LAPORAN AKHIR HIBAH KOMPETITIF PENELITIAN FMIPA

LAPORAN AKHIR HIBAH KOMPETITIF PENELITIAN FMIPA

Produksi -Amilase Rekombinan dalam Inang Pichia pastoris Defisien Protease

Tahun ke 1 dari rencana 1 tahun

Nama Peneliti Utama: Dr. Shabarni Gaffar, M.Si (0025047105)

Nama Anggota: Dian Siti Kamara, M.Si (0006126603)

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN NOVEMBER 2014

HALAMAN PENGESAHAN Judul: Produksi -amilase rekombinan dalam inang Pichia pastoris defisien protease. Peneliti/Pelaksana Nama Lengkap NIDN Jabatan Fungsional Program Studi Nomor HP Alamat surel (e-mail)

: Dr. Shabarni Gaffar, M.Si. : 0025047105 : Lektor : Kimia : 081573019025 : [email protected]

Anggota (1) Nama Lengkap NIDN Perguruan Tinggi

: Dian Siti Kamara, M.Si : 0006126603 : Universitas Padjadjaran

Institusi Mitra (jika ada) Nama Institusi Mitra : Alamat :Penanggung Jawab :Tahun Pelaksanaan : Tahun ke 1 dari rencana 1 tahun Biaya Tahun Berjalan : Rp. 25.000.000 Biaya Keseluruhan : Rp. 25.000.000 Mahasiswa yang terlibat penelitian : S1 : 1 orang S2 S3 Jatinangor, November 2014 Mengetahui, Kepala Departemen Kimia

Ketua,

(Dr. Iwan Hastiawan) NIP. 19550111 198701 1 001)

(Dr. Shabarni Gaffar, M.Si) NIP. 19710425 200501 2 001

Menyetujui Dekan FMIPA Unpad

(Prof. Dr. Budi Nurani Ruchjana, MS) NIP. 19631223 198803 2 001

DAFTAR ISI

LEMBAR PENGESAHAN .......................................................................................... ii DAFTAR ISI ............................................................................................................... iii DAFTAR GAMBAR.................................................................................................... iv

RINGKASAN ................................................................................................................ 1 PRAKATA .................................................................................................................... 2 BAB I. PENDAHULUAN............................................................................................. 3 1.1. Latar Belakang ......................................................................................................... 3 1.2. Tujuan Penelitian ..................................................................................................... 4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA .................................................................................. 5 2.1. Sistem ekspresi Pichia pastoris ............................................................................... 5 2.2. Enzim α-amilase Saccharomycopsis fibuligera ....................................................... 7 2.3. Penelitian yang telah dilakukan ............................................................................... 7 2.4. Penelitian yang akan dikerjakan .............................................................................. 8 BAB III TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN .............................................. 15 3.1. Tujuan .................................................................................................................... 15 3.2. Manfaat penelitian ................................................................................................. 15 BAB IV METODE PENELITIAN ............................................................................ 20 4.1. Alat dan Bahan....................................................................................................... 20 4.1.1. Alat...................................................................................................................... 22 4.1.2. Objek Penelitian .................................................................................................. 23 4.1.3. Bahan Penelitian ................................................................................................. 24 4.2. Metode Penelitian .................................................................................................. 24 4.2.1. Isolasi plasmid rekombinan yang membawa gen pengode a-amilase ................ 25 4.2.2. Peremajaan inang P. pastoris.............................................................................. 26 4.2.3. Pembuatan sel kompeten dan transformasi P. pastoris ...................................... 28 4.2.4. Penetuan fenotipe P. pastoris ............................................................................. 29 4.2.5. Ekspresi α-amilase .............................................................................................. 30 4.2.6. Karakterisasi α-amilase dengan SDS PAGE ...................................................... 31

4.2.7. Penentuan aktivitas α-amilase............................................................................. 32 4.2.8. Penentuan kadar protein...................................................................................... 33 BAB V. HASIL YANG DICAPAI ............................................................................. 34 5.1. Isolasi plasmid rekombinan yang membawa gen pengode α-amilase ................... 35 5.2. Peremajaan inang P. pastoris SMD 1165 .............................................................. 35 5.3. Transformasi P pastoris SMD 1165 dengan metoda elektroporasi ....................... 36 5.4. Ekspresi α-amilase oleh P. pastoris rekombinan ................................................... 37 5.5. Aktifitas α-amilase rekombinan ............................................................................. 38 5.6. Karakterisasi α-amilase rekombinan ...................................................................... 39 5.7. Penentuan kadar protein......................................................................................... 40 BAB VI. KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................... 41 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................. 21

DAFTAR GAMBAR

Gambar 5.1. Hasil isolasi plasmid pPICZA-Sfamy ...................................

21

Gambar 5.2. Peta plasmid pPICZA-Sfamy ...............................................

22

Gambar 5.3. Peremajaan kultur P. pastoris SMD 1165 ...........................

23

RINGKASAN

Sistem ekspresi Pichia pastoris banyak digunakan untuk memproduksi protein heterolog karena tingkat ekspresinya yang tinggi, mudah dilakukan peningkatan skala produksi, adanya modifikasi pasca translasi, serta mampu mensekresikan protein heterolog dengan ukuran lebih besar dari 50 kDa. Namun level sekresi pada beberapa protein rekombinan tertentu masih rendah, yang diantaranya disebabkan terjadinya proteolisis dari protein yang diekspresikan. Penelitian ini dilakukan dengan hipotesis bahwa penggunaan inang P. pastoris defisien protease akan meningkatkan produksi -amilase oleh P. pastoris. Penggunaan inang P. pastoris sudah kami pelajari sebelumnya untuk produksi -amilase S. fibuligera. Namun hasil yang diperoleh dirasa tidak terlalu besar dibanding dengan tipe natif, padahal beberapa hal lain yang mempengaruhi hasil ekspresi telah diperhatikan. Oleh karena itu pada penelitian ini kami bermaksud untuk mempelajari penggunaan inang P. pastoris defisien protease untuk produksi -amilase. Penelitian ini dilaksanakan selama satu tahun dan melibatkan satu orang mahasiswa S1. Vektor ekspresi untuk P. pastoris yang telah mengandung gen pengode -amilase digunakan untuk mentransformasi P. pastoris SMD 1165 defisien protease. Transformasi dilakukan dengan metoda elektroporasi. Ekspresi -amilase oleh inang P. pastoris defisien protease dilakukan dengan menambahkan penginduksi metanol. Karakterisasi dilakukan dengan metoda SDSPAGE. -Amilase yang dihasilkan diuji aktifitasnya dan ditentukan kadar proteinnya. Hasil penelitian ini menujukkan telah diperoleh transforman P. pastoris defisien protease yang membawa gen Sfamy. Hasil analisis kualitatif menunjukan transforman P. pastoris[pPICZA-Sfamy] mensekresikan α-amilase. Hasil ini juga dikonfirmasi dengan ekspresi α-amilase rekombinan dan analisis aktivitas α-amilase, dimana diperoleh aktivitas α-amilase yang disekresikan oleh P. pastoris defisien protease, tertingi pada jam ke 48 dengan aktivitas 300 U/mL dan kadar protein 25 ug/mL. Analisis dengan SDS-PAGE menunjukkan berat mulekul α-amilase sekitar 60 kDa, hasil ini sedikit lebih besar dibanding α-amilase natif (57 kDa), yang kemungkinan disebabkan oleh adanya glikosilasi pada P. pastoris.

2

PRAKATA Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah Subhanahu wa Ta’ala, karena hanya dengan izin-Nya penulis bisa menyelesaikan laporan kemajuan penelitian ini. Shalawat serta salam semoga tercurah kepada Rasulullah SAW beserta keluarga, sahabat dan seluruh pengikut setia Beliau sampai akhir zaman. Alhamdulillah, penulis akhirnya dapat menyelesaikan laporan kemajuan hibah kompetitif penelitian FMIPA dengan judul “Produksi -amilase rekombinan dalam inang Pichia pastoris defisien protease” Penyusun ingin mengucapkan terima kasih kepada: 1. Prof. Dr. Budi Nurani R, MS, selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Padjadjaran. 2. Dr. Iwan Hastiawan, selaku Kepala Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran. 3. Dr Toto Subroto, selaku kepala Laboratorium Kesehatan dan Pangan Departemen Kimia FMIPA Unpad dan seluruh staf dosen Biokimia atas bantuan dan dorongannya. Semoga Allah memberikan balasan yang berlipat ganda atas segala bantuan dan dorongan selama ini. Penyusun menyadari bahwa dalam penyusunan laporan ini masih terdapat kekurangan. Oleh karena itu, penyusun menerima kritik dan saran yang bersifat membangun dari berbagai pihak sebagai perbaikan supaya penyusunan laporan ini dapat berkembang dan tentunya bermanfaat bagi peneliti pada khususnya dan masyarakat pada umumnya. Akhir kata, semoga penyusunan laporan ini dapat bermanfaat bagi semua pihak dan bisa memberikan ilmu bagi yang membacanya.

Jatinangor, November 2014

Penyusun

3

BAB I. PENDAHULUAN

1.1.Latar Belakang -Amilase telah dipakai pada bidang industri seperti makanan, alkohol, gula, dan tekstil. Sampai saat ini, Indonesia masih mengimpor enzim ini dari beberapa negara, karena belum adanya industri yang memproduksi enzim ini. Padahal Indonesia memiliki biodiversitas mikroba yang tinggi, yang potensial untuk menghasilkan amilase. Salah satu mikroba penghasil -amilase yang telah dipelajari adalah Saccharomycopsis fibuligera (Soemitro et al, 1996) -Amilase S. fibuligera merupakan salah suatu enzim ekstraseluler yang mampu

memecah pati mentah sehingga dapat menghemat energi dalam pemrosesan pati, dengan demikian memiliki potensi untuk dapat dikembangkan dan diaplikasikan dalam industri (Hostinova, 2002; Hasan et al., 2006). Optimasi produksi -amilase S. fibuligera perlu dilakukan untuk mempermudah pengembangan produksi -amilase dalam skala komersial, dengan harga yang bersaing dengan enzim impor. Penelitianpenelitian tentang -amilase S. fibuligera telah dilakukan oleh kelompok kami sejak tahun 1993. Penelitian ini telah menghasilkan publikasi internasional tentang proteolisis -amilase S. fibuligera (Hasan et al., 2008), Karakterisasi biokimia glukoamilase (Natalia et al., 2011) dan peningkatan aktivitas -amilase S. fibuligera melalui modifikasi kovalen (Ismaya et al., 2013). Selanjutnya -amilase S. fibuligera di produksi dalam P. pastoris pada penelitian RUT XII (Puspasari et al, 2006), dan dimodifikasi peptida signalnya untuk peningkatan sekresi dalam P. pastoris (Gaffar et al, 2007). Hasil yang diperoleh dari penelitian-penelitian ini telah berhasil meningkatkan produksi -amilase dalam P. pastoris, namun masih lebih rendah dibandingkan yang dipublikasikan oleh Paifer et al. (1994) yang melaporkan ekspresi -amilase suatu bakteri dalam P. pastoris. Beberapa faktor yang mempengaruhi

tingkat sekresi juga sudah dipelajari, yaitu: penambahan faktor pelipatan protein dan faktor sekresi (Gaffar et al., 2010). Pada penelitian ini akan dilakukan ekspresi amilase S. fibuligera menggunakan inang P. pastoris defisien protease. Penggunakan galur ini

berhasil

meningkatkan produksi

(Cereghino&Cregg, 2000).

4

endostatin murin

dan manusia

Dari hasil penelitian RUT XII (Puspasari et al. 2006) dengan topik ”Produksi amilase dengan kestabilan tinggi dalam P. pastoris”, diperoleh aktivitas -amilase S. fibuligera R64 tertinggi dengan sistem batch sebesar 5000 U/mL. Sementara itu Paifer et al. (1994) melaporkan bahwa tingkat ekspresi -amilase bakteri dalam P. pastoris mencapai 22.000 U/mL. Berdasarkan hal tersebut di atas, disimpulkan bahwa ternyata tingkat ekspresi -amilase S. fibuligera R64 dalam P. pastoris masih relatif rendah. Pengaruh penambahan faktor pelipatan protein dan faktor sekresi juga sudah dipelajari (Gaffar et al., 2010; Gaffar et al., 2012), namun hasil yang diperoleh masih belum memuaskan. Terdapat banyak faktor yang mempengaruhi level sekresi protein oleh mikroba. Menurut Shi-Hwei et al. (2005), beberapa masalah yang sangat potensial dalam sekresi protein, termasuk dalam P. pastoris adalah: (1) jenis penggunaan kodon dari gen yang diekspresikan, (2) jumlah gen yang digunakan, (3) efisiensi dan kekuatan promoter, (4) efisiensi sinyal translasi, (5) jenis peptida sinyal, (6) proses dan pelipatan di dalam retikulum endoplasma dan badan Golgi, (7) faktor lingkungan dalam sekresi ekstraseluler, dan (8) hidrolisis protein oleh protease.

1.2. Tujuan Penelitian. Berdasarkan pertimbangan di atas, pada penelitian ini faktor “hidrólisis protein oleh protease” menjadi perhatian. dalam peningkatan hasil. Penggunaan inang defisien proteasi diyakini akan meminimalkan proteólisis protein yang dihasilkan sehingga dapat meningkatkan hasil. Penelitian ini merupakan topik

penelitian S1. Hasil yang diperoleh akan

melengkapi data hasil penelitian tentang produksi -amilase dalam sistem ekspresi P. pastoris, sehingga dapat dipublikasikan pada jurnal nasional atau internasional. Bagi pengembangan institusi, adanya penelitian ini selain akan meningkatkan kualitas sumber daya tenaga akademik institusi yang terlibat, juga akan memperkuat jaringan kerjasama yang telah ada.

5

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1.Sistem ekspresi Pichia pastoris. Cowan (1996) dalam pembahasannya mengenai teknologi enzim dalam industri melaporkan bahwa sebagian besar enzim yang telah digunakan di industri ternyata merupakan hasil rekayasa, baik rekayasa pada tingkat genetik maupun protein. Salah satu pendekatan untuk memproduksi enzim rekombinan pada skala komersial adalah dengan cara kloning, yaitu dengan memindahkan gen pengkode enzim tertentu ke inang (host), dengan harapan tingkat sekresi yang tinggi dari inang terhadap enzim tertentu, karena tingkat jumlah enzim yang disekresi dari mikroba asalnya

(tanpa kloning) biasanya lebih rendah dibandingkan dengan hasil

rekombinan. Escherichia coli telah lama menjadi pilihan sebagai ‘pabrik’ berbagai protein rekombinan. Penggunaan E. coli sebagai sistem ekspresi dipilih karena sistem ini mempunyai tingkat ekspresi yang tinggi, media pertumbuhannya murah, serta mudah dilakukan peningkatan skala produksi untuk industri. Masalah timbul bila protein yang akan diekspresikan dalam E. coli berasal dari organisme eukariot. Seperti semua prokariot lainnya, E. coli tidak dapat melakukan modifikasi pasca-translasi yang sangat diperlukan oleh protein-protein eukariot. Selain itu protein yang diekspresikan di E. coli merupakan protein intraseluler yang sering menghasilkan badan inklusi yang tidak larut (dalam kasus ekspresi tinggi). Untuk memperoleh protein dalam bentuk aktif, badan inklusi harus dilarutkan dan dilakukan pelipatan ulang. Selanjutnya bila protein diekspresikan di E. coli, residu metionin kadang-kadang tetap tertinggal pada sisi N-terminal dari protein yang diekspresikan. Ekstra metionin ini dilaporkan mempengaruhi kestabilan konformasi protein (Chaudlhuri et al., 1999; Takano et al., 1999). Untuk mengatasi kendala dalam sistem ekspresi E. coli, protein rekombinan yang berasal dari eukariot banyak diekspresi dalam sistem Saccharomyces cerevisiae. Beberapa hasil penelitian dari beberapa kelompok telah berhasil meningkatkan produksi enzim-enzim tertentu di S. cerevisiae. Namun ternyata sistem ekspresi S. cerevisiae memiliki keterbatasan. Produksinya rendah dan kebanyakan protein yang disekresikan S. cerevisiae tidak ditemukan bebas dalam medium, akan tetapi berada pada rongga periplasma, hal ini menimbulkan masalah pada saat pemurnian protein 6

sehingga menurunkan hasil yang diperoleh. Disisi lain, protein heterolog mengalami hiperglikosilasi dengan lebih dari 100 residu manosa dalam bentuk rantai samping Noligosakarida. Kelebihan manosa sering mengubah fungsi protein sehingga protein heterolog menjadi bersifat antigenik. Selain itu bila densitas sel tinggi, S. cerevisiae akan memproduksi etanol yang bersifat racun, sehingga menurunkan jumlah protein yang disekresikan (Glick dan Pasternak, 2003). Pichia pastoris merupakan spesies alternatif untuk ekspresi protein rekombinan. Penggunaan sistem ekspresi P. pastoris memberikan keuntungan dibandingkan dengan sistem ekspresi lain. Sistem ini merupakan satu-satunya sistem yang menggabungkan keuntungan penggunaan E. coli (tingkat ekspresi tinggi, mudah dilakukan peningkatan skala produksi, dan murah) dan sistem ekspresi eukariot (adanya komponen pelipatan protein dan modifikasi pasca translasi). Fleksibilitas sistem ekspresi P. pastoris menjadikannya alat yang ideal untuk riset laboratorium yang ditujukan untuk aplikasi industri. Berbagai jenis protein telah berhasil diproduksi dengan sistem ekspresi P. pastoris dengan tingkat ekspresi hingga 12 g/L (Invitrogen, 2004). Tingkat ekspresi -amilase suatu bakteri dalam P. pastoris yang cukup tinggi telah diperlihatkan oleh Paifer et al. (1994), yaitu sebanyak 2,5 g/L. P. pastoris telah digunakan juga untuk ekspresi mutan -amilase pankreas manusia yang berbobot molekul 56 kDa (Rydberg et al., 1999). Hasil yang ditunjukkan di atas dapat menjadi pertimbangan kuat dalam penggunaan P. pastoris sebagai vektor dalam produksi amilase untuk aplikasi industri. P. pastoris memiliki beberapa keunggulan dibandingkan dengan S. cerevisiae, yaitu: (1) P. pastoris memiliki promoter yang diregulasi dengan ketat, yaitu gen AOX1 yang mengkode alkohol oksidase yang dapat diinduksi oleh metanol. Apabila ada metanol, 30% dari protein selular adalah alkohol oksidase. Sedangkan bila tidak ada metanol, gen AOX1 tidak bekerja. Selanjutnya promoter gen AOX1 dengan cepat merespons penambahan metanol ke medium. Dengan kata lain, promoter AOX1 merupakan kandidat yang baik untuk menjalankan transkripsi gen yang diklon dan memproduksi protein rekombinan dalam jumlah besar; (2) Tingkat sekresi protein rekombinan pada P. pastoris tinggi, hal ini disebabkan oleh konsentrasi sel yang tinggi dan tidak dihasilkannya etanol yang merupakan racun bagi sel; dan (3) P. pastoris biasanya mensekresikan sangat sedikit proteinnya sendiri, sehingga

7

memudahkan pemurnian protein rekombinan yang disekresikan (Glick dan Pasternak, 2003). Protein dapat disekresikan ke medium ekstraselular dengan cara memilih peptida sinyal tertentu dari sel eukariot seperti ragi. Banyak jenis sinyal sinyal yang telah digunakan dalam sistem ekspresi ragi, seperti peptida sinyal yang berasal dari gen PHO1, yeast invertase, sinyal sekresi -mating factor, dan lain-lain. Masing masing sinyal memiliki keunggulan tersendiri dan tidak ada aturan khusus untuk menentukan urutan sinyal yang efektif. Diantara peptida sinyal yang paling umum digunakan adalah peptida sinyal protein -mating factor dari S. cerevisiae (Cereghino dan Cregg, 2000). Vektor P. pastoris pada umumnya dirancang sebagai plasmid integrasi untuk mencegah masalah ketidakstabilan plasmid selama pertumbuhan jangka panjang. Gen asing dan marker seleksi ragi diinsersikan ke kromosom spesifik melalui proses rekombinasi homolog antara DNA pada vektor dengan daerah yang homolog pada genom P. pastoris. Peta vektor ekspresi P. pastoris diperlihatikan pada Gambar 2.1. (Invitrogen, 2004).

Gambar 2.1. Peta vektor ekspresi pPICZA, B, C dari P. pastoris (Invitrogen, 2005). Pada P. pastoris terdapat dua gen yang mengkode alkohol oksidase, yaitu: AOX1 dan AOX2. AOX1 bertanggung jawab terhadap aktivitas alkohol oksidase di sel. Ekspresi gen AOX1 sangat tergantung kepada regulasi dan induksi dari metanol dan biasanya jumlah AOX1 mencapai 30% dari total protein P. pastoris ketika metanol dijadikan sebagai sumber karbon. Gen AOX2 memiliki kemiripan dengan AOX1 sampai 97%. Gen ini terekspresi lebih lambat di metanol dibandingkan AOX1. Tingkat ekspresi dari AOX1 diatur pada tingkat transkripsi. Pada medium sel yang 8

mengandung metanol, sekitar 5% dari polyA-RNA di dalam sel berasal dari gen AOX1. Terdapat dua mekanisme regulasi AOX1, yaitu: mekanisme represi/ depresi dan mekanisme induksi (Glick dan Pasternak., 2003). Kemampuan P. pastoris mensekresikan protein tertentu dengan tingkat sekresi tinggi tidak terlepas dari kemampuan ragi tersebut melakukan metabolisme terhadap alkohol. Metabolisme yang dimaksud adalah oksidasi metanol menjadi formaldehid dengan menggunakan molekul oksigen oleh alkohol oksidase. Salah satu produk samping dari oksidasi metanol adalah hidrogen peroksida (H2O2). Untuk mencegah sifat racun dari H2O2, maka metabolisme metanol ini dilakukan disebuah organel sel khusus yang disebut dengan peroksisom. Karena alkohol oksidase memiliki afinitas yang sangat rendah terhadap oksigen, maka kompensasi P. pastoris adalah dengan cara mensekresi protein dengan jumlah sangat banyak (Invitrogen, 2004). Sistem ekpresi P. pastoris telah digunakan untuk memproduksi lebih dari 100 protein aktif dari bakteri, jamur, invertebrata, tumbuh-tumbuhan, dan mamalia, termasuk manusia. Protein-protein rekombinan ini, seperti antigen permukaan hepatitis B, serum albumin manusia, dan bovine lysozyme, memiliki sifat identik dengan protein natifnya (Cereghino dan Cregg, 2000) Menurut Shi-Hwei et al. (2005), beberapa masalah yang sangat potensial dalam sekresi protein, termasuk dalam P. pastoris adalah: (1) jenis penggunaan kodon dari gen yang diekspresikan, (2) jumlah gen yang digunakan, (3) efisiensi dan kekuatan promoter, (4) efisiensi sinyal translasi, (5) jenis peptida sinyal, (6) proses dan pelipatan di dalam retikulum endoplasma dan badan Golgi, (7) faktor lingkungan dalam sekresi ekstraseluler, dan (8) hidrolisis protein oleh protease. Beberapa galur defisien protease SMD1163 (his4pep4prb1), SMD1165 (his4prb1), dan SMD1168 (his4, pep4) mendegradasi beberapa protein asing dengan efektif. Hal ini terutama dapat diamati pada kultur fermentor, karena kombinasi dari sel densitas tinggi dan lisis sejumlah kecil sel menghasilkan protease vakuola konsentrasi tinggi. Galur defisien protease SMD1168 Δpep4:: URA3 Δkex1:: SUC2 his4 ura3 baru-baru ini dikembangkan untuk menginhibisi proteolisis dari endostatin murine dan manusia. Protease Kex1 dapat memotong ujung karboksil dari lysin dan arginin. Sehingga galur dengan delesi Kex1 dibuat untuk menghambat proteolisis ujung karboksil. Setelah fermentasi selama 40 jam, pemurnian endostatin dapat dilakukan. Namun sel defisien protease ini tidaklah sebagus galur wild type (dalam hal 9

PEP4). Selain itu, kelangsungan hidupnya juga rendah dan sel ini tumbuh lambat dan lebih sulit untuk ditransformasi. Sehingga penggunaan galur defisien protease hanya direkomendasikan pada situasi bila cara lain untuk mengurangi proteolisis memberikan hasil yang tidak memuaskan (Cereghino & Cregg, 2000). 2.2. Enzim α-amilase Saccharomycopsis fibuligera Enzim -amilase (1,4--D-glukan glukanohidrolase [EC 3.2.1.1]) adalah enzim yang mengkatalisis hidrolisis pati atau poli- dan oligosakarida lain yang memiliki ikatan 1,4--glikosida secara acak dan cepat dengan produk berupa gula yang lebih sederhana dengan konfigurasi-. Sejak -amilase termostabil yang dihasilkan oleh Bacillus licheniformis digunakan dalam industri produksi gula cair, maka pengembangan aplikasi -amilase bidang industri lainnya semakin luas, seperti alkohol, pengolahan buah-buahan, dan tekstil. Kebutuhan yang besar akan -amilase yang besar dengan sifat-sifat yang optimal, menyebabkan beberapa kelompok peneliti berusaha meningkatkan kapasitas produksi dan sifat -amilase agar dapat menyesuaikan dengan kebutuhan industri, salah satunya dengan rekayasa pada tingkat protein atau gen. (Hashida dan Bisgaard-Frantzen, 2000). Enzim -amilase Saccharomycopsis fibuligera merupakan salah suatu enzim ekstraseluler yang memiliki potensi untuk dapat dikembangkan sehingga dapat diaplikasikan dalam industri. Walaupun -amilase yang dihasilkan oleh ragi belum diaplikasikan secara luas dibandingkan dengan yang diproduksi oleh bakteri dan jamur, enzim -amilase dari S. fibuligera telah lama dimanfaatkan untuk proses sakarifikasi pada fermentasi makanan. Kemampuan amilase (-amilase dan glukoamilase) yang dihasilkan oleh Saccharomycopsis fibuligera dalam memecah pati mentah merupakan sifat yang menarik, enzim semacam ini dapat digunakan dalam pemrosesan pati yang hemat energi (Hostinova, 2002).

2.3. Penelitian yang telah dikerjakan. Penelitian-penelitian tentang -amilase S. fibuligera telah dilakukan oleh kelompok kami sejak tahun 1993. Penelitian ini telah menghasilkan publikasi internasional tentang proteolisis -amilase S. fibuligera (Hasan et al., 2008), Karakterisasi biokimia glukoamilase (Natalia et al., 2011) dan peningkatan aktivitas 10

-amilase S. fibuligera melalui modifikasi kovalen (Ismaya et al., 2013). Selanjutnya -amilase S. fibuligera di produksi dalam P. pastoris pada penelitian RUT XII (Puspasari et al, 2006), dan dimodifikasi peptida signalnya untuk peningkatan sekresi dalam P. pastoris (Gaffar et al, 2007). Hasil yang diperoleh dari penelitian-penelitian ini telah berhasil meningkatkan produksi -amilase dalam P. pastoris, namun masih lebih rendah dibandingkan yang dipublikasikan oleh Paifer et al. (1994) yang melaporkan ekspresi -amilase suatu bakteri dalam P. pastoris. Beberapa faktor yang mempengaruhi tingkat sekresi juga sudah dipelajari, yaitu: penambahan faktor pelipatan protein dan faktor sekresi (Gaffar et al., 2010; Gaffar et al., 2012).

2.4. Penelitian yang akan dikerjakan. Topik yang akan dikerjakan pada penelitian ini adalah produksi a-amilase S. fibuligera dalam inang P. pastoris defisien protease. Penggunaan inang ini disarankan untuk meminimalkan degradasi protein oleh protease inang. Penelitian ini akan melengkapi data hasil penggunaan sistem ekspresi P. pastoris untuk produksi amilase sehingga bisa dipublikasikan di jurnal internasional atau nasional terakreditasi.

11

BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN

3.1. Tujuan Tujuan penelitian ini adalah produksi -amilase S. fibuligera dalam inang P. pastoris defisien protease. Sistem ekspresi yang dihasilkan diharapkan mampu memproduksi -amilase yang secara ekonomi dapat bersaing dengan enzim komersial. Tujuan khusus yang akan dicapai pada penelitian ini adalah : 1. Transformasi inang P. pastoris defisien protease dengan vektor ekspresi yang telah membawa gen pengode a-amilase. 2. Ekspresi a-amilase oleh P. pastoris defisien protease. 3. Produksi -amilase dalam P. pastoris. 4. Mengetahui aktivitas -amilase dan kadar protein 5. Karakterisasi a-amilase dengan SDS-PAGE dan Western Blot 6. Mengetahui kondisi optimum untuk produksi -amilase dalam inang P. pastoris defisien protease.

3.2. Manfaat Penelitian Hasil penelitian ini akan memberikan informasi tentang manfaat penggunakan inang P. pastoris defisien protease untuk produksi protein rekombinan dalam sistem ekspresi P. pastoris. Salah satu kunci dalam produksi enzim -amilase rekombinan adalah manipulasi mikroba penghasil -amilase. Hampir semua enzim komersial merupakan enzim rekombinan yang berasal dari mikroba yang telah direkayasa (Cowan, 1996). Salah satu kendala produksi enzim -amilase wild type adalah produktivitasnya rendah, sedangkan dalam industri diperlukan mikroba dengan produktivitas yang tinggi dan ekonomis. Untuk menghasilkan galur mikroba dengan sifat-sifat yang unggul ini, dapat dimanfaatkan teknologi DNA rekombinan. Enzim-enzim tersebut dapat dihasilkan dalam sistem ekspresi protein heterolog, seperti E. coli, S. cerevisiae dan P. pastoris. Jumlah enzim yang disekresi dari mikroba asalnya biasanya lebih rendah dibandingkan dengan hasil rekombinan.

12

BAB III. METODE PENELITIAN 4.1

Alat dan Bahan

4.1.1 Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah elektroporator, shaker incubator, seperangkat alat PAGE (Poliakrilamid gel electrophoresis), seperangkat alat elektroforesisi agarose, penangas air, autoclave, spektrofotometer, pengaduk magnet, pemanas dan alat-alat gelas.

4.1.2 Objek Penelitian Objek penelitian adalah gen pengode -amilase S. fibuligera R64 (Sfamy) yang dibawa oleh inang E. coli Top10F’ [pPICZA-Sfamy]. Inang yang akan digunakan adalah P. pastoris galur SMD 1165 (Invitrogen).

4.1.3 Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: YNB, ekstrak ragi, bakto pepton, sorbitol, D-biotin, histidin, metanol, gliserol, kalium hidrogen fosfat dan kalium dihidrogen fosfat untuk ekspresi protein. Pati, DNS, natrium hidroksida, kalium-natrium-tartrat , buffer fosfat, reagen Bradford untuk uji aktifitas dan kadar protein. Transformasi P. pastoris metode elektroporasi menggunakan HEPES, DTT dan sorbitol. Isolasi DNA genom S. fibuligera menggunakan kit Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega). SDS, akrilamida, metilenbisakrilamida, AMPS, TEMED, glisin, Tris-base, merkaptoetanol, bromofenol biru, gliserol, coomassie brilliant blue, asam asetat glasial, dan marka protein untuk karakterisasi protein dengan SDS-PAGE.

4.2 Metode Penelitian. 4.2.1. Isolasi plasmid rekombinan yang mengandung gen pengode -amilase dan linearisasi dengan enzim restriksi Pme1. Plasmid rekombinan akan diisolasi dari inang E. coli yang diperoleh pada penelitian sebelumnya. Plasmid rekombinan diisolasi dari koloni E. coli transforman menggunakan QIAgen Spin Plasmid Miniprep Test Kit (Qiagen) mengikuti protocol. 13

DNA plasmid rekombinan hasil pemurnian, dianalisis dengan elektroforesis agarosa 1%. Sebanyak 1-5 μg plasmid rekombinan pPICZA-Sfamy dilinearisasi menggunakan enzim restriksi Pme1. Campuran reaksi mengandung 1-5 μg plasmid rekombinan, 10 Unit Pme1 dan buffer Tango 1X. Restriksi dilakukan dalam volume 20 L, dan diinkubasi pada suhu 37C selama 16 jam. Hasil restriksi di elektroforesis menggunakan gel agarosa 1%. 4.2.2. Peremajaan inang P. pastoris SMD 1165 Inang P. Pastoris SMD 1165 diremajakan menggunakan media pertumbuhan YPD (yeast-peptone-dextrose). Kultur P. pastoris diremajakan untuk mendapatkan koloni tunggal. Kultur dipindahkan ke dalam 20 mL media YPD cair (ekstrak ragi 1% (b/v), bakto pepton 2% (b/v), dekstrosa 2% (b/v)) diinkubasi pada suhu 30C semalam dengan pengocokan 250 rpm, dan kemudian di sebarkan pada media YPD padat (ekstrak ragi 1% (b/v), bakto pepton 2% (b/v), dekstrosa 2% (b/v), bakto agar 2%) untuk mendapatkan koloni tunggal. Koloni tunggal dipindahkan ke agar miring untuk penyimpanan dalam jangka waktu 3 bulan. 4.2.3. Pembuatan sel kompeten dan transformasi P. pastoris dengan metoda elektroporasi. Satu koloni tunggal P. pastoris dipindahkan ke dalam 20 mL media YPD cair, diinkubasi pada suhu 30C semalam dengan pengocokan 250 rpm. Kemudian 1 mL kultur dipindahkan ke dalam 100 mL media YPD cair, diinkubasi pada suhu 30C dengan pengocokan 250 g sampai mencapai OD660 = 1,3-1,5. Sel dipanen dengan sentrifugasi pada 5000 g selama 10 menit, diresuspensi dalam 20 mL media YPD dan ditambahkan 400 μL HEPES 1M (pH 8,0). Selanjutnya ditambahkan 0,5 mL DTT 1M dan diinkubasi pada suhu 30C selama 15 menit dengan pengocokan. Pada pelet ditambahkan ddH2O steril sampai volume 100 mL. Sel dipelet dengan sentrifugasi pada 5000 g, suhu 4C selama 10 menit. Selanjutnya dicuci satu kali dengan 100 mL ddH2O dingin, satu kali dengan 50 mL ddH2O dingin, dan satu kali dengan 4-10 mL sorbitol 1M dingin. Setiap setelah pencucian, sel dipelet dengan sentrifugasi pada 5000 g, 4C selama 10 menit, dan terakhir sel diresuspensi dalam 100 μL sorbitol 1M dingin (akan menghasilkan volume total 200-300 μL). Sebanyak 40-50 μL sel dimasukkan kedalam kuvet elektroporasi, kemudian ditambahkan 5 ng - 1 μg DNA 14

hasil linearisasi (dalam volume 5 μL). Kuvet yang telah berisi campuran didiamkan dalam es selama 5 menit. Kuvet dikeringkan dan segera lakukan elektroporasi menggunakan BTX electro cell manipulator 600. Kemudian segera tambahkan 1 mL sorbitol 1M dingin ke dalam kuvet. Sel hasil transformasi ditumbuhkan pada media padat YPDS (ekstrak ragi 1% (b/v), bakto pepton 2% (b/v), dekstrosa 2% (b/v), sorbitol 1M, bakto agar 2% (b/v)) yang mengandung zeocin 100 μg/mL. Sel diinkubasi pada suhu 30C selama 3-5 hari. 4.2.4. Penentuan Fenotip Mut P. pastoris. Menggunakan tusuk gigi steril, satu koloni transforman P. pastoris diambil dan digoreskan pada media padat MMH (minimal methanol medium+ histidin: YNB 1,34% (b/v), biotin 4x10-5% (b/v), metanol 0,5% (v/v), histidin 0,004% (b/v)) dan MDH (minimal dextrose medium + histidin: YNB 1,34% (b/v), biotin 4x10-5% (b/v), dekstrosa 2% (b/v)), penggoresan koloni dilakukan pada media MMH terlebih dulu. Menggunakan tusuk gigi steril yang berbeda sejumlah koloni transforman lain digoreskan pada media MMH dan MDH. Untuk membedakan fenotip Mut+ dari MutS dibuat satu goresan kontrol (GS115/ albumin MutS dan GS115/pPICZ/lacZ Mut+) pada media MDH dan MMH. Lalu diinkubasi pada suhu 30C selama 2 hari atau lebih, dan dianalisis dengan “scoring template”. Galur Mut+ akan tumbuh normal dikedua media, sementara galur MutS tumbuh normal pada media MDH tetapi menunjukkan pertumbuhan lambat atau sama sekali tidak tumbuh pada media MMH. 4.2.5. Ekspresi -amilase. Ekpresi -amilase akan dilakukan pada transforman P. pastoris yang positif berisi plasmid rekombinan dengan menambahkan penginduksi metanol. Satu koloni tunggal transforman P. pastoris diinokulasi dalam 10 mL media YPD cair, dan diinkubasi semalam pada suhu 30C dengan pengocokan 200 rpm. Sebanyak 1 mL kultur cair dipindahkan ke 10 mL media BMGY (buffered glycerol complex medium: ekstrak ragi 1% (b/v), bakto pepton 2% (b/v), kalium fosfat 100 mM pH 6, YNB 1,34% (b/v), biotin 4x10-5% (b/v), gliserol 1% (v/v)) menggunakan labu 100 mL. Sel ditumbuhkan pada suhu 28–30C pada inkubator pengocok 250 rpm hingga mencapai OD600 = 10-20 (kira-kira 18-20 jam). Sel di panen dengan sentrifugasi pada 1500 – 3000 rpm selama 5 menit pada suhu ruang. Supernatan didekantasi dan pelet sel 15

diresuspensi dalam 25 mL media BMMH (buffered minimal methanol-histidin: YNB 1,34% (b/v), kalium fosfat 100 mM pH 6, biotin 4x10-5% (b/v), metanol 1% (v/v), histidin 0,004%) menggunakan labu 250 mL. Labu ditutup dengan kapas steril dan inkubasi dilanjutkan dengan pengocokan. Induksi dilakukan dengan menambahkan metanol dengan konsentrasi akhir 0,75% setiap 24 jam, pada jam ke 24, 36, 72, 96, 120, dan 144. Pengambilan sampel dilakukan setiap jam induksi dengan mengambil 1 mL kultur hasil ekspresi dipindahkan ke dalam tabung mikro 1,5 mL. Sampel disentrifugasi pada kecepatan maksimum selama 2-3 menit pada suhu ruang. Supernatan dipindahkan ke tabung lain, supernatan dan pelet disimpan pada pendingin -20C sampai siap untuk diuji. 4.2.6. Karakterisasi -amilase dengan SDS-PAGE. Persiapan gel: Pelet dan supernatan hasil ekspresi dikarakterisasi dengan SDSPAGE (Sambrook et al., 1989) menggunakan gel dengan komposisi 10% separating gel dan 4% stacking gel. Separating gel dibuat dengan mencampurkan 4 mL akrilamida 30% (akrilamida 29% (b/v) dan N-N’-metilenbisakrilamida 1% (b/v)); 3,3 mL aquadest; 2,5 mL buffer Tris-Cl 1M (pH 8,8); 50 μL SDS 20%; 200 μL AMPS 10% dan

8,2 μL TEMED. Larutan dimasukkan kedalam cetakan dan dibiarkan

memadat. Stacking gel dibuat dengan mencampurkan 0,67 mL akrilamid 30%; 2,65 mL aquadest; 0,65 mL buffer Tris-Cl 1M (pH 6,8); 20 μL SDS 20%; 50 μL AMPS 10% dan 6 μL TEMED. Stacking gel dituang diatas separating gel setelah memadat. Sebelum stacking gel dimasukkan, terlebih dahulu dipasang sisir untuk membuat sumur sampel. Setelah itu didiamkan sampai terjadi polimerisasi (kira-kira 30 menit). Persiapan supernatan: 50 μL supernatan dicampur dengan sampel bufer (TrisCl 50 mM, pH 6,8, gliserol 1% (v/v), β-merkapoetanol 100 mM, SDS 2% (b/v), bromofenol biru 0,1% b/v) dan dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit dan didinginkan. Persiapan pelet sel: Pelet sel diresuspensi dalam 300 μL aquadest, dan ditambahkan 100 μL TCA 50%, diaduk segera. Sampel dibekukan pada suhu -80C selama 30 menit. Sel disentrifugasi pada suhu ruang dengan kecepatan 14.000 g selama 5 menit. Pelet sel dicuci dua kali dengan 500 μL

aseton 80% dingin,

dilanjutkan dengan sentrifugasi pada 14.000 g selama 5 menit pada suhu ruang. Supernatan dibuang dengan hati-hati, dan pelet dibiarkan mengering. Pelet dilarutkan 16

dalam 100 μL SDS 1% dalam natrium hidroksida 0,1N. Kemudian ditambahkan sampel buffer (Tris-Cl 50 mM pH 6,8, gliserol 1% v/v, β-merkaptoetanol 100 mM, SDS 2% b/v, bromofenol biru 0,1% b/v) dan dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit dan didinginkan. Elektroforesis: Gel yang sudah memadat dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis dan ditambahkan running buffer (glisin 1,18% b/v, Tris base

0,32%

b/v, SDS 0,2% b/v). Sebanyak 25 μL sampel protein dimasukkan ke dalam tiap-tiap lubang gel dan elektroforesis dilakukan pada tegangan 120 V, 400 A selama 60-80 menit). Sebagai marka digunakan PageRulerTM prestained protein ladder (Fermentas, SM0671). Alat elektroforesis dimatikan setelah blue dye tepat keluar dari gel. Staining dan Destaining: Gel dikeluarkan dari plat kaca kemudian di cuci 3x selama 5 menit dalam 20 mL air de-ion, kemudian diinkubasi dalam 20 mL larutan staining (coomassie brilliant blue 0,25% b/v, asam asetat glasial 10% v/v, metanol 45% v/v, dan akua dm) selama 45 menit dengan pengocokan rotasi. Kemudian dipindahkan ke dalam 30 mL larutan destaining (asam asetat glacial 10% v/v glasial, metanol 45% v/v, dan akua dm) dan dibiarkan sampai gel menjadi bersih (30 menit sampai semalam). Gel yang sudah bersih di scan 4.2.7. Penentuan aktivitas -amilase. Aktivitas -amilase ditentukan dengan metode DNS (Miller, 1959). Reagen DNS disiapkan dengan menambahkan 0,1 gram asam dinitrosalisilat ke dalam 2 mL natrium hidroksida 2N dan 5 mL aquadest. Kemudian, ditambahkan 3 gram garam Rochelle (kalsium natrium tartrat) dan volume dicukupkan menjadi 10 mL dengan aquadest. Persiapan supernantan dan pelet sel. Supernatan disiapkan untuk pengukuran aktivitas tanpa pengenceran dan dengan pengenceran sampai 100 kali. Pelet sel diresuspensi dalam breaking buffer (natrium fosfat 50 mM, pH 7,4; PMSF 1 mM; EDTA 1 mM; gliserol 5%) kemudian disentrifugasi selama 5-10 menit pada 3000 g pada suhu 4C. Sel kemudian diresuspensi dalam breaking buffer sampai mencapai OD600 sekitar 50-100. Kemudian ditambahkan glass beads (diameter 0,5 mm) dengan volume yang sama, campuran di vortex selama 30 detik, inkubasi di es selama 30 detik, dilakukan sampai 7 kali. Campuran disentrifugasi pada suhu 4C selama 5-10

17

menit pada 12.000 g. Supernatan dipindahkan ke tabung baru dan digunakan untuk penentuan aktivitas -amilase. Reaksi enzimatik: Sebanyak 325 μL pati 2% (b/v) (yang dilarutkan dalam buffer fosfat 20 mM pH 6,0) ditambahkan 625 μL buffer fosfat 20 mM pH 6,0, diinkubasi pada suhu 50C selama 10 menit. Kemudian 50 μL sampel supernatan atau hasil lisis pelet ditambahkan ke dalam campuran reaksi, dan inkubasi dilanjutkan selama 10 menit. Reaksi enzimatik dihentikan tepat setelah inkubasi 10 menit dengan memindahkan tabung ke dalam wadah es. Sebagai blanko digunakan semua komponen reaksi, kecuali sampel diganti dengan ddH2O. Penentuan aktivitas amilase dan pembuatan kurva kalibrasi: Sebanyak 50 μL hasil reaksi enzimatik digunakan untuk penentuan aktivitas -amilase dengan menambahkan 50 μL reagen DNS. Kurva kalibrasi disiapkan dengan menambahkan 50 μL glukosa 1; 2; 3; 4; 5 mM ke dengan 50 μL reagen DNS. Semua tabung sampel ditempatkan dalam waterbath dan dididihkan selama 7 menit. Setelah didinginkan, sampel diencerkan 10x dengan menambahkan 900 μL aquadest, dan absorbansi diukur pada 500 nm. Satu unit aktivitas enzim adalah enzim yang membebaskan sejumlah gula pereduksi yang ekivalen dengan 1 μmol gula pereduksi per-menit pada kondisi uji. 4.2.8. Penentuan kadar protein. Kadar protein ditentukan dengan metode Bradford. Sebanyak 160 μL sampel dan standar BSA dipipet ke dalam pelat mikro, kemudian ditambahkan

40 μL reagen

Bradford. Sampel dicampur menggunakan pipet multi-channel, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Absorbansi diukur pada 595 nm.

18

BAB 5. HASIL YANG DICAPAI

5.1

Isolasi plasmid rekombinan yang membawa gen pengode a-amilase (pPICZA-Sfamy). Hasil karakterisasi dengan gel agarose memperlihatkan bahwa plasmid

pPICZA-Sfamy telah berhasil diisolasi dari E. coli. Plasmid ini mempunyai ukuran sekitar 3300 pb dan membawa DNA sisipan gen Sfamy dengan ukuran 1700 pb, sehingga total ukurannnya adalah sekitar 5000 pb. Hasil pemotongan dengan enzim restriksi Kpn1 dan Apa1 akan mengeluarkan DNA sisipan Sfamy sehingga terlihat dua pita (3300 dan 1700 pb). Hasil pemotongan dengan enzim Pme1 melinearkan plasmid ini sehingga terlihat satu pita dengan ukuran 5000 pb (Gambar 5.1). plasmid pPICZASfamy yang sudah linear ini yang digunakan untuk mentransformasi P. pastoris.

A.

B.

Gambar 5.1. A. Hasil isolasi plasmid pPICZA-Sfamy. (1) Marka DNA, (2) Plasmid pPICZA-Sfamy sirkular, (3) pPICZA-Sfamy/Kpn1/Apa1, (4) pPICZASfamy/Pme1. B. Peta plasmid pPICZA-Sfamy. Plasmid pPICZA-Sfamy yang digunakan adalah hasil rancangan dari penelitian sebelumnya, dengan peta seperti diperlihatkan pada gambar 5.1.

5.2. Peremajaan inang P. pastoris SMD 1165 Hasil peremajaan P. pastoris SMD 1165 diperlihatkan pada gambar 5.3. Peremajaan dilakukan dengan memindahkan kultur P. pastoris dari media agar miring ke media YPD padat (ekstrak ragi 1% (b/v), bakto pepton 2% (b/v), dekstrosa 19

2% (b/v), bakto agar 2%) dalam cawan petri, untuk mendapatkan koloni tunggal. Koloni tunggal yang diperoleh diperlihatkan pada gambar 5.3.

Gambar 5.3. Kultur P. pastoris SMD 1165 hasil peremajaan

5.3. Transformasi P. pastoris SMD 1165 menggunakan plasmid pPICZA-Sfamy linear dengan metoda elektroporasi. P. pastoris ditransformasi menggunakan metode elektroporasi. Elektroporasi menghasilkan 103-104 transforman per μg DNA linear dan tidak merusak dinding sel P. pastoris. Metode elektroporasi menghasilkan frekuensi transformasi yang tinggi pada P. pastoris dan merupakan metode pilihan yang tepat untuk mengisolasi integran multi-kopi. Kemungkinan insersi multi-kopi berkisar antara 1-10%, sehingga dibutuhkan ratusan sampai ribuan transforman untuk mengisolasi sejumlah klon multi-kopi (Invitrogen, 2006). Vektor pPICZA-Sfamy yang dilinearkan pada daerah 5’AOX1 akan mengalami integrasi melalui insersi gen ke daerah 5’AOX1 inang. Sehingga inang P. pastoris yang digunakan akan menentukan apakah galur rekombinan dapat memetabolisme metanol (Mut+) atau tidak (Muts). Untuk menghasilkan galur rekombinan Mut+, digunakan inang P. pastoris yang mengandung gen AOX1 natif (misalnya X-33, GS115, SMD1165). Pada penelitian ini digunakan inang P. pastoris SMD 1165. Sebanyak

1-5

μg

plasmid

rekombinan

pPICZA-Sfamy

dilinearkan

menggunakan enzim restriksi Pme1 mengikuti prosedur (Gambar 5.1). Sisi pemotongan Pme1 berada pada daerah promotor 5’AOX1. Transformasi P. pastoris dengan metode elektroporasi dilakukan mengikuti prosedur. Sel hasil transformasi ditambahkan 1 mL sorbitol 1M dingin dan

20

ditumbuhkan pada media padat YPDS yang mengandung zeocin 100 μg/mL dan diinkubasi pada 30C selama 3 hari.

A.

B.

Gambar 5.4. A. Koloni transforman P. pastoris[Sfamy]. B. replika P. pastoris[Sfamy]

Hasil transformasi metode elektroporasi memperlihatkan efisiensi yang tidak terlalu tinggi, diperoleh sekitar 10 koloni P. pastoris transforman (Gambar 5.4). Elektroporasi dilakukan menggunakan Eppendorf electroporator pada tegangan 1500 volt, menggunakan kuvet 0,2 cm Elektroporasi atau elektropermeabilisasi merupakan peningkatan konduktivitas listrik dan permeabilitas membran plasma sel yang disebabkan pemberian arus listrik dari luar. Elektroporasi biasa digunakan untuk transformasi bakteri, ragi dan protoplas tanaman. Dinding sel pada umumnya berpori dan berperan sebagai kerangka yang kaku yang berfungsi menjaga sel dari pengaruh lingkungan. Jika sel (bakteri/ragi) dan plasmid dicampur, maka plasmid dapat pindah ke dalam sel setelah elektroporasi. Setelah itu sel harus diperlakukan dengan hati-hati sampai sel memiliki kesempatan untuk membelah membentuk sel baru yang mengandung plasmid. Transformasi metode elektroporasi 10 kali lebih efektif dibandingkan transformasi kimia (Weaver & Chizmadzhev, 1996). Transforman yang tumbuh direplika ke media YPD yang baru. Hasil replika transforman diperlihatkan pada gambar 5.4B.

5.4. Uji Kualitatif P. pastoris [Sfamy] Uji kualitatif perlu dilakukan untuk memastikan koloni P. pastoris yang akan dipakai mengekspresikan α-amilase. Uji kualitatif pada P. pastoris dilakukan dengan menggunakan media YPD padat yang mengandung pati. Hasil pengamatan (Gambar 5.5) menunjukkan bahwa koloni P. pastoris [Sfamy] mampu mensekresikan α-amilase 21

keluar sel. Hal ini ditunjukkan oleh adanya daerah bening di sekeliling koloni P. pastoris setelah dilakukan penambahan larutan KI/I2. Daerah bening tersebut terbentuk karena tidak adanya pati yang membentuk kompleks dengan KI/I2 karena pati telah dihidrolisis oleh -amilase yang disekresikan oleh P. pastoris, sedangkan daerah biru menunjukkan adanya pati yang masih tersisa dalam media pertumbuhan sehingga membentuk kompleks dengan iodium.

Gambar 5.5 Hasil uji aktivitas -amilase secara kualitatif dalam media padat yang mengandung 2% pati dan 0,5% metanol. 5.5. Ekspresi α-amilase oleh P. pastoris[Sfamy]. Transforman P. pastoris [Sfamy] dan [WT-ALP1] digunakan untuk mengekspresikan Sfamy. Ekspresi dilakukan mengikuti prosedur. Induksi dilakukan dengan menambahkan metanol 0,75% (konsentrasi akhir dalam medium) setiap 24 jam. Sebagai pembanding tingkat sekresi Sfamy oleh P. pastoris digunakan inang GS115. Supernatan dan pelet dikumpulkan setiap 24 jam dan dianalisis aktivitas amilasenya dengan metode DNS. Sekresi Sfamy meningkat tajam pada jam ke-72, namun kemudian menurun hingga pengambilan sampel terakhir pada jam ke-144. Pada jam ke-72, aktivitas Sfamy pada supernatan kultur P. pastoris [MS-ALP1] dan [WT-ALP1] berturut-turut adalah 106,69 U/mL dan 32,29 U/mL (Gambar 4.15). Sedangkan pada inang GS115 aktivitas -amilase yang terdeteksi pada kultur supernatan hanya 1,9 U/mL sehingga bisa dianggap bahwa inang P. pastoris tidak

22

mensekresikan -amilase. Hasil ini memperlihatkan level sekresi Sfamy oleh P. pastoris [MS-ALP1] lebih tinggi 3,3x dibandingkan P. pastoris [WT-ALP1].

Penentuan aktifitas, kadar protein dan karakterisasi a-amilase hasil ekspresi

1 y = 0.0757x + 0.0276 R² = 0.9879

Absorbansi

0.8 0.6 0.4 0.2 0 1

2

3 4 5 Konsentrasi Glukosa (mM)

6

Pembuatan laporan akhir Publikasi di Jurnal Nasional Bionatura. Jam ke -

A500

[Glukosa]

0 24 48 72 96 120

0.06 0.245 0.372 0.351 0.143 0.127

0.44 2.90 4.6 4.32 1.54 1.33

23

Aktivitas (U/mL) 88 581 920 864 309 266

Aktivitas (U/ml)

1000 800

600 400

[WTSfamy]

200 0 0

24

48

72

96

120

Waktu (jam)

24

BAB 7. KESIMPULAN DAN SARAN

7.1. Kesimpulan 1.

Plasmid pPICZA-Sfamy telah berhasil diisolasi, dikarakterisasi dan dilinerkan dengan enzim restriksi.

2.

P. pastoris SMD 1165 telah berhasil diremajakan menggunakan media pertumbuhan YPD padat.

7.2

Saran 1. Penelitian ini perlu dilanjutkan ke tahap berikutnya, yaitu transformasi P. pastoris, ekspresi a-amilase, uji aktivitas dan karakterisasi.

25

DAFTAR PUSTAKA

Chandhuri, T.K., Horii, K., Yoda, T., Arai, M., Nagata, S., Terada, T.P., Uchiyama, H., Ikura, K., Tsumoto, K., Kataoka, H., Matshushima, M., Kuwajima, K., Kumagai, I. 1999. Effect of the extra N-Terminal Met. Residu on the Stability and folding of Recombinant-lactalbumin express in E. coli. J. Mol. Biol. 285, 1179-1194. Cereghino, J. L., Cregg, J. M. 2000. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol. Rev. 24, 45-66 Cowan, D. 1996. Industrial enzyme technology. Trends Biotechnol. 14, 177-178 Gaffar, S., 2007. Peningkatan sekresi -amilase S. fibuligera melalui manipulasi peptide sinyal dalam P. pastoris. Laporan Penelitian Hibah Bersaing. Gaffar, S., 2010. Penambahan faktor pelipatan protein (PDI1) untuk meningkatkan sekresi -amilase S. fibuligera oleh P. pastoris. Laporan Penelitian Hibah Bersaing. Gaffar, S., 2011. Pengaruh manipulasi genetik terhadap tingkat sekresi -amilase Sacharomycopsis fibuligera R64 dalam Pichia pastoris. Disertasi. Unpad. Gaffar, S., 2012. Pengaruh ko-ekspresi Sec4p terhadap tingkat sekresi -amilase S. fibuligera R64 oleh Pichia pastoris. Glick, B.R., Pasternak, J.J. 2003. Molecular biotechnology, principles and applications of recombinant DNA. ASM Press (Washington DC). 163-173. Hasan, K., Ismaya, W.T., Kardi, I., Andiyana, Y., Kusumawidjaya, S., Ishmayana, S., Subroto, T., and Soemitro, S. 2008. Proteolysis of -amylase from Saccharomycopsis fibuligera: characterization of digestion products. Biologia. 63: 1044-1050. Hashida, M., Bisgaard-Frantzen, H. 2000. Protein engineering of new industrial amylase. Trends Glycosci. Glycotechnol. 12, 389-401 Hostinova, E. 2002. Amylolitic enzyme produced by the yeast Saccharomycopsis fibuligera. Biologia Bratislava. 11, 247-251 Invitrogen, 2005. A manual of methods for expresion of recombinant proteins in Pichia Pastoris. California. 7-10. Ismaya, W. T., Setiana, T., Mulyana, B., Natalia, D., Soemitro, S. 2001. Stabilization and protein engineering of -amylase from Saccharomycopsis fibuligera. The First Symposium on -Amilase Family, Slovakia. 30 September-4 Oktober. 26

Ismaya, W.T., Hasan, K., Kardi, I., Zainuri, A., Rahmawaty, R.I., Permanahadi, S., Viera, B.V.E., Harinanto, G., Gaffar, S., Natalia, D., Subroto, T., Soemitro, S.2013. Chemical Modification of Saccharomycopsis fibuligera R64αAmylase to Improve its Stability Against Thermal, Chelator, and Proteolytic Inactivation, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol 170, No.1, 44-57. ISSN 0273-2289, DOI 10.1007/s12010-013-0164-8. Ismaya, W. T., Setiana, T., Natalia, D., Soemitro, S. 2003. Peningkatan kestabilan amilase melalui rekayasa protein. Laporan Hibah Bersaing IX. Departemen Pendidikan Nasional Paifer, E., Margolles, E., Cremata, J., Montesino, R., Herrera, L., Delgado, J. M. 1994. Efficient expression and secretion of recombinat alpha amylase in Pichia pastoris using two different signal sequences. Yeast. 10, 1415-1419. Puspasari, F., Soemitro, S., Natalia, D. 2007. Produksi -Amilase dengan Kestabilan Tinggi dalam Pichia pastoris. Laporan RUT XII. Kementrian Riset Dan Teknologi. Rydberg, E. H., Sidhu, G., Vo, H. C., Hewitt, J., Cote, H. C. F., Wang, Y., Numao, S., Macgillivray, R. T. A., Overall, C. M., Brayer, G. D., Withers, S. G. 1999. Cloning, mutagenesis, and structural analysis of human pancreatic -amylase expressed in Pichia pastoris. Protein Sci. 8, 635-643. Shi-Hwei, L., Wei-I, C., Chia-Chin, S., Margaret Dah-Tsyr, C. 2005. Improved secretory production of glucoamylase in Pichia pastoris by combination of genetic manipulation. Biochem. Biophys. Res. Comm. 326, 817-824 Soemitro, S., Bahti, H. H., Adi, T. P, Thaurhesia, S., Hardjito, L., Niloperbowo, W., Wenten I. G. 1996. Produksi enzim pemecah pati. Laporan RUT I. Kementrian Riset Dan Teknologi Takano, K., Tsuchimora, K., Yamagata, Y., Yutani, K. 1999. Effct of foreign Nterminal residues on the conformational stability of human lyzozyme. Eur. J. Biochem. 266, 675-682.

27