79
Lampiran 1a Gambar alat presto
Lampiran 1b Gambar alat oven
Lampiran 1c Gambar alat timbangan analitik
80
Lampiran 1d Gambar alat grinder
Lampiran 2 Gambar kandang metabolik
Lampiran 3 Gambar mencit (Mus mucuslus) dewasa
Lampiran 4 Gambar anak mencit pada awal kelahiran
81
Lampiran 5 Prosedur penetapan asam folat serum dengan metoda Spektrofotometer Elissa. Prosedur ini menggunakan alat Imx System Software Versi 6,0 dan Imx Metabolic Assay Module versi 3,0. Prinsip pengukuran asam folat serum didasarkan pada teknologi penangkapan ion (ion captur technology). Pada teknologi ini, sebelumnya glass fiber matrix dari reaction cell ion captur technology (penangkapan ion) dilapisi dengan senyawa amonium berat, molekul tinggi yang bermuatan positif dan menangkap senyawa kompleks yang bermuatan negatif. Selama pengujian kompleks yang bermuatan negatif dibentuk, komplek ini ditangkap melalui interaksi elektrostatik denga matrix beruatan positif. Pada proses pengujian asam folat ini menggunakan 150 µl serum. Bahan-bahan reaksi : 1.
Potasium hidroksida konsentrasi 0,8 N
2.
Alkalin fosfatase berkonyugasi dalam TRIS buffer dengan albumin.
3.
4-Metylumbelliferyl fosfat; 1,2 mM dalam buffer AMP.
4.
Capture reagent, monoclonal (mencit) protein pengikat anti folat bergabung pada polyanion/protein pengikat folat dalam buffer borat dengan albumin.
5.
Denaturant, dithiothreitol dalam buffer asetat.
6.
Lysis reagent, asam askorbat dan guanidin hidrokhlorida.
7.
Spesiment diluent, buffer TRIS dalam albumin.
Bahan Reaksi dan sampel ditambahkan pada Reaction cell seperti urutan berikut: 1.
Ion capture reaction cell diisi dengan denaturant.
2.
Pasang elektroda untuk menyambungkan sampel dan denaturant.
3.
Pasang elektroda untuk menambahkan potasium hidrokksida.
4.
Capture reagent ditambahkan pada reaksi dan inkubasikan.
5.
Folat berikatan dengan komponen FBP pada pembentukan capture reagent sebagai polyanion FBP analyte complex.
6.
Sebagian dari campuran reaksi yang mengandung komplek polyanion FBP analyte dipindahkan pada glass fiber matrix yang bermuatan positif.
7.
Matrix dicuci untuk membuang konyugasi yang tidak terikat.
8.
Substrat, 4-Metylumbelliferyl fosfat ditambahkan pada matrix dan fluorescent yang dihasilkan diukur dengan MEIA optical assembly.
82
Lampiran 6 Prosedur penetapan retinol serum dengan metoda HPLC Waters 501 Pembuatan larutan standar 1.
Stok standar A
2.
Stok standar B = 0,1ml, larutan stok standar A dilarutkan dalam etanol
3.
Stok standar C = 2,5ml, larutan stok standar B diambil lalu dilarutkan dalam etanol sampai 10 ml, kemudian baca pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 290 nm.
4.
Lalu suntikan pada alat HPLC sebanyak 50 µl, dua kali suntik
5.
Diperoleh peak area I, Peak area II dan rata-rata Peak.
6.
Konsentrasi standar dihitung sebagai berikut : Konsentrasi standar =
Optical Density x 103 78,5
Cara Kerja: 1. Pipet 100 µl serum + 100 µl standar, kocok dengan alat vortex selama 45 menit, lalu tambahkan 200 µl heksan dan kocok kembali dengan vortex selama 45 menit. 2. Kemudian sentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 2000 rpm 3. Ambil supernatant kemudian diuapkan dengan gas N2 sampai kering, lalu tambahkan 100 µl methanol: dichlorometan (75:25). 4. Kocok dengan vortex selama 10 menit 5. Suntikan pada alat HPLC sebanyak 50 µl.
Perhitungan dilakukan dengan menggunakan rumus : = Area sampel x C std = .....mg/dl Area standar
83
Lampiran 7 Prosedur penetapan feritin serum dengan metode Spektrofotometer Elissa Alat yang digunakan adalah Imx System (imx system software module 6.0 dan imx metabolic assay module versi 1.0). Prinsip pengukuran kadar feritin dalam serum didasarkan pada teknologi microparticle enzyme immunoassay (MEIA). Sebelum dianalisis serum darah sebanyak 150 µl yang sebelumnya disimpan dalam bentuk beku dicairkan terlebih dahulu. Bahan-bahan reaksi : 1. Anti feritin dilapisi partikel mikro dalam buffer dengan penstabil protein. 2. Konyugasi antiferitin, alkalin fosfatase dalam buffer dengan penstabil protein. 3. 4-metylumbelliferyl fosfat, 1,2 mM dalam buffer AMP. 4. Feritin diluent, buffer mengandung surfactant dan penstabil protein. 5. Feritin untuk calibrator dan control dalam berbagai konsentrasi. Bahan reaksi dan sampel ditambahkan pada reaction cell seperti urutan berikut: 1. Pemasangan elektroda untuk menyambungkan sampel, speciment diluent, konyugasi anti feritin alkalin fosfatase, dan feritin yang dilapisi partikel mikro untuk inkubasi yang baik pada reaction cell. 2. The enzyme-labeled antibody, feritin dan partikel mikro membentuk ikatan sebagai komplek antibodi-antigen-antibodi. 3. Sebagian dari campuran reaksi yang mengandung komplek-antibodi-antigenantibodi berikatan dengan partikel mikro dipindahkan pada glass fiber matrix. 4. Matrix dicuci untuk membuang material yang tidak terikat. 5. Substrat, 4-methylumbelliferyl fosfat ditambahkan pada matrix dan fluorescent yang dihasilkan diukur dengan MEIA optical assembly.
