Lumineszcencia Dr. Vámosi György
Lumineszcencia • • •
Lumineszcencia: gerjesztett molekulák fényemissziója a hőmérsékleti sugárzáson kívül, „hideg emisszió” Fluoreszcencia: szinglet-szinglet átmenet Foszforeszcencia: Triplet-szinglet átmenet („tiltott”)
•
Gerjesztés módjai: • fotonabszorpció (fotolumineszcencia) • kémiai reakció (kemilumineszcencia) • biokémiai reakció (biolumineszcencia) • radioaktív bomlás energiája (radiolumineszcencia)
•
Lumineszkáló molekulák szerkezete: konjugált kettős kötéseket tartalmazó gyűrűkkel rendelkeznek
A lumineszcencia molekulaszerkezeti értelmezése: Jablonski diagram • Vibrációs relaxáció: energia hővé alakul
a
vibrációs
belső konverzió (kic)
(10-16 s)
• Kasha-szabály: a fluoreszcencia emisszió az első gerjesztett állapot legalacsonyabb vibrációs szintjéről történik. inte rsys t S → em cro ss T ( ki ) ing sc
• szinglet állapot (S): minden e- spinje párosított, eredő spin=0 triplet állapot (T): két e- spinje párosítatlan, eredő spin=1 • fluoreszcencia: nem jár spinátfordulással, gyors (10-9-10-7 s) • Intersystem crossing (isc) és foszforeszcencia: egy elektron spinje átfordul, „elsőrendben tiltott átmenet”, lassú (10-6-10 s)
(10-12 s)
• belső konverzió: átmenet
sugárzásmentes
Élő sejtek saját fluoreszcenciája I. • aromás aminosavak: triptofán, tirozin, fenilalanin. Q: 0,02-0,3 nagy mennyiség
• fluoreszcens metabolitok: NAD(H), NADP(H), FAD, piridoxál származékok (B6 vit.), ösztrogén hormonok, stb. Q: 0,06-0,4 közepes mennyiség • biolumineszcencia: luciferin/luciferáz + ATP → hf
Élő sejtek saját fluoreszcenciája II.
• zöld fluoreszcens protein (GFP):
Ser65
Tyr66
kromofór β-redős szerk. (11)
Gly67
MW=27 kDa
Aqueora victoria
Fluoreszcens fehérjék spektrumai (R. Tsien) Kék Cián Zöld Sárga Vörös
Fluoreszcens fehérjék mutációkkal létrehozott variánsai (R. Tsien)
Biomolekulák fluoreszcens jelölése I. Fehérjék • Fehérjék direkt módosítása festékkel: Lys, Arg oldalláncok amino (NH2)-csoportja, Cys tiol (SH)-csoportja reaktív csoportot (izotiocianát, szukcinimidil észter, ill. maleimid) tartalmazó festékkel jelölhető. Pl. FITC: fluoreszcein-izotiocianát
festék-N=C=S + NH2-prot → → festék-NH-C-NH-prot S • Jelölés fluoreszcensen jelzett toxinokkal: falloidin (F-aktin) β-skorpiótoxin (fesz. függő K-csatorna), α-bungarotoxin (acetilkolin receptor)
Piros: rodamin-falloidin (aktin filamentumok)
• Transzfekció GFP-vel fuzionált fehérjét kódoló DNS vektorral – a sejt maga termeli a fluoreszcens fehérjét
Zöld: epidermális növekedési hormon receptor + GFP
• Jelölés specifikus antitestekkel (immunfluoreszcens, immunhisztokémai jelölés) Epitóp
Antitest Antigén
Antigén kötő rész (variábilis régió)
Könnyűlánc
Fab
Fc
• • •
Nehézlánc
Az antitest nagy affinitással és specificitással kötődik az általa felismert molekula felszínhez (epitóphoz). Monoklonális antitest: epitóphoz kötődik
egyetlen
Poliklonális antitest: különféle szomszédos epitópokhoz kötődő antitestek keveréke
Direkt jelölés: az antitesthez fluoreszcens festék van kötve Indirekt jelölés: az elsődleges antitest jelöletlen, az első ellen irányuló, másodlagos antitest van megjelölve. Utóbbi ált. poliklonális → erősítés Példák klinikai és biológiai felhasználásokra: • vérsejtek felszínén megjelenő antigének diagnosztikai célú kimutatása, expressziós szintjének mérése, különféle sejtfelszíni antigéneket kifejező (pl. CD4+, CD8+) sejtek mennyiségének meghatározása • hormonok, virális és bakteriális antigének, egyéb kis mennyiségben előforduló anyagok kimutatása vérből • sejtfelszíni fehérjék lokalizációjának, mintázatának, asszociációinak, mobilitásának vizsgálata fluoreszcencia spektroszkópiás és mikroszkópiás módszerekkel
Immunfluoreszcens jelölés: target sejt – ölősejt kölcsönhatás MHC I (Alexa 488)
Target sejt
Ölősejt (CTL)
CD8 (Cy5)
Kv1.3 ioncsatorna (Alexa 546)
•Nukleinsavak: szelektíven jelölhetők nem kovalensen kötődő festékekkel •Interkaláció: beékelődés két szomszédos bázispár közé pl. propidium-jodid (PI), etidium-bromid (EtBr), daunomicin, akridin narancs (AO)
•Kötődés a DNS kis v. nagy „árkához” pl. DAPI, Hoechst: kis árok •Elektrosztatikus kötődés a negatív foszfátcsoportokhoz (egyszálas RNS-re jellemző) •Felhasználás: •DNS sávok megjelenítése gél elfo. után EtBr-dal •életképesség mérése: PI számára az ép sejtmembrán nem átjárható. •DNS/RNS tartalom mérése, sejtciklus analízis: AO + kétszálas nukleinsav: zöld (interkaláció), AO + egyszálas nukleinsav: vörös fluoreszcencia (elektrosztatikus kötődés)
Nukleinsavak jelölése
Antiszensz DNS oligonukleotid
sejtmag
sejtmembrán Tárkányi és mtsai, 2005
•
Szekvencia specifikus nukleinsav próbák A cél egyes génszakaszok meglétének, kópiaszámának vizsgálata, a belőlük átírt mRNS jelenlétének és mennyiségének meghatározása. A specifikus kötődést a próba és a kimutatandó szekvencia komplementer volta biztosítja.
•
Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH): (a) a kimutatni kívánt génszakasszal homológ, fluoreszcensen jelölt v. jelölhető (biotinált) oligo-nukleotidokat juttatnak a sejtbe (b) a DNS-t denaturálják (egyszálas) (c) a renaturáció során a bázispárosodás nagyobb valószínűséggel jön létre a nagyobb koncentrációban jelenlévő próba és a gén vele komplementer szakasza, mint a gén eredeti komplementer szálai között (d) a jelölésre alkalmas próbához festéket kapcsolnak (biotinált DNS - avidin - biotinált festék) (e) a keresett, fluoreszcensen megjelölt DNS szakaszok elhelyezkedése mikroszkóppal vizsgálható
Fluoreszcens jelölők méretarányai Fluoreszcein
Biotin
Streptavidin
QdotTM
IgG
GFP
Forrás: Fehérjék - MMDB,
Qdot TEM-képe - http://www.qdots.com, összeállította: Lengyel R.
A félvezető nanokristályok
Forrás: Shimon Weiss: Single Molecule Spectroscopy and Imaging Óravázlat
A QdotTM streptavidin konjugátum szerkezete
Forrás: Qdot™ Streptavidin Conjugates User Manual - Quantum Dot Corporation
Működés • CdSe mag • ZnS héj – Mag felületi csapdáinak kiküszöbölése – A gerjesztést a magba zárja
A héj a QY-et ~80%-ra növeli.
Színkép
Forrás: Qdot™ Streptavidin Conjugates User Manual - Quantum Dot Corporation
Színkép Széles abszorpciós spektrum Keskeny emissziós spektrum (FWHM=30-40 nm)
Mérettől függő em. maximum
Forrás: Chan WC et al. Curr Opin Biotechnol 13,40 (2002. Febr.) Han et al. Nat Biotechnol 19,631 (2001.)
Fotostabilitás - összehasonlítás Sejtmag
Mikrotubulusok
Felső sor
QD 630 streptavidin
Alexa 488 anti-mouse IgG
Alsó sor
Alexa 488 anti-mouse IgG
QD 630 streptavidin
100 W Hg gőz lámpa; 100x, 1.3 NA immerziós objektív Sejt: 3T3
Forrás: Wu X. et al., Nat Biotechnol. 21,41 (2003. Jan.)
„Ultrahigh resolution colocalization" Pixel méret: 50 nm
Thilo D. Lacoste, Xavier Michalet, Fabien Pinaud, Daniel S. Chemla, A. Paul Alivisatos, and Shimon Weiss
Ultrahigh-resolution multicolor colocalization of single fluorescent probes PNAS August 15, 2000 vol. 97 no. 17 9461–9466
"Time-Gated Imaging" Fluoreszcencia élettartam: 10-40 ns Autofluoreszcencia: néhány ns 1. Mouse 3T3 sejt 2 % formaldehid, 0,5% glutáraldehid Impulzusos gerjesztés, házi konfokális mikroszkóp
1. Összes foton 2. 35 ns - 65 ns közötti foton Jel/zaj arány 15-szörösére nőtt. Forrás: Michalet X. et al. Single Mol. 2,261 (2001.)
Sejt mozi – Q dottal
Epidermális növekedési faktor receptor - GFP (zöld) EGF - quantum dot (piros) mozi: EGF kötődése és internalizációja
erbB3 receptor – citrin (zöld) EGF – quantum dot (piros) mozi: EGF transzportja a filopódiumok mentén (D. Liedke, Nagy P. és mtsai, Nature Biotechnology 2004)
Fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) Sugárzás nélüli energiaátadás két festék, a donor (D) és az akceptor (A) molekula között, dipólusdipólus kölcsönhatás révén. (Theodor Förster, 1948)
D
A
D
A
kt
D
A
A
D
Feltételek: • a D emissziós és az A abszorpciós spektrumának átfedése, • 2-10 nm távolság, • D és A megfelelő relatív orientációja. 1
Érzékeny távolságfüggés:
kt R06 E= = 6 = 6 kt + k f + kic + kisc + ... R0 + R (kt: a FRET sebességi állandója)
1 R6 1+ 6 R0
E 0,5 0
0
1
2
R/R0
Fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) Felhasználás: „spektroszkópiai vonalzó”, • inter- és intramolekuláris távolságok meghatározása • molekulák közti asszociáció kimutatása • molekulaszerkezet, konformáció vizsgálata.
Mérése: „D” fluoreszcenciájának csökkenéséből
E = 1-FDA/FD
„A” fluoreszcenciájának növekedéséből „D” élettartam csökkenéséből.
E = 1-τDA/τD
„D” fotokioltás időállandójának növekedéséből
E = 1-τDA/τD
„D” fluoreszcencia anizotrópia növekedéséből.
E = 1-(r0/rDA-1)/(r0/rD-1)
Akceptor fotokioltásos Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer (apbFRET) hν’ hν
hν’’
FRET D
A A
D
akceptor
donor
1 E= 6 1 + (R R0 )
Akceptor fotokioltásos Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer (apbFRET) hν’ hν
FRET D
A A
D
donor
akceptor
E = 1 − FDA / FD
Interleukin-15 receptor α és Interleukin-2 receptor α alegység molekuláris asszociációja IL-15Rα
100%
átfedés
0.016
FRET
<E> ~ 17%
0.014 0.012 pixelszám
0
IL-2Rα
0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 -100
-50
0
50
FRET hatásfok (%)
100
Sejtenkénti FRET mérés áramlási citométerrel: nincs szubcelluláris feloldása, de jó a statisztikája Négy fluoreszcencia intenzitás: Autofluoreszcencia
FL1(488,530) = AF + I D (1 − E ) ⋅ S5
(1)
Donor csatorna
FL 2(532,580) = AF ⋅ B2 + I D (1 − E )
(2)
FRET csatorna
FL3(532, > 670) = AF ⋅ B3 + I D (1 − E ) ⋅ S1 + I A ⋅ S 2 + I D ⋅ E ⋅ α (3)
Akceptor csatorna
FL 4(633, > 670) = AF ⋅ B4 + I A
Átvilágítás: B2 =
Jelöletlen minta Donor minta
S1 =
(4)
FL 4 FL3 FL 2 , B4 = , B3 = FL1 FL1 FL1
FL1 FL3 , S5 = Akceptor minta FL 2 FL 2 FL3 A LD ε (532) D α= ⋅ ⋅ FL 2 D LA ε (532) A
→ E minden sejtre
S2 =
FL3 FL 4
Sejtszám
FRET hatásfok (%)
Receptor mintázatok Kit225 K6
Kit225 IG3
Hut102B2
Fotokromizmus
Donor: Lucifer yellow Diheteroarylethene vegyületek – fénnyel átkapcsolható akceptorok fotokromikus FRET méréshez (pcFRET)
Fotokromizmus •Fénnyel indukálható, spektroszkópiai tulajdonságokat változtató átmenet. •Néhány foton abszorpciója kiváltja az átmenetet •Reverzibilis 500-580 nm
320-380 nm
•Ki-bekapcsolható FRET akceptorként alkalmazható •Önkontrollos FRET mérést tesz lehetővé
•E = 1-FDA/FD
Specifikus nukleinsav szekvenciák detektálása molekuláris „fáklyákkal” (molecular beacon)
„riporter” festék (FRET donor) kioltó (nem fluoreszcens FRET akceptor)
Allélek, pontmutációk detektálása FRET-tel monitorozott DNS denaturációval (Herpes simplex vírus)
A próba a HSV-1-gyel komplementer – magasabb Tm
Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia
0,3 µm
1,5 µm
•A vizsgálandó molekula (fehérje, lipid, stb.) fluoreszcens jelölése •Kicsiny, <1µm3-es térfogat megvilágítása fókuszált lézernyalábbal •A fluoreszcencia időbeli változásának detektálása érzékeny fotodetektorral •A jelenlévő molekulák száma kicsi – az ingadozás relatív értéke jelentős
Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia (FCS)
V ≈ 0.25 fL megvilágított térfogat
F(t) time
FCCS setup
Malte Wachsmuth & Michael Tewes
A fluktuáció analízis elve
•
•
A fluoreszcensen jelölt molekula fotonokat emittál, míg a lézer által megvilágított térfogatelemen áthalad Az időegység alatt kibocsátott fotonok száma függ ¾A molekulaszámtól (konc.) ¾megvilágított folt méretétől (instrumentális paraméter) ¾a kvantumhatásfoktól (a festék tulajdonsága)
•
Az ingadozás kinetikája függ ¾a diffúziós időtől (D, MW)
T
A fluoreszcencia időfüggéséből...
G (τ ) =
δF(t) τD
idő
δ F (t ) ⋅ δ F (t + τ ) F
2
=
∫ δF (t ) ⋅ δF (t + τ ) dt 0
F
2
...kiszámítható az autokorrelációs függvény G(τ)
... Amit a fluoreszcencia intenzitást befolyásoló molekuláris folyamatok dinamikus paraméterei határoznak meg:
G(τ)
G(0) ~1/N
• a detektálási térfogatban lévő molekulák átlagos száma, N • a diffúziós korrelációs idő, τD, ami fordítottan arányos a diffúziós állandóval • aggregáció foka (fluoreszcencia/molekula F/N) • fotofizikai időállandók, stb.
τD =
2 ω xy
4D
τ
A fluoreszcencia ingadozás időfüggése:
δF (t )
t
tD
G(0)
δF(t) = F(t) − F
pillanatnyi ingadozás
T
1 F = ∫ F (t )dt T 0
G(τ )
átlagos intenzitás
tD
A fluoreszcencia időbeli autokorrelációs függvénye:
τ
T
G (τ ) =
δ F (t ) ⋅ δ F (t + τ ) F
G(0) =
2
(δ F(0)) F2
=
2
=
∫ δF (t ) ⋅ δF (t + τ ) dt
t<
0 t>>tD: δF (t ) ⋅ δF (t + τ ) > <0
0
F
2
(δ N(0) ⋅ f ) N2 f 2
N(0) Poisson-eloszlást követ
→
2
=
δ N(0)2 N2
=
σ N2 N2
=
szórásnégyzete σ2 = λ = N
N 1 = 2 N N
Egyetlen molekula detektálását lehetővé tevő érzékenység 5
Fluoreszcencia fluktuáció
3
2
1
0 0
50
100
150
200
time (seconds)
Autokorrelációs függvény
4
N = 1/G(0) ~ 0.3 G(t)
I (kHZ)
4
τ ~ 200 ms
2
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
time (milliseconds)
3
10
4
10
5
10
6
10
Fluoreszcencia intenzitás változással járó folyamatok kinetikájából származó korreláció additívan szeparálható a diffúziós korrelációs függvénytől: • fotofizikai folyamatok: triplet átmenet, sötét komplex keletkezése • kémiai folyamatok: kötődés és disszociáció) G(τ ) =
1 G (τ ) = N
Triplet
(δF
diff
(0) ⋅δFdiff (τ )) F
2
+
(δFkin(0) ⋅δFkin(τ )) F
1 T −τ τ tr 1 e ⋅ ⋅ + τ τ 1 1 T + − τ D 1 + S 2 ⋅τ D
2.0
2
= Gdiff (τ ) + Gkin(τ )
Bimolekuláris reakció: DNS + L
D+L
1.8 1.6 Parameters: N=1 τD=100 µs τT=2 µs S=7
1.4
G(τ)
1.2 1.0
Gbim
0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 1E-3
k-
DL
1 1 −τ /τ bim = e N cD K A
τ bim = (cD k+ + k− )−1
Triplet fraction 0 % Triplet fraction 20 % Triplet fraction 60 % 0.01
k+
0.1
τ [ms]
1
10
(cL<
Többkomponensű rendszerek: az egyes komponensek hozzájárulása a G-hez a Qi részecskénkénti fluoreszcencia négyzetével arányos. (Yi: molekuláris hányad)
1
1 1 ⋅ YQ ⋅ ⋅ = G (τ ) = 2 ∑ i i τ τ 1 + τ i 1 + S 2 ⋅τ i i N ∑ YiQi i 1 1 1 = ⋅ ∑ wi ⋅ ⋅ τ 1/N’ 1 + τ i 1 + S 2τ⋅τ N' i 2
1,9
i
1,7
N’ = 1/G(0) mindig felülbecslése a tényleges molekulaszámnak, ha Qi-k különböznek.
G(τ)
1,5 1,3 1,1 0,9 0,01
τfree τbound 0,1
1
10
100
1000
10000
τ [ms]
Milyen kölcsönhatások vizsgálhatók? Fehérje - DNS
Nukleinsavak hibridizációja
Antigén - Antitest
Receptor – Ligandum kötődés
Kalibráció
1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 -3 -2 -1 10 10 10
T −τ τ tr 1 1 ⋅ ⋅ + e τ τ 1−T 1 + τ D 1 + S 2 ⋅τ D
12 10
1 nM fluorescein 2 nM 5 nM 10 nM
8 6
N
G(τ)
1 G (τ ) = N
4
N = c NA Vellipsoid × 1.33 Vellipsoid ~ 1.35 femtoL
2 0 0
10
1
10
2
10
τ (ms)
3
10
4
10
5
10
0
2
4
6 c (nM)
8
10
Antitest diffúziója oldatban és membrán receptorhoz (IL-2Rα) kötve 0.025 0.02
receptorhoz kötött Fab G( τ )
0.015 0.01
szabad Fab
τD
0.005 0 0.001
0.01
0.1
1
10
100
1000
10000
lag tim e (m s )
A diffúziós állandó 3 nagyságrenddel csökken
MHC II receptorok mobilitása JY sejtek ép membránjában és apoptotikus „bleb”-jeiben 1.05
ép sejt bleb
1.04
G(τ)
1.03 1.02
τD
1.01 1 0.99 0.001
0.01
0.1
1
10
100
1000
10000 100000
τ (ms) ép sejt bleb
D (cm2/s) 5.5 × 10-10 6.7 × 10-9
Keresztkorreláció: Két spektrálisan különböző festék fluoreszcenciájának ingadozása hogyan korrelál egymással - molekuláris asszociáció kimutatása olyan esetben is, amikor nem változik jelentősen a diffúziós állandó az asszociáció következtében
a+b
G (τ ) = ×
ab
δFa (t ) ⋅ δFb (t + τ ) Fa Fb
Fluoreszcencia keresztkorrelációs spektroszkópia (FCCS) Asszociált molekulák együttmozgása
Fluoreszcencia intenzitások párhuzamos ingadozása
Pozitív keresztkorrelációs jel
a+b
G (τ ) ∝ ×
ab
cab
Veff ( ca ,tot )( cb ,tot )
I. és II. osztályú fő hisztokompatibilitási komplex fehérjék diffúziójának vizsgálata B-limfocita sejtvonalon 1.1 1.08
G(τ)
1.06 Cross corr Alexa-L243 Cy5-W6/32-0
1.04 1.02 1 0.98 0.001
0.1
10
1000
100000
τ (ms) MHC II autokorreláció MHC I autokorreláció MHC I - MHC II keresztkorreláció
Fos és Jun stabil asszociációja (ko-mobilitás)
Fos-GFP (autokorr.) Jun-mRFP (autokorr.) Keresztkorreláció
1
b
N 380
DNA b
Fos és Jun heterodimert alkotó transzkripciós faktorok • Dimerizációs domén (leucin cipzár) • DNS-kötő domén • Transzaktivációs domén
C
Fos
340 1
Jun
N. Baudendistel és mtsai
Diffúzió mérése fotokioltáson alapuló technikákkal (Lippincott-Schwartz) FRAP: diffúziós állandó, mobilis hányad
FLIP (Kioltás során fellépő fluoreszcencia veszteség): a molekulák mely térrészekből juthatnak el a kiválasztott területre Fotoaktiválható GFP: láthatóvá tétel csak a kiválasztott térrészben, organellumban, kompartmentek közti vándorlás
paGFP fotoaktivációja és diffúziója (Lippincott-Schwartz)
paGFP abszorpciós spektrumának és fluoreszcenciaájának megváltozása 400 nm-es fénnyel történő fotoaktiváció hatására
paGFP diffúziója a magból a citoplazmába
Aktivált sejtek, sejtcsoportok nyomon követése kísérleti állatok egyedfejlődése során
Fluoreszcens indikátorok IND--AM
Ca2+ IND
IND--AM észteráz IND enzim
Fura 2 Ca2+-indikátor
acetoximetilészter (hidrofób)
szabad festék spektruma Ca2+-kötő festék
λ (nm)
Fluoreszcens ion-indikátorok
Ca2+
Fura-2 Indo-1
H+
BCECF
K+
PBFI
Na+
SBFI
Ca2+-válasz mérése 2.9
Mn2+
F340 / F380
2.4
szabad festék spektruma
ionomycin
1.9
Ca2+-kötő festék
50 nM EGF
1.4
λ (nm)
0.9 0
200
400
600
