Latar Belakang VAKSIN. Colony Forming Unit ( CFU) Metode Alternatif

Latar Belakang VAKSIN

PREVENTIF

KUALITAS & STABILITAS

JUMLAH BAKTERI HIDUP

Colony Forming Unit ( CFU) 1. Waktu pengujian yang lama 2. Tergantung pada medium pertumbuhan >> waktu inkubasi hingga 5 pekan. Pengembangan & Validasi metode ATP

Metode Alternatif

Metode ATPBioluminesens

Belum ada laporan Validasi metode

Metode ATP-Bioluminesens Reaksi Enzimatik ( Sistem LuciferinLuciferase) dengan ATP :

Luminometer :

SAMPEL

Vaksin BCG SSI Danish strain 1331

1 vial >> 0.75mg BGC liofilisasi & 3.75mg Na.glutamat

Low Viability Sample Suhu 37˚C selama 28 hari

Intermediate Viability Sample Suhu 2-8˚C selama 12-18 bulan.

High Viability Sample Suhu 2-8˚C selama 1-3 bulan.

2. Reagen :

•

• •

• • •

Medium Dubos (0.045% Tween & 0.5% Bovine Albumin) Reagen ATP-SL ( rekonstitusi dengan 10 mL aqua pro injectione) Dapar Tris-asetat 0.1 M (dengan 2 mM EDTA, pH 7.75) Larutan Kerja Standar -5 ATP-Standar , 1 x 10 M. Sauton SSI encer. Larutan Kerja Apyrase

METODE ANALISIS 1. Penetapan ATP dalam Vaksin BCG - Ekstraksi ATP, sampel tanpa inkubasi - Ekstraksi ATP, sampel dengan pre-inkubasi 37˚C. - Pengukuran ATP

2. Penetapan CFU 3. Korelasi antara ATP – CFU 4. Validasi metode dengan tahapan Pre-inkubasi. 5. Analisis data

1. Penetapan ATP 1 vial Vaksin BCG + 400 µl sauton SSI dan 100 µl Apyrase. Didiamkan 10 menit. Ekstraksi ATP (tiap vial 3 x 100 µl suspensi BCG) dengan Buffer Tris-Asetat dengan EDTA ( 3 x 500 µl ) yang sebelumnya dipanaskan pada suhu 98-99°C. Campuran BCG-Buffer dijaga pada suhu 98-99°C selama 6 menit, ekstrak lalu didinginkan pada suhu kamar.

Tanpa Inkubasi Ekstraksi ATP

Dengan Preinkubasi 24 jam, 37˚C

Pengukuran ATP

1 vial vaksin BCG + 1.0 ml Media pertumbuhan mikroba ( Medium Dubos dengan Tween dan Bovine Albumin ), Nitrogen dialirkan selama 10-15 menit, vial ditutup. Inkubasi 24 jam suhu 37˚C sebelum ATP diekstraksi. Prosedur ekstraksi ATP, mengikuti prosedur ekstraksi ATP tanpa inkubasi.

Pengukuran ATP Ekstrak ATP ( 100 µg Suspensi BCG + 500 µl buffer)

Blanko (100 µl Sauton/Apyrase atau medium Dubos)

100 µl reagen ATP Suhu 25°C, signal 10 detik ( mV x 10 detik )

Diukur dengan Luminometer 1251

10/20µl Larutan ATP Standar

Konsentrasi standar 1.0-15 x 10-12 mol ATP

Reagen ATP

Output RLU (Relative Light Unit) >> ng ATP

2. Penetapan CFU 8 vial BCG, direkonstitusi dengan Sauton SSI hingga diperoleh konsentrasi 0.75mg BCG/ml. 3 seri pengenceran diinokulasikan pada Medium Lowenstein-Jansen, diinkubasi pada suhu 37˚C selama 5 pekan dan kemudian dihitung jumlah CFU.

3. KORELASI ATP -CFU Tujuan : Melihat hubungan viabilitas sampel lyophilised BCG dengan berbagai level berbeda hasil pengukuran dengan metode ATP dan CFU Sampel BCG tidak.di pre-inkubasi dalam media pertumbuhan sebelum pengukuran ATP. Samples (n = 43) ● : viabilitas rendah ▀ : viabilitas tinggi  Korelasi positif ( P < 0.01)  koefisien korelasi r = 0.53  Untuk pengukuran dengan metode ATP : overlapping antara viabilitas rendah dan tinggi www.themegallery.com

3. KORELASI ATP -CFU Sampel BCG di pre-inkubasi dalam media pertumbuhan selama 24 jam sebelum pengukuran ATP. Samples (n = 43) ● : viabilitas rendah ▲ : viabilitas sedang ▀ : viabilitas tinggi

 Korelasi positif ( P < 0.01)  koefisien korelasi r = 0.93

Metode pengukuran ATP dengan pre-inkubasi dalam media pertumbuhan meningkatkan korelasi antara ATP-CFU secara signifikan

4. Validasi Metode dengan Tahapan Preinkubasi

1. Robustness 2. Linearitas dan Rentang 3. Akurasi 4. Presisi

www.themegallery.com

1. Robustness (Kekuatan) Tujuan Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode dengan cara dibuat perubahan metode dengan kondisikondisi tertentu, apakah berbagai faktor tersebut berpengaruh terhadap respon yang dihasilkan.

Prosedur  Desain Faktorial (Software statistik JMP 6.0)  Menggunakan 16 vial Vaksin BCG dengan

Intermediate Viability

 Terdiri dari 8 faktor kondisi percobaan dengan 2 level www.themegallery.com

Desain Percobaan Robustness Faktor

Level

A. Pre-Inkubasi •Vial airing time before incubation •Incubation temperature •Incubation time •pH in Dubos medium

5 or 30 min 35 or 39 C 21 or 27 h pH 6.6 atau 7.0

B. Ekstraksi ATP •Time to preheat extraction buffer •Extraction buffer temperature •Heat treatment time •Covering cuvettes during extraction

10 or 20 min 97 or 100 C 5 or 10 min With or without


Hasil Robustness

Untuk masing-masing faktor, metode menunjukkan robust di masing2 level percobaan α =0.05 , tidak ada perbedaan yang signifikan pada masing2 hasil pengukuran ATP di berbagai kondisi percobaan www.themegallery.com

2. Linearitas dan Rentang  Linearitas Kemampuan metode analisis untuk memperoleh hasil uji yang proporsional (sepadan) terhadap konsentrasi analit dalam sampel dan dalam rentang konsentrasi yang digunakan.  Rentang Menunjukkan nilai terendah dan tertinggi hasil pengujian yang dapat ditentukan dengan cermat dan seksama.


Prosedur Linearitas Linearitas Linearitas Standar ATP Dibuat Variasi Konsentrasi Standar ATP dengan rentang 1.0-25 x10-12 mol ATP per kuvet

Linearitas ATP yang diekstrak dari BCG Total konsentrasi BCG (bakteri hidup dan mati) dalam sampel dibuat konstan dengan penambahan BCG yang telah dimatikan dengan pemanasan dan hanya konsentrasi ekstrak ATP yang dibuat bervariasi. www.themegallery.com

Linearitas ATP yang diekstrak dari BCG

500µl Buffer TrisEDTA

Untuk Vial Suspensi BCG dengan volume : 20 µl 40 µl 60 µl 80 µl Volume dibuat konstan dengan penambahan BCG yang telah dimatikan dengan pemanasan

total100 µl suspensi BCG

ATP standar dengan rentang konsentrasi 1.015 x 10-12 mol ATP/kuvet untuk mengkonversi respon BCGATP ke dalam mol-ATP


Hasil Linearitas 1. Kurva Linearitas ATP standar 1.0-25 x1012 mol ATP -> Koefisien Korelasi r ≥ 0,99 (kurva tidak ditampilkan)

2. Kurva Linearitas ATP yang diekstrak dari BCG dengan viabilitas yang berbeda pada konsentrasi BCG konstan -> Koefisien Korelasi r ≥ 0,99 www.themegallery.com

Hasil Rentang  Kurva ATP standard dengan rentang konsentrasi 1.0-15 x 1012 mol ATP menghasilkan respon dibawah konsentrasi standar (pada vial dengan low viability dengan volume terkecil ) dan respon diatas konsentrasi standar pada vial dengan high viability dengan volume terbesar.  Rentang pengukuran adalah tidak kurang dari 1.0-15 x 10-12 mol ATP untuk 100 µl suspensi BCG atau setara dengan 10-150 x 1012 mol ATP per vial vaksin


3. AKURASI  Tujuan Untuk mengukur ketepatan atau kedekatan hasil pengujian dengan hasil yang sebenarnya.  Prosedur 1. Menggunakan 15 sampel baru yang di pre-inkubasi 2. Hasil yang didapat kemudian dibandingkan dengan data korelasi antara ATP dengan jumlah CFU 3. Dibuat kurva regresi linier dengan derajat kepercayaan 95%. 4. Data hasil 15 sampel baru kemudian diplotkan tehadap kurva korelasi yang telah ada. www.themegallery.com

Hasil Akurasi



Hasil Akurasi Terdapat korelasi positif yang signifikan dengan nilai P < 0.0001, r = 0.934 Perhitungan hubungan antara metode ATP dan CFU : log (CFU) = -1.426 + 1.398 LOG (ATP) atau CFU = 0.037 ATP1.398


4 .Presisi  Definisi Tingkat kesesuaian antara hasil pengujian individual dengan rata-rata hasil pengujian berulang  Prosedur 1. Presisi dilakukan oleh 3 analis dalam 3 hari 2. Desain faktorial dilakukan untuk menguji repeatability dan intermediate precision dari sampel dengan low viability dan

high viability. 3. Repeatability: pengujian dengan 2 sampel (2x8 vial), diukur koefisien variasinya (CV) untuk repeatability. 4. Intermediate precision: Data dari desain percobaan dianalisa, dihitung sesuai dengan perhitungan intermediate precision. www.themegallery.com

Hasil Presisi


Hasil Presisi  Low Viability

1. Repeatability : 5.5% 2. Intermediate Precision : 15%

 High Viability

1. Repeatability : 5.1% 2. Intermediate Precision : 9.0%


Parameter dan Hasil Validasi

Akurasi Presisi -Repeatability -Intermediate Precision Linearitas Robustness

Hasil 5,1%-5,5% 9%-15% 99% r > 099

Cfu/plate 30-300 10-30 <10

Syarat >70% <15% <25% <35%

>95% Statistik tidak berbeda signifikan

Kesimpulan Metode ATP dengan pre-inkubasi memiliki tingkat kecepatan (rapid), kekuatan (robust), ketepatan (akurasi) dan keseksamaan (presisi) yang baik untuk mengetahui estimasi dari BCG viability. Metode ATP telah sesuai untuk tujuan pengujian rutin quality control BCG.


LOGO

Latar Belakang VAKSIN. Colony Forming Unit ( CFU) Metode Alternatif

Recommend Documents