Magas mortalitású tumoros betegségek célzott kezelésére alkalmas biokonjugátumok és moduljaik fejlesztése NVKP_16-1-2016-0036 Mező Gábor MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport
MEDInPROT Konferencia 2017. 04. 22. Budapest
PÁLYÁZATI FELHÍVÁS NEMZETI VERSENYKÉPESSÉGI ÉS KIVÁLÓSÁGI PROGRAM KÓDSZÁM: NVKP_16 „A” alprogram (Kiemelkedő halálozási kockázattal járó betegségek gyógyításának eredményességét lényegesen javító nemzeti program) „B” alprogram (Anyagtudományi, technológia nemzeti program) „C” alprogram (Víz-egészség-élelmiszer nemzeti program)
Miért foglalkozunk a daganatos megbetegedésekkel?
Évente kb. 33000 ember hal meg rákos megbetegedésben Magyarországon; A daganatos betegségekben meghaltak 40 százaléka 65 év alatti; A 65 év alattiak esetében a vezető halálok; Az elmúlt harminc évben közel 30 százalékkal nőtt, miközben az Unió országaiban folyamatosan csökkent;
A tíz leggyakoribb daganatos megbetegedés és leggyakoribb halált okozó rák típus
A rák terápiás kezelései
Sebészeti beavatkozás: Jól hozzáférhető, jól körülhatárolt tumorokra Nem alkalmas: hematológiai tumorokra (leukémia) metasztázisok kezelésére
Sugárkezelés (radioterápia): szilárd tumorok leukémia esetén is
Kemoterápia
cisplatin doxorubicin
5-fluoruracil vinblasztin
metotrexát
kamptotecin
taxol
A kemoterápia mellékhatásai Kemoterápiás szerek: a gyorsan osztódó sejtekre hatnak (tumorsejtek) de hatnak a normális körülmények között gyorsan osztódó sejtekre is és károsítják azokat
pl. csontvelő (vérképző szerv) sejtjei, emésztőszervek hajhagymákat tartalmazó tüsző A kemoterápia legáltalánosabb mellékhatásai: - mieloszuppresszió (vérsejtek képződésének csökkenése) - immunszuppresszió (érzékenység fertőző betegségekre)
- mukozitisz (bél és emésztő rendszer gyulladása, hányás) - alopecia (foltos hajhullás) Egyedi toxikus hatások: kardiotoxicitás, veseelégtelenség, ödémásodás, májfunkció zavarai, terratogén (magzat károsító) hatás
A terápia fokozott szelektivitásának lehetősége az egészséges sejtek és a tumorsejtek különbségén alapul Néhány különbség az egészséges és tumorsejtek, szövetek között: Sejtfelszíni (pl. tumorspecifikus vagy túltermelődött receptor) egészséges sejt
tumorsejt
Sejtbeni (pl. enzimek, egyéb fehérjék eltérő mennyiségben, minőségben)
katepszin B
mátrix metallopeptidáz 9 (MMP9)
Lokalizálható „szilárd” tumorok (pl. újonnan kialakult vérerek)
Gélelektroforézis – Western Blot fehérje analízis
Műszerpályázat
HT-29 vastagbél tumorsejteken a GnRH-III kezelés nem befolyásolja szignifikánsan az EGFR szintet.
Monoklonális antitestek terápiás alkalmazása Új erek képződésének feltétele: VEGF (vaszkuláris endoteliális növekedési faktor) kötődése receptorához (VEGF-R) Új erek képződésének gátlása: VEGF mennyiségének csökkentése a receptorhoz kötődés megakadályozása
bevacizumab (Avastin®) - monoklonális VEGF antitest - angiogenezis gátlása
Regisztrált molekulárisan irányított szerek Név
Típus
Támadáspont
Indikáció
Alemtuzumab
Monoclonal antibody, humanized Monoclonal IgG1, chimeric
CD52
CLL, CML
IL-2 R
rák, leukemia
Monoclonal IgG1, chimeric
IL-2 R
Monoclonal IgG1, chimeric
CD20
rák, lymphoma
Monoclonal IgG1, humanized
HER2/neu
Monoclonal IgG4, humanized
CD33
emlő-, prosztatarák, NSCLC rák, leukemia
Ibritumomab (Y90) Monoclonal IgG1, murine
CD20
rák, lymphoma
Edrecolomab Gefitinib Imatinib
EpCAM EGFR TK TK
CRC NSCLC GIST, CML
(Mabcampath)
Daclizumab (Zenapax)
Basiliximab (Simulect)
Rituximab (Rituxan/Mabthera)
Trastuzumab (Herceptin)
Gemtuzumab
Calicheamicinnel konjugált
Monoclonal IgG2, murine EGFR-TKI KIT-TKI
Gonadotropin Releasing Hormon - GnRH
Andrew Victor Schally
Roger Guillemin
1977-ben megosztott orvosi Nobel Díj
"for their discoveries concerning the peptide hormone production of the brain"
Human GnRH-I (LH-RH): Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 165000 disznó hipotalamuszából kivonva és tisztítva: 800 mg
A Gonadotropin Releasing Hormon szerepe Peptide hormon, hipotalamuszban termelődik és pulzálva kiválasztódik A reprodukciót kontrollálja, a hipofízisben lévő gonadotróp sejtek stimulálása útján A gonadotropin hormonok termelődésének és kiválasztásának stimulálása - luteinizáló hormon (LH) (sárgatest hormon) heterodimer glikoprotein (92 + 121 aminosav) - follikulusz stimuláló hormon (FSH) heterodimer glikoprotein (92 + 118 aminosav)
tesztoszteron
ösztrogén
Szex-szteroidok
Hormonfüggő tumorok kialakulásában fontos szerepük van
Férfiaknál tesztoszteron
Agonista és antagonista peptidek alkalmazása a tumorterápiában Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 Agonista: [D-Lys6]-GnRH-I
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 X
Antagonista: Cetrorelix
Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 Nal: 2-naftilalanin Cpa: p-klór-fenilalanin
nem természetes aminosavak
Pal: 2-piridilalanin Cit: citrulin
A
B GnRH antagonista
szérum hormon szint
szérum hormon szint
GnRH agonista
10
20
nap
A szérum hormon szint csökkentése a kasztrációs szint alá (kémiai kasztráció) 4
8
12
24
óra
Tumorspecifikus célbajuttatás GnRH (LHRH) receptoron keresztül
GnRH receptorok tumorsejteken: > 50% emlődaganat ~ 100% melanoma > 70% petefészekrák > 90% prosztatarák > 75% méhtestrák > 80% vesedaganat
> 40% agytumor > 90% non-Hodgkin limfóma tartalmaz GnRH receptorokat.
GPCR GnRH receptorok megtalálhatók egészséges szövetekben is, különösen a szaporító szervekben, de sokkal kisebb mértékben, mint a tumorsejteken.
GnRH receptorok a tumorsejteken GnRH-II
GnRH-I A GnRH peptidek hatása a tumorsejteken egy bonyolult folyamat
Számos tumorsejten nagy mennyiségben Egészséges sejteken nem vagy csak kis mennyiségben fordul elő
GnRH-R Gai
RPTK P GRB2 PTP
p38
SOS
JNK
RAS PI3K RAF
AP-1
c-Jun
P EGFR
AKT
MAPK Sejt osztódás
c-fos
P
MAPKK
TCF
P
P
Célzott tumorterápia: szelektív hatóanyag célba juttatás irányító molekulákkal
konjugált hatóanyag szabad hatóanyag
konjugált hatóanyag összekötő
összekötő
receptor-közvetített endocitózis
irányító molekula
irányító molekula receptor
hatás helye vezikula
szabad hatóanyag
lizoszóma hatás helye endoszóma
tumorsejt
Mező G, Manea M. Expert Opinion on Drug Delivery 7, 79-96 (2010)
egészséges sejt
Antibody Drug Conjugates (ADCs) Adcetris (Seattle Genetics, Bothell, WA) brentuximab vedotin
antimitotikus hatású (tengeri kagylóból izolálták)
Antibody Drug Conjugates (ADCs) Kadcyla (Genentech, South San Francisco, CA) Mertansine (emtansine, tubulin inhibítor) Trastuzumab (HER2 receptor ellenanyag)
DM1/Mab ~ 3,5
DM1 4-(maleimidylmethyl) cyclohexane-1-carboxylate
Doxorubicin-[D-Lys6]-GnRH-I (AEZS-108, AN-152) Zoptarelin doxorubicin (AEterna Zentaris Inc.) [D-Lys6]-GnRH-I
Doxorubicin
[D-Lys6]-GnRH-I egy GnRH-I agonist analog
Észter-kötéssel kapcsolják a Doxorubicinhez Klinikai Fázis II-ben vizsgálják, emlő, petefészek és méh daganatokra Észter-kötés gyors lebomlása humán szérumban (t1/2 ~ 2 óra) karboxil-észterázok hatására
GnRH-III a nagy tengeri ingolából izolált GnRH analog
GnRH-I: Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 GnRH-III: Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2 A GnRH receptor(ok)hoz kötődik a tumor sejteken 500 – 1000-szor kisebb az endokrin hatása emlősökön, mint a humán GnRH-I Tumorellenes hatását kimutatták emlő, prosztata, méh, hasnyálmirigy, vastagbél daganat sejeteken
GnRH-III: Hatásos szállító molekula lehet az irányított tumorterápiában
Daunorubicin-GnRH-III konjugátumok tervezése Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2
GnRH-III:
eNH 2
a Lys8 e-aminocsoportja felhasználható konjugálásra a Lys8 bázikus oldalláncának módosítása nem eredményezi a receptor kötődés és az antiproliferatív hatás elvesztését, de tovább csökken a hormon hatása Daunorubicin (Daunomicin) antraciklin antibiotikum, a rák gyógyításában alkalmazott szer (e.g., leukémia, neuroblastoma)
kemoszelektív ligáció: oxim-, hidrazon-kötés
DNA interkaláció; topoizomeráz II inhibitor O
O
OH
CH3 OH
CH3O
O
OH
O
amid-kötés NH2
O
OH
Toxikus mellékhatások: - emésztőrendszer, vese, máj, bőr toxicitás, stb. - immunszupresszió, mieloszupresszió
- kardiotoxicitás
CH3
Kovács M., et al. Peptides 28, 821-829 (2007)
Mező, G., Manea M.: Prot. Pept. Lett. 24, 479-488 (2013)
Az oxim-kötést tartalmazó Dau-GnRH-III konjugátumok lebomlása Katepszin B enzim hatására Szabó, I., et al. Bioconjug. Chem., 20, 656-665 (2009)
Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2 O
H-Lys-OH
N-O-CH2-CO-
OH
O
N-O-CH2-CO-
OH
OH
CH3O
O
OH
O
OH NH2
O
CH3O
O
OH
O
OH
NH2 O CH3
OH
CH3
Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2 O
N-O-CH2-CO-Gly-Phe-Leu-Gly-
OH
O
N-O-CH2-CO-Gly-OH
OH
OH
OH
CH3O
O
OH
O
CH3O
NH2
O
OH
O
NH2 O
O
OH
OH CH3
CH3
Citosztatikus hatás (IC50 mM) MCF-7 (humán emlő): HT-29 (humán vastagbél):
7,8 ± 2,1 17,9 ± 4,0
MCF-7 (humán emlő): HT-29 (humán vastagbél):
3,9 ± 1,2 22,5 ± 1,7
Daunorubicin és daunorubicint tartalmazó metabolitok kötődése csirke eritrocita DNS-hez Anyag
K (x 105) (M-1)
n
Dau
11,70
2,5
Dau=Aoa-OH
2,21
3,8
H-Lys(Dau=Aoa)-OH
6,80
3,0
Dau=Aoa-Gly-OH
6,74
3,5
Dau=Aoa-Arg-OH
6,78
3,2
Dau=Aoa-Tyr-OH
4,40
3,5
Dau=Aoa-Leu-OH
3,23
3,6
GnRH-III(Dau=Aoa)
0,83
4,2
K: kötődési állandó; n: kizárási paraméter
Dau – COOH közelsége gátolja a kötődést Bázisos aminosav (esetleg ikerionos szerkezet miatt) segíti a kötődést Nagy térkitöltésű oldalláncot tartalmazó aminosav gátolja a kötődést Orbán E., et al. Amino Acids 41(2): 469-483 (2011) Orbán E., et al. Bioconjugate Chemistry 22(10): 2154-2165 (2011)
Antraciklinek konjugálása GnRH-III hormon peptidhez <EHWSHDWKPG-NH2 O
N-O-CH2-CO-GFLG-
OH
O OH
CH3O
O
OH
savlabilis lizoszómákban pH < 5
O
N-NH-CO-CH2-CH2-CO-
OH
hasadás lizoszómális enzimekkel NH2
O
<EHWSHDWKPG-NH2
OH
CH3O
O
OH
O
OH
O
CH3
O
<EHWSHDWKPG-NH2 O
O
OH
CH3O
O
OH
O
hasadás észterázokkal
OH
<EHWSHDWKPG-NH2 CH3O
O
NH2 O
észter-kötés
O
OH
O-CO-(CH2)3-COOH
OH CH3
Mező, G., Manea, M. et al. (2008) Curr. Med. Chem. 15, 2366
OH CH3
hidrazon-kötés
oxim-kötés
NH2
OH
O
NH-CO-(CH2)3-CO-YO
amid-kötés
OH CH3
PABC spacert tartalmazó konjugátum lebomlása Katepszin B enzim hatására
p-aminobenziloxikarbonil (PABC)
GnRH-III
Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2 Ac-Cys S
Katepszin B
O N
O
H
(CH2)5
Phe-Lys- N
O
O H2N
NH
O
OH
O O
HO O
OH
O
O OMe
O HO O
OH
1,6-elimináció
+
+ H2O
CO2
OH
37°C , pH 5
O
Daunorubicin (Dau)
H2N NH
Katepszin B
O O
O
OH O OMe
+
Dau
A szabad Dau és hatóanyag - GnRH-III konjugátumok in vitro citosztatikus hatása MCF-7 and HT-29 tumorsejtvonalakon Citosztázis (MCF-7)
Citosztázis (HT-29)
IC50 (µM)
IC50 (µM)
Daunorubicin
0,4 ± 0,1
0,3 ± 0,2
Dau-GnRH-III (hidrazon)
0,5 ± 0,2
2,4 ± 0,5
Dau-PABC-GnRH-III
0,4 ± 0,0
1,7 ± 0,2
Dox-GnRH-III (észter)
0,1 ± 0,1
2,4 ± 0,2
Dox-[D-6Lys]-GnRH-I (észter)
0,2 ± 0,1
1,9 ± 0,3
Dau-GnRH-III (amid)
> 100
> 100
Vegyület
Az in vitro citosztatikus hatást (IC50 értékek) MTT teszttel mértük. MTT = 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid
Mező, G. et al. (2008) Curr. Med. Chem., 15(23):2366-2379; Szabó, I et al. (2009) Bioconjug. Chem., 20(4):656-665; Orbán, E. et al. (2010), Amino Acids, 41(2), 469-483; Schlage, P. et al. (2011) J. Control. Release 156(2), 170–178.
Daunorubicin-GnRH-III biokonjugátumok rövidszénláncú zsírsavakkal Glp-His-Trp-Lys(X)-His-Asp-Trp-Lys(Dau=Aoa)-Pro-Gly-NH2 acetil propionil izo-butiril butiril krotonil izo-valeril hexanoil mirisztoil
Manea, M. et al. (2011) Bioconjug. Chem. 22(7):1320-1329
Hegedüs, R. et al. (2012) Eur. J. Med. Chem. 56(10):155-165
Dau-GnRH-III konjugátumok antitumor hatása orthotopikus HT-29 vastagbél modellen Tumorok tömege a terminálás napján (50. nap)
Máj tömegek a terminálás napján (50. nap)
1,6
1,6 1,4
1,2 1,0
P=0,0350
0,8 0,6 0,4
92,9 %
100 % 70,3 %
60,6 %
0,2
Máj tömegek (g)
Primer tumor tömeg (g)
1,4
1,2 1,0 0,8
100 %
0,6
102,2 %
105,0 %
Lys-Ac
Lys-nBu
89,1 %
0,4 0,2
0,0
Kontroll
Dau
Lys-Ac
Lys-nBu
0,0
Kontroll
Dau
Daunorubicin: heti egy alkalommal (7x1 mg/ttkg) Konjugátumok: heti két alkalommal (5x15 mg Dau-tartalom/ttkg, 8x 7,5 mg/ttkg)
Proliferációs index: konjugátumok (15%-kal csökken), Dau (nincs változás) Vaszkularizáció: konjugátumok (30-40%-kal csökken), Dau (12%-kal nő) Metasztázis gátlás: nincs
Hogyan növelhető a hatóanyag – peptid konjugátumok hatása? Korlátok: A receptorok száma a tumorsejteken limitált. Ezért a biokonjugátumok mennyiségének növelése önmagában nem megoldás.
Lehetséges megoldások: Azonos vagy különböző hatóanyagok kapcsolása egy irányító molekulához. Több különböző receptoron keresztül történő sejtbe juttatás két vagy több hatóanyag – irányító molekula konstrukcióval.
receptor 1 receptor 2 irányító molekula 1 hatóanyag molekula 1 irányító molekula 2 hatóanyag molekula 2
Biokonjugátum tervezés biokonjugátumok két azonos tumorellenes hatóanyaggal
Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2
Glp-His-Trp-Lys-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2 eNH
eNH
O
O O
O
N
OH
Lys aNH
O
O
N
OH
O
O
O O
OH
N
OH
O
OH
O O
O N
OH
O
OH
O
HO OH
CH3O
eNH
O O
OH
O
OCH3
CH3O
OH NH2
HO NH2
O
OH
O O
HO NH2
HO O O
OH NH2
Anyagok
MCF-7 IC50 [µM]
HT-29 IC50 [µM]
LNCaP IC50 [µM]
Daunorubicin
0,4 ± 0,1
0,2 ± 0,2
0,1 ± 0,1
GnRH-III[4,8Lys(Dau=Aoa)]
2,9 ± 0,9
6,8 ± 1,0
4,9 ± 0,3
GnRH-III[8Lys(Dau=Aoa-Lys(Dau=Aoa))]
3,0 ± 0,4
5,6 ± 2,0
3,8 ± 1,6
GnRH-III[8Lys(Dau=Aoa)]
6,7 ± 1,9
29,9 ± 0,6
15,2 ± 2,4
Leurs, U. et al. (2012) Biopolymers Pept. Sci. 98:1–10
OCH3
Biokonjugátum tervezés biokonjugátumok két különböző tumorellenes hatóanyaggal Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2
Glp-His-Trp-Lys-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2 eNH
O
Lys
eNH
aNH
O
eNH
O O
O
O OH N H
N
N
OH
O
O
OH N H
O HO
N N H2N
N
O O
N N
O
NH2
OH
O
OH
O
OH
O
O HO
N
OCH3 N
OH NH2
N
H2N
O O
N N
OH NH2
NH2
MCF-7 IC50 [µM]
LNCaP IC50 [µM]
HT-29 IC50 [µM]
Daunorubicin
0,4 ± 0,1
0,1 ± 0,1
0,2 ± 0,2
Methotrexate
n,d,
0,3 ± 0,2
1,4 ± 0,6
GnRH-III[4Lys(MTX),8Lys(Ac)]
> 50
> 50
> 50
GnRH-III[4Lys(MTX),8Lys(Dau=Aoa)]
5,8 ± 1,1
28,8 ± 4,7
3,6 ± 1,5
GnRH-III[8Lys(MTX-Lys(Dau=Aoa)]
5,4 ± 0,7
11,3 ± 0,5
5,6 ± 3,0
GnRH-III[8Lys(Dau=Aoa)]
6,7 ± 1,9
15,2 ± 2,4
29,9 ± 0,6
Anyagok
Leurs, U. et al. (2012) Eur. J. Med. Chem. 52:173-183
OCH3
Horizon 2020 - MAGICBULLET
MSCA-ITN-2014-ETN: Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Networks (ITN-ETN) https://www.uni-bielefeld.de/chemie/oc3sewald/magicbullet/
ELTE, Országos Onkológiai Intézet Univeristy of Helsinki Bielefeld Cologne Milan Como
Bayer, Heidelberg Pharma, Exiris, Italpharmaco,
Új hatékonyabb GnRH-III – daunomicin konjugátum K2:
Glp-His-Trp-Lys(Bu)-His-Asp-Trp-Lys(Dau=Aoa)-Pro-Gly-NH2
P19-H: Glp-D-Tic-Lys(Bu)-His-Asp-Trp-Lys(Dau=Aoa)-Pro-Gly-NH2 1,2,3,4-tetrahidroizokinolin-3-karbonsav (Tic) Átlag ± SD, Mann-Whitney teszt
1,0
Átlag ± SD, Mann-Whitney teszt
1,2
1,0
0,8 0,7 0,6 0,5
P = 0,0127
0,4 0,3
100%
0,2
P = 0,0005
0,8
0,6
P = 0,0005 0,4
100%
73,6% 45,0%
0,1
9,0%
0,0
Máj tömegek (g)
Primer tumor tömege (g)
0,9
115,7%
104,8%
51,7%
0,2
0,0
Kontroll
Dau
K2
P19-H
N=11
N=5
N=5
N=5
Kontroll
Dau
K2
P19-H
N=11
N=5
N=7
N=5
Terminálás a tumor transzplantációt követő 34. napon A Dau csoportot előbb - a 30. napon - kellett terminálni
Potenciális konjugátumok a MAGICBULLET projekt keretében
kriptoficin
paclitaxel
GnRH, szomatosztatin RGD- , NGR- peptidek
a-anamitin
auristatin
Konzorcium az NVKP_16-1-2016-0036 pályázat megvalósítására
1 019 321 884 Ft támogatás
Mező Gábor MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport
Csámpai Antal ELTE Kémiai Intézet
Kőhidai László Semmelweis Egyetem
Bertók Béla ComInnex Zrt
A projekt célja Kiemelkedő halálozási kockázattal járó betegségek gyógyításának eredményességét lényegesen javító nemzeti program Hazánk versenyképességének szempontjából stratégiai jelentőségű kutatásfejlesztési és innovációs tevékenységeket, illetve az azok keretében jelentős szellemi hozzáadott értéket tartalmazó piacképes termékek, szolgáltatások, technológiák létrehozását támogatja Célzott tumorterápia
hatóanyag
irányító molekula
kapcsoló elem linker
Vegyülettárak, amelyek számos, nagy variációs lehetőséget tartalmazó modult tartalmaznak és alkalmasak személyre szabott, illetve kombinációs célzott tumorterápiára
funkcionalizált hatóanyag
funkcionalizált hatóanyag
funkcionalizált hatóanyag
bifunkciós linker
funkcionalizált irányító molekula
bifunkciós linker
funkcionalizált irányító molekula
bifunkciós linker
funkcionalizált irányító molekula
Vastagbél tumorsejthez (HT-29) kötődő peptidek kiválasztása fág-bemutatás technikával Szekvencia 2-3 szelekciós lépés után
VHLGYAT
Fág könyvtár
kiválasztott peptid Ismétlés 2-3-szor
Vastagbél tumorsejt Mosás Kötődés
Nem kötődött fágok
Kötődött fágok
E. coli-ban való kifejeztetés
Dau=Aoa-VHLGYAT-NH2 Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH2 Dau=Aoa-GFLG-VHLGYAT-NH2
Eluálás
Dau: daunomicin Aoa: aminooxiacetil
1011 fág klón felhasználásával, 50 kiválasztott, amelyek kevés és csak dipeptid szakasz homológiát mutattak Zhang Y., et al. (2007) J. Biomol. Screen. 12, 429-435
GFLG, LRRY: Katepszin B enzim által hasítható szekvenciák
Hatékonyabb konjugátum kiválasztása Ala-szken segítségével V
H
L
G
Y
A
T
A
H
L
G
Y
A
T
V
A
L
G
Y
A
T
Dau=Aoa-LRRY- V
H
A
G
Y
A
T -NH2
V
H
L
A
Y
A
T
V
H
L
G
A
A
T
V
H
L
G
Y
A
A
Kód
Konjugátum
Citosztázis (IC50 (mM)) (24 órás kezelés + 48 óra)
KK06/2
Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH2
50,5 ± 5,5
KK11
Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAA-NH2
60,9 ± 3,1
KK12
Dau=Aoa-LRRY-VHLGAAT-NH2
> 100
KK13
Dau=Aoa-LRRY-VHLAYAT-NH2
14,0 ± 1,5
KK14
Dau=Aoa-LRRY-VHAGYAT-NH2
> 100
KK15
Dau=Aoa-LRRY-VALGYAT-NH2
26,8 ± 0,4
KK16
Dau=Aoa-LRRY-AHLGYAT-NH2
> 100
Konjugátumok sejtfelvételének tanulmányozása áramlási citométerrel (3 órás kezelés) 20 mM
HT-29
100 mM
7000
fluoreszcencia int.
6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 KK06/2 KK11
KK12
KK13
KK14
KK15
KK16
20 mM
HT-29
100 mM
Dau+ sejtek [%]
100 80 60 40 20 0 KK06/2 KK11
KK12
KK13
KK14
KK15
KK16
Konjugátumok sejtfelvételének vizsgálata fluoreszcens mikroszkóppal KK06/2 15 perc
c=20 mM KK06/2 30 perc
c=20 mM
KK13 15 perc
c=20 mM KK13 30 perc
c=20 mM
További módosítások a 4. pozícióban a hatás fokozása érdekében
V
H
L
A
Y
A
T
V
H
L
L
Y
A
T
V
H
L
S
Y
A
T
Dau=Aoa-LRRY- V
H
L
P
Y
A
T -NH2
V
H
L
F
Y
A
T
V
H
L
K
Y
A
T
V
H
L
E
Y
A
T
In vitro citosztázis Konjugátum
Citosztázis* 24 óra (IC50 SD; mM)
Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH2
39,4 5,9
Dau=Aoa-LRRY-VHLAYAT-NH2
27,9 6,4
Dau=Aoa-LRRY-VHLKYAT-NH2
50,3 3,0
Dau=Aoa-LRRY-VHLEYAT-NH2
29,5 6,2
Dau=Aoa-LRRY-VHLLYAT-NH2
7,5 3,5
Dau=Aoa-LRRY-VHLFYAT-NH2
6,6 2,9
Dau=Aoa-LRRY-VHLSYAT-NH2
24,8 7,4
Dau=Aoa-LRRY-VHLTYAT-NH2
21,7 6,5
Dau=Aoa-LRRY-VHLNYAT-NH2
28,0 19,4
Dau=Aoa-LRRY-VHLPYAT-NH2
>50
FLTSANEGKP
Fluoreszcencia int.
In vitro sejtbejutási vizsgálatok
Dau=Aoa-LRRY-VHLAYAT-NH2 Dau=Aoa-LRRY-VHLFYAT-NH2 Dau=Aoa-LRRY-VHLSYAT-NH2 Dau=Aoa-LRRY-VHLPYAT-NH2
9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
Dau+ sejtek [%]
6,25 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 6,25
12,5
25 c / mM
50
100
12,5
25 c / mM
50
100
„Egy üst” reakcióban kialakított konjugátum
ClAc-GFLG-PABC-ONp
DMF - 0,1 M Tris puffer 8:2 (V/V) pH 8, szobahő, 5 óra
daunomicin
ciklo[RGDfC]
ciklo[RGDfC(CH2CO-GFLG-PABC-Dau)]
Támogatók
NK 77485 K 104045 K 119552
MSCA-ITN-2014-ETN: Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Networks (ITN-ETN)
NVKP_16-1-2016-0036 Szinergia program Műszer pályázat
Köszönöm a figyelmet!
