);-l LAPORAN PENELITIAN HIBAH BERSAING LANJUTAN
fl-ffi-* EKSPLORASI BAKTERI PENGHASIL KITINASE DARI LUMPUR PERTANIAN DAN KERAGAMAN GEN PENGYANDI BAKTERI KITINOLITIK SEBAGAI GEN BIOKONTROL
Tim Peneliti
:
Nuniek Herdyastuti, S.Si., M.Si. Dr. Sari Edi Cahyaningrum, lM.Si. Dr. Tri Joko Raharjo, M.Si.
Dibiayaioleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Depailemen Pendidikan Nasional, sesuaidengan SuratPerjanjlan Pelaksanaan Hibah Kompeiillf Penelilian SesuaiPrio tas Nasional Nomof : 333/SP2H/PP/DP2fi{lr'l12009
DEPARTEMEN PENDIDIKAN NASIONAL REPUBLIK INDONESIA UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA LEMBAGA PENELITIAN 2009
:
Mi-i.a
1.
.
. , ,,21t-)ry c(t / vnt(A/2111 ..
ct t tao 4( / h; e_/F
{
LAPORAN PENELITIAN HIBAH BERSAING LANJUTAN
EKSPLORASI BAKTERI PENGHASIL KITINASE DARI LUIVPUR PERTANIAN DAN KERAGAMAN GEN PENGYANDI BAKTERI KITINOLITIK SEBAGAI GEN BIOKONTROL
Tim Peneliti
:
Nuniek Herdyasiuti, S.Si., M.Si. Dr. Sari Edi Cahyaningrum, [/.Si. Dr. TriJoko Raharjo, M.Si.
Dibiayaioleh Dlrekto€t Jenderal Pendid kan Tinggi, Departemen pendidikan Nasional, sesuaidengan Surat Pe4anjian Pelaksanaan Hibah Kompelitif Penelllian Sesuaiprioritas Nasional Nomor : 333/SP2H/PP/DP2I,1M/2009
DEPARTEMEN PENDIDIKAN NASIONAL REPUBLIK INDONESIA UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA LEMBAGA PENELITIAN 2009
IL{I-AMAN PENGT,SAIIAN LAPORAN AKHIR 1.
Judul
r Eksplo.asi Bakte.i Penghasil Kitinase Dari
Lumpur Pertanim dan Keragamafl Penyandi Bakteri Bioko rol 2. Ketua Peneliti
Kitirclitit
Gen
Sebagai Agen
:
a. Nama
:
Nuniek Herdyastuti, M-Si
b. JerLis Kelamin c. Pangkarcololgan
:
Perempuan
d, NIP
Tk. L{IId :197011101998022001
e. Jabatan Sekararg
i
Lellor
f. Fakultas/Jurusan?usat Pemlitian g. Alamat kantor/Telp./Fax-,8-mail
:
MIPA/Kimia,tlNESA
i Penata
Kampus UNESA Jl.Ketintang Surabaya/
:
(03 1 )8298761/
[email protected]
h. Alamat rumah/Telp./I ax./E-mail
i. Tim Peneliti No Narna 1
Nuliek Herdyastuti,
S.Si,
Jl.Karah 5/50 Jambangan Suabaya/ (031)8285623/
[email protected]
I
Bidang keahlian
Fakultas/Jurusan
Perguruatr Tinggi
Biokimia
MIPA,{aimia
Uoiv.Neg. S ulabaya
Biokimia Kimia Anorsanik
MIPA,{finia MIPA,{imia
Univ.Gadjah Mada Univ.Neg.Surabaya
M.Si 2. 3.
Dr.T
Joko Rahario. M.Si Dr. Sari Edi Cahyadngum, M.Si
3. Pendanaan dan jangka waktu penelitian a. Jangka Wallu Pelelitian : 2 Tahun b. Biaya total yang diusulkan : fu. 85.000.000,00 c. Biaya yang disetujui tahun II : Rp. 40.000.000,00
Mengetahui Dekan FMIPA tJl.{ESA
:Dr.dr.Tiandmktuarla. M. S. NIP, 19410423t97 3032001
Surabaya, 5 Nopember 2009 Ketua Peneliti
Nuriek Herdvastuti.M.Si NIP. 197011101998022001
EKSPLORASI BAI(TERI PENGHASIL KITINASE DARI LUMPT]R PERTANIAN DAN KERAGAMAN GEN PNNYAM)I BAKTERI KITINOLTTIK SEBAGAI AGEN BIOKONTROL RINGTASAN Oleh
:
Nuniek Herdyastuti, M,Si, Sari Edi C., M.Si., Dr.Tri Joko Raharjo, M.Si
Mikoorgadsme dan enzim batryak dimadaatk& industri urltuk m^oghasilkan produk yang bemilai tinggi dalam skala industri. Upaya pencarian isolat-isolat yang dapat digunakan dalam hdustri seperti isolat' yang mampu _ peDghasilkan enzim komersial baryak sekali dilakuka;. Hal ini didGrng oleh kondisi. Negam Indonesia yary mempunyai keragaman lingkungan sef,ingga Denyediaka.n banyal sumber isolat. Baklen kjtinolidk menaril- uo'tuk diisoiasi karetra kemampuannya unh* meDghj&olisis kitin me0jadi turunan kirin yaog sangat berman faar pada bidang kesebalan. indusni malaian daD pengolairao- limbah. Kitimse juga dilaporkan sebagai agen biokonhol yang berperan-terhadap jamur patogen.
TujMn perclitian ini adalah melakutal isolasi datr karalterisasi enzim ktitrjse.dari isolat TNH54 yang mempuoyai aktivitas tertinggi yary telah diperoleh pada tahun pertama. Enzim dikarakterisasi berdasarkan ulciritu,'kitin^" d"og* menggunakan metode Monreal dan Reese. Karakterisasi enzim meliputi penentiran optimum pH dau suhu, stabilitas terhadap pH dan suhu, penentuan konsentrasi subsrat optimal, penentuau harga Ku dan V_"r* serta meth;t peryanrh iotr logam terhadap akiviras eDzim. Etzim diaplikasikan sebagai bioko;troatefiadap jainur
patogetr terhadap tanaman.
Pada tihun pertama Isolat TNH54 telah diidetrtifikasi sifat morfologi dan fisiologi berdasarkan B e rgey's Manual qf Systematic Bacteriolog). pada tahun-kedua dil"njutkan .iderrifikasi berdasarkan gen l6s-rRNA terhadap isolat TNH54 yary dilahkan d_1rSg cara amplifikasi DNA dengan pCF. dal sequencing. il.tr]it sequencilg l6s-rRNA dibandirykan dengan urut n yary ada di Gene Balk" denean meryguoakan ,a.rrc Zocal Alignmekt Search Tool (BLAST). HasiT phylogenetic iree menunjul.kan bahwa isolat TNH54 merupakan kelofipok pseudomonas"-. d"oo^ prosentase kemiripan 99%. produksi enzim kjtinase yalg relal difraksinasi deE;atr ammoniuo sulfat 5090 metrunjuktan hasil kemumian 2.4 kati dibandinekan deo; ekstrak kasar enzim. Hasil karakrerisasi meounjukkan batwa enim kitinise mempuyai pH optimum 5, suhu optimum 35.C, stabil sampai suhu 40.C selana 30 menit dan pada range pH 6 enzim masih merunjukkan kestabilan deng* uttlult* .".r1dy gi1ar 600lo selama I jam suhu 4.C. Enz:trl kitinase mempunyai harga Ky adalah l-51 mg/ml dan V..G 0.35 lmrml jam. Adanya p"rgr; logu. Konsmtr_asr lUmM meounjull(an ion Mn, sebagaj al-tirator seda_ogkan ion Cul dan sebagaj iniibitor terhadap akliviras kllir1aie. Enzinr kjtirase \ anp. telah d*araklerisasi dengan akriviras 10.6 dapat meoghambat perrumb;ha; janur A.higer, A.parusiticus dat Afunigatus dengi waktu inkubasi situ-u tigu na.i puaa
2
;;;;-
le'
t
suhu ruang.
.j: 111
EXPLORATION OF CHITINASE BACTERY FROM FIELD MI]D AND GENE BIODIVf,RSITY CHITINOLYTIC BACTERY AS BIOCONTROL AGEN
SUMMARY By:
Nu
ek Herdyastuti, M.Si.,
Dr.Tri Joko Raharjo, M.Si., Sari Edi C., M.Si
Miaoorganism and enzlme have been used h industty to produce hig! qualiry product ir indusry scale. EffoIt to tud isolates are using in industry like isolate to produc€ comercial eDz$ne. Indotresian country have to support er.fuomeft various to supply isolates. Chitr'nol),tic bactery has been interested to isolation because chitioase enzyme that hydrolyze chitin to produce derivate chith as the result which calr be used ir1 the fie1th ofhealth, food hdustly atrd waste management. Chitinase are reported to offer potedial bioconhol agetrts that to play a protective role against
fiilga1 patlogefls. The research aim to isolatiotr arrd charactedzation chitinase enzl.me &om isolate TNH54 which highest activity has obtained in tust year. En_zyme was characterized based on chitinase activity using Momeal Reese methode. Characteriztion ilvolved ill determhatiol ofoptimal temperature atrd pH, temperatue and pH stability, optimal substrate optimal, KM dafl Vnarc value atrd effect metall iol1s to enzlme activity- Enzfme was applicated as biocotrtrol for pathogen fuagi h plant. kr the fust year isolate TNH54 was identified through its moryhological ard physiological properties according to Bergey's Manual of Systematic Bacteriolos/. In the second year to cotrthued identified with PCR amplification and sequercing of PCR prcduct for analysis of l6s-rRNA. The 16s-rRNA sequence was compared to tlie sequence in the Gelre Bank database by using Basic Local Ali$meft Search Tool (BLAST). The result of Phylogenetic hee to showed that isolate TNH54 was Pseudomonas sp. With 98% homology. The euyrne was precipitated by the addition ammonium sulphate up to 50% resultgd in 2.l-fold increase than crude extract. Characterizatio[ of enz]me to showed that chitinase was optimally active at pH of5.0 atrd at 35oC for an hour itr 4oC. The enzyme was stable up to 40.C for 30 minute a at the range pH 2 to 6. Ao apparent KM value of l,5I mg/ml and V.,1" 0,15 umrml. hour. Amotrg the metals thet were test€d, the Cu2t dan Fe2t completely inhibired the activity etrzlme but activated there is Mrr* in I0 nM concentration. Chrtinase enzl/rrle was charactgrization with 10.6U actiyiry could be in:lhibition A. igeL A.parasilio a]id Aium Ealr,r in 3 days itrcubation at room tempemture.
PRAKATA
Dengatr metrgucap
s,'uhr kehadllat Altah s.w.t,
atas segala Rahmad dan
Kemurahar-Nya penulis dapat menyeleaika[ penelitian dengan lapoml akhir yalg
bodudul
"
Eksplorasi Bakteri Penghasil Kithase dari Lumpur Pertanian dan
Keragaman G€n Penyardi Bakteri Kititrolitik Sebagai Agetr Biokontrol". Penelitiao ini memperoleh dalla dari Proyek Pedqkatan Kualitas Sumber Daya Manusia
D
ekiorat Pembinaan Pgnelitiatr Dan Pengabdial Kepada Maryankat
Dirjen Dikti Depdiloras Tahun Anggaran 2009 melalui progam perclitian Hibah Bersaiog XVIL Untul( itu kami mengucapkan terima kasit kepada : Ketua DP2M,
Rektor UNESA, Ketua Lembaga Penelitian UNESA, Kepala Laboratodur Kimia
L[{ESA, Kepala Laboratorium PMPP PUSVETMA Suabaya, Pimpil1a4 Laboran, Mahasiswa Kimia
yary telah memba[tu peneliti sehirgga penelitian ini
diselesaikaL Harapar kami semoga penelitian
ini
dapat
dapat membawa maofaat bagi
percliti sendiri Ltususnya dan dapat membeikan informasi bagi rekan-rekan peneliti lainnya.
Surabaya,
l0
Nopember 2009
Penulis
DAFTAR ISI
Halaman
HAIAMAN JIIDI II, LEMBAR PENGESAHAN RINGI(ASAN SI,h,TN4ARY
PRAKATA DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN BAB I PENDAHULUAN BAB II TINJAUAN PUSTAI'A
BAB
III
TUJUAN DAN MANFAAT
PENELITIAN BAB IV METODE PENELITIAN BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN BAB VI KESIMPIILAN DAN SARAN DAF'TAR PUSTAKA LAMPIRAN
6 13
15
23 43 45
47
DAFTAR TABEL
Tabel
Halaman
1
Hasil p€nNmian paffial kitinase deogan Pemmbahan Amoniutr sulfat 50%
30
2
Hasil Peoentua[ suhu optimum
3l
dan stabilitas suhu enzim kitinase dari Isolat TNH54
Penetrtuan pH optimum dan stabilitas pH enzim kitimse dari Isolat TNH54
Hasil
34
Hasil Penga$h iotr-ion logam terhadap aktivitas Enzim Kitimse dari Isolat
39
TNI{54 Hasil peoghambatan kitinase 18,6
terhadap
jamur Aspergrllut
UhIniger,
Aspergillus pafasiticus don Aspe@llus funigatus ya[g diinkubasi selama 4 hari pada suhu kamar
41
DAFTAR GAMBAR Gambar
Halaman
2
Kitobiosa Jalur Degmdasi Kititr secara enzimatis
3
Kerangka Operasional Penelitian
1
l0 l1 pada
11
Umtar trukl€otida dari lsolat TNH54 Philogenetic tree daiisolat TNH54 Hasil analisis IR Kitin yang diisolasi dari cangkang udang windu Kuna pemmbuhan lsotat TNH54 Kurva aLtivitas Isolat TNH54 Pef,eatuan suhu optimum enzim kitinase dari Isolat TNH54 Stabilitas temal enzim kitinase dari Isolat TNH54 Penentuan pH optimu.m e[ziE kjrinase dari Isolat TNH54 Stabilitas pH enzim kitiaase dari Isolat TNHs4 Penetrtuan konsetrtrasi substmt maksimum pada kondisi optimum pH dan suhu 35.C PeoeDtuatr KM datl Vie]s dari psrsamaan Liaeweaver-Burk aftara 1/[S] dan 1A/ Pelgaruh iotr ion logam tefiadap aLtivitas
25 25 26
tahutr ke dua
4 5 6 7 8
9 10
t1 12 13
t4 l5
5
kitiaase 16
trji
aktiviras Ef,zim kitinase
sebagai
biokontrol dengatr total a(tivitas 18,6U
27 29 32 33 35 36 31
38
40
DAITAR I"AMPIRAN
Halaman
Kurva Standar N-Asetil glukosamir Kurva statrdar plotei[ Bradford Eleknoforegram hasil sequercing isolat TNH 54 Penambahatr ftaksiuasi amodum sulfat Biografi,/Riwa1,at hidup peteliti
47 48
49
Tabel
s2 54
lx
BIDANG ILMU : MIPA
LAPORAN PENELITIAN HIBAH BERSAING XVI PERGURUAN TINGGI Tahun Anggaran 2009
EKSPLORASI BAKTERI PENGHASIL KITINASE DARI LUMPUR PERTANIAN DAN KERAGAMAN GEN PENYANDI BAKTERI KITINOLITIK SEBAGAI AGEN BIOKONTROL
Oleh : Nuniek Herdyastuti, S.Si, M.Si Dr. Sari Edi Cahyaningrum, M.Si Dr.Tri Joko Raharjo, M.Si
DEPARTEMEN PENDIDIKAN NASIONAL REPUBLIK INDONESIA UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA LEMBAGA PENELITIAN Desember, 2009
i
HALAMAN PENGESAHAN LAPORAN AKHIR 1. Judul
: Eksplorasi Bakteri Penghasil Kitinase Dari Lumpur Pertanian dan Keragaman Gen Penyandi Bakteri Kitinolitik Sebagai Agen Biokontrol 2. Ketua Peneliti : a. Nama : Nuniek Herdyastuti, M.Si b. Jenis Kelamin : Perempuan c. Pangkat/Golongan : Penata Tk. I/IIId d. NIP : 197011101998022001 e. Jabatan Sekarang : Lektor f. Fakultas/Jurusan/Pusat Penelitian : MIPA/Kimia/UNESA g. Alamat kantor/Telp./Fax./E-mail : Kampus UNESA Jl.Ketintang Surabaya/ (031)8298761/
[email protected] h. Alamat rumah/Telp./Fax./E-mail : Jl.Karah 5/50 Jambangan Surabaya/ (031)8285623/
[email protected] i. Tim Peneliti No Nama Bidang Fakultas/Jurusan Perguruan Tinggi . keahlian 1. Nuniek Herdyastuti, S.Si, Biokimia MIPA/Kimia Univ.Neg.Surabaya M.Si 2. Dr.Tri Joko Raharjo, M.Si Biokimia MIPA/Kimia Univ.Gadjah Mada 3. Dr. Sari Edi Cahyaningrum, Kimia MIPA/Kimia Univ.Neg.Surabaya M.Si Anorganik 3. Pendanaan dan jangka waktu penelitian : a. Jangka Waktu Penelitian : 2 Tahun b. Biaya total yang diusulkan : Rp. 85.000.000,00 c. Biaya yang disetujui tahun II : Rp. 40.000.000,00 Surabaya, 5 Nopember 2009 Ketua Peneliti
Mengetahui Dekan FMIPA UNESA
Prof.Dr.dr.Tjandrakirana, M.S.,Sp.And. NIP. 194704231973032001
Nuniek Herdyastuti,M.Si NIP. 197011101998022001
Menyetujui Ketua Lembaga Penelitian
Prof.Dr.Bambang Yulianto,M.Pd NIP. 196007051987031003 ii
EKSPLORASI BAKTERI PENGHASIL KITINASE DARI LUMPUR PERTANIAN DAN KERAGAMAN GEN PENYANDI BAKTERI KITINOLITIK SEBAGAI AGEN BIOKONTROL RINGKASAN Oleh : Nuniek Herdyastuti, M.Si., Sari Edi C., M.Si., Dr.Tri Joko Raharjo, M.Si Mikroorganisme dan enzim banyak dimanfaatkan industri untuk menghasilkan produk yang bernilai tinggi dalam skala industri. Upaya pencarian isolat-isolat yang dapat digunakan dalam industri seperti isolat yang mampu menghasilkan enzim komersial banyak sekali dilakukan. Hal ini didukung oleh kondisi Negara Indonesia yang mempunyai keragaman lingkungan sehingga menyediakan banyak sumber isolat. Bakteri kitinolitik menarik untuk diisolasi karena kemampuannya untuk menghidrolisis kitin menjadi turunan kitin yang sangat bermanfaat pada bidang kesehatan, industri makanan dan pengolahan limbah. Kitinase juga dilaporkan sebagai agen biokontrol yang berperan terhadap jamur patogen. Tujuan penelitian ini adalah melakukan isolasi dan karakterisasi enzim kitinase dari isolat TNH54 yang mempunyai aktivitas tertinggi yang telah diperoleh pada tahun pertama. Enzim dikarakterisasi berdasarkan aktivitas kitinase dengan menggunakan metode Monreal dan Reese. Karakterisasi enzim meliputi penentuan optimum pH dan suhu, stabilitas terhadap pH dan suhu, penentuan konsentrasi substrat optimal, penentuan harga KM dan Vmaks serta melihat pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim. Enzim diaplikasikan sebagai biokontrol terhadap jamur patogen terhadap tanaman. Pada tahun pertama Isolat TNH54 telah diidentifikasi sifat morfologi dan fisiologi berdasarkan Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Pada tahun kedua dilanjutkan identifikasi berdasarkan gen 16s-rRNA terhadap isolat TNH54 yang dilakukan dengan cara amplifikasi DNA dengan PCR dan sequencing. Hasil sequencing 16s-rRNA dibandingkan dengan urutan yang ada di Gene Bank dengan menggunakan Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Hasil Phylogenetic tree menunjukkan bahwa isolat TNH54 merupakan kelompok Pseudomonas sp. dengan prosentase kemiripan 99%. Produksi enzim kitinase yang telah difraksinasi dengan ammonium sulfat 50% menunjukkan hasil kemurnian 2,1 kali dibandingkan dengan ekstrak kasar enzim. Hasil karakterisasi menunjukkan bahwa enzim kitinase mempunyai pH optimum 5, suhu optimum 35C, stabil sampai suhu 40C selama 30 menit dan pada range pH 2 – 6 enzim masih menunjukkan kestabilan dengan aktivitas residu diatas 60% selama 1 jam suhu 4C. Enzim kitinase mempunyai harga KM adalah 1,51 mg/mL dan Vmaks 0,35 µml/mL jam. Adanya pengaruh logam dengan konsentrasi 10mM menunjukkan ion Mn2+ sebagai aktivator sedangkan ion Cu2+ dan Fe2+ sebagai inhibitor terhadap aktivitas kitinase. Enzim kitinase yang telah dikarakterisasi dengan aktivitas 10,6 U dapat menghambat pertumbuhan jamur A.niger, A.parasiticus dan A.fumigatus dengan waktu inkubasi selama tiga hari pada suhu ruang.
iii
EXPLORATION OF CHITINASE BACTERY FROM FIELD MUD AND GENE BIODIVERSITY CHITINOLYTIC BACTERY AS BIOCONTROL AGEN SUMMARY By : Nuniek Herdyastuti, M.Si., Dr.Tri Joko Raharjo, M.Si., Sari Edi C., M.Si Microorganism and enzyme have been used in industry to produce high quality product in industry scale. Effort to find isolates are using in industry like isolate to produce comercial enzyme. Indonesian country have to support eviroment various to supply isolates. Chitinolytic bactery has been interested to isolation because chitinase enzyme that hydrolyze chitin to produce derivate chitin as the result which can be used in the fielth of health, food industry and waste management. Chitinase are reported to offer potential biocontrol agents that to play a protective role against fungal pathogens. The research aim to isolation and characterization chitinase enzyme from isolate TNH54 which highest activity has obtained in first year. Enzyme was characterized based on chitinase activity using Monreal Reese methode. Characteriztion involved in determination of optimal temperature and pH, temperature and pH stability, optimal substrate optimal, KM dan Vmaks value and effect metall ions to enzyme activity. Enzyme was applicated as biocontrol for pathogen fungi in plant. In the first year isolate TNH54 was identified through its morphological and physiological properties according to Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. In the second year to continued identified with PCR amplification and sequencing of PCR product for analysis of 16s-rRNA. The 16s-rRNA sequence was compared to the sequence in the Gene Bank database by using Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). The result of Phylogenetic tree to showed that isolate TNH54 was Pseudomonas sp. With 98% homology. The enzyme was precipitated by the addition ammonium sulphate up to 50% resulted in 2.1-fold increase than crude extract. Characterization of enzyme to showed that chitinase was optimally active at pH of 5.0 and at 35C for an hour in 4C. The enzyme was stable up to 40C for 30 minute and at the range pH 2 to 6. An apparent KM value of 1,51 mg/mL and Vmaks 0,35 µml/mL hour. Among the metals thet were tested, the Cu2+ dan Fe2+ completely inhibited the activity enzyme but activated there is Mn2+ in 10 mM concentration. Chitinase enzyme was characterization with 10.6U activity could be inhibition A.niger, A.parasiticus and A.fumigatus in 3 days incubation at room temperature.
iv
PRAKATA
Dengan mengucap syukur kehadlirat Allah s.w.t, atas segala Rahmad dan Kemurahan-Nya penulis dapat menyeleaikan penelitian dengan laporan akhir yang berjudul ” Eksplorasi Bakteri Penghasil Kitinase dari Lumpur Pertanian dan Keragaman Gen Penyandi Bakteri Kitinolitik Sebagai Agen Biokontrol”. Penelitian ini memperoleh dana dari Proyek Peningkatan Kualitas Sumber Daya Manusia Direktorat Pembinaan Penelitian Dan Pengabdian Kepada Masyarakat Dirjen Dikti Depdiknas Tahun Anggaran 2009 melalui program penelitian Hibah Bersaing XVII. Untuk itu kami mengucapkan terima kasih kepada : Ketua DP2M, Rektor UNESA, Ketua Lembaga Penelitian UNESA, Kepala Laboratorium Kimia UNESA, Kepala Laboratorium PMPP PUSVETMA Surabaya, Pimpinan, Laboran, Mahasiswa Kimia yang telah membantu peneliti sehingga penelitian ini dapat diselesaikan. Harapan kami semoga penelitian ini dapat membawa manfaat bagi peneliti sendiri khususnya dan dapat memberikan informasi bagi rekan-rekan peneliti lainnya.
Surabaya, 10 Nopember 2009 Penulis
v
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL LEMBAR PENGESAHAN RINGKASAN SUMMARY PRAKATA DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN BAB I PENDAHULUAN BAB II TINJAUAN PUSTAKA BAB III TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN BAB IV METODE PENELITIAN BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN
.................................................... .................................................... .................................................... .................................................... .................................................... .................................................... .................................................... .................................................... .................................................... .................................................... ....................................................
i ii iii iv v vi vii viii ix 1 6 13
.................................................... .................................................... .................................................... .................................................... ....................................................
15 23 43 45 47
vi
DAFTAR TABEL
Tabel
Halaman
1
Hasil pemurnian parsial kitinase dengan ............................................... Penambahan Amonium sulfat 50%
30
2
Hasil Penentuan suhu optimum dan ............................................... stabilitas suhu enzim kitinase dari Isolat TNH54
31
3
Hasil Penentuan pH optimum dan ............................................... stabilitas pH enzim kitinase dari Isolat TNH54
34
4
Hasil Pengaruh ion-ion logam terhadap ............................................... aktivitas Enzim Kitinase dari Isolat TNH54
39
5
Hasil penghambatan kitinase 18,6 U/mL ............................................... terhadap jamur Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus dan Aspergillus fumigatus yang diinkubasi selama 4 hari pada suhu kamar
41
vii
DAFTAR GAMBAR Gambar 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Halaman Kitobiosa Jalur Degradasi Kitin secara enzimatis Kerangka Operasional Penelitian pada tahun ke dua Urutan nukleotida dari Isolat TNH54 Philogenetic tree dari isolat TNH54 Hasil analisis IR Kitin yang diisolasi dari cangkang udang windu Kurva pertumbuhan Isolat TNH54 Kurva aktivitas Isolat TNH54 Penentuan suhu optimum enzim kitinase dari Isolat TNH54 Stabilitas termal enzim kitinase dari Isolat TNH54 Penentuan pH optimum enzim kitinase dari Isolat TNH54 Stabilitas pH enzim kitinase dari Isolat TNH54 Penentuan konsentrasi substrat maksimum pada kondisi optimum pH 5 dan suhu 35C Penentuan KM dan Vmaks dari persamaan Lineweaver-Burk antara 1/[S] dan 1/V Pengaruh ion-ion logam terhadap aktivitas kitinase Uji aktivitas Enzim kitinase sebagai biokontrol dengan total aktivitas 18,6U
............................................ ............................................ ............................................
10 11 17
............................................ ............................................ ............................................
25 25 26
............................................ ............................................ ............................................
27 29 32
............................................
33
............................................
35
............................................
36
............................................
37
............................................
38
............................................
40
............................................
42
viii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 2 3 4 5
Halaman Kurva Standar N-Asetil glukosamin Kurva standar protein Bradford Elektroforegram hasil sequencing isolat TNH 54 Tabel Penambahan fraksinasi amonium sulfat Biografi/Riwayat hidup peneliti
.................................................. .................................................. ……………………………….. .................................................. ..................................................
47 48 49 52 54
ix
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Bumi kita kaya akan mikroorganisme terutama di daerah tropis seperti halnya Negara Indonesia. Untuk memanfaatkan secara baik mikroorganisme tersebut diperlukan upaya yang tidak mudah dan memerlukan waktu yang cukup lama. Upaya pencarian isolat-isolat yang dapat digunakan dalam industri seperti isolat yang mampu menghasilkan enzim komersial untuk industri banyak sekali dilakukan. Banyaknya industri yang menggunakan mikroorganisme dan enzim untuk menghasilkan produk yang bernilai tinggi karena sifat potensial enzim. Perkembangan bioindustri saat ini semakin pesat dan maju. Hal ini dibuktikan dengan banyaknya industri yang menggunakan mikroorganisme dan enzim untuk menghasilkan produk yang bernilai tinggi dalam skala industri. Enzim saat ini banyak digunakan dalam berbagai industri karena sifatnya yang potensial diantaranya adalah dapat aktif dalam jumlah yang sangat kecil, aksi katalitiknya spesifik dan dapat mempercepat reaksi tanpa mempengaruhi kesetimbangan reaksi yang bersangkutan. Begitu banyak sekali enzim yang telah dikaji oleh para peneliti, di antaranya adalah enzim kitinase. Kitinase merupakan salah satu enzim yang menarik untuk diisolasi karena kemampuannya untuk menghidrolisis kitin menjadi turunan kitin yang sangat banyak manfaatnya. Kitin merupakan polimer yang sangat melimpah di alam dan menempati urutan kedua setelah selulosa. Kitin banyak tersebar di alam seperti pada jamur, alga, nematoda, arthropoda, mollusca, hewan, dan tumbuhan (Guo, 2004) . Pabrik
1
pembekuan udang (cold storage) yang mengolah udang untuk ekspor dalam bentuk udang beku headless atau peeled menghasilkan limbah berupa kulit keras (cangkang) sekitar 50-60% yang dibuang atau hanya digunakan sebagai campuran makanan ternak (Ratanakkit, 2002). Limbah cangkang udang yang dibuang begitu saja akan menghasilkan bau busuk, meningkatkan BOD air sehingga kualitas air menurun dan berpotensi sebagai pencemar lingkungan (Indra, 1993). Kitin banyak digunakan sebagai substrat pada media fermentasi enzim kitinase, karena aktivitas kitinolitik diinduksi dalam media pertumbuhan strain dengan adanya kitin sebagai sumber karbon (Chernin, 1998). Keberadaan kitin yang tersebar luas di alam, memungkinkan eksplorasi kitinase dapat dilakukan di mana saja seperti tanah, lumpur, air tawar, air laut dan tumbuhan. Seperti dikemukakan di atas bahwa eksplorasi kitinase dapat dilakukan di mana saja mulai dari tanah, lumpur, air tawar, air laut, tumbuhan. Lumpur pertanian misalnya begitu banyak ditemukan di sekitar kita tetapi masih jarang dilakukan eksplorasi kitinase pada tempat tersebut. Tanah merupakan permukaan lahan di atas permukaan bumi yang menyediakan substrat bagi kehidupan tumbuhan dan hewan. Semua bahan organik yang terkandung di dalam tanah akhirnya akan diuraikan oleh mikroorganisme menjadi bahan anorganik sederhana yang merupakan unsur hara bagi tumbuhan. Aktivitas kitinase telah diketahui mempunyai peranan anti jamur dalam mekanisme ketahanan tanaman terhadap penyakit oleh jamur patogen. Pada tumbuhan enzim ini digunakan sebagai pertahanan dalam melawan serangan organisme patogen yang mengandung kitin. Fenomena tersebut mendorong peneliti BPPT untuk mengembangkan prototype produk biofungisida yang ramah lingkungan, yaitu
2
biofungisida Trichoderma harzianum yang mengandung konidia jamur T.harzianum. Keunggulannya adalah sebagai pengendali hayati (biokontrol) penyakit jamur patogen (fitopatogen) yang menyerang tanaman palawija, sayuran, buah-buahan dan dapat pula digunakan sebagai bioprotektan bagi tanaman yang masih muda serta perkebunan (www.suaramerdeka.com ,2002). T.harzianum juga berpotensi sebagai agen biokontrol bagi Fusarium oxysporum f.sp.zingiberi (Soesanto, 2006). Serratia marcescens dilaporkan sebagai agen biokontrol pada Rhizoctonia solani dan Sclerotium rolfsii yang dapat menghambat infeksi pada akar tanaman (Ordentlich,1987). Pada penelitian lain juga dilaporkan bahwa Enterobacter agglomerans merupakan bakteri kitinolitik yang dapat mengurangi penyakit sekitar 64% yang disebabkan R.solani pada tanaman kapas (Chernin, 1997). Enzim-enzim banyak digunakan pada industri dikarenakan mempunyai daya katalitik yang lebih besar dari katalisator sintetik, tidak beracun, alami dapat digunakan untuk memperbaiki produk seperti mengubah warna, aroma, tekstur, rasa (Lehninger, 1993). Enzim industri umumnya digunakan dalam keadaan yang tidak murni, salah satu yang menjadi alasan adalah segi ekonomis bila menggunakan enzim dalam keadaan murni membutuhkan biaya yang tinggi. Jumlah enzim dalam larutan dapat diuji secara kuantitatif berdasarkan pengaruh katalitik yang dihasilkan yang dinyatakan sebagai aktivitas enzim. Umumnya aktivitas enzim ditentukan pada pH dan suhu optimum dan pada konsentrasi substrat yang mendekati jenuh. Penentuan nilai KM dan VMaks suatu enzim diperlukan dalam industri, sebab dengan mengetahui nilai KM dapat diketahui kekuatan ikatan enzim dengan substrat untuk membentuk produk. Nilai VMaks diperlukan untuk mengetahui kecepatan enzim melakukan aktivitas pembentukan produk. Setiap
3
enzim memiliki harga KM dan VMaks yang berbeda-beda. Besarnya harga KM dan VMaks menunjukkan aktivitas dan kekuatan ikatan enzim dengan substrat dalam membentuk produk. Pada tahun pertama telah dilakukan isolasi dari lumpur pertanian di sekitar kampus Universitas Negeri Surabaya dengan kondisi lumpur pertanian dalam keadaan kering, mempunyai pH 7,1 dan suhu 29C. Enam puluh tiga isolat yang dihasilkan diberi tanda TNH1 sampai TNH63 dan masing-masing ditentukan aktivitas kitinase. Isolat TNH54 menunjukkan aktivitas kitinase tertinggi dan telah diidentifikasi berdasarkan fisiologi dan morfologi menunjukkan bakteri Gram negatif dengan bentuk batang – kokoid dengan koloni berwarna kuning, bentuk bulat, elevasi konveks, margin rata, diameter koloni 3 -5 mm. Bakteri dapat tumbuh pada suhu maksimal 42C, dapat memproduksi asam dari mannitol, sukros, sorbitol, innositol dan melakukan oksidasi glukosa. Diduga isolat TNH54 tersebut merupakan kelompok Burkholderia pseudomalle, tetapi hasil identifikasi tersebut masih harus dibuktikan dengan gen 16S-rRNA untuk menentukan dengan pasti spesies yang telah diperoleh. Tujuan jangka panjang dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan enzim kitinase dari isolat kitinolitik dengan aktivitas kitinase tertingi yang selanjutnya akan dikembangkan sebagai kandidat biokontrol. Sehingga serangkaian hasil yang telah diperoleh pada tahun pertama penelitian ini akan dilanjutkan pada tahun kedua untuk mendapatkan hasil sesuai dengan tujuan yang diharapkan Penelitian pada tahun kedua ini akan melanjutkan tahapan yang telah diperoleh pada tahun pertama yaitu melakukan identifikasi 16S-rRNA dari isolat TNH54, memproduksi dan melakukan karakterisasi enzim kitinase dari isolat TNH54. Penerapan
4
dari penelitian ini akan dilakukan uji kitinase sebagai kandidat agen biokontrol terhadap beberapa jamur patogen khususnya pada jamur tanaman.
B. Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang di atas dapat dibuat rumusan masalah sebagai berikut : 1. Bagaimanakah aktivitas kitinase hasil isolasi dari Isolat TNH54 setelah dimurnikan dengan amonium sulfat, serta berapa kali kemurnian enzim yang dapat diperoleh dibandingkan dengan ekstrak kasar? 2. Bagaimanakah karakter enzim kitinase meliputi pH, suhu optimum, stabilitas suhu dan pH, kinetika enzim dan pengaruh ion logam ? 3. Apakah enzim kitinase yang telah dikarakterisasi dapat digunakan sebagai anti jamur pada skala laboratorium dan bagaimana daya hambatnya?
5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Kitinase Kitinase (EC.3.2.1.14) adalah enzim yang mengkatalisis hidrolisis kitin menjadi monomer atau oligomernya berupa senyawa linier N-asetilglukosamin. Kitinase dapat ditemukan pada bakteri, jamur dan kelenjar pencernakan binatang yang dapat mengkonsumsi kitin sebagai makanannya [Hou, 1998]. Beberapa bakteri penghasil kitinase adalah Enterobacter, Serratia marcescens dan Streptomyces sedangkan dari golongan jamur seperti Aspergillus, Penicillium dan Trichoderma (Monreal and Reese, 1969). Tronsmo dan Harman (1993) serta Sahai dan Manocha (1993) membagi kitinase dalam tiga tipe, yaitu : a). Endhokitinase (EC.3.2.1.14) memotong secara acak ikatan 1,4 bagian internal kitin membentuk oligomer pendek N-asetilglukosamin dengan BM rendah, b). eksokitinase atau kitobiosidase pemotongan hanya terjadi pada ujung non reduksi kitin tapi tidak secara acak dan c). -1,4- N-asetilglukosaminidase (EC.3.2.1.30) bekerja pada pemutusan diasetil/kitobiosa, kitotriosa dan kitotetraose dengan menghasilkan monomer N-asetilglukosamin. Semua enzim yang dapat mendegradasi kitin disebut kitinase total atau kitinase non spesifik. Kitinase diklasifikasikan dalam dua famili yaitu 18 dan 19 berdasarkan kemiripan urutan asam amino. Kitinase dari mikroba mempunyai berat molekul yang bervariasi berkisar antara 20.000-120.000 Da, bakteri 60.000-110.000 Da, Actinomycetes 30.000 atau lebih rendah, jamur lebih besar dari 30.000 dan tumbuhan sekitar 30.000 Da.
6
Kitinase adalah enzim ekstraseluler dan melibatkan endokitinase, kitobiosa dan “faktor” kristalin kitin yang umumnya diproduksi pada fase logaritma [Nielsen, 1999]. Kitinase dikarakterisasi sebagai enzim indusibel dengan kitin dan produk hasil degradasinya bertindak sebagai induser. Kitinase yang dihasilkan oleh beberapa strain dapat diproduksi apabila terdapat kitin dalam jumlah yang tinggi. Produksi kitinase pada medium kitin dapat direpresi oleh senyawa tambahan metabolit yang mengandung karbon seperti gula di dalam medium [Monreal and Reese, 1969]. Produksi kitinase tidak akan dihambat oleh penambahan polisakarida seperti kitin, tetapi pada Bacillus pabuli K1 penambahan amilum, -glukan dan glukosa terbukti dapat menghambat produksi kitinase pada konsentrasi tiga kalinya kitin yaitu sekitar 0,6% [Frandberg ,1997]. B.pabuli K1 kemungkinan dapat menghasilkan enzim ekstraseluler -glukanase dan amylase yang dapat mendegradasi polimer menghasilkan glukosa dalam medium. Setelah ditumbuhkan 24 jam penambahan 0,5% glukosa tersebut dalam substrat yang yang mengandung koloidal kitin dapat megurangi produksi kitinase dibandingkan dengan kontrol tanpa glukosa bahkan dengan adanya 2% glukosa dapat menghambat produksi kitinase sekitar 90% [de la Cruz, 1993]. Faktor lain yang dapat menginduksi sintesis kitinase adalah kemampuan sel mengenali struktur fisik kitin seperti susunan rantainya. Hasil hidrolisis kitin yang tidak larut sulit intuk dideteksi sehingga dibuat modifikasi jarak atau substrat kimia sintesis yang dikembangkan untuk mengukur aktivitas kitinase. Metode Reissig kerapkali dipakai, merupakan metode non spesifik yaitu berdasarkan jumlah residu gula reduksi yang dilepaskan dan dideteksi dengan menggunakan reaksi pewarna pdimetilaminobenzaldehid.
Ini untuk mengestimasi
aktivitas eksokitinase. Bila kitooligosakarida yang dilepaskan mereka didegradasi oleh -
7
N-asetilglukosaminidase untuk menguji kolorimetri [Boller and Mauch, 1988]. Hasilnya dibandingkan dengan pelepasan N-asetilglukosamin sebelum dan sesudah -Nasetilglukosaminidase ditambahkan untuk mengestimasi perbandingan aktivitas -Nasetilglukosaminidase dan aktivitas kitibiosidase atau endokitinase dapat diperoleh. Metode kolorimetri Reissig juga mengenali semua kitooligosakarida yang larut meskipun lebih sensitive pada monomer [Domard and Vasseur, 1991].
Ohtara, 1988
mengembangkan metode berdasarkan pengurangan substrat dengan metode viskosimetri dan turbidimetri. Metode ini sensitive untuk pengukuran aktivitas endokitinase tetapi memerlukan waktu lama dan sulit. Metode ini telah disesuaikan dengan uji mikrotiter plate [Tronsmo and Harman, 1993]. Perbandingan antara pengurangan dalam turbidi pada suspensi kitin dan pelepasan gugus reduksi dapat digunakan untuk mengevaluasi karakter enzim ekso/endokitinase. Ini dapat digunakan juga pada pembentukan zona bening pada agar kitin meskipun hasilnya terkadang sulit untuk menetapkan zona yang dihasilkan bagaimana halo, tepi tajam atau tepi yang tidak terlalu terang [Watanabe, 1990]. Uji lain adalah menggunakan Spectrometer Assay dengan menggunakan kromogen 3,4 dinitrophenil tetra N-asetilkhitotetraose dan Radiometer Assay.
2.2. Manfaat Kitinase Kitinase telah dikenal mempunyai peranan anti jamur dalam mekanisme ketahanan tanaman terhadap penyakit oleh jamur pathogen. BPPT telah berhasil mengembangkan prototype produk biofungisida yang ramah lingkungan, yaitu biofungisida Trichoderma harzianum yang mengandung konidia jamur Trichoderma harzianum. Keunggulannya adalah sebagai pengendali hayati (biokontrol) penyakit jamur
8
patogen (fitopatogen) yang menyerang tanaman palawija, sayuran, buah-buahan dan dapat pula digunakan sebagai bioprotektan bagi tanaman yang masih muda serta perkebunan [www.suaramerdeka.com]. Produk atau hasil degradasi kitinase berupa senyawa N-asetil-glukosamin juga bermanfaat dalam bidang Farmakologi atau di bidang media medis dapat digunakan sebagai obat anti inflamatori, immunoajuva, anti tumor, penurun kolesterol dan sebagai supplemen yang dapat membantu mencegah serangan asma [Tripuraneni, 2005]. Pada industri dapat digunakan sebagai kosmetik, kapsul obat, supplemen kalsium, penurun berat badan, atau makanan hewan. Selain itu juga bisa digunakan sebagai bahan bakar biologis, flokulan dalam pengolahan limbah, agensia anti fungi atau artropoda hama dan teknologi protoplas fungi. Penggunaan mikroorganisme kitinolitik sebagai biokontrol fitopatogenik terhadap jamur telah lama dilakukan. Elad et al. (1982) telah mempelajari mekanisme enzim ekstraseluler dalam mendegradasi dinding sel jamur yang terlibat didalam biokontrol fitopatogenik jamur oleh Trichoderma harzianum. Chet et al. (1990) menyatakan bahwa patogenik jamur tergantung pada antibiotik, kompetisi dan lisis. Proses lisis terutama terletak pada dihasilkannya enzim-enzim litik seperti kitinase dan glukanase yang dapat menyebabkan degradasi dinding sel jamur. Dalam beberapa kasus enzim hidrolitik seperti kitinase dan beberapa enzim-enzim yang lain seperti glukanase atau protease dapat bereaksi pada dinding sel jamur dengan melibatkan antibiotik yang diproduksinya. Viterbo et al (2002) juga menyatakan bahwa secara umum mekanisme biokontrol dapat dibagi dua, yaitu pengaruh secara langsung dan tidak langsung agen biokontrol terhadap patogen tanaman. Pengaruh secara langsung melibatkan kompetisi nutrien pada permukaan, produksi antibiotik dan enzim litik serta inaktivasi enzim dan
9
parasitisme patogen. Pengaruh secara tidak langsung melibatkan aspek dari morfologi yang dihasilkan dan perubahan biokimia didalam tanaman seperti toleransi terhadap tekanan yang menembus akar dan perkembangan tanaman, kelarutan nutrien anorganik dan resistensi.
2.3. Kitin Kitin merupakan bentuk linier polisakarida yang dibentuk dari ikatan -1,4 residu N-asetil-glukosamin [Nathalie, 2006]. Dengan demikian kitin secara kimiawi adalah suatu polimer golongan polisakarida yang tersusun atas 2-asetamido-2-deoksi-Dglukosa membentuk ikatan -1,4. Monomer senyawa ini merupakan disakarida dari Nsetil-D-glukosamin yang disebut kitobiosa dengan struktur seperti pada gambar 1. Ikatan pada molekul tersebut membentuk fibra yang linier. Rantainya dapat membentuk kristal karena adanya ikatan hydrogen intramolekul dan membentuk mikrofibril yang panjang menghasilkan struktur yang rigid dan stabil [Gooday, 1983]. Kitin berbentuk padat, amorf, tidak berwarna, tidak larut dalam air, asam encer, alkohol dan semua pelarut organik tetapi kitin dapat larut dalam fluoroalkohol dan asam mineral pekat [Richard dalam Yurnaliza, 2002]. Kitin dapat didegradasi melalui dua jalur utama, pertama degradasi oleh induksi kitinase pada ikatan -1,4-glikosidik prosesnya ditentukan oleh mekanisme kitinolitik. Kedua polimer mengalami deasetilasi pertama dan selanjutnya dihidrolisis oleh kitosanase seperti pada gambar 2 [Gooday,1991]. Muzzarelli (1985) menyebutkan bahwa istilah kitin digunakan untuk menunjuk polimer fibrilar 2asetamido-2deoksi-beta-D-glukan yang berikatan
-1,4 dimana astilasinya biasanya
tidak sempurna. Kitosan mempunyai bentuk polimer yang sama dengan kitin. Kedua
10
polimer tersebut dibedakan berdasarkan kandungan nitrogennya, polimer tersebut disebut kitin bila kandungan nitrogennyakurang dari 7% dan bila kandungan nitrogennya lebih dari 7% disebut kitosan. Kedua senyawa tersebut dapat ditemukan di alam dan istilah kitosan sekarang lebih sering digunakan untuk menunjuk kitin yang dihilangkan gugus asetilnya secara artifisial [Suhardi,1992].
Gambar 1. Kitobiosa, merupakan disakarida N-Asetil-glukosamin yang membentuk seyawa kitin
Kitin Kitinase (GlcpNAc)2 N-asetilglukosaminidasee GlcpNAc
Kitin deasetilase Kitosan Kitosanase (GlcpN)2 Glukosaminidase GlcpN
Gambar 2. Jalur Degradasi Kitin secara enzimatis [Gooday,1990]
11
Kitin merupakan salah satu polimer alami yang cukup melimpah dan merupakan biopolimer terbanyak kedua di alam setelah selulosa. Polimer ini ditemukan sebagai komponen struktural eksoskeleton pada insekta, dalam kulit krustacea, dalam dinding sel beberapa fungi dan alga serta nematode. Sirkulasi kitin dari material yang tersedia dan organisme mati utamanya dihasilkan dari aktivitas kitinolitik mikroorganisme. Kitin menyusun hampir separoh dari total bahan organik dalam bahan-bahan yang mengandung kitin. Konsentrasi tertinggi mencapai 85% ditemukan pada Arthropoda [Folders, 2001]. Kitin juga dapat ditemukan dalam lapisan usus, trakea, sayap penutup dan bagian-bagian lain dari tubuh hewan tingkat rendah. Kitin dan kitosan mempunyai sifat yang khas dan dapat dimanfaatkan dalam berbagai bidang dan industri. Kitin dan senyawa-senyawa turunannya mendapat perhatian besar para ahli karena sifat-sifat fungsionalnya yang khas. Sifat potensial yang dimiliki kitin memungkinkan pemanfaatannya dalam berbagai bidang seperti biokimia, obatobatan, farmakologi, enzomologi, mikrobiologi, pertanian, pangan dan gizi serta industriindustri yang menjadikan biopolimer ini sangat berharga.
12
BAB III TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
3.1. Tujuan Jangka Pendek a. Mendapatkan enzim kitinase dari Isolat TNH54 yang mempunyai aktivitas tertentu setelah dimurnikan dengan amonium sulfat dan mengetahui kemurnian enzim bila dibandingkan dengan ekstrak kasar b. Menentukan kondisi optimum enzim kitinase meliputi : pH, suhu, konsentrasi, penentuan stabilitas pH dan suhu, harga KM dan Vmaks serta pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim c. Mengetahui aktivitas enzim yang telah dikarakterisasi sebagai anti jamur pada skala laboratorium dan bagaimana daya hambatnya.
3.2. Tujuan jangka panjang : Beberapa keluaran utama yang diharapkan dari penelitian ini adalah : a. Menghasilkan isolat yang mempunyai aktivitas kitinolitik dan berpotensi dapat dikembangkan sebagai agensia biokontrol dan dapat dikembangkan dalam industri baik dalam bentuk massa sel, enzim ataupun gen b. Memberikan informasi biodiversitas bakteri kitinolitik bagi perkembangan ilmu pengetahuan ataupun secara komersial bagi industri yang terkait.
13
3.3. Manfaat Penelitian Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah : a. Memanfaatkan limbah cangkang udang windu untuk memproduksi kitin sebagai substrat pada media untuk produksi enzim kitinase. b. Mendapatkan biodiversitas mikroorganisme penghasil kitinase serta dapat memberikan informasi tentang sifat ataupun fungsi potensial dari isolat.
14
BAB IV METODE PENELITIAN
A. Rancangan Penelitian Penelitian ini mengikuti rancangan penelitian eksperimen B. Populasi dan Sampel Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah enzim kitinase dari isolat TNH54. Adapun sampel penelitian ini adalah sebagian dari populasi yang diambil secara acak C. Waktu Penelitian Penelitian ini direncanakan selama 1 tahun, yaitu tahun anggaran 2009 yang dilaksanakan 10 bulan dimulai bulan Maret 2009 sampai bulan Desember 2009. D. Tempat Penelitian Kegiatan penelitian ini dilakukan di laboratorium Biokimia Jurusan Kimia FMIPA UNESA, LPPT UGM dan Laboratorium PMPP PUSVETMA. Beberapa Analisis dilakukan di jurusan Kimia UGM dan Jurusan Biologi UNAIR E. Kerangka Operasional Penelitian Penelitian ini direncanakan akan berlangsung selama 1 tahun dengan program yaitu : Produksi kitinase dari mikroorganisme kitinolitik terpilih, Karakterisasi kitinase meliputi pH dan suhu optimum, stabilitas termal dan pH, konsentrasi substrat optimum serta penentuan KM dan Vmaks . Enzim yang telah dikarakterisasi akan diaplikasikan sebagai biokontrol pada beberapa jamur patogen pada tanaman. Secara garis besar kerangka operasional tahun ke dua dapat dilihat pada gambar 3.
15
F. Bahan dan Alat Bahan Bahan-bahan yang dipergunakan pada penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Kitin yang diisolasi dari cangkang udang windu yang diperoleh dari industri pembekuan udang PT. Surya Alam Tropodo, Sidoarjo 2. Bahan-bahan kimia yang diperoleh di pasaran komersial dengan kemurnian p.a antara lain : HCl, Na3C6H5O7.2H2O, 3,5-asam dinitrosalisilat (SIGMA), N-Asetilglukosamin (SIGMA), bahan untuk produksi enzim, bahan untuk karakterisasi enzim. Alat Peralatan yang dipergunakan pada penelitian ini disamping peralatan gelas standar, digunakan pula peralatan khusus seperti : 1. Peralatan untuk produksi enzim : shaker, sentrifugasi dingin, 2. Peralatan untuk karakterisasi molekular isolat : mesin PCR, lampu UV, DNA sequencer (ABM 3130, Hitachi), elektroforesis DNA (BioRad). 3. Peralatan untuk karakterisasi enzim : sentrifuse dingin, inkubator, UV-Vis (Schimadzu 1700)
16
Kurva Pertumbuhan
Mikroba penghasil kitinase dengan aktivitas tertinggi (Isolat TNH54)
Kurva Aktivitas
Isolasi
Identifikasi molekular : gen 16s-rRNA
Amplifikasi (dg PCR), Sequencing, Blast ke Gene Bank
Spesies mikroorganisme
Ekstrak kasar enzim kitinase
Presipitasi dengan (NH4)2SO4
Dialisis (24 jam)
Fraksi dg aktivitas kitinase tertinggi (NH4)2SO4
Karakterisasi
-
pH optimum suhu optimum KM dan Vmaks Stabilitas pH Stabilitas suhu Ion logam
` Enzim yang telah dikaraterisasi Uji sebagai Biokontrol pada jamur patogen tanaman
Gambar 3. Kerangka Operasional Penelitian pada tahun ke dua
17
G. Prosedur Penelitian 1. Pembuatan Kurva Pertumbuhan dan Kurva Aktivitas Kurva pertumbuhan dilakukan dengan cara menumbuhkan isolat pada media screening cair yang mengandung kitin koloidal dan diinkubasi selama 96 jam. Setiap 6 jam sampel diambil dan ditentukan Optical Density (OD) pada panjang gelombang 600 nm serta aktivitas kitinase.
2. Identifikasi Isolat TNH54 Pada tahun pertama karakterisasi yang dilakukan baru dilakukan pada tahap klasik dengan melakukan uji morfologi dan fisiologi yang meliputi bentuk dan warna koloni, bentuk sel, pewarnaan gram serta uji biokimia. Hasilnya kemudian dibandingkan dengan Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology untuk menentukan spesies mikroorganisme. Pada tahun kedua dilanjutkan kembali dengan Uji molekular dari gen 16s-rRNA dengan tahapan : isolasi DNA isolat TNH54, amplifikasi gen 16s-rRNA dengan PCR, elektroforesis hasil PCR, sequencing, analisis hasil sequencing dan pembuatan pohon filogenetik.
3. Aktivitas Enzim Aktivitas enzim ditentukan berdasarkan jumlah N-asetil-glukosamin yang dilepaskan dan diukur secara kolorimetri dengan menggunakan spektofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 540 nm berdasarkan metode Monreal dan Reese (1969). Aktivitas enzim ditentukan dengan menggunakan persamaan :
18
Unit/mL enzim = (jumlah NAG yg dilepaskan)(2,5) (2)(1)(0,5) Keterangan : 2,5 = volume reaksi mula-mula dari uji 2 = faktor konversi untuk mengkonversi 2 jam ke 1 jam sebagai definisi per unit 1 = volume (dalam mL) supernatan (dalam penentuan kolorimetri) 0,5 = volume (dalam mL) enzim yang digunakan NAG = N-Asetil glukosamin
4. Penentuan Kadar Protein Kadar protein ditentukan dengan metode Bradford dengan menggunakan metode kolorimetri menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 695 nm dan Bovine Serum Albumin digunakan sebagai standart (Scopes, 1994).
5. Produksi Enzim Koloni tunggal dari isolat TNH54 ditumbuhkan pada 100 mL media screening cair yang mengandung 0,4% kitin pada suhu kamar dengan pengocokan 120 rpm selama 20 jam. Kultur cair kemudian disentrifugasi pada 8000xg selama 15 menit suhu 4C. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak kasar kitinase. Ekstrak kasar enzim yang diperoleh diendapkan dengan penambahan amonium sulfat pada fraksi kejenuhan 20 – 100% (Tabel penambahan amonium sulfat pada Lampiran 4). Masing-masing fraksi ditentukan kadar protein dan aktivitas kitinase. Fraksi yang mempunyai aktivitas tertinggi selanjutnya didialisis dengan menggunakan tabung selopan pada suhu 4C selama satu malam.
19
6. Karakterisasi Enzim Karakterisasi enzim meliputi : penentuan pH dan suhu optimum, stabilitas suhu dan pH, konsentrasi substrat optimum, K M dan Vmaks, pengaruh ion-ion logam. Penentuan suhu optimum dilakukan pada range suhu 29 – 55C dan masingmasing ditentukan aktivitasnya.
Penentuan stabilitas termal dilakukan dengan cara
melarutkan enzim dalam larutan buffer dengan pH optimum kemudian campuran reaksi ini diinkubasi pada suhu optimum. Selanjutnya dilakukan penentuan aktivitas enzim pada pH dan suhu optimum setiap 2 jam. Penentuan pH optimum dipaparka pada range pH 2 – 9 dengan menggunakan larutan buffer sitrat-fosfat 0,1M pH 2, 3, 4, dan 5 buffer fosfat untuk pH 6, 7, dan 8 serta buffer Tris-HCl 0,1M untuk pH 9. Penentuan stabilitas pH dilakukan dengan cara melarutkan enzim dalam larutan buffer dengan berbagai pH yaitu pH 2 – 10. Masing-masing campuran reaksi ini diinkubasi pada suhu optimum selama 1 jam. Selanjutnya dilakukan penentuan aktivitas enzim pada pH dan suhu optimum. Konsentrasi substrat optimum dilakukan dengan menggunakan variasi konsentrasi kitin koloidal 0,2 ; 0,4 ; 0,6 ; 0,8 ; 1,0 ; 1,2
dan 1,4 g/L. Selanjutnya masing-masing
ditentukan aktivitas kitinase pada pH dan suhu optimum. Harga KM dan Vmaks dapat ditentukan dari persamaan Lineweaver-Burk’s. Pengaruh ion-ion logam dipelajari dengan menambahkan garam-garam KCl, CoCl2, CuCl2, CaCl2, Fe(NH4)2(SO4)2, MgSO4, MnCl2, ZnSO4, BaCl2 dengan konsentrasi 10mM. Masing-masing ditentukan aktivitas enzim pada suhu, pH dan konsentrasi kitin koloidal optimum.
20
7. Uji Kitinase Sebagai Agen Biokontrol Disiapkan biakan dari jamur Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus dan Aspergillus fumigatus pada media padat PDA (potato dextrose agar). Selanjutnya ditambahkan enzim kitinase pada paper dish ukuran 6 mm dan diletakkan pada permukaan biakan jamur di atas. Biakan diinkubasi pada suhu kamar selama 4 hari dan diamati pengahambatan yang terjadi.
H. Analisis Data Data yang diperoleh dari identifikasi molekular adalah mendapatkan amplifikasi DNA dari isolat yang telah didapat dengan menggunakan mesin PCR. Hasil amplifikasi kemudian ditentukan urutan nukleotidanya dengan menggunakan DNA sequencer. Berdasarkan sequence aligment gen 16s-rRNA yang diperoleh selanjutnya di-BLAST untuk memperoleh urutan DNA dalam database Gen-Bank yang paling dekat hubungannya dengan urutan DNA yang diketahui. Sehingga diperoleh pohon filogenetik dari isolat dan dapat ditentukan kedekatan atau kekerabatan isolat sehingga bisa ditentukan spesiesnya. Isolat
yang
telah
diketahui
spesiesnya
selanjutnya
digunakan
untuk
memproduksi enzim kitinase. Enzim kitinase merupakan enzim ekstraseluler maka enzim akan terdapat di dalam filtrat setelah disentrifugasi. Filtrat yang mengandung enzim kemudian difraksinasi untuk mendapatkan enzim dengan cara menambahkan garam amonium sulfat dalam berbagai persen kejenuhan. Setelah melalui tahap dialisis untuk menghilangkan garam amonium sulfat enzim dapat dikarakterisasi berdasarkan
21
aktivitasnya meliputi : pH optimum, suhu optimum, KM dan Vmaks, stabilitas pH dan stabilitas suhu serta pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim. Untuk menentukan suhu, pH dan subtrat optimum dibuat grafik antara suhu atau pH atau konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim, aktivitas tertinggi menunjukkan suhu atau pH atau konsentrasi substrat optimum. Penentuan harga KM dan Vmaks ditentukan dari persamaan LineweaverBurk antara 1/V dan 1/[S]. Pengaruh ion-ion logam dapat ditentukan dengan menentukan prosentase aktivitas terhadap enzim tanpa penambahan ion logam. Prosentase yang diperoleh menyatakan aktivitas relatif enzim. Enzim yang telah dikarakterisasi selanjutnya di uji sebagai biokontrol dengan menggunakan jamur Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus dan Aspergillus fumigatus. Biakan tersebut diinkubasi selama 3 – 4 hari pada suhu kamar, halogenitas yang muncul di sekitar paper dish menunjukkan adanya penghambatan enzim terhadap jamur patogen.
22
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk produksi dan karakterisasi enzim kitinase serta uji biokontrol enzim pada beberapa jamur patogen terhadapa tanaman. Penelitian diawali dengan memproduksi enzim pada media screening yang mengandung kitin koloidal. Enzim yang diperoleh selanjutnya dikarakterisasi meliputi : pH optimum, suhu optimum, KM dan Vmaks, Stabilitas pH dan Stabilitas suhu serta pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim. Enzim yang telah dikarakterisasi akan diuji sebagai agen biokontrol terhadap jamur patogen tanaman
5.1. Identifikasi Isolat TNH54 Isolat TNH54 merupakan penghasil kitinase dengan aktivitas tertinggi yang telah diidentifikasi secara morfologi dan fisiologi diduga merupakan golongan dari Burkholderia pseudomallei atau Pseudomonas pseudomallei pada tahun pertama. DNA isolat TNH54 juga telah diamplifikasi menunjukkan ukuran pita sekitar 1500 pasang basa. Pada tahun kedua identifikasi tersebut dilanjutkan dengan tahapan sequencing merupakan kegiatan untuk mengetahui urutan nukleotida yang menyusun suatu molekul DNA. Prinsip dari DNA sequencer (Genetic analyzer) adalah berdasarkan metode Sanger yakni menggunakan dideoksi-nukleotida, berlabel pewarna fluorescent untuk menghentikan polimerisasi molekul DNA melalui proses PCR disebut dengan cycle sequencing. Sebelumnya hasil amplifikasi dimurnikan dengan menggunakan High Pure PCR Product Purification kit dari Roche kemudian dilakukan dengan tahapan cycle sequencing yang
23
merupakan metode sederhana terdiri dari proses denaturasi, annealing dan ekstensi yang berulang-ulang dalam mesin themal cycler, menghasilkan amplifikasi linear produk ekstensi yang mempunyai perbedaan panjang satu basa nukleotida dimana fragmen ini diakhiri oleh satu basa dideoksi-nukleotida. Hasil
cycle sequencing selanjutnya
dimurnikan dengan menggunakan ABI PRISM Big Dye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kit. Produk ini kemudian diinjeksikan pada proses elektroforesis kapiler secara elektrokinetik ke dalam sebuah kapiler yang diisi polimer. Dengan diberikannya tegangan listrik tinggi maka fragmen DNA yang bermuatan negatif akan bergerak melalui polimer di dalam kapiler menuju elektroda positif. Elektroforesis kapiler dapat memisahkan molekul DNA yang memiliki perbedaan bobot molekul hanya satu nukleotida. Hasil sequencing diperoleh urutan seperti pada gambar 4 dengan panjang 720 nukleotida (hasil elektroforegram di Lampiran 3). Urutan tersebut kemudian di BLAST (Basic local alignment search tool) ke Gene Bank dengan menggunakan web-page www.ncbi.nlm.nih.gov. Dengan Blast kita dapat menemukan urutan DNA dalam database yang paling dekat hubungannya dengan urutan DNA yang akan diteliti. Metode ini digunakan untuk mempelajari evolusi sekuens-sekuens dari leluhur yang sama (common ancestor). Hal ini berguna untuk menemukan gen sejenis pada beberapa organisme atau untuk memeriksa keabsahan hasil sequencing maupun untuk memeriksa fungsi gen hasil sequencing. Algoritma yang mendasari kerja BLAST adalah penyejajaran sekuens (sequence alignment) yang merupakan proses penyusunan dua atau lebih sekuens sehingga persamaan sekuens-sekuens tersebut tampak nyata. Metode ini akan memberikan hipotesis dari proses evolusi yang terjadi dalam sekuens-sekuens
24
tersebut. Hasil alignment dapat dibuat philogenetic tree seperti pada gambar 5. Berdasarkan philogenetic tree tersebut, menunjukkan bahwa isolat TNH54 merupakan golongan Pseudomonas sp UK4 dengan strain yang berbeda karena prosentase kemiripan hanya 98%.
TAGCTACTTCTGGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGG GAACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGT CGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTATGGGATTAGCTCCACCTCGCG GCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCC ATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAG TGCCCACCATTACGTGCTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAAC CCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAATGTTCCCGA AGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCATTGGATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGC GTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTG AGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCAC TAAAAGCTCAAGGCTTCCAACGGCTAGTTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCANGGT ATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATTAGTCC Gambar 4. Urutan nukleotida sepanjang 720 basa nukleotida dari isolat TNH54 hasil sequencing dengan menggunakan Capillary electrophoresis Genetic Analysis 3130 dari Applied Biosystem
Isolat TNH54
Gambar 5. Philogenetic tree isolat TNH54 dari lumpur sawah menunjukkan hubungan kekerabatan 98% bahwa isolat TNH54 merupakan golongan Pseudomonas sp.UK4 5.2. Pembuatan Kitin dan Kitin Koloidal dari Limbah Cangkang Udang Windu 25
Kitin diperoleh dari limbah cangkang udang windu industri pembekuan udang yang ada di kota Sidoarjo. Kitin yang diperoleh dianalisis dengan spektrofotometer infra merah dan hasilnya dibandingkan dengan kitin standar dari SIGMA seperti pada gambar 6. Hasil analisis IR kitin yang telah diisolasi dari cangkang udang pada gambar 5 menunjukkan pita serapan yang sama dengan spektra IR dari kitin SIGMA, yaitu 3441 dan 3286 cm-1 (adanya OH dan NH2), 1658 cm-1 (C=O), 1072 cm-1 (C-O). Gugus-gugus fungsi yang dihasilkan pada spektra tersebut sesuai dengan struktur kitin dimana kitin merupakan polimer linier dari N-asetil-glukosamin membentuk ikatan β-1,4 glikosida. Kitin akan memberikan spektra yang khas pada 1665, 1555 dan 1313 cm -1 menunjukkan adanya ikatan amida [Suhardi, 1992]. Kitin yang telah diperoleh selanjutnya dibuat bentuk koloidal untuk digunakan sebagai substrat pada media fermentasi produksi kitinase.
Gambar 6. Hasil analisis IR Kitin yang diisolasi dari cangkang udang windu. Hasil Spektra kitin yang diisolasi dari cangkang udang memberikan serapan yang sama yaitu pada 3441 dan 3286 cm-1 ,1658 cm-1 (C=O), 1072 cm-1 (C-O). 5.3. Produksi Enzim Kitinase
26
5.3.1. Kurva Pertumbuhan Isolat TNH54 Isolat TNH 54 yang dihasilkan dari lumpur pertanian di lingkungan kampus UNESA merupakan isolat terpilih karena dapat menghasilkan enzim kitinase dengan aktivitas tertinggi. Sebelum dilakukan produksi enzim, maka dibuat kurva pertumbuhan untuk mengetahui waktu tertentu sel yang dapat dihasilkan dengan jumlah maksimum. Kurva pertumbuhan (gambar 7) diamati setiap 6 jam sekali berdasarkan OD yang diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 630 nm. Pertumbuhan mikrobial biasanya ditentukan oleh waktu yang diperlukan untuk menggandakan massa sel. Waktu penggandaan bagi bakteri telah dilaporkan secepat 15-20 menit pada kondisi pertumbuhan optimal. Tetapi pada umumnya berlangsung 45-60 menit [Pelczar, 1986].
1.2
Optical Density
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
10
20
30
40
50
60
70
Waktu (Jam)
Gambar 7. Kurva pertumbuhan Isolat TNH54 menunjukkan bahwa sel dapat diproduksi dalam jumlah maksimum pada saat inkubasi sekitar 30 jam Kurva pertumbuhan Isolat TNH54 di atas tidak memerlukan waktu lama untuk mengalami adaptasi dengan media yang ada sehingga sel berada pada fase lag cukup
27
singkat. Isolat mulai mengalami fase logaritma atau fase pertumbuhan setelah melewati 6 jam inkubasi. Pada fase ini sel membelah dengan laju yang konstan, massa menjadi dua kali lipat dengan laju yang sama, aktivitas metabolik konstan dan keadaan pertumbuhan seimbang. Jumlah sel tertinggi terjadi saat inkubasi 30 jam dengan OD sebesar 1,06. Pada beberapa titik laju pertumbuhan mulai menurun karena nutrien esensial telah berkurang dan hambatan oleh adanya produk metabolik yang tertimbun, sehingga sel-sel tersebut akan mengalami transisi dan menyebabkan laju pertumbuhan bersih menjadi nol. Hal ini terlihat saat inkubasi 36 jam jumlah sel mulai menunjukkan jumlah yang hampir sama bahkan menurun hal ini dikatakan sel telah memasuki fase stasioner. Pada fase statis ini yang terjadi adalah penumpukan produk beracun dan atau kehabisan nutrien. Beberapa sel mati sedangkan yang lain ada yang tumbuh dan membelah sehingga jumlah sel hidup tetap. Selain dibuat kurva pertumbuhan juga dibuat kurva aktivitas yang bertujuan untuk mengetahui jumlah protein atau enzim yang dihasilkan. Kurva aktivitas B.pseudomallei pada gambar 8 menunjukkan fenomena yang sama dengan kurva pertumbuhan, dimana aktivitas kitinase menunjukkan kenaikan setelah melewati waktu inkubasi 6 jam. Aktivitas tertinggi ditunjukkan pada saat inkubasi 36 jam sebesar 0,94 U/mL.
28
1 0.9
Aktivitas (U/mL)
0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
Waktu (Jam)
Gambar 8. Kurva aktivitas Isolat TNH54 menunjukkan bahwa aktivitas kitinase dicapai saat inkubasi 36 jam
5.3.2. Produksi Kitinase dan Fraksinasi dengan Amonium sulfat Berdasarkan tempat bekerjanya enzim dibedakan menjadi 2 golongan yaitu endoenzim dan eksoenzim. Endoenzim (intraseluler) merupakan enzim yang berada dan bekerja di dalam sel sedangkan eksoenzim (ekstraseluler) merupakan enzim yang bekerja di luar sel. Enzim ini memiliki fungsi utama yaitu untuk melangsungkan perubahanperubahan pada nutrien di luar sel sehingga memungkinkan terserap di dalam sel. Enzim kitinase merupakan enzim ekstraseluler [Hendy, 1990 ; Kim, 2003 ; Yong, 2005], sehingga ekstrak kasar enzim dapat diperoleh tanpa melalui proses pemecahan sel. Enzim kitinase yang berada di dalam filtrat selanjutnya diendapkan dengan amonium sulfat 0 - 50%.
Pengendapan dengan ammonium sulfat tergolong metode yang tertua
dan terbanyak dilakukan tetapi menguntungkan karena
murah harganya dan
29
solubilitasnya tinggi meskipun dibawah suhu kamar dan bisa bekerja pada pH netral antara 6 – 7,5 [Scopes, 1994]. Salting out dengan ammonium sulfat merupakan tahap awal dalam prosedur pemurnian. Hasil pengendapan ekstrak kasar enzim kitinase kemudian dilanjutkan proses dialisis dengan menggunakan membran semi-permiabel cellophane selama satu malam pada suhu 4C. Proses dialisis dapat menghilangkan padatan dengan berat molekul rendah dan sampel yang mempunyai keseimbangan secara simultan dalam larutan bufer baru dan sebagai larutan pekat. Larutan yang mengandung (NH4)2SO4 dapat dihilangkan dengan cara dialisis [Rosenberg, 1996]. Enzim kitinase yang telah melalui proses pengendapan dan dialisis ditampilkan dalam tabel 2. Pada tabel 1 menunjukkan hasil perhitungan aktivitas dan kemurnian yang diperoleh setelah ekstrak kasar enzim dimurnikan parsial. Ekstrak kasar enzim kitinase yang telah difraksinasi dengan amonium sulfat dan dialisis mengalami penurunan aktivitas enzim samapi 50% tetapi sebaliknya aktivitas spesifiknya mengalami kenaikan sehingga diperoleh enzim kitinase dengan tingkat kemurnian 1,31 kali dibandingkan ekstrak kasarnya. Penurunan aktivitas dapat terjadi selama tahap pemurnian seperti proses dialisis atau pemekatan, atau selama proses penyimpanan, dikatakan bahwa prosentase kehilangan aktivitas bisa mencapai 50%. Hal ini akan menyebabkan perubahan konformasi selama pengikatan yang akan memberikan pengaruh yang besar terhadap aktivitas [Deutscher, 1990].
Tabel 1. Pemurnian Parsial Kitinase dengan Penambahan Amonium sulfat 50% Tahap
Total Protein
Total
Aktivitas
Pemurnian
Hasil
(mg)
Aktivitas (U)
Spesifik (U/mg)
(kali)
(% total aktivitas)
Ekstrak kasar
9,184
53,46
5,74
1
100
(NH4)2SO4
2,185
16,46
7,53
1,31
30,79
30
5.4. Karakterisasi Enzim Enzim kitinase yang telah diendapkan dengan ammonium sulfat 0 – 50% dan telah didialisis selanjutnya dikarakterisasi meliputi pH dan suhu optimum, stabilitas pH dan suhu, konsentrasi substrat optimum, penentuan K M dan Vmaks, serta pengaruh ion logam,
5.4.1. Penentuan Suhu Optimal dan Stabilitas Suhu Penentuan suhu optimum enzim kitinase dilakukan dengan cara menginkubasi enzim dengan substrat pada range suhu 29 – 55C, hasil penentuan suhu optimum ditampilkan pada tabel 2 dan gambar 9. Enzim mulai menunjukkan aktivitasnya pada suhu 29C dan aktivitas enzim menunjukkan kenaikan pada suhu 35C dan merupakan suhu optimum yang dicapai dan diperoleh nilai aktivitas tertinggi sebesar 0,16 U/mL. Setelah melewati suhu 35C enzim mulai menunjukkan penurunan aktivitas dan kehilangan aktivitasnya ketika mencapai suhu 55C.
Tabel 2. Penentuan suhu optimum dan stabilitas suhu enzim kitinase dari Isolat TNH54 No.
Suhu (C)
1. 2. 3. 4. 5. 6.
29 C 35 C 40 C 45C 50C 55 C
Aktivitas Enzim Kitinase (U/mL) Suhu Optimum 0,093 0,098 0.070 0.030 0.025 0,001
Stabilitas Suhu 0,818 0,719 0,331 0,264 0,165 0,125
31
0.12
Aktivitas (U/mL)
0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 25
30
35
40
45
50
55
60
o
Suhu ( C)
Gambar 9. Penentuan suhu optimum enzim kitinase dari Isolat TNH54. Suhu optimum yang diperoleh adalah 35C dengan aktivitas kitinase 0,098 U/mL Dalam suatu proses fermentasi bila suhu dinaikkan maka hasil sel akan menurun karena media sebagian akan digunakan untuk mempertahankan diri atau kebutuhan untuk mempertahankan diri meningkat [Judoamidjojo, 1992]. Sebagai konsekuensinya bila suhu meningkat maka penggunaan sumber energi karbon untuk pertahanan akan meningkat pula dan menyebabkan enzim terdenaturasi. Suhu optimum pada 35C juga ditunjukkan oleh kitinase yang dihasilkan oleh Gliocladium virens 41 [Lorito, 1994]. Kitinase yang mempunyai suhu optimum 37C diperoleh dari Bacillus sp yang menghasilkan kitotriosa sebagai produk utama kitinolitiknya [Woo, 2003], Bacterium C4 yang diisolasi dari tanah adalah bakteri baru penghasil kitinase, merupakan genus Sanguibacter.
32
120
Aktivitas Residu (%)
100
80
60
40
20
0 20
25
30
35
40
o
Suhu ( C)
45
50
55
60
Gambar 10. Stabilitas termal enzim kitinase dari Isolat TNH54. Enzim menunjukkan kestabilan terhadap suhu disekitar 30 – 40C dengan aktivitas residu di atas 80%, saat diinkubasi pada suhu 45C enzim kehilangan aktivitas hampir 50% Stabilitas enzim terhadap suhu dilakukan dengan cara preinkubasi enzim selama 30 menit pada selang suhu 29 – 55C tanpa penambahan substrat, hasilnya seperti pada tabel 3 dan gambar 10. Pada gambar 10, enzim menunjukkan kestabilan terhadap suhu di sekitar suhu 30 – 40C dimana aktivitas aktivitas enzim masih menunjukkan prosentase diatas 80%. Tetapi setelah melewati suhu 45C enzim mulai kehilangan aktivitas dan menunjukkan aktivitas residu 53,2%.
5.4.2. Penentuan pH Optimal dan Stabilitas pH Penentuan pH optimum enzim kitinase dari Isolat TNH54 dilakukan pada range pH 2 – 9 pada kondisi suhu optimum 35C. Hasil penentuan pH optimum ditunjukkan 33
pada tabel 3 dan gambar 11. Pengukuran pH merupakan parameter yang mempengaruhi pertumbuhan dan pembentukan produk. Sebagian besar organisme dapat berfungsi dengan baik dalam selang pH antara 3 – 4 unit pH. Adanya perubahan pH secara tidak langsung juga akan mempengaruhi pembentukan produknya seperti enzim [Judoamidjojo, 1992].
Tabel 3. Penentuan pH optimum dan stabilitas pH enzim kitinase dari Isolat TNH54 No.
pH
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
2 3 4 5 6 7 8 9
Aktivitas Enzim Kitinase (U/mL) pH Optimum Stabilitas pH 0,091 1,052 0,109 1,393 0.104 1,303 0.112 1,193 0.056 0,856 0,013 0,858 0,010 0,793 0,004 0,598
Protein atau enzim mempunyai gugus fungsi yang dapat terionisasi, apabila terjadi perubahan pH maka akan memberikan efek pada bagian katalitik dan konformasi enzim. Enzim hanya aktif pada selang pH yang terbatas dan pada bagian selang pH tersebut akan diperoleh pH optimum. Gambar 11 menunjukkan bahwa enzim sudah mulai menunjukkan aktivitas kitinase pada pH 2 dan mengalami kenaikan sampai pH 5. Pada pH 5 merupakan pH optimum enzim dimana enzim menunjukkan aktivitas tertinggi sebesar 0,15 U/mL. Setelah melewati pH 5 aktivitas enzim kitinase menunjukkan penurunan sampai pada pH 9. Enzim kitinase dengan pH optimum 5 juga ditunjukkan oleh kitinase dari Burkholderia cepacia KH2 [Ogawa, 2002], Streptomyces sp. M-20
34
yang diisolasi dari tanah Mongolian [Kim, 2003] , Bacterium C4 [Yong, 2005], Enterobacter sp. NRG4 yang diisolasi dari tangkai jamur [Dahiya, 2005], dan Trichoderma atroviride PTCC5220 yang diperoleh dari koleksi kultur Persia [ Harighi, 2007].
0.12
Aktivitas Enzim (U/mL)
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
pH
Gambar 11. Penentuan pH optimum enzim kitinase dari Isolat TNH54. Enzim diinkubasi pada suhu 35C menunjukkan pH 5 merupakan optimum dengan aktivitas kitinase 0,112 U/mL Enzim kitinase diuji kestabilan terhadap pH pada range pH 2 – 9 selama 1 jam pada suhu 4C diperlihatkan pada gambar 12 dan tabel 4. Gambar 12 menunjukkan bahwa pada range pH 2 – 6 enzim masih menunjukkan kestabilan dengan aktivitas residu diatas 60%. Tetapi enzim mulai kehilangan aktivitasnya sampai 50% setelah diinkubasi diatas pH 8.
35
Aktivitas residu (%)
100
80
60
40
20
0 2
3
4
5
6
pH
7
8
9
10
Gambar 12. Stabilitas pH enzim kitinase dari Isolat TNH54. Enzim menunjukkan kestabilan terhadap pH disekitar 2 – 6 dengan aktivitas residu di atas 60%, saat diinkubasi di atas pH 6 enzim mulai kehilangan aktivitas 50% 5.4.3. Penentuan Konsentrasi Substrat Maksimum, KM dan Vmaks Enzim Kitinase Hasil penentuan konsentrasi substrat terbaik untuk memproduksi kitinase ditunjukkan pada gambar 13. Pada sebagaian besar fermentasi, laju pertumbuhan spesifik akan konstan dan tidak tergantung pada konsentrasi nutrien atau substrat. Tetapi laju pertumbuhan sama seperti kecepatan reaksi kimia yang merupakan fungsi konsentrasi reaktan, yang dalam hal ini adalah nutrien esensial atau substrat untuk pertumbuhannya. Gambar 13 menunjukkan bahwa aktivitas enzim meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi substrat, sampai pada titik tertentu menunjukkan kinetika penjenuhan meskipun konsentrasi substrat meningkat. Terlihat suatu daerah penghambatan substrat akan terjadi terhadap aktivitas enzim.
36
0.18 0.16
V (U/mL jam)
0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1.1
1.2
[S] (mg/mL)
Gambar 13. Penentuan konsentrasi substrat maksimum pada kondisi optimum pH 5 dan suhu 35C. Diperoleh aktivitas tertinggi 0,16 U/mL pada saat konsentrasi substrat 1,0 mg/mL Grafik pada gambar 13 menunjukkan bahwa enzim mengikuti pola dari persamaan Michaelis-Menten. Untuk menentukan secara tepat harga KM dan Vmaks dilakukan “pemetakan kebalikan berganda” dengan mempergunakan transformasi aljabar dari persamaan Michaelis-Menten. Diperoleh persamaan Lineweaver-Burk dengan mengalurkan 1/V dan 1/[S] seperti pada gambar 14. Berdasarkan pemetaan kebalikan-ganda diperoleh harga KM adalah 1,51 mg/mL dan Vmaks 0,35 µml/mL jam atau 21,06 µml/mL mnt. Harga KM tersebut lebih kecil bila dibandingkan dengan kitinase yang telah dimurnikan dari Bacillus sp.WY22 dan Bacterium C4 mempunyai KM masingmasing 3 mg/mL dan 6,95 mg/mL, tetapi lebih besar dari kitinase asam yang telah
37
dimurnikan hasil isolasi dari Gallus gallus L dengan harga KM 0,42 mg/mL [Woo, 2003 ; Yong, 2005 ; Han, 2000].
25
20
1/V (U/mL jam)-1
15
10
5
0 -1
0
1
2
3
4
5
6
-5
1/[S ] (mg/mL)
-1
Gambar 14. Penentuan KM dan Vmaks dari persamaan Lineweaver-Burk antara 1/[S] dan 1/V. Diperoleh harga KM adalah 1,51 mg/mL dan Vmaks adalah 0,35 µml/mL jam 5.4.4. Pengaruh Ion Logam Pengaruh beberapa ion-ion logam terhadap aktivitas kitinase telah dipelajari dengan menambahkan masing-masing 10 mM garam pada enzim, hasilnya seperti terlihat pada Tabel 4 dan gambar 15. Ion logam dalam enzim dapat berperan dalam proses katalisis dengan beberapa cara. Beberapa enzim tidak memerlukan komponen tambahan untuk mencapai aktivitas penuhnya. Namun pada beberapa enzim memerlukan molekul non-protein yang disebut kofaktor untuk berikatan dengan enzim dan menjadi aktif. Kofaktor dapat berupa zat anorganik, contohnya seperti ion logam Fe2+, Mn2+ atau Zn2+ ataupun zat organik seperti flavin dan heme [de Bolster, 1997].
38
Pengikatan ion logam dapat mengontrol konformasi makromolekul biologis dan juga mempengaruhi sifat-sifat biologi dan kimianya. Ion-ion logam seperti diketahui dapat menstabilkan konfigurasi enzim, seperti Ca 2+, Mg2+ dan Mn2+ dapat mempengaruhi kesetimbangan antara antara keadaan native dan keadaan terdenaturasi. Dalam beberapa kasus disebutkan bahwa adanya ion logam dalam konsentrasi tinggi dapat mencegah denaturasi protein enzim. Akan tetapai beberapa pengikatan ion logam dapat menyebabkan perubahan konformasi dalam protein terutama pada sisi aktifnya [Hughes, 1984].
Tabel 4. Pengaruh ion-ion logam terhadap aktivitas Enzim Kitinase dari Pseudomonas sp.
Uji garam Tanpa penambahan garam KCl CoCl2 CuCl2 CaCl2 Fe(SO4)2 MgSO4 MnCl2 ZnSO4 BaCl2
konsentrasi (mmol/L)
Aktivitas Relatif (%)
10 10 10 10 10 10 10 10 10
100 63 91.5 36.4 73.8 42.6 95.6 118.6 68 71.7
Pada tabel 5 dan gambar 15 menunjukkan bahwa penambahan ion Mn 2+ secara signifikan dapat menambah aktivitas kitinase, tetapi dengan adanya ion Fe 2+ dan Cu2+ menunjukan penghambatan kuat sekali pada aktivitas kitinase. Hal ini telah terlihat pada saat preinkubasi ion logam Fe2+ dan Cu2+ dengan enzim kitinase selama 30 menit dapat menyebabkan enzim mengendap yang menunjukkan bahwa enzim mengalami denaturasi.
39
Fenomena pengaruh logam terhadap kitinase yang dihambat oleh adanya ion Fe2+ dan Cu2+ tetapi diaktivasi oleh Mn2+ ditunjukkan oleh Bacterium C4 yang dilaporkan oleh Yong Tao (2005).
120
Aktivitas Relatif (%)
100
80
60
40
20
0
None
K+
Co2+
Cu2+
Ca2+
Fe2+
Mg2+
Mn2+
Zn2+
Ba2+
Ion Logam
Gambar 15. Pengaruh ion-ion logam terhadap aktivitas kitinase. Ion Mn2+ menunjukkan sebagai aktivator sedangkan ion Cu 2+ sebagai inhibitor terhadap aktivitas kitinase dari Pseudomonas sp.
5.5. Uji Enzim Kitinase Terhadap Jamur Patogen Enzim kitinase yang telah dikarakterisasi diuji kemampuannya terhadap beberapa jamur yang patogen terhadap tanaman. Aspergillus niger merupakan dekomposit utama parasit yang biasanya digunakan sebagai kontrol untuk pengujian anti jamur.
Aspergillus parasiticus dan Aspergillus fumigatus merupakan jamur patogen
terhadap tanaman kentang dan juga padi. Enzim kitinase sebanyak 20 µL yang
40
mempunyai aktivitas 18,6 U/mL ditambahkan pada biakan jamur melalui paper dish dan diinkubasi selama 3 – 4 hari pada suhu kamar. Pada saat inkubasi 2 hari enzim kitinase telah menunjukkan aktivitasnya dan menimbulkan halogenitas atau penghambatan pada semua jamur seperti pada gambar 16 dan tabel 5.
Tabel 5. Hasil penghambatan kitinase 18,6 U/mL terhadap jamur Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus dan Aspergillus fumigatus yang diinkubasi selama 4 hari pada suhu kamar No.
Jenis jamur
1.
Aspergillus niger
2.
Aspergillus parasiticus
3.
Aspergillus fumigatus
Diameter penghambatan (cm) 4,87 4,92 4,94 4,50 3,98 3,95 4,33 4,29 4,00
Rata-rata penghambatan (cm)
Diameter – kontrol (cm)
Indeks kitinolitik
4,91
3,63
1,17
4,15
3,05
1,20
4,21
3,17
1,19
Diameter penghambatan yang diberikan kitinase terhadap ketiga jamur mempunyai indeks kitinolitik yang hampir sama dan cukup besar seperti terlihat pada gambar 16. Enzim kitnase tidak hanya mempunyai peranan penting dalam pertahanan mekanisme tanaman, tetapi juga didalam proses mikoparasit jamur. Aktivitas ini didasarkan pada kemampuan enzim ekstraseluler litik (kitinase) untuk mendegradasi dinding sel dan atau pencegahan terhadap pertumbuhan hifa [ Gohel et al, 2006]. Pemanfaatan mikroba kitinolitik merupakan salah satu cara pengendalian hayati yang efektif untuk jamur patogen tanaman, karena mekanisme pengendaliannya tidak tergantung pada ras patogen dan tidak merangsang timbulnya resistensi [Mazzone, 1987].
41
Kitinase yang diproduksi mikroba dapat menghidrolisis struktur kitin, senyawa utama penyusun dinding sel tabung kecambah spora dan miselia, sehingga jamur tidak mampu menginfeksi tanaman.
A
B
C Gambar 16. Uji aktivitas Enzim kitinase sebagai anti jamur dengan total aktivitas 18,6U terhadap A. niger (A), A.parasiticus (B) dan, A.fumigatus (C) memberikan daya hambat dengan membentuk halogenitas disekitar paper dish masingmasing 3,63 cm, 3,05 cm dan 3,17 cm.
42
BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN
6.1. Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan maka dapat diambil kesimpulan sebagai berikut : 1. Isolat TNH54 sebagai penghasil kitinase dengan aktivitas tertinggi telah diidentifikasi berdasarkan gen 16s r-RNA merupakan golongan Pseudomonas sp.dengan prosentase kemiripan 98%. 2. Produksi enzim kitinase dari isolat TNH54 melalui pengendapan amonium sulfat diperoleh enzim kitinase yang mempunyai aktivitas kitinase spesifik 7,53 U/mg dengan tingkat kemurnian 1,31 kali dibandingkan ekstrak kasar kitinase. 3. Karakterisasi kitinase dari Pseudomonas sp adalah : mempunyai suhu optimum 35C dengan aktivitas 0,16 U/mL dan stabil pada suhu 30 – 40C dengan aktivitas residu di atas 80%. pH optimum pada pH 5 dengan aktivitas 0,112 U/mL dan stabil pada pH disekitar 2 – 6 dengan aktivitas residu di atas 60%. Enzim kitinase menunjukkan konsentrasi optimum 1 mg/mL dengan aktivitas 0,16 U/mL dengan harga KM 1,51 mg/mL dan Vmaks adalah 0,35 µml/mL jam. Aktivitas kitinase menunjukkan kenaikan dengan adanya ion logam Mn2+ tetapi dihambat oleh Cu2+ dan Fe2+ masing-masing pada konsentrasi 10mM. 4. Enzim kitinase dari Pseudomonas sp. dapat berfungsi sebagai anti jamur terhadap jamur patogen pada skala laboraatorium. Hasil uji kitinase terhadap jamur patogen A.
43
niger, A.parasiticus dan, A.fumigatus memberikan daya hambat masing-masing 3,63 cm, 3,05 cm dan 3,17 cm. 6.2. Saran 1. Pada tahap selanjutnya masih harus dilanjutkan penelitian enzim kitinase ke tahap molekular. Perlu dilakukan kloning terhadap kitinase untuk mendapat enzim yang mempunyai aktivitas tinggi dan dapat diproduksi dalam jumlah besar. 2. Enzim kitinase dari Pseudomonas sp. yang telah diperoleh berpotensi sebagai agen biokontrol yang baik, perlu dilakukan uji terhadap beberapa jamur patogen lain dan dapat dikembangkan sebagai anti jamur pada skala yang lebih luas lagi.
44
DAFTAR PUSTAKA Chernin, L.S, Winson, M.K, Thompson, J.M, 1998, Chitinolytic Activity in Chromobacterium violaceum : Substrat analysis and regulation by quorum sensing, Journal of Bacteriology, vol.180, no. 17. Dahiya, N., et al, 2005, Chitinase from Enterobacter sp. NRG4 : Its Purification, Characterization and Reaction Pattern, Electronic Journal of Biotechnology, Vol. 8 (2). Deutscher,M.P., 1990, Methods in Enzymology, Guide to Protein Purification, vol. 182, Academic Press, Inc. San Diego Domard, A. and Vasseur,V., 1991, Nonspecificity of a colorimetric method for the estimation of N-asetil-glukosamin, Int.J.Biol.Macromol., 13 : 366-368. Dubey,S.K., Tripathi,A.K., and Upadhyay,S.N., 2006, Exploration of Soil Bacterial Communities for Their Potential as Biosource, Biosource Technology, Vol. 97 : 2217-2224. Gohel,V., Singh, Vimal, Ashwini, and Chhatpar, 2006, Bioprospecting and antifungal potential of Chitinolitic Microorganism, African Journal of Biotechnology, Vol 5(2) : 54 -72 Gooday, G.W., 1983, The Microbial Synthesis of cellulose, Chitin and Chitosan, In Progress in Industrial Microbiology, M.E, Bushell (ed.), Elsevier, Amsterdam, pp 85-127. Gooday, G.W., 1990, Physiology of Microbial Degradation of Chitin and Chitosan, Biodegradation, 1 : 177-190 Han B.K., Moon J.K., Ryu Y.W., Park Y.H. and Jo D.H., Purifucation and Characterization of Acidic Chitinase from Gizzard of Broiler (Gallus gallus L.), 2000, J.of Biochemistry and Molecular Biology, 33(4) : 326-331 Harighi,M.J., Zamani,M.R., and Motallebi, M., 2007, Evaluation of Antifungal Activity of Purified Chitinase 42 from Tricodherma atroviride PTCC5220, Biotechnology, Vol 6 (1) : 28-33. Hendy,L., Gallagher, J., Winters, A., Hackett, T.J., MacHale, L., & McHale,A.P., 1990, Production of an extracellular chitinolytic system by Talaromyces emersonii CBS 814.70, Biotechnology Letters, Vol. 12 (9) : 673-678. Hughes,M.N., 1984, The in organic chemistry of biological processes, second edition, John Willey and Sons, New York Judoamidjojo,M., Darwis,A.Z., dan Sa’id, E.G., 1992, Teknologi Fermentasi, PAUBioteknologi Institut Pertanian Bogor, Bogor. Kim K.J., Yang Y.J. and Kim J.G., 2003, Purification and Characterization of Chitinase from Sterptomyces sp. M-20, Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 36(2) : 185-189. Lehninger A.L., 1995, Dasar-dasar Biokimia, terjemahan Maggy Thenawidjaya, Penerbit Erlangga, Jakarta.
45
Mazzone, H.M. 1987. Control of invertebrate pests through the chitin pathway. In Maramorosch, K. (Ed.). Biotechnology in Invertebrate Pathology and Cell Culture. Acad. Press. London. p. 439-450. Monreal J. and Reese, E.T., 1969, The Chitinase of Serratia marcescens, Canadian Journal of Microbiology, 15 : 689-696. Nugroho, T, 2003, Isolasi dan Karakterisasi Sebagian Kitinase Trichoderma viride TNJ63, Jurnal Natur Indonesia, 5(2): 101-106 Ohtakara.A, 1988, Viscosimetric assay for chitinase, In Methods in Enzimology, W.A. Wood and S.T. Kellog (eds.) Academic Press, San Diego, pp 426-430 Ogawa Kihachiro, Yoshida, Kariya, Ohnishi and Ikeda Ryuichiro, 2002, Purification and Characterization of a Novel Chitinase from Burkholderia cepacia strain KH2 isolated from the Bed Log of Lentinus edodes, Shiitake mushroom, J.Gen. Appl. Microbiol., 48 : 25-33. Pelczar, Michael.J, 1976, Elements of Microbiology, McGraw Hill Company, New York Rosenberg, I.M., 1996, Protein Analysis and Purification, Benchtop Techniques, Birkhäuser Boston Scopes,R.K.,1994, Protein Purification, Principles and Practice, Third ed., SpringerVerlag, New York. Soesanto,L., Prabowo,Edi, Prihatiningsih,N., 2006, Potensi Trichoderma harzianum dalam mengendalikan sembilan isolate Fusarium oxysporum Schlecht.f.sp. zingiberi Trujillo pada kencur, Jurnal Ilmu Pertanian, Vol.8, No.2 : 76-84. Suhardi, 1992, Khitin dan Khitosan, PAU-Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Suraini, A.A., et al, 2008, Microbial Degradation of Chitin Materials by Trichoderma virens UKM1, Journal of Biological Science, Vol.8 (1) : 52-59 Tronsmo,A., and Harman,G.E., 1993, Detection and Quantification of N-Asetil--Dglukosaminidase, Chitobiosidase and endochitinase in Solution and on gels, Anal.Biochem, 208 : 74-79 Vogan, C.L., Ramos, C.C., and Rowley, A.F., 2002, Isolation, Characterization and Pathogencity of Chitinolytic Bacteria, Microbiology, 148 : 743-754. Vaidya, R.J., Macmil,S.L.A., Vyas,P.R., and Chhatpar,H.S., 2003, The novel Method for Isolating Chitinolitic Bacteria and its Application in Screening for Hyperchitinase Producing Mutant of Alcaligenes xylosoxydans, Journal of Applied Microbiology, 36(3) : 129-134. Watanabe, T., Oyanagi,W., Suzuki,K., and Tanaka,H., 1990, Chitinase system of Bacillus circulans WL-12 and Importance of Chitinase A1 in Chitin Degradation, Journal Bacteriology 172 : 4017-4022 Whipps, J.M., 2001, Microbial Interaction and Biocontrol in The Rhizosphere, Journal of Experimental Botany, 52 : 487-511 Woo C.D. and Park H.D., 2003, An Extrasellular Bacillus sp. Chitinase for the production of chitotriose as a major chitinolytic product, Biotechnology Letters, 25 : 409-412. Yong Tao, Hong Jin, Zhangfu, Li Zhang, Xiuqiong, Ke Tao, Shaorong, Shigui, 2005, Purification and Characterization of an Extraselluler Chitinase Produced by Bacterium C4, Anall of Microbiology, 55 (3) : 213-218
46
LAMPIRAN 1 KURVA STANDAR N-Asetil glukosamin
Standart 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Blanko
Absorbansi (540nm) 0,108 0,103 0,104 0,203 0,204 0,225 0,372 0,388 0,361 0,510 0,472 0,470 0,642 0,654 0,659 0,060
Rerata 0,105
A 0,045
0,211
0,151
0,374
0,314
0,484
0,424
0,652
0,592 -
Kurva standart 0.7 y = 1.367x - 0.1049 2 R = 0.9944
0.6
Absorbansi
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
N-Asetilglukosam in (m g)
47
LAMPIRAN 2 KURVA STANDAR PROTEIN (Metode Bradford)
No.
Konsentrasi BSA (mg/mL)
Absorbansi ( = 750 nm)
1.
20
0,097
2.
40
0,222
3.
60
0,323
4.
80
0,391
5.
100
0,479
6.
120
0,565
7.
140
0,661
8.
160
0,813
0.9 y = 0.0048x + 0.0087
0.8
2
R = 0.9939
Absorbansi
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0
20
40
60
80
100
120
Konsentrasi BSA (ug/mL)
140
160
180
48
49
LAMPIRAN 3 HASIL ANALISIS IDENTIFIKASI MIKROBA (Elektroforegram hasil sequencing)
50
51
52
LAMPIRAN 4 DAFTAR TABEL PENAMBAHAN FRAKSINASI AMONIUM SULFAT (Gram Amonium sulfat yang ditambahkan sampai 1 Liter Larutan)
Konsentrasi Awal 0% 5% 10 % 15 % 20 % 25 % 30 % 35 % 40 % 45 %
Konsentrasi Akhir 5% 27
10 % 55 27
15 % 84 56 28
20 % 113 85 57 28
25 % 144 115 86 58 29
30 % 176 146 117 88 59 29
35 % 208 179 149 119 89 60 30
40 % 242 212 182 151 121 91 61 30
45 % 277 246 216 185 154 123 92 62 31
50 % 314 282 251 219 188 157 126 94 63 31
53
Konsentrasi Awal 0% 5% 10 % 15 % 20 % 25 % 30 % 35 % 40 % 45 % 50 % 55 % 60 % 65 % 70 % 75 % 80 % 85 % 90 % 95 %
Konsentrasi Akhir 55 % 351 319 287 255 223 191 160 128 96 64 32
60 % 390 357 325 292 260 227 195 163 130 97 65 33
65 % 430 397 364 331 298 265 232 199 166 132 99 66 33
70 % 472 439 405 371 337 304 270 236 202 169 135 101 67 34
75 % 516 481 447 413 378 344 309 275 241 206 172 138 103 69 34
80 % 561 526 491 456 421 386 351 316 281 245 210 175 140 105 70 35
85 % 608 572 537 501 465 429 393 358 322 286 250 215 179 143 107 72 36
90 % 657 621 584 548 511 475 438 402 365 329 292 256 219 183 146 110 73 37
95 % 708 671 634 596 559 522 485 447 410 373 335 298 261 224 186 149 112 75 37
100 % 761 723 685 647 609 571 533 495 457 419 381 343 305 266 228 190 152 114 76 38
54
LAMPIRAN 5 BIOGRAFI /RIWAYAT HIDUP PENELITI RIWAYAT HIDUP KETUA PENELITI 1. Nama Lengkap dan Gelar Akademik 2. Tempat dan Tanggal Lahir 3. Jenis Kelamin 4. Fakultas / Jurusan / Program Studi 5. Pangkat / Golongan / NIP 6. Bidang Keahlian 7. Alamat Kantor 8. Telepon / Faximili 9. e-mail 10. Alamat Rumah 11. Telepon Rumah 12. e-mail 13. Riwayat Pendidikan Jenjang Pendidikan S1 S2
Tempat Studi ITS ITB
: Nuniek Herdyastuti, S.Si, M.Si : Surabaya, 10 Nopember 1970 : Perempuan : MIPA / Kimia : Lektor / IIId / 197011101998022001 : Biokimia : Jurusan Kimia UNESA Kampus Ketintang Surabaya : 031-8298761 / 031-8298761 :
[email protected] : Karah 5/50 Surabaya : 031-8285623 :
[email protected] Tahun Lulus 1994 2002
Bidang Keahlian Kimia Biokimia
14. Pengalaman Penelitian a. Eksplorasi Bakteri Penghasil Kitinase Dari Lumpur Pertanian dan Keragaman Gen Penyandi Bakteri Kitinolitik Sebagai Agen Biokontrol (Hibah Bersaing PT XVI, 2008, Ketua) b. Penghilangan Aroma Langu pada Susu Kedelai dengan Menggunakan Enzim Papain (Dipa, 2007, Ketua) c. Identifikasi mikroorganisme termofilik penghasil enzim fitase yang tumbuh di kawah Ijen Banyuwangi (Peneliti Muda, 2007, anggota) d. Pemanfaatan Kitosan dari limbah udang windu (Penaus monodon) sebagai matriks pendukung pada imobilisasi papain melalui metode carier crosslink (Hibah Bersaing PT XIV, 2006, anggota) e. Pemanfaatan Protease dari Mikroorganisme Termofilik Yang Tumbuh di Sumber Air Panas Cangar (Peneliti Muda, 2005, Anggota) f. Produksi Etanol dari Kulit Pisang Raja dengan Variasi Konsentrasi Inokulum Saccharomyces cereviceae (Penelitian Mandiri, 2005, Ketua) e. Pengurangan Bahan Pencemar Arsen Melalui Proses Pengubahan Spesies Anorganik (As) Menjadi Spesies Organik yang Volatil dengan Memanfaatkan Aktivitas Mikroorganisme, (Peneliti Muda, 1999,Ketua)
55
15. Publikasi Ilmiah : a. Deteksi Tingkat Ekspresi Invitro Protein Car A Menggunakan Teknik Elisa dan Western Imunoblotting, Jurnal Hayati, Edisi khusus, No.2, Tahun 2003 Hal 99103 b. Pemanfaatan Air Kelapa Untuk Produksi Minuman Probiotik Dengan Variasi konsentrasi inokulum Lactobacillus casei, Seminar Nasional Kimia UNESA, 2004 c. Isolasi dan Karakterisasi Ekstrak kasar Protease dari Streptomyces griseus, Seminar Nasional Kimia UPI, 2005 d. Pemanfaatan ampas onggok untuk produksi asam sitrat dengan variasi konsentrasi inokulum aspergillus niger dan waktu inkubasi, Prosiding Seminar Nasional Kimia UNESA, 2005. e. Penentuan nilai KM dan Vmaks ekstrak kasar enzim protease hasil isolasi Streptomyces griseus melalui pengendapan ammonium sulfat, Prosiding Seminar Nasional Kimia UNESA, 2005. f. Produksi enzim glukosaisomerase dari Streptomyces sp. Dengan menggunakan xilosa sebagai induser, Seminar Nasional Kimia UNESA 2006 g. Produksi protein sel tunggal dari Sacharomyces cereviceae dengan menggunakan limbah cair tahu sebagai media pertumbuhan, Seminar Nasional UNESA, 2006 h. Pemanfaatan Dedak sebagai substrat untuk produksi enzim amylase dari Aspergillus niger, Saccharomyces cereviceae dan Bacillus licheniformis, Seminar Nasional Kimia, ITS, 2006 i. Pemakaian kitosan limbah udang windu sebagai matriks pendukung pada imobilisasi papain, Seminar Nasional Kimia VIII, ITS, 2006. j. Isolasi dan Karakterisasi Ekstrak Kasar Bromelin dari Batang Nenas (Ananas comusus L.merr), Jurnal Hayati, Edisi Desember, Volume 12, No.1, Tahun 2006. k. Kitinase dan mikroorganisme kitinolitik : Isolasi, karakterisasi dan manfaatnya (Review), International Journal Chemistry, Vol 9 : 1, Tahun 2009 l. Kitin dari limbah cangkang udang sebagai media untuk bakteri kitinolitik yang diisolasi dari lumpur sawah, Jurnal Manusia dan Lingkungan, Vol 16 : 2, Tahun 2009 m. Enzim ekstraseluler kitinase dari Burkholderia pseudomallei yang diisolasi dari lumpur sawah. Seminar Nasional Kimia UNS, 2009 n. Partial purification and characterization of chitinase produced by Burkholderia pseudomallei. International Conference on Natural and Material Sciences (NAMES 2009) di Universitas Lambung Mangkurat, 2009 Surabaya, Nopember 2009
Nuniek Herdyastuti, S.Si,M.Si NIP. 197011101998022001
56
ANGGOTA PENELITI I Nama Tempat&Tanggal Lahir Jenis Kelamin Pekerjaan NIP Jabatan dan Golongan Alamat
Pendidikan: Universitas/Instansi dan Lokasi 1. Universitas Gadjah Mada Yogyakarta 2. Institut Teknologi Bandung 3. Universiteit Leidein Netherland
: Dr. Tri Joko Raharjo, M.Si : Boyolali, 12 Juni 1973 : Laki-laki : Dosen FMIPA UGM Yogyakarta : 132 230 862 : Lektor kepala, III/d : Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Gadjah Mada, PO Box BLS 21 Sekip Utara Yogyakarta 55281, Tel 0274 545188, 0274 902122, Fax 0274 545188, email:
[email protected]
Gelar
Tahun selesai
Bidang Studi
S.Si
1996
Kimia
M.Si
1998
Biokimia
Dr
2004
Plant Biochemistry
Pengalaman kerja: Institusi 1. PT Indesso Aroma, Purwokerto, Jawa Tengah 2. Laboratorium Klinik Pramita, BandungYogyakarta 3. Jurusan Kimia, FMIPA, UGM Jogjakarta 4. Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) UGM
Jabatan Quality Control & Assurance Officer (ISO 9001) Molecular biology researcher
Perode kerja 1996 1998-2000
Staf Pengajar
1999-sekarang
Kepala Bidang Pengujian Kalibrasi dan Sertifikasi (Manajer Teknis ISO 17025-2005)
2006-sekarang
57
Pengalaman dan Beban Mengajar: Jurs TPHP/Fak. Tek Pertanian UGM Fak. Kedokteran Hewan UGM Jur. Kimia /FMIPA UGM Fak. Kehutanan UGM Jur. Kimia /FMIPA UGM
Perode kerja (Semester) 1999-2000 2000-2001 1999-2001 2004 2004-2006
Jur. Fisika-Elins/FMIPA UGM Jur. Kimia /FMIPA UGM Jur. Kimia /FMIPA UGM Jur. Kimia/FMIPA UII Jur. Kimia /FMIPA UGM
2004-sekarang 2004-2005 2004-sekarang 2006 2006/2007
Matakuliah (SKS) 1. 2. 3. 4. 5.
Kimia Organik (2) Kimia Organik (2) Biokimia (3) Kimia Organik (2) Kimia Organik Dasar II (2) 6. Kimia Dasar I (3) 7. Biokimia II (2) 8. Enzimologi (2) 9. Kimia Hasil Alam (2) 10. Kimia Organik Dasar I (3) 11. Kimia Organik Dasar II (3) 12. Biokimia II (3) 13. Analisis Biomolekul (2) 14. Analisis bahan organik (2) 15. Kimia Kelautan 16. Analisis Biomolekul (3) 17. Kimia Lipida (3) 18. Biokimia enzim (3)
Jurusan/Fakultas
Jur. Kimia /FMIPA UGM
2006/2007
Jur. Kimia /FMIPA UGM S2 Bioteknologi UGM S2 Kimia MIPA UGM
2006/2007 2005-sekarang 2005/2006
S2 Kimia MIPA UGM S3 Peternakan UGM S3 Kimia MIPA UGM
2005-sekarang 2006/2007 2005-sekarang
S3 Kimia MIPA UGM S3 Peternakan UGM
2005/2006 2006/2007
Penelitian penting: Penelitian
Jabatan
Tahun
1. Normal variant of Indonesian mithochondrial DNA 2. Penggunaan sel epitel kumur sebagai invasive sample pada tes DNA 3. Analisis tokoferol dengan menggunakan FTIR 4. Biosynthesis of cannabinoid in Cannabis sativa, first step leading to olivetolate 5. Proteomics of Cannabis sativa, analysis proteins involved in cannabinoid biosynthesis 6. Cloning pks genes involved in olivetolate
Anggota
1997-1998
PI
1998-1999
Anggota PI
1999-2000 2001-2002
PI
2001-2004
PI
2002-2004 58
biosynthesis from Cannabis sativa 7. Pengembangan metode baru preparasi serum untuk studi biomarker 8. Identidikasi senyawa antihiperkolesterol pada minyak kelapa murni 9. Pengembangan metode baru penentuan posisi asam lemak dalam triasilgliserol
PI
2006-sekarang
PI
2006-sekarang
PI
2006-sekarang
Publikasi Internasional: 1. Tri Joko Raharjo, et al., Methods for cannabinoids analysis in biological materials, Phytochem. Anal., 2004, 15 (2), 79-94 2. Tri Joko Raharjo, et al., Olivetol as a product of polyketide synthase (PKS) in Cannabis sativa L., Plant Sci., 2004, 15 (2), 79-94 3. Tri Joko Raharjo, et al., Cloning aand over-expression of a cDNA encoding a polyketide synthase from Cannabis sativa, Plant. Physiol. Biochem., 2004, 15 (2), 79-94 5. Tri Joko Raharjo, et al., Comparative proteomics of Cannabis sativa plant tissues, J. Biomol.Tech., 2004, 15, 97-106 6. Tri Joko Raharjo, et al., Callus induction of Cannabis sativa and phytochemical characterization, Indo. J. Chem. 2006, 6, 70-74 Seminar: 1. 2001 Congress on Cannabis and the cannabinoids, Berlin Germany, 2001 (Peserta) 2. 26th LOF symposium, Leiden Netherland, 2002 (Presentasi poster) 3. 27th LOF symposium, Anwerp Belgium, 2003 (Peserta) 4. 13th Symposium ALW-discussion group on Secondary Metabolism in Plant and Plant Cell: Role of transport in regulation of plant secondary metabolism, Utrecht Netherland, 2003 (Peserta) 5. 7th International congress of plant molecular biology, Barcelona Spain, 2003 (Presentasi poster) 6. ABRF2004 International Symposium: Integrating Technologies in Proteomics & Genomics, Portland USA, 2004 (Presentasi poster) 7. Seminar Nasional Kimia, Jurusan kimia FMIPA UGM, 2004
Yogyakarta, Nopember 2009
Dr. Tri Joko Raharjo, M.Si NIP. 197306121999031002
59
ANGGOTA PENELITI II 1. Nama Lengkap dan Gelar Akademik 2. Tempat dan Tanggal Lahir 3. Jenis Kelamin 4. Fakultas / Jurusan / Program Studi 5. Pangkat / Golongan / NIP 6. Bidang Keahlian 7. Alamat Kantor 8. Telepon / Faximili 9. e-mail 10. Alamat Rumah 11. Telepon Rumah 12. e-mail 13. Riwayat Pendidikan Jenjang Pendidikan S1 S2 S3
Tempat Studi ITS UGM UGM
: Sari Edi Cahyaningrum, S.Si, M.Si : Kediri, 29 Desember 1970 : Perempuan : MIPA / Kimia : Lektor kepala/ IIId / 197012291997022001 : Kimia Anorganik : Jurusan Kimia UNESA Jl. Ketintang Surabaya : 031-8298761 / 031-8298761 :
[email protected] : Pondok Ridho III Sidodadi Taman Sidoarjo : 031-7870861 :
[email protected] Tahun Lulus 1994 2001 2009
Bidang Keahlian Kimia Kimia Anorganik Bio- Anorganik
14. Pengalaman Penelitian a. Pembuatan siruf fruktosa (HFCS) menggunakan enzim glukosa isomerase yang terimobilisasi pada matriks kitosan bead (Stranas Batch II, DP2M, 2009, Ketua) b. Peranan jembatan kation logam dan imobilisasi papain pada kitosan (Disertasi, 2009) c. Eksplorasi Bakteri Penghasil Kitinase Dari Lumpur Pertanian dan Keragaman Gen Penyandi Bakteri Kitinolitik Sebagai Agen Biokontrol (Hibah Bersaing PT XVI, 2008, Anggota) d. Peningkatan produktivitas dan kualitas produk serat tanaman di kecamatan Menganti Kabupaten Gresik melalui teknologi enzimologi (Hilink Tahun III, DP2M, Anggota, 2008) e. Penghilangan Aroma Langu pada Susu Kedelai dengan Menggunakan Enzim Papain (Dipa, 2007, Anggota) f. Peningkatan Kualitas bahan baku serat tanaman dengan bioteknologi enzim (HiLink DP2M, 2007, anggota) g. Pemanfaatan Kitosan dari limbah udang windu (Penaus monodon) sebagai matriks pendukung pada imobilisasi papain melalui metode carier crosslink (Hibah Bersaing PT XIV, 2006, anggota) h. Imobilisasi S.cereviceae limbah fermentasi industri bir melalui pembentukan sol gel silica dan aplikasinya untuk adsorben kation logam berat (Hibah pekerti, DP2M, 2006, anggota)
60
i. Pemanfaatan limbah cangkang udang windu sebagai penyerap kation kadmium dalam media air (Peneliti muda, 2004, ketua) 15. Publikasi Ilmiah : a. Isolasi dan karakterisasi kitosan cangkang udang windu (Jurnal Hayati, Terakreditasi, ISSN ; 0852-6834 Edisi khusus No.2 tahun 2004) b. Adsorbsi kation Cd(II) dengan kitosan dalam medium air (Prosiding Seminar Nasional Kimia, UNESA, 2004) c. Pemanfaatan kitosan limbah udang sebagai adsorben Cd(II) dari limbah industri (Indon.Journal of Chem, Terakreditasi, Universitas Gadjah Mada, vol. 5, No. 2 2005) d. Pemanfaatan kitosan sebagai matriks dalam imobilisasi papain (Prosiding seminar Nasional Kimia, ITS, 2006) e. Perubahan karakteristik papain yang terimobilisasi pada kitosan (Prosiding seminar Nasional Kimia, ITS, 2007) f. Pengaruh proses sweelling terhadap adsorpsi Mg(II) pada kitosan (Prosiding seminar Nasional Kimia, UNESA, 2007) g. Pengaruh anion counter pada adsorpsi Ni (II) pada kitosan (Prosiding seminar Nasional Kimia, UNY, 2007) h. Adsorpsi Zn(II) dengan kitosan pada medium air (Prosiding seminar Nasional Kimia Lingkungan, UNAIR, 2008) i. Karakteristik papain terimobilisasi pada kitosan melalui jembatan Mg(II) (Jurnal Kimia Lingkungan, terakreditasi, vol.9, No. 1 tahun 2007) j. Pengaruh proses penggembungan pada kitosan terhadap adsorpsi Mg(II) dalam medium air (Jurnal Penenlitian Matematika dan Sains, vol. 14, No.2 tahun 2007) k. Karakteristik adsorpsi Cu(II) pada Kitosan bead (Jurnal Kimia Lingkungan, terakreditasi, vol. 8, No. 3 tahun 2008) l. Adsorpsi Zn(II) pada kitosan yang termodifikasi secara swelling (Jurnal Manusia dan Lingkungan, terakreditasi, vol. 10, No. 2 tahun 2008)
Surabaya, Nopember 2009
Dr.Sari Edi Cahyaningrum, M.Si NIP. 197012291997022001
61
DEPARTEMEN PENDIDIKAN NASIONAL
UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA KafrplsKetinran8Sulabalr,60231Telp,(031)8290009.8280765,Fax,(031)8280804,8293050e-nait:b,
[email protected] SUTiAT KEPUTUSAN RIKTOR UNIVERSIIAS NEGERI SURABAYA Nomor : 089 /'1.138n1K.01.23r,L.0s.01/2009 Tentrng
KECIATAN PI]NELITLAN KER]ASAMA DENCAN DIREKIORAT PENELMAN DAN IINGADDIAN KEP,I.DA MASYAR
K T (DP2M), DIRIEN DIKTI DEPDIKNAS RI
TATIUN ANCGARAN
2l]O9
REKTOR UNIVERSI'TA5 NEGERI SURABAYA
unl!l kclan.rran pelal6anaa. KeBiaran Pcnelitim Keiasama Dintlorar len€lirian dan P.ngabdian Kep.d: M.sy.rkat (DP2M), Dnjen Dikti D.pdiknas RI Tahun A.Egaran 2009, maka dipandanB pcrlu rcncrt,iiknn surar Kcputusan ini:
LrihNi
: 1. Undang-undJnSltl No,20tihun 2003 2. Prraturan Pcmerinlah Nomor60rrhun 1999 3. Sural Kepurusan PresidenRl Nd.269 rahun 1965; a. S..J t.put$n l'"!d4 nlNo. ol rrhln tccc. s. Surat Kcpuiusin Pr€siden l{l No. s7M iahun 2006, 6. Surrt Kepurusan Mendiknas No.092/O200tj 7. Su r3t K.pu tu$n lteklor No. 001/,H38/..qK.01 ?3,4O.00.06/2009. VITMUTUSI(AN
: ; : :
Judul drn Pcneliti Kegiatnn Pcnclilian Kerjasama Di.oktorar p.tulirian dan p€nEabdian K.pad. Msya.kat(DP2M), Didcn DlktiDepdiknas Rl Tahun Anggaran 2009, Dalam mcnjahntin tu86nya, Peneliti wajibb..pedoman padal€l.n anyangberlaku, S.Eali birya )rnn8 rinbul akibar d. adan/a keSiatan reGrbrt dibebantan pada.lana DlpA Univcrsilas N.gcri sulnbayi Nomor: 0173,023.04.2,4v/2009, ranSgal 31 D.s.hber 2OOg Surrl (cputus:n ini bcnrku s.jrk tanggal ditctapkan de.8an ker.ntuan bahwa seBaln s.suituny. akan dilinj.u d.nakan diubah sebaSaimana mesrinya apabila temy.ta dik€nudian lrri lcrdrpat k.krlirurn drla.r penerrprn ini.
Dilelapkan di:Surabaya lada tanepal :15 anril ?04!
&
Rcrb,.
HARISSUPNATNO
NIP 13112{863
dk.mpaiian k.pada Yth: M.nt.ri Pendidikan Nasional
Sal inan
1. 2. 3, 4, 5, 6.
Sckclnris Jendc.al D.pdilms lnspekturJe.deralDepdiknas Dnett!r Jcnder.l Pendidik.n'lingSi Dcpdikn:s rara Penbantu R.ktorunesr ParaDcknn, (elun LcmbiSa, Kepal, airo di linSkunSan UNESA
7,
Tim Pengeloh Drn:Masyarlk.l Unesa
,,* t>-t
o
o
8
s
o '?
1
bi z=
I
g
E
:;f" !E9,
5 e
E
E
'a
E
E
e
2*t :d
E
E
E
.E
-9 l5
I
9B ;?n! I
1ta
:
'."
1i
!
d,6
AP
! ! z-a o. I;
E.E
i
€6
-.*
7_1 od m1
I
I
E; .-:
v? AE
94 Ei
E
'6
$
-F
lj -
? ..=
,s 3
1o Z
l;
ia
3
t;6-<
E
\ae4
-t!
i66 .6fiA
."u
.€ 9g ;3 ! g z
g E
:a::t::
'e ! !
ltt-lii li: !
IEE
EE
E
l-'l l-' I lI li
* l:, l; l:
i"
-. da
l'" I
E
I
,.]
-E
= i.s
';9
lo o
ooo
dd
lr;nEsEEi
1"""1" II:
1"" I
-l-l-t"to
:i-
loo
oo
lod
E
c .!
c
l9
B
: ;
3
o
r) C
t t.
9F
g
,E
c,a i1
:EJ lJ E € $
i62
l;{ E.-
if,.
3s 3;l
=:
r-y 3i
t.!E
r,
:R
{
EA e7I i:o
.,_
=Jo
;v
-!a
li
eDC
v !: 9a i
L!E " r3 c>> .6€ ! E:E a2': 2lvl .^* | :+:. zoc Ei e ,'D :" A lEi! i EP
t"
E;i
t d
P)
a
=
i=3:
PE F
7_
^iFe
f-
F
I
3i3
i>i
v,6>
si 3e
!
;3f
i
9C5 baE
_3_
E:
itJ
---=
E"
:t P: $I s ;
l.;
-E
4-H
+:
E b.E
rE si
P*
!.q i.e
*l
'tn
P
s
e.
4; zr
PE.
s
:
q
zzij >6 >6
'1 P
E
:€
d:
:;
q
.e
9,1
ai
n::( :'!:l :; --9E :59I E:€i iatr 3 q5 ;,EI +.s : +;, E
I I
E
i
I I
-"t .^,"1 ;."." 6AA
.-9 d
€
!'a .- al
!,91
E3:!
l
66AA
E
F
L
?,
.E
E
,3AE
x;;i.l 4q.Ea 2Z,n>
e
ESF
i:
dul>
ts.9
ii
7)i
7,<
EP
E
c
d5 -3'iil
*i,_ a; i6: 9n
j3
"'9i
!
.E
?
d:
H! =
!"Ezi ; t;l? =I
l
.g
E
d;
6;1
;'t I
I
I
E
-!
o
d x'
!'
o
I I I
a;
,
B
/
2
I
t€ Ef E^E>
I l5 u:
I
li
e
c6
iitd -"E
,$-
i iE
H
E.
t'E -!
t5,
E E,-: +<.'dE
ts;l E ss
/l
E
5
EJ:
s,n
., l< 5I d l=a t 3"
l*t
u,
-3i ;'1
P
=*iEg x4P
iv . !bit i:t *i-9 ; s3;l
i
Pl
I*iaa iil ! n E'n] p3*pl Ei! YI
" lr
F
33F
x:1
E
l!
,
t,
ua,>
q>-Z
c T
F-
6,!
:e
>-o u
3
E
Eo3
: E
!d ci
aa
ffitrN ;iiY€\ll'.\ 'EEt-l.l r:+, \. 1:j
V
E
