Lumineszcencia mindenütt Fehérjék szerkezetvizsgáló módszerei Lumineszcenciás technikák Kellermayer Miklós
Fotolumineszcencia
Lumineszcencia mindenütt
Lumineszcencia mindenütt
Radiolumineszcencia Fotolumineszcencia
Lumineszcencia mindenütt
Lumineszcencia mindenütt
Radiolumineszcencia Aurora borrealis (sarki fény)
Biolumineszcencia
Lumineszcencia mindenütt
Lumineszcencia mindenütt
GFP-egér
Biolumineszcencia Szentjánosbogár Szuperrezoluciós mikroszkópia (Nobel-díj 2014)
Epifluoreszcencia mikroszkópia (citoszkeletális rendszer)
Fluoreszcencia
Lumineszcencia
Atomszerkezet Növekvő energiájú pályák
Gerjesztett állapotból fényemisszióval járó relaxáció A hőmérsékleti sugárzáson felül kibocsátott sugárzás
Fotonemisszió: E=hf
“Hideg fény” Fluoreszcencia és foszforeszcencia
Molekulaszerkezet
Molekula energiája Born-Oppenheimer - közelítés:
Molekula: kémiai kötéssel összekapcsolt atomok Legegyszerűbb eset: kétatomos molekula (pl., hidrogénmolekula)
E total = E e + E v + E r
A molekulák vibrációs és rotációs mozgásokat végeznek!
Fontos megjegyzések: Energia állapotok egymástól függetlenek (csatolás elhanyagolható) Állapotok energianívói kvantáltak Átmenetek energia “csomag” elnyelésével/kibocsátásával járnak Energiaszintek közötti különbségek nagyságrendje különbözik: ~100x
Vibrációs mozgás háromatomos csoportban (-CH2-):
~100x
Ee > Ev > Er ~3x10-19 J (~2 eV) > ~3x10-21 J > ~3x10-23 J Aszimmetrikus nyúlás
Szimmetrikus nyúlás
Ollózás
Energia állapotok ábrázolása
A lumineszcencia lépései
Vibrációs energiaszintek (vékony vonalak)
Abszorpció
Gerjesztés (magasabb energiaszintre lépés)
Első gerjesztett állapot Elektron energiaszintek (vastag vonalak)
Alapállapot
S: szingulett álapot; ellentétes spinű párosított elektronok (N.B.: Pauli-féle elv) T: triplett állapot; azonos spinű “párosított” elektronok
Emisszió
A lumineszcencia folyamatai
A lumineszcencia típusai Biolumineszcencia
Lumineszcencia típusa
abszorpció
fotolumineszcencia
kémiai reakció
kemilumineszcencia, biolumineszcencia
termikusan aktivált ion-rekombináció
termolumineszcencia
töltés injekció
elektrolumineszcencia
nagyenergiájú radioaktív sugárzás
radiolumineszcencia
súrlódás
tribolumineszcencia
hanghullámok
szonolumineszcencia
Gerjesztett állapot
Belső konverzió
Jablonski diagram
Vibrációs relaxáció “Intersystem crossing”
Energia
Gerjesztés módja
De-excitáció (relaxáció az alapállapotba)
Lumineszcencia típusa
első gerjesztett szingulett állapot
fluoreszencia
legalsó triplett állapot
foszforeszcencia
Szentjánosbogár
Gerjesztés
Fluoreszcencia
Foszforeszcencia
Kasha-szabály Fotonemisszió (fluoreszcencia vagy foszforeszcencia) a legalacsonyabb elektron-energiaállapotból történő átmenet során lép fel.
Az átmenetek sebessége (időskálája) fluoreszcencia
foszforeszcencia
10-9 s
10-6 - 10 s
gerjesztés
10-15 s
alapállapot
gerjesztett állapot vibrációs relaxáció
relaxáció
10-12 s
kioltás vagy energiatranszfer
belső konverzió (hő)
Intenzitás (norm.)
Michael Kasha (1920-) Amerikai fizikus
A lumineszcencia tulajdonságai I.
A lumineszcencia tulajdonságai II.
Lumineszcencia spektrumok
Kvantumhatásfok
Fluoreszcencia gerjesztési spektrum (emisszió 340 nm-nél) Fluoreszcencia emissziós spektrum (gerjesztés 295 nm-nél)
Foszforeszcencia emissziós spektrum (gerjesztés 295 nm-nél)
Φ=
emittált fotonok száma ≤ 1 abszorbeált fotonok száma knr=nem sugárzásos átmenetek sebességi állandói
• Sávos színkép • Gerjesztési és
emissziós spektrumok tükörszimmetrikusak
• “Stokes shift”
A gerjesztett állapot élettartama
(
− k +k t N = N 0e ( f nr )
1 τ= k f + k nr Hullámhossz (nm)
)
dN = − k f + k nr ⋅ N dt
N=gerjesztett állapotú molekulák száma t=idő kf=fluoreszcencia sebességi állandó knr=nem-sugárzásos átmenetek sebességi állandója τ=fluoreszcencia élettartam
Gerjesztés során elnyelt energia sorsa
A fluoreszcencia mérése Fluoreszcencia spetrométer
Belső konverzió (hő)
(“Steady-state” spektrofluoriméter)
kic kisc
Küvetta (minta)
Rendszerek közötti átmenet S→T
Gerjesztő monokromátor
ENERGIA
kFRET
kf
Xe-lámpa
kQ
Fluoreszcencia kioltás
FRET
Emissziós monokromátor
Fluoreszcencia (ns) Foszforeszcencia (ms)
Sugárzásos v. nem sugárzásos átmenetek!
Fotodetektor
Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer
FRET •
Általánosan: •A gerjesztett állapotban lévő molekula (donor), valamint egy megfelelő spektroszkópiás követelményeket kielégítő molekula (akceptor) között dipól-dipól kölcsönhatás révén, sugárzás nélküli energiaátadás formájában jön létre. •
Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer (FRET): ha az energiatranszfer szereplői fluorofórok.
A gerjesztett donor relaxációjához hozzájárul az akceptor molekula emissziója!
hν hν
hν
-
D
E ~ kFRET ~ 1/R6
+
A +
R
A FRET feltételei • Fluoreszcens donor és akceptor molekula. • A donor és akceptor molekula közötti távolság (R) 2-10 nm! • Átfedés a donor emissziós spektruma és az akceptor abszorpciós spektruma között.
A FRET távolságfüggése Förster-távolság
R06 E= 6 R0 + R 6
(Az a távolság melyen a FRET hatásfok felére csökken: transzferhatásfok 0.5)
E
Fl intenzitás ill. OD
A fluorofórok közötti aktuális távolság
Hullámhossz (nm)
A FRET alkalmazása • Molekuláris mérőszalag: távolságmérés a nm-es (10-9m) tartományban. • Nagyon érzékeny! • Alkalmazás: – Molekulák közötti kölcsönhatások tanulmányozása. – Molekulákon belüli szerkezeti változások tanulmányozása.
R0
A fény elektromágneses hullám •Térben tovaterjedő elektromágneses zavar. •Tranzverzális hullám. •Polarizálható. Mágneses tér oszcillációja
Hul lám hos sz
Tovaterjedés iránya Elektromos tér oszcillációja
Polarizáció, anizotrópia
Polarizáció, anizotrópia
Iz abszorpciós vektor
Fotoszelekció: Vertikálisan síkpolarizált gerjesztő fény
Fluorofórokhoz rendelhető abszorpciós és emissziós vektor: megszabja a foton abszorpció és emisszió valószínűségét.
random populációból az elektromos vektorral párhuzamos abszorpciós vektorú festékmolekulák kiválasztása
Ix V
Iy
polarizációs szűrő H
Abszorpció maximális, ha absz. vektor és a fény elektromos vektora párhuzamos. Abszorpció képessége függ cos2α-tól (α az absz. vektor és a fény elektromos vektora közötti szög).
A fluoreszcencia orvosibiológiai alkalmazásai
IV IH
Polarizáció:
p=
IVV − IVH IVV + IVH
Anizotrópia:
DNS festés (EtBr) DNS microarray technológia
• Intrinsic fluorofórok
triptofán, tirozin
Immunfluoreszcencia Fluoreszcencia-aktivált sejt válogatás (FACS) Förster rezonancia energia transzfer (FRET) “Fluorescence recovery after photoleaching” (FRAP) Fluoreszcens fehérjekonjugációs technikák Kvantum pontok (quantum dots)
IVV − IVH IVV + 2IVH
Fehérjefluoreszcencia forrása
Fluoreszcencia mikroszkópia DNS szekvenálás (lánc terminációs módszer)
r=
• Extrinsic fluorofórok
kívülről bevitt festékmolekulák,
"fluoreszcens jelölés"
kémiai specificitás?
térbeli specificitás?
Fluoreszcens jelölési technikák
Fluoreszcens jelölési technikák 1. Natív oldalláncok jelölése
1. Natív oldalláncok jelölése 2. Célzott pontmutagenezis
Fluorofór:
3. Peptid ligáció
festékmolekula +
4. C-terminális jelölés puromicin-származékokkal
kémiai keresztkötő
5. Nem természetes aminosavak pontmutagenezise
TMRIA
(egyedi fluorofór analízisre nem igazán alkalmas)
6. Fehérjekomplexek rekonstituciója előre megjelölt alegységekből
Relatív kémiai specificitás (SH, NH2) Relatív térbeli specificitás Lépések: -moláris arány számítása -inkubálás -nem kötődött festék eltávolítása (dialízis, kromatográfia)
7. Fluoreszcens fehérjékkel való konjugálás 8. Kvantumpontok
Fluoreszcens jelölési technikák
Fluoreszcens jelölési technikák
2. Célzott pontmutagenezis Cisztein aminosav célzott elhelyezése
3. Peptid ligáció Fehérje "összeállítása" szintetikus, fluoreszcensen jelölt peptidekből
Bifunkcionális fluorofór tioészter
MT orientáció
Kinezin motor domén
N-terminális cisztein*
peptidkötés
*Csak N-terminális cisztein vesz részt a reakcióban
Fluoreszcens jelölési technikák
Fluoreszcens jelölési technikák
4. C-terminális jelölés puromicin-származékokkal Puromicin: -riboszóma A helyére, az aminoacyl tRNS helyére kötődő antibiotikum -fehérjeszintézist gátol -kovalensen kapcsolódik a már megszintetizálódott fehérje C-terminálisához -fluoreszcens konjugátumai fehérjejelölésre használhatók
5. Nem természetes aminosavak pontmutagenezise
1. Direkt: intrinzic fluorofór származékok (pl. 7-aza-triptofán) 2. Indirekt: nem proteinogén reaktív csoportpokat (pl. keto) tartalmazó aminosavak
6. Fehérjekomplexek rekonstituciója előre megjelölt alegységekből Multi-subunit (alegység) fehérjék, fehérjekomplexek esetén
Fluoreszcens jelölési technikák 7. Fluoreszcens fehérjékkel való konjugálás
Fluoreszcens jelölési technikák 8. Kvantumpontok
1. Zöld fluoreszcens fehérje (Green Fluorescent Protein, GFP) Félvezető nanokristályok Emissziós spektrum a méret függvénye Méret: ~27 kDa, 238 aa Szerkezet: 11-szálú β-hordó Kromofór: a központi hélix Ser65-Tyr66-Gly67 oldalláncaiból Fluoreszcencia 3D szerkezet intaktságától függ
(CdSe)
Tandem fúziós konstrukció a GFP és a vizsgált fehérje génjeiből Előnyök: in vivo mérések, mutánsokból spektrális variánsok állíthatók elő, melyek több különböző konstrukció együttes vizsgálatát is lehetővé teszik . Hátrányok: pislogás, csak terminális (N vagy C) jelölés, a GFP a célfehérje működését szterikusan befolyásolhatja.
2. A GFP egyéb színű (kék, sárga, vörös) mutánsai 3. Fotoaktiválható GFP analóg 4. Kaede: korallból származó fluoreszcens fehérje, mely UV-indukálható zöld-vörös fotokonverziót mutat
(ZnS)
20 nm
(kémiai aktiválás)
Kvantumpont jelölés
Kvantumpont jelölés
gerjesztési spektrum emissziós spektrum
Előnyök: széles gerjesztési spektrum hangolható emissziós spektrum fotokifehéredéssel szemben rendkívül ellenállóak
Vörös: aktin Zöld: Laminin Kék: sejtmag
A mouse intestinal section visualized using fluorescent Qdot nanocrystal conjugates. Actin was labeled with a mouse anti-actin monoclonal antibody and visualized using red-fluorescent Qdot 655 goat F(ab')2 anti–mouse IgG. Laminin was labeled with a rabbit anti-laminin polyclonal antibody and visualized using green-fluorescent Qdot 525 goat F(ab')2 anti–rabbit IgG. Nuclei were stained with blue-fluorescent Hoechst 33342
Lézerek mindenütt
Lumineszcencián alapuló fényerősítés: Lézer Alapok, tulajdonságok, alkalmazások
5 mW diódalézer néhány mm
Terawattos NOVA lézer Lawrence Livermore Laboratories Futballpálya méret
Lézer:
Lézertörténet dióhéjban
“Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation”
E2
hν hν
E1
MASER: Microwave Amplification by Stimulated Emission of Radiation
A lézer alapjai I.
A lézer alapjai II.
indukált emisszió
Populáció inverzió
1. Abszorpció E2
1917 - Albert Einstein: indukált emisszió elméleti predikciója. 1946 - G. Meyer-Schwickerather: első szemműtét fénnyel. 1950 - Arthur Schawlow és Charles Townes: az emittált fotonok a látható tartományba eshetnek. 1954 - N.G. Basow, A.M. Prochorow, és C. Townes: ammónia mézer 1960 - Theodore Maiman: első lézer (rubin lézer) 1964 - Basow, Prochorow, Townes (Nobe-díj): kvantum elektronika 1970 - Arthur Ashkin: lézercsipesz 1971 - Gábor Dénes (Nobel-díj): holográfia 1997 - S. Chu, W.D. Phillips és C. Cohen-Tanoudji (Nobel-díj): lézeres atomhűtés.
2. Spontán emisszió
3. Indukált emisszió
N2
ρ(ν)
ρ(ν) B12
B21
Fényerősítés az energianívók relatív betöltöttségétől függ
A F
Aktív közeg
F+dF
dF=FA(N2-N1)dz
dz
A21 N1
E1
Átmenet gyakorisága: n12=N1B12ρ(ν)
Átmenet gyakorisága: n21=N2A21
Átmenet gyakorisága: n21=N2B21ρ(ν)
ΔE= E2-E1=hν
E2-E1 fotonok
energiakvantum elnyelésekor.
egymástól függetlenül a tér minden irányába.
Külső sugárzási tér hatására. Sugárzási tér energiája nő. Emittált és külső fotonok fázisa, iránya, frekvenciája megegyezik.
E2
E2
E1
Termikus egyensúly
Populáció inverzió
E2
• Populáció inverzió csak Magyarázat: kétállapotú atomi vagy molekuláris rendszer E1, E2 : energianívók, E2>E1 ρ(ν) : sugárzási tér spektrális energiasűrűsége N1, N2 : adott energianívón levő atomok, molekulák száma B12, A21, B21: energianívók közötti átmeneti valószínűségek (Einstein-féle együtthatók), B12 = B21
E1
többállapotú rendszerben! • Pumpálás: elektromos, optikai, kémiai energia
Gyors relaxáció E1
Metastabil állapot
Pumpálás Lézerátmenet E0
A lézerfény tulajdonságai I.
A lézer alapjai III. Optikai rezonancia Zárótükör (99.9%)
Pumpálás
1. Kis divergencia
Részlegesen áteresztő tükör (99%)
Párhuzamos nyaláb
2. Nagy teljesítmény Aktív közeg
Lézernyaláb
d=nλ/2
Rezonátor:
•két párhuzamos sík (vagy homorú) tükör •a kimenő fényteljesítmény egy részét visszacsatolja a közegbe •pozitív visszacsatolás -> öngerjesztés -> rezonancia •Optikai zár a rezonátorban: Q-csatolás, impulzus üzemmód
Folytonos üzemmódban több tíz, akár száz W (pl. CO2 lézer) Q-csatolású üzemmódban a pillanatnyi teljesítmény hatalmas (GW) Kis divergencia miatt óriási térbeli teljesítménysűrűség
3. Kis spektrális sávszélesség “Monokromaticitás” Nagy spektrális energiasűrűség
4. Polarizáltság 5. Rendkívül rövid impulzusok lehetősége ps, fs
A lézerfény tulajdonságai II.
Lézertípusok Fényerősítő közeg alapján:
6. Koherencia fázisazonosság, interferenciaképesség Időbeli koherencia (különböző időpontokban emittált fotonok fázisazonossága) Térbeli koherencia (nyalábkeresztmetszet menti fázisazonosság)
1. Szilárdtest lézerek Kristályokba v. üveganyagokba bevitt fémszennyeződés; Rubin, Nd-YAG, Ti-zafír Vörös-infravörös spektrális tartomány; Folytonos, Q-kapcsolású üzemmód, nagy teljesítmény
2. Gázlézerek Legismertebb: He-Ne lézer (10 He/Ne). Kis energia, Széleskörű használat CO2 lézer: CO2-N2-He keverék; λ~10 μm; Óriási teljesítmény (100 W)
3. Festéklézerek Szerves festékek (pl. rodamin, kumarin) híg oldata; Pumpálásra más lézer használt Nagy teljesítmény (Q-kapcsolt módban); Hangolható
4. Félvezető lézerek Alkalmazás: holográfia
Összefekvő p- és n-típusú, szennyezett félvezetők határán. Rezonátor tükrökre nincs szükség (belső visszaverődés) Vörös, IR spektrális tartomány. Nagy kontinuus üzemmódú teljesítmény (akár 100W) Nyalábkarakterisztika nem túl jó. Kis méret miatt széleskörű alkalmazás.
Lézerek alkalmazása
Holográfia
Teljesítmény alapján
▪
5 mW – CD-ROM meghajtó
▪
5–10 mW – DVD lejátszó vagy DVD-ROM meghajtó
▪
100 mW – Nagysebességű CD-RW író
▪
250 mW – DVD-R író
▪
1–20 W – szilárdtest-lézer mikromegmunkálásra
▪
30–100 W – sebészeti CO2 lézer
▪
100–3000 W – ipari CO2 lézer (lézervágó)
▪
1 kW – 1 cm diódalézer rúd
Gábor Dénes
Hologram fotolemez felülete
Sebességmérés lézerrel LIDAR: “Light Detection and Ranging”
Hologram megtekintése
Hologram felvétele
Hologramok
MALDI-TOF: matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry
Lézer
Pásztázó tükör MALDI-TOF sémája
Felülnézeti elrendezés Gyorsítóba/ Detektorba Impulzus lézer N2, 337 nm Ionok
Felvétel: rekonstruált térbeli elhelyezkedés. Közlekedési sebességmérőben: 100 impulzus 0.3 s alatt
Minta 30 ˚
Mintatartó
Fluorescence activated cell sorter (FACS)
Lézer pásztázó konfokális mikroszkóp
Sejtszuszpenzió
fluorofór Folyadékköpeny
Áramló sejtek
Szűrők
Lézer
lézer
Detektor
Fókuszáló optika
Detektor i
Dikroikus tükör
Sejtszorter
ii
Lencsék és zűrők fluorofór
Szferikus sejtek
Ovoid sejtek
Teljes belső visszaverődés fluoreszcencia mikroszkópia (TIRFM)
Lézercsipesz Lézer
evaneszcens mező
I ( z) = I0e
−z d
d=karakterisztkus hossz z=távolság
n2 n > n 1 2 n1
Mikroszkóp objektív
fluorofórok fedőlemez
F Fénytörő mikrogyöngy
objektív (NA1.45)
F
Grádiens erő
EGYENSÚLY Szórási erő (fénynyomás)
Lézer nyaláb Alexa532-vel jelölt bakteriális flagellumok
Csomókötés egyetlen DNS láncra
Csomókötés aktin filamentumra lézercsipesszel
mikrogyöngy mozgatható lézercsipeszben Fáziskontraszt kép
Fluoreszcencia kép
mikrogyöngy stacionárius lézercsipeszben Kinosita Group Arai et al. Nature 399, 446, 1999.
Fehérjegombolyodás vizsgálata: Stopped-flow
Fehérjegombolyodás vizsgálata tranziens kinetikai módszerekkel
Fehérjegombolyodás vizsgálata: Quench-flow
Analitika kémiai módszerekkel (SDS-PAGE, stb.)
