Luminiscence
Luminiscence emise světla látkou, která je způsobená: • světlem (fotoluminiscence) →fluorescence, fosforescence
• chemicky (chemiluminiscence) • teplem (termoluminiscence) • zvukem (sonoluminiscence) • mechanicky (mechanoluminiscence)
Fluorescence sekundární záření po absorpci elektromagnetického záření (od fosforescence se liší dobou, po kterou trvá sekundární záření, když přestalo působit záření primární) tzv. dosvit • fluorescence 10-8 až 10-5 s • fosforescence 10-2 s až několik dní Anorganické sloučeniny - fluorescence poměrně zřídka (např. u solí
vzácných zemin, uranylu, thallia). Organické látky - fluorescence častěji, nejintenzívnější a analyticky nejvíce využitelná u sloučenin s aromatickými cykly.
1
Fluorescence ze života
tonik – obsahuje chinin
bankovky – ochranné fluorescenční prvky
fluorescenční barviva, uprostřed roztok chininsulfátu
Fluorescence
S1
Deexcitace
Energie
vibrační relaxace S1
Excitace
Energie
excitovaný stav
Absorpce S0
λa < λe „energie se ztratí“ Fluorescence
světlo λa
S0
světlo λe
základní stav
Fluorescenční spektrum
fluorescenční spektrum je posunuto k delším vlnovým délkám než původní absorpční spektrum (Stokesův posun) a je k němu zrcadlově symetrické
λ→ ←ν
2
Kam se ztrácí energie?
vibrační relaxace
absorpce – rychlá 10-15 s geometrie se nemění – vertikální přechod Frank-Condonův princip
λa < λe
„energie se ztrácí do vibračních pohybů“ λa = λe POZOR: u atomů platí
Monomolekulární procesy vyhasínání S2
ISC IC ISC
Absorption
IC Internal Conversion (vnitřní konverze) S → S or T → T – nemění se spin IC ISC Inter-System Crossing T1 (mezi-systémové křížení) S → T or T → S – mění se spin T2
S1
F
Nezářivé pochody
IC
ISC
Zářivé pochody
P
F
Fluorescence S1 → S0 emise fotonu
P
Fosforescence T1 → S0 emise fotonu
S0 Jablonského diagram
Doby života - lifetimes ISC
1
laserový pulz
T1
S0
F
IC
ISC
P
IFluor
S1
1/e = 0.37
τF čas τF = doba života fluorescence τF = 1 - 100 ns τP = doba života fosforescence τP = 1 ms - dny
τP >> τF protože přechody Triplet-Singlet jsou spinově zakázány
3
Vlastnosti fluorescence 1. Aby látka emitovala fluorescenční světlo, musí světlo absorbovat 2. Vlnová délka fluorescenčního světla > vlnová délka excitačního světla (Stokesův zákon) λemit > λexcit Delší λ ≈ menší E ⇒ Efluorescence < Eabsorbované světlo 3. Intenzita fluorescence « intenzita excitačního světla 4. Fluorescenční světlo je emitováno všemi směry nezávisle na směru excitačního světla 5. Fluorescence postupně mizí 6. Intenzita fluorescence je úměrná intenzitě excitačního světla I0, hustotě vzorku C a efektivnosti fluorescence (kvantový výtěžek kappa) 7. Každá látka má své charakteristické fluorescenční spektrum 8. Absorpční a fluorescenční spektra tvoří zrcadlové obrazy 9. Fluorescenční světlo má různý stupeň polarizace
Kvantový výtěžek
kvantový výtěžek fluorescence
φ=
N emit N absorb
kvantové výtěžky fluorescence jsou výrazně nižší než 1
Kvantový výtěžek - standardy
4
Doba života nezbytná charakteristika látky a její interakce s okolím obtížně měřitelná (10 ns) měří se metodou
• pulzní • harmonickou (fázová modulace)
Zhášecí procesy
kolizní procesy
statické zhášení
tvorba komplexu v základním stavu, který nefluoreskuje (jednotlivé složky ale samotné fluoreskují)
přenos energie
kolizí s jinou látkou, která zajistí nezářivou deexcitaci (O2, I-, akrylamid)
FRET – fluorescenční (Försterův) rezonanční přenos energie
reakce přenosu náboje fotochemické reakce
po excitaci dochází k chemické reakci molekuly
Využití kvalitativní analýza - podle zbarvení, resp. tvaru fluorescenčního spektra můžeme usuzovat na přítomnost dokazované látky kvantitativní analýza - podle intenzity záření na její množství fluorescenční detektory se používají i při některých separačních metodách časté využití v biovědách
5
Fluorescenční spektroskop
měří se v kolmém směru k excitačnímu záření
Fluorometr (fluorimetr)
Luminometr
měří luminiscenci např.
chemiluminiscenci nebo její zhášení
často bývá kombinován s fluorometrem např. Fluoroscan ascent
6
Detektory
potřeba měřit nízké intenzity často potřeba měřit rychlé dosvity fotonásobiče
(photomultiplier tube)
Fluorescenční mikroskop Excitační paprsek dopadá na zrcadlo, odtud se odráží a přes čočky a excitační filtr dopadá na vzorek. Fluorescenční signál prochází přes čočky, zrcadlo a filtry do fotonásobiče, kde se fluorescenční signál transformuje na elektrický signál.
Fluorescenční mikroskop schémata
princip 1. absorbce 2. excitace 3. emise
7
Fluor. mikroskop - části Světelný zdroj: Ze světelného zdroje vychází světlo s různými vlnovými délkami od ultrafialové po infračervenou
Excitační filtr: Tento filtr propouští pouze světlo, které je potřebné k fluorescenci vzorku, především obvykle s kratší vlnovou délkou. Ostatní světlo pohlcuje.
Fluorescenční preparát: Vzorky, které reagují na dopadající světlo fluorescencí (většinou po přidání barviva-fluorochromu)
Bariérový filtr: Tento filtr pohlcuje všechno excitační světlo, které nebylo použito k excitaci a propouští pouze fluorescenční světlo. Navíc je možné z fluorescenčního spektra nechat projít pouze jeho část.
Fluorescenční mikroskop Fluorescenční mikroskop je založen na následujících dvou principech: Na vzorek dopadá pouze světlo v intervalu vlnových délek, které způsobují excitaci. K vytvoření obrazu se použije pouze nezbytně nutná část fluorescenčního světla, které obsahuje i neabsorbovanou část excitačního světla. Obraz se buď pozoruje, nebo se zachytí na mikrofotografii. Volba vlnové délky je velmi podstatná. Proto je ve fluorescenční mikroskopii důležitá volba vhodných optických filtrů.
Filtry Filtry z barevného skla Tento typ filtrů se vyrábí přidáním pigmentu do skla. Tyto filtry jsou propustné pouze pro část spektra díky absorpci světla. Filtry z barevného skla jsou relativně levné. Nelze je použít k vytvoření úzkého pásma. Interferenční filtry Interferenční filtry jsou relativně drahé, ale mají ostré charakteristiky, kterých nelze dosáhnout pomocí barevných filtrů.
8
Fluor. mikroskop - využití Biologie (zoologie, botanika, mikrobiologie) Medicína (předepsané zkoušky, patologie, anatomie, neurologie, fyziologie, imunologie atd.) Farmacie, chemický průmysl, biochemický průmysl Výzkum a kontrola průmyslových aplikací (restaurátorství, defektoskopie, kontrola bankovek atd.)
Fluor. metody v biovědách Proč? Vysoký poměr signál/šum, detekce až jednotlivých molekul, neinvazivní, flexibilní, časový profil ... Organické látky produkují fluorescenci po dopadu ultrafialového záření. K vyvolání fluorescence se používají barviva a pak se pozoruje sekundární fluorescence fluorochromu. Pozorování autofluorescence (bez použití barviva) Pozorování sekundární fluorescence (metoda chemického barvení) Fluorescenční barvení protilátek (imunologické barvení)
Pozorování autofluorescence (bez použití barviva) Při této metodě se pozoruje vlastní fluorescence preparátu. Autofluorescenční světlo produkují některé tkáně, buňky, mikroorganismy atd. Látka se identifikuje pomocí spektrofotometru, změřením emitovaného fluorescenčního spektra a někdy také současně změřením excitačního spektra. Aplikace: Identifikace vitamínů, studium neurotransmiterů, chlorofylu, porfyrinu, detekce a identifikace organického znečištění v oblasti průmyslu atd.
9
Pozorování sekundární fluorescence (metoda chemického barvení) Tato metoda je založena na pozorování fluorescenčního světla generovaného fluorochromem, kterým se obarví látka bez vlastní fluorescence (proteiny, sachyridy). Pokud se obarví pouze objekty, které chcete pozorovat, lze je pozorovat odděleně od tkáně a ostatních buněk. Aplikace: medicína (akridin + nukleová kyselina, auramin + bacil tuberkulózy, chinakrin mustard + chromozom atd.)
Fluorescenční barvení protilátek (imunologické barvení) Tato metoda využívá skutečnosti, že reakce probíhá pouze mezi jedním druhem antigenu a jedním druhem protilátky. Protilátka se obarví fluorochromem. Množství respektive přítomnost antigenů se pak studuje po reakci antigen/protilátka. Hlavní použití fluorescenčních mikroskopů je v oblasti medicíny, biologie a veterinární medicíny. V těchto oblastech se právě nejvíce využívá fluorescenční metoda založená na protilátkách
Ukázky
10
Fosforescence
Fosforescenční spektrofotometr
Anglické termíny lamp - lampa, zdroj sample - vzorek cuvette, cell - kyveta fiber optic - optické vlákno lens - čočka, lupa laser beam - laserový svazek ray - paprsek photomultiplier tube - fotonásobič dichroic mirror - polopropustné zrcadlo flash - záblesk, blesk
11
