Lumineszcencia
Lumineszcencia alapjelenségek (Nyitrai Miklós; 2011 február 7.)
Lumineszcencia
• Definíció: Egyes anyagok spontán fénykibocsátása, a termikus fényemissziótól függetlenül, elektrongerjesztést követően. • Lumineszcens anyag – energia átalakító
Kemilumineszcencia
• Típusai (az elektrongerjesztés oka): – Fotolumineszcencia • Nagyobb energiájú optikai sugárzás átalakulása kisebb energiájú sugárzássá (fénycső)
– Katódlumineszcencia • e- -ok mozgási energiája átalakul látható fénnyé (katódsugárcső)
– Elektrolumineszcencia • Elektromos tér energiája átalakul fénnyé
– Kemilumineszcencia • Kémiai energia átalakul fénnyé
– Termolumineszcencia • Hő által indukált lumineszcencia
– Tribolumineszcencia
luciferin + ATP
luciferáz
oxyluciferin + AMP + fény
• Mechanikai munka átalakulása fénnyé http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Leuchtk%C3%A4fer_-_Firefly.JPG
Tribolumineszcencia
Elemi lépések a lumineszcencia során • Energia elnyelése (abszorpció) • Gerjesztés • A többletenergia fény formájában történő kibocsátása
Látható fény és röntgensugárzás kibocsátása átlátszó ragasztószalag letekerése során.
Photos by Carlos Camara, Juan Escobar and Seth Putterman. http://www.nytimes.com/2008/10/28/science/28xray.html?_r=2&partner=rssnyt&emc=rss
1
Szingulett és triplett állapotok O
C
O
szimmetrikus vibráció
O
C
O
A spinállapothoz rendelt mágneses momentumnak a mágneses tér irányához képest lehetséges orientációs állapotai száma = 2S+1
asszimetrikus vibráció
Szingulett → S=0 O
O C „hajlításos!?” vibráció
Triplett → S=1
Energia-szintek
Abszorpció E(total) = E(transzlációs) + E(elektromos) + E(vibrációs) + E(rotációs)
Vibrációs szintek
ΔE(elektromos) ~ 1.000* ΔE(vibrációs) ~ 1.000.000*ΔE(rotációs)
Első gerjesztett állapot Elektron energia szintek Alapállapot
Energia szintek közötti átmenetek (bővebben később)
Aleksander Jablonski (1898-1980) – lengyel fizikus
Abszorpció Kasha szabály Foton emisszió
2
Jablonski diagram
A Jablonski diagram A Kasha szabály
Gerjesztett-állapot
Belső konverzió v. vibrációs relaxáció – hő (10-12s)
S1
KashaKasha-szabá szabály! ly!
Sugárzásmentes átmenet pl. belső konverzió = hő (10-7 – 10-5 s) gerjesztés (10-15s) S0 – S1
S1 – S0 (10-8s)
Abszorbció Fluoreszcencia Foszforeszcencia
hν
5 4 3 2 1 0
S0
vibrációs szintek
Alap-állapot
Milyen időskálán zajlanak a folyamatok? Fluoreszcencia
Foszforeszcencia
10-9 s
10-3 s
A fluoreszcencia és foszforeszcencia definíciója
gerjesztés
S
S
A ‘ns’ tartomány
T
S
A ‘> ms’ tartomány
10-15 s alapállapot
gerjesztett állapot relaxáció
fl. kioltás
‘Internal conversion’ (hő)
FRET
A fluoreszcencia alapvető paraméterei • • • • •
Fluoreszcencia spektrum Intenzitás Kvantumhatásfok Élettartam Polarizáció
Mi a fluoreszcencia spektrum? Definíció! a. Emissziós spektrum b. Gerjesztési spektrum (ld. abszorpciós sp.)
3
Emissziós spektrum
Gerjesztési spektrum
• Grafikon (függvénykapcsolat), mely a kisugárzott fény intenzitásának hullámhossztól (λ(em)) való függését jellemzi. • Reprezentálja az alapállapot vibrációs szintrendszerét (S0). • λ(ex)=állandó → λ(em)=változó
• Grafikon (függvénykapcsolat), mely az elnyelt fény intenzitásának hullámhossztól (λ(ex)) való függését jellemzi. • Reprezentálja a gerjesztett állapot vibrációs szintrendszerét (S1, S2..). • λ(ex)=változó → λ(em)=állandó
Kasha-szabály A fluoreszcencens fény kibocsátása (emisszió) mindig az első gerjesztett állapot legalacsonyabb vibrációs szintjéről (S1) történik meg.
Tükörkép-szabály Az abszorpciós (gerjesztési) és emissziós spektrumok általában tükör-szimmetrikusak.
Fontos tehát: Stokes-féle eltolódás, tükörkép spektrumok
Az emissziós spektrum maximuma eltolódik a nagyobb hullámhosszak irányába (energiaveszteség!).
fluoreszcencia intenzitás (a.u.)
Stokes-féle eltolódási törvény
hullámhossz (nm)
Fluoreszcencia gerjesztési és emissziós spektrumok tükörszimmetriája.
4
Jablonski diagram
Foszforeszcencia Gerjesztett-állapot
• A foto-lumineszcencia egy típusa.
belső átalakulás - hő (10-12s)
S1 KashaKasha-szabá szabály! ly!
Tükörké rkép szabá szabály!
– Időtartam (élettartam): ~10-3 – 10-1s (~ms - s) – Triplett - szingulett átmenettel jár – Spinátfordulás – tiltott átmenet!
gerjesztés (10-15s) S0 – S1
S1 – S0 (10-8s)
StokesStokes-féle eltoló eltolódási tö törvé rvény!
hν
5 4 3 2 1 0
S0
vibrációs szintek
Alap-állapot
Foszforeszcencia
Jablonski diagram Gerjesztett-állapot
Vibrációs relaxáció (10-12s)
S1 S1 → T1: rendszerek közötti átmenet (10-10 – 10-8 s) T1 gerjesztés (10-15s) T1 → S0 (10-3 – 10-1s )
S0 – S1 hν
5 4 3 2 1 0
S0
vibrációs szintek
Alap-állapot
Fluoreszcens folyamatok időtartama átmenet
elnevezé elnevezés
sebessé sebességi állandó llandó jele
idő időtartam (s)
S(0) → S(1) (Sn)
gerjesztés
-
10-15
S(n) → S(1)
belső átalakulás
k(ic)
10-14 - 10-10
S(1) → S(1)
vibrációs relaxáció
k(vibr.)
S(1) → S(0)
fluoreszcencia
k(f)
10-9 - 10-7
S(1) → T(1)
rendszerek közötti átmenet
k(intersys.crossing)
10-10 - 10-8
S(1) → S(0)
sugárzásmentes átmenet
k(q)
10-7 - 10-5
T(1) → S(0)
foszforeszcencia
k(p)
10-3 - 1
T(1) → S(0)
sugárzásmentes átmenet
k(qp)
10-3 - 1
10-12
-
Fluorofórok Fluoreszcenciára képes molekulák. –
Belső fluorofórok (természetben előfordulnak) – aromás aminosavak (triptofán, tirozin, fenilalanin)
–
Külső fluorofórok – IAEDANS, FITC…
10-10
5
Hogyan mérünk fluoreszcenciát?
Luciferin
(‘steady-state’ eset) hullámh. fényforrás
választás
minta
hullámh. választás
detektor
Nem lineáris elrendezés !!!
SPEKTROFLUOROMÉTER SEMATIKUS RAJZA F
M
S
P
A fluoreszcencia alkalmazásának előnyei
- jó detektálhatóság: kis koncentrációban is jól mérhető - a fluoreszcencia érzékeny a környezetre
90o P M
D
Nem lineáris elrendezés !!!
A fluoreszcencia alapvető paraméterei • • • • •
Fluoreszcencia spektrum Intenzitás Kvantumhatásfok Élettartam Polarizáció
Kvantumhatásfok (Q) • Milyen hatásfokkal fordítódik az elnyelt energia fénykibocsátásra.
Q=
emittált fotonok száma abszorbeált fotonok száma
J EF = C ⋅ J E 0 ⋅ c ⋅ ε (λ ) ⋅ l ⋅ QF
6
Kvantumhatásfok (Q)
Q=
kf
Fluoreszcencia élettartam (τ) A gerjesztett állapot élettartama: Időtartam, mely alatt a gerjesztett molekulák száma e-ad részére csökken. 1.2
F0
1
F = F0 e
0.8
k f + k nr
0.6
F0 e
− ( k t + k nr ) t
= F0 e
−
t
τ
0.4
0.2
0 0
1
τ
Fluoreszcencia élettartam (τ)
τ=
2
3
4
5
6
7
8
9
10
t
Fényforrások: lámpák, lézerek
1 k f + k nr
Optikai szűrők Felüláteresztő szűrők
Optikai szűrők
Sáv szűrők
Aluláteresztő szűrők
7
A reakció sémája
Monokromátorok, polarizátorok, küvetták, detektorok
A fluoreszcencia koncentráció-függése Lineáris függést várnánk, de…! A belső-szűrő hatás (inner-filter effect) jelentkezik.
Fluoreszcens festékek: natív vagy intrinsic fluorofórok (definíció)
Triptofán, tirozin, fenilalanin
Előnyük: Nem kell módosítani a fehérjét.
Fluoreszcens festékek: külső vagy extrinsic fluorofórok - e.g., denzil, fluoreszcein, rodamin, kumarin, lantanidak
A fehérjék fluoreszcens jelölése - a jelölők minősége és elhelyezkedése tervezhető. - a fluorofórokat specifikus kötőhelyekhez kapcsoljuk. - így a fehérje módosulhat, aktivitását tesztelni kell.
8
A lényeg - a lumineszcencia jelensége - a fluoreszcencia és foszforeszcencia definíciója - fluoreszcencia paraméterek - Hogyan mérhetőek? - Alkalmazások (ld későbbi előadásokon is)
9
