LAMPIRAN
Lampiran 1. Road-map Penelitian Persiapan Penelitian
Pelaksanaan Penelitian
Analisis Data Deskriptif
Persiapan wadah dan ikan uji (15-30 Agustus 2013) Bak ukuran 45x30x35cm sebanyak 4 buah dicuci, didesinfeksi, dan dikeringkan Diletakkan secara acak dan diberi label Diisi air dengan padat tebar ikan kakap putih 15 ekor/bak. Adaptasi ikan selama 7 hari
Pencampuran pakan dengan imunostimulan (H0/9 September 2013) Pakan buatan ditimbang sebanyak 1 kg. Imunostimulan dicampurkan pada pakan, ditambahkan putih telur sebagai binder dan diaduk. Pellet dikeringkan dengan cara diangin-anginkan.
Pengganasan Virus VNN (H21 dan H28) PBS, tabung reaksi dan mortar diautoklaf Organ diambil dari ikan yang terserang VNN, digerus dengan mortar dan ditambahkan PBS steril. Air gerusan disaring dengan menggunakan milipore (ThermoTM) 0,45 µm, hasilnya diambil sebanyak 1ml dengan menggunakan Spuit. Disuntikan secara intra peritoneal (i.p) dengan dosis 0,1 ml. Ikan media dipelihara, diamati gejala yang timbul untuk mengetahui apakah virus VNN sudah menginfeksi ikan tersebut.
Pemberian pakan yang dicampur imunostimulan Pakan diberikan selama 45 hari pemeliharaan Frekuensi 2x/hari, pukul 08.00 dan 16.00 WIB
Uji Tantang Uji tantang pada hari ke-38 Penyuntikan virus VNN ke tubuh semua ikan uji secara intra peritoneal (i.p) dengan dosis 0,1 ml.
Pengambilan Darah Pengambilan sampel darah pada hari ke- 0, 7, 14, 21 dan 45 Jarum suntik dan microtube dibilasdengan EDTA 10% Darah diambil dari 5 ekor ikan, dipilih secara acak pada setiap bak, lalu disimpan di microtube 1,5ml
Parameter pengamatan Hematologi Hematokrit Total Leukosit Diferensial Leukosit Uji Fagositosis
Kualitas Air Suhu pH DO Salinitas
Penyusunan Laporan
64 Lampiran 2. Pembuatan Isolat VNN
organ diambil dari ikan yang terserang VNN
Ikan media disuntikan secara intra peritoneal (i.p) dengan dosis 0,1 ml
Organ digerus dengan menggunakan mortar Air hasil saringan diambil sebanyak 1ml dengan menggunakan Spuit
Hasil gerusan dimasukkan ke dalam microtube
Ditambahkan PBS steril
65 Lampiran 3. Pencampuran imunostimulan jintan hitam pada pakan
Pakan ditimbang sebanyak 1kg
Dosis jintan hitam ditambahkan sesuai perlakuan
Pakan diberi label sesuai dengan dosis imunostimulan pada perlakuan
Putih telur ditambahkan sebagai binder Diaduk hingga merata lalu dikeringanginkan
66
Lampiran 4. Pengamatan Hematokrit
Darah diambil dengan spuit 1ml Setelah komponen darah terpisah lalu diukur dengan penggaris
Darah dihisap kedalam tabung hematokrit Tabung hematokrit disentrifuge selama 15 menit, kecepatan 3.500 rpm
Tabung hematokrit ditutup dengan lilin Tabung hematokrit diberi label
67 Lampiran 5. Pengamatan Total Leukosit
Sampel darah dihisap dengan pipet berskala sampai 0,5 dilanjutkan dengan menghisap larutan turk sampai skala 11
Empat tetesan pertama dibuang
Bilik hitung/ haemocytometer tersebut diletakkan di bawah mikroskop
Tetesan berikutnya dimasukkan ke dalam haemocytometer
68 Lampiran 6. Pengamatan Differensial Leukosit
Kaca pemulas disentuhkan pada tetesan darah, digeser Ke kanan sehingga darah menyebar sepanjang kaca objek, selanjutnya dikeringkan.
Amati dengan perbesaran 1000x
Sediaan tersebut digenangi dengan methanol secukupnya selama 5-10 menit Preparat dikeringanginkan
Genangi dengan giemsa selama 25 menit Dibilas dengan aquades
69 Lampiran 7. Pengamatan Uji Fagositosis
Kultur V. alginolyticus dipanen ditambahkan PBS, dimatikan dengan 2% formalin selama 24 jam.
Sentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 menit.
Tabung hematokrit dipotong pada leukosit, lalu ditampung pada mikrotube (effendorf)..
Preparat difiksasi dengan etanol (95%) selama 5 menit, dikeringanginkan, lalu diwarnai dengan safranin (0,15%) selama 10 menit dan diamati dengan mikroskop perbesaran 1000x.
Sampel dari microplate well diambil sebanyak 5 l dan diletakkan pada objek glass, dibuat preparat ulas, dikeringanginkan
Leukosit dimasukkan dalam microplate well, kemudian ditambah dengan V. alginolyticus (kepadatan 107 sel/ml) dengan volume yang sama.
