformisoamilalkohol (24 : I) kemudian ditambal1kan dengan volume smna, disentrifugasi, dan diperoleh rase air yang mengandlmg DNA. DNA diendapkan dengan menambal1kcw larutan NaC.\ 5M dan etanol absolut dingin (-20°C). relet DNA didapatkan dengan
mensentrifugasi suspensi tersebut dengan kecepatan 13.000 rpm, SuI1U-10°C. Penentuan Kon.~entrasi don Tingkat Kemurnian DNA. relet DNA disuspensikan dengan biller TE pH 8,0. Suspensi DNA tersebut dibuat pengenceran, kemudian ditentukan konsentrasi dan kemurnian DNA basil ekstraksi, dengan menggulli'lkan spektrofotometer padc1 A (panjang gelombang) 260 run dan 280 nm. Amplifikasi DNA. DNA M. tuberculosis resisten antibiotika diamplifikasi dengan teknik PCR menggunakan 2 nlacam primer. Primer I adalah pasangan primer Pt8 (5' GTGCGGA TGGTCGCAGAGA T -3') dan Pt9 (CTGGATGCCCTCACGGTTCA-3') yang terletak dalam sekwens sisipan (IS6110) genom bakteri M
70
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil ekstraksi DNA isolat M tuberculosis resisten terbadap beberapa antibiotika dapat dilibat pada Tabel I. Konsentrasi DNA dari 9 strain bakteri tersebut bervariasi yaitu berkisar antara 109,5 -556,5 fig/Ill. Hal ini disebabkan tingkat pertumbuhan strain-strain tersebut berbeda, sehingga mempengaruhi jumlah DNA yang diekstraksi. Nilai rasio (I.. 260nm / 1..280nm) yang menunjukkan tingkat kemurnian DNA basil ekstraksi 9 strain bakteri tersebut juga bervariasi antara 1,27 -1,50. Nilai rasio 1,8 -1,9 menunjukkan kemurnian DNA basil ekstraksi (10). Hasil ekstraksi DNA dalam penelitian ini mempunyai nilai rasio di bawah 1,8 menununjukkan adanya kontaminasi dengan protein (II). Kontaminasi tersebut kemungkinan daTi protein medium pertumbuhan
yang tercampur pada saat penyediaan suspensi sel bakteri. Kontaminasi protein daTi medium kecil kemungkinannya apabila menggunakan medium cair untuk penyediaan suspensi bakteri. KOLK, dkk (10) menggunakan juga kultur cair M tuberculosis dalam media cair Sauton, Middlebrook 7HII atau Tween
RiSillah Pertemuan
Ilmiah Penell~ian dan pengembangan
Teknologi
Isolop
dan Radias~ ZOOO
albumin lmulk ekstraksi DNAnya dan memberikan tingkat kemurnian yang baik. Namun. Imsil pcnclitian terdahulu (12) dengan menggunakan medium padat yang sarna dengan penelitian ini, menunjukkan tingkat kemumian DNA Ai. tuberculosi.s-H37Rv sebagai strain standar cukup baik (nilai rasio 260 mn/ 280 nm = 1,9). Pernbalmn pada sel bakteri yang resisteD terbadap antibiotika, mungkin juga dapat mempengaruiu DNA basil ekstraksinya. Menurut MORRIS (5) M. tuberculosis resisteD streptomisin mengalalni pernbalmn pada
ribosomal S 12 dan gen rrs yang menyandi 16rRNA, terdapatpada j: 80 % strain M tuberculosis resisten streptomisin.(16). Strain resisten rifampisin (:t 95%) mengalamimutasi pada daerah spesifik dari gen rpop yang menyandi RNA polimerase sub unit P (17). Mekanismeutarnaresistensiobat anti tuberkolosisganda adalahakumulasiperubahandalam gen yang menyandi sasaranobat dalam sel (5). Dalam penelitian ini, lokasi sekwensDNA targetdenganmenggunakanprimer Pt8 & Pt9 maupun Pt3 & Pt6 adalah pada sekwens sisipan selubung illuding selnya yang menyebabkan (IS6110& IS986)dari genomM tuberculosis. Jaditidak penneabilitasnya menunm, kemungkilmn akan pada gen yang menyandi sasaranobat dalam genom mempengarnlli ekstraksi pada DNA nya. tersebut. Namun, DNA beberapa isolat tidak dapat Hasil amplifikasi DNA 9 isolat strain M diamplifikasi seperti satu isolat resistenisoniazid + tuberculosis resisten terbadap beberapa antibiotika rifampisindenganmenggunakanprimer Pt8 & Pt9 dan 7 menggunakan primer Pt8 & Pt9 yang dianalisis dengan isolat denganmenggunakanprimer Pt3 & Pt6. Hal ini teknik elektroforesis gel agarosa, dapat dilihat pada mungkin disebabkanadanya mekanisme resistensilain Gambar 1 dan 2. Dari gambar tersebut dapat dilihat 8 dalam genombakteriyang resisteDtersebut.Berdasarkan isolat dari 9 isolat resisteD antibiotika,menunjukkan basil penelitian MORRIS (5), gen rrs dan rpsL pada 27 % positif demikian juga strain H37Rv. Adanya fragmen/pita isolat resisteD streptomisin, tidak mengalami mutasi DNA pada gel agarosa dari 4 isolat resisteD isoniazid demikianjuta 17 isolat resisteDisoniazid daTi 42 isolat (Gambar 1 lajur 3, 5, 8, daD Gambar 2, lajur 2 ), saul tidak mengalamiperubahanpadagenkatG atauinhA. isolat resisteD streptomisin dan I isolat resisteD isoniazid Apabila dibandingkan uji PCR menggunakan + streptomisin IMsing-masing pada Gambar 2 lajur 3 daD primer Pt8 & Pt9 dan PtJ & Pt6, temyata primer Pt8 & lajur 6, menlmjukk.:wlmsil positif. DNA 2 isolat bakteri Pt9 lebih sensitif. SekwensDNA sasaranuntuk primer resisteD isoniazid + rifampisin yang diamplifikasi dengan Pt8 & Pt9 kemungkinan terdapat lebih banyak dalam pasangan primer tersebut, juga menunjukkan Imsil positif genom isolate yang digunakan dalam penelitian ini, (Gambar I, lajur 4 dan 7). Junllah DNA isolat dan strain daripadasekwensuntuk Pt3 & Pt6. Penggunaanprimer H37Rv yang diamplifikasi masing-masing adalah 100 ng Pt3 & Pt6 akan lebih sensitif daD spesifik untuk deteksi daD 10 ng. Fragmen DNA tersebut mempunyai ukuran M. tuberculosisapabila digunakan sebagaiprimer ke 2 541 bp. Pada Gambar 2 lajur 5 juga terlibat Imsil negatif untuk mengamplifikasiDNA basil PCR denganprimer (tidak adanya pita DNA) dari satu isolat resisteD INS1 & INS2 padanestedPCR (7)
isoniazid + rifampisin (IR3). Hal ini mungkin disebabkan adanya pernbahan sekwens DNA pada daeral1/ lokasi sasaran primer Pt8 & Pt9 yang terletak pacta sekwens sisipan (IS 6110) daTi isolat tersebut. Jmnlall kopi IS6110 dalam genom isolat resisten tersebut juga sangat mempengarnhi DNA Imsil mnplifikasi. Beberapa strain bakteri M tuberculosis hanya mempunyai 1 kopi IS61 10 ballkan acta strain yang tidak mempunyai kopi tersebut.. (13). Analisis DNA produk PCR yang dimplifikasi menggunakan primer PtJ & Pt6 diperlibatkan pada Gambar 3 dan 4. Gmnbar tersebut menunjukkan di antara 9 isolat M tuberculo..,is yang resisteD pada antibiotika, Imnya terdap.'lt 2 isolat memberikan Imsil positif yaitu isolat resisteD isoniazid (I.a) daD isolat resisteD isoniazid + rifampisin (IR. I). Fragmen DNA 2 isolat tersebut terdapat pada lajur 3 daD 6 gel agarosa (Gambar 3) DNA strain standar H37Rv Imsil amplifikasi sebagai kontrol positif juga memberikan basil positif. Jumlah DNA isolat dan strain standar masing-nk'lsing adalah lOOng dan lOng. Fragnlen DNA basil amplifikasi menggunakaJl primer Pt3 & Pt6 baik untuk isolat maupun strain standar adalah 188bp. Beberapa peneliti menyatakan resistensi terlmdap obat anti tuberkulosis pada M tuberculosis disebabkan perubahan ataupun mutasi pada gen dalam genom bakteri. Perubaltan pada gen katG yang menyandi katalase-peroksidase atau gen inllA yang mengkode enzim yang terlibat dt'llam biosintesis asam mikolat, menyebabkan terjadinya sifat resistensi terhadap isoniazid (14,15). Mutasi gen rpsl yang menyandi proteiIl
KESIMPULAN Deteksi M. tuberculosis resistent terhadap beberapaantibiotika (obatanti tuberkulosis)denganPCR menggunakanprimer Pt8 & Pt9, lebih sensitif dibanding denganprimer Pt3 & Pt6. Jadi uji PCR dengan primer Pt8 & Pt9 dapat dipakai untuk mengetahui adanya bakteriresisteDtersebut. Uji PCR dengan menggunakan primer yang didisain dari gen yang menyandi protein / enzim yang menjadi sasaran obat anti tuberkulosis (oat), yang dilanjutkan denganteknik biologi molekuler yang lain seperti sekwensing dapat mendeteksi resistensi M. tuberculosisterltadapoat,sehinggadapatdiberikanterapi yangtepat. U CAPAN TERIMA KASIH Penulis mengucapkanterilna kasih kepada Sdr. Almaida, Sdr. Suheni, dan Sdr. Rika Heryani atas bantuan yang diberikan, sehingga penelitian dapat terlaksanadenganbaik.
DAFTARPUSTAKA 1
KOENTJAHJA. Tempi tuberkulosis pada pengidap HIV. Kumpulan Naskah Ilmiah Tuberkulosis 71
14.
Hisalah
Pet1emtJan Ilmiah Penelil/an
dan Pengembangan
Teknologi IsOlop dan Had/asi, 2(xx)
Perhimpunan Dokter Paru Indonesia. Pertemuan Ilmiah Nasional Tuberkulosis, SumSel .Jambi (1997). 2.
AZHAR. T..KELIAT. E.N. Resistensi M tuberculosis terltadap obat anti tuberkulosis pacta penderita tuberkulosis pam yang telah mengalalni pengobatan. Maj. Kedokt. Indon. .4Q (1996) 242 -247.
10. KOLK, A.H.J., KOx, L.F.F., van LEEUWEN. J., and KlliJPER, S. Polymerase chain reaction for the M tuberculosis complex. Laboratory of Tropical Hygiene, Department of Biomedical Research Royal Tropical Institute, AInsterdam, The Netherlands (1995) 1-35. 11. SAMBROK, J., FRITSCH, E.F., and MANIATIS, T. Molecular cloning. A laboratory manual. 2 nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) E.5.
3. WINARIANI,K. Pedomanpenanganantuberkulosis pam dengan reseistensimulti obat (MDR-TB). Kumpulan Naskah Ilmiall Tuberkulosis PerhimpunanDokter ParuIndonesia.Pertemuan Ilrniall Nasional Tuberkulosis,SwnSel -JaJnbi (1997).
4. 5TYBLO,K. Overview and epidemiologic assesment of the current global tuberculosis situation with an emphasis on control in developing countries. Rev. Infect. Dis. II (52) (1989) 339 -346.
5. MORRIS,
S., HAN BAI,G., SUFFYS, P., PORTILLO-GOMEZ, L., FAIRCHOK,M., and ROUSE, D. Molecular mechanismsof multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacteriumtuberculosis.J. Infect. Dis. ill
12. LINA,M.R. Deteksi Mycobacterium tuberculosis denganreaksiberantaipolimerasa/ Polymerase ChainReaction(PCR).TesisMagister. Program Pascasarjana Bidang IImu Kesehatan,Program Studi IImu Biomedik, Kekhususan Mikrobiologi, Universitas Indonesia, Jakarta (1998)32-46. 13. van
SOLINGEN, D., de HAAS, P.E.W., HERMANS, P.W.H., GROENEN,P.M.A., and van EMBDEN, J.D.A. Comparisonof various repetitive DNA elementsas geneticmarkersfor strain differentiation and epidemiology of Mycobacteriumtuberculosis.J. Clin. Microbiol. 1(1993) 1987-1995.
(1995) 954 -960.
6. BEAVIS, K.G., LICHTY, M.B., JUNGKIND, D.L., and GIGER,O. Evaluationof amplicorPCRfor direct detectionof A{vcobacteriumtuberculosis from SputWllspecimen.J. Clin. Microbiol. 11 (1995) 2582-2586. 7. KOLK, A.H.J., SCHUITEMA, A.R.J., KUIJPER,S., van LEEUWEN,J., HERMANS, P. W.M., van EMBDEN, J.D.A., and HARTSKEERL, R.A. Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by using polymerase chain reaction and a nonradioactive detection system. .J. Clin. Microbiol. J.Q10 (1992) 2567 -2575.
8. YAP, S.F., CHEN, Y.C., WONG, P.W., alld SOOHOO, T.S. Application of tIle polymerase chain reaction and moleculer probe technology for tIle diagnosis of tuberculosis. In Radionuclides in Molecular Technology for Diagnosis of Communicable Disese. Tharavanyi, S., and Khusrnith, S. (eds). IAEA- Tec. Doc., Vienna, Austria (!994) 93-96. 9
LINA, M.R., SUDARMONO, P., IBRAHIM, F., daD SOEBANDRIO, A. Deteksi Mycobacterium tubercu/osi.., H37Rv dengan reaksi berantai polimerase (PCR). Maj. Kedokt. Indon. 1
(1999)250-255.
72
ZHANG, Y., HEYM, B., ALLEN, B., YOUNG, D., and COLE, S. The catalase-peroxidase, gene and isoniazid resistance of Mycobacterrium tuberculosis. Nature 328 (1992) 591 -593
15. BANERJEE, A., DUBNAU,E, Quemaid, A., BALASUBRAMANIAN, V., SUN UM, K., WILSON, T., COLLINS, D., de LISTE, G., and JACOBS, Jr. W.R. InhA, a geneencoding a target for isoniazid and ethionamide in Alfycobacteriumtuberculosis. Science. ~ (1994) 227 -230 16. KATASUKAWA, C.; TAMARU, A., MIYATA, Y., ABE, C., MAKINO, M., and SUZUKI, Y.
Characterizationof the rpsL and rrs genesof streptomycin
-resistant clinical
isolates
of
A~ycobacteriumtuberculosis in Japan.J. Appl. Microbiol. ~ (1977) 634 -640. 7. TELENTI, A., IMBODEN, P., MARCHESI, F., LOWRIE, D., COLE, S.T., COLSTON, M.J., MATTER, L., SCHOPFER, K., and BODMER, T. Detection of rifampicinresistance mutants in Mycobacterium tuberculosis.Lancetill (1993) 647 -650
/I'S.11.1h1"'~If!nIU.111 i'mi.1h 1'r"f!"";111
Tabcll.
d1111'f!lIg""l/lill1q.lIllf!Allologi
IsOlop ddll h'd"'~1S'; ?(XX)
Kon~cntra~i dan tin~kat kcmurnian (ra~io ab~orban~i pllda )., 260 nm I )., 2ROnm) DNA basil ckstrak~i isolat AI. tuherculo.\'i.\' rcsi~tcn i~oniazid (I), streptomisin (8), isoniazid + strcptomisin (I+S), dan isoniazid + rifampisin (IR)
Macam Isolaj
(A.260 11m/A.28011m)
Isolat I.a.
144
1.41
lsolall.b
400,5
1.43
150l
IOIJ~
1.30
IsoIat I.d
181,5
1,33
Isolat S
324
1,50
Isolat I + S
121,5
1.40
Isolat JR. I
145,4
1,30
Isolat IR.2
318
1.42
Isolat JR.3
556,5
1,27
34567
Gambar
Ra!iio ab!iorl)al1!ii
Kon!icntra!ii DNA (ng I 1.11)
II
Alluli~is DNA prod uk PCR isolul M. luherculu.~i.~rcsislclI. dclIguII primcr PI8 & 1'19mcIIggullakall
clcktrof()rcsisgcl ugurosu IAljllr
I : Al{II*(~,.0XI74111Iclll
Lujur2:
I)Nt\~lrllillll)71{v
1(llIg
(kontrol +)
Lajur3:
Isolat l.a(IOOng)
l.ujur4: Lajur5:
l~olulll{.I(I()(hlg) Isolull.h(IO(lIlg)
Lajur 6: Kolllrol -(Tanpa DNA) Lajur 7: Isolat IR.2 (1 OOng) Lajur 8: Isolat I.c (I DOng)
23456
,
It
Gumbar 2. Allalisis DNA prouuk PCI~ isolut i\,1. IIlbercltl(J.~isresistel!, uellgm! prilller PIR & PI9 mellggullukm! eleklruloresis gel ugurosu IAljur I: IAljur2: Lajur 3: Lajur 4: 1.lljurS: 1~!ljur6: Lajur 8:
Afllli..,.0XI741111t:111 l~olllll.d(I()()lIg) Isolat S (IOOng) Kontrol -(tanpa DNA) I~olnlll{.3 (!(X)lIg) Isolnll + S (IOOlIg) DNA strain H37Rv lOng (kontrol +)
73
1(,5.11.111 1'l'rll'mu.1l1llml.111
1'l'I1l'ltlh111 d.111I'l'llgl'fllb.1I1gJfI
IrAflo!tJgllsOlop
J4567
.-
all1l':ldl;ISI;
201J0
8
2
Gambar3. Analisis DNA produk PCI{ isolal M. tuberculosisrcsislcn,dcngml primer Pl3 & Pt6 menggunakan eleklro[orcsis gel agarosa
J ..5
6
7
8
Gmnbar4. Arullisis I)NA produk Pl-:!{ isolal M. tllberculosis resisten,dellgml prirnerPt3 & Pt6 rnenggUlillkan elcklro[oresis gel agarosa
Lujur I: Lajur 2: Lajur 3: Lajur 4: I_ujur5:
fv!a,-ker0XI74fluclll Isolat I + S (IOOllg) Isolat l.a (I DOng) Kontrol -(Tanpu DNA) DNAstruinl137RviOng (kontrol +) Lujur 6: Isolulll?.1 (I OOng) Lajur 7: fsolul S (I DOng) 1.lljllrR: Isolull.h(I()(}llg)
Lajur I: Alm:k(!r0XI74IJuclll Lajur 2: DNA struin HJ7Rv IOllg
(koulrm +) Lajur 3: Lajur4: Lajur 5: Lajur 6: Lajur 8:
Koutrol -(tanpa DNA) Isolut l.c(IO(hlg) Isola! Il{.2 ( IOOng) Isola! I.d (I (){)ng) Isola! IR.3 (I ()()ng)
DISKUSI
NAZL Y HILMY
MARIA LINA
Bcrapa lama kcccpalan analisis dcngan PCR dibandingkan dcllgan mclode kollvcnsiollal pada pasicn yang terkontarninasikwnan TB resisten?
DclIgml mctodc kollvCIIsiolla1 uji rcsistClIsi 1\/. tuberculosis: uji pcmbiakrul + liji rcsistensi : 2 -4 bulrul. Dengan metode PCR : dilanjutkan dengrul metode RFLP ataupull sekwensillg : 2 -3 hari.
Ke Daftar Isi 74
