LIPIDY
IZOLACE CELKOVÝCH LIPIDŮ LIPIDŮ
• pro stanovení celkového množství lipidů • pro další detailní rozbory charakteru lipidů Obecné Obecné pož požadavky na izolaci ¾ selektivita (absence nelipidických složek) ¾ zachování nativní struktury - nutnost desaktivace lipolytických a oxidativních enzymů (ochrana polynenasycených mastných kyselin) - minimalizace autooxidace
Zajištění kvantitativních výsledků – nutnost užití směsi mísitelných rozpouštědel: nepolá (nejčastě astěji uhlovodí uhlovodík) – nepolární rní (nejč rozrušení hydrofobních a van der Waalsových interakcí s matricí polá polární rní (alkohol) – přerušení vodíkových a iontových vazeb na lipidy a polysacharidy
1
Přehled metod izolace a stanovení celkových lipidů Postup podle
Štěpení Rozpouštědla Použitelnost vodíkových vazeb Soxhleta ne pentan, hexan, vzorky s petrolether, nízkým chloroform, obsahem vody, diethylether hlavně neutrální lipidy Grossfelda ano diethylether vzorky s vysokým (HCl) obsahem sacharidů (peč (pečivo)
Postup podle
FOLCHE
Postup podle
Štěpení Rozpouštědla vodíkových vazeb ano
chloroformmethanol (2:1)
Štěpení Rozpouštědla vodíkových vazeb
ano ROSEHO, GOTTLIEBA (NH4OH) (př (přesná esná rozhodč rozhodčí metoda !)
Použitelnost
vzorky s vyšším obsahem vody a polárních lipidů jako fosfolipidy a komplexní lipidy (maso a masné masné výrobky)
Použitelnost
ethanol, vzorky s diethylether, vyšším petrolether obsahem vody a lipoproteinů, bílkovin a sacharidů (mlé (mléko a některé které mlé mléčné výrobky)
2
Postup podle
Štěpení vodíkových vazeb
Rozpouštědla
Použitelnost
Schmida, Schmida, BondzynskihoBondzynskihoRatzlaffa
ano (HCl)
ethanol, diethylether, petrolether
vzorky s vyšším obsahem vody a bílkovin (sýry, maso a masné masné výrobky)
Î GRAVIMETRICKÁ GRAVIMETRICKÁ KONCOVKA odpař odpaření ení rozpouš rozpouštědla, zvá zvážení ení rezidua
BĚŽN ĚŽNÉ TYPY EXTRAKTORŮ EXTRAKTORŮ: aparatura dle SOXHLETA X
STANOVENÍ STANOVENÍ CELKOVÝCH LIPIDŮ LIPIDŮ RYCHLÝMI FYZIKÁ FYZIKÁLNÍ LNÍMI METODAMI ¾ Metoda butyrometrická butyrometrická (Gerberova) Gerberova) - vzorek resp. tukové tukové kulič kuličky se hydrolyzují hydrolyzují H2SO4 - uvolně uvolněný tuk se po př přídavku 11-pentanolu (amylalkoholu) amylalkoholu) odstř odstředí edí - objem tuku se odeč odečte na stupnici butyrometru (% hm.) - vhodné vhodné pro mlé mléko, smetanu, sýry
3
Butyrometr na mléko A – kalibrovaná stupnice,B – tělo butyrometru C – hrdlo butyrometru, D - zátka
¾ Metoda denzimetrická denzimetrická - extrakce 1,2-dichlorbenzenem - stanovení hustoty extraktu - odečet % tuku z kalibračního grafu (olejniny) modifikace: - stanovení dielektrické konst., - indexu lomu apod.
¾ Metoda nízkorozliš zkorozlišovací ovací NMR spektrometrie Měření signálu pohyblivějších protonů kapalného podílu vzorku – signál příslušející vodě se eliminuje kalibrací, vysušením, převedením do tuhé fáze ... Použití: • obsah oleje v semenech, extrakčních šrotech • podíl tekutého podílu lipidů v emulzích, margarínech
4
A – obalový pás vodíků tuhé fáze B – ostrý pás vodíků kapalné fáze C – plocha odpovídající podílu kapalné fáze M - frekvence
Nízkorozlišovací NMR-spektrum jedlého tuku
STANOVENÍ STANOVENÍ FUNKČ FUNKČNÍCH SKUPIN LIPIDŮ LIPIDŮ „Klasické“ Klasické“ postupy charakterizace lipidů lipidů Tukové číslo kyselosti
zmýdelnění esterové
Tukové číslo
Míra obsahu
Vyjádření obsahu
volných mastných kyselin
mg KOH na 1 g tuku nebo ml KOH (c = 1 mol.l-1) na 100 g tuku = stupeň kyselosti veškerých mastných mg KOH na 1 g kyselin esterově vázaných mastných kyselin
Míra obsahu
mg KOH na 1 g
Vyjádření obsahu
hydroxylové
hydroxylových skupin (parciálních esterů glycerolu)
mg KOH na 1 g acetylovaného tuku
jodové
dvojných vazeb
% halogenu (jako jod) vázaného lipidy
rhodanové
polyenových mastných kyselin
% rhodanu (jako jod) vázaného lipidy
5
Tukové číslo
Míra obsahu
Vyjádření obsahu
dienové
konjugovaných mastných kyselin
% maleinanhydridu (jako jod) vázaného lipidy
Reichertovo – Weiselovo
těkavých mastných kyselin (ve vodě rozpustných dtto ve vodě nerozpustných)
mg KOH na 1 g tuku
Polenského
¾ Číslo jodové jodové Na dvojné vazby lipidů se váže (aduje) halogen, jeho nespotřebované množství (vyjádřené jako jod) se stanoví titrací thiosíranem CH=CH
+ BrI
CH
CH
Br
I
BrI + KI → I2 + KBr I2 + 2 Na2S2O3 → 2 NaI + Na2S4O6 Hanušova metoda: BrI Wijsova metoda: ICl
* existuje řada modifikací Ö vždy je třeba specifikovat použitý postup
* metoda je nevhodná pro oxidované a polymerované lipidy
Příklad hodnot jodového čísla: slunečnicový olej ~ 125 kokosový olej ~ 8
6
¾ Číslo zmýdelně zmýdelnění zmýdelnění přebytkem KOH Æ neutralizace HCl s použitím fenolftaleinu jako indikátoru stanovení K iontů vázaných v mýdlech pomocí titrace HCl na bromfenolovou modř ¾ Číslo kyselosti lipidy rozpuštěné v polárním rozpouštědle se titrují alkoholickým roztokem KOH (fenolftalein nebo thymolftalein) - posouzení posouzení rozsahu hydrolytické hydrolytického žluknutí luknutí (lipá (lipázy, technologické technologické operace jako smaž smažení ení ...)
¾ Číslo hydroxylové hydroxylové rozpuštěné lipidy resp. volné hydroxylové skupiny se acetylují acetanhydridem (v prostředí pyridinu) Æ stanoví se přírůstek obsahu esterových vazeb
• titrač titrační metoda: metoda: CH2 -O-CO-R´
CH2 -O-CO-R´ CH-O-CO-R´´
+ (CH3CO)2O
CH2OH
CH-O-CO-R´´
+
CH3COOH
CH2 -O-CO-CH3
Rozložení přebytku acetanhydridu, titrace uvolněné octové kyseliny: (CH3CO)2O + H2O → 2 CH3COOH 2 CH3COOH + 2 NaOH
→ 2 CH3COONa
7
• spektrofotometrická spektrofotometrická metoda: - výpočet z rozdílu esterových vazeb před a po acetylaci (po rozložení přebytku acetanhydridu se tuk izoluje do rozpouštědla nemísitelného s vodou) a) vznik hydroxamových kyselin: CH2 -O-CO-R´
´ + R´-C
R´-C
+ CHOH OH
OH
CH2OH
CH2OH
NOH
NOH
CH-O-CO-R´ + 2 NH2OH
CH2OH
b) vznik barevného produktu s železitými solemi: NH-O-
N-O-
NOH + Fe3+
3 R´- C
R´- C
OH
OH
O
NOH + 3 NH2OH
R´- C
CH2OH +
OH
+ OH
NOH CH3 - C
3
NOH
+ R´-´ C OH
CH2 -O-CO-CH3
Fe
R´- C
3
CH2 -O-CO-R´ CH-O-CO-R´´
nebo
Fe
CHOH CH2OH
- charakterizace emulgátorů (parciálních esterů glycerolu); přítomnost ricinolejové kyseliny
STANOVENÍ STANOVENÍ FRAKCÍ FRAKCÍ LIPIDŮ LIPIDŮ METODY SEPARACE podle uspořádání
chromatografie v plošném uspořádání (TLC) sloupcová chromatografie HPLC (GLC) podle principu ` adsorpční chromatogarfie ` rozdělovací chromatografie ` ionexová chromatografie
8
Sorbenty použ používané vané pro LC frakcionaci lipidů lipidů • deaktivovaný Florisil – magnesium silikát (7 % vody) • silikagel (5 – 10 % vody) • oxid hlinitý (5 %)
TLC
Příklad 1. separace lipidů na silikagelu (Merck)
vyvíjecí soustava: hexan – Et2O – k. octová (70 : 30 : 1) detekce: 2´,7´- dichlorfluorescein / UV
Sloupcová Sloupcová LC Příklad 2.
Separace lipidů na koloně Florisilu (35 x 170 mm, 30 g, 60 – 100 nm), eluce podle vzrůstající polarity
ml elučního činidla
skupina eluovaných lipidů
hexan
diethylether
methanol
100
-
-
uhlovodíky
95
5
-
estery cholesterolu
85
15
-
75
25
-
triacylglyceroly + volné mastné kyseliny volný cholesterol
50
50
-
diacylglyceroly
-
90
10
monoacylglyceroly
9
SEPARACE NEUTRÁ NEUTRÁLNÍ LNÍCH LIPIDŮ LIPIDŮ - STRUKTURNÍ STRUKTURNÍ ANALÝZA TRIACYLGLYCEROLŮ TRIACYLGLYCEROLŮ • Dělení TGA podle zastoupení mastných kyselin – chromatografické metody (GC, HPLC)
GC Požadavky na instrumentaci: • možnost programování teploty až do 350 – 400 oC • injektor „on-column“ • FID nebo „light scattering“ detektor
Příklad 1: Dělení triacylglycerolů kokosového oleje na náplňové koloně s 1% JXR na Gas-ChromQ, teplota 250 – 360 oC, 3 oC/min, nosný plyn: dusík 50 ml/min
Příklad 2: separace máselného tuku na křemenné kapilární koloně (25 m x 0.25 mm) s relativcně polární stacionární fází TAP (0.1 μm), teplota 260 – 360 oC, 3 oC/min, FID, vodík 2 ml/min
10
STANOVENÍ STANOVENÍ NEZMÝDELNITELNÝCH LÁ LÁTEK které které látky patř patří do té této skupiny? Ö extrahovatelné organickými rozpouštědly spolu s lipidy Ö nerozkládají se za podmínek zmýdelnění ( = účinkem hydroxidů alkalických kovů)
` pigmenty (např. karotenoidy) ` uhlovodíky ` vyšší alifatické alkoholy ` steroly (volné, esterifikované, glykosidy) ` tokoferoly ` (minerální či silikonové oleje)
STANOVENÍ CELKOVÉHO OBSAHU NEZMÝDELNITELNÝCH LÁTEK Æ lipidy se zmýdelní (1 M KOH v ethanolu; 1 hod., 95 o
C)
Æ nezmýdelnitelné látky se extrahují petroletherem nebo diethyletherem Æ rozpouštědlo se odpaří a odparek se zváží (gravimetrie)
11
STANOVENÍ STANOVENÍ FRAKCÍ FRAKCÍ NEZMÝDELNITELNÝCH LÁTEK ¾ Předběž ná separace pomocí edběžn pomocí TLC, přednostně ednostně ale HPLC Příklad: HPLC separace nezmýdelnitelného podílu slunečnicového oleje (LiChrosorb Si-60, 250 x 4.6 mm; hexan – isopropanol, 99 : 1), RID I – neidentifikovaná frakce, II – 4-monomethylsteroly, III – Δ5-steroly, IV – Δ7-steroly, V – vnitřní standard (betulin)
STANOVENÍ STANOVENÍ STEROLŮ STEROLŮ Stanovení Stanovení celkové celkového obsahu sterolů sterolů ¾ lipidy se zmýdelní ¾ volné steroly se srazí digitoninem a stanoví vážkově CH3 CH3 CH3 RO
O
CH3 H
O
Digitonin R,R´ : 2 D-glukosa 2 D-galaktosa 1 L-xylosa
OH
R´O
Stanovení Stanovení jednotlivých sterolů sterolů metodou GC ¾ lipidy se zmýdelní ¾ nezmýdelnitelný podíl se izoluje a rozdělí chromatografií na tenké vrstvě či pomocí HPLC Î vyšetření pomocí metody GC (často po derivatizaci na trimethylsilylethery) Detekce: - běžně pomocí FID - identifikace podle retenčních časů - selektivněji pomocí hmotnostně spektrpometrického detektoru (MSD) – zohlednění struktury
12
Příklad: Separace sterolů slunečnicového oleje pomocí kapilární GC/FID; o kolona CP Sil 19 CB (25m x 0.32 mm); isotermně 265 C
1 – cholesterol, 2 – campeterol, 3 – campestanol, 4- stigmasterol, 5 – Δ7 campesterol, 6 – cholesterol, 7 – β-sitosterol, 8 – stigmastanol, 9 – Δ5-avenasterol, 10 – Δ5-24-stigmastadienol, 11 – 7Δ-stigmasterol, 12 – 7Δ-avenasterol
Enzymová Enzymová metoda stanovení stanovení cholesterolu Komerční kity – pro volný cholesterol, vázaný je třeba uvolnit cholesterol + O 2
cholesteroloxidasa
katalasa
H2O2 + CH3OH
5-cholesten-3-on + 2HO2
H-CH=O + 2 H 2O COCH3
H3CCO H-CH=O + CH 3-C-CH2-C-CH3 O
O acetylaceton
+ NH3
+ 3 H2O H3C
N
CH3
3,5-biacetyl-1,4-dihydrolutidin
STANOVENÍ STANOVENÍ FOSFOLIPIDŮ FOSFOLIPIDŮ • Izolace tuhé vzorky – extrakce směsí chloroform – methanol, hexan – isopropanol, dichlormethan – methanol Æ potřeba rozrušení lipid-proteinových komplexů Æ oddělení od triacylglycerolů z roztoků v nepolárních rozpouštědel – precipitace acetonem tekuté vodné vzorky – směs methanolu a chloroformu Æ vysolení – fosfolipidy v organické vrstvě
13
STANOVENÍ STANOVENÍ CELKOVÉ CELKOVÉHO OBSAHU FOSFOLIPIDŮ FOSFOLIPIDŮ
¾ Konverze organického fosforu na anorganický - lipidy se mineralizují na mokré cestě - fosfor se stanoví spektrofotometricky jako molybdenová modř (viz stanovení fosforu)
STANOVENÍ STANOVENÍ SLOŽ SLOŽENÍ ENÍ FOSFOLIPIDŮ FOSFOLIPIDŮ - FRAKCIONACE TLC na silikagelu chromogenní činidla: ♦ směs octanu měďnatého, kyseliny fosforečné a sírové (barva závisí na stupni nenasycenosti) ♦ molybdenové činidlo (reaguje s fosforem) ♦ Dragendorffovo činidlo (pro deriváty cholinu) ♦ ninhydrin (pro deriváty obsahující aminoskupinu)
¾ Extrakce na tuhou fázi (solid phase extraction, SPE) Oddělení fosfolipidů od neutrálních lipidů
Princip SPE
14
Stacionární fáze Sep-Pak silica
Sep-Pak silica
Sep-Pak silica
Mobilní fáze 10 ml chloroform 10 ml petrolether/diethyl ether (7:93) 30 ml methanol 40 ml hexan/diethylether (1:1) 20 ml methanol 20 ml CHCl3/CH3OH/H2O (3:5:2) 20 ml chloroform 30 ml methanol
Frakce NL PL NL PL NPL PL
Stacionární fáze Mobilní fáze Sep-Pak silica chloroform aceton/methanol (9:1) chloroform/methanol (1:1) Bond-Elut chloroform/2-propanol (2:1) aminopropyl k. octová/diethylether (2:98) methanol Sep-Pak silica 10 ml petrolether/diethylether (95:5) 20 ml diethylether 10 ml methanol Bond-Elut silica 30 ml hexan/diethylether (20:80)
Frakce NL
30 ml methanol
PL
PL NL FFA PL TG
PL NPL
HPLC metody Příklad: Separace fosfolipidů kravského mléka kolona: Sperisorb (100 x 4.6 mm), hexan-2-propanol, detektor: evaporative light scattering
15
Stanovení Stanovení trans mastných kyselin
Trans9-octadecenoic acid (Elaidic acid) Cis9-octadecenoic acid (Oleic acid)
ANTINUTRIČNÍ VLASTNOSTI
STANOVENÍ STANOVENÍ MASTNÝCH KYSELIN Stanovení Stanovení trans mastných kyselin INFRAČ INFRAČERVENÁ ERVENÁ SPEKTROMETRIE Absorbce při 967 cm-1, (10.34 µm) deformace přilehlých C-H vazeb Příklad: Vyhodnocení infračerveného spektra při stanovení trans-vazeb; A – absorbance, P´,Q´- korigovaná hodnota
Stanovení Stanovení konjugovaných mastných kyselin ¾ Mastné kyseliny a jejich estery s konjugovanými dvojnými vazbami (na rozdíl od polyenových kyselin) absorbují při: - 233 nm (konjugované dieny: -CH=CH-CH=CH- 268 nm (konjugované trieny: -CH=CH-CH=CH- CH=CH-)
Stanovení SPEKTROFOTOMETRICKÉ
16
Stanovení Stanovení esenciá esenciální lních mastných kyselin ENZYMOVÉ ENZYMOVÉ ¾ Esenciá Esenciální lní mastné mastné kyseliny a jejich estery se oxidují oxidují lipoxygenasou (linoleá linoleát: O2 oxidoreduktasa, oxidoreduktasa, EC 1.13.1.13) na př přísluš slušné hydroperoxidy V rá rámci finá finální lního kroku se stanoví stanoví: ` úbytek O2 manometricky ` absorbance při 232 nm (absorbance konjugovaných hydroperoxidů hydroperoxidů) - spektrofotometrie ` Fe3+ vzniklé vzniklé oxidací oxidací Fe2+ - spekrofotometrie Fe2+ + RR-O-O-H → Fe3+ + RO + OH-
Stanovení Stanovení jednotlivých mastných kyselin STANOVENÍ STANOVENÍ POMOCÍ POMOCÍ GC ¾ niž nižší mastné mastné kyseliny se stanoví stanoví jako volné volné nebo po př převedení evedení na butylestery – analýza mlé mléčných výrobků výrobků Obecny postup: mastné mastné kyseliny se př převedou př před GC analýzou na METHYLESTERY v rá rámci ná následují sledujících kroků kroků (i) Zmýdelně Zmýdelnění
*
jsoujsou-li mastné mastné kyseliny vá vázány v triacylglycerolech, triacylglycerolech, fosfolipidech, fosfolipidech, voscí voscích apod., musí musí se uvolnit zmýdelně zmýdelněním Î var s cca 1M metanolickým KOH v inertní inertní atmosfé atmosféře) a následně sledně extrakce do organické organického rozpouš rozpouštědla
(ii) ii) Příprava methylesterů methylesterů
•
Esterifikace methanolem v př přítomnosti kyselé kyselého katalyzá katalyzátoru – BF3 (Lewisova kyselina)
•
Kyselá Kyselá katalýza (HCl (HCl,, H2SO4 )
•
basicky katalyzovaná katalyzovaná reakce – např např. transesterifikace methoxidem sodným: R-COOH + CH3ONa → RCOOCH3 + RR-On
17
Příklad: GC separace methyl esterů mastných kyselin máselného oleje, BPX kapilára (25 m x 0.32 mm), FID (1) 4:0, (2) 6:0, (3) 8:0, (4) 10:0, (5) 10:1, (6) 12:0, (7) 14:0, (8) 14:1 n-5, (9) iso 15:0, (10) anteiso 15:0, (11) iso 16:0, (13) 16:1 n-7, (14) 17:1, (15) 18:0, (16) 18:1 n-9 + n-7, (17) 18:2 n-6, (18) 18:3 n-3, (19) conj, 18:2, (20) 20:0
STANOVENÍ STANOVENÍ METODAMI HPLC ` volné mastné kyseliny – malá detekční citlivost RID ` derivatizace - absorbce v UV (např. fenacylestery) Příklad: HPLC v reverzní fázi, kolona - µBondapak™ C18), mobilní fáze - acetonitril - voda (gradient)
STANOVENÍ STANOVENÍ STUPNĚ STUPNĚ ŽLUKLOSTI
18
STANOVENÍ STANOVENÍ STUPNĚ STUPNĚ ŽLUKLOSTI Stanovení peroxidového čísla - indikace rozsahu žluklosti v úvodních fázích ` Hydroperoxidy mastných kyselin se stanoví stanoví JODOMETRICKY: JODOMETRICKY: ROOH + 2 I- + 2 H+ → ROH + I2 + H2O I2 + 2 Na2S2O3 → 2 NaI + Na2S4O6 Výsledky se vyjadřují jako peroxidové číslo (P.Č.) v mg aktivního kyslíku na 1 g tuku
Stanovení Stanovení p-anisidinové anisidinového čísla - indikace fáze rozkladu hydroperoxidů (vznik off-flavour) ` p-anisidin reaguje s 22-alkenaly a jinými aldehydy za vzniku barevné barevného produktu (Schiffovy (Schiffovy base), které které se stanoví stanoví SPEKTROFOTOMETRICKY
NH2 + O=CH-CH=CH-R
H3C O
H3C
O
N=CH- CH + H2O CH R
Výsledky se vyjadřují jako anisidinové číslo (absorbance při 400 nebo 430 nm, 1% roztoku tuku v 1 cm kyvetě)
Stanovení thiobarbiturového čísla - indikace fáze rozkladu hydroperoxidů (vznik off-flavour)
` 2-thiobarbiturová thiobarbiturová kyselina reaguje s malondialdehydem a 2,42,4-alkadienaly za vzniku barevné barevného produktu, stanovení stanovení SPEKTROFOTOMETRICKY SH 2
N
+ O=CH-CH2-CH=O
N
HO
OH
OH
N
N CH-CH= CH
S
SH N
N OH
OH
HO
Výsledky se vyjadřují jako thiobarbiturové číslo (absorbance při 530 nm, 1% roztok tuku v 1 cm kyvetě, nebo v mg malondialdehydu na 1 g tuku)
19
Stanovení Stanovení obsahu polymerů polymerů - indikace tepelného namáhání (smažení) ` Vzorek se frakcionuje pomocí pomocí VYLUČ VYLUČOVACÍ OVACÍ (GELOVÉ (GELOVÉ PERMEAČ PERMEAČNÍ) CROMATOGRAFIE Příklad: sójový olej po smažení - 1, 2 polymery, 2 TGA, 3 – volné mastné k. SCE kolona (300 x 7.8 mm; PL-GelTM (póry = 100 Å) tetrahydrofuran, RI detektor
STANOVENÍ STANOVENÍ STABILITY TUKŮ TUKŮ - různé zné typy testů testů podle využ využití ití dané daného tuku Schaalů Schaalův test ¾ Lipidy se skladují skladují při zvýš zvýšené ené teplotě teplotě za přístupu vzduchu a stanoví stanoví se ve vhodných intervalech stupeň stupeň oxidace a urč určí se indukč indukční perioda sledované sledované změ změny: peroxidové peroxidové číslo, př přírůstek hmotnosti, anisidinové anisidinové číslo, tě těkavé kavé slouč sloučeniny Æ jednoduchý test, vyž vyžaduje vš však velké velké množ množství ství vzorků vzorků, zdlouhavý (4 až až 8 dní dní)
Metoda aktivní aktivního kyslí kyslíku (AOM) o ¾ Vzorek oleje se provzdušňuje při teplotě 100 C
Æ oficielní oficielní metoda (AOAC) Metoda „kyslí kyslíkové kové bomby“ bomby“ pro stabilní tuky a oleje (např. fritovací, šorteningy, apod.) o ¾ vzorek udržován při 135 C, výchozí tlak kyslíku 110 psig, sleduje se pokles tlaku
Æ 2 – 10 x rychlejší než AOM
20
Expozice svě světlu pro různé typy výrobků jako bramborové lupínky, mléko apod. ¾ vzorek se ozařuje florescenčním světlem o intenzitě 7535 lux, teplota 30 oC Æ sleduje se změna senzorické jakosti, příp. vznik těkavých sloučenin
21
